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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024160305
(43)【公開日】2024-11-13
(54)【発明の名称】肺炎連鎖球菌の精製された莢膜多糖
(51)【国際特許分類】
C08B 37/00 20060101AFI20241106BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241106BHJP
A61K 39/09 20060101ALI20241106BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241106BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C08B37/00 P
A61K47/64
A61K39/09
A61P31/04
A61K47/10
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024130732
(22)【出願日】2024-08-07
(62)【分割の表示】P 2021516582の分割
【原出願日】2019-09-23
(31)【優先権主張番号】201841031653
(32)【優先日】2018-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(31)【優先権主張番号】201841031654
(32)【優先日】2018-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(71)【出願人】
【識別番号】517176375
【氏名又は名称】バイオロジカル イー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100106080
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 晶子
(72)【発明者】
【氏名】ブルキ，ラジェンダー
(72)【発明者】
【氏名】カンディマラ，ヴィヴェーク・バブ
(72)【発明者】
【氏名】スリラマン，ラジャン
(72)【発明者】
【氏名】マトゥール，ラメシュ・ベンカト
(72)【発明者】
【氏名】マンテナ，ナレンダー・デーブ
(72)【発明者】
【氏名】ダトラ，マヒマ
(72)【発明者】
【氏名】サンガレッディ，ベーラパンドゥ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】単純で且つ効率的な方法で精製及びサイジングされた多糖を含む多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。
【解決手段】平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖が提供される。さらに、肺炎連鎖球菌血清型の精製及びサイジングされた莢膜多糖を調製する方法、及び担体タンパク質にコンジュゲートした、前記莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンが提供される。
【選択図】なし
【解決手段】平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖が提供される。さらに、肺炎連鎖球菌血清型の精製及びサイジングされた莢膜多糖を調製する方法、及び担体タンパク質にコンジュゲートした、前記莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンが提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖。
【請求項2】
平均分子量（Ｍｗ）５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～５００ｋＤａを有する、請求項１に記載の肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製された莢膜多糖。
【請求項3】
５～１８％の範囲内のグリセロール含有量を有する、請求項１に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ａ又は１５Ｃの精製された莢膜多糖。
【請求項4】
５～１０％のグリセロール含有量を有する、請求項３に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ａの精製された莢膜多糖。
【請求項5】
５～１０％のグリセロール含有量を有する、請求項３に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃの精製された莢膜多糖。
【請求項6】
２～１０％の範囲内、好ましくは２～８％の範囲内のアセテート含有量を有する、請求項１に記載の肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの精製された莢膜多糖。
【請求項7】
肺炎連鎖球菌血清型の精製及びサイジングされた莢膜多糖を調製する方法であって、
ａ．肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂを適切な培養培地で培養するステップ；
ｂ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを不活性化するステップ；
ｃ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを遠心分離にかけるステップ；
ｄ．培養ブロスから前記肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を精製するステップ；
及び
ｅ．精製された肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を高圧均質化にかけて、平均分子量（ＭＷ）５０～１０００ｋＤａを有するサイジングされた莢膜多糖を得るステップ
を含む方法。
ａ．肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂを適切な培養培地で培養するステップ；
ｂ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを不活性化するステップ；
ｃ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを遠心分離にかけるステップ；
ｄ．培養ブロスから前記肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を精製するステップ；
及び
ｅ．精製された肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を高圧均質化にかけて、平均分子量（ＭＷ）５０～１０００ｋＤａを有するサイジングされた莢膜多糖を得るステップ
を含む方法。
【請求項8】
均質化が、５０～２００ＭＰａ（５００～２０００ｂａｒ）の範囲の圧力で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
請求項７に記載の方法により得られた、平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製された莢膜多糖。
【請求項10】
