特開2024-160277ヘテロ接合性ＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子の差次的ノックアウト
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024160277
(43)【公開日】2024-11-13
(54)【発明の名称】ヘテロ接合性ＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子の差次的ノックアウト
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241106BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241106BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241106BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241106BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20241106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/0789 20100101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/113 Z ZNA
C12N5/071
C12N5/10
C12N15/55
A61P37/02
A61P7/00
A61K35/28
A61K48/00
A61K31/7105
C12N15/113 Z
C12N5/0789
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024125705
(22)【出願日】2024-08-01
(62)【分割の表示】P 2020563637の分割
【原出願日】2019-05-06
(31)【優先権主張番号】62/723,941
(32)【優先日】2018-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/743,309
(32)【優先日】2018-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/667,536
(32)【優先日】2018-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】520433182
【氏名又は名称】エメンドバイオ インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】バラム，デヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】イザール，リオール
(72)【発明者】
【氏名】ヘルマン，アサエル
(72)【発明者】
【氏名】エマニュエル，ラフィ
(72)【発明者】
【氏名】ゴラン マシアッチ，ミカル
(72)【発明者】
【氏名】ジョージソン，ジョセフ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）の変異対立遺伝子を不活性化するための方法を提供する。
【解決手段】ＳＣＮまたはＣｙＮに関連している変異を有するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を賦活化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７等を含む特定のＳＮＰ群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、細胞に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
【選択図】なし
【解決手段】ＳＣＮまたはＣｙＮに関連している変異を有するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を賦活化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７等を含む特定のＳＮＰ群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、細胞に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連
している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立
遺伝子を不活性化するための方法であって、前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３
７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０
ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７
６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４
８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１
７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及
びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合
性であり、前記方法は、
前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することを含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立
遺伝子を不活性化するための方法であって、前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３
７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０
ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７
６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４
８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１
７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及
びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合
性であり、前記方法は、
前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することを含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
【請求項2】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の前記複合体は、前記ＥＬＡ
ＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、前記変異対立遺伝子は、
前記１つ又は複数の多型部位に基づいて前記二本鎖切断のための標的とされる、請求項１
に記載の方法。
ＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、前記変異対立遺伝子は、
前記１つ又は複数の多型部位に基づいて前記二本鎖切断のための標的とされる、請求項１
に記載の方法。
【請求項3】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２の
ＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する、請
求項１又は請求項２に記載の方法。
ＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する、請
求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部は、配列番号１～１１９２のいずれか１つに
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含む、請求項１～３の何れか
一項に記載の方法。
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含む、請求項１～３の何れか
一項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の二本鎖切断は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である、請求項３又
は４に記載の方法。
は４に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前
記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝
子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方
法。
記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝
子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方
法。
【請求項7】
前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前
記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝
子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方
法。
記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝
子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方
法。
【請求項8】
前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前
記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝
子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の
方法。
記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝
子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の
方法。
【請求項9】
前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における
二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方法。
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における
二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における
二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方法。
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における
二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域におけ
る二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方法。
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域におけ
る二本鎖切断に影響する、請求項３～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項12】
重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変
異を有する前記細胞を、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有
する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、前記対象は
、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、請求項１～１１の何れか一項に記載の方法。
異を有する前記細胞を、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有
する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、前記対象は
、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、請求項１～１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項13】
第１にＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又は
ＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、前記対象は、ｒｓ１０４１
４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４０
０２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒ
ｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８
９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６
ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１
０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型
部位でヘテロ接合性である、こと、及び前記対象から前記細胞を取得することを含む、請
求項１２に記載の方法。
ＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、前記対象は、ｒｓ１０４１
４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４０
０２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒ
ｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８
９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６
ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１
０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型
部位でヘテロ接合性である、こと、及び前記対象から前記細胞を取得することを含む、請
求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞を前記対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取得することを
含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞を前記対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む、請求項１４に記載の
方法。
方法。
【請求項16】
前記組成物を前記細胞に導入する前に前記細胞を予備刺激する、請求項１～１５の何れ
か一項に記載の方法。
か一項に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞を培養増殖して細胞群を取得することをさらに含む、請求項１２～１６の何れ
か一項に記載の方法。
か一項に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ又は複数
とともに培養する、請求項１７に記載の方法。
とともに培養する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する、請求項１７又は１８に記
載の方法。
載の方法。
【請求項20】
前記少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカインである、請求項１９に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項21】
前記細胞は、複数の細胞の中の１つであり、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前
記第２のＲＮＡ分子の両方を含む前記組成物を、前記複数の細胞の中の少なくとも前記細
胞及び他の細胞に導入し、そして前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び前記他の
細胞中の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改
変細胞を取得する、請求項１～２０の何れか一項に記載の方法。
記第２のＲＮＡ分子の両方を含む前記組成物を、前記複数の細胞の中の少なくとも前記細
胞及び他の細胞に導入し、そして前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び前記他の
細胞中の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改
変細胞を取得する、請求項１～２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記第１のＲＮＡ分子を含む前記組成物を導入すること又は前記第２のＲＮＡ分子の導
入は、前記細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む、請求項１～２１の何れ
か一項に記載の方法。
入は、前記細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む、請求項１～２１の何れ
か一項に記載の方法。
【請求項23】
請求項２１又は２２に記載の方法によって取得される改変細胞。
【請求項24】
請求項２１に記載の細胞を培養増殖することから取得される改変細胞。
【請求項25】
生着することができる、請求項２３又は２４に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
【請求項26】
子孫細胞を生じることができる、請求項２３～２５の何れか一項に記載の改変細胞又は
複数の改変細胞。
複数の改変細胞。
【請求項27】
生着後に子孫細胞を生じることができる、請求項２６に記載の改変細胞又は複数の改変
細胞。
細胞。
【請求項28】
自家移植後に子孫細胞を生じることができる、請求項２７に記載の改変細胞又は複数の
改変細胞。
改変細胞。
【請求項29】
生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる
、請求項２７又は２８の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
、請求項２７又は２８の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
【請求項30】
前記改変細胞又は複数の改変細胞は、造血幹細胞及び／又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）であ
る、請求項２３～２９の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
る、請求項２３～２９の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
【請求項31】
前記改変細胞又は複数の改変細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項３０に記載
の改変細胞又は複数の改変細胞。
の改変細胞又は複数の改変細胞。
【請求項32】
前記改変細胞又は複数の改変細胞は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（ＰＭＣ）である、請
求項２３～３１の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
求項２３～３１の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
【請求項33】
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞。
【請求項34】
前記改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、
ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９
５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８
２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒ
ｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２
７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群か
ら選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された、請求項
３３に記載の改変細胞。
ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９
５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８
２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒ
ｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２
７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群か
ら選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された、請求項
３３に記載の改変細胞。
【請求項35】
請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む、
組成物。
組成物。
【請求項36】
前記細胞と前記薬学的に許容される担体とを混合することを含む、請求項３５に記載の
組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法。
組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法。
【請求項37】
インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、前記方法
は、
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳ
ＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することで
あって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４
、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０
９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３
８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、
ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３
２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群
から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、そして前記対象か
ら前記細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性
化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の
細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる
ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及
びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を培養増殖すること、を含み、
前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、方法。
は、
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳ
ＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することで
あって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４
、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０
９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３
８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、
ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３
２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群
から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、そして前記対象か
ら前記細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性
化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の
細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる
ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及
びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を培養増殖すること、を含み、
前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、方法。
【請求項38】
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳ
ＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することで
あって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４
、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０
９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３
８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、
ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３
２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群
から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、 こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性
化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の
細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる
ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及
びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着する
ことができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために前記対象にステップ（ｂ）又は
ステップ（ｃ）の前記細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される
組成物の使用。
ＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することで
あって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４
、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０
９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３
８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、
ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３
２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群
から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、 こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性
化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の
細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる
ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及
びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着する
ことができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために前記対象にステップ（ｂ）又は
ステップ（ｃ）の前記細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される
組成物の使用。
【請求項39】
治療有効量の請求項２１～３４の何れか一項に記載の改変細胞、請求項３５に記載の組
成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法によって調製された組成物を投与すること
を含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法。
成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法によって調製された組成物を投与すること
を含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法。
【請求項40】
ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象
におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒ
ｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ
２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５
２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６
ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒ
ｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７
０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ
接合性であり、前記方法は、
ａ）前記対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性
化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の
細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる
ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及
びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着する
ことができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与し、それにより前
記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法。
におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒ
ｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ
２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５
２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６
ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒ
ｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７
０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ
接合性であり、前記方法は、
ａ）前記対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性
化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及
び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の
細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる
ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及
びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ
遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着する
ことができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与し、それにより前
記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法。
【請求項41】
ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象
におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒ
ｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ
２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５
２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６
１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒ
ｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１ ０４２４４
７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテ
ロ接合性であり、前記方法は、
前記対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、前記自家改
変細胞は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子において二本鎖切断するように改
変され、
前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを
コードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を前記細胞に導入することから生じ、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞の前記Ｅ
ＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記
変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、こと、を含み、それにより前記対象の前
記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法。
におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒ
ｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ
２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５
２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６
１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒ
ｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１ ０４２４４
７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテ
ロ接合性であり、前記方法は、
前記対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、前記自家改
変細胞は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子において二本鎖切断するように改
変され、
前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを
コードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を前記細胞に導入することから生じ、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞の前記Ｅ
ＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記
変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、こと、を含み、それにより前記対象の前
記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法。
【請求項42】
ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であ
って、
ａ）前記対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異について選別し、
ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ
、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された前記対象の前記細胞を配列決定することによりｒ
ｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択され
る１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、及び
ｄ）治療のために前記１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象の
みを選択するステップを含む、方法。
って、
ａ）前記対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異について選別し、
ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ
、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された前記対象の前記細胞を配列決定することによりｒ
ｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択され
る１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、及び
ｄ）治療のために前記１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象の
みを選択するステップを含む、方法。
【請求項43】
ｅ）前記対象の骨髄から吸引によるか又は動員及び末梢血液のアフェレシスによるかの
いずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記ＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子に存在する前記１つ又は複数の多型部
位の前記ヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１～１１９
２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列
を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
前記第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の前記
ＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に
影響し、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第１のＲ
ＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が第１の二本鎖切断に影響した前
記１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、
イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を
取得する、こと、
ｇ）前記対象にステップ（ｆ）の前記改変細胞を投与し、それにより前記対象のＳＣＮ
又はＣｙＮを治療すること、を含む、
ステップ（ｄ）において選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさ
らに含む、請求項４２に記載の方法。
いずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記ＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子に存在する前記１つ又は複数の多型部
位の前記ヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１～１１９
２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列
を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
前記第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の前記
ＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に
影響し、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第１のＲ
ＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が第１の二本鎖切断に影響した前
記１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、
イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を
取得する、こと、
ｇ）前記対象にステップ（ｆ）の前記改変細胞を投与し、それにより前記対象のＳＣＮ
又はＣｙＮを治療すること、を含む、
ステップ（ｄ）において選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさ
らに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
配列番号：１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接している
ヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ
分子。
ヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ
分子。
【請求項45】
請求項４４に記載のＲＮＡ分子及びガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を含む、組成
物。
物。
【請求項46】
前記第２のＲＮＡ分子は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする、請求項
４５に記載の組成物。
４５に記載の組成物。
【請求項47】
前記第２のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記ヌクレオチド配列は、前記第１のＲＮ
Ａ分子の前記ガイド配列部の前記配列とは異なるヌクレオチド配列である、請求項４５又
は４６に記載の組成物。
Ａ分子の前記ガイド配列部の前記配列とは異なるヌクレオチド配列である、請求項４５又
は４６に記載の組成物。
【請求項48】
前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合
する配列を有する部分を含む、請求項４５～４７の何れか一項に記載の組成物。
する配列を有する部分を含む、請求項４５～４７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項49】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する前記配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である、請求
項４８に記載の組成物。
項４８に記載の組成物。
【請求項50】
前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒメイト配列を有する部
分を含む、請求項４５～４８の何れか一項に記載の組成物。
分を含む、請求項４５～４８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項51】
前記第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部をさらに含む、請求項４５～５０
の何れか一項に記載の組成物。
の何れか一項に記載の組成物。
【請求項52】
前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである、
請求項４２～５１の何れか一項に記載の組成物。
請求項４２～５１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項53】
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列、及び／又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記１つ
又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む、請求項４５～５２の何
れか一項に記載の組成物。
アーゼをコードする配列、及び／又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記１つ
又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む、請求項４５～５２の何
れか一項に記載の組成物。
【請求項54】
細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記方法は、
前記細胞に請求項４４に記載のＲＮＡ分子又は請求項４５～５３の何れか一項に記載の組
成物を送達することを含む、方法。
前記細胞に請求項４４に記載のＲＮＡ分子又は請求項４５～５３の何れか一項に記載の組
成物を送達することを含む、方法。
【請求項55】
ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する対
象に請求項４４に記載のＲＮＡ分子若しくは請求項４５～５３の何れか一項に記載の組成
物、又は請求項４４に記載のＲＮＡ分子若しくは請求項４５～５３の何れか一項に記載の
組成物によって改変された細胞を送達することを含む、方法。
象に請求項４４に記載のＲＮＡ分子若しくは請求項４５～５３の何れか一項に記載の組成
物、又は請求項４４に記載のＲＮＡ分子若しくは請求項４５～５３の何れか一項に記載の
組成物によって改変された細胞を送達することを含む、方法。
【請求項56】
前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子及
び前記ＲＮＡ分子若しくは複数のＲＮＡ分子を、前記対象及び／又は細胞に実質的に同時
に又は異なる時間に送達する、請求項５４又は５５に記載の方法。
び前記ＲＮＡ分子若しくは複数のＲＮＡ分子を、前記対象及び／又は細胞に実質的に同時
に又は異なる時間に送達する、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項57】
前記方法は、
ａ）変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、
前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子は、エキソン全体又は前記
エキソンの一部に隣接している領域を標的とする、こと、
ｂ）遺伝子の複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体を除去すること、
又は遺伝子全体を除去すること、
ｃ）前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝
子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とすること
、
ｄ）前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する
配列を標的とすること、
ｅ）前記第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること、
ｆ）エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により前記変異対立遺伝子に挿
入又は欠失を受けさせ、前記変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成すること、を
含み、
任意選択で前記フレームシフトは、前記変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウト
を生じ、
好ましくは、前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが
作成される又は前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異
依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる、請求項５４～５６の何れか一項に記載の方法。
ａ）変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、
前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子は、エキソン全体又は前記
エキソンの一部に隣接している領域を標的とする、こと、
ｂ）遺伝子の複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体を除去すること、
又は遺伝子全体を除去すること、
ｃ）前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝
子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とすること
、
ｄ）前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する
配列を標的とすること、
ｅ）前記第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること、
ｆ）エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により前記変異対立遺伝子に挿
入又は欠失を受けさせ、前記変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成すること、を
含み、
任意選択で前記フレームシフトは、前記変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウト
を生じ、
好ましくは、前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが
作成される又は前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異
依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる、請求項５４～５６の何れか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記不活性化又は治療により前記変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク
質及び前記機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる、請求項５
５～５７の何れか一項に記載の方法。
質及び前記機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる、請求項５
５～５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項59】
ａ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテ
ロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｂ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテ
ロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｃ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテ
ロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響し、
ｄ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｅ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｆ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３
’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項５５～５８の何れか一項に記載の方
法。
ロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｂ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテ
ロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｃ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテ
ロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響し、
ｄ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｅ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｆ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３
’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項５５～５８の何れか一項に記載の方
法。
【請求項60】
細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、請求項４４に記載のＲＮＡ
分子、請求項３５、４５～５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７
に記載の方法により調製された組成物、の使用。
分子、請求項３５、４５～５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７
に記載の方法により調製された組成物、の使用。
【請求項61】
細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、請求項４４に記載の
ＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６
若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を含む薬物であって、前記細胞に請求
項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物
又は請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を送達することにより
前記薬物を投与する、薬物。
ＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６
若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を含む薬物であって、前記細胞に請求
項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物
又は請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を送達することにより
前記薬物を投与する、薬物。
【請求項62】
ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治
療、寛解又は防止するための、請求項１～２２の何れか一項に記載の方法、請求項２３～
３４の何れか一項に記載の改変細胞、請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載
の組成物又は請求項３６～３７に記載の方法により調製された組成物、又は請求項４４に
記載のＲＮＡ分子、の使用。
療、寛解又は防止するための、請求項１～２２の何れか一項に記載の方法、請求項２３～
３４の何れか一項に記載の改変細胞、請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載
の組成物又は請求項３６～３７に記載の方法により調製された組成物、又は請求項４４に
記載のＲＮＡ分子、の使用。
【請求項63】
ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、請求項４４のＲＮＡ分子、
請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に
記載の方法により調製された組成物又は請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変細胞
を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、請求項
４４のＲＮＡ分子、請求項３５もしくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物、請求項
３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は請求項２３～３４の何れか一
項に記載の改変細胞を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に
記載の方法により調製された組成物又は請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変細胞
を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、請求項
４４のＲＮＡ分子、請求項３５もしくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物、請求項
３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は請求項２３～３４の何れか一
項に記載の改変細胞を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
【請求項64】
請求項４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃ
ｒＲＮＡをコードする配列、及び前記細胞の前記変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化す
るために、前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列、及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒ
ＲＮＡをコードする配列を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異Ｅ
ＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
ヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃ
ｒＲＮＡをコードする配列、及び前記細胞の前記変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化す
るために、前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列、及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒ
ＲＮＡをコードする配列を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異Ｅ
ＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
【請求項65】
請求項４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃ
ｒＲＮＡをコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう前記ＲＮＡ分子、ＣＲ
ＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／
又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記ＳＣＮ
又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、前記
対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
ヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃ
ｒＲＮＡをコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう前記ＲＮＡ分子、ＣＲ
ＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／
又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記ＳＣＮ
又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、前記
対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
【請求項66】
請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７
に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変
細胞、及び前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう前記組成物を前記細胞に
送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するた
めのキット。
に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変
細胞、及び前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう前記組成物を前記細胞に
送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するた
めのキット。
【請求項67】
請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７
に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変
細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項
に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は請
求項２３～３４の何れか一項に記載の改変細胞をＳＣＮ若しくはＣｙＮを有する又は有す
るリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療す
るためのキット。
に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３～３４の何れか一項に記載の改変
細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう請求項３５若しくは４５～５３の何れか一項
に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は請
求項２３～３４の何れか一項に記載の改変細胞をＳＣＮ若しくはＣｙＮを有する又は有す
るリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療す
るためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１８年１０月９日に出願された米国仮出願第６２／７４３，３０９号、
２０１８年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／７２３，９４１号、２０１８年５
月６日に出願された米国仮出願第６２／６６７，５３６号の利益を主張するものであり、
その各々の内容を参照により本明細書に援用される。
２０１８年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／７２３，９４１号、２０１８年５
月６日に出願された米国仮出願第６２／６６７，５３６号の利益を主張するものであり、
その各々の内容を参照により本明細書に援用される。
【0002】
本出願を通じて、丸括弧で参照されることを含んで、各種出版物が参照される。本出願
において言及される全ての出版物の開示は、本発明が属する当該技術及び本発明とともに
利用されることができる当該技術分野の特徴の追加の記述を提供するために、その全体を
参照により本出願に援用される。
において言及される全ての出版物の開示は、本発明が属する当該技術及び本発明とともに
利用されることができる当該技術分野の特徴の追加の記述を提供するために、その全体を
参照により本出願に援用される。
【0003】
配列リストに対する参照
本出願は、「１９０５０６＿９０５２２－Ａ－ＰＣＴｊＳｅｑｕｅｎｃｅＪＬｉｓｔｉ
ｎｇ＿ＡＤＲ．ｔｘｔ」と名前をつけたファイルに存在するヌクレオチド配列を参照によ
り援用し、このファイルはサイズが２４９キロバイトであり、ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓと互
換性があるオペレーションシステムを有する、ＩＢＭ－ＰＣ機械フォーマットにおいて２
０１９年５月３日に作成され、２０１９年５月６日に本出願の一部として提出されたテキ
ストファイルに含まれる。
本出願は、「１９０５０６＿９０５２２－Ａ－ＰＣＴｊＳｅｑｕｅｎｃｅＪＬｉｓｔｉ
ｎｇ＿ＡＤＲ．ｔｘｔ」と名前をつけたファイルに存在するヌクレオチド配列を参照によ
り援用し、このファイルはサイズが２４９キロバイトであり、ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓと互
換性があるオペレーションシステムを有する、ＩＢＭ－ＰＣ機械フォーマットにおいて２
０１９年５月３日に作成され、２０１９年５月６日に本出願の一部として提出されたテキ
ストファイルに含まれる。
【背景技術】
【0004】
ヒトゲノムには、挿入及び欠失、反復配列のコピー数の差並びに一塩基多型（ＳＮＰ）
を含む、いくつかの種類のＤＮＡの変動がある。ＳＮＰは、ゲノム中の一塩基（アデニン
（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ））がヒト対象間又は個人の一
対の染色体間で異なるときに生じるＤＮＡ配列の変動である。長年にわたって、種々のタ
イプのＤＮＡの変動はピンポイントの遺伝形質若しくは疾患因果関係についての研究のマ
ーカーとして又は遺伝性障害の潜在的原因としてのいずれかで研究コミュニティの中心と
なってきた。ＳＮＰは通常、良性で疾患の原因ではないと考えられている。
を含む、いくつかの種類のＤＮＡの変動がある。ＳＮＰは、ゲノム中の一塩基（アデニン