担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の精製及びサイジングされた莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、この組成物は、約０．５～約２．０のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項11】
担体タンパク質が、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はこれらの組合せから選択される、請求項１０に記載のコンジュゲートワクチン。
【請求項12】
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型２からの多糖を含み、この組成
物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項13】
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型１５Ａからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項14】
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型１５Ｃからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項15】
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型３５Ｂからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項16】
コンジュゲートが、下記範囲の平均分子量：５００ｋＤａ～５０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ～２５，０００ｋＤａ、又は３，０００ｋＤａ～３０，０００ｋＤａを有する、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項17】
肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、糖コンジュゲート中の多糖は、請求項１に記載の精製された莢膜多糖である、免疫原性組成物。
【請求項18】
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質、又は担体タンパク質の組合せにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆからの糖コンジュゲートをさらに含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項19】
組成物が、多価の免疫原性組成物であり、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、又はそれより高い原子価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項20】
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも３種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲート組成物であり、血清型は、担体タンパク質にコンジュゲートしており、担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項21】
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲートであり、血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項22】
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆから選択される１種又は複数の追加の血清型からの多糖を含む多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項23】
組成物が、担体タンパク質にコンジュゲートした肺炎連鎖球菌の血清型からの多糖を含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ、並びに追加の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆを含み、担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項24】
多糖が、ワクチン又は免疫原性組成物の調製に有用である、請求項１に記載の精製された莢膜多糖。
【請求項25】
ワクチン又は免疫原性組成物が、肺炎連鎖球菌感染の予防に有用である、請求項１０～１６のいずれか一項に記載のワクチン、又は請求項１７～２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２３日に出願された印国特許出願第２０１８４１０３１６５３号明細書及び同第２０１８４１０３１６５４号明細書に対する優先権の利益を主張し、これらの明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本発明は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の精製された莢膜多糖に関する。より具体的には、本発明は、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖、並びにその調製方法に関する。
本出願は、２０１８年９月２３日に出願された印国特許出願第２０１８４１０３１６５３号明細書及び同第２０１８４１０３１６５４号明細書に対する優先権の利益を主張し、これらの明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本発明は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の精製された莢膜多糖に関する。より具体的には、本発明は、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖、並びにその調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
肺炎連鎖球菌は、敗血症、髄膜炎、中耳炎、及び大葉性肺炎等の動物及びヒトでの侵襲性感染における主な原因病原体であるグラム陽性菌である。感染プロセスの一環として、肺炎球菌は、真核生物炭水化物にレクチン様で結合することにより、上下気道の炎症を起こしていないヒト上皮細胞に容易に結合する。
【0003】
肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学的に連結された多糖でカプセル化されている。肺炎球菌には９０種超の既知の血清型が存在しており、このカプセルは、肺炎球菌の主要な病原性決定基であり、なぜならば、このカプセルは、補体から細菌の内面を保護するだけでなく、それ自体が免疫原性に乏しいからである。抗多糖抗体レベルは、侵襲性肺炎球菌疾患に対する保護を予測するものと考えられている。ワクチンとして、肺炎球菌多糖被膜は、免疫系が発達しているか又は損なわれてない個体では、肺炎連鎖球菌に対する適度な免疫を付与し得るが、適切な担体タンパク質にコンジュゲートした莢膜多糖は、肺炎球菌感染のリスクも最も高い乳児及び年長者における免疫反応を可能にする。