（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ））がヒト対象間又は個人の一
対の染色体間で異なるときに生じるＤＮＡ配列の変動である。長年にわたって、種々のタ
イプのＤＮＡの変動はピンポイントの遺伝形質若しくは疾患因果関係についての研究のマ
ーカーとして又は遺伝性障害の潜在的原因としてのいずれかで研究コミュニティの中心と
なってきた。ＳＮＰは通常、良性で疾患の原因ではないと考えられている。
【0005】
遺伝性障害は、ゲノム中の１つ又は複数の異常によって起こる。遺伝性障害は、「ドミ
ナントな」又は「潜性」のいずれかとみなされてもよい。潜性遺伝性障害は、提示される
ためには２コピーの（すなわち２個の対立遺伝子の）異常／欠損遺伝子が必要となる障害
である。対照的に、ドミナントな遺伝性障害では、正常な（機能性の／健康な）遺伝子又
は遺伝子群にわたって優位を示す遺伝子又は遺伝子群が関与する。このように、ドミナン
トな遺伝性障害においては、特定の遺伝性障害の症状を引き起こす又は寄与するためには
１コピー（すなわち対立遺伝子）のみの異常欠損遺伝子しか必要とされない。このような
変異には、例えば変化した遺伝子産物が新しい分子機能又は遺伝子発現の新しいパターン
を持つ機能獲得型変異が含まれる。機能獲得型変異は、一般的にドミナントネガティブ変
異である。ドミナントネガティブ変異の例は、１個の対立遺伝子が突然変異して機能を失
い、残された単一の野生型対立遺伝子が特定の細胞機能に十分なほどの必要なタンパク質
を作成しないハプロ不全である。他の例には、野生型対立遺伝子に対して拮抗的に働く遺
伝子産物を有するドミナントネガティブ変異が含まれる。
ナントな」又は「潜性」のいずれかとみなされてもよい。潜性遺伝性障害は、提示される
ためには２コピーの（すなわち２個の対立遺伝子の）異常／欠損遺伝子が必要となる障害
である。対照的に、ドミナントな遺伝性障害では、正常な（機能性の／健康な）遺伝子又
は遺伝子群にわたって優位を示す遺伝子又は遺伝子群が関与する。このように、ドミナン
トな遺伝性障害においては、特定の遺伝性障害の症状を引き起こす又は寄与するためには
１コピー（すなわち対立遺伝子）のみの異常欠損遺伝子しか必要とされない。このような
変異には、例えば変化した遺伝子産物が新しい分子機能又は遺伝子発現の新しいパターン
を持つ機能獲得型変異が含まれる。機能獲得型変異は、一般的にドミナントネガティブ変
異である。ドミナントネガティブ変異の例は、１個の対立遺伝子が突然変異して機能を失
い、残された単一の野生型対立遺伝子が特定の細胞機能に十分なほどの必要なタンパク質
を作成しないハプロ不全である。他の例には、野生型対立遺伝子に対して拮抗的に働く遺
伝子産物を有するドミナントネガティブ変異が含まれる。
【0006】
好中球減少症
好中球減少症は、血液循環中の好中球の絶対数の減少と定義され、通常末梢血液中の好
中球絶対数（ＡＮＣ）を測定することにより診断される。好中球減少症の重症度は、ＡＮ
Ｃが１０００～１５００／μＬであると軽度、ＡＮＣが５００～１０００／μＬであると
中等度、又はＡＮＣが５００／μＬ未満であると重度とみなされる（Ｂｏｘｅｒ ２０１
２）。
好中球減少症は、血液循環中の好中球の絶対数の減少と定義され、通常末梢血液中の好
中球絶対数（ＡＮＣ）を測定することにより診断される。好中球減少症の重症度は、ＡＮ
Ｃが１０００～１５００／μＬであると軽度、ＡＮＣが５００～１０００／μＬであると
中等度、又はＡＮＣが５００／μＬ未満であると重度とみなされる（Ｂｏｘｅｒ ２０１
２）。
【0007】
好中球減少症は、先天性（遺伝性）又は後天性に分類することができる。先天性条件で
の、通常常染色体性優性遺伝の２つの主要なタイプは、周期性好中球減少症（ＣｙＮ）及
び重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）である。周期性好中球減少症は、好中球数が正常レ
ベルからゼロまで変動することにより特徴づけられる一方、重症先天性好中球減少症（Ｓ
ＣＮ）は、出生時に非常に低いＡＮＣ（５００／ｍＴ）が認められ、前骨髄球／骨髄球ス
テージで骨髄中の骨髄造血の成熟化が停止し、細菌感染症を早期発症することにより特徴
づけられる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｈｏｒｗｉｔｚら、２０１３）
。
の、通常常染色体性優性遺伝の２つの主要なタイプは、周期性好中球減少症（ＣｙＮ）及
び重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）である。周期性好中球減少症は、好中球数が正常レ
ベルからゼロまで変動することにより特徴づけられる一方、重症先天性好中球減少症（Ｓ
ＣＮ）は、出生時に非常に低いＡＮＣ（５００／ｍＴ）が認められ、前骨髄球／骨髄球ス
テージで骨髄中の骨髄造血の成熟化が停止し、細菌感染症を早期発症することにより特徴
づけられる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｈｏｒｗｉｔｚら、２０１３）
。
【0008】
ＳＣＮを、血液中の非常に低いＡＮＣを測定し、骨髄穿刺法を検査して骨髄成熟の停止
を同定することにより診断してもよい（Ｄａｌｅ ２０１７）。ＳＣＮは、通常生後６か
月前に診断される一方、ＣｙＮの診断は、概して生後２年の間、又はそれ以降になされ、
主要な臨床所見は反復性急性口腔医学的疾患である。ＳＣＮが疑われるとき、悪性血液疾
患を除外し、細胞充実度を決定し、骨髄成熟度を評価し、正確な原因の徴候を検出するた
めに、今では細胞遺伝学的骨髄試験が決定的である、骨髄検査が必要となることが多い。
ＳＣＮ及びＣｙＮを評価する際、抗好中球抗体アッセイ、免疫グロブリンアッセイ（Ｉｇ
ＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリプシノーゲン及び糞便エ
ラスターゼ）並びに脂溶性ビタミンレベル（ビタミンＡ、Ｅ及びＤ）も関心事項である（
Ｄｏｎａｄｉｅｕ ２０１１を参照）。
を同定することにより診断してもよい（Ｄａｌｅ ２０１７）。ＳＣＮは、通常生後６か
月前に診断される一方、ＣｙＮの診断は、概して生後２年の間、又はそれ以降になされ、
主要な臨床所見は反復性急性口腔医学的疾患である。ＳＣＮが疑われるとき、悪性血液疾
患を除外し、細胞充実度を決定し、骨髄成熟度を評価し、正確な原因の徴候を検出するた
めに、今では細胞遺伝学的骨髄試験が決定的である、骨髄検査が必要となることが多い。
ＳＣＮ及びＣｙＮを評価する際、抗好中球抗体アッセイ、免疫グロブリンアッセイ（Ｉｇ
ＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリプシノーゲン及び糞便エ
ラスターゼ）並びに脂溶性ビタミンレベル（ビタミンＡ、Ｅ及びＤ）も関心事項である（
Ｄｏｎａｄｉｅｕ ２０１１を参照）。
【0009】
ＳＣＮは、常染色体性―潜性（ＨＡＸ１、Ｇ６ＰＣ３）、常染色体性―ドミナント（Ｅ
ＬＡＮＥ、ＧＦＩ１）又はＸ染色体連鎖（ＷＡＳ）型の遺伝であることができ、又は孤発
性に生じることもできる（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２０１２；Ｂｏｘｅｒ ２０１２）。
ＬＡＮＥ、ＧＦＩ１）又はＸ染色体連鎖（ＷＡＳ）型の遺伝であることができ、又は孤発
性に生じることもできる（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２０１２；Ｂｏｘｅｒ ２０１２）。
【0010】
周期性及び先天性好中球減少症は、「好中球エラスターゼ遺伝子」（ＥＬＡＮＥ遺伝子
）―好中球エラスターゼのための遺伝子の突然変異によって引き起こされることが最も多
い。ＥＬＡＮＥ遺伝子変異は、ＳＣＮ患者の４０～５５％で同定され、男性と女性は等し
く発症する（Ｄｏｎａｄｉｅｕら、２０１１；Ｄａｌｅ２０１７）。ＥＬＡＮＥ遺伝子中
の突然変異は、常染色体性及び孤発性のＳＣＮの症例と関連している（Ｃａｒｌｓｓｏｎ
ら、２０１２）。今日までに、２００種類を超える様々なＥＬＡＮＥ突然変異が同定され
てきており、全てのエキソン並びにイントロン３及びイントロン４にわたってランダムに
分布している（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。例えば予後不良に特に関連づけられるＣ
１５１Ｙ及びＧ２１４Ｒなどの、ＣｙＮ及びＳＣＮに関連する１２０種類を超える別個の
ＥＬＡＮＥ遺伝子変異が今では知られている（ＣｙＮ及びＳＣＮに関連するＥＬＡＮＥ遺
伝子の包括的リストについては、Ｍａｋａｒｙａｎら、２０１２を参照；またＧｅｒｍｅ
ｓｈａｕｓｅｎら、２０１３を参照）。
）―好中球エラスターゼのための遺伝子の突然変異によって引き起こされることが最も多
い。ＥＬＡＮＥ遺伝子変異は、ＳＣＮ患者の４０～５５％で同定され、男性と女性は等し
く発症する（Ｄｏｎａｄｉｅｕら、２０１１；Ｄａｌｅ２０１７）。ＥＬＡＮＥ遺伝子中
の突然変異は、常染色体性及び孤発性のＳＣＮの症例と関連している（Ｃａｒｌｓｓｏｎ
ら、２０１２）。今日までに、２００種類を超える様々なＥＬＡＮＥ突然変異が同定され
てきており、全てのエキソン並びにイントロン３及びイントロン４にわたってランダムに
分布している（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。例えば予後不良に特に関連づけられるＣ
１５１Ｙ及びＧ２１４Ｒなどの、ＣｙＮ及びＳＣＮに関連する１２０種類を超える別個の
ＥＬＡＮＥ遺伝子変異が今では知られている（ＣｙＮ及びＳＣＮに関連するＥＬＡＮＥ遺
伝子の包括的リストについては、Ｍａｋａｒｙａｎら、２０１２を参照；またＧｅｒｍｅ
ｓｈａｕｓｅｎら、２０１３を参照）。
【0011】
ＥＬＡＮＥは、好中球細胞外トラップ（病原体と結合する繊維のネットワーク）の機能
に関与する好中球エラスターゼ（ＮＥ）をコードする。いくつかの研究から、変異ＥＬＡ
ＮＥの産物は、骨髄での好中球の産出を妨害し、好中球減少症を引き起こすことが示唆さ
れている。これらの研究から、ＮＥでの突然変異は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を惹
起し、骨髄での好中球形成プロセスにおける細胞損失につながることが分かる（Ｍａｋａ
ｒｙａｎら、２０１７）。
に関与する好中球エラスターゼ（ＮＥ）をコードする。いくつかの研究から、変異ＥＬＡ
ＮＥの産物は、骨髄での好中球の産出を妨害し、好中球減少症を引き起こすことが示唆さ
れている。これらの研究から、ＮＥでの突然変異は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を惹
起し、骨髄での好中球形成プロセスにおける細胞損失につながることが分かる（Ｍａｋａ
ｒｙａｎら、２０１７）。
【0012】
現在の治療
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）は、ＳＣＮの第一選択治療とみなされる（Ｃｏ
ｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ及びＬｅｖｉｎｅ ２０１２）。Ｇ－ＣＳＦは、より多い好中球
の生産を刺激し、アポトーシスを遅延させる（Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＫｌｅｉｎ ２００
７）。ＳＣＮ患者の１０％はまだ重度の細菌性感染症又は敗血症で死亡するけれども、悪
性病変が発生している患者を含めて、全体の生存率は今では８０％を超えると推定される
（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。Ｇ－ＣＳＦ療法は敗血症での死亡数を防止することに
成功しているけれども、長期治療するとＳＣＮ患者に骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白
血病が発生するリスクが高まることと関連することが明らかになった。ＳＣＮにおいて最
も一般的な白血病は、ＡＭＬであるが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、若年性骨髄単球
性白血病（ＪＭＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び二重表現型白血病も文献
に報告されている（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ，及びＬｅｖｉｎｅ ２０１２）。Ｇ－
ＣＳＦに強い応答がある（投与量８μｇ／ｋｇ／ｄａｙ未満）患者は、Ｇ－ＣＳＦ時から
１５年後ＭＤＳ／白血病の発症について累積発症率が１５％だった一方、高投与量にも関
わらずＧ－ＣＳＦに対して応答不良だった患者の発症率は３４％だったとこれまでに報告
された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２０１０）。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）は、ＳＣＮの第一選択治療とみなされる（Ｃｏ
ｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ及びＬｅｖｉｎｅ ２０１２）。Ｇ－ＣＳＦは、より多い好中球
の生産を刺激し、アポトーシスを遅延させる（Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＫｌｅｉｎ ２００
７）。ＳＣＮ患者の１０％はまだ重度の細菌性感染症又は敗血症で死亡するけれども、悪
性病変が発生している患者を含めて、全体の生存率は今では８０％を超えると推定される
（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。Ｇ－ＣＳＦ療法は敗血症での死亡数を防止することに
成功しているけれども、長期治療するとＳＣＮ患者に骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白
血病が発生するリスクが高まることと関連することが明らかになった。ＳＣＮにおいて最
も一般的な白血病は、ＡＭＬであるが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、若年性骨髄単球
性白血病（ＪＭＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び二重表現型白血病も文献
に報告されている（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ，及びＬｅｖｉｎｅ ２０１２）。Ｇ－
ＣＳＦに強い応答がある（投与量８μｇ／ｋｇ／ｄａｙ未満）患者は、Ｇ－ＣＳＦ時から
１５年後ＭＤＳ／白血病の発症について累積発症率が１５％だった一方、高投与量にも関
わらずＧ－ＣＳＦに対して応答不良だった患者の発症率は３４％だったとこれまでに報告
された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２０１０）。
【0013】
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、Ｇ－ＣＳＦ療法に応答しない又はＡＭＬ／ＭＤＳが発
症した患者に対しての代替的な根治療法である。しかしながら、ＨＣＴを受ける慢性好中
球減少症患者には、真菌及び移植片対宿主病などの感染性合併症が発症するリスクが高い
（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。さらに、ＨＣＴでは、生存率を改善するためには適合
血縁ドナーが必要となるが、ほとんどの患者には利用可能な適合ドナーがいない（Ｃｏｎ
ｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ，及びＬｅｖｉｎｅ ２０１２）。
症した患者に対しての代替的な根治療法である。しかしながら、ＨＣＴを受ける慢性好中
球減少症患者には、真菌及び移植片対宿主病などの感染性合併症が発症するリスクが高い
（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。さらに、ＨＣＴでは、生存率を改善するためには適合
血縁ドナーが必要となるが、ほとんどの患者には利用可能な適合ドナーがいない（Ｃｏｎ
ｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ，及びＬｅｖｉｎｅ ２０１２）。
【発明の概要】
【0014】
開示されるのは、ドミナントな変異対立遺伝子を破壊する又は生じたｍＲＮＡを分解す
ることによりドミナントな変異対立遺伝子の発現をノックアウトする手法である。
ることによりドミナントな変異対立遺伝子の発現をノックアウトする手法である。
【0015】
本開示は、一方の対立遺伝子は変異が疾患表現型を生じる変異タンパク質をコードする
ような変異を保持し（「変異対立遺伝子」）、他方の対立遺伝子は機能性タンパク質をコ
ードする（「機能性対立遺伝子」）、遺伝子の２個の対立遺伝子間を識別／区別するため
に少なくとも１つの自然発生のヘテロ接合性ヌクレオチドの差又は遺伝子多型（一塩基多
型（ＳＮＰ）等）を利用する方法を提供する。
ような変異を保持し（「変異対立遺伝子」）、他方の対立遺伝子は機能性タンパク質をコ
ードする（「機能性対立遺伝子」）、遺伝子の２個の対立遺伝子間を識別／区別するため
に少なくとも１つの自然発生のヘテロ接合性ヌクレオチドの差又は遺伝子多型（一塩基多
型（ＳＮＰ）等）を利用する方法を提供する。
【0016】
本発明の実施形態は、ある一定の細胞又は対象においてドミナントな変異対立遺伝子を
発現する遺伝子の少なくとも１つのヘテロ接合性ＳＮＰを利用する方法を提供する。本発
明の実施形態において、利用されるＳＮＰは、疾患表現型と関連してもしなくてもよい。
本発明の実施形態において、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異対立遺伝子中
のヘテロ接合性ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能性対立遺伝子中の異なるヌクレ
オチド塩基を有するヌクレオチド塩基を標的とすることにより遺伝子の変異対立遺伝子を
標的とする。
発現する遺伝子の少なくとも１つのヘテロ接合性ＳＮＰを利用する方法を提供する。本発
明の実施形態において、利用されるＳＮＰは、疾患表現型と関連してもしなくてもよい。
本発明の実施形態において、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異対立遺伝子中
のヘテロ接合性ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能性対立遺伝子中の異なるヌクレ
オチド塩基を有するヌクレオチド塩基を標的とすることにより遺伝子の変異対立遺伝子を
標的とする。
【0017】
いくつかの実施形態において、方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能
性タンパク質の発現を許容するステップをさらに含む。
性タンパク質の発現を許容するステップをさらに含む。
【0018】
本発明は、細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（Ｃｙ
Ｎ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子
の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、
ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒ
ｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３
５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７
６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、
ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４
７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテ
ロ接合性であり、方法は、
細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組
成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法を提供する。
Ｎ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子
の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、
ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒ
ｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３
５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７
６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、
ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４
７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテ
ロ接合性であり、方法は、
細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組
成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法を提供する。
【0019】
本発明は、本発明の方法によって取得される改変細胞を提供する。
【0020】
本発明は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細
胞を提供する。
胞を提供する。
【0021】
本発明は、改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【0022】
本発明は、本発明の細胞と薬学的に許容される担体とを混合することを含む、組成物の
インビトロ又はエクスビボ調製方法を提供する。
インビトロ又はエクスビボ調製方法を提供する。
【0023】
本発明は、インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって
、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は
、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、及び対象から細胞を取得する
こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における
第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の改変細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着すること
ができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、を含む、方法を提
供する。
、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は
、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、及び対象から細胞を取得する
こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における
第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の改変細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着すること
ができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、を含む、方法を提
供する。
【0024】
本発明は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は
、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の
二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ
）の細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用を提
供する。
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は
、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の
二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ
）の細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用を提
供する。
【0025】
本発明は、治療有効量の本発明の改変細胞、組成物又は方法によって調製された組成物
を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法を提供する。
を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法を提供する。
【0026】
本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要
とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３
７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ
、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ
３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒ
ｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００
７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２
４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位で
ヘテロ接合性であり、方法は、
ａ）対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の
二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与し、それにより対象のＳＣ
Ｎ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法を提供する。
とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３
７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ
、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ
３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒ
ｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００
７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２
４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位で
ヘテロ接合性であり、方法は、
ａ）対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の
二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与し、それにより対象のＳＣ
Ｎ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法を提供する。
【0027】
本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要
とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４１４８３
７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１
、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１
３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒ
ｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００
７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２
４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位で
ヘテロ接合性であり、方法は、
対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、自家改変細胞は
、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断するように改変され、
上記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコー
ドする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を細胞に導入することから生じ、ＣＲＩＳ
ＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変
異対立遺伝子を不活性化するよう、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断する
ことに影響する、投与すること、を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法を提供する。
とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４１４８３
７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１
、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１
３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒ
ｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００
７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２
４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位で
ヘテロ接合性であり、方法は、
対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、自家改変細胞は
、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断するように改変され、
上記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコー
ドする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を細胞に導入することから生じ、ＣＲＩＳ
ＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変
異対立遺伝子を不活性化するよう、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断する
ことに影響する、投与すること、を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法を提供する。
【0028】
本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択す
る方法であって、方法は、
ａ）対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を求めて選別し
、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステッ
プ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された対象の細胞を配列決定することによりｒｓ１０
４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、そして
ｄ）治療のために１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみ
を選択するステップ、を含む方法を提供する。
る方法であって、方法は、
ａ）対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を求めて選別し
、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステッ
プ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された対象の細胞を配列決定することによりｒｓ１０
４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、そして
ｄ）治療のために１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみ
を選択するステップ、を含む方法を提供する。
【0029】
本発明の実施形態は、
ｅ）対象の骨髄から末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいず
れかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）のＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヘテロ接
合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号１～１１９２のいずれか１つに
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌク
レオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標
的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数のＨＳＰＣ
細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、第２のＲ
ＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌ
クレアーゼの複合体が第１の二本鎖切断することに影響した１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞
におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲ
が第２の二本鎖切断することに影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、
ｇ）対象にステップ（ｆ）の改変細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを
治療すること、を含む、選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさら
に含む。
ｅ）対象の骨髄から末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいず
れかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）のＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレ
アーゼをコードする配列
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヘテロ接
合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号１～１１９２のいずれか１つに
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌク
レオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標
的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数のＨＳＰＣ
細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、第２のＲ
ＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌ
クレアーゼの複合体が第１の二本鎖切断することに影響した１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞
におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲ
が第２の二本鎖切断することに影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、
ｇ）対象にステップ（ｆ）の改変細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを
治療すること、を含む、選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさら
に含む。
【0030】
本発明は、配列番号１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接
しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含
むＲＮＡ分子を提供する。
しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含
むＲＮＡ分子を提供する。
【0031】
本発明は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方
法は、細胞に本発明のＲＮＡ分子又は組成物を送達することを含む、方法を提供する。
法は、細胞に本発明のＲＮＡ分子又は組成物を送達することを含む、方法を提供する。
【0032】
本発明は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、本発明のＲＮＡ
分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物の使用を提供する。
分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物の使用を提供する。
【0033】
本発明は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、本発明の
ＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を含む薬物であっ
て、細胞に本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成
物を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
ＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を含む薬物であっ
て、細胞に本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成
物を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
【0034】
本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又は
ＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、本発明の方法、本発明の改変細胞、本発明の組
成物又は本発明の方法により調製された組成物、又は本発明のＲＮＡ分子の使用を提供す
る。
ＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、本発明の方法、本発明の改変細胞、本発明の組
成物又は本発明の方法により調製された組成物、又は本発明のＲＮＡ分子の使用を提供す
る。
【0035】
本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、本発明のＲＮＡ
分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞を含
む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、本発明のＲ
ＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞
を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞を含
む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、本発明のＲ
ＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞
を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
【0036】
本発明は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコ
ードする配列、及び細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、ＲＮＡ分子
、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又
はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を細胞に送達するための
説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供す
る。
ーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコ
ードする配列、及び細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、ＲＮＡ分子
、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又
はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を細胞に送達するための
説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供す
る。
【0037】
本発明は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコ
ードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するようＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡをＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対
象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットを
提供する。
ーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコ
ードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するようＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡをＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対
象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットを
提供する。
【0038】
本発明は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変
細胞、及び細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう組成物を細胞に送達するための説
明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供する
。
細胞、及び細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう組成物を細胞に送達するための説
明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供する
。
【0039】
本発明は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変
細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう本発明の組成物、本発明の方法により調製さ
れた組成物、又は本発明の改変細胞をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある
対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット
を提供する。
細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう本発明の組成物、本発明の方法により調製さ
れた組成物、又は本発明の改変細胞をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある
対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】図１。ＳＮＰ位置の上流からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまでのプロモーター領域を切除する。１つの実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略ｌａ－ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略ｌｂ－ｒｓ３７６ｌ００５）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。
【図2】図２。ＳＮＰ位置の上流からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまでのプロモーター領域を切除する。１つの実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略ｌａ－ｒｓ１０４１４８３７、戦略ｌｂ－ｒｓ３７６１００５）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。別の実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域ヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略ｌａ－ｒｓ１０４１４８３７、戦略ｌｂ－ｒｓ３７６１００５）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする。
【図3】図３。イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域までを切除する。１つの実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域ヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略２－ｒｓ１６８３５６４）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。別の実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略２－ｒｓ１６８３５６４）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。さらなる実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略２－ｒｓ１６８３５６４）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする。
【図4】図４。イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域までを切除する。この戦略は、健常な対立遺伝子を無傷のままにする一方、疾患発症性対立遺伝子（「変異対立遺伝子」）を特異的にノックアウトするよう設計される。対立遺伝子特異的編集は、集団におけるヘテロ接合頻度が比較的高い区別する（ヘテロ接合性）ＳＮＰ位置を標的とするガイドを使用することにより達成される。
【図5】図５。ヘテロ接合性頻度及び選択ヘテロ接合性ＳＮＰ間の重複／連鎖に基づく集団内の予想される適用範囲。３個の治療戦略の代替解決策を設計すると、集団の約８０％を含めることができてもよい。集団の約８０％は、上記リストから１つ又は複数のヘテロ接合性ＳＮＰを保持していると評価される。そのうち３３％は１つのヘテロ接合性ＳＮＰを保持し、３１％はリストから２個のヘテロ接合性ＳＮＰを保持し、１６％は３個のヘテロ接合性ＳＮＰを保持する。一方で、２０％は上記リストのいかなるＳＮＰも保持しない。
【図6】図６。ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに播種した（３Ｋ／ウェル）。２４時間後、６５ｎｇのＷＴ－Ｃａｓ９又はＤｅａｄ－Ｃａｓ９及びｇ３６～ｇ６６として識別され、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ試薬（サーモサイエンティフィック）を使用してＥＬＡＮＥの異なる領域及びＳＮＰを標的とする、２０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドで同時導入した。編集の割合を以下の式にしたがって算出した。１００％－（未編集バンド強度／全バンド強度）Ｘ１００。３個の独立した実験のＤｅａｄ－Ｃａｓ９バックグラウンド活性を減算した後の各ｇＲＮＡの平均活性±ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明の実施形態は、細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減
少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝
子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ
４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４０
０２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒ
ｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８
９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６
１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１
０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型
部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組
成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法を提供する。
少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝
子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ
４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４０
０２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒ
ｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８
９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６
１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１
０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型
部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組
成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法を提供する。
【0042】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、変異対立遺伝子は、１つ又
は複数の多型部位に基づいて二本鎖切断のための標的とする。
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、変異対立遺伝子は、１つ又
は複数の多型部位に基づいて二本鎖切断のための標的とする。
【0043】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、変異対立遺伝子は、１つ又
は複数の多型部位での変異対立遺伝子の配列に基づいて二本鎖切断のための標的とする。
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、変異対立遺伝子は、１つ又
は複数の多型部位での変異対立遺伝子の配列に基づいて二本鎖切断のための標的とする。
【0044】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヌクレオチド塩基に
基づいてＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する。
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヌクレオチド塩基に
基づいてＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する。
【0045】
本発明の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、第２のＲＮＡ分子及びＣ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響
する。
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、第２のＲＮＡ分子及びＣ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響
する。
【0046】
本発明の実施形態において、組成物は、１、２、３又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでもよい。本発明の実施形態に
おいて、組成物を細胞に導入することは、細胞に１、２、３又は複数の組成物を導入する
ことを含む。本発明の実施形態において、各組成物は、異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
もしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列又は同一のＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼもしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでもよい。２個のＲＮＡ分
子を含む本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ分子と同じＣＲ
ＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してもよいし、別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複
合体を形成してもよい。
ゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでもよい。本発明の実施形態に
おいて、組成物を細胞に導入することは、細胞に１、２、３又は複数の組成物を導入する
ことを含む。本発明の実施形態において、各組成物は、異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
もしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列又は同一のＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼもしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでもよい。２個のＲＮＡ分
子を含む本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ分子と同じＣＲ
ＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してもよいし、別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複
合体を形成してもよい。
【0047】
本発明の実施形態において、第２の二本鎖切断は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内
である。本発明の実施形態において、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域は、イントロン又
は非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。本発明の実施形態において、非コード領域は、
イントロン３又はイントロン４である。本発明の実施形態において、ＵＴＲは、３’ＵＴ
Ｒである。
である。本発明の実施形態において、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域は、イントロン又
は非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。本発明の実施形態において、非コード領域は、
イントロン３又はイントロン４である。本発明の実施形態において、ＵＴＲは、３’ＵＴ
Ｒである。
【0048】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１～１１
９２の何れか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含む。
９２の何れか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含む。
【0049】
本発明の実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１～１１
９２の何れか１つ、又は配列番号１１９３～２０００の何れか１つに記載されている１７
～２０個の近接しているヌクレオチドの配列にある１７～２０個のヌクレオチドを含む。
９２の何れか１つ、又は配列番号１１９３～２０００の何れか１つに記載されている１７
～２０個の近接しているヌクレオチドの配列にある１７～２０個のヌクレオチドを含む。
【0050】
本発明の実施形態において、第２の二本鎖切断は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内
である
である
【0051】
本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５で
ヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。
ヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。
【0052】
本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５で
ヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。
ヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。
【0053】
本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５で
ヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。
ヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。
【0054】
本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン
４における二本鎖切断に影響する。
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン
４における二本鎖切断に影響する。
【0055】
本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン
３における二本鎖切断に影響する。
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン
３における二本鎖切断に影響する。
【0056】
本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ
領域における二本鎖切断に影響する。
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ
領域における二本鎖切断に影響する。
【0057】
いくつかの実施形態においては、細胞は、ＥＬＡＮＥ ｒｓ１０４ｌ４８３７の多型部
位でヘテロ接合性であり、１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１
のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺
伝子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖
切断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は、
１７～２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：８２、８６、９３、９４、１１５
、１１９、１３５、１７３、１８０、２１３、２１５、２２４、２２５、２６２、２６３
、３０７、３０８、３１９、３２３、３５１、３５２、３７４、４６１、４６２、４６６
、４６７、４７４、４７７、４７８、４９１、５０４、５０５、５３３、５３７、５３８
、５５０、５５６、５６９、５７０、５８３、５８４、６８４、６８５、７１４、７４５
、７９０、７９１、８４５、８４６、８５４、８５７、８５８、８６１、８６３、８６４
、８８０、８８１、８８６、８９０、８９１、９０１、９１１、９１２、９３６、９３７
、９３９、９４０、９６０、９６１、９７２、９７８、９７９、９８３、９８４、１０１
８、１０３４、１０３５、１０４０、１０８６、１１１０、１１１１、１１３５、１１４
４及び１１４５の何れか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチド
の配列を含んでもよい。
位でヘテロ接合性であり、１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１
のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺
伝子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖
切断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は、
１７～２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：８２、８６、９３、９４、１１５
、１１９、１３５、１７３、１８０、２１３、２１５、２２４、２２５、２６２、２６３
、３０７、３０８、３１９、３２３、３５１、３５２、３７４、４６１、４６２、４６６
、４６７、４７４、４７７、４７８、４９１、５０４、５０５、５３３、５３７、５３８
、５５０、５５６、５６９、５７０、５８３、５８４、６８４、６８５、７１４、７４５
、７９０、７９１、８４５、８４６、８５４、８５７、８５８、８６１、８６３、８６４
、８８０、８８１、８８６、８９０、８９１、９０１、９１１、９１２、９３６、９３７
、９３９、９４０、９６０、９６１、９７２、９７８、９７９、９８３、９８４、１０１
８、１０３４、１０３５、１０４０、１０８６、１１１０、１１１１、１１３５、１１４
４及び１１４５の何れか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチド
の配列を含んでもよい。
【0058】
いくつかの実施形態においては、細胞は、ＥＬＡＮＥ ｒｓ３７６ｌ００５の多型部位
でヘテロ接合性であり、１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１の
ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝
子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切
断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は１７
～２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：２６、５７、６５、６６、７０、１８
７、１８８、１９１、２０６、２２０、２２１、２４３、２４５、２６１、２７５、３５
６、３５７、３９２、４１７、４１８、４３１、４４１、４４２、４４７、４８８、５１
３、５１４、５４５、５４６、５４８、５９８、５９９、６０４、６０７、６０８、６１
２、６１３、６３９、６４８、６５８、６５９、６６０、６８０、６８１、７４２、７４
３、７５５、７５６、７５９、７６２、７６３、７６７、７７１、７７２、７７３、７８
６、７８７、８１５、８１６、８１８、８１９、８２０、８３１、８３６、８４９、８５
０、８７０、８７１、８９８、８９９、９０７、９０８、１００９、１０１０、１０１３
、１０２３、１０２９、１０３０、１０８２、１０８３、４０９３、１０９９、１１００
、１１０１、１１０７、１１０８及び１１８２の何れか１つに記載されている１７～２０
個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。
でヘテロ接合性であり、１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１の
ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝
子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切
断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は１７
～２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：２６、５７、６５、６６、７０、１８
７、１８８、１９１、２０６、２２０、２２１、２４３、２４５、２６１、２７５、３５
６、３５７、３９２、４１７、４１８、４３１、４４１、４４２、４４７、４８８、５１
３、５１４、５４５、５４６、５４８、５９８、５９９、６０４、６０７、６０８、６１
２、６１３、６３９、６４８、６５８、６５９、６６０、６８０、６８１、７４２、７４
３、７５５、７５６、７５９、７６２、７６３、７６７、７７１、７７２、７７３、７８
６、７８７、８１５、８１６、８１８、８１９、８２０、８３１、８３６、８４９、８５
０、８７０、８７１、８９８、８９９、９０７、９０８、１００９、１０１０、１０１３
、１０２３、１０２９、１０３０、１０８２、１０８３、４０９３、１０９９、１１００
、１１０１、１１０７、１１０８及び１１８２の何れか１つに記載されている１７～２０
個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。
【0059】
いくつかの実施形態においては、細胞は、ＥＬＡＮＥ ｒｓ１６８３５６４の多型部位
でヘテロ接合性であり、１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１の
ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝
子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切
断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は１７
～２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：５２、８７、１２２、１６４、１７５
、１９９、２１４、２９０、３２６、３４５、３４６、３７３、４０４、４１２、４３６
、４３７、４５１、４５２、４８３、４８４、５１７、５２０、５２５、６１７、６１８
、６２１、６４１、６６１、６７６、７２２、７３６、８０６、８５５、８５６、８７８
、８７９、８８８、８８９、８９６、９０３、９０５、９１３、９１４、９２９、９３３
、９３４、９３５、９８２、９９８、１０２１、１０２２、１０２６、１０４６、１０４
７、１０５３、１０９７、１１２１、１１２２、１１２４、１１２６、１１２７、１１３
１、１１３４、１１７５、１１７６、１１８３及び１１９０の何れか１つに記載されてい
る１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。
でヘテロ接合性であり、１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１の
ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝
子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切
断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は１７
～２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：５２、８７、１２２、１６４、１７５
、１９９、２１４、２９０、３２６、３４５、３４６、３７３、４０４、４１２、４３６
、４３７、４５１、４５２、４８３、４８４、５１７、５２０、５２５、６１７、６１８
、６２１、６４１、６６１、６７６、７２２、７３６、８０６、８５５、８５６、８７８
、８７９、８８８、８８９、８９６、９０３、９０５、９１３、９１４、９２９、９３３
、９３４、９３５、９８２、９９８、１０２１、１０２２、１０２６、１０４６、１０４
７、１０５３、１０９７、１１２１、１１２２、１１２４、１１２６、１１２７、１１３
１、１１３４、１１７５、１１７６、１１８３及び１１９０の何れか１つに記載されてい
る１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。
【0060】
本発明の実施形態は、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又はＣｙＮに関連しているＥ
ＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞を、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子
変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、対象は
、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である。
ＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞を、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子
変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、対象は
、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である。
【0061】
本発明の実施形態は、第１にＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を
有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、対象は、ｒｓ
１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒ
ｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２
２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４
１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒ
ｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５
、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複
数の多型部位でヘテロ接合性であること、及び対象から細胞を取得することを含む。
有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、対象は、ｒｓ
１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒ
ｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２
２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４
１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒ
ｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５
、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複
数の多型部位でヘテロ接合性であること、及び対象から細胞を取得することを含む。
【0062】
本発明の実施形態は、細胞を対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取
得することを含む。
得することを含む。
【0063】
本発明の実施形態は、細胞を対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む。
【0064】
本発明の実施形態において、組成物を細胞に導入する前に細胞を予備刺激する。
【0065】
本発明の実施形態は、細胞を培養増殖して細胞群を取得することを含む。
【0066】
本発明の実施形態において、細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳ
Ｆのうちの１つ又は複数とともに培養する。
Ｆのうちの１つ又は複数とともに培養する。
【0067】
本発明の実施形態において、細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する。
【0068】
本発明の実施形態において、少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカイ
ンである。
ンである。
【0069】
本発明の実施形態において、細胞は、複数の細胞の中の１つであり、第１のＲＮＡ分子
又は第１及び第２のＲＮＡ分子の両方を含む組成物を、複数の細胞の中の少なくとも細胞
及び他の細胞に導入し、そして複数の細胞の中の少なくとも細胞及び他の細胞中のＥＬＡ
ＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する。
又は第１及び第２のＲＮＡ分子の両方を含む組成物を、複数の細胞の中の少なくとも細胞
及び他の細胞に導入し、そして複数の細胞の中の少なくとも細胞及び他の細胞中のＥＬＡ
ＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する。
【0070】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入すること又は第２の
ＲＮＡ分子の導入は、細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む。
ＲＮＡ分子の導入は、細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む。
【0071】
本発明の実施形態は、本発明の方法によって取得される改変細胞を提供する。
【0072】
本発明の実施形態においては、改変細胞をさらに培養増殖する。
【0073】
本発明の実施形態において、改変細胞は、生着することができる。
【0074】
本発明の実施形態において、改変細胞は、患者に注入すると長期生着することができ、
注入後少なくとも１２か月間で、好ましくは少なくとも２４か月間で、そしてさらに一層
好ましくは注入後少なくとも３０か月間で分化造血細胞を生じる。さらなる実施形態にお
いて、改変細胞は、自家対象に注入すると長期生着することができる。さらなる実施形態
において、改変細胞は、骨髄破壊せずに対象に注入しても長期生着することができる。本
発明の実施形態において、改変細胞は、ヒトである対象に生着すると、長期生着を提供す
る十分な数で対象に送達される。
注入後少なくとも１２か月間で、好ましくは少なくとも２４か月間で、そしてさらに一層
好ましくは注入後少なくとも３０か月間で分化造血細胞を生じる。さらなる実施形態にお
いて、改変細胞は、自家対象に注入すると長期生着することができる。さらなる実施形態
において、改変細胞は、骨髄破壊せずに対象に注入しても長期生着することができる。本
発明の実施形態において、改変細胞は、ヒトである対象に生着すると、長期生着を提供す
る十分な数で対象に送達される。
【0075】
本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、子孫細胞を生じることができ
る。
る。
【0076】
本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、生着後に子孫細胞を生じるこ
とができる。
とができる。
【0077】
本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、自家移植後に子孫細胞を生じ
ることができる。
ることができる。
【0078】
本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、生着後少なくとも１２か月間
又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる。
又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる。
【0079】
１つの実施形態において、細胞又は細胞群は、幹細胞である。１つの実施形態において
、細胞は、胚性幹細胞である。１つの実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞／前駆細
胞（ＨＳＰＣ）である。
、細胞は、胚性幹細胞である。１つの実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞／前駆細
胞（ＨＳＰＣ）である。
【0080】
本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である
。
。
【0081】
本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（
ＰＭＣ）である。
ＰＭＣ）である。
【0082】
本発明の実施形態は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いて
いる改変細胞を提供する。
いる改変細胞を提供する。
【0083】
本発明の実施形態において、改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５
、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２
９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８
０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、
ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４
９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３
０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞
から改変された。
、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２
９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８
０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、
ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４
９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３
０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞
から改変された。
【0084】
本発明の実施形態は、改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【0085】
本発明の実施形態は、本発明の細胞と薬学的に許容される担体とを混合することを含む
、組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法を提供する。
、組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法を提供する。
【0086】
本発明の実施形態は、インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方
法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、
対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４
９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ
２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６
、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０
９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８
ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択され
る１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、及び対象から細胞を取
得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド
配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳ
ＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における第
２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の改変細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着すること
ができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、を含む、方法を提
供する。
法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、
対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４
９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ
２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６
、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０
９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８
ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択され
る１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、及び対象から細胞を取
得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド
配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳ
ＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における第
２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の改変細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着すること
ができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、を含む、方法を提
供する。
【0087】
本発明の実施形態は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は
、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における
第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ
）の細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用を提
供する。
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ
又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は
、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７
４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５
９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ
１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７
４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７
０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における
第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ
）の細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用を提
供する。
【0088】
本発明の実施形態は、治療有効量の本発明の改変細胞、組成物又は方法によって調製さ
れた組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法を提
供する。
れた組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法を提
供する。
【0089】
本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治
療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４
ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４
００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、
ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８
８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７
６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ
１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多
型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
ａ）対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における
第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与し、それにより対象のＳＣ
Ｎ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法を提供する。
療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４
ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４
００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、
ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８
８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７
６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ
１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多
型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
ａ）対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよ
う、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞にお
けるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイ
ド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における
第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することがで
き、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与し、それにより対象のＳＣ
Ｎ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法を提供する。
【0090】
本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する
治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０
４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７
４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９
、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３
８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３
７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒ
ｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の
多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、自家改変細胞
は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断するように改変され、
上記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコー
ドする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を細胞に導入するから生じ、ＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対
立遺伝子を不活性化するよう、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に
影響する、投与すること、を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法を提供する。
治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０
４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７
４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９
、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３
８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３
７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒ
ｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の
多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、自家改変細胞
は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断するように改変され、
上記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコー
ドする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を細胞に導入するから生じ、ＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対
立遺伝子を不活性化するよう、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に
影響する、投与すること、を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法を提供する。
【0091】
本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対
象を選択する方法であって、方法は、
ａ）対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を求めて選別し
、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステッ
プ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された対象の細胞を配列決定することによりｒｓ１０
４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、そして
ｄ）治療のために１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみ
を選択するステップ、を含む方法を提供する。
象を選択する方法であって、方法は、
ａ）対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を求めて選別し
、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステッ
プ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された対象の細胞を配列決定することによりｒｓ１０
４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ
又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、そして
ｄ）治療のために１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみ
を選択するステップ、を含む方法を提供する。
【0092】
本発明の実施形態は、
ｅ）対象の骨髄から末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいず
れかによりＨＳＰＣ細胞を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）のＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼをコードする配列
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヘテロ接合
性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１～１１９２のいずれか１つに
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌク
レオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的
とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数のＨＳＰＣ細
胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼの複合体が第１の二本鎖切断することに影響した１つ又は複数のＨＳＰＣ
細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’Ｕ
ＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること
、
ｇ）対象にステップ（ｆ）の改変細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを
治療すること、を含む、選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療するステップを
さらに含む。
ｅ）対象の骨髄から末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいず
れかによりＨＳＰＣ細胞を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）のＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼをコードする配列
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヘテロ接合
性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１～１１９２のいずれか１つに
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌク
レオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的
とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数のＨＳＰＣ細
胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、第２
のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼの複合体が第１の二本鎖切断することに影響した１つ又は複数のＨＳＰＣ
細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’Ｕ
ＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること
、
ｇ）対象にステップ（ｆ）の改変細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを
治療すること、を含む、選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療するステップを
さらに含む。
【0093】
本発明の実施形態は、配列番号：１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～
２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイ
ド配列部を含むＲＮＡ分子を提供する。
２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイ
ド配列部を含むＲＮＡ分子を提供する。
【0094】
本発明の実施形態は、ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子をさらに含む。
【0095】
本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を
標的とする。
標的とする。
【0096】
本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部のヌクレオチド配列は、
第１のＲＮＡ分子のガイド配列部の配列とは異なるヌクレオチド配列である。
第１のＲＮＡ分子のガイド配列部の配列とは異なるヌクレオチド配列である。
【0097】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合す
る配列を有する部分をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分をさらに含む。
る配列を有する部分をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分をさらに含む。
【0098】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列は、ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ配列である。
ＲＮＡ配列である。
【0099】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分
をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列
を有する部分をさらに含む。
をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列
を有する部分をさらに含む。
【0100】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部分をさら
に含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部分
をさらに含む。
に含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部分
をさらに含む。
【0101】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでであ
る。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでで
ある。
る。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでで
ある。
【0102】
本発明の実施形態において、組成物は、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。本発明の実施
形態において、組成物は、１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は１つ又は複数のｔｒ
ａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む。
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。本発明の実施
形態において、組成物は、１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は１つ又は複数のｔｒ
ａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む。
【0103】
本発明の実施形態は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法で
あって、方法は、細胞に本発明のＲＮＡ分子又は組成物を送達することを含む、方法を提
供する。
あって、方法は、細胞に本発明のＲＮＡ分子又は組成物を送達することを含む、方法を提
供する。
【0104】
本発明の実施形態において、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複
数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及びＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子を
、対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する。
数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及びＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子を
、対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する。
【0105】
本発明の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮ
Ａ分子をコードする配列及びＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子を、対象及び／又は細胞に
実質的に同時に又は異なる時間に送達する。
Ａ分子をコードする配列及びＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子を、対象及び／又は細胞に
実質的に同時に又は異なる時間に送達する。
【0106】
本発明の実施形態において、方法は、
変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することを含み、第１のＲＮ
Ａ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、エキソンのエキソン全体又は部分に隣接してい
る領域を標的とする。
変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することを含み、第１のＲＮ
Ａ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、エキソンのエキソン全体又は部分に隣接してい
る領域を標的とする。
【0107】
本発明の実施形態において、方法は、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体、複
数のエキソンを除去すること、又は遺伝子全体を除去することを含む。
数のエキソンを除去すること、又は遺伝子全体を除去することを含む。
【0108】
本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、変異
対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的と
する。
対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的と
する。
【0109】
本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子
の両方に存在する配列を標的とする。
の両方に存在する配列を標的とする。
【0110】
本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とする。
【0111】
本発明の実施形態において、方法は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構
により変異対立遺伝子に挿入又は除去を受けさせ、変異対立遺伝子の配列にフレームシフ
トを生じさせることを生じる。
により変異対立遺伝子に挿入又は除去を受けさせ、変異対立遺伝子の配列にフレームシフ
トを生じさせることを生じる。
【0112】
本発明の実施形態において、フレームシフトは、変異対立遺伝子の不活性化又はノック
アウトを生じる。
アウトを生じる。
【0113】
本発明の実施形態において、フレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コド
ンが作成されるか、フレームシフトにより変異対立遺伝子の転写物のナンセンス変異依存
ｍＲＮＡ分解機構が生じる。
ンが作成されるか、フレームシフトにより変異対立遺伝子の転写物のナンセンス変異依存
ｍＲＮＡ分解機構が生じる。
【0114】
本発明の実施形態において、不活性化又は治療により変異対立遺伝子によってコードさ
れる切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生
じる。
れる切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生
じる。
【0115】
本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ
００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体
が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。
００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体
が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。
【0116】
本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ
００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体
が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。
００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体
が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。
【0117】
本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ
００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体
が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。
００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体
が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。
【0118】
本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であ
り、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン４における二本鎖切断に影響する。
り、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン４における二本鎖切断に影響する。
【0119】
本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であ
り、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン３における二本鎖切断に影響する。
り、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイ
ントロン３における二本鎖切断に影響する。
【0120】
本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であ
り、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３
’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。
り、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３
’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。
【0121】
本発明の実施形態は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、本発
明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物の使用を提供
する。
明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物の使用を提供
する。
【0122】
本発明の実施形態は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための
、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を含む
薬物であって、細胞に本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製
された組成物を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を含む
薬物であって、細胞に本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製
された組成物を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
【0123】
本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象における
ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、本発明の方法、本発明の改変細胞、
本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物、又は本発明のＲＮＡ分子の使
用を提供する。
ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、本発明の方法、本発明の改変細胞、
本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物、又は本発明のＲＮＡ分子の使
用を提供する。
【0124】
本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、本発
明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改
変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、
本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明
の改変細胞を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改
変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、
本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明
の改変細胞を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。
【0125】
本発明の実施形態は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮ
Ａ分子をコードする配列、及び細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、
ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を細胞に送達
するための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキッ
トを提供する。
Ｒヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮ
Ａ分子をコードする配列、及び細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、
ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を細胞に送達
するための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキッ
トを提供する。
【0126】
本発明の実施形態は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮ
Ａ分子をコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するようＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒ
ＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有す
るリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療す
るためのキットを提供する。
Ｒヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮ
Ａ分子をコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するようＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒ
ＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有す
るリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療す
るためのキットを提供する。
【0127】
本発明の実施形態は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本
発明の改変細胞、及び細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう組成物を細胞に送達す
るための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット
を提供する。
発明の改変細胞、及び細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう組成物を細胞に送達す
るための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット
を提供する。
【0128】
本発明の実施形態は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本
発明の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう本発明の組成物、本発明の方法に
より調製された組成物、又は本発明の改変細胞をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリ
スクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するた
めのキットを提供する。
発明の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう本発明の組成物、本発明の方法に
より調製された組成物、又は本発明の改変細胞をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリ
スクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するた
めのキットを提供する。
【0129】
定義
特に規定がない限り、本明細書において使用される技術的及び／又は科学的用語は、本
発明が属する技術分野における当業者の一人によって一般的に理解されるのと同一の意味
を有する。本明細書において記載されるものと類似する又は同等の方法及び材料を本発明
の実施形態の実施又は試験において使用することができるがも、例示的な方法及び／又は
材料は以下に記載されるものである。矛盾のある場合、定義を含む、特許明細書が支配す
るであろう。さらに、材料、方法及び実施例は例証にすぎず、必ずしも制限することを意
図するものではない。
特に規定がない限り、本明細書において使用される技術的及び／又は科学的用語は、本
発明が属する技術分野における当業者の一人によって一般的に理解されるのと同一の意味
を有する。本明細書において記載されるものと類似する又は同等の方法及び材料を本発明
の実施形態の実施又は試験において使用することができるがも、例示的な方法及び／又は
材料は以下に記載されるものである。矛盾のある場合、定義を含む、特許明細書が支配す
るであろう。さらに、材料、方法及び実施例は例証にすぎず、必ずしも制限することを意
図するものではない。
【0130】
用語「ａ」及び「ａｎ」は、上で、そして本明細書の他の場所で使用するとき、列挙さ
れる構成要素の「１つ又は複数」を指すと理解されるべきである。単数形の使用には、特
に他に明言されない限り複数形も含まれることは当業者の一人にとって明らかであろう。
したがって、用語「ａ」、「ａｎ」及び「少なくとも１つの」は、本出願において交換可
能に使用される。
れる構成要素の「１つ又は複数」を指すと理解されるべきである。単数形の使用には、特
に他に明言されない限り複数形も含まれることは当業者の一人にとって明らかであろう。
したがって、用語「ａ」、「ａｎ」及び「少なくとも１つの」は、本出願において交換可
能に使用される。
【0131】
本教示をより良く理解することを目的として、そして本教示の範囲を決して制限せず、
他に示されない限り、本明細書及び請求項において使用される量、割合又は比率、及び他
の数値を表現する全ての数字は、用語「訳」によって全ての事例において修正されるとし
て理解されるべきである。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、以下の明細
書及び添付の特許請求項に記載されている数値パラメーターは、取得しようとする所望の
特性に依存して変動することができる近似である。最低限各数値パラメーターは、報告さ
れた有効数字の数を考慮して、そして通常の端数処理方法を適用することにより少なくと
も解釈されるべきである。
他に示されない限り、本明細書及び請求項において使用される量、割合又は比率、及び他
の数値を表現する全ての数字は、用語「訳」によって全ての事例において修正されるとし
て理解されるべきである。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、以下の明細
書及び添付の特許請求項に記載されている数値パラメーターは、取得しようとする所望の
特性に依存して変動することができる近似である。最低限各数値パラメーターは、報告さ
れた有効数字の数を考慮して、そして通常の端数処理方法を適用することにより少なくと
も解釈されるべきである。
【0132】
特に明言されない限り、本発明の実施形態の特徴又は特徴群特有の条件又は関係を修正
する「実質的に」及び「およそ」などの形容詞は、この条件又は特質が、それが意図され
る適用にとって、実施形態の工程として許容できる範囲内と定義されるという意味と理解
される。特に他に指示がない限り、本明細書及び請求項における単語「ｏｒ」は、排他的
なｏｒよりむしろ包括的な「ｏｒ」とみなされ、それが結合する項目の少なくとも１つ又
は任意の組み合わせを示す。
する「実質的に」及び「およそ」などの形容詞は、この条件又は特質が、それが意図され
る適用にとって、実施形態の工程として許容できる範囲内と定義されるという意味と理解
される。特に他に指示がない限り、本明細書及び請求項における単語「ｏｒ」は、排他的
なｏｒよりむしろ包括的な「ｏｒ」とみなされ、それが結合する項目の少なくとも１つ又
は任意の組み合わせを示す。
【0133】
本出願の記述及び請求項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌ
ｕｄｅ）」及び「有する」の動詞並びにその活用形は、動詞の対象又は対象群が必ずしも
構成要素、要素又は動詞の対象若しくは対象群の部分の完全な一覧表ではないことを示す
よう使用される。本明細書において使用される他の用語は、当該技術分野において周知の
意味によって定義される。
ｕｄｅ）」及び「有する」の動詞並びにその活用形は、動詞の対象又は対象群が必ずしも
構成要素、要素又は動詞の対象若しくは対象群の部分の完全な一覧表ではないことを示す
よう使用される。本明細書において使用される他の用語は、当該技術分野において周知の
意味によって定義される。
【0134】
本明細書において使用するとき、用語「ヘテロ接合一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、集
団内の対である染色体間で異なるゲノム中の単一のヌクレオチドの位置を指す。本明細書
において使用するとき、この位置で最も一般的な又は最も普及しているヌクレオチド塩基
は、参照（ＲＥＦ）、野生型（ＷＴ）、共通又は主要形と呼ばれる。この位置であまり普
及していないヌクレオチド塩基は、代替（ＡＬＴ）、少数、希少又はバリアント形と呼ば
れる。
団内の対である染色体間で異なるゲノム中の単一のヌクレオチドの位置を指す。本明細書
において使用するとき、この位置で最も一般的な又は最も普及しているヌクレオチド塩基
は、参照（ＲＥＦ）、野生型（ＷＴ）、共通又は主要形と呼ばれる。この位置であまり普
及していないヌクレオチド塩基は、代替（ＡＬＴ）、少数、希少又はバリアント形と呼ば
れる。
【0135】
ＲＮＡ分子の「ガイド配列部」は、特異的な標的ＤＮＡ配列にハイブリッド形成できる
ヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部は、ガイド配列部の長さにわたって標的
とされるＤＮＡ配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形
態においては、ガイド配列部は、長さが１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は
２４ヌクレオチド、又は長さがおよそ１７～２４、１８～２２、１９～２２、１８～２０
又は１７～２０ヌクレオチドである。ガイド配列部の全長は、ガイド配列部の長さにわた
って標的とされるＤＮＡ配列と完全に相補的である。ガイド配列部は、ガイド配列部がＣ
ＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的部として働くＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成す
ることができるＲＮＡ分子の一部であってもよい。ガイド配列部を有するＤＮＡ分子がＣ
ＲＩＳＰＲ分子と同時に存在すると、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特異的
な標的ＤＮＡ配列に対して標的とすることができる。各可能性は、別々の実施形態を表す
。ＲＮＡ分子は、いかなる望みの配列を標的とするようカスタム設計することができる。
ヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部は、ガイド配列部の長さにわたって標的
とされるＤＮＡ配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形
態においては、ガイド配列部は、長さが１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は
２４ヌクレオチド、又は長さがおよそ１７～２４、１８～２２、１９～２２、１８～２０
又は１７～２０ヌクレオチドである。ガイド配列部の全長は、ガイド配列部の長さにわた
って標的とされるＤＮＡ配列と完全に相補的である。ガイド配列部は、ガイド配列部がＣ
ＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的部として働くＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成す
ることができるＲＮＡ分子の一部であってもよい。ガイド配列部を有するＤＮＡ分子がＣ
ＲＩＳＰＲ分子と同時に存在すると、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特異的
な標的ＤＮＡ配列に対して標的とすることができる。各可能性は、別々の実施形態を表す
。ＲＮＡ分子は、いかなる望みの配列を標的とするようカスタム設計することができる。
【0136】
用語「標的とする」は本明細書において使用するとき、ＲＮＡ分子が標的とされるヌク
レオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリッドを形成するガイド配列部を指す。用語
「標的とする」は、標的とされるヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリッド
形成するが、標的上のハイブリッド形成に加えて意図していないオフターゲットのハイブ
リッド形成も起きるかもしれないような、可変的なハイブリッド形成効率を包含すると理
解される。ＲＮＡ分子がある配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ分子の複合体がヌクレアーゼ活性のためにこの配列を標的とすると理解される。
レオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリッドを形成するガイド配列部を指す。用語
「標的とする」は、標的とされるヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリッド
形成するが、標的上のハイブリッド形成に加えて意図していないオフターゲットのハイブ
リッド形成も起きるかもしれないような、可変的なハイブリッド形成効率を包含すると理
解される。ＲＮＡ分子がある配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ分子の複合体がヌクレアーゼ活性のためにこの配列を標的とすると理解される。
【0137】
複数の細胞に存在するＤＮＡ配列を標的とするという文脈においては、この標的とする
ことは、ＲＮＡ分子のガイド配列部が１つ又は複数の細胞の配列とハイブリッド形成する
ことを包含し、またＲＮＡ分子が複数の細胞のうち全てより少ない細胞の標的配列とハイ
ブリッド形成することを包含すると理解される。したがって、ＲＮＡ分子が複数の細胞の
配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が１つ又は複数
の細胞の標的配列とハイブリッド形成すると理解され、また全てより少ない細胞の標的配
列とハイブリッド形成してもよいと理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼの複合体が１つ又は複数の細胞の標的配列とハイブリッド形成するのと関連
して二本鎖切断を導入し、また全てより少ない細胞の標的配列とハイブリッド形成するの
と関連して二本鎖切断を導入してもよい。本明細書において使用するとき、用語「改変細
胞」は、標的配列とのハイブリッド形成、すなわち標的上のハイブリッド形成の結果とし
てＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体により二本鎖切断が引き起こされた細
胞を指す。
ことは、ＲＮＡ分子のガイド配列部が１つ又は複数の細胞の配列とハイブリッド形成する
ことを包含し、またＲＮＡ分子が複数の細胞のうち全てより少ない細胞の標的配列とハイ
ブリッド形成することを包含すると理解される。したがって、ＲＮＡ分子が複数の細胞の
配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が１つ又は複数
の細胞の標的配列とハイブリッド形成すると理解され、また全てより少ない細胞の標的配
列とハイブリッド形成してもよいと理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼの複合体が１つ又は複数の細胞の標的配列とハイブリッド形成するのと関連
して二本鎖切断を導入し、また全てより少ない細胞の標的配列とハイブリッド形成するの
と関連して二本鎖切断を導入してもよい。本明細書において使用するとき、用語「改変細
胞」は、標的配列とのハイブリッド形成、すなわち標的上のハイブリッド形成の結果とし
てＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体により二本鎖切断が引き起こされた細
胞を指す。
【0138】
本発明の実施形態において、ＲＮＡガイド分子は、変異対立遺伝子の多型部位に存在す
るヌクレオチド塩基に基づいて変異対立遺伝子を標的としてもよい。
るヌクレオチド塩基に基づいて変異対立遺伝子を標的としてもよい。
【0139】
本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号：１～１１９２のいずれか１つに
記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、７５、７６、２５２、２５３、２８
７、２９５、２９６、３１１、５３６、５９２、５９５、５９６、５９７、６９５、７２
９、７３７、８１２、８３９、９１５、９４７、１０４８、１０４９、１０７０、１０７
１、１１６９に記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、７５、７６、９３、
９４、９７、９８、１４８、１４９、１７１、１７３、１８０、１８２、１８３、１８４
、１８７、１８８、２１３、２３２、２３４、２４９、２５２、２５３、２６４、２７２
、２８７、２９１、２９５、２９６、３０５、３０６、３０７、３０８、３１１、３２６
、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３４０、３５１、３５２、３５８、３５９
、３７８、３７９、３８５、３８８、３９９、４０８、４１０、４１９、４２０、４２６
、４２７、４２８、４２９、４３０、４３６、４３７、４４９、４５０、４６５、４６８
、４７６、４７７、４７８、４８０、４９５、４９７、４９９、５００、５０８、５１１
、５２１、５２２、５２３、５２４、５２９、５３０、５３２、５３６、５４２、５４５
、５４６、５６４、５６５、５６６、５７３、５７４、５８３、５８４、５９１、５９２
、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０４、６１２、６１３
、６１６、６２２、６２３、６３４、６４４、６４５、６５８、６５９、６６１、６７０
、６７１、６７８、６８０、６８１、６８４、６８５、６８８、６８９、６９４、６９５
、７１４、７１５、７１６、７２２、７２３、７２４、７２９、７３６、７３７、７３９
、７４０、７４５、７５５、７５６、７６０、７６１、７６９、７７０、７７１、７７２
、７７５、７７６、７８６、７８７、８０６、８０９、８１２、８１８、８１９、８２１
、８２２、８２６、８２９、８３０、８３３、８３４、８３９、８４５、８４６、８６１
、８６２、８７４、８７５、８７６、８７７、８８４、８８８、８８９、８９０、８９１
、８９３、８９４、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９２５、９２８、９３０
、９３１、９３９、９４０、９４２、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５７
、９７２、９７４、９８２、９９４、９９８、１００６、１００７、１００８、１０２１
、１０２２、１０２６、１０２７、１０２８、１０３１、１０３２、１０３４、１０３５
、１０３９、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５７、１０７０、１０７１
、１０７２、１０７４、１０７５、１０７６、１０７９、１０８４、１０９０、１０９１
、１０９３、１０９４、１０９５、１１１２、１１１３、１１１６、１１１７、１１１８
、１１１９、１１２１、１１２２、１１２４、１１４０、１１６８、１１６９、１１７０
、１１７１、１１７９に記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、１０、１３
、１４、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３４、３５、３６、
３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５
５、５７、５８、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、８２、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、
９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０７、１０８、１
０９．１１５、１１９、１２２、１２３．１２４．１２５．１２６、１２７、１２８、１
３０、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１
４２、１４３、１４４、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５６、１
５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６７、１６８、１６９、１
７０、１７１、１７２、１７３、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１
８１、１８２、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１
９５、１９６、１９８、１９９、２０１、２０３、２０６、２０９、２１１、２１２、２
１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２
２５、２２６、２２７、２３２、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２４０、２
４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２
５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６１、２６２、２６３、２６４、２
６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２
７６、２７７、２８１、２８２、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２
９３、２９４、２９５、２９６、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３０８、３
１０、３１１、３１４、３１９、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３１、３
３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３
４３、３４４、３４５、３４６、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３
５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６３、３６４、３６６、３７０、３７１、３
７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３
８２、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３
９４、３９５、３９６、３９７、３９９、４００、４０４、４０５、４０６、４０７、４
０８、４１０、４１１、４１２、４１５、４１７、４１８、４１９、４２０、４２２、４
２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４
３３、４３５、４３６、４３７、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４
４６、４４７、４４９、４５０、４５１、４５２、４５４、４５５、４５６、４５７、４
６０、４６１、４６２、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４
７１、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８３、４８４、４
８５、４８６、４８８、４８９、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４
９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０４、５０５、５０６、５０８、５
０９、５１０、５１１、５１３、５１４、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５
２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５