【0004】
肺炎球菌ワクチンとして、肺炎球菌多糖ワクチン及び肺炎球菌コンジュゲートワクチンが挙げられる。商品化されている肺炎球菌多糖ワクチンの予防効果は、ワクチン接種時に誘導される抗体の濃度に多かれ少なかれ関連していることが一般に認められている。現在のワクチンとして、多価肺炎球菌多糖ワクチン（２種以上の血清型からの肺炎球菌多糖を含む）、及び肺炎球菌コンジュゲートワクチンが挙げられる。
【0005】
Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）２３は、多価肺炎球菌多糖ワクチンであり、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆを含む２３種の肺炎球菌血清型からの非コンジュゲート莢膜多糖を含む。認可されているＰｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）２３は、成人（特に年長者及び高リスク者）での肺炎球菌疾患の予防で有用であることが証明された。しかしながら、乳児及び幼児は、この非コンジュゲート肺炎球菌多糖ワクチンに反応しにくい。
【0006】
Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）－７は、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンであり、７種の最も高い頻度で単離された多糖血清型（例えば、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、及び２３Ｆ）を含む。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）－７が２０００年に米国で使用され始めてから、子供での侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）は大幅に減少している。ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした１３種の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆを含む１３価のコンジュゲートワクチンＰｒｅｖｅｎａｒ－１３（登録商標）が開発され、世界のある特定の領域では、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）－７による血清型適用範
囲の限界に起因して承認された。
囲の限界に起因して承認された。
【0007】
Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ（登録商標）は、１０種の、タンパク質Ｄにコンジュゲートした多糖血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、２３Ｆ（ＰＤ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）にコンジュゲートした血清型１８Ｃ、及びジフテリアトキソイド（ＤＴ）にコンジュゲートした血清型１９Ｆを含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンである。血清型多糖のそれぞれは、制御されたｐＨ下で１－シアノ－４－ジメチルアミノ－ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を使用して結合されている。
【0008】
米国特許第９，４９２，５５９Ｂ２号明細書では、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｂからの糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型２２Ｆからの糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型３３Ｆからの糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型１２Ｆからの糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型１０Ａからの糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型１１Ａからの糖コンジュゲート、及び肺炎連鎖球菌血清型８からの糖コンジュゲートからなる群から選択される少なくとも１種の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物が開示されている。国際公開第２０１９／０５０８１３Ａ１号パンフレットでは、肺炎連鎖球菌血清型１６Ｆからの精製された莢膜多糖、及びその多糖タンパク質コンジュゲートが開示されている。
【0009】
国際公開第２０１９／０５０８１４Ａ１号パンフレットでは、肺炎連鎖球菌血清型２３Ａ及び２３Ｂからの精製された莢膜多糖、並びにその多糖－タンパク質コンジュゲートが開示されている。
【0010】
国際公開第２０１９／０５０８１５Ａ１号パンフレットでは、肺炎連鎖球菌血清型２４Ｆからの精製された莢膜多糖、及びその多糖－タンパク質コンジュゲートが開示されている。
【0011】
国際公開第２０１９／０５０８１６Ａ１号パンフレットでは、肺炎連鎖球菌血清型３１からの精製された莢膜多糖、及びその多糖－タンパク質コンジュゲートが開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
これらのワクチンにもかかわらず、単純で且つ効率的な方法で精製及びサイジングされた多糖を含むさらなる多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンの開発が必要とされている。従って、本発明の発明者らは、単純で且つ効率的な方法で肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの莢膜多糖を精製及びサイジングした。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型２の精製及びサイジングされた莢膜多糖に関する。
本発明はまた、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型１５Ａの精製及びサイジングされた莢膜多糖にも関する。
本発明はまた、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型１５Ａの精製及びサイジングされた莢膜多糖にも関する。
【0014】
本発明はまた、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃの精製及びサイジングされた莢膜多糖にも関する。
本発明はまた、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖にも関する。
本発明はまた、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図5】図５Ａ：血清型２－ＣＲＭ１９７のコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。図５Ｂ：血清型２－ＰｓａＡのコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図6】図６Ａ：（Ａ）血清型１５Ａ－ＣＲＭ１９７のコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。図６Ｂ：血清型１５Ａ－ＰｓａＡのコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図7】図７Ａ：（Ａ）血清型１５Ｃ－ＣＲＭ１９７のコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。図７Ｂ：血清型１５Ｃ－ＰｓａＡのコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図8】図８Ａ：（Ａ）血清型３５Ｂ－ＣＲＭ１９７のコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。図８Ｂ：血清型３５Ｂ－ＰｓａＡのコンジュゲーション反応速度論を示すＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図9】ＰＣＶ製剤で免疫化されたウサギにおける血清抗体力価。
【発明を実施するための形態】
【0016】
定義
本発明全体を通して、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。同様に、単語「又は」が、２つ以上の項目のリストに関して他の項目を除外する単一の項目のみを意味するように明確に限定されない限り、そのようなリストにおける「又は」の使用は、（ａ）このリスト中の任意の単一の項目、（ｂ）このリスト中の全ての項目、又は（ｃ）このリスト中の項目の任意の組合せを含むと解釈すべきである。加えて、「含む」という用語、及び同類のものは、本発明全体を通して、同一の特徴の任意のより多くの数、及び／又は１種若しくは複数の追加の種類の特徴が除外されないように、列挙された特徴を少なくとも含むことを意味するために使用される。さらに、様々な特定の特徴、方法、又は特性を、１つ又は複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせ得る。
本発明全体を通して、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。同様に、単語「又は」が、２つ以上の項目のリストに関して他の項目を除外する単一の項目のみを意味するように明確に限定されない限り、そのようなリストにおける「又は」の使用は、（ａ）このリスト中の任意の単一の項目、（ｂ）このリスト中の全ての項目、又は（ｃ）このリスト中の項目の任意の組合せを含むと解釈すべきである。加えて、「含む」という用語、及び同類のものは、本発明全体を通して、同一の特徴の任意のより多くの数、及び／又は１種若しくは複数の追加の種類の特徴が除外されないように、列挙された特徴を少なくとも含むことを意味するために使用される。さらに、様々な特定の特徴、方法、又は特性を、１つ又は複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせ得る。
【0017】
本発明は、網羅的であることが意図されておらず、本技術を本明細書で開示されている詳細な形態に限定することも意図されていない。本明細書では、説明を目的として具体的な実施形態が開示されているが、関連分野の当業者が認識するように、本技術から逸脱することなく様々な等価の改変が可能である。いくつかの場合では、本技術の実施形態の説明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、公知の構造及び機能は示されておらず、及び／又は詳細には説明されてない。本明細書では、方法のステップを特定の順序で示す場合があるが、代替実施形態では、このステップは別の適切な順序を有し得る。同様に、特定の実施形態の文脈で開示されている本技術のある特定の実施形態を、他の実施家形態で組み合わせてもよいし、他の実施形態において除外してもよい。さらに、ある特定の実施形態と関連する利点が、この実施形態の文脈で開示され得るが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態は、本技術の範囲に含まれるために、本明細書で開示されているそのような利点又は他の利点を示す必要はない。従って、この開示及び関連技
術は、本明細書で明示的に示されていない及び／又は説明されていない他の実施形態を包含し得る。
術は、本明細書で明示的に示されていない及び／又は説明されていない他の実施形態を包含し得る。
【0018】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本方法が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
値の範囲が記載されている場合には、この範囲の上限と下限との間の各介在値、並びにこの規定の範囲内の任意の他の規定の又は介在する値は、本方法及び本組成物に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、これらのより小さい範囲に含まれ得、この規定の範囲中で任意の特に除外された限界を条件として、本方法及び本組成物にも包含される。この規定の範囲が限界の一方又は両方を含む場合には、これらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、本方法、本組成物、及び本組合せに含まれる。
値の範囲が記載されている場合には、この範囲の上限と下限との間の各介在値、並びにこの規定の範囲内の任意の他の規定の又は介在する値は、本方法及び本組成物に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、これらのより小さい範囲に含まれ得、この規定の範囲中で任意の特に除外された限界を条件として、本方法及び本組成物にも包含される。この規定の範囲が限界の一方又は両方を含む場合には、これらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、本方法、本組成物、及び本組合せに含まれる。
【0019】
本明細書で使用される場合、「莢膜多糖」という用語は、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの細胞壁の外側でこの細胞壁と連続する多糖の層を指す。
本明細書で使用される場合、「担体タンパク質」という用語は、典型的には免疫系による抗原の検出を強化するか又は促進する目的で、多糖が結合するか、付着するか、又はコンジュゲートするあらゆるタンパク質を指す。担体タンパク質の例として、ＣＲＭ１９７、ＰｓａＡ、及び破傷風トキソイド（ＴＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「担体タンパク質」という用語は、典型的には免疫系による抗原の検出を強化するか又は促進する目的で、多糖が結合するか、付着するか、又はコンジュゲートするあらゆるタンパク質を指す。担体タンパク質の例として、ＣＲＭ１９７、ＰｓａＡ、及び破傷風トキソイド（ＴＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
「コンジュゲート」又は「コンジュゲートした」という用語は、本明細書で使用される場合、肺炎連鎖球菌莢膜多糖が担体タンパク質に共有結合することを意味するために使用される。
【0021】
「多糖」という用語は、本明細書で使用される場合、グリコシド結合により互いに連結されたサッカライド鎖で構成された複合炭水化物を指す。この多糖は、少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、若しくは５０個、又はより多くのサッカライドを含み得る。