３２、５３３、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５
４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５２、５５３、５５４、５
５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５
６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７３、５７４、５７７、５
７９、５８０、５８２、５８３、５８４、５８６、５８７、５８８、５９０、５９１、５
９２、５９３、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６
０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１２、６１３、６１４、６
１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６
２５、６２８、６２９、６３０、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６
３９、６４０、６４１、６４４、６４５、６４８、６５０、６５１、６５２、６５３、６
５４、６５５、６５８、６５９、６６０、６６１、６６３、６６４、６６５、６６７、６
７０、６７１、６７２、６７３、６７５、６７６、６７８、６８０、６８１、６８３、６
８４、６８５、６８６、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９４、６９５、６
９８、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７
０９、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１８、７１９、７２０、７２２、７
２３、７２４、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７
３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４２、７４３、７４４、７４５、７
４６、７４７、７４８、７４９、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７
５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６７、７６９、７７０、７７１、７
７２、７７３、７７５、７７６、７７８、７７９、７８０、７８１、７８６、７８７、７
８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９４、７９５、７９８、８００、８０１、８
０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８
１６、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２６、８２９、８３０、８
３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４３、８
４４、８４５、８４６、８４９、８５０、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８
５７、８５８、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８
７０、８７１、８７２、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８
８１、８８２、８８３、８８４、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８
９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９０１、９０２、９０３、９
０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９
１５、９１６、９１７、９２０、９２１、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９
３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３９、９４０、９
４２、９４３、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９
５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９６０、９６１、９６２、９６３、９
６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７２、９７４、９７５、９７６、９
７８、９７９、９８２、９８３、９８４、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９
９３、９９４、９９６、９９７、９９８、１００１、１００２、１００３、１００４、１
００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１
０１３、１０１４、１０１５、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１
０２２、１０２３、１０２４、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１
０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１
０３９、１０４０、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１
０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１
０５６、１０５７、１０５８、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６９、１
０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１
０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８６、１
０９０、１０９１、１０９３、１０９４、１０９５、１０９７、１０９９、１１００、１
１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０７、１１０８、１１１０、１
１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１
１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２６、１１２７、１
１２８、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１
１３８、１１３９、１１４０、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４７、１
１４８、１１４９、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１
１５８、１１５９、１１６０、１１６２、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１
１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７５、１１７６、１
１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３に記載されている１７～２０個の近接
しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含
む。本発明のいかなる実施形態においても、ＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１
～１１９２の任意の単一の配列に、又は配列の上記グループからの任意の単一の配列に、
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含んでもよいと理解される。
記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、７５、７６、２５２、２５３、２８
７、２９５、２９６、３１１、５３６、５９２、５９５、５９６、５９７、６９５、７２
９、７３７、８１２、８３９、９１５、９４７、１０４８、１０４９、１０７０、１０７
１、１１６９に記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、７５、７６、９３、
９４、９７、９８、１４８、１４９、１７１、１７３、１８０、１８２、１８３、１８４
、１８７、１８８、２１３、２３２、２３４、２４９、２５２、２５３、２６４、２７２
、２８７、２９１、２９５、２９６、３０５、３０６、３０７、３０８、３１１、３２６
、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３４０、３５１、３５２、３５８、３５９
、３７８、３７９、３８５、３８８、３９９、４０８、４１０、４１９、４２０、４２６
、４２７、４２８、４２９、４３０、４３６、４３７、４４９、４５０、４６５、４６８
、４７６、４７７、４７８、４８０、４９５、４９７、４９９、５００、５０８、５１１
、５２１、５２２、５２３、５２４、５２９、５３０、５３２、５３６、５４２、５４５
、５４６、５６４、５６５、５６６、５７３、５７４、５８３、５８４、５９１、５９２
、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０４、６１２、６１３
、６１６、６２２、６２３、６３４、６４４、６４５、６５８、６５９、６６１、６７０
、６７１、６７８、６８０、６８１、６８４、６８５、６８８、６８９、６９４、６９５
、７１４、７１５、７１６、７２２、７２３、７２４、７２９、７３６、７３７、７３９
、７４０、７４５、７５５、７５６、７６０、７６１、７６９、７７０、７７１、７７２
、７７５、７７６、７８６、７８７、８０６、８０９、８１２、８１８、８１９、８２１
、８２２、８２６、８２９、８３０、８３３、８３４、８３９、８４５、８４６、８６１
、８６２、８７４、８７５、８７６、８７７、８８４、８８８、８８９、８９０、８９１
、８９３、８９４、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９２５、９２８、９３０
、９３１、９３９、９４０、９４２、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５７
、９７２、９７４、９８２、９９４、９９８、１００６、１００７、１００８、１０２１
、１０２２、１０２６、１０２７、１０２８、１０３１、１０３２、１０３４、１０３５
、１０３９、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５７、１０７０、１０７１
、１０７２、１０７４、１０７５、１０７６、１０７９、１０８４、１０９０、１０９１
、１０９３、１０９４、１０９５、１１１２、１１１３、１１１６、１１１７、１１１８
、１１１９、１１２１、１１２２、１１２４、１１４０、１１６８、１１６９、１１７０
、１１７１、１１７９に記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、１０、１３
、１４、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３４、３５、３６、
３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５
５、５７、５８、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、８２、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、
９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０７、１０８、１
０９．１１５、１１９、１２２、１２３．１２４．１２５．１２６、１２７、１２８、１
３０、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１
４２、１４３、１４４、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５６、１
５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６７、１６８、１６９、１
７０、１７１、１７２、１７３、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１
８１、１８２、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１
９５、１９６、１９８、１９９、２０１、２０３、２０６、２０９、２１１、２１２、２
１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２
２５、２２６、２２７、２３２、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２４０、２
４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２
５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６１、２６２、２６３、２６４、２
６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２
７６、２７７、２８１、２８２、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２
９３、２９４、２９５、２９６、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３０８、３
１０、３１１、３１４、３１９、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３１、３
３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３
４３、３４４、３４５、３４６、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３
５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６３、３６４、３６６、３７０、３７１、３
７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３
８２、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３
９４、３９５、３９６、３９７、３９９、４００、４０４、４０５、４０６、４０７、４
０８、４１０、４１１、４１２、４１５、４１７、４１８、４１９、４２０、４２２、４
２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４
３３、４３５、４３６、４３７、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４
４６、４４７、４４９、４５０、４５１、４５２、４５４、４５５、４５６、４５７、４
６０、４６１、４６２、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４
７１、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８３、４８４、４
８５、４８６、４８８、４８９、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４
９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０４、５０５、５０６、５０８、５
０９、５１０、５１１、５１３、５１４、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５
２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５
３２、５３３、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５
４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５２、５５３、５５４、５
５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５
６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７３、５７４、５７７、５
７９、５８０、５８２、５８３、５８４、５８６、５８７、５８８、５９０、５９１、５
９２、５９３、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６
０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１２、６１３、６１４、６
１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６
２５、６２８、６２９、６３０、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６
３９、６４０、６４１、６４４、６４５、６４８、６５０、６５１、６５２、６５３、６
５４、６５５、６５８、６５９、６６０、６６１、６６３、６６４、６６５、６６７、６
７０、６７１、６７２、６７３、６７５、６７６、６７８、６８０、６８１、６８３、６
８４、６８５、６８６、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９４、６９５、６
９８、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７
０９、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１８、７１９、７２０、７２２、７
２３、７２４、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７
３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４２、７４３、７４４、７４５、７
４６、７４７、７４８、７４９、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７
５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６７、７６９、７７０、７７１、７
７２、７７３、７７５、７７６、７７８、７７９、７８０、７８１、７８６、７８７、７
８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９４、７９５、７９８、８００、８０１、８
０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８
１６、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２６、８２９、８３０、８
３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４３、８
４４、８４５、８４６、８４９、８５０、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８
５７、８５８、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８
７０、８７１、８７２、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８
８１、８８２、８８３、８８４、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８
９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９０１、９０２、９０３、９
０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９
１５、９１６、９１７、９２０、９２１、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９
３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３９、９４０、９
４２、９４３、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９
５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９６０、９６１、９６２、９６３、９
６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７２、９７４、９７５、９７６、９
７８、９７９、９８２、９８３、９８４、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９
９３、９９４、９９６、９９７、９９８、１００１、１００２、１００３、１００４、１
００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１
０１３、１０１４、１０１５、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１
０２２、１０２３、１０２４、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１
０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１
０３９、１０４０、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１
０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１
０５６、１０５７、１０５８、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６９、１
０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１
０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８６、１
０９０、１０９１、１０９３、１０９４、１０９５、１０９７、１０９９、１１００、１
１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０７、１１０８、１１１０、１
１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１
１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２６、１１２７、１
１２８、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１
１３８、１１３９、１１４０、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４７、１
１４８、１１４９、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１
１５８、１１５９、１１６０、１１６２、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１
１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７５、１１７６、１
１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３に記載されている１７～２０個の近接
しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含
む。本発明のいかなる実施形態においても、ＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１
～１１９２の任意の単一の配列に、又は配列の上記グループからの任意の単一の配列に、
記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含んでもよいと理解される。
【0140】
本明細書において使用するとき、配列番号に記載されている「近接しているヌクレオチ
ド」は、いかなるヌクレオチドも介在しないで配列番号に記載されている順序のヌクレオ
チドの配列であるヌクレオチドを指す。
ド」は、いかなるヌクレオチドも介在しないで配列番号に記載されている順序のヌクレオ
チドの配列であるヌクレオチドを指す。
【0141】
本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドであっても
よく、配列番号：１～１１９２の任意の１つに記載されている２０個の近接しているヌク
レオチドの配列である２０個のヌクレオチドから構成される。本発明の実施形態において
、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドより短くてもよい。例えば、本発明の実
施形態において、ガイド配列部は、長さが１７、１８又は１９個のヌクレオチドであって
もよい。このような実施形態において、ガイド配列部は、それぞれ配列番号：１～１１９
２の任意の１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の、
１７、１８又は１９個のヌクレオチドから構成されてもよい。例えば、配列番号：１に記
載されている１７個の近接しているヌクレオチドの配列である１７個のヌクレオチドを有
するガイド配列部は、以下のヌクレオチド配列の任意の１つから構成されてもよい（近接
している配列から除外されるヌクレオチドを取り消し線で印をつけた）。
よく、配列番号：１～１１９２の任意の１つに記載されている２０個の近接しているヌク
レオチドの配列である２０個のヌクレオチドから構成される。本発明の実施形態において
、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドより短くてもよい。例えば、本発明の実
施形態において、ガイド配列部は、長さが１７、１８又は１９個のヌクレオチドであって
もよい。このような実施形態において、ガイド配列部は、それぞれ配列番号：１～１１９
２の任意の１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の、
１７、１８又は１９個のヌクレオチドから構成されてもよい。例えば、配列番号：１に記
載されている１７個の近接しているヌクレオチドの配列である１７個のヌクレオチドを有
するガイド配列部は、以下のヌクレオチド配列の任意の１つから構成されてもよい（近接
している配列から除外されるヌクレオチドを取り消し線で印をつけた）。
【0142】
本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドより長くて
もよい。例えば、本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２１、２２、２３
又は２４個のヌクレオチドであってもよい。このような実施形態において、ガイド配列部
は、配列番号：１～１１９２の任意の１つに記載されている２０個の近接しているヌクレ
オチドの配列である２０個のヌクレオチド及び標的配列の３’末端、標的配列の５’末端
又は両方に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチドの配列に完全に相補的な追加のヌクレ
オチドを含む。
もよい。例えば、本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２１、２２、２３
又は２４個のヌクレオチドであってもよい。このような実施形態において、ガイド配列部
は、配列番号：１～１１９２の任意の１つに記載されている２０個の近接しているヌクレ
オチドの配列である２０個のヌクレオチド及び標的配列の３’末端、標的配列の５’末端
又は両方に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチドの配列に完全に相補的な追加のヌクレ
オチドを含む。
【0143】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイド配列部を含むＲＮＡ
分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断を引き起こすＣＲＩＳＰＲ複合
体を形成する。Ｃｐｆｌ等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、さらにｔｒａｃｒＲＮＡ分
子なしでＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成して
もよい。あるいは、Ｃａｓ９等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい
。
分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断を引き起こすＣＲＩＳＰＲ複合
体を形成する。Ｃｐｆｌ等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、さらにｔｒａｃｒＲＮＡ分
子なしでＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成して
もよい。あるいは、Ｃａｓ９等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい
。
【0144】
本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を含ん
でもよい。このような実施形態を、ＲＮＡ分子のガイド部とトランス活性化型ｃｒＲＮＡ
（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の合成融合物として設計してもよい。（Ｊｉｎｅｋ（２０１２）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ参照）。本発明の実施形態は、また別々のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド
配列部を含む別々のＲＮＡ分子を利用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。このよ
うな実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子と塩基対形成を介してハイ
ブリッドを形成してもよく、本明細書に記載される発明の特定の応用において有利になる
ことができる。
でもよい。このような実施形態を、ＲＮＡ分子のガイド部とトランス活性化型ｃｒＲＮＡ
（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の合成融合物として設計してもよい。（Ｊｉｎｅｋ（２０１２）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ参照）。本発明の実施形態は、また別々のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド
配列部を含む別々のＲＮＡ分子を利用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。このよ
うな実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子と塩基対形成を介してハイ
ブリッドを形成してもよく、本明細書に記載される発明の特定の応用において有利になる
ことができる。
【0145】
用語「ｔｒａｃｒメイト配列」は、ｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対形成を介してハイブリッ
ドを形成し、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するようｔｒａｃｒＲＮＡ分子と十分に相
補的な配列を指す。（ＵＳ８９０６６１６参照）。本発明の実施形態において、ＲＮＡ分
子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分をさらに含んでもよい。
ドを形成し、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するようｔｒａｃｒＲＮＡ分子と十分に相
補的な配列を指す。（ＵＳ８９０６６１６参照）。本発明の実施形態において、ＲＮＡ分
子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分をさらに含んでもよい。
【0146】
本発明の実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、長さが３００、２９０、２８０、２７０、２
６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１
６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０又は１００個のヌクレオチドまでであっ
てもよい。各可能性は、別々の実施形態を表す。本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子
は、長さが１７～３００個のヌクレオチド、長さが１００～３００個のヌクレオチド、長
さが１５０～３００個のヌクレオチド、長さが２００～３００個のヌクレオチド、長さが
１００～２００個のヌクレオチド又は長さが１５０～２５０個のヌクレオチドであっても
よい。各可能性は、別々の実施形態を表す。
６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１
６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０又は１００個のヌクレオチドまでであっ
てもよい。各可能性は、別々の実施形態を表す。本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子
は、長さが１７～３００個のヌクレオチド、長さが１００～３００個のヌクレオチド、長
さが１５０～３００個のヌクレオチド、長さが２００～３００個のヌクレオチド、長さが
１００～２００個のヌクレオチド又は長さが１５０～２５０個のヌクレオチドであっても
よい。各可能性は、別々の実施形態を表す。
【0147】
本開示の目的においては、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、及び遺
伝子産物の合成を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列はコード及び／
又は転写配列に隣接してもしなくてもよい。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、
ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位等の翻訳調節配列、エ
ンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製開始点、マトリックス結合
領域及び遺伝子座調節領域を含むが、かならずしもこれらに限定されるものではない。
伝子産物の合成を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列はコード及び／
又は転写配列に隣接してもしなくてもよい。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、
ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位等の翻訳調節配列、エ
ンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製開始点、マトリックス結合
領域及び遺伝子座調節領域を含むが、かならずしもこれらに限定されるものではない。
【0148】
「真核」細胞は、真菌細胞（酵母菌等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト
細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【0149】
本明細書において使用するとき、用語ＨＳＰＣは、造血幹細胞及び造血幹前駆細胞の両
方を指す。幹細胞の非限定的な例は、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、多能性前駆細胞、系統
限定前駆細胞を含む。
方を指す。幹細胞の非限定的な例は、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、多能性前駆細胞、系統
限定前駆細胞を含む。
【0150】
本明細書において使用するとき、「前駆細胞」は、幹細胞に由来し、有糸分裂能力及び
多分化能（例えば、１つより多いが全ての種類ではない細胞の成熟系統へと分化又は発達
することができる）を保持する系統細胞を指す。本明細書において使用するとき、「造血
」又は「赤血球産生」は、各種種類の血液細胞（例えば、赤血球、巨核球、骨髄球（例え
ば、単球、マクロファージ及び好中球）ならびにリンパ球）ならびに体内（骨髄中等）で
形成される他の要素を指す。
多分化能（例えば、１つより多いが全ての種類ではない細胞の成熟系統へと分化又は発達
することができる）を保持する系統細胞を指す。本明細書において使用するとき、「造血
」又は「赤血球産生」は、各種種類の血液細胞（例えば、赤血球、巨核球、骨髄球（例え
ば、単球、マクロファージ及び好中球）ならびにリンパ球）ならびに体内（骨髄中等）で
形成される他の要素を指す。
【0151】
用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書において使用するとき、核酸のヌクレオチドサブユ
ニット間のホスホジエステル結合を開裂することができる酵素を指す。ヌクレアーゼは、
天然源から分離されても由来してもよい。天然源は、任意の生存生物であってもよい。あ
るいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合開裂能を保持する改変又は合成タンパク
質であってもよい。ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して遺伝子
改変を成し遂げることができる。
ニット間のホスホジエステル結合を開裂することができる酵素を指す。ヌクレアーゼは、
天然源から分離されても由来してもよい。天然源は、任意の生存生物であってもよい。あ
るいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合開裂能を保持する改変又は合成タンパク
質であってもよい。ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して遺伝子
改変を成し遂げることができる。
【0152】
本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在
するヘテロ接合性多型部位を標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子
の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬ
Ｔを標的とする。
するヘテロ接合性多型部位を標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子
の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬ
Ｔを標的とする。
【0153】
本開示は、一方の対立遺伝子は変異が疾患表現型を生じる変異タンパク質をコードする
ような変異を保持し（「変異対立遺伝子」）、他方の対立遺伝子は機能性タンパク質をコ
ードする（「機能性対立遺伝子」）、遺伝子の２個の対立遺伝子間を識別／区別するため
に少なくとも１つの自然発生のヌクレオチドの差又は遺伝子多型（一塩基多型（ＳＮＰ）
等）を利用する方法を提供する。方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能
性タンパク質の発現を許容するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、方
法は、ドミナントネガティブな遺伝性障害を治療、寛解又は予防するための方法である。
ような変異を保持し（「変異対立遺伝子」）、他方の対立遺伝子は機能性タンパク質をコ
ードする（「機能性対立遺伝子」）、遺伝子の２個の対立遺伝子間を識別／区別するため
に少なくとも１つの自然発生のヌクレオチドの差又は遺伝子多型（一塩基多型（ＳＮＰ）
等）を利用する方法を提供する。方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能
性タンパク質の発現を許容するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、方
法は、ドミナントネガティブな遺伝性障害を治療、寛解又は予防するための方法である。
【0154】
本発明の実施形態は、ある一定の細胞又は対象においてドミナントな変異対立遺伝子を
発現する遺伝子の少なくとも１つのヘテロ接合性ＳＮＰを利用する方法を提供する。本発
明の実施形態において、利用されるＳＮＰは、疾患表現型と関連してもしなくてもよい。
本発明の実施形態において、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異対立遺伝子中
のヘテロ接合性ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能性対立遺伝子中の異なるヌクレ
オチド塩基を有するヌクレオチドを標的とすることにより遺伝子の変異対立遺伝子を標的
とする。
発現する遺伝子の少なくとも１つのヘテロ接合性ＳＮＰを利用する方法を提供する。本発
明の実施形態において、利用されるＳＮＰは、疾患表現型と関連してもしなくてもよい。
本発明の実施形態において、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異対立遺伝子中
のヘテロ接合性ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能性対立遺伝子中の異なるヌクレ
オチド塩基を有するヌクレオチドを標的とすることにより遺伝子の変異対立遺伝子を標的
とする。
【0155】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又はプ
ロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又は
ＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン
又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ
又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子又は機能性対立遺
伝子の両方に存在する非コード領域の配列を標的とする。
ロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又は
ＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン
又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ
又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子又は機能性対立遺
伝子の両方に存在する非コード領域の配列を標的とする。
【0156】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コドンまたは非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘ
テロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在
するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
ＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コドンまたは非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘ
テロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在
するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
【0157】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の少なくともプロモーターの一部及び／又は開始コドン及
び／又はＵＴＲの一部を標的とする。
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の少なくともプロモーターの一部及び／又は開始コドン及
び／又はＵＴＲの一部を標的とする。
【0158】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、プロモーターの一部、ＥＬＡＮＥ遺
伝子のプロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰ、又はＥＬＡＮＥ遺伝子のプロ
モーターの上流に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、第２の
ヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、この第２のヘテロ接合性ＳＮＰは、第１のヘテロ接合性
ＳＮＰの下流のＥＬＡＮＥ遺伝子に存在し、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター、ＵＴＲも
しくはイントロン又はエキソンにあり、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対
立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第
２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレ
オチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
伝子のプロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰ、又はＥＬＡＮＥ遺伝子のプロ
モーターの上流に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、第２の
ヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、この第２のヘテロ接合性ＳＮＰは、第１のヘテロ接合性
ＳＮＰの下流のＥＬＡＮＥ遺伝子に存在し、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター、ＵＴＲも
しくはイントロン又はエキソンにあり、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対
立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第
２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレ
オチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
【0159】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター、
プロモーターの上流、又はＵＴＲに存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子
は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異誘発遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又
はＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子及び機能
性対立遺伝子の両方のイントロンに存在する配列を標的とするよう設計される。
プロモーターの上流、又はＵＴＲに存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子
は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異誘発遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又
はＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子及び機能
性対立遺伝子の両方のイントロンに存在する配列を標的とするよう設計される。
【0160】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子
又は機能性対立遺伝子の両方に存在するプロモーターの上流の配列を標的とし、第２のＲ
ＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の位置に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、
第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチ
ド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
又は機能性対立遺伝子の両方に存在するプロモーターの上流の配列を標的とし、第２のＲ
ＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の位置に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、
第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチ
ド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
【0161】
本発明の実施形態によれば、変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除
去することであって、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、エキソンのエ
キソン全体又は一部に隣接している領域を標的とする、ことを含む方法が提供される。
去することであって、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、エキソンのエ
キソン全体又は一部に隣接している領域を標的とする、ことを含む方法が提供される。
【0162】
本発明の実施形態によれば、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体、複数のエキ
ソンを除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、を含む方法が提供される。
ソンを除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、を含む方法が提供される。
【0163】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子はＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又はプロ
モーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡ
ＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性Ｓ
ＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第
２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分
子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に存在するイント
ロンの配列を標的とする。
モーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡ
ＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性Ｓ
ＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第
２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分
子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に存在するイント
ロンの配列を標的とする。
【0164】
本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、変異
対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的と
する。
対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的と
する。
【0165】
本発明の実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子
と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とする。
と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とする。
【0166】
本発明の実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、イントロンを標的とする。
【0167】
本発明の実施形態によれば、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により変
異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生じ
させることを含む方法が提供される。
異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生じ
させることを含む方法が提供される。
【0168】
本発明の実施形態によれば、フレームシフトは、変異対立遺伝子の不活性化又はノック
アウトを生じる。
アウトを生じる。
【0169】
本発明の実施形態によれば、フレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コド
ンが作成される。
ンが作成される。
【0170】
本発明の実施形態によれば、フレームシフトにより変異対立遺伝子の転写物にナンセンス
変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。
変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。
【0171】
本発明の実施形態によれば、不活性化又は治療により変異対立遺伝子によってコードさ
れる切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生
じる。
れる切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生
じる。
【0172】
本開示の組成物及び方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、予防、寛解又は悪化を遅くする
ために利用されてもよい。
ために利用されてもよい。
【0173】
いくつかの実施形態において、細胞に、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コ
ドン又は非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするＲＮＡ分子を
送達することにより変異対立遺伝子を不活性化し、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変
異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
ドン又は非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするＲＮＡ分子を
送達することにより変異対立遺伝子を不活性化し、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変
異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
【0174】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、少なくともプロモーターの一部を除
去すること及び／又は開始コドン及び／又はＵＴＲの一部を除去することにより不活性化
される。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、少なくと
もプロモーターの一部を除去することを含む。このような実施形態において、１つのＲＮ
Ａ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター又はプロモーターの上流に存在する第１のヘ
テロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され、別のＲＮＡ分子は、第２のヘテロ接合性Ｓ
ＮＰを標的とし、この第２のヘテロ接合性ＳＮＰは、第１のＳＮＰの下流であり、ＥＬＡ
ＮＥ遺伝子のプロモーター、ＵＴＲもしくはイントロン又はエキソンに存在する。あるい
は、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター又はプロモーターの上流もし
くはＥＬＡＮＥ遺伝子のＵＴＲに存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され
てもよく、別のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子
の両方のイントロンに存在する配列を標的とするよう設計される。あるいは、１つのＲＮ
Ａ分子は、変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両方に存在するプロモーターの上流の
配列を標的とするよう設計されてもよく、他のガイドは、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン、
イントロン、ＵＴＲ又はプロモーターの下流等の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の位置に存在
するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の
変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
去すること及び／又は開始コドン及び／又はＵＴＲの一部を除去することにより不活性化
される。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、少なくと
もプロモーターの一部を除去することを含む。このような実施形態において、１つのＲＮ
Ａ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター又はプロモーターの上流に存在する第１のヘ
テロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され、別のＲＮＡ分子は、第２のヘテロ接合性Ｓ
ＮＰを標的とし、この第２のヘテロ接合性ＳＮＰは、第１のＳＮＰの下流であり、ＥＬＡ
ＮＥ遺伝子のプロモーター、ＵＴＲもしくはイントロン又はエキソンに存在する。あるい
は、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター又はプロモーターの上流もし
くはＥＬＡＮＥ遺伝子のＵＴＲに存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され
てもよく、別のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子
の両方のイントロンに存在する配列を標的とするよう設計される。あるいは、１つのＲＮ
Ａ分子は、変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両方に存在するプロモーターの上流の
配列を標的とするよう設計されてもよく、他のガイドは、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン、
イントロン、ＵＴＲ又はプロモーターの下流等の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の位置に存在
するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の
変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。
【0175】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、変異対立遺伝子
から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去するステップを含むエキソンスキッピングス
テップを含む。変異対立遺伝子の疾患発症性の変異を含むエキソンを除去するには、エキ
ソンのエキソン全体又は一部に隣接している領域を標的とする２個のＲＮＡ分子が必要と
される。疾患発症性の変異を含むエキソンの除去は、野生型の活性の一部又は全てを保持
する残りのタンパク質生成物の発現を許容しながらタンパク質の疾患発症活性を除去する
よう設計されてもよい。単一のエキソンスキッピングの代わりとして、複数のエキソン、
オープンリーディングフレーム全体又は遺伝子全体を、切除されることが望まれる領域に
隣接している２個のＲＮＡ分子を使用して切除することができる。
から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去するステップを含むエキソンスキッピングス
テップを含む。変異対立遺伝子の疾患発症性の変異を含むエキソンを除去するには、エキ
ソンのエキソン全体又は一部に隣接している領域を標的とする２個のＲＮＡ分子が必要と
される。疾患発症性の変異を含むエキソンの除去は、野生型の活性の一部又は全てを保持
する残りのタンパク質生成物の発現を許容しながらタンパク質の疾患発症活性を除去する
よう設計されてもよい。単一のエキソンスキッピングの代わりとして、複数のエキソン、
オープンリーディングフレーム全体又は遺伝子全体を、切除されることが望まれる領域に
隣接している２個のＲＮＡ分子を使用して切除することができる。
【0176】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、２個のＲＮＡ分
子を細胞に送達することを含み、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又は
プロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮ
Ｅ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬ
Ｔを標的とし、他のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイ
ントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺
伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを
標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に
存在するイントロンの配列を標的とする。
子を細胞に送達することを含み、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又は
プロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮ
Ｅ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬ
Ｔを標的とし、他のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイ
ントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺
伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを
標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に
存在するイントロンの配列を標的とする。
【0177】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが変異対立遺
伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とし、そ
れにより変異対立遺伝子の選択的スプライシングシグナル配列を破壊するために使用する
。
伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とし、そ
れにより変異対立遺伝子の選択的スプライシングシグナル配列を破壊するために使用する
。
【0178】
変異対立遺伝子を不活性化するための上述した戦略の任意の１つ又は組み合わせを、本
発明の文脈において使用してもよい。
発明の文脈において使用してもよい。
【0179】
変異対立遺伝子を不活性化するために、さらなる戦略を使用してもよい。例えば、本発
明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるためにＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子のエキソン又はスプライス部位に向けさせ、エラー
プローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によりヌクレオチドを挿入又は欠失させ、変異
対立遺伝子のフレームシフト変異を形成させるために使用される。フレームシフト変異に
より、（１）変異対立遺伝子に早期の終止コドンが作成されることにより変異対立遺伝子
が不活性化するかノックアウトされ、切断型タンパク質が作成されてもよく、又は（２）
変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じてもよい。さらな
る実施形態において、１つのＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子
のプロモーターに向けさせるために使用される。
明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるためにＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子のエキソン又はスプライス部位に向けさせ、エラー
プローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によりヌクレオチドを挿入又は欠失させ、変異
対立遺伝子のフレームシフト変異を形成させるために使用される。フレームシフト変異に
より、（１）変異対立遺伝子に早期の終止コドンが作成されることにより変異対立遺伝子
が不活性化するかノックアウトされ、切断型タンパク質が作成されてもよく、又は（２）
変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じてもよい。さらな
る実施形態において、１つのＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子
のプロモーターに向けさせるために使用される。
【0180】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、機能性タンパク
質の活性を活性化／増強することができる、タンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチ
ドをコードする核酸又は化学物質等の小分子を提供すること等により機能性タンパク質の
活性を増強することをさらに含む。
質の活性を活性化／増強することができる、タンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチ
ドをコードする核酸又は化学物質等の小分子を提供すること等により機能性タンパク質の
活性を増強することをさらに含む。
【0181】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ＲＮＡがガ
イドするＤＮＡヌクレアーゼと結合する／関連している及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ等の、ＲＮＡがガイドするＤＮＡヌクレアーゼを関心のある遺伝子の変異対立遺伝子
と機能性対立遺伝子との間に差がある少なくとも１つのヌクレオチド（ヘテロ接合性ＳＮ
Ｐ等）を含む配列（機能性対立遺伝子には存在しない変異対立遺伝子の配列等）に向けさ
せるＲＮＡ分子を提供する。
イドするＤＮＡヌクレアーゼと結合する／関連している及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼ等の、ＲＮＡがガイドするＤＮＡヌクレアーゼを関心のある遺伝子の変異対立遺伝子
と機能性対立遺伝子との間に差がある少なくとも１つのヌクレオチド（ヘテロ接合性ＳＮ
Ｐ等）を含む配列（機能性対立遺伝子には存在しない変異対立遺伝子の配列等）に向けさ
せるＲＮＡ分子を提供する。
【0182】
いくつかの実施形態において、方法は、関心のある遺伝子の変異対立遺伝子を対立遺伝
子特異的ＲＮＡ分子及びＣａｓ９タンパク質等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと接触する
ステップを含み、対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣａｓ９タンパク質等の、ＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼは、関心のある遺伝子の機能性対立遺伝子のヌクレオチド配列と少なくと
も１つのヌクレオチドだけ異なる、関心のある遺伝子の変異対立遺伝子のヌクレオチド配
列と結合し、それによって変異対立遺伝子を改変又はノックアウトする。
子特異的ＲＮＡ分子及びＣａｓ９タンパク質等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと接触する
ステップを含み、対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣａｓ９タンパク質等の、ＣＲＩＳＰ
Ｒヌクレアーゼは、関心のある遺伝子の機能性対立遺伝子のヌクレオチド配列と少なくと
も１つのヌクレオチドだけ異なる、関心のある遺伝子の変異対立遺伝子のヌクレオチド配
列と結合し、それによって変異対立遺伝子を改変又はノックアウトする。
【0183】
いくつかの実施形態において、対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼは、関心のある遺伝子をコードする細胞に導入される。いくつかの実施形態において
、関心のある遺伝子をコードする細胞は、哺乳類対象にある。いくつかの実施形態におい
て、関心のある遺伝子をコードする細胞は、植物にある。
ーゼは、関心のある遺伝子をコードする細胞に導入される。いくつかの実施形態において
、関心のある遺伝子をコードする細胞は、哺乳類対象にある。いくつかの実施形態におい
て、関心のある遺伝子をコードする細胞は、植物にある。
【0184】
いくつかの実施形態において、開裂した変異対立遺伝子は、エラープローン非相同末端
結合（ＮＨＥＪ）機構により挿入又は欠失を受けさせ（インデル）、変異対立遺伝子の配
列にフレームシフトを生成する。いくつかの実施形態において、生成されたフレームシフ
トにより、変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトが生じる。いくつかの実施形態に
おいて、生成されたフレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成さ
れ、切断型タンパク質が生成する。このような実施形態において、方法は、変異対立遺伝
子によってコードされた切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされた機
能性タンパク質を生じる。いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して変異対
立遺伝子に生成されたフレームシフトにより、変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異
依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。
結合（ＮＨＥＪ）機構により挿入又は欠失を受けさせ（インデル）、変異対立遺伝子の配
列にフレームシフトを生成する。いくつかの実施形態において、生成されたフレームシフ
トにより、変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトが生じる。いくつかの実施形態に
おいて、生成されたフレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成さ
れ、切断型タンパク質が生成する。このような実施形態において、方法は、変異対立遺伝
子によってコードされた切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされた機
能性タンパク質を生じる。いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して変異対
立遺伝子に生成されたフレームシフトにより、変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異
依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。
【0185】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、「好中球エラスターゼ」遺伝子（Ｅ
ＬＡＮＥ遺伝子）の対立遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、Ｓ
ＣＮ又はＣｙＮ遺伝性障害に関連する変異配列と共存する／関連づけられるＥＬＡＮＥ遺
伝子のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、
ＥＬＡＮＥ遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、上記ＳＮＰのヘテロ接合性は、集団
内で高度に蔓延している。本発明の実施形態において、ＲＥＦヌクレオチドは、治療すべ
き個々の対象の変異対立遺伝子には蔓延しているが、機能性対立遺伝子には蔓延していな
い。本発明の実施形態において、ＡＬＴヌクレオチドは、治療すべき個々の対象の変異対
立遺伝子には蔓延しているが、機能性対立遺伝子には蔓延していない。いくつかの実施形
態において、変異ＥＬＡＮＥ遺伝子内の疾患発症性の変異が標的とされる。
ＬＡＮＥ遺伝子）の対立遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、Ｓ
ＣＮ又はＣｙＮ遺伝性障害に関連する変異配列と共存する／関連づけられるＥＬＡＮＥ遺
伝子のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、
ＥＬＡＮＥ遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、上記ＳＮＰのヘテロ接合性は、集団
内で高度に蔓延している。本発明の実施形態において、ＲＥＦヌクレオチドは、治療すべ
き個々の対象の変異対立遺伝子には蔓延しているが、機能性対立遺伝子には蔓延していな
い。本発明の実施形態において、ＡＬＴヌクレオチドは、治療すべき個々の対象の変異対
立遺伝子には蔓延しているが、機能性対立遺伝子には蔓延していない。いくつかの実施形
態において、変異ＥＬＡＮＥ遺伝子内の疾患発症性の変異が標的とされる。
【0186】
本発明の実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ関連疾患表現型に関連
していてもしていなくてもよい。本発明の実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、Ｅ
ＬＡＮＥ関連疾患表現型に関連している。本発明の実施形態において、ＳＮＰは、ＥＬＡ
ＮＥ関連疾患表現型に関連していない。
していてもしていなくてもよい。本発明の実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、Ｅ
ＬＡＮＥ関連疾患表現型に関連している。本発明の実施形態において、ＳＮＰは、ＥＬＡ
ＮＥ関連疾患表現型に関連していない。
【0187】
いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、関心のある遺伝子のエキソン内
にある。このような実施形態において、ＲＮＡ分子のガイド配列部は、関心のある遺伝子
のエキソンを標的とするよう設計されてもよい。
にある。このような実施形態において、ＲＮＡ分子のガイド配列部は、関心のある遺伝子
のエキソンを標的とするよう設計されてもよい。
【0188】
いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、関心のある遺伝子のイントロン
又はエキソン内にある。いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、イントロ
ンとエキソンの間のスプライス部位にある。いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性
ＳＮＰは、関心のある遺伝子のＰＡＭ部位にある。
又はエキソン内にある。いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、イントロ
ンとエキソンの間のスプライス部位にある。いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性
ＳＮＰは、関心のある遺伝子のＰＡＭ部位にある。
【0189】
当業者は、本発明の実施形態の各々において、個別に、本発明のＲＮＡ分子の各々は、
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列に
関連しているような、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ヌクレアーゼと複合体を形成する
ことができることを、理解するであろう。次にヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの開裂を媒介
してプロトスペーサー内部に二本鎖切断を作成する。したがって、本発明の実施形態にお
いて、本発明のガイド配列とＲＮＡ分子は、ＰＡＭ部位から１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド上流又は下流の位置を標的
としてもよい。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列に
関連しているような、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ヌクレアーゼと複合体を形成する
ことができることを、理解するであろう。次にヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの開裂を媒介
してプロトスペーサー内部に二本鎖切断を作成する。したがって、本発明の実施形態にお
いて、本発明のガイド配列とＲＮＡ分子は、ＰＡＭ部位から１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド上流又は下流の位置を標的
としてもよい。
【0190】
それゆえに、本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ヌクレアー
ゼと複合体を形成している本発明のＲＮＡ分子は、標的部位から１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８遺伝子上流又は下流の対立遺伝子で二
本鎖切断に影響してもよい。当業者は、ヘテロ接合性多型部位が存在し、標的を明確化す
るために使用されるならば、ＲＮＡ分子は、ヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌ
クレオチド塩基のみを標的として二本鎖切断に影響するよう設計されてもよいことを理解
するであろう。
ゼと複合体を形成している本発明のＲＮＡ分子は、標的部位から１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８遺伝子上流又は下流の対立遺伝子で二
本鎖切断に影響してもよい。当業者は、ヘテロ接合性多型部位が存在し、標的を明確化す
るために使用されるならば、ＲＮＡ分子は、ヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌ
クレオチド塩基のみを標的として二本鎖切断に影響するよう設計されてもよいことを理解
するであろう。
【0191】
ヘテロ接合性多型部位がＰＡＭ部位内部にあるならば、ＲＮＡ分子は、ＰＡＭ部位から
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチ
ド上流又は下流の配列を標的とするよう設計されてもよく、ＲＮＡ分子とヌクレアーゼの
複合体は、ＰＡＭ部位のヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１
つのみを標的としてＰＡＭ部位での切断に影響するよう設計され、例えばｔｒａｃｒＲＮ
Ａは、ヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１つを標的とするよ
う設計されることが理解される。
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチ
ド上流又は下流の配列を標的とするよう設計されてもよく、ＲＮＡ分子とヌクレアーゼの
複合体は、ＰＡＭ部位のヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１
つのみを標的としてＰＡＭ部位での切断に影響するよう設計され、例えばｔｒａｃｒＲＮ
Ａは、ヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１つを標的とするよ
う設計されることが理解される。
【0192】
本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子に存在するヘテロ接合性
多型部位を標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多
型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするよう設計される。
多型部位を標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多
型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするよう設計される。
【0193】
本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬物は、ヘ
テロ接合体ＥＬＡＮＥ遺伝子に起因する疾患表現型を有する対象を治療するために利用さ
れる。本発明の実施形態において、疾患は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。このような実施形
態において、方法は、疾患表現型を改善、寛解又は予防する。
テロ接合体ＥＬＡＮＥ遺伝子に起因する疾患表現型を有する対象を治療するために利用さ
れる。本発明の実施形態において、疾患は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。このような実施形
態において、方法は、疾患表現型を改善、寛解又は予防する。
【0194】
本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬
物は、対象を治療するにＳＣＮ又はＣｙＮのための第２の治療と組み合わせて使用される
。本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬
物は、第２の治療の投与前に、第２の治療の投与中に及び／又は第２の治療の投与後に投
与される。
物は、対象を治療するにＳＣＮ又はＣｙＮのための第２の治療と組み合わせて使用される
。本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬
物は、第２の治療の投与前に、第２の治療の投与中に及び／又は第２の治療の投与後に投
与される。
【0195】
本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬
物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）治療と組み合わせて投与される。
物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）治療と組み合わせて投与される。
【0196】
上記の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子（類）及びｔｒａｃｒＲＮ
Ａ分子が対象又は細胞内で同時に効果的であることを指す。ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ分子（
類）及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を実質的に同時に送達することができ、又は異なる時点で
送達できるが同時に効果を持つことができる。例えば、これには、ＲＮＡ分子及び／又は
ｔｒａｃｒＲＮＡ分子が対象又は細胞内に実質的に現存する前に、ＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼを対象又は細胞に送達することが含まれる。
Ａ分子が対象又は細胞内で同時に効果的であることを指す。ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ分子（
類）及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を実質的に同時に送達することができ、又は異なる時点で
送達できるが同時に効果を持つことができる。例えば、これには、ＲＮＡ分子及び／又は
ｔｒａｃｒＲＮＡ分子が対象又は細胞内に実質的に現存する前に、ＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼを対象又は細胞に送達することが含まれる。
【0197】
本発明の実施形態によれば、細胞の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化す
るための方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８
３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２
ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７
ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、
ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ０
０７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４
２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を選択すること、
ｂ）細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子
の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対
立遺伝子における二本鎖切断には影響しない、導入すること、を含み、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
るための方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８
３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２
ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７
ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、
ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ０
０７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４
２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を選択すること、
ｂ）細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子
の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対
立遺伝子における二本鎖切断には影響しない、導入すること、を含み、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
【0198】
本発明の実施形態によれば、細胞の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化す
るための方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８
３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２
ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７
ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、
ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ０
０７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４
２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を選択するステップ、
ｂ）細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入するステップであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子
の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝
子における二本鎖切断には影響しない、ステップを含み、
方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列
部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することを含み、第２のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌク
レアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
るための方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８
３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２
ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７
ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、
ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ０
０７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４
２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ
又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を選択するステップ、
ｂ）細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入するステップであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子
の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝
子における二本鎖切断には影響しない、ステップを含み、
方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列
部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することを含み、第２のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌク
レアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
【0199】
本発明の実施形態によれば、細胞の、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連している変異を有するＥ
ＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０
４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７
４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９
、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３
８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３
７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒ
ｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝
子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、導入すること、を含み、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
ＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０
４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７
４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９
、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３
８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３
７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒ
ｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝
子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、導入すること、を含み、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
【0200】
本発明の実施形態によれば、細胞の、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝
子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ
９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２
、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６
９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１
０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、
ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選
択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であるＥＬＡＮＥ遺
伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、
細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列
部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することを含み、第２のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌク
レアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ
９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２
、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６
９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１
０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、
ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選
択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であるＥＬＡＮＥ遺
伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、
細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む
組成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列
部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することを含み、第２のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌク
レアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供す
る。
【0201】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体
は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、細胞の
ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断には影響しない。
は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、細胞の
ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断には影響しない。
【0202】
本発明の実施形態において、細胞はまた、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５
、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２
９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８
０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、
ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４
９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３
０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の少なくとも１つのさらなる多型
部位でヘテロ接合性である。
、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２
９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８
０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、
ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４
９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３
０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の少なくとも１つのさらなる多型
部位でヘテロ接合性である。
【0203】
本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を
有する細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでい
る対象由来であってもよい。したがって、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞を選択する
ことは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象を選択することを含んでもよい。本発明のさ
らなる実施形態において、細胞を選択することは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象由
来の細胞を選択することを含んでもよい。本発明の実施形態において、本主題発明の組成
物を細胞に導入することは、本発明の組成物をＥＬＡＮＥ遺伝子変異で苦しんでいる対象
の細胞に導入することを含んでもよい。
有する細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでい
る対象由来であってもよい。したがって、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞を選択する
ことは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象を選択することを含んでもよい。本発明のさ
らなる実施形態において、細胞を選択することは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象由
来の細胞を選択することを含んでもよい。本発明の実施形態において、本主題発明の組成
物を細胞に導入することは、本発明の組成物をＥＬＡＮＥ遺伝子変異で苦しんでいる対象
の細胞に導入することを含んでもよい。
【0204】
したがって、本発明の実施形態において、細胞の、対象のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立
遺伝子を不活性化するであって、方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを引き起こすＥＬＡＮＥ遺伝
子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ
９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２
、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６
９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１
０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、
ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４ｎから成る群から
選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である対象を選択
するステップを含む、方法が提供される。
遺伝子を不活性化するであって、方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを引き起こすＥＬＡＮＥ遺伝
子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ
９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２
、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６
９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１
０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、
ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４ｎから成る群から
選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である対象を選択
するステップを含む、方法が提供される。
【0205】
したがって、本発明の実施形態は、ＥＬＡＮＥ遺伝子を求めて対象又は細胞を選別する
ことを包含する。当業者は、非限定的な例として、例えば、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ
－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、サンガー塩基配列決定法、核型分析、蛍光インサイツハイブリダ
イゼーション法、及び／又はマイクロアレイ試験等の、従来技術のＥＬＡＮＥ遺伝子内の
変異を選別する方法を容易に理解するだろう。本発明の実施形態においては、ＥＬＡＮＥ
遺伝子内の変異をエキソン配列決定法により選別する。
ことを包含する。当業者は、非限定的な例として、例えば、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ
－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、サンガー塩基配列決定法、核型分析、蛍光インサイツハイブリダ
イゼーション法、及び／又はマイクロアレイ試験等の、従来技術のＥＬＡＮＥ遺伝子内の
変異を選別する方法を容易に理解するだろう。本発明の実施形態においては、ＥＬＡＮＥ
遺伝子内の変異をエキソン配列決定法により選別する。
【0206】
本発明の実施形態において、対象は、末梢血液中の好中球絶対数（ＡＮＣ）を測定する
ことによりＳＣＮ又はＣｙＮと診断される又は診断された。本発明の実施形態において、
ＳＣＮは、対象が生後６か月に達する前に診断される又は診断された。本発明の実施形態
において、ＣｙＮは、生後１２か月と２４か月の間に、又は生後２４か月の後に診断され
る又は診断された。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、１つ又は複数の再
発性急性口腔医学的疾患によって診断される。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣ
ｙＮは、骨髄検査によって診断され、好ましくは、骨髄検査は、細胞遺伝学的骨髄調査で
ある。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、抗好中球抗体アッセイ、免疫グ
ロブリンアッセイ（Ｉｇ ＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリ
プシノーゲン及び糞便エラスターゼ）並びに脂溶性ビタミンレベル（ビタミンＡ、Ｅ及び
Ｄ）のうちの１つ又は複数によって診断される。全ての診断方法を他のいかなる診断方法
とともに使用してもよいことが理解される。
ことによりＳＣＮ又はＣｙＮと診断される又は診断された。本発明の実施形態において、
ＳＣＮは、対象が生後６か月に達する前に診断される又は診断された。本発明の実施形態
において、ＣｙＮは、生後１２か月と２４か月の間に、又は生後２４か月の後に診断され
る又は診断された。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、１つ又は複数の再
発性急性口腔医学的疾患によって診断される。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣ
ｙＮは、骨髄検査によって診断され、好ましくは、骨髄検査は、細胞遺伝学的骨髄調査で
ある。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、抗好中球抗体アッセイ、免疫グ
ロブリンアッセイ（Ｉｇ ＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリ
プシノーゲン及び糞便エラスターゼ）並びに脂溶性ビタミンレベル（ビタミンＡ、Ｅ及び
Ｄ）のうちの１つ又は複数によって診断される。全ての診断方法を他のいかなる診断方法
とともに使用してもよいことが理解される。
【0207】
本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象は、ＥＬＡＮＥ遺伝子
のＥＬＡＮＥ病原性変異を同定するためにエキソンシーケンシングにより選別される。さ
らなる実施形態において、対象は、表１の少なくとも１つのＳＮＰのヘテロ接合性を確認
するためにサンガーシーケンシングにより選別される。本発明の実施形態において、ＳＮ
Ｐは、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓＩ０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６１００５のうちの１つ
である。本発明の実施形態において、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のヘテロ接合性
ＳＮＰのヌクレオチドは、ＢＡＣ ｂｉｏを使用して決定される。本発明の実施形態にお
いて、表２にしたがって適切なガイドを選択する。本発明の実施形態において、選択され
たガイドは、対象から取得した、ＰＢＭＣ等の、細胞に導入され、細胞の病原性ＥＬＡＮ
Ｅ変異の減少は、次世代シーケンス技術等によって測定される。
のＥＬＡＮＥ病原性変異を同定するためにエキソンシーケンシングにより選別される。さ
らなる実施形態において、対象は、表１の少なくとも１つのＳＮＰのヘテロ接合性を確認
するためにサンガーシーケンシングにより選別される。本発明の実施形態において、ＳＮ
Ｐは、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓＩ０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６１００５のうちの１つ
である。本発明の実施形態において、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のヘテロ接合性
ＳＮＰのヌクレオチドは、ＢＡＣ ｂｉｏを使用して決定される。本発明の実施形態にお
いて、表２にしたがって適切なガイドを選択する。本発明の実施形態において、選択され
たガイドは、対象から取得した、ＰＢＭＣ等の、細胞に導入され、細胞の病原性ＥＬＡＮ
Ｅ変異の減少は、次世代シーケンス技術等によって測定される。
【0208】
ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムを用いると、ヌクレアーゼを疾患発症性の
変異に立ち向かう配列特異的な様式で標的部位を標的とすることができる。造血幹細胞・
前駆細胞（ＨＳＰＣ）は自己複製と分化の両方の能力があるので（Ｙｕ，Ｎａｔａｎｓｏ
ｎ，ａｎｄ Ｄｕｎｂａｒ ２０１６）、治療可能性がある。したがって、本発明の実施
形態は、ゲノム編集をＨＳＰＣに適用する。
変異に立ち向かう配列特異的な様式で標的部位を標的とすることができる。造血幹細胞・
前駆細胞（ＨＳＰＣ）は自己複製と分化の両方の能力があるので（Ｙｕ，Ｎａｔａｎｓｏ
ｎ，ａｎｄ Ｄｕｎｂａｒ ２０１６）、治療可能性がある。したがって、本発明の実施
形態は、ゲノム編集をＨＳＰＣに適用する。
【0209】
本発明の実施形態において、自家製治療では、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者由来
のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集した自家ＣＤ３４＋造血幹細胞を利用する。本発明の実
施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄又は患者にアフェレシスした後の末梢血単核球
（ＰＢＭＣ）から単離される。
のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集した自家ＣＤ３４＋造血幹細胞を利用する。本発明の実
施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄又は患者にアフェレシスした後の末梢血単核球
（ＰＢＭＣ）から単離される。
【0210】
ＳＣＮ又はＣｙＮ等の、ドミナントネガティブ（又は複合ヘテロ接合性）の徴候がある
場合、戦略は、変異対立遺伝子を編集することであり、ヘテロ接合性ＳＮＰ配列を標的と
することにより変異していない対立遺伝子又は他のオフターゲットの開裂を避けることで
ある。
場合、戦略は、変異対立遺伝子を編集することであり、ヘテロ接合性ＳＮＰ配列を標的と
することにより変異していない対立遺伝子又は他のオフターゲットの開裂を避けることで
ある。
【0211】
本発明の実施形態は、以下のステップを含む。
本明細書の以下の表１のＳＮＰのうちの少なくとも１つがヘテロ接合性を示すと同定され
たＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者の選択。本発明の実施形態において、対象は、ｒｓ
１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５又はｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、
候補患者の同定されたヘテロ接合性ＳＮＰ位置に基づく治療戦略の選択。
末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいずれかにより対象の骨髄
からＨＳＰＣ細胞を取得する、任意選択で、ＨＳＰＣ細胞を処理する（濃縮する、刺激す
る、両方等）
ＨＳＰＣ細胞に（エクスビボエレクトロポレーション等により）
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は同一物をコードする配列（ｍＲＮＡ等）、
変異対立遺伝子の同定されたヘテロ接合性ＳＮＰの特定の配列（ＲＥＦ／ＡＬＴ配列）を
標的とする特徴的なＲＮＡ分子及び
変異対立遺伝子と他の対立遺伝子の両方に共通である、イントロン３、イントロン４又は
３’ＵＴＲ中の配列を標的とする非特徴的なＲＮＡ分子を含む組成物を導入し、
それによりＨＳＰＣ細胞を編集してＥＬＡＮＥの変異対立遺伝子発現をノックアウトする
。そして
編集したＨＳＰＣを候補患者に導入する。
本明細書の以下の表１のＳＮＰのうちの少なくとも１つがヘテロ接合性を示すと同定され
たＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者の選択。本発明の実施形態において、対象は、ｒｓ
１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５又はｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、
候補患者の同定されたヘテロ接合性ＳＮＰ位置に基づく治療戦略の選択。
末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいずれかにより対象の骨髄
からＨＳＰＣ細胞を取得する、任意選択で、ＨＳＰＣ細胞を処理する（濃縮する、刺激す
る、両方等）
ＨＳＰＣ細胞に（エクスビボエレクトロポレーション等により）
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は同一物をコードする配列（ｍＲＮＡ等）、
変異対立遺伝子の同定されたヘテロ接合性ＳＮＰの特定の配列（ＲＥＦ／ＡＬＴ配列）を
標的とする特徴的なＲＮＡ分子及び
変異対立遺伝子と他の対立遺伝子の両方に共通である、イントロン３、イントロン４又は
３’ＵＴＲ中の配列を標的とする非特徴的なＲＮＡ分子を含む組成物を導入し、
それによりＨＳＰＣ細胞を編集してＥＬＡＮＥの変異対立遺伝子発現をノックアウトする
。そして
編集したＨＳＰＣを候補患者に導入する。
【0212】
本発明の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞を、骨髄又は患者アフェレシス後の末梢血
単核球（ＰＢＭＣ）から分離してもよい。骨髄又はＰＢＭＣを、ＨＳＰＣ動員後のアフェ
レシスにより患者から収集してもよい。本発明の実施形態において、アフェレシス生成物
を洗浄して血小板を除去してもよく、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）等を使用する生成により、ＣＤ３４＋細胞集団を濃縮してもよい。本発明
の実施形態において、選択された細胞を、組換えヒトサイトカインの混合物等により、エ
クスビボで予備刺激してもよい。本発明の実施形態において、細胞は、エレクトロポレー
ションを受けてもよい。本発明の実施形態において、エレクトロポレーションの前に、刺
激した細胞（ＣＤ３４＋細胞等）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを
、限定条件下でプレインキュベートしてもよい。本発明の実施形態において、細胞を、Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ混合物により又は組み立て済みＲＮＰ（Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質であるリボヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡ）に
よりエクスビボでエレクトロポレーションし、その後細胞洗浄する。本発明の実施形態に
おいて、細胞を、最終製剤へと懸濁する。本発明の実施形態において、細胞を再懸濁して
もよい。本発明の実施形態において、再懸濁した細胞を注入用バッグへと充填してもよい
。本発明の実施形態において、バッグをコントロールレートフリーザーのフリーズダウン
ステップを使用して凍結しても及び／又は気相の液体窒素内で保存してもよい。本発明の
実施形態において、製品を静脈内（ＩＶ）投与により患者に投与してもよい。
単核球（ＰＢＭＣ）から分離してもよい。骨髄又はＰＢＭＣを、ＨＳＰＣ動員後のアフェ
レシスにより患者から収集してもよい。本発明の実施形態において、アフェレシス生成物
を洗浄して血小板を除去してもよく、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）等を使用する生成により、ＣＤ３４＋細胞集団を濃縮してもよい。本発明
の実施形態において、選択された細胞を、組換えヒトサイトカインの混合物等により、エ
クスビボで予備刺激してもよい。本発明の実施形態において、細胞は、エレクトロポレー
ションを受けてもよい。本発明の実施形態において、エレクトロポレーションの前に、刺
激した細胞（ＣＤ３４＋細胞等）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを
、限定条件下でプレインキュベートしてもよい。本発明の実施形態において、細胞を、Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ混合物により又は組み立て済みＲＮＰ（Ｃ
ＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質であるリボヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡ）に
よりエクスビボでエレクトロポレーションし、その後細胞洗浄する。本発明の実施形態に
おいて、細胞を、最終製剤へと懸濁する。本発明の実施形態において、細胞を再懸濁して
もよい。本発明の実施形態において、再懸濁した細胞を注入用バッグへと充填してもよい
。本発明の実施形態において、バッグをコントロールレートフリーザーのフリーズダウン
ステップを使用して凍結しても及び／又は気相の液体窒素内で保存してもよい。本発明の
実施形態において、製品を静脈内（ＩＶ）投与により患者に投与してもよい。
【0213】
ドミナントな遺伝性障害
当業者は、いかなる種類のヘテロ接合体遺伝性障害（ドミナントな遺伝性障害等）の全
ての対象も本明細書において記載される方法を受けてもよいことを理解するであろう。１
つの実施形態において、本発明を、例えばＳＣＮ又はＣｙＮ等のドミナントな遺伝性障害
に関与する、関連している又は原因となる遺伝子を標的とするために使用してもよい。い
くつかの実施形態において、ドミナントな遺伝性障害は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。いく
つかの実施形態において、標的遺伝子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ，
ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３３５）である。
当業者は、いかなる種類のヘテロ接合体遺伝性障害（ドミナントな遺伝性障害等）の全
ての対象も本明細書において記載される方法を受けてもよいことを理解するであろう。１
つの実施形態において、本発明を、例えばＳＣＮ又はＣｙＮ等のドミナントな遺伝性障害
に関与する、関連している又は原因となる遺伝子を標的とするために使用してもよい。い
くつかの実施形態において、ドミナントな遺伝性障害は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。いく
つかの実施形態において、標的遺伝子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ，
ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３３５）である。
【0214】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＰＡＭ認識
いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
又はその機能性バリアントから選択される。いくつかの実施形態において、配列特異的ヌ
クレアーゼは、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼである。このような実施形態に
おいて、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼをガイドするＲＮＡ配列（Ｃｐｆｌ等
）は、このＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼに結合する及び／又はこのＲＮＡで
ガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを変異対立遺伝子とその対応物である機能性対立遺伝子
との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチド（ＳＮＰ等）を含む配列に向けさせる。い
くつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、さらにｔｒａｃｒＲＮＡを含まない
。非限定的な例において、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲヌク
レアーゼであるが、ドミナントな変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少な
くとも１つのヌクレオチドは、ＰＡＭ部位内部にあっても及び／又はＲＮＡ分子がハイブ
リッド形成するよう設計された領域内部のＰＡＭ部位に近位であってもよい。当業者は、
ＲＮＡ分子を、従来技術において周知の方法によりゲノム内の選択した標的と結合するよ
う操作することができることを理解するであろう。
いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
又はその機能性バリアントから選択される。いくつかの実施形態において、配列特異的ヌ
クレアーゼは、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼである。このような実施形態に
おいて、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼをガイドするＲＮＡ配列（Ｃｐｆｌ等
）は、このＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼに結合する及び／又はこのＲＮＡで
ガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを変異対立遺伝子とその対応物である機能性対立遺伝子
との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチド（ＳＮＰ等）を含む配列に向けさせる。い
くつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、さらにｔｒａｃｒＲＮＡを含まない
。非限定的な例において、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲヌク
レアーゼであるが、ドミナントな変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少な
くとも１つのヌクレオチドは、ＰＡＭ部位内部にあっても及び／又はＲＮＡ分子がハイブ
リッド形成するよう設計された領域内部のＰＡＭ部位に近位であってもよい。当業者は、
ＲＮＡ分子を、従来技術において周知の方法によりゲノム内の選択した標的と結合するよ
う操作することができることを理解するであろう。
【0215】
本発明の実施形態において、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムでは、成熟型ｃｒＲＮ
Ａを利用する、つまり追加の標的認識要求として、ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９等
の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをｃｒＲＮＡと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）に隣接するプロトスペーサーに接する標的ＤＮＡのプロトスペーサーとの間のワトソン
・クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡに向かわせる。次に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼは、標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内部に二本鎖切断を作成する。当業
者は、本発明の操作されたＲＮＡ分子の各々がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
に接する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列と関連するように、例えばＰＡＭが、非限定的
な例として、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ
９ ＷＴ（ＳｐＣＡＳ９）についてはＮＧＧ又はＮＡＧ、「Ｎ」は任意の核酸塩基であり
、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）に
ついてはＮＮＧＲＲＴ、空腸（Ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９ ＷＴについてはＮＮＮＶＲＹＭ
、ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントについてはＮＧＡＮ又はＮＧＮＧ、ＳｐＣａｓ９－Ｖ
ＲＥＲバリアントについてはＮＧＣＧ、ＳｐＣａｓ９－ＥＱＲバリアントについてはＮＧ
ＡＧ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮｍＣａｓ９）に
ついてはＮＮＮＮＧＡＴＴ又はＣｐｆｌについてはＴＴＴＶ等、利用されるＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼの種類に関連している配列と適合するようにさらに設計されることを理解す
るであろう。本発明のＲＮＡ分子は、各々が１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼと組み合わせて複合体を形成するよう設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼに対してそれぞれ１つ又は複数の異なるＰＡＭ配列を利用して関心のあるポリヌクレオ
チド配列を標的とするよう設計される。
Ａを利用する、つまり追加の標的認識要求として、ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９等
の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをｃｒＲＮＡと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）に隣接するプロトスペーサーに接する標的ＤＮＡのプロトスペーサーとの間のワトソン
・クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡに向かわせる。次に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼは、標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内部に二本鎖切断を作成する。当業
者は、本発明の操作されたＲＮＡ分子の各々がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
に接する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列と関連するように、例えばＰＡＭが、非限定的
な例として、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ
９ ＷＴ（ＳｐＣＡＳ９）についてはＮＧＧ又はＮＡＧ、「Ｎ」は任意の核酸塩基であり
、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）に
ついてはＮＮＧＲＲＴ、空腸（Ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９ ＷＴについてはＮＮＮＶＲＹＭ
、ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントについてはＮＧＡＮ又はＮＧＮＧ、ＳｐＣａｓ９－Ｖ
ＲＥＲバリアントについてはＮＧＣＧ、ＳｐＣａｓ９－ＥＱＲバリアントについてはＮＧ
ＡＧ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮｍＣａｓ９）に
ついてはＮＮＮＮＧＡＴＴ又はＣｐｆｌについてはＴＴＴＶ等、利用されるＣＲＩＳＰＲ
ヌクレアーゼの種類に関連している配列と適合するようにさらに設計されることを理解す
るであろう。本発明のＲＮＡ分子は、各々が１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレア
ーゼと組み合わせて複合体を形成するよう設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアー
ゼに対してそれぞれ１つ又は複数の異なるＰＡＭ配列を利用して関心のあるポリヌクレオ
チド配列を標的とするよう設計される。
【0216】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ＲＮＡでガイドされた
ＤＮＡヌクレアーゼは、ＤＮＡを細胞のゲノムの所望の位置で切断させるために使用され
てもよい。最も一般的に使用されるＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩ
ＳＰＲシステムに由来するけれども、他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼも本
明細書において記載されるゲノム編集組成物及び方法において使用するために熟慮される
。例えば、その内容を参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１５－
０２１１０２３を参照する。
ＤＮＡヌクレアーゼは、ＤＮＡを細胞のゲノムの所望の位置で切断させるために使用され
てもよい。最も一般的に使用されるＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩ
ＳＰＲシステムに由来するけれども、他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼも本
明細書において記載されるゲノム編集組成物及び方法において使用するために熟慮される
。例えば、その内容を参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１５－
０２１１０２３を参照する。
【0217】
本発明の実施において使用することができるＣＲＩＳＰＲシステムは、非常に多岐にわ
たる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＶ型システムとすることが
できる。適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａ
ｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃ
ａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、ＣａｓｌＯ、Ｃａｓｌ
２ａ、Ｃａｓｌ２ｂ、Ｃａｓｌ２ｃ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ Ｏｄ、Ｃ
ａｓＦ、ＣａｓＧ、Ｃａｓｌｉ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（又はＣａｓ
Ａ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ
）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ
５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ
２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３
、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕｌ９６６が
ある（Ｋｏｏｎｉｎ ２０１７等を参照）。
たる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＶ型システムとすることが
できる。適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａ
ｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃ
ａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、ＣａｓｌＯ、Ｃａｓｌ
２ａ、Ｃａｓｌ２ｂ、Ｃａｓｌ２ｃ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ Ｏｄ、Ｃ
ａｓＦ、ＣａｓＧ、Ｃａｓｌｉ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（又はＣａｓ
Ａ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ
）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ
５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ
２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３
、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕｌ９６６が
ある（Ｋｏｏｎｉｎ ２０１７等を参照）。
【0218】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃ
ＲＩＳＰＲシステムに由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等）である。ＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）、ストレプトコッカス サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、黄色
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍ
ａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ノカルディオプシス ダッソンビエイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐ
ｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス プリスチナエスピラリス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセ
ス ヴィリドクロモジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ）、ストレプトマイセス ヴィリドクロモジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖ
ｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム ロセウム（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム ロセウム（
Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルス アシド
カルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、
バシラス シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、
バシラス セレニチレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎ
ｓ）、エグジゴバクテリウム シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉ
ｒｉｃｕｍ）、デルブリュッキ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ
ｉ）、ラクトバシラス サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉ
ｕｓ）、ミクロシラ マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデ
リア バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロ
モナス ナフタレニボラン（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａ
ｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスファエラ ワト
ソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノテス属（Ｃｙａｎｏｔ
ｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロキスティス エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセ
トハロビウム アラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）
、アンモニフェックス デゲンシ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディ
セルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ
）、カンディダートゥス デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏ
ｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフ
ィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｊｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア マグナ
（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、（ナトラナエロビウス テルモフィルスムＮａ
ｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロ
ピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシ
ドチオバシラス カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、ア
シディチオバチルス フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅ
ｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマティウム ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕ
ｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニト
ロソコッカス ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、
ニトロソコッカス ワトソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュー
ドアルテロモナス ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌ
ｏｐｌａｎｋｔｉ）、クテドノバクテル ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂ
ｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａ
ｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅ
ｎａ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルトロスピラ マキシマ（Ａｒｔｈ
ｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルトロスピラ プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉ
ｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルトロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、
リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレウス クソノプラステス（Ｍｉｃ
ｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌ
ａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトーガ モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉ
ｓ）、テルモシフォ アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、
アカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、フランシセ
ラ ｃｆ．ノビシダ Ｆｘｌ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ
ｌ）、アリサイクロバチルス アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、オレイフィーラス属（Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓ
ｐ．）、細菌ＣＣ０９ ３９ ２４、デルタプロテオバクテリア細菌、又は既知のＰＡＭ
配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする任意の種に由来してもよい。無培養
細菌によってコードされたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもまた、本発明の文脈において使用
してもよい（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７を参照）。ｓｐＣ
ａｓ９ Ｄ１１３５Ｅバリアント、ｓｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント、ｓｐＣａｓ９ Ｅ
ＱＲバリアント又はｓｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアント等の、既知のＰＡＭ配列を有する
ＣＲＩＳＰＲタンパク質のバリアントもまた、本発明の文脈において使用してもよい。
ＲＩＳＰＲシステムに由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等）である。ＣＲＩ
ＳＰＲヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）、ストレプトコッカス サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、黄色
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍ
ａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ノカルディオプシス ダッソンビエイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐ
ｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス プリスチナエスピラリス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセ
ス ヴィリドクロモジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ）、ストレプトマイセス ヴィリドクロモジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖ
ｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム ロセウム（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム ロセウム（
Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルス アシド
カルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、
バシラス シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、
バシラス セレニチレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎ
ｓ）、エグジゴバクテリウム シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉ
ｒｉｃｕｍ）、デルブリュッキ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ
ｉ）、ラクトバシラス サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉ
ｕｓ）、ミクロシラ マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデ
リア バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロ
モナス ナフタレニボラン（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａ
ｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスファエラ ワト
ソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノテス属（Ｃｙａｎｏｔ
ｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロキスティス エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセ
トハロビウム アラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）
、アンモニフェックス デゲンシ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディ
セルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ
）、カンディダートゥス デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏ
ｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフ
ィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｊｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア マグナ
（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、（ナトラナエロビウス テルモフィルスムＮａ
ｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロ
ピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシ
ドチオバシラス カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、ア
シディチオバチルス フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅ
ｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマティウム ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕ
ｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニト
ロソコッカス ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、
ニトロソコッカス ワトソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュー
ドアルテロモナス ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌ
ｏｐｌａｎｋｔｉ）、クテドノバクテル ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂ
ｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａ
ｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅ
ｎａ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルトロスピラ マキシマ（Ａｒｔｈ
ｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルトロスピラ プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉ
ｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルトロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、
リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレウス クソノプラステス（Ｍｉｃ
ｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌ
ａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトーガ モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉ
ｓ）、テルモシフォ アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、
アカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、フランシセ
ラ ｃｆ．ノビシダ Ｆｘｌ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ
ｌ）、アリサイクロバチルス アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、オレイフィーラス属（Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓ
ｐ．）、細菌ＣＣ０９ ３９ ２４、デルタプロテオバクテリア細菌、又は既知のＰＡＭ
配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする任意の種に由来してもよい。無培養
細菌によってコードされたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもまた、本発明の文脈において使用
してもよい（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７を参照）。ｓｐＣ
ａｓ９ Ｄ１１３５Ｅバリアント、ｓｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント、ｓｐＣａｓ９ Ｅ
ＱＲバリアント又はｓｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアント等の、既知のＰＡＭ配列を有する
ＣＲＩＳＰＲタンパク質のバリアントもまた、本発明の文脈において使用してもよい。
【0219】
したがって、Ｃａｓ９タンパク質、修飾Ｃａｓ９、Ｃａｓ９のホモログあるいはオルソ
ログ等のあるＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣ
ｐｆｌ及びそのホモログ並びにオルソログ等の、他の型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する
他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを、本発明の組成物において使用してもよ
い。
ログ等のあるＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣ
ｐｆｌ及びそのホモログ並びにオルソログ等の、他の型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する
他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを、本発明の組成物において使用してもよ
い。
【0220】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、自然起源のＣａｓタンパク質
の「機能性誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然
配列ポリペプチドと共通した定性的な生物学的特徴を有する化合物である。「機能性誘導
体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物活性を有することを条件として
、天然配列のフラグメント並びに天然配列ポリペプチドの誘導体及びそのフラグメントが
含まれるが、これに限定されるものではない。本明細書において熟慮される生物活性は、
機能性誘導体がＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する能力である。用語「誘導体」は
、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、その共有結合的修飾物及びその融合物の両方
を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体又はそのフラグメントには、Ｃａｓタン
パク質の変異体、融合物、共有結合的修飾物又はそれらのフラグメントが含まれるが、こ
れに限定されるものではない。Ｃａｓタンパク質又はそのフラグメントを含む、Ｃａｓタ
ンパク質及びＣａｓタンパク質の誘導体又はそのフラグメントは、細胞から入手可能であ
ってもよく、化学的に合成してもよく、又はこれらの２個の製法の組み合わせによって入
手可能であってもよい。細胞は、自然にＣａｓタンパク質を産生する細胞であってもよく
、又は自然にＣａｓタンパク質を産生し、高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産
生するか、内因性Ｃａｓと同一又は異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸
からＣａｓタンパク質を産生するよう遺伝子改変された細胞であってもよい。いくつかの
場合において、この細胞は自然にはＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産
生するよう遺伝子改変される。
の「機能性誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然
配列ポリペプチドと共通した定性的な生物学的特徴を有する化合物である。「機能性誘導
体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物活性を有することを条件として
、天然配列のフラグメント並びに天然配列ポリペプチドの誘導体及びそのフラグメントが
含まれるが、これに限定されるものではない。本明細書において熟慮される生物活性は、
機能性誘導体がＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する能力である。用語「誘導体」は
、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、その共有結合的修飾物及びその融合物の両方
を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体又はそのフラグメントには、Ｃａｓタン
パク質の変異体、融合物、共有結合的修飾物又はそれらのフラグメントが含まれるが、こ
れに限定されるものではない。Ｃａｓタンパク質又はそのフラグメントを含む、Ｃａｓタ
ンパク質及びＣａｓタンパク質の誘導体又はそのフラグメントは、細胞から入手可能であ
ってもよく、化学的に合成してもよく、又はこれらの２個の製法の組み合わせによって入
手可能であってもよい。細胞は、自然にＣａｓタンパク質を産生する細胞であってもよく
、又は自然にＣａｓタンパク質を産生し、高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産
生するか、内因性Ｃａｓと同一又は異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸
からＣａｓタンパク質を産生するよう遺伝子改変された細胞であってもよい。いくつかの
場合において、この細胞は自然にはＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産
生するよう遺伝子改変される。
【0221】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃｐｆｌである。Ｃｐｆ
ｌは、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する単一のＲＮＡでガイドされた
エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆｌは、ＤＮＡをねじれ形のＤＮＡ二本鎖切断により開
裂する。Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属由来
の２個のＣｐｆｌ酵素が、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を行うことが証明さ
れている（Ｚｅｔｓｃｈｅら、（２０１５）Ｃｅｌｌ．を参照）。
ｌは、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する単一のＲＮＡでガイドされた
エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆｌは、ＤＮＡをねじれ形のＤＮＡ二本鎖切断により開
裂する。Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属由来
の２個のＣｐｆｌ酵素が、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を行うことが証明さ
れている（Ｚｅｔｓｃｈｅら、（２０１５）Ｃｅｌｌ．を参照）。
【0222】
したがって、Ｃａｓ９タンパク質又は修飾Ｃａｓ９あるいはＣａｓ９のホモログ、オル
ソログ又はバリアント等の、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡでガイドされたＤＮＡ
ヌクレアーゼあるいはＣｐｆｌ及びそのホモログ、オルソログ又はバリアント等の、他の
型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを、本
明細書において使用してもよい。
ソログ又はバリアント等の、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡでガイドされたＤＮＡ
ヌクレアーゼあるいはＣｐｆｌ及びそのホモログ、オルソログ又はバリアント等の、他の
型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを、本
明細書において使用してもよい。
【0223】
いくつかの実施形態において、ガイド分子は、新規の又は改良された特性を加える１つ
又は複数の化学修飾（例えば、分解からの安定性の改善、ハイブリッドエネルギーの改善
又はＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼとの結合特性の改善等）を含む。適切な化
学修飾には、修飾塩基、修飾糖部分又は修飾ヌクレオシド間結合が含まれるがこれに限定
されるものではない。適切な化学修飾の非限定的な例としては、４－アセチルシチジン、
５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’－０－メチルシチジン、５－カルボ
キシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジ
ン、ジヒドロウリジン、２’－０－メチルプソイドウリジン、「β、Ｄ－ガラクトシルキ
ュェオシン」、２’－０－メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシ
ン、１－メチルアデノシン、ｌ－メチルプソイドウリジン、ｌ－メチルグアノシン、１－
メチルイノシン、「２，２－ジメチルグアノシン」、２－メチルアデノシン、２－メチル
グアノシン、３－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－
メチルグアノシン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－
チオウリジン、「β、Ｄ－マンノシルキューオシン」、５－メトキシカルボニルメチル－
２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２
－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシル
－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－
リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン－５
－オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸、ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ、
キューオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、
４－チオウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－
６－イル）－カルバモイル）スレオニン、２’－０－メチル－５－メチルウリジン、２’
－Ｏ－メチルウリジン、ワイブトシン、「３－（３－アミノ－３－カルボキシ－プロピル
）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ」、２’－Ｏ－メチル（Ｍ），３‘－ホスホロチオエート（
ＭＳ）、３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン又は１－メチルプソイドウリ
ジンがある。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
又は複数の化学修飾（例えば、分解からの安定性の改善、ハイブリッドエネルギーの改善
又はＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼとの結合特性の改善等）を含む。適切な化
学修飾には、修飾塩基、修飾糖部分又は修飾ヌクレオシド間結合が含まれるがこれに限定
されるものではない。適切な化学修飾の非限定的な例としては、４－アセチルシチジン、
５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’－０－メチルシチジン、５－カルボ
キシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジ
ン、ジヒドロウリジン、２’－０－メチルプソイドウリジン、「β、Ｄ－ガラクトシルキ
ュェオシン」、２’－０－メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシ
ン、１－メチルアデノシン、ｌ－メチルプソイドウリジン、ｌ－メチルグアノシン、１－
メチルイノシン、「２，２－ジメチルグアノシン」、２－メチルアデノシン、２－メチル
グアノシン、３－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－
メチルグアノシン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－
チオウリジン、「β、Ｄ－マンノシルキューオシン」、５－メトキシカルボニルメチル－
２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２
－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシル
－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－
リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン－５
－オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸、ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ、
キューオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、
４－チオウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－
６－イル）－カルバモイル）スレオニン、２’－０－メチル－５－メチルウリジン、２’
－Ｏ－メチルウリジン、ワイブトシン、「３－（３－アミノ－３－カルボキシ－プロピル
）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ」、２’－Ｏ－メチル（Ｍ），３‘－ホスホロチオエート（
ＭＳ）、３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン又は１－メチルプソイドウリ
ジンがある。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【0224】
さらなる適切な化学修飾の非限定的な例としては、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）、
ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２‘－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ
（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシ
ン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ
６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチ
オ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニ
ルカルバモイルアデノシン（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）
）；ｔ６Ａ（Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチ
オ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－ス
レオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイ
ルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバ
モイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸塩））；Ｉ（
イノシン）；ｍ１Ｉ（ｌ－メチルイノシン）；ｍ１Ｉｍ（ｌ，２’－Ｏ－ジメチルイノシ
ン）；ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２
－チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジ
ン）；ｍ５Ｃｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２
’－Ｏ－メチルシチジン）；ｋ２Ｃ（ライシジン）；ｍ１Ｇ（ｌ－メチルグアノシン）；
ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’－Ｏ
－メチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２
、２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグ
アノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸塩））；ｙＷ（ワイブ
トシン）；０２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）
；ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ウイオシン）；ｍｉｍＧ（メ
チルウイオシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガ
ラクトシルキュェオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７－
シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ１（７－アミノメチル－７－デアザグアノシ
ン）；Ｇ＋（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメ
チルウリジン）；ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリ
ジン）；ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３－（３－ア
ミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍ
ｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５
Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキ
シメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン
メチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕ
ｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５
－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ５Ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－
２－チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ
（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノ
メチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃ
ｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５－
カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミ
ノメチル－２’－０－メチルウリジン）；ｃｍｍｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミ
ノメチル－２－チオウリジン）；ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’－０－メチルイノシ
ン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）；ｍ４Ｇｍ（Ｎ４，２’－０－ジメチルシチジン
）；ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ
５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’－０－ジメチルアデノシ
ン）；ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，０－２’－トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２
，７－ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン
）；ｍ３Ｕｍ（３，２’－０－ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジ
ン）；ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－０－メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（ｌ，２’－０
－ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（ｌ，２’－０－ジメチルアデノシン）；ｘｍ５Ｕ（
５－タウリノメチルウリジン）；ｘｍＶＵ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））
；ｉｍＧ－ｌ４（４－デメチルウイオシン）；ｉｍＧ２（イソウイオシン）；又はａｃ６
Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）がある。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
（米国特許第９，７５０，８２４号を参照）。
ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２‘－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ
（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシ
ン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ
６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチ
オ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニ
ルカルバモイルアデノシン（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）
）；ｔ６Ａ（Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチ
オ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－ス
レオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイ
ルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバ
モイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸塩））；Ｉ（
イノシン）；ｍ１Ｉ（ｌ－メチルイノシン）；ｍ１Ｉｍ（ｌ，２’－Ｏ－ジメチルイノシ
ン）；ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２
－チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジ
ン）；ｍ５Ｃｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２
’－Ｏ－メチルシチジン）；ｋ２Ｃ（ライシジン）；ｍ１Ｇ（ｌ－メチルグアノシン）；
ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’－Ｏ
－メチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２
、２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ２ ２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグ
アノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸塩））；ｙＷ（ワイブ
トシン）；０２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）
；ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ウイオシン）；ｍｉｍＧ（メ
チルウイオシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガ
ラクトシルキュェオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７－
シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ１（７－アミノメチル－７－デアザグアノシ
ン）；Ｇ＋（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメ
チルウリジン）；ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリ
ジン）；ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３－（３－ア
ミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍ
ｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５
Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキ
シメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン
メチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕ
ｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５
－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ５Ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－
２－チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ
（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノ
メチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃ
ｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５－
カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミ
ノメチル－２’－０－メチルウリジン）；ｃｍｍｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミ
ノメチル－２－チオウリジン）；ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’－０－メチルイノシ
ン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）；ｍ４Ｇｍ（Ｎ４，２’－０－ジメチルシチジン
）；ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ
５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’－０－ジメチルアデノシ
ン）；ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，０－２’－トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２
，７－ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン
）；ｍ３Ｕｍ（３，２’－０－ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジ
ン）；ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－０－メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（ｌ，２’－０
－ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（ｌ，２’－０－ジメチルアデノシン）；ｘｍ５Ｕ（
５－タウリノメチルウリジン）；ｘｍＶＵ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））
；ｉｍＧ－ｌ４（４－デメチルウイオシン）；ｉｍＧ２（イソウイオシン）；又はａｃ６
Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）がある。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
（米国特許第９，７５０，８２４号を参照）。
【0225】
変異対立遺伝子を特異的に標的とするガイド配列
一定の遺伝子には数千のＳＮＰが含まれてもよい。遺伝子の各ＳＮＰを標的とするため
に２４塩基対の標的ウィンドウを使用するとなると、数十万個のガイド配列が必要となる
だろう。ＳＮＰを標的とするよう利用されるときいかなる与えられたガイド配列であって
も、ガイド配列が分解する、活性が制限される、活性がなくなる、又はオフターゲット効
果が生じることがある。したがって、一定の遺伝子を標的とするには適切なガイド配列が
必要である。本発明によって、変異タンパク質の発現をノックアウトし、ＥＬＡＮＥ遺伝
子の変異対立遺伝子を不活性化し、そしてＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのガイド配列
の新規なセットが同定された。
一定の遺伝子には数千のＳＮＰが含まれてもよい。遺伝子の各ＳＮＰを標的とするため
に２４塩基対の標的ウィンドウを使用するとなると、数十万個のガイド配列が必要となる
だろう。ＳＮＰを標的とするよう利用されるときいかなる与えられたガイド配列であって
も、ガイド配列が分解する、活性が制限される、活性がなくなる、又はオフターゲット効
果が生じることがある。したがって、一定の遺伝子を標的とするには適切なガイド配列が
必要である。本発明によって、変異タンパク質の発現をノックアウトし、ＥＬＡＮＥ遺伝
子の変異対立遺伝子を不活性化し、そしてＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのガイド配列
の新規なセットが同定された。
【0226】
本開示は、機能性対立遺伝子は未修飾のままの一方で変異対立遺伝子を不活性化するた
めに特異的に標的とすることができるガイド配列を提供する。本発明のガイド配列は、変
異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で特異的に区別するよう設計され、区別する可能
性が最も高い。不活性化させたいと望まれる変異対立遺伝子を標的とする全ての可能なガ
イド配列のうち、本発明において開示される特異的なガイド配列は、開示される実施形態
で機能するのに特に効果的である。
めに特異的に標的とすることができるガイド配列を提供する。本発明のガイド配列は、変
異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で特異的に区別するよう設計され、区別する可能
性が最も高い。不活性化させたいと望まれる変異対立遺伝子を標的とする全ての可能なガ
イド配列のうち、本発明において開示される特異的なガイド配列は、開示される実施形態
で機能するのに特に効果的である。
【0227】
簡潔に言えば、ガイド配列は、以下の、（１）母集団、特定の民族集団又は患者集団で
の有病率が１％を超えて高く、同一の集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルヘテロ接合
率が１％を超える、ヘテロ接合性ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルを標的とし、（２）例え
ば、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン又はイントロン等の、遺伝子の任意の部分から５ｋ
塩基以内等の、遺伝子の部分に近位のＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置を標的とし、
（３）疾患／遺伝子のための創始者又は一般的な病原性変異を標的とするＲＮＡ分子を使
用して変異対立遺伝子を標的とするような特性を有してもよい。いくつかの実施形態にお
いて、母集団、特定の民族集団又は患者集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの有病率
は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％
、１３％、１４％又は１５％を超え、同一の集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルヘテ
ロ接合率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％
、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表し、随
意に組み合わせてもよい。
の有病率が１％を超えて高く、同一の集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルヘテロ接合
率が１％を超える、ヘテロ接合性ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルを標的とし、（２）例え
ば、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン又はイントロン等の、遺伝子の任意の部分から５ｋ
塩基以内等の、遺伝子の部分に近位のＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置を標的とし、
（３）疾患／遺伝子のための創始者又は一般的な病原性変異を標的とするＲＮＡ分子を使
用して変異対立遺伝子を標的とするような特性を有してもよい。いくつかの実施形態にお
いて、母集団、特定の民族集団又は患者集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの有病率
は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％
、１３％、１４％又は１５％を超え、同一の集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルヘテ
ロ接合率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％
、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表し、随
意に組み合わせてもよい。
【0228】
各遺伝子について、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルにしたがって、変異対立遺伝子を不
活性化するために以下の（１）１個のＲＮＡ分子を使用するノックアウト戦略―ＣＲＩＳ
ＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子に向けさせて二本鎖切断（ＤＳＢ）を作成し、変異対
立遺伝子のエキソン又はスプライス部位領域でフレームシフト変異を形成するために、１
個のＲＮＡ分子を利用する、（２）２個のＲＮＡ分子を使用するノックアウト戦略―２個
のＲＮＡ分子を利用する。第１のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のプロモーター内の領域
又は変異対立遺伝子の上流領域を標的とし、別のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のプロモ
ーター、エキソン又はイントロン内の第１のＲＮＡ分子の下流を標的とする、（３）エキ
ソン（複数含む）スキッピング戦略―スプライス部位を破壊するために、イントロンの５
’末端（ドナー配列）又はイントロンの３’末端（アクセプター配列）の何れかのスプラ
イス部位領域にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを向けさせるために１個のＲＮＡ分子を使用し
てもよい。戦略のうち任意の１つを使用してもよい。あるいは、第１のＲＮＡ分子はエキ
ソンの上流領域を標的とし、第２のＲＮＡ分子は第１のＲＮＡ分子の下流領域の標的とし
、それによりエキソン（複数含む）を切除するように、２個のＲＮＡ分子を利用してもよ
い。各変異対立遺伝子について同定されたＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置に基づい
て、変異対立遺伝子を不活性化するための上述した方法のいずれか１つ、又は組み合わせ
を利用してもよい。
活性化するために以下の（１）１個のＲＮＡ分子を使用するノックアウト戦略―ＣＲＩＳ
ＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子に向けさせて二本鎖切断（ＤＳＢ）を作成し、変異対
立遺伝子のエキソン又はスプライス部位領域でフレームシフト変異を形成するために、１
個のＲＮＡ分子を利用する、（２）２個のＲＮＡ分子を使用するノックアウト戦略―２個
のＲＮＡ分子を利用する。第１のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のプロモーター内の領域
又は変異対立遺伝子の上流領域を標的とし、別のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のプロモ
ーター、エキソン又はイントロン内の第１のＲＮＡ分子の下流を標的とする、（３）エキ
ソン（複数含む）スキッピング戦略―スプライス部位を破壊するために、イントロンの５
’末端（ドナー配列）又はイントロンの３’末端（アクセプター配列）の何れかのスプラ
イス部位領域にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを向けさせるために１個のＲＮＡ分子を使用し
てもよい。戦略のうち任意の１つを使用してもよい。あるいは、第１のＲＮＡ分子はエキ
ソンの上流領域を標的とし、第２のＲＮＡ分子は第１のＲＮＡ分子の下流領域の標的とし
、それによりエキソン（複数含む）を切除するように、２個のＲＮＡ分子を利用してもよ
い。各変異対立遺伝子について同定されたＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置に基づい
て、変異対立遺伝子を不活性化するための上述した方法のいずれか１つ、又は組み合わせ
を利用してもよい。
【0229】
１個のＲＮＡ分子のみを使用するときは、ＳＮＰの位置がエキソンの中にあるか、又は
イントロンとエキソンとの間のスプライス部位のきわめて近く（２０塩基対内等）にある
ときである。２個のＲＮＡ分子を使用するとき、ガイド配列は、第１のＳＮＰが、５’非
翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始点の５’最初の２キロベース等の、エキソン１
の上流にあり、第２のＳＮＰが、転写開始点の５’最初の２キロベース、イントロン１、
２又は３内又はエキソン１、２又は３内等の、第１のＳＮＰの下流であるように、２個の
ＳＮＰを標的としてもよい。
イントロンとエキソンとの間のスプライス部位のきわめて近く（２０塩基対内等）にある
ときである。２個のＲＮＡ分子を使用するとき、ガイド配列は、第１のＳＮＰが、５’非
翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始点の５’最初の２キロベース等の、エキソン１
の上流にあり、第２のＳＮＰが、転写開始点の５’最初の２キロベース、イントロン１、
２又は３内又はエキソン１、２又は３内等の、第１のＳＮＰの下流であるように、２個の
ＳＮＰを標的としてもよい。
【0230】
本発明のガイド配列は、標的とする遺伝子の上流部分、好ましくは標的とする遺伝子の
最後のエキソンの上流部分のＳＮＰを標的としてもよい。ガイド配列は、エキソン１の上
流、例えば、５’非翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始点の５’最初の４～５キロ
ベース内のＳＮＰを標的としてもよい。
最後のエキソンの上流部分のＳＮＰを標的としてもよい。ガイド配列は、エキソン１の上
流、例えば、５’非翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始点の５’最初の４～５キロ
ベース内のＳＮＰを標的としてもよい。
【0231】
本発明のガイド配列はまた、既知のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位のき
わめて近く（５０塩基対内、より好ましくは２０塩基対内等）のＳＮＰを標的としてもよ
い。
わめて近く（５０塩基対内、より好ましくは２０塩基対内等）のＳＮＰを標的としてもよ
い。
【0232】
本発明のガイド配列はまた、（１）標的とする遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰ、（２）遺
伝子の上流及び下流のヘテロ接合性ＳＮＰ、（３）母集団、特定の民族集団又は患者集団
での、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの有病率が１％を超えるＳＮＰ、（４）グアニジン
－シトシン含有量が３０％を超えて８５％未満である、（５）４以上のチミン／ウラシル
反復配列または８以上のグアニン、シトシン又はアデノシン反復配列がない、（６）オフ
ターゲット解析によって同定されたオフターゲットがない、及び（７）好ましくはイント
ロンよりエキソンを標的とするか、又はＳＮＰの下流よりもＳＮＰの上流である、ものを
標的としてもよい。
伝子の上流及び下流のヘテロ接合性ＳＮＰ、（３）母集団、特定の民族集団又は患者集団
での、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの有病率が１％を超えるＳＮＰ、（４）グアニジン
－シトシン含有量が３０％を超えて８５％未満である、（５）４以上のチミン／ウラシル
反復配列または８以上のグアニン、シトシン又はアデノシン反復配列がない、（６）オフ
ターゲット解析によって同定されたオフターゲットがない、及び（７）好ましくはイント
ロンよりエキソンを標的とするか、又はＳＮＰの下流よりもＳＮＰの上流である、ものを
標的としてもよい。
【0233】
本発明の実施形態において、ＳＮＰは、遺伝子の上流又は下流であってもよい。本発明
の実施形態において、ＳＮＰは、遺伝子の上流又は下流４，０００塩基対内である。
の実施形態において、ＳＮＰは、遺伝子の上流又は下流４，０００塩基対内である。
【0234】
変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、
関心のある遺伝子の疾患発症性変異配列の上流、下流又は内部であってもよい。変異対立
遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある
遺伝子のエキソン内部又はイントロン内部にあってもよい。いくつかの実施形態において
、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、
関心のある遺伝子のエキソン内部にある。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子
と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある遺伝子
のエキソン内部又はイントロン内部にある、すなわちイントロンとエキソンの間のスプラ
イス部位のきわめて近く、例えば、スプライス部位の１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチ
ド上流又は下流にある。
関心のある遺伝子の疾患発症性変異配列の上流、下流又は内部であってもよい。変異対立
遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある
遺伝子のエキソン内部又はイントロン内部にあってもよい。いくつかの実施形態において
、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、
関心のある遺伝子のエキソン内部にある。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子
と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある遺伝子
のエキソン内部又はイントロン内部にある、すなわちイントロンとエキソンの間のスプラ
イス部位のきわめて近く、例えば、スプライス部位の１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチ
ド上流又は下流にある。
【0235】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、一塩基多型（ＳＮＰ
）である。いくつかの実施形態において、ＳＮＰのヌクレオチドバリアントの各々は、変
異対立遺伝子で発現してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは、創始者又は一
般的な病原性変異であってもよい。
）である。いくつかの実施形態において、ＳＮＰのヌクレオチドバリアントの各々は、変
異対立遺伝子で発現してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは、創始者又は一
般的な病原性変異であってもよい。
【0236】
ガイド配列は、（１）母集団で１％を超える等の、母集団での有病率が高いこと、そし
て（２）１％を超える等の、母集団でのヘテロ接合率が高いことの両方を持つＳＮＰを標
的としてもよい。ガイド配列は、世界中に分布するＳＮＰを標的としてもよい。ＳＮＰは
、創始者又は一般的な病原性変異であってもよい。いくつかの実施形態において、母集団
での有病率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１
％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態において、母集団でのヘテロ接合率は、１％、２％、３％、４％、５
％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超
える。各可能性は、別々の実施形態を表す。
て（２）１％を超える等の、母集団でのヘテロ接合率が高いことの両方を持つＳＮＰを標
的としてもよい。ガイド配列は、世界中に分布するＳＮＰを標的としてもよい。ＳＮＰは
、創始者又は一般的な病原性変異であってもよい。いくつかの実施形態において、母集団
での有病率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１
％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態において、母集団でのヘテロ接合率は、１％、２％、３％、４％、５
％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超
える。各可能性は、別々の実施形態を表す。
【0237】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少な
くとも１つのヌクレオチドは、集団において有病率が高い疾患発症性変異と関連づけられ
る／共存する。このような実施形態において、「有病率が高い」とは、少なくとも９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を指す。各可
能性は、本発明の別々の実施形態を表す。１つの実施形態において、変異対立遺伝子と機
能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、疾患発症性変異である
。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは集団内で高度に蔓延している。このような実施
形態において、「高度に蔓延している」とは、集団の少なくとも１０％、１１％、１２％
、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％を指す
。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
くとも１つのヌクレオチドは、集団において有病率が高い疾患発症性変異と関連づけられ
る／共存する。このような実施形態において、「有病率が高い」とは、少なくとも９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を指す。各可
能性は、本発明の別々の実施形態を表す。１つの実施形態において、変異対立遺伝子と機
能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、疾患発症性変異である
。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは集団内で高度に蔓延している。このような実施
形態において、「高度に蔓延している」とは、集団の少なくとも１０％、１１％、１２％
、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％を指す
。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【0238】
本発明のガイド配列は、上記基準のいずれか１つを満たしてもよく、変異対立遺伝子を対
応する機能性対立遺伝子と区別する可能性が最も高い。
応する機能性対立遺伝子と区別する可能性が最も高い。
【0239】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、以下の表１に示されるようなＳＮＰ由来
のＥＬＡＮＥ遺伝子に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とする。ＳＮＰの詳細は左から
１番目のカラムに示され、ＳＮＰ ＩＤを含む（一塩基多型のＮＣＢＩの２０１８年版デ
ータベース（ｄｂＳＮＰ）に基づく）。ｒｓ番号がないバリアントについては、バリアン
トの特性をｇｎｏｍＡＤ ２０１８ブラウザーデータベースに基づいて示した。２番目の
カラムでは、各ＳＮＰに割り当てられた識別子を示す。３番目のカラムでは、ＥＬＡＮＥ
遺伝子上での各ＳＮＰの位置を示す。
のＥＬＡＮＥ遺伝子に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とする。ＳＮＰの詳細は左から
１番目のカラムに示され、ＳＮＰ ＩＤを含む（一塩基多型のＮＣＢＩの２０１８年版デ
ータベース（ｄｂＳＮＰ）に基づく）。ｒｓ番号がないバリアントについては、バリアン
トの特性をｇｎｏｍＡＤ ２０１８ブラウザーデータベースに基づいて示した。２番目の
カラムでは、各ＳＮＰに割り当てられた識別子を示す。３番目のカラムでは、ＥＬＡＮＥ
遺伝子上での各ＳＮＰの位置を示す。
【表1】
【0240】
図５ではヒト集団において表１から選択されたある一定のＳＮＰの異型遺伝子性を開示
する。
する。
【0241】
本発明の実施形態は、ＳＮＰ位置の上流からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴ
Ｒまでのプロモーター領域を切除することを含んでもよい。ある実施形態において、第１
のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰの特異的な配列（戦略
１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ－ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイ
ド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする（図１
）。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテ
ロ接合性ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ－ｒｓ３７
６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイ
ントロン３の配列を標的とする。別の実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立
遺伝子の上流領域のヘテロ接合ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７
、戦略１ｂ－ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対
立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする（図２）。
Ｒまでのプロモーター領域を切除することを含んでもよい。ある実施形態において、第１
のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰの特異的な配列（戦略
１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ－ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイ
ド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする（図１
）。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテ
ロ接合性ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ－ｒｓ３７
６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイ
ントロン３の配列を標的とする。別の実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立
遺伝子の上流領域のヘテロ接合ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７
、戦略１ｂ－ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対
立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする（図２）。
【0242】
本発明の実施形態は、イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下
流の領域を切除することを含んでもよい。ある実施形態において、第１のガイド配列は、
変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２－ｒｓ１６
８３５６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイン
トロン４の配列を標的とする。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対
立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２－ｒｓ１６８３５
６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン
３の配列を標的とする。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝
子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２－ｒｓ１６８３５６４）
を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列
を標的とする（図３）。
流の領域を切除することを含んでもよい。ある実施形態において、第１のガイド配列は、
変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２－ｒｓ１６
８３５６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイン
トロン４の配列を標的とする。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対
立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２－ｒｓ１６８３５
６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン
３の配列を標的とする。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝
子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２－ｒｓ１６８３５６４）