【0022】
「サイジングされた」又は「サイジング」という用語は、本明細書で使用される場合、様々な方法により天然多糖のサイズを減少させることを指す。この方法として、均質化等の機械的方法が挙げられ得る。天然多糖のサイズを減少させること、又はサイジングにより、下記を含む様々な利点が得られる：（１）天然多糖と比較して、より均質性を付与する、（２）コンジュゲート中における多糖対タンパク質の比を制御し得る、（３）サイジングされた多糖は、組成物により高い安定性を付与し得る。本発明の目的のために、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの天然莢膜多糖は、５０～１０００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）までサイジングされている。
【0023】
多糖の「分子量」、又は「分子サイズ」、又は「平均分子サイズ」、又は「平均分子量」という用語は、本明細書で使用される場合、ＭＡＬＩＳ（多角度レーザー光散乱）で測定した多糖の重量平均分子量（Ｍｗ）を指す。
本発明の詳細な説明
本発明は、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖、並びにこの調製方法に関する。
本発明の詳細な説明
本発明は、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖、並びにこの調製方法に関する。
【0024】
本発明に係る多糖を、発酵槽内において最適化された栄養素中で肺炎連鎖球菌を培養し、発酵の終了時に、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）又は任意の従来の溶解剤の添加により細胞を溶解させることによって調製する。回収された溶解物ブロスを下流の精製に供して、タンパク質、核酸、細胞壁成分等の不純物を除去する。
【0025】
発酵後、ＤＯＣ細胞溶解物を、バッチ式又は連続式の遠心分離機で遠心分離し、細胞残
屑を除去する。細胞フリーブロスのｐＨを酸性条件に調整し、温度を上昇させた後に遠心分離する。遠心分離後、上清を深層フィルターに通し、濃縮し、限外ろ過（ＵＦ）膜を使用して透析ろ過する。界面活性剤を添加し、続いて遠心分離することにより、多糖調製物（保持液）からさらなる不純物を除去する。続いて、界面活性剤処理上清を、チャコールフィルターに通すか、又は活性炭カラムに通し、続いて、ろ過された多糖をＳｉＯ２粒子にさらし、次いで遠心分離する。上清を深層フィルターに通し、深層ろ液を炭素フィルターに通し、続いて０．２２～０．６μｍフィルターに通す。ろ液を濃縮し、ＵＦ膜で透析ろ過し、０．５～２％のＮａＣｌ溶液又は水若しくは緩衝液で透析ろ過して、実質的に純粋な形態で多糖を得る。
屑を除去する。細胞フリーブロスのｐＨを酸性条件に調整し、温度を上昇させた後に遠心分離する。遠心分離後、上清を深層フィルターに通し、濃縮し、限外ろ過（ＵＦ）膜を使用して透析ろ過する。界面活性剤を添加し、続いて遠心分離することにより、多糖調製物（保持液）からさらなる不純物を除去する。続いて、界面活性剤処理上清を、チャコールフィルターに通すか、又は活性炭カラムに通し、続いて、ろ過された多糖をＳｉＯ２粒子にさらし、次いで遠心分離する。上清を深層フィルターに通し、深層ろ液を炭素フィルターに通し、続いて０．２２～０．６μｍフィルターに通す。ろ液を濃縮し、ＵＦ膜で透析ろ過し、０．５～２％のＮａＣｌ溶液又は水若しくは緩衝液で透析ろ過して、実質的に純粋な形態で多糖を得る。
【0026】
精製された多糖を、高いｐＨで化学的にサイジングするか、又は高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングする。サイジングされた多糖調製物を、ＵＦ膜で５～２５ｍｇ／ｍＬに濃縮する。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させる。
【0027】
一実施形態では、本発明は、平均分子量（Ｍｗ）が５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖を提供する。好ましくは、１００～１０００ｋＤａ、２００～８００ｋＤａ、２５０～６００ｋＤａ、又は３００～４００ｋＤａ、７０～１５０ｋＤａ、又は７５～１２５ｋＤａ。
【0028】
一部の実施形態では、コンジュゲーション前の肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製された莢膜多糖は、平均分子量が５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａである。他のそのような実施形態では、この多糖は、平均分子量５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～５００ｋＤａを有する。
【0029】
本発明の莢膜多糖のサイズを、精製手順後に、様々なサイジング技術を使用して所望のサイズまで減少させる。本発明者らは、本発明に従って調製された担体タンパク質とコンジュゲートした血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの精製された莢膜多糖は免疫原性が高いことを発見している。
【0030】
ある実施形態では、本発明の莢膜多糖は、平均分子量が約８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７００ｋＤａ、又は１０００ｋＤａである、血清型２からの肺炎連鎖球菌多糖を含む。
【0031】
ある実施形態では、本発明の莢膜多糖は、平均分子量が約８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７００ｋＤａ、又は１０００ｋＤａである、血清型１５Ａからの肺炎連鎖球菌多糖を含む。
【0032】
ある実施形態では、本発明の莢膜多糖は、平均分子量が約８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７００ｋＤａ、又は１０００ｋＤａである、血清型１５Ｃからの肺炎連鎖球菌多糖を含む。
【0033】
ある実施形態では、本発明の莢膜多糖は、平均分子量が約８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７００ｋＤａ、又は１０００ｋＤａである、血清型３５Ｂからの肺炎連鎖球菌多糖を含む。
【0034】
さらなる態様では、本開示は、グリセロール含有量が５～１８％の範囲であり、好ましくは５～１０％の範囲であるサイジングされた肺炎連鎖球菌血清型１５Ａ莢膜多糖を提供する。
【0035】
さらなる態様では、本開示は、グリセロール含有量が５～１８％の範囲であり、好ましくは５～１０％の範囲であるサイジングされた肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃ莢膜多糖を提供する。
【0036】
さらなる態様では、本開示は、アセテート(acetate)含有量が２～１０％の範囲であり
、好ましくは２～８％の範囲であるサイジングされた肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂ莢膜多糖を提供する。
、好ましくは２～８％の範囲であるサイジングされた肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂ莢膜多糖を提供する。
【0037】
さらなる態様では、本開示は、平均分子量が５０～１０００ｋＤａであり、グリセロール含有量が５～１８％の範囲であるサイジングされた肺炎連鎖球菌血清型１５Ａを提供する。
【0038】
さらなる態様では、本開示は、平均分子量が５０～１０００ｋＤａであり、グリセロール含有量が５～１８％の範囲であるサイジングされた肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃを提供する。
【0039】
さらなる態様では、本開示は、平均分子量が５０～１０００ｋＤａであり、アセテート含有量が２～１０％の範囲である単離された肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂを提供する。
フッ化水素酸（ＨＦ）による多糖の処理によるグリセロールの放出後のパルスアンペロメトリック検出付きの高性能陰イオン交換クロマトグラフイー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を使用するグリセロールの測定により、グリセロールリン酸側鎖の存在を決定し得る。
フッ化水素酸（ＨＦ）による多糖の処理によるグリセロールの放出後のパルスアンペロメトリック検出付きの高性能陰イオン交換クロマトグラフイー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を使用するグリセロールの測定により、グリセロールリン酸側鎖の存在を決定し得る。
【0040】
ある実施形態では、本発明は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、平均分子量が５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型２からの精製された多糖は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしており、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。
【0041】
ある実施形態では、本発明は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、平均分子量が５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型１５Ａからの精製された多糖は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしており、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。
【0042】
ある実施形態では、本発明は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、平均分子量が５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃからの精製された多糖は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしており、この組成物は、約０．５～約２．０タンパク質／ＰＳ、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。
【0043】
ある実施形態では、本発明は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、平均分子量が５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂからの精製された多糖は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしており、この組成物は、約０．５～約２．０タンパク質／ＰＳ、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。
【0044】
ある実施形態では、本発明は、肺炎連鎖球菌血清型２からの少なくとも１種の糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型１５Ａからの少なくとも１種の糖コンジュゲート、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃからの少なくとも１種の糖コンジュゲート、及び３５Ｂからの少なくとも１種の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【0045】
一態様では、本発明の免疫原性組成物は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はＣＲＭ１９７及びＰｓｐＡの組合せ、又はＣＲＭ１９７及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＰｓａＡ及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、及び破傷風トキソイドの組合せから選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆからの糖コンジュゲートをさらに含む。
【0046】
別の態様では、免疫原性組成物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、又はそれより高い原子価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。
【0047】
別の態様では、免疫原性組成物は多価であり、８個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（８価）、９個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（９価）、１０個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１０価）、１１個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１１価）、１２個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１２価）、１３個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１３価）、１４個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１４価）、１５個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１５価）、１６個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１６価）、１７個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１７価）、１８個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１８価）、１９個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（１９価）、２０個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２０価）、２１個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２１価）、２２個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２２価）、２３個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２３価）、２４個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２４価）、２５個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２５価）、２６個の肺炎球菌多糖コンジュゲート（２６価）を含む。
【0048】
さらに別の実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量が約５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの精製された莢膜多糖を含む免疫原性組成物を提供する。
【0049】
本発明の一態様では、免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌多糖を含み、この多糖血清型は、最大２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の係数でサイジングされている。「最大２の係数でサイジングされている」という用語は、糖を、この糖のサイズを減少させるが天然多糖のサイズの半分超のサイズを保持することが意図されたプロセスにかけることを意味する。
【0050】
サイジング技術のプロセスにかけられていない多糖は、天然多糖と称される。多糖は、通常の精製手順中に、又はコンジュゲーション中の分解により、サイズがわずかに減少する場合があるが、この多糖は、依然として天然多糖と称され得る。
【0051】
本莢膜多糖のサイズを、当分野で既知の様々な機械的手段（例えば、高圧技術、例えば、顕微溶液化、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ（商標）、高圧均質化、超音波処理、又はＧａｕｌｉｎ均質化）により減少させ得る。
【0052】
高圧均質化では、十分に小さい寸法の流路に通してプロセス流をポンプで流すことによ
り、高いせん断速度が達成される。このせん断速度を、より高い均質化圧を印加することにより増加させ、露出時間を、ホモジナイザーを通る供給流を再循環させることにより増加させ得る。
り、高いせん断速度が達成される。このせん断速度を、より高い均質化圧を印加することにより増加させ、露出時間を、ホモジナイザーを通る供給流を再循環させることにより増加させ得る。
【0053】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型２からの莢膜多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１００００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0054】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ａからの莢膜多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１００００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0055】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃからの莢膜多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１００００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0056】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂからの莢膜多糖を含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１００００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0057】
本発明の多糖タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約５０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ～約１０，０００ｋＤａ、約１，５００ｋＤａ～約１５，０００ｋＤａ、約２，０００ｋＤａ～約２０，０００ｋＤａ、約２，５００ｋＤａ～約２５，０００ｋＤａ、又は約３，０００ｋＤａ～約３０，０００ｋＤａの範囲である。
【0058】
別の実施形態では、本発明は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）のパーセント比を有する、精製された肺炎球菌多糖及び担体タンパク質を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0059】
好ましい実施形態では、本発明は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はＣＲＭ１９７及びＰｓｐＡの組合せ、又はＣＲＭ１９７及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＰｓａＡ及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、及び破傷風トキソイドの組合せから選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量が５０～１０００ｋＤｄである、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの精製された多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／多糖）のパーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0060】
別の実施形態では、本発明は、担体タンパク質にそれぞれ独立してコンジュゲートした１種又は複数の精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、各多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が約１，５００ｋＤａ～約１５，０００ｋＤａである肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0061】
他の実施形態では、精製された肺炎球菌多糖を、１種又は複数の担体タンパク質へのコンジュゲーション前に（例えば化学的に）活性化し得る。各活性化された肺炎球菌多糖を、多糖－タンパク質コンジュゲート（例えば糖コンジュゲート）を形成する担体タンパク質に、それぞれ独立してコンジュゲートさせ得る。
【0062】
一部の実施形態では、既知の技術（例えば、米国特許第４，３６５，１７０号明細書、同第４，６７３，５７４号明細書、及び同第４，９０２，５０６号明細書で説明されているもの）に従って、本発明の精製された肺炎球菌多糖を、化学的に活性化してその後に担体タンパク質にコンジュゲートさせ得る。例えば、炭水化物の１つ又は複数の隣接ヒドロキシル基のランダム酸化開裂による、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、又は過ヨウ素酸）等の酸化剤を使用する末端ヒドロキシル基のアルデヒドへの酸化、及び１つ又は複数の反応性アルデヒド