を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列
を標的とする（図３）。
【0243】
本発明の実施形態は、イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下
流領域までを切除する。この戦略は、健常な対立遺伝子を無傷のままにする一方、疾患発
症性対立遺伝子（「変異対立遺伝子」）を特異的にノックアウトするよう設計される。対
立遺伝子特異的編集は、集団におけるヘテロ接合頻度が比較的高い区別する（ヘテロ接合
性）ＳＮＰ位置を標的とするガイドを使用することにより達成される（図４）。
流領域までを切除する。この戦略は、健常な対立遺伝子を無傷のままにする一方、疾患発
症性対立遺伝子（「変異対立遺伝子」）を特異的にノックアウトするよう設計される。対
立遺伝子特異的編集は、集団におけるヘテロ接合頻度が比較的高い区別する（ヘテロ接合
性）ＳＮＰ位置を標的とするガイドを使用することにより達成される（図４）。
【0244】
細胞への送達
例示される方法において、本明細書において記載されるＲＮＡ分子及び組成物を任意の
適切な手段により標的細胞又は対象に送達してもよいことが理解される。以下の実施形態
は、本発明のＲＮＡ分子及び組成物を送達する方法の非限定的な例を提供する。
例示される方法において、本明細書において記載されるＲＮＡ分子及び組成物を任意の
適切な手段により標的細胞又は対象に送達してもよいことが理解される。以下の実施形態
は、本発明のＲＮＡ分子及び組成物を送達する方法の非限定的な例を提供する。
【0245】
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ分子及び組成物は、任意の哺乳類又は植
物細胞を含む、ドミナントネガティブな対立遺伝子を含む及び／又は発現する任意の細胞
を標的としてもよい。例えば、１つの実施形態において、ＲＮＡ分子は、変異ＥＬＡＮＥ
対立遺伝子を特異的に標的とし、標的細胞は、肝細胞である。
物細胞を含む、ドミナントネガティブな対立遺伝子を含む及び／又は発現する任意の細胞
を標的としてもよい。例えば、１つの実施形態において、ＲＮＡ分子は、変異ＥＬＡＮＥ
対立遺伝子を特異的に標的とし、標的細胞は、肝細胞である。
【0246】
本主題発明の、ＲＮＡ分子組成物等の、核酸組成物を送達するために、任意の適切なウ
イルス性ベクターシステムを使用してもよい。従来のウイルス性又は非ウイルス性に基づ
く遺伝子導入方法は、核酸及び標的組織を導入するために使用することができる。特定の
実施形態において、核酸は、インビトロ又はエクスビボ遺伝子治療用途で投与される。非
ウイルス性ベクター送達システムは、裸の核酸及びリポソーム又はポロクサマー等の送達
媒体と複合体を形成する核酸を含む。遺伝子治療方法を概説するため、Ａｎｄｅｒｓｏｎ
（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｉｇｎｅ
ｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅ
ｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６、Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩ
ＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：
４５５－４６０、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１
０）：１１４９－１１５４、Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６、Ｋｒｅｍｅｒ ＆
Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉ
ｎ ５１（１）：３１－４４、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｉｎ Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）、及びＹｕ ｅｔ ａｌ．（１
９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６を参照する。
イルス性ベクターシステムを使用してもよい。従来のウイルス性又は非ウイルス性に基づ
く遺伝子導入方法は、核酸及び標的組織を導入するために使用することができる。特定の
実施形態において、核酸は、インビトロ又はエクスビボ遺伝子治療用途で投与される。非
ウイルス性ベクター送達システムは、裸の核酸及びリポソーム又はポロクサマー等の送達
媒体と複合体を形成する核酸を含む。遺伝子治療方法を概説するため、Ａｎｄｅｒｓｏｎ
（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｉｇｎｅ
ｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅ
ｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６、Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩ
ＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：
４５５－４６０、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１
０）：１１４９－１１５４、Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６、Ｋｒｅｍｅｒ ＆
Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉ
ｎ ５１（１）：３１－４４、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｉｎ Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）、及びＹｕ ｅｔ ａｌ．（１
９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６を参照する。
【0247】
核酸及び／又はタンパク質の非ウイルス性送達方法としては、エレクトロポレーション
、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、粒子銃加速器、ビロソーム
、リポソーム、イムノリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリカチオン又は脂質：核
酸複合体、人工ビリオン及び核酸の薬剤増強取込みがあり、又は細菌もしくはウイルス（
アグロバクテリウム、根粒菌属、ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍｍｅｌｉ
ｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、タバコモザイクウイルス、ジャガイ
モウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス等）
によって植物に送達することができる。（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１ ｌ（ｌ）：ｌ－４等を参照）。Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２
０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）等を使用するＳｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎも、
核酸を送達するために使用することができる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性―
脂質媒介送達も、インビボ又はインビトロ送達方法として熟慮される。（Ｚｕｒｉｓ ｅ
ｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（ｌ）：７３－８０を参照
； Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９、８１
９－８２９； Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３、４９４
－５０５；及びＢａｓｈａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９、２１８
６－２２００も参照。）
、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、粒子銃加速器、ビロソーム
、リポソーム、イムノリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリカチオン又は脂質：核
酸複合体、人工ビリオン及び核酸の薬剤増強取込みがあり、又は細菌もしくはウイルス（
アグロバクテリウム、根粒菌属、ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍｍｅｌｉ
ｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、タバコモザイクウイルス、ジャガイ
モウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス等）
によって植物に送達することができる。（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１ ｌ（ｌ）：ｌ－４等を参照）。Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２
０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）等を使用するＳｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎも、
核酸を送達するために使用することができる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性―
脂質媒介送達も、インビボ又はインビトロ送達方法として熟慮される。（Ｚｕｒｉｓ ｅ
ｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（ｌ）：７３－８０を参照
； Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９、８１
９－８２９； Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３、４９４
－５０５；及びＢａｓｈａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９、２１８
６－２２００も参照。）
【0248】
さらなる代表的な核酸送達システムとしては、Ａｍａｘａ．ＲＴＭ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（ロックビル、Ｍｄ．）、ＢＴＸ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、Ｍａｓｓ．）及
びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが
ある（米国特許第６，００８，３３６号等を参照）。リポフェクションは、米国特許第５
，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号及び米国特許第４，８９７，３５
５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ａｍ．ＴＭ．、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．ＴＭ．及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．ＴＭ．
ＲＮＡｉＭＡＸ等）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適
したカチオン性及び中性脂質としては、Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９
１／１６０２４のものがある。送達を細胞（エクスビボ投与）又は標的組織（インビボ投
与）に対してすることができる。
ｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（ロックビル、Ｍｄ．）、ＢＴＸ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、Ｍａｓｓ．）及
びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが
ある（米国特許第６，００８，３３６号等を参照）。リポフェクションは、米国特許第５
，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号及び米国特許第４，８９７，３５
５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ａｍ．ＴＭ．、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．ＴＭ．及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．ＴＭ．
ＲＮＡｉＭＡＸ等）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適
したカチオン性及び中性脂質としては、Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９
１／１６０２４のものがある。送達を細胞（エクスビボ投与）又は標的組織（インビボ投
与）に対してすることができる。
【0249】
イムノリピド複合体等の標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に
周知である（Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０；Ｂ
ｌａｅｓｅら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７；Ｂ
ｅｈｒら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９；Ｒｅ
ｍｙら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４；Ｇａｏ
ら（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２；Ａｈｍａｄら（１９９
２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０；米国特許第１８６，１８３号、
同４，２１７，３４４号、同４，２３５，８７１号、同４，２６１，９７５号、同４，４
８５，０５４号、同４，５０１，７２８号、同４，７７４，０８５号、同４，８３７，０
２８号及び同４，９４６，７８７号等を参照）。
周知である（Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０；Ｂ
ｌａｅｓｅら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７；Ｂ
ｅｈｒら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９；Ｒｅ
ｍｙら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４；Ｇａｏ
ら（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２；Ａｈｍａｄら（１９９
２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０；米国特許第１８６，１８３号、
同４，２１７，３４４号、同４，２３５，８７１号、同４，２６１，９７５号、同４，４
８５，０５４号、同４，５０１，７２８号、同４，７７４，０８５号、同４，８３７，０
２８号及び同４，９４６，７８７号等を参照）。
【0250】
さらなる送達方法としては、送達される核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達担体（ＥＤＶ）に
パッケージングすることの使用がある。これらのＥＤＶは、抗体の一方の腕が標的細胞へ
の特異性を有し、他方がＥＤＶへの特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的細胞に
特異的に送達される。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面まで運び、次にＥＤＶは細胞内
へとエンドサイトーシスにより運ばれる。一度でも細胞内に入れば、内容物が放出される
（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２
７（７）：６４３を参照）。
パッケージングすることの使用がある。これらのＥＤＶは、抗体の一方の腕が標的細胞へ
の特異性を有し、他方がＥＤＶへの特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的細胞に
特異的に送達される。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面まで運び、次にＥＤＶは細胞内
へとエンドサイトーシスにより運ばれる。一度でも細胞内に入れば、内容物が放出される
（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２
７（７）：６４３を参照）。
【0251】
核酸をウイルス媒介送達するためにＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースシステムを使用す
ると、ウイルスを体内の特定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核へ輸送
するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与する
こともできるし（インビボ）、又は細胞をインビトロで処理し、改変細胞を患者に投与す
ることもできる（エクスビボ）。核酸を送達するための従来のウイルスベースシステムと
しては、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアベクター及び単純ヘルペスベク
ターがあるが、これに限定されるものではない。
ると、ウイルスを体内の特定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核へ輸送
するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与する
こともできるし（インビボ）、又は細胞をインビトロで処理し、改変細胞を患者に投与す
ることもできる（エクスビボ）。核酸を送達するための従来のウイルスベースシステムと
しては、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアベクター及び単純ヘルペスベク
ターがあるが、これに限定されるものではない。
【0252】
レトロウイルスの指向性は、異種エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化
させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させることができる。レンチウイ
ルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するか感染し、一般的に高いウイルス力価を引き
起こすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システム
の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６～１０ｋｂまでの異種配
列をパッケージする能力を有するシス作用性末端反復配列から成る。最小シス作用性ＬＴ
Ｒは、ベクターを複製しパッケージするのに十分であり、次に治療遺伝子を標的細胞に組
み込んで持続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く用いられるレトロウ
イルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイル
ス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及
びその組み合わせに基づくものがある（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら（１９９２
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６６：１６３５－１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１
７６：５８－５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３
７８；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４；ＰＣＴ
／ＵＳ９４／０５７００等を参照）。
させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させることができる。レンチウイ
ルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するか感染し、一般的に高いウイルス力価を引き
起こすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システム
の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６～１０ｋｂまでの異種配
列をパッケージする能力を有するシス作用性末端反復配列から成る。最小シス作用性ＬＴ
Ｒは、ベクターを複製しパッケージするのに十分であり、次に治療遺伝子を標的細胞に組
み込んで持続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く用いられるレトロウ
イルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイル
ス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及
びその組み合わせに基づくものがある（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら（１９９２
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６６：１６３５－１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１
７６：５８－５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３
７８；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４；ＰＣＴ
／ＵＳ９４／０５７００等を参照）。
【0253】
臨床試験において、少なくとも６個のウイルスベクター手法が現在利用可能であり、ヘ
ルパー細胞株に挿入された遺伝子により欠損ベクターを補完して形質導入薬剤を生成する
ことを含む手法を利用する。
ルパー細胞株に挿入された遺伝子により欠損ベクターを補完して形質導入薬剤を生成する
ことを含む手法を利用する。
【0254】
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床試験において使用されてきたレトロウイルスベクタ
ーの例である（Ｄｕｎｂａｒら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５；Ｋｏ
ｈｎら（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２；Ｍａｌｅｃｈら（１９９７
）ＰＮＡＳ９４：２２１２１３３－１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治
療治験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら（１９９５））
。ＭＦＧ－Ｓをパッケージしたベクトルについて５０％以上の形質導入効率が観察された
（Ｅｌｌｅｍら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０
－２０；Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２）
。
ーの例である（Ｄｕｎｂａｒら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５；Ｋｏ
ｈｎら（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２；Ｍａｌｅｃｈら（１９９７
）ＰＮＡＳ９４：２２１２１３３－１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治
療治験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら（１９９５））
。ＭＦＧ－Ｓをパッケージしたベクトルについて５０％以上の形質導入効率が観察された
（Ｅｌｌｅｍら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０
－２０；Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２）
。
【0255】
パッケージングセルは、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するため
に使用される。このような細胞には、アデノウィルス、ＡＡＶをパッケージする２９３細
胞、及びレトロウイルスをパッケージするＰｓｉ－２ ｃｅｌｌｓ又はＰＡ３１７が含ま
れる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子に
パッケージする生産細胞株によって作成される。このベクターは通常、パッケージングし
、その後宿主に組み込む（適用可能な場合）ために必要とされる最小のウイルス配列を含
み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換
される。欠損しているウイルス機能は、パッケージングセルラインによってトランスで供
給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、一般的にはパッケージン
グし、宿主ゲノムに組み込むために必要とされる、ＡＡＶゲノムからの末端逆位配列（Ｉ
ＴＲ）のみを持つ。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージされ、そこには他のＡＡＶ遺伝
子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラス
ミドが含まれる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウィルスにも感染する。ヘルパーウ
イルスは、ＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進
する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠いているので相当量はパッケージされてい
ない。アデノウィルスによる汚染を、アデノウィルスの方がＡＡＶより感受性が高い熱処
理等によって低減することができる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルスシステムを使
用して臨床規模で作成することができる（米国特許第７，４７９，５５４号を参照）。
に使用される。このような細胞には、アデノウィルス、ＡＡＶをパッケージする２９３細
胞、及びレトロウイルスをパッケージするＰｓｉ－２ ｃｅｌｌｓ又はＰＡ３１７が含ま
れる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子に
パッケージする生産細胞株によって作成される。このベクターは通常、パッケージングし
、その後宿主に組み込む（適用可能な場合）ために必要とされる最小のウイルス配列を含
み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換
される。欠損しているウイルス機能は、パッケージングセルラインによってトランスで供
給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、一般的にはパッケージン
グし、宿主ゲノムに組み込むために必要とされる、ＡＡＶゲノムからの末端逆位配列（Ｉ
ＴＲ）のみを持つ。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージされ、そこには他のＡＡＶ遺伝
子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラス
ミドが含まれる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウィルスにも感染する。ヘルパーウ
イルスは、ＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進
する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠いているので相当量はパッケージされてい
ない。アデノウィルスによる汚染を、アデノウィルスの方がＡＡＶより感受性が高い熱処
理等によって低減することができる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルスシステムを使
用して臨床規模で作成することができる（米国特許第７，４７９，５５４号を参照）。
【0256】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織タイプに対して高
い特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、ウイルスコー
トタンパク質がこのウイルスの外面にある融合タンパク質としてのリガンドを発現するこ
とによってある一定の細胞タイプに特異性を有するよう改変することができる。このリガ
ンドは、関心のある細胞タイプに存在すると知られている受容体に親和性を有するよう選
択される。例えば、Ｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９２：９７４７－９７５１で、モロニーマウス白血病ウイルスをｇｐ７０に融合したヒ
トヘレグリンを発現するよう改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子
受容体を発現した特定のヒト乳がん細胞に感染することが報告された。この原理を、標的
細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面受容体のためのリガンドを含む融合タンパク
質を発現する、他のウイルス標的細胞ペアに拡張することができる。例えば、繊維状ファ
ージを、実質的にあらゆる選択された細胞の受容体に対する特異的結合親和性を有する抗
体断片（ＦＡＢ又はＦｖ等）を呈するよう操作することができる。上の記述は主にウイル
スベクターに適用されるけれども、同一の原理を非ウイルス性ベクターに適用することが
できる。このようなベクターを、特異的な標的細胞による取り込みを好む特異的取り込み
配列を含むよう操作することができる。
い特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、ウイルスコー
トタンパク質がこのウイルスの外面にある融合タンパク質としてのリガンドを発現するこ
とによってある一定の細胞タイプに特異性を有するよう改変することができる。このリガ
ンドは、関心のある細胞タイプに存在すると知られている受容体に親和性を有するよう選
択される。例えば、Ｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９２：９７４７－９７５１で、モロニーマウス白血病ウイルスをｇｐ７０に融合したヒ
トヘレグリンを発現するよう改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子
受容体を発現した特定のヒト乳がん細胞に感染することが報告された。この原理を、標的
細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面受容体のためのリガンドを含む融合タンパク
質を発現する、他のウイルス標的細胞ペアに拡張することができる。例えば、繊維状ファ
ージを、実質的にあらゆる選択された細胞の受容体に対する特異的結合親和性を有する抗
体断片（ＦＡＢ又はＦｖ等）を呈するよう操作することができる。上の記述は主にウイル
スベクターに適用されるけれども、同一の原理を非ウイルス性ベクターに適用することが
できる。このようなベクターを、特異的な標的細胞による取り込みを好む特異的取り込み
配列を含むよう操作することができる。
【0257】
遺伝子治療ベクターを、個々の患者に、一般的に全身投与（例えば、硝子体内、静脈内
、腹腔内、筋肉内、皮下又は脳内注入）又は上述したような、局所投与によりインビボで
送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植した細胞（例えば、
リンパ球、骨髄穿刺法、細胞生検等）又は万能ドナー造血幹細胞などの、細胞にエクスビ
ボで送達することができ、通常ベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、続けて患者に
細胞を再移植する。
、腹腔内、筋肉内、皮下又は脳内注入）又は上述したような、局所投与によりインビボで
送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植した細胞（例えば、
リンパ球、骨髄穿刺法、細胞生検等）又は万能ドナー造血幹細胞などの、細胞にエクスビ
ボで送達することができ、通常ベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、続けて患者に
細胞を再移植する。
【0258】
診断、研究のため、又は遺伝子治療（例えば、遺伝子導入した細胞の宿主生物への再注
入を介して）のためのエクスビボ細胞遺伝子導入は、当業者に周知である。好ましい実施
形態において、細胞を対象生物から単離し、核酸組成物を用いて遺伝子導入し、対象生物
（患者等）に再注入する。エクスビボ遺伝子導入に適した各種細胞タイプは、当業者に周
知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａ
ｌ Ｃｅｌｌｓ、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、３ｒｄ
ｅｄ及び、患者からの細胞の単離及び培養方法を考察するためのそこに引用されている参
考文献を参照）。
入を介して）のためのエクスビボ細胞遺伝子導入は、当業者に周知である。好ましい実施
形態において、細胞を対象生物から単離し、核酸組成物を用いて遺伝子導入し、対象生物
（患者等）に再注入する。エクスビボ遺伝子導入に適した各種細胞タイプは、当業者に周
知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａ
ｌ Ｃｅｌｌｓ、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、３ｒｄ
ｅｄ及び、患者からの細胞の単離及び培養方法を考察するためのそこに引用されている参
考文献を参照）。
【0259】
適した細胞には、真核細胞及び／又は細胞株が含まれるが、これに限定されるものでは
ない。このような細胞又はこのような細胞から作製される細胞株の非限定的な例としては
、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｄ
ＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ等）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、
Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０－Ａｇｌ４、Ｈｅ
Ｌａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ
等）、ｐｅｒＣ６ ｃｅｌｌｓ、任意の植物細胞（分化型又は未分化型）、及びＳｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）等の昆虫細胞又はサッカロミセス、ピキア及び
シゾサッカロミセス等の真菌細胞がある。特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ－
Ｋ１、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞株である。さらに、初代細胞を単離し、治療される
患者に再導入して続けてガイドされたヌクレアーゼシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等）
による治療をするためにエクスビボで使用してもよい。適した初代細胞には、末梢血単核
球（ＰＢＭＣ）、及び限定されるものではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞等
の他の血液細胞サブセットが含まれる。適した細胞としてはまた、例として、胚性幹細胞
、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経型幹細胞及び間葉系幹細胞等の幹
細胞がある。
ない。このような細胞又はこのような細胞から作製される細胞株の非限定的な例としては
、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｄ
ＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ等）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、
Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０－Ａｇｌ４、Ｈｅ
Ｌａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ
等）、ｐｅｒＣ６ ｃｅｌｌｓ、任意の植物細胞（分化型又は未分化型）、及びＳｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）等の昆虫細胞又はサッカロミセス、ピキア及び
シゾサッカロミセス等の真菌細胞がある。特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ－
Ｋ１、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞株である。さらに、初代細胞を単離し、治療される
患者に再導入して続けてガイドされたヌクレアーゼシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等）
による治療をするためにエクスビボで使用してもよい。適した初代細胞には、末梢血単核
球（ＰＢＭＣ）、及び限定されるものではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞等
の他の血液細胞サブセットが含まれる。適した細胞としてはまた、例として、胚性幹細胞
、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経型幹細胞及び間葉系幹細胞等の幹
細胞がある。
【0260】
１つの実施形態において、幹細胞は、細胞遺伝子導入及び遺伝子治療のためのエクスビ
ボ方法において使用される。幹細胞を使用する利点は、インビトロで他の細胞タイプに分
化できること、又は骨髄内に生着するだろう哺乳類（細胞のドナー等）に導入することが
できることである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α等のサイトカインを使用し
てＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化する方法が知られてい
る（非限定的な例として、Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７
０２（１９９２）を参照）。
ボ方法において使用される。幹細胞を使用する利点は、インビトロで他の細胞タイプに分
化できること、又は骨髄内に生着するだろう哺乳類（細胞のドナー等）に導入することが
できることである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α等のサイトカインを使用し
てＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化する方法が知られてい
る（非限定的な例として、Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７
０２（１９９２）を参照）。
【0261】
既知の方法を使用して、幹細胞を形質導入及び分化のために単離する。例えば、ＣＤ４
＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）及びｌａ
ｄ（分化抗体提示細胞）等の不必要な細胞と結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングす
ることにより、幹細胞を骨髄細胞から単離する（非限定的な例として、Ｉｎａｂａら（１
９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７０２を参照）。いくつかの実施形
態において、既に改変された幹細胞を使用してもよい。
＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）及びｌａ
ｄ（分化抗体提示細胞）等の不必要な細胞と結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングす
ることにより、幹細胞を骨髄細胞から単離する（非限定的な例として、Ｉｎａｂａら（１
９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７０２を参照）。いくつかの実施形
態において、既に改変された幹細胞を使用してもよい。
【0262】
一般的に、細胞は少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に投与さ
れる。成句「薬学的に許容される」とは、適切な医学的良識の範囲内であり、過剰な毒性
、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症なしで、妥当な利益／リスク比率で
つりあった、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適している、化合物、物質、組
成物及び／又は剤形を指す。成句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において使用
するとき、物質を被包する液体、固体充填剤、希釈剤、賦形剤又は溶媒等の薬学的に許容
される物質、組成物又は媒体を意味する。
れる。成句「薬学的に許容される」とは、適切な医学的良識の範囲内であり、過剰な毒性
、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症なしで、妥当な利益／リスク比率で
つりあった、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適している、化合物、物質、組
成物及び／又は剤形を指す。成句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において使用
するとき、物質を被包する液体、固体充填剤、希釈剤、賦形剤又は溶媒等の薬学的に許容
される物質、組成物又は媒体を意味する。
【0263】
本明細書において記載されるＲＮＡ分子組成物のいずれの１つも、有糸分裂後の細胞又
は活発に分裂しない、例えば停止細胞である、任意の細胞においてゲノム編集するのに適
している。本発明のＲＮＡ分子組成物を使用して編集されることができる有糸分裂後の細
胞の例は、肝細胞を含むが、これに限定されるものではない。
は活発に分裂しない、例えば停止細胞である、任意の細胞においてゲノム編集するのに適
している。本発明のＲＮＡ分子組成物を使用して編集されることができる有糸分裂後の細
胞の例は、肝細胞を含むが、これに限定されるものではない。
【0264】
治療核酸組成物を含むベクター（例えば、レトロウイルス、リポソーム等）を、インビ
ボで細胞に形質導入するために生物に直接投与することもできる。投与は、注射、注入、
局所投与（点眼及びクリーム等）及びエレクトロポレーションを含むが、これに限定され
るものではない、分子を血液細胞又は組織細胞と究極的に接触させて導入するために通常
使用される経路のいずれかである。このような核酸を投与するのに適した方法は、当業者
に利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために１つを超える経路を使用
できるけれども、特定の経路が別の経路より即時で効果的な反応を提供できることが多い
。いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＩＶ注射により送達される。
ボで細胞に形質導入するために生物に直接投与することもできる。投与は、注射、注入、
局所投与（点眼及びクリーム等）及びエレクトロポレーションを含むが、これに限定され
るものではない、分子を血液細胞又は組織細胞と究極的に接触させて導入するために通常
使用される経路のいずれかである。このような核酸を投与するのに適した方法は、当業者
に利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために１つを超える経路を使用
できるけれども、特定の経路が別の経路より即時で効果的な反応を提供できることが多い
。いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＩＶ注射により送達される。
【0265】
免疫細胞（Ｔ細胞等）に導入遺伝子を導入するのに適したベクターには、非組み込みレ
ンチウイルスベクターが含まれる。米国特許出願公開第２００９－０１１７６１７号を参
照する。
ンチウイルスベクターが含まれる。米国特許出願公開第２００９－０１１７６１７号を参
照する。
【0266】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、及び組成物を投与する
ために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載する
ように、利用可能な医薬品組成物の多種多様の適した製剤がある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ ｅｄ．、１９８９等
を参照）
ために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載する
ように、利用可能な医薬品組成物の多種多様の適した製剤がある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ ｅｄ．、１９８９等
を参照）
【0267】
いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと結合する／
関連している及び／又はＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを関心のある遺伝子の
変異誘発遺伝子と機能性対立遺伝子との間に差がある少なくとも１つのヌクレオチド（Ｓ
ＮＰ等）を含む配列（機能性対立遺伝子には存在しない変異誘発遺伝子の配列等）に向け
させるＲＮＡ分子を提供する。この配列は、疾患関連変異内部にあってもよい。この配列
は、疾患関連変異の上流又は下流にあってもよい。変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子と
の間のいかなる配列の差も機能性対立遺伝子の活性を保存する一方、本発明のＲＮＡ分子
によって変異対立遺伝子を不活性化するため、そうでなければ変異対立遺伝子のドミナン
トな疾患発症性効果を無効にするために、標的となってもよい。
関連している及び／又はＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを関心のある遺伝子の
変異誘発遺伝子と機能性対立遺伝子との間に差がある少なくとも１つのヌクレオチド（Ｓ
ＮＰ等）を含む配列（機能性対立遺伝子には存在しない変異誘発遺伝子の配列等）に向け
させるＲＮＡ分子を提供する。この配列は、疾患関連変異内部にあってもよい。この配列
は、疾患関連変異の上流又は下流にあってもよい。変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子と
の間のいかなる配列の差も機能性対立遺伝子の活性を保存する一方、本発明のＲＮＡ分子
によって変異対立遺伝子を不活性化するため、そうでなければ変異対立遺伝子のドミナン
トな疾患発症性効果を無効にするために、標的となってもよい。
【0268】
開示される組成物及び方法はまた、患者のドミナントな遺伝障害を治療するための薬物
の製造に使用されてもよい。
の製造に使用されてもよい。
【0269】
本明細書において開示されるいくつかの実施形態についての作用機構
ＳＣＮ又はＣｙＮを引き起こすと証明されたＥＬＡＮＥの変異は、切断型Ｎ－終端タン
パク質を生成するフレームＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の代替物からの翻訳
を媒介し、その結果ＥＲ及びタンパク質ミスフォールディングストレスの原因となる。
ＳＣＮ又はＣｙＮを引き起こすと証明されたＥＬＡＮＥの変異は、切断型Ｎ－終端タン
パク質を生成するフレームＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の代替物からの翻訳
を媒介し、その結果ＥＲ及びタンパク質ミスフォールディングストレスの原因となる。
【0270】
いかなる理論又は機構にも拘束されることを望むものではないが、本発明は、ＳＣＮ又
はＣｙＮを防止、寛解又は治療するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを適用して変異し
た病原性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の発現を防止するか、変異した病原性対立遺伝子から切断
型非病原性ペプチドを作成するか、又は変異した病原性ＥＬＡＮＥを修復／修正するなど
、変異した病原性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を処理するが機能性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子は処理
しないために利用される。
はＣｙＮを防止、寛解又は治療するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを適用して変異し
た病原性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の発現を防止するか、変異した病原性対立遺伝子から切断
型非病原性ペプチドを作成するか、又は変異した病原性ＥＬＡＮＥを修復／修正するなど
、変異した病原性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を処理するが機能性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子は処理
しないために利用される。
【0271】
ＯＲＦの上流又は下流に位置するＳＮＰを利用するいくつかの別の編集戦略を適用して
もよい。この戦略には、全遺伝子の除去、遺伝子のＣ―終端を除去するための遺伝子の切
断及び遺伝子の発現の減弱が含まれる。
もよい。この戦略には、全遺伝子の除去、遺伝子のＣ―終端を除去するための遺伝子の切
断及び遺伝子の発現の減弱が含まれる。
【0272】
いくつかの実施形態において、２個のガイド（表２に開示されたガイド等）を、全遺伝
子（すなわちエキソン１、２、３、４及び５）を除去して変異タンパク質をノックアウト
するために利用してもよい。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡを、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のＯＲＦ上流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列を標的とするこ
とにより対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために利用し、第２のガイドＲＮＡを、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のエキソン５に位置する又は変異対立遺伝子の下流に位置するＳＮＰ／ＷＴ
配列、又はＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のイントロン４、３’ＵＴＲ又は下流に位置す
る配列、又はＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のイントロン４、３’ＵＴＲ又は下流に位置
するＳＮＰ／ＷＴ配列にＤＳＢを媒介するために利用してもよい。
子（すなわちエキソン１、２、３、４及び５）を除去して変異タンパク質をノックアウト
するために利用してもよい。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡを、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のＯＲＦ上流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列を標的とするこ
とにより対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために利用し、第２のガイドＲＮＡを、ＥＬ
ＡＮＥ遺伝子のエキソン５に位置する又は変異対立遺伝子の下流に位置するＳＮＰ／ＷＴ
配列、又はＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のイントロン４、３’ＵＴＲ又は下流に位置す
る配列、又はＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のイントロン４、３’ＵＴＲ又は下流に位置
するＳＮＰ／ＷＴ配列にＤＳＢを媒介するために利用してもよい。
【0273】
エキソン３までに位置する終止コドンを獲得することになるフレームシフト変異を抱え
る健康な個人の記録がある。したがって、可能性のある戦略は、最大でエキソン１から３
までを含むように変異対立遺伝子を切断することであってもよい。いくつかの実施形態に
おいて、２個のガイド（表２に開示されたガイド等）を、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺
伝子のｃ－終端を切断するために利用してもよい。いくつかの実施形態において、第１の
ガイドＲＮＡを、変異対立遺伝子のエキソン５又は下流のＳＮＰ／ＷＴ配列を標的とする
ことにより対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために利用してもよく、第２のガイドＲＮ
Ａを、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン１、２又は３に位置する配列又はＳＮＰ／ＷＴ配列
のＤＳＢを媒介するために利用してもよい。切断型変異対立遺伝子によってコードされた
ペプチド／タンパク質は、病原性効果を示さなくてもよい。あるいは、ナンセンス変異依
存ｍＲＮＡ分解機構をトリガーとして変異対立遺伝子の発現をノックアウトしてもよい。
結果をｍＲＮＡ及びタンパク質発現を検査することにより検証してもよい。
る健康な個人の記録がある。したがって、可能性のある戦略は、最大でエキソン１から３
までを含むように変異対立遺伝子を切断することであってもよい。いくつかの実施形態に
おいて、２個のガイド（表２に開示されたガイド等）を、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺
伝子のｃ－終端を切断するために利用してもよい。いくつかの実施形態において、第１の
ガイドＲＮＡを、変異対立遺伝子のエキソン５又は下流のＳＮＰ／ＷＴ配列を標的とする
ことにより対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために利用してもよく、第２のガイドＲＮ
Ａを、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン１、２又は３に位置する配列又はＳＮＰ／ＷＴ配列
のＤＳＢを媒介するために利用してもよい。切断型変異対立遺伝子によってコードされた
ペプチド／タンパク質は、病原性効果を示さなくてもよい。あるいは、ナンセンス変異依
存ｍＲＮＡ分解機構をトリガーとして変異対立遺伝子の発現をノックアウトしてもよい。
結果をｍＲＮＡ及びタンパク質発現を検査することにより検証してもよい。
【0274】
いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子の発現を、ＯＲＦ上流に位置するＳＮＰ
を使用して配列を近位プロモーター及びエンハンサー領域から要素を切除することにより
減弱してもよい。非限定的な例において、ＳＮＰを標的とすることによりエンハンサー領
域の大部分を切除することにより、かなりの減少を達成してもよい。
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を特異的に標的とするＲＮＡガイド配列の例
を使用して配列を近位プロモーター及びエンハンサー領域から要素を切除することにより
減弱してもよい。非限定的な例において、ＳＮＰを標的とすることによりエンハンサー領
域の大部分を切除することにより、かなりの減少を達成してもよい。
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を特異的に標的とするＲＮＡガイド配列の例
【0275】
多くのガイド配列は、変異対立遺伝子を標的とするよう設計することができるけれども
、以下の配列番号１～１１９２によって特定される表２に記載されたヌクレオチド配列は
、本明細書に記載されている方法を効果的に実行するために、そして対立遺伝子間を効果
的に区別するために特異的に選択された。
、以下の配列番号１～１１９２によって特定される表２に記載されたヌクレオチド配列は
、本明細書に記載されている方法を効果的に実行するために、そして対立遺伝子間を効果
的に区別するために特異的に選択された。
【0276】
カラム１～４を参照すると、カラム１に示される配列番号１～１１９２の各々は、操作
されたガイド配列に対応する。対応するＳＮＰの詳細は、カラム２に示される。２番目の
カラムに示されるＳＮＰの詳細は、表１に示されるＳＮＰ ＩＤに対応する各ＳＮＰに割
り当てられた識別子を示す。カラム３は、各ガイド配列の標的が示される部位でＥＬＡＮ
Ｅ遺伝子の多型か野生型配列かどうかを示す。カラム４は、示される部位での各ガイド配
列のグアニン－シトシン含有量を示す。
されたガイド配列に対応する。対応するＳＮＰの詳細は、カラム２に示される。２番目の
カラムに示されるＳＮＰの詳細は、表１に示されるＳＮＰ ＩＤに対応する各ＳＮＰに割
り当てられた識別子を示す。カラム３は、各ガイド配列の標的が示される部位でＥＬＡＮ
Ｅ遺伝子の多型か野生型配列かどうかを示す。カラム４は、示される部位での各ガイド配
列のグアニン－シトシン含有量を示す。
【0277】
表２では、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子配列内部の異なるＳＮＰと関連づけて上記実施形
態において記載されるように使用するために設計されたガイド配列を示す。各操作された
ガイド分子はさらに、配列ＮＧＧ又はＮＡＧ（「Ｎ」は任意の核酸塩基である）と適合す
るＰＡＭ等の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接して位置する関心のある標
的ゲノムＤＮＡ配列と関連するように設計される。このガイド配列は、ＳｐＣａｓ９ＷＴ
（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．ｌ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＡＮ）
、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．２（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＥＱＲ（Ｐ
ＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＡＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＲＥＲ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＣＧ）、Ｓ
ａＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＧＲＲＴ）、ＮｍＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ
：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｃｐｆｌ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＴＴＴＶ）又はＪｅＣａｓ９ＷＴ（
ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＮＶＲＹＭ）等を含むが、これに限定されない、１つ又は複数の異
なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて機能するよう設計された。本発明のＲＮＡ
分子は各々、１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて複合体を形
成するよう設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対してそれぞれ１つ又は複
数の異なるＰＡＭ配列を利用して関心のあるポリヌクレオチド配列を標的とするよう設計
される。
態において記載されるように使用するために設計されたガイド配列を示す。各操作された
ガイド分子はさらに、配列ＮＧＧ又はＮＡＧ（「Ｎ」は任意の核酸塩基である）と適合す
るＰＡＭ等の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接して位置する関心のある標
的ゲノムＤＮＡ配列と関連するように設計される。このガイド配列は、ＳｐＣａｓ９ＷＴ
（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．ｌ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＡＮ）
、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．２（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＥＱＲ（Ｐ
ＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＡＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＲＥＲ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＧＣＧ）、Ｓ
ａＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＧＲＲＴ）、ＮｍＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ ＳＥＱ
：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｃｐｆｌ（ＰＡＭ ＳＥＱ：ＴＴＴＶ）又はＪｅＣａｓ９ＷＴ（
ＰＡＭ ＳＥＱ：ＮＮＮＶＲＹＭ）等を含むが、これに限定されない、１つ又は複数の異
なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて機能するよう設計された。本発明のＲＮＡ
分子は各々、１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて複合体を形
成するよう設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対してそれぞれ１つ又は複
数の異なるＰＡＭ配列を利用して関心のあるポリヌクレオチド配列を標的とするよう設計
される。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【表2-10】
【表2-11】
【表2-12】
【表2-13】
【表2-14】
【表2-15】
【表2-16】
【表2-17】
【表2-18】
【表2-19】
【表2-20】
【表2-21】
【表2-22】
【表2-23】
【表2-24】
【表2-25】
【表2-26】
【表2-27】
【表2-28】
【表2-29】
【表2-30】
【表2-31】
【0278】
前述の実施形態にとって、本明細書に開示された各実施形態は、他の開示された実施形
態の各々に適用できると考慮される。例えば、本発明の任意のＲＮＡ分子又は組成物を本
発明の任意の方法において利用してもよいことが理解される。
態の各々に適用できると考慮される。例えば、本発明の任意のＲＮＡ分子又は組成物を本
発明の任意の方法において利用してもよいことが理解される。
【0279】
本明細書において使用するとき、全ての見出しはただ構成のためのみであり、いかなる
方式でも本開示を制限することを意図するものではない。いかなる個々の段落の内容も全
ての段落に等しく適用可能であってもよい。
方式でも本開示を制限することを意図するものではない。いかなる個々の段落の内容も全
ての段落に等しく適用可能であってもよい。
【0280】
本発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例
で本発明を作成し、実施する例示的モードを説明する。しかしながら、本発明の範囲はこ
れらの実施例において開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、説明のみを
目的としている。
で本発明を作成し、実施する例示的モードを説明する。しかしながら、本発明の範囲はこ
れらの実施例において開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、説明のみを
目的としている。
【0281】
さらに、本発明における以下の実施例は、ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９を開示される
ＳＮＰ位置に向けさせるのに適したガイド配列を、利用することを含む方法を開示する。
実施例では開示される戦略の実現可能性が証明される。当業者は、特定の戦略の各々を適
用するために同一のガイド配列を異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとともに使用して、開
示されるＳＮＰを標的としてもよいことを理解するだろう。さらに、特定の戦略の各々を
適用するために、他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを同一のＳＮＰに向けさせる異なるガイ
ド配列を他のヌクレアーゼと一緒に使用してもよい。
ＳＮＰ位置に向けさせるのに適したガイド配列を、利用することを含む方法を開示する。
実施例では開示される戦略の実現可能性が証明される。当業者は、特定の戦略の各々を適
用するために同一のガイド配列を異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとともに使用して、開
示されるＳＮＰを標的としてもよいことを理解するだろう。さらに、特定の戦略の各々を
適用するために、他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを同一のＳＮＰに向けさせる異なるガイ
ド配列を他のヌクレアーゼと一緒に使用してもよい。
【実施例0282】
実験的詳細
実施例１：ＳｐＣａｓ９と組み合わせて機能するのに適したＳＮＰを標的とするガイド配
列及び開示される戦略に従う配列を選別する
ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに播種した（３Ｋ／ウェル）。２４時間後、細胞を６５
ｎｇのＷＴ－Ｃａｓ９又はＤｅａｄ－Ｃａｓ９及びｇ３６～ｇ６６として識別され、Ｔｕ
ｒｂｏｆｅｃｔ試薬（サーモサイエンティフィック）を使用してＥＬＡＮＥの異なる領域
及びＳＮＰを標的とする、２０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドで同時導入した。１２時間後、
新鮮な培地を加え、そして遺伝子導入後７２時間で、ゲノムＤＮＡを抽出し、そしてＣａ
ｓ９によって標的とされる予想領域を増幅し、生成物のサイズをＤＮＡラダーによるキャ
ピラリー電気泳動により分析した。バンドの強度をＰｅａｋ Ｓｃａｎｎｅｒ ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ ｖｌ．０を使用して分析した。編集の割合を以下の式にしたがって算出した。
１００％－（未編集バンド強度／全バンド強度）Ｘ１００。図６には、３個の独立した実
験のＤｅａｄ－Ｃａｓ９バックグラウンド活性を減算した後の各ｇＲＮＡの平均活性±Ｓ
Ｄを表す。
実施例１：ＳｐＣａｓ９と組み合わせて機能するのに適したＳＮＰを標的とするガイド配
列及び開示される戦略に従う配列を選別する
ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに播種した（３Ｋ／ウェル）。２４時間後、細胞を６５
ｎｇのＷＴ－Ｃａｓ９又はＤｅａｄ－Ｃａｓ９及びｇ３６～ｇ６６として識別され、Ｔｕ
ｒｂｏｆｅｃｔ試薬（サーモサイエンティフィック）を使用してＥＬＡＮＥの異なる領域
及びＳＮＰを標的とする、２０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドで同時導入した。１２時間後、
新鮮な培地を加え、そして遺伝子導入後７２時間で、ゲノムＤＮＡを抽出し、そしてＣａ
ｓ９によって標的とされる予想領域を増幅し、生成物のサイズをＤＮＡラダーによるキャ
ピラリー電気泳動により分析した。バンドの強度をＰｅａｋ Ｓｃａｎｎｅｒ ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ ｖｌ．０を使用して分析した。編集の割合を以下の式にしたがって算出した。
１００％－（未編集バンド強度／全バンド強度）Ｘ１００。図６には、３個の独立した実
験のＤｅａｄ－Ｃａｓ９バックグラウンド活性を減算した後の各ｇＲＮＡの平均活性±Ｓ
Ｄを表す。
【0283】
【表3】
【0284】
実施例２：切除戦略の実現可能性を証明する
ＨｅＬａ細胞をｓｐＣａｓ９－ＷＴとＲＮＡのペア（複数）で同時導入したが、戦略ｌ
ａ、ｌｂ及び２のためにそれぞれｓｇ３５（ＩＮＴ４）とｇ３９（ｒｓ１０４ｌ４８３７
）、ｇ５８（ｒｓ３７６ｌ００５）又はｇ６２（ｒｓ１６８３５６４）のいずれかだった
。遺伝子導入後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣ
Ｒ（ｄｄＰＣＲ）キット（１００４２９５８及び１００３１２２８、バイオ・ラッドラボ
ラトリーズ）を使用して、エキソン１（戦略１）又はエキソン５（戦略２）のコピー数の
減少を測定することにより切除効率を評価した。さらに、戦略２の切除率を正規化するた
めにエキソン１を使用する一方、戦略１の切除率を正規化するためにエキソン５を使用し
た。表４に開示される結果には、２個の独立した実験の平均％切除±ＳＤ（標準偏差）を
示す。
ＨｅＬａ細胞をｓｐＣａｓ９－ＷＴとＲＮＡのペア（複数）で同時導入したが、戦略ｌ
ａ、ｌｂ及び２のためにそれぞれｓｇ３５（ＩＮＴ４）とｇ３９（ｒｓ１０４ｌ４８３７
）、ｇ５８（ｒｓ３７６ｌ００５）又はｇ６２（ｒｓ１６８３５６４）のいずれかだった
。遺伝子導入後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣ
Ｒ（ｄｄＰＣＲ）キット（１００４２９５８及び１００３１２２８、バイオ・ラッドラボ
ラトリーズ）を使用して、エキソン１（戦略１）又はエキソン５（戦略２）のコピー数の
減少を測定することにより切除効率を評価した。さらに、戦略２の切除率を正規化するた
めにエキソン１を使用する一方、戦略１の切除率を正規化するためにエキソン５を使用し
た。表４に開示される結果には、２個の独立した実験の平均％切除±ＳＤ（標準偏差）を
示す。
【0285】
【表4】
【0286】
実施例３：異なるｓｇＲＮＡによる編集を区別して対立遺伝子を評価する
製造業者説明書に従って、参照配列を標的とする、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）
を関連しているｇＲＮＡｓから構築し、ＷＴ－Ｃａｓ９（＃１０８１０５８）又はＨｉＦ
ｉＣａｓ９（＃１０８１０６０）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（ＩＤＴ）から購入した。次にＲＮＰを、関連しているＳＮＰを抱えるｉＰＳＣへと４
Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｏｒ（Ｒ）システム（ロンザ）を使用してヌクレオフェクト（ｎ
ｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）した。７２時間後、ｇＤＮＡを抽出し、ＳＮＰ領域を増幅し、
ＮＧＳ分析に送った。対立遺伝子の区別を参照対立遺伝子及び別の対立遺伝子で検出され
た編集割合にしたがって評価した。各部位でのインデル頻度をＣａｓ－Ａｎａｌｙｚｅｒ
ソフトウェアを使用して算出した。結果を表５に要約する。
製造業者説明書に従って、参照配列を標的とする、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）
を関連しているｇＲＮＡｓから構築し、ＷＴ－Ｃａｓ９（＃１０８１０５８）又はＨｉＦ
ｉＣａｓ９（＃１０８１０６０）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（ＩＤＴ）から購入した。次にＲＮＰを、関連しているＳＮＰを抱えるｉＰＳＣへと４
Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｏｒ（Ｒ）システム（ロンザ）を使用してヌクレオフェクト（ｎ
ｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）した。７２時間後、ｇＤＮＡを抽出し、ＳＮＰ領域を増幅し、
ＮＧＳ分析に送った。対立遺伝子の区別を参照対立遺伝子及び別の対立遺伝子で検出され
た編集割合にしたがって評価した。各部位でのインデル頻度をＣａｓ－Ａｎａｌｙｚｅｒ
ソフトウェアを使用して算出した。結果を表５に要約する。
【0287】
【表5】
【0288】
実施例４：ＨＳＣでの編集効率
健常ドナーからのＨＳＣをｓｐＣａｓ９－ＷＴ及びＥＭＸ１（ｓｇＥＭＸｌ）又はＥＬ
ＡＮＥ（ｇ３５：ＩＮＴ４；ｇ５８：ｒｓ３７６ｌ００５；ｇ６２：ｒｓ１６８３５６４
）のいずれかを標的とするｇＲＮＡのＲＮＡ構成要素でヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌ
ｅｏｆｅｃｔｅｄ）。ヌクレオフェクション後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、編集レベ
ルをＩＤＡＡにより定量した。図７には、二度繰り返して実施された２個の独立した実験
の平均編集％±ＳＤを示す。
健常ドナーからのＨＳＣをｓｐＣａｓ９－ＷＴ及びＥＭＸ１（ｓｇＥＭＸｌ）又はＥＬ
ＡＮＥ（ｇ３５：ＩＮＴ４；ｇ５８：ｒｓ３７６ｌ００５；ｇ６２：ｒｓ１６８３５６４
）のいずれかを標的とするｇＲＮＡのＲＮＡ構成要素でヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌ
ｅｏｆｅｃｔｅｄ）。ヌクレオフェクション後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、編集レベ
ルをＩＤＡＡにより定量した。図７には、二度繰り返して実施された２個の独立した実験
の平均編集％±ＳＤを示す。
【0289】
実施例５：機能性成熟アッセイ
修正された細胞における表現型の救出を証明するために、患者由来の人工多能性幹細胞
（ｉＰＳＣ）から始める成熟アッセイを、再プログラム化された体細胞から調製した。こ
の細胞は、患者由来細胞の再生可能な供給源を提供し、疾患表現型を正確に再現すること
が分かっている。簡潔には、患者のＰＢＭＣを、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉ
ｎ２８、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４及びＳＶ４０ＬＴである、再プログラム化遺伝子を発現す
るエピソーム構築物で遺伝子導入する。同一のＳＮＰ遺伝子型を抱える患者由来ｉＰＳＣ
及び通常のｉＰＳＣを、市販のキット（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅ
ｔｉｃ Ｋｉｔ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して造血前駆細
胞へと分化する。１２日後、分化効率を、フローサイトメトリー分析で前駆細胞マーカー
ＣＤ３４及びＣＤ４５の発現のために細胞を分析することにより推定する。通常及びＳＣ
Ｎ分化前駆細胞は、遺伝子編集を受け、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３及び好中球への
分化を促進するＧＭ－ＣＳＦを含む条件培地で５日間生育する。通常の未編集及び編集さ
れた細胞、すなわちＳＣＮの編集された細胞を好中球へと分化する一方、未編集のＳＣＮ
に由来する細胞は分化の早い段階で停止する。好中球への分化効率を、フローサイトメト
リーで好中球表面マーカー（例えばＣＤ１６、ＣＤ６６ｂ及び汎骨髄マーカーＣＤ３３の
発現上昇等）を検出することにより測定する。
修正された細胞における表現型の救出を証明するために、患者由来の人工多能性幹細胞
（ｉＰＳＣ）から始める成熟アッセイを、再プログラム化された体細胞から調製した。こ
の細胞は、患者由来細胞の再生可能な供給源を提供し、疾患表現型を正確に再現すること
が分かっている。簡潔には、患者のＰＢＭＣを、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉ
ｎ２８、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４及びＳＶ４０ＬＴである、再プログラム化遺伝子を発現す
るエピソーム構築物で遺伝子導入する。同一のＳＮＰ遺伝子型を抱える患者由来ｉＰＳＣ
及び通常のｉＰＳＣを、市販のキット（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅ
ｔｉｃ Ｋｉｔ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して造血前駆細
胞へと分化する。１２日後、分化効率を、フローサイトメトリー分析で前駆細胞マーカー
ＣＤ３４及びＣＤ４５の発現のために細胞を分析することにより推定する。通常及びＳＣ
Ｎ分化前駆細胞は、遺伝子編集を受け、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３及び好中球への
分化を促進するＧＭ－ＣＳＦを含む条件培地で５日間生育する。通常の未編集及び編集さ
れた細胞、すなわちＳＣＮの編集された細胞を好中球へと分化する一方、未編集のＳＣＮ
に由来する細胞は分化の早い段階で停止する。好中球への分化効率を、フローサイトメト
リーで好中球表面マーカー（例えばＣＤ１６、ＣＤ６６ｂ及び汎骨髄マーカーＣＤ３３の
発現上昇等）を検出することにより測定する。
【0290】
実施例６：免疫不全マウスにおけるインビボ投与量範囲知見及び体内分布パイロット研究
Ｇ－ＣＳＦを投与した後の、免疫不全ＮＳＧマウスにおける自己複製能力及び多系列能
力を有するＨＳＣの存在及び数を測定するために投与スケジュール、投与量範囲及び投与
経路を研究する。長期生着を確立するための機能免疫システムを再生することができるＨ
ＳＣの存在及び数を測定するために再増殖アッセイを実施する。このような検証のために
、ヒトの生着及び造血系再増殖を高度に支持する、ＮＳＧ細胞株を使用する。ＮＳＧマウ
スは、複数のサイトカインシグナル経路が欠損し、自然免疫に多くの欠陥があるのに加え
、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠いているＮＯＤ ＳＣＩＤ
マウスである。一次移植の１６週間後に生着を評価する（移植後１２週間後分析）。
Ｇ－ＣＳＦを投与した後の、免疫不全ＮＳＧマウスにおける自己複製能力及び多系列能
力を有するＨＳＣの存在及び数を測定するために投与スケジュール、投与量範囲及び投与
経路を研究する。長期生着を確立するための機能免疫システムを再生することができるＨ
ＳＣの存在及び数を測定するために再増殖アッセイを実施する。このような検証のために
、ヒトの生着及び造血系再増殖を高度に支持する、ＮＳＧ細胞株を使用する。ＮＳＧマウ
スは、複数のサイトカインシグナル経路が欠損し、自然免疫に多くの欠陥があるのに加え
、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠いているＮＯＤ ＳＣＩＤ
マウスである。一次移植の１６週間後に生着を評価する（移植後１２週間後分析）。
【0291】
ＮＳＧマウスにおける１６週間の体内分布パイロット研究では、投与量及び最大持続時
間を調べ、いくつかの細胞投与量レベルで実施する。この研究には、３個の投与量レベル
と未編集のＳＣＮ細胞を受けたマウスのグループが含まれる。パイロット研究の期間は１
６週間であるが、投与量が高い２個のグループのうちの１個は６か月間まで継続する。こ
のパイロット研究でマウスは６か月間生存し、中心的な体内分布研究の期間は６か月であ
る。この研究の間、ｑＰＣＲによる発現の持続性及び免疫組織化学を研究する。
間を調べ、いくつかの細胞投与量レベルで実施する。この研究には、３個の投与量レベル
と未編集のＳＣＮ細胞を受けたマウスのグループが含まれる。パイロット研究の期間は１
６週間であるが、投与量が高い２個のグループのうちの１個は６か月間まで継続する。こ
のパイロット研究でマウスは６か月間生存し、中心的な体内分布研究の期間は６か月であ
る。この研究の間、ｑＰＣＲによる発現の持続性及び免疫組織化学を研究する。
【0292】
実施例７：免疫不全マウスにおける中心的な体内分布研究
中心的な体内分布研究ではＮＳＧマウスを利用し、実施例６のパイロット投与量範囲の
知見に従う。この研究は、優良試験所基準（ＧＬＰ）を遵守して実行され、中心的な非臨
床薬物動態、薬力学及び毒性学研究である。毒性研究は、ＨＳＣ注入後の死亡率、臨床的
知見、体重及び器官重量、並びに臨床的及び解剖学的病理学に基づく。
中心的な体内分布研究ではＮＳＧマウスを利用し、実施例６のパイロット投与量範囲の
知見に従う。この研究は、優良試験所基準（ＧＬＰ）を遵守して実行され、中心的な非臨
床薬物動態、薬力学及び毒性学研究である。毒性研究は、ＨＳＣ注入後の死亡率、臨床的
知見、体重及び器官重量、並びに臨床的及び解剖学的病理学に基づく。
【0293】
遺伝子を編集したＣＤ３４＋細胞をＮＳＧマウスに移植するには、内在性骨髄の枯渇を
提供し、ドナー細胞の生着を許容するために、前処理が必要となる。したがって、臨床状
況を模倣するためにブスルファン前処理を利用する。グループあたり１０匹の雄と雌のマ
ウスの３個のグループ（遺伝子を編集した細胞、未編集の細胞及びブスルファン媒体のみ
のコントロール）を利用する。
提供し、ドナー細胞の生着を許容するために、前処理が必要となる。したがって、臨床状
況を模倣するためにブスルファン前処理を利用する。グループあたり１０匹の雄と雌のマ
ウスの３個のグループ（遺伝子を編集した細胞、未編集の細胞及びブスルファン媒体のみ
のコントロール）を利用する。
【0294】
ＮＳＧマウスモデルはヒト好中球を枯渇した状況と完全に類似するものではないけれど
も、エクスビボ遺伝子編集細胞をインビボ注射する前に、全ての割合のマウスをブスルフ
ァンで処理し、骨髄機能を枯渇させるので、この研究は遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞の体内
分布研究に使用するためのモデルの妥当性に影響しない。利用可能な好中球欠乏マウス株
、Ｌｙｚ２Ｃｒｅ／ＣｒｅＭｃｌ－ｌｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（Ｍｃｌ－ｌΔＭｙｅｌｏ）の
骨髄系細胞白血病（Ｍｃｌ－１）抗アポトーシス性タンパク質から、Ｍｃｌ－ｌが骨髄系
特異的に欠乏すると非常に重度の好中球減少症が生じることが分かる（Ｃｓｅｐｒｅｇｉ
ら、２０１８）。Ｍｃｌ－ｌΔＭｙｅｌｏマウスは繁殖することができ、その生存率は、
特定の病原体がいない（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）条件と従来の
収容条件の両方で正常に近かった。しかしながら、ＮＳＧマウスとは対照的に、Ｍｃｌ－
１ΔＭｙｅｌｏマウスモデルでは限られた経験しかない。
も、エクスビボ遺伝子編集細胞をインビボ注射する前に、全ての割合のマウスをブスルフ
ァンで処理し、骨髄機能を枯渇させるので、この研究は遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞の体内
分布研究に使用するためのモデルの妥当性に影響しない。利用可能な好中球欠乏マウス株
、Ｌｙｚ２Ｃｒｅ／ＣｒｅＭｃｌ－ｌｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（Ｍｃｌ－ｌΔＭｙｅｌｏ）の
骨髄系細胞白血病（Ｍｃｌ－１）抗アポトーシス性タンパク質から、Ｍｃｌ－ｌが骨髄系
特異的に欠乏すると非常に重度の好中球減少症が生じることが分かる（Ｃｓｅｐｒｅｇｉ
ら、２０１８）。Ｍｃｌ－ｌΔＭｙｅｌｏマウスは繁殖することができ、その生存率は、
特定の病原体がいない（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）条件と従来の
収容条件の両方で正常に近かった。しかしながら、ＮＳＧマウスとは対照的に、Ｍｃｌ－
１ΔＭｙｅｌｏマウスモデルでは限られた経験しかない。
【0295】
実施例８：修正分析
配列番号１～１１９２に記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配
列中の１７～２０個のヌクレオチドを含むガイド配列を、標的上の活性の高さについてス
クリーニングする。標的上の活性は、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析により測定される
。
配列番号１～１１９２に記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配
列中の１７～２０個のヌクレオチドを含むガイド配列を、標的上の活性の高さについてス
クリーニングする。標的上の活性は、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析により測定される
。
【0296】
ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析によると、配列番号１～１１９２に記載されている１
７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを含むガ
イド配列は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の修正に適していることが分かる。
７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを含むガ
イド配列は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の修正に適していることが分かる。
【0297】
実施例９：ＥＬＡＮＥの対立遺伝子特異的ノックアウトの有効性
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の特異的ノックアウトは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子のイントロン４及びエキソン５を切除することにより媒介される。これは、図
８に描かれるような対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために、イントロン４でのＤＳＢ
を媒介しＳＮＰｒｓ１６８３５６４を利用することにより成し遂げられる。この戦略を用
いるとＨＳＣが効率的に成熟好中球及び機能性好中球へと分化できることを証明するため
に、健常ドナーを、イントロン４のそれぞれのＳＮＰ（表１参照）を標的とするｇ３５及
びｇ６２を含むＲＮＰを有するＨＳＣ（ロンザ）でヌクレオフェクトする（ｎｕｃｌｅｏ
ｆｅｃｔｅｄ）。未編集の細胞をポジティブコントロールとして使用する。ヌクレオフェ
クション後４８（４８）時間で、公表された手順書（Ｚｈｅｎｗａｎｇ Ｊｉｅら、Ｐｌ
ｏｓＯｎｅ ２０１７）にしたがってＨＳＣを好中球に分化する。編集された細胞と未編
集の細胞の分化効率を、好中球特異的マーカーＣＤ６６ｂ及びＣＤ１７７で染色した後Ｆ
ＡＣＳによって測定する。ＨＳＣ媒介好中球の機能を評価するために、以下のアッセイを
実行する。
１．貪食性をＥＺＣｅｌｌ（商標）Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（
ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用してアッセイする。このキットは、フローサイトメトリーに
よる迅速で正確な検出及びインビトロでの貪食性の定量化のためのツールとして事前に標
識されたザイモサン粒子を利用する。
２．ＨＳＣ由来好中球を大腸菌と共に培養し、次に細菌をコロニー形成のために寒天板
に播種することによってキリングアッセイを実施する。未処理の細菌または未分化のHSC
と 培養した細菌をコントロールとして使用する。死滅効率は次のように計算される：(コ
ロニー数Neutrophils /コロニー数コントロール）ｘ100。
３．ＥＺＣｅｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ／Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ａ
ｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して走化性をアッセイする。
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の特異的ノックアウトは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異
対立遺伝子のイントロン４及びエキソン５を切除することにより媒介される。これは、図
８に描かれるような対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために、イントロン４でのＤＳＢ
を媒介しＳＮＰｒｓ１６８３５６４を利用することにより成し遂げられる。この戦略を用
いるとＨＳＣが効率的に成熟好中球及び機能性好中球へと分化できることを証明するため
に、健常ドナーを、イントロン４のそれぞれのＳＮＰ（表１参照）を標的とするｇ３５及
びｇ６２を含むＲＮＰを有するＨＳＣ（ロンザ）でヌクレオフェクトする（ｎｕｃｌｅｏ
ｆｅｃｔｅｄ）。未編集の細胞をポジティブコントロールとして使用する。ヌクレオフェ
クション後４８（４８）時間で、公表された手順書（Ｚｈｅｎｗａｎｇ Ｊｉｅら、Ｐｌ
ｏｓＯｎｅ ２０１７）にしたがってＨＳＣを好中球に分化する。編集された細胞と未編
集の細胞の分化効率を、好中球特異的マーカーＣＤ６６ｂ及びＣＤ１７７で染色した後Ｆ
ＡＣＳによって測定する。ＨＳＣ媒介好中球の機能を評価するために、以下のアッセイを
実行する。
１．貪食性をＥＺＣｅｌｌ（商標）Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（
ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用してアッセイする。このキットは、フローサイトメトリーに
よる迅速で正確な検出及びインビトロでの貪食性の定量化のためのツールとして事前に標
識されたザイモサン粒子を利用する。
２．ＨＳＣ由来好中球を大腸菌と共に培養し、次に細菌をコロニー形成のために寒天板
に播種することによってキリングアッセイを実施する。未処理の細菌または未分化のHSC
と 培養した細菌をコントロールとして使用する。死滅効率は次のように計算される：(コ
ロニー数Neutrophils /コロニー数コントロール）ｘ100。
３．ＥＺＣｅｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ／Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ａ
ｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して走化性をアッセイする。
【0298】
実施例１０：治療用の患者選択
ステップ１：ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された４人の患者Ａ～Ｄを、エキソンシーケンシ
ングしてＥＬＡＮＥ遺伝子内のＥＬＡＮＥ病原性変異を同定することにより選別する。ス
テップ２：同定された変異を有する対象を、次にサンガーシーケンシングしてｒｓ１６８
３５６４、ｒｓ１０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６ｌ００５の少なくとも１つのヘテロ接合
性を確認することにより選別する。ステップ３．ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ１０４ｌ４８
３７及びｒｓ３７６ｌ００５少なくとも１つでヘテロ接合性であると決定された各対象に
ついて、ＥＬＡＮＥ遺伝子内の変異対立遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰのヌクレオチドを、
ＢＡＣ ｂｉｏを使用して決定する。ステップ４．表６にしたがって適切なガイドを選択
する。
ステップ１：ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された４人の患者Ａ～Ｄを、エキソンシーケンシ
ングしてＥＬＡＮＥ遺伝子内のＥＬＡＮＥ病原性変異を同定することにより選別する。ス
テップ２：同定された変異を有する対象を、次にサンガーシーケンシングしてｒｓ１６８
３５６４、ｒｓ１０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６ｌ００５の少なくとも１つのヘテロ接合
性を確認することにより選別する。ステップ３．ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ１０４ｌ４８
３７及びｒｓ３７６ｌ００５少なくとも１つでヘテロ接合性であると決定された各対象に
ついて、ＥＬＡＮＥ遺伝子内の変異対立遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰのヌクレオチドを、
ＢＡＣ ｂｉｏを使用して決定する。ステップ４．表６にしたがって適切なガイドを選択
する。
【表6】
【0299】
ステップ５．選択されたガイドをそれぞれの対象から取得したＰＢＭＣに導入し、ＰＢＭ
Ｃにおける病原性ＥＬＡＮＥ変異の減少を次世代シーケンス技術により検証する。患者Ａ
～Ｄのための方法論を以下に説明する。
１．患者Ａをステップ１にしたがって選別し、表現型及び臨床的状況と一致している、
ＥＬＡＮＥの既知の病原性変異があることが分かる。患者Ａを関心のあるＳＮＰの周りで
、ステップ２にしたがって選別し、３個のＳＮＰｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ１６８３５
６４及びｒｓ３７６ｌ００５の全てでホモ接合性であることが分かる。患者Ａを、治療に
好適ではないと判断する。
２．患者Ｂを既知の病原性ＥＬＡＮＥ変異について検証する。患者Ｂを、ステップ２に
したがって選別し、ＳＮＰｒｓ１６８３５６４及びｒｓ１０４ｌ４８３７でホモ接合性で
あることが分かる。患者Ｂは、プロモーター領域のｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性で
あると分かる。患者Ｂを、治療に好適であると判断する。ステップ３にしたがって病原性
ＥＬＡＮＥ変異と同一の対立遺伝子に存在するヌクレオチド（連鎖決定）を決定する。患
者Ｂは、ＥＬＡＮＥ病原性変異と同一の対立遺伝子のｒｓ３７６１００５ＳＮＰ位置に参
照ヌクレオチド塩基があることが分かる。ｇ５８ｒｅｆは、このＳＮＰの提示と完全に相
補性があり、イントロン４の非コード領域に向けられるｇ３５と併せて選択される。ステ
ップ４にしたがって、選択されたガイド組成物は、ガイドｇ５８ｒｅｆ及びｇ３５のペア
を含む。この選択されたガイドのペアを使用する変異した対立遺伝子の切除が成功したか
を患者ＰＭＢＣにＮＧＳ読み取りを使用するステップ５にしたがって検証する。
３．患者Ｃは、幼児期から重度の好中球減少症に苦しんでいる。ステップＡにしたがっ
て選別し、ＥＬＡＮＥ遺伝子には病原性変異を見出さなかった。患者Ｃを、治療に好適で
ないと判断する。
４．患者Ｄは、ＥＬＡＮＥ遺伝子に既知の病原性変異があると検証され、ステップ２に
したがってＳＮＰの遺伝子型を同定すると、３個のＳＮＰのうち、２個でヘテロ接合性で
あることが分かる、つまりｒｓ１０４ｌ４８３７とｒｓ１６８３５６４の両方がヘテロ接
合性であると分かる一方、ｒｓ３７６１００５はホモ接合性であると分かる。遺伝子操作
に使用する２個の可能性のあるＳＮＰ間の選択をする。選択をするために、ステップ３を
実行してＳＮＰと病原性変異間の連鎖を決定する、すなわち、ＳＮＰ（参照又は代替）の
どのヌクレオチドがＥＬＡＮＥ病原性変異と同一の対立遺伝子に存在するかを決定する（
ＳＮＰ提示）。患者Ｄをｒｓ１０４１４８３７の参照提示があると判断し、ｓｇ３９ｒｅ
ｆが使用に適していると判断する。ｒｓ１６８３５６４ＳＮＰを参照すると、代替提示は
、ＥＬＡＮＥ病原性変異と関連づけられていることが分かり、ガイドとしてｓｇ６２ａｌ
ｔが使用に適していると判断する。これらのガイドの各々をｇ３５と併せて使用する。ス
テップ４にしたがって、可能性のあるガイド組成物の２個のペア、ｓｇ３９ｒｅｆ＋ｇ３
５及びｇ６２ａｌｔ＋ｇ３５を同定する。ガイドペアのいずれが好ましいか決定するため
に、ガイドの各々及びガイドペアの編集特性及び特徴のデータベースを評価してオフター
ゲット効果及び編集効率を決定する。データベース評価に基づいてガイドペアを選択し、
ＮＧＳ読み取りを提供するＰＭＢＣにステップ５にしたがって、利用する。
Ｃにおける病原性ＥＬＡＮＥ変異の減少を次世代シーケンス技術により検証する。患者Ａ
～Ｄのための方法論を以下に説明する。
１．患者Ａをステップ１にしたがって選別し、表現型及び臨床的状況と一致している、
ＥＬＡＮＥの既知の病原性変異があることが分かる。患者Ａを関心のあるＳＮＰの周りで
、ステップ２にしたがって選別し、３個のＳＮＰｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ１６８３５
６４及びｒｓ３７６ｌ００５の全てでホモ接合性であることが分かる。患者Ａを、治療に
好適ではないと判断する。
２．患者Ｂを既知の病原性ＥＬＡＮＥ変異について検証する。患者Ｂを、ステップ２に
したがって選別し、ＳＮＰｒｓ１６８３５６４及びｒｓ１０４ｌ４８３７でホモ接合性で
あることが分かる。患者Ｂは、プロモーター領域のｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性で
あると分かる。患者Ｂを、治療に好適であると判断する。ステップ３にしたがって病原性
ＥＬＡＮＥ変異と同一の対立遺伝子に存在するヌクレオチド（連鎖決定）を決定する。患
者Ｂは、ＥＬＡＮＥ病原性変異と同一の対立遺伝子のｒｓ３７６１００５ＳＮＰ位置に参
照ヌクレオチド塩基があることが分かる。ｇ５８ｒｅｆは、このＳＮＰの提示と完全に相
補性があり、イントロン４の非コード領域に向けられるｇ３５と併せて選択される。ステ
ップ４にしたがって、選択されたガイド組成物は、ガイドｇ５８ｒｅｆ及びｇ３５のペア
を含む。この選択されたガイドのペアを使用する変異した対立遺伝子の切除が成功したか
を患者ＰＭＢＣにＮＧＳ読み取りを使用するステップ５にしたがって検証する。
３．患者Ｃは、幼児期から重度の好中球減少症に苦しんでいる。ステップＡにしたがっ
て選別し、ＥＬＡＮＥ遺伝子には病原性変異を見出さなかった。患者Ｃを、治療に好適で
ないと判断する。
４．患者Ｄは、ＥＬＡＮＥ遺伝子に既知の病原性変異があると検証され、ステップ２に
したがってＳＮＰの遺伝子型を同定すると、３個のＳＮＰのうち、２個でヘテロ接合性で
あることが分かる、つまりｒｓ１０４ｌ４８３７とｒｓ１６８３５６４の両方がヘテロ接
合性であると分かる一方、ｒｓ３７６１００５はホモ接合性であると分かる。遺伝子操作
に使用する２個の可能性のあるＳＮＰ間の選択をする。選択をするために、ステップ３を
実行してＳＮＰと病原性変異間の連鎖を決定する、すなわち、ＳＮＰ（参照又は代替）の
どのヌクレオチドがＥＬＡＮＥ病原性変異と同一の対立遺伝子に存在するかを決定する（
ＳＮＰ提示）。患者Ｄをｒｓ１０４１４８３７の参照提示があると判断し、ｓｇ３９ｒｅ
ｆが使用に適していると判断する。ｒｓ１６８３５６４ＳＮＰを参照すると、代替提示は
、ＥＬＡＮＥ病原性変異と関連づけられていることが分かり、ガイドとしてｓｇ６２ａｌ
ｔが使用に適していると判断する。これらのガイドの各々をｇ３５と併せて使用する。ス
テップ４にしたがって、可能性のあるガイド組成物の２個のペア、ｓｇ３９ｒｅｆ＋ｇ３
５及びｇ６２ａｌｔ＋ｇ３５を同定する。ガイドペアのいずれが好ましいか決定するため
に、ガイドの各々及びガイドペアの編集特性及び特徴のデータベースを評価してオフター
ゲット効果及び編集効率を決定する。データベース評価に基づいてガイドペアを選択し、
ＮＧＳ読み取りを提供するＰＭＢＣにステップ５にしたがって、利用する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願明細書に記載の発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0279】
本明細書において使用するとき、全ての見出しはただ構成のためのみであり、いかなる方式でも本開示を制限することを意図するものではない。いかなる個々の段落の内容も全ての段落に等しく適用可能であってもよい。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することを含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
２．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、前記変異対立遺伝子は、前記１つ又は複数の多型部位に基づいて前記二本鎖切断のための標的とされる、上記１に記載の方法。
３．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する、上記１又は上記２に記載の方法。
４．前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部は、配列番号１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含む、上記１～３の何れかに記載の方法。
５．前記第２の二本鎖切断は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である、上記３又は４に記載の方法。
６．前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
７．前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
８．前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
９．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
１０．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
１１．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
１２．重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する前記細胞を、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、上記１～１１の何れかに記載の方法。
１３．第１にＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、及び前記対象から前記細胞を取得することを含む、上記１２に記載の方法。
１４．前記細胞を前記対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取得することを含む、上記１３又は１４に記載の方法。
１５．前記細胞を前記対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む、上記１４に記載の方法。
１６．前記組成物を前記細胞に導入する前に前記細胞を予備刺激する、上記１～１５の何れかに記載の方法。
１７．前記細胞を培養増殖して細胞群を取得することをさらに含む、上記１２～１６の何れかに記載の方法。
１８．前記細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ又は複数とともに培養する、上記１７に記載の方法。
１９．前記細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する、上記１７又は１８に記載の方法。
２０．前記少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカインである、上記１９に記載の方法。
２１．前記細胞は、複数の細胞の中の１つであり、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子の両方を含む前記組成物を、前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び他の細胞に導入し、そして前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び前記他の細胞中の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する、上記１～２０の何れかに記載の方法。
２２．前記第１のＲＮＡ分子を含む前記組成物を導入すること又は前記第２のＲＮＡ分子の導入は、前記細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む、上記１～２１の何れかに記載の方法。
２３．上記２１又は２２に記載の方法によって取得される改変細胞。
２４．上記２１に記載の細胞を培養増殖することから取得される改変細胞。
２５．生着することができる、上記２３又は２４に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２６．子孫細胞を生じることができる、上記２３～２５の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２７．生着後に子孫細胞を生じることができる、上記２６に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２８．自家移植後に子孫細胞を生じることができる、上記２７に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２９．生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる、上記２７又は２８の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３０．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、造血幹細胞及び／又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、上記２３～２９の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３１．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、上記３０に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３２．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（ＰＭＣ）である、上記２３～３１の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３３．前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞。
３４．前記改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された、上記３３に記載の改変細胞。
３５．上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
３６．前記細胞と前記薬学的に許容される担体とを混合することを含む、上記３５に記載の組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法。
３７．インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、前記方法は、
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、そして前記対象から前記細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を培養増殖すること、を含み、
前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、方法。
３８．ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、 こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用。
３９．治療有効量の上記２１～３４の何れかに記載の改変細胞、上記３５に記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法によって調製された組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法。
４０．ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
ａ）前記対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与し、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法。
４１．ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１ ０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、前記自家改変細胞は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子において二本鎖切断するように改変され、
前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を前記細胞に導入することから生じ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、こと、を含み、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法。
４２．ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であって、
ａ）前記対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異について選別し、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された前記対象の前記細胞を配列決定することによりｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、及び
ｄ）治療のために前記１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみを選択するステップを含む、方法。
４３．ｅ）前記対象の骨髄から吸引によるか又は動員及び末梢血液のアフェレシスによるかのいずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記ＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子に存在する前記１つ又は複数の多型部位の前記ヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
前記第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の前記ＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第１のＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が第１の二本鎖切断に影響した前記１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、こと、
ｇ）前記対象にステップ（ｆ）の前記改変細胞を投与し、それにより前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、
ステップ（ｄ）において選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさらに含む、上記４２に記載の方法。
４４．配列番号：１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ分子。
４５．上記４４に記載のＲＮＡ分子及びガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を含む、組成物。
４６．前記第２のＲＮＡ分子は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする、上記４５に記載の組成物。
４７．前記第２のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記ヌクレオチド配列は、前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記配列とは異なるヌクレオチド配列である、上記４５又は４６に記載の組成物。
４８．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を含む、上記４５～４７の何れかに記載の組成物。
４９．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する前記配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である、上記４８に記載の組成物。
５０．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を含む、上記４５～４８の何れかに記載の組成物。
５１．前記第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部をさらに含む、上記４５～５０の何れかに記載の組成物。
５２．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである、上記４２～５１の何れかに記載の組成物。
５３．１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む、上記４５～５２の何れかに記載の組成物。
５４．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記方法は、前記細胞に上記４４に記載のＲＮＡ分子又は上記４５～５３の何れかに記載の組成物を送達することを含む、方法。
５５．ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する対象に上記４４に記載のＲＮＡ分子若しくは上記４５～５３の何れかに記載の組成物、又は上記４４に記載のＲＮＡ分子若しくは上記４５～５３の何れかに記載の組成物によって改変された細胞を送達することを含む、方法。
５６．前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子及び前記ＲＮＡ分子若しくは複数のＲＮＡ分子を、前記対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する、上記５４又は５５に記載の方法。
５７．前記方法は、
ａ）変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子は、エキソン全体又は前記エキソンの一部に隣接している領域を標的とする、こと、
ｂ）遺伝子の複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体を除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、
ｃ）前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とすること、
ｄ）前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とすること、
ｅ）前記第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること、
ｆ）エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により前記変異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、前記変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成すること、を含み、
任意選択で前記フレームシフトは、前記変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトを生じ、
好ましくは、前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成される又は前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる、上記５４～５６の何れかに記載の方法。
５８．前記不活性化又は治療により前記変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク質及び前記機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる、上記５５～５７の何れかに記載の方法。
５９． ａ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｂ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｃ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響し、
ｄ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｅ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｆ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記５５～５８の何れかに記載の方法。
６０．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５、４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、の使用。
６１．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を含む薬物であって、前記細胞に上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
６２．ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、上記１～２２の何れかに記載の方法、上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６～３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記４４に記載のＲＮＡ分子、の使用。
６３．ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、上記４４のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、上記４４のＲＮＡ分子、上記３５もしくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
６４．上記４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及び前記細胞の前記変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
６５．上記４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
６６．上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞、及び前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう前記組成物を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
６７．上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞をＳＣＮ若しくはＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することを含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
２．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、前記変異対立遺伝子は、前記１つ又は複数の多型部位に基づいて前記二本鎖切断のための標的とされる、上記１に記載の方法。
３．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する、上記１又は上記２に記載の方法。
４．前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部は、配列番号１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドを含む、上記１～３の何れかに記載の方法。
５．前記第２の二本鎖切断は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である、上記３又は４に記載の方法。
６．前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
７．前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
８．前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
９．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
１０．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
１１．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記３～５の何れかに記載の方法。
１２．重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する前記細胞を、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、上記１～１１の何れかに記載の方法。
１３．第１にＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、及び前記対象から前記細胞を取得することを含む、上記１２に記載の方法。
１４．前記細胞を前記対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取得することを含む、上記１３又は１４に記載の方法。
１５．前記細胞を前記対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む、上記１４に記載の方法。
１６．前記組成物を前記細胞に導入する前に前記細胞を予備刺激する、上記１～１５の何れかに記載の方法。
１７．前記細胞を培養増殖して細胞群を取得することをさらに含む、上記１２～１６の何れかに記載の方法。
１８．前記細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ又は複数とともに培養する、上記１７に記載の方法。
１９．前記細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する、上記１７又は１８に記載の方法。
２０．前記少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカインである、上記１９に記載の方法。
２１．前記細胞は、複数の細胞の中の１つであり、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子の両方を含む前記組成物を、前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び他の細胞に導入し、そして前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び前記他の細胞中の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する、上記１～２０の何れかに記載の方法。
２２．前記第１のＲＮＡ分子を含む前記組成物を導入すること又は前記第２のＲＮＡ分子の導入は、前記細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む、上記１～２１の何れかに記載の方法。
２３．上記２１又は２２に記載の方法によって取得される改変細胞。
２４．上記２１に記載の細胞を培養増殖することから取得される改変細胞。
２５．生着することができる、上記２３又は２４に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２６．子孫細胞を生じることができる、上記２３～２５の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２７．生着後に子孫細胞を生じることができる、上記２６に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２８．自家移植後に子孫細胞を生じることができる、上記２７に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２９．生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる、上記２７又は２８の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３０．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、造血幹細胞及び／又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、上記２３～２９の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３１．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、上記３０に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３２．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（ＰＭＣ）である、上記２３～３１の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３３．前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞。
３４．前記改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された、上記３３に記載の改変細胞。
３５．上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
３６．前記細胞と前記薬学的に許容される担体とを混合することを含む、上記３５に記載の組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法。
３７．インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、前記方法は、
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、そして前記対象から前記細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を培養増殖すること、を含み、
前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、方法。
３８．ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、 こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用。
３９．治療有効量の上記２１～３４の何れかに記載の改変細胞、上記３５に記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法によって調製された組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法。
４０．ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
ａ）前記対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与し、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法。
４１．ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１ ０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、前記自家改変細胞は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子において二本鎖切断するように改変され、
前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を前記細胞に導入することから生じ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、こと、を含み、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法。
４２．ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であって、
ａ）前記対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異について選別し、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された前記対象の前記細胞を配列決定することによりｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、及び
ｄ）治療のために前記１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみを選択するステップを含む、方法。
４３．ｅ）前記対象の骨髄から吸引によるか又は動員及び末梢血液のアフェレシスによるかのいずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記ＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子に存在する前記１つ又は複数の多型部位の前記ヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
前記第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の前記ＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第１のＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が第１の二本鎖切断に影響した前記１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、こと、
ｇ）前記対象にステップ（ｆ）の前記改変細胞を投与し、それにより前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、
ステップ（ｄ）において選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさらに含む、上記４２に記載の方法。
４４．配列番号：１～１１９２のいずれか１つに記載されている１７～２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７～２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ分子。
４５．上記４４に記載のＲＮＡ分子及びガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を含む、組成物。
４６．前記第２のＲＮＡ分子は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする、上記４５に記載の組成物。
４７．前記第２のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記ヌクレオチド配列は、前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記配列とは異なるヌクレオチド配列である、上記４５又は４６に記載の組成物。
４８．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を含む、上記４５～４７の何れかに記載の組成物。
４９．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する前記配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である、上記４８に記載の組成物。
５０．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を含む、上記４５～４８の何れかに記載の組成物。
５１．前記第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部をさらに含む、上記４５～５０の何れかに記載の組成物。
５２．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである、上記４２～５１の何れかに記載の組成物。
５３．１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む、上記４５～５２の何れかに記載の組成物。
５４．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記方法は、前記細胞に上記４４に記載のＲＮＡ分子又は上記４５～５３の何れかに記載の組成物を送達することを含む、方法。
５５．ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する対象に上記４４に記載のＲＮＡ分子若しくは上記４５～５３の何れかに記載の組成物、又は上記４４に記載のＲＮＡ分子若しくは上記４５～５３の何れかに記載の組成物によって改変された細胞を送達することを含む、方法。
５６．前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子及び前記ＲＮＡ分子若しくは複数のＲＮＡ分子を、前記対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する、上記５４又は５５に記載の方法。
５７．前記方法は、
ａ）変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子は、エキソン全体又は前記エキソンの一部に隣接している領域を標的とする、こと、
ｂ）遺伝子の複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体を除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、
ｃ）前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とすること、
ｄ）前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とすること、
ｅ）前記第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること、
ｆ）エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により前記変異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、前記変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成すること、を含み、
任意選択で前記フレームシフトは、前記変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトを生じ、
好ましくは、前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成される又は前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる、上記５４～５６の何れかに記載の方法。
５８．前記不活性化又は治療により前記変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク質及び前記機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる、上記５５～５７の何れかに記載の方法。
５９． ａ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｂ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｃ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響し、
ｄ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｅ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｆ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記５５～５８の何れかに記載の方法。
６０．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５、４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、の使用。
６１．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を含む薬物であって、前記細胞に上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
６２．ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、上記１～２２の何れかに記載の方法、上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物又は上記３６～３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記４４に記載のＲＮＡ分子、の使用。
６３．ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、上記４４のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、上記４４のＲＮＡ分子、上記３５もしくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
６４．上記４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及び前記細胞の前記変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
６５．上記４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
６６．上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞、及び前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう前記組成物を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
６７．上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう上記３５若しくは４５～５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３～３４の何れかに記載の改変細胞をＳＣＮ若しくはＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
【外国語明細書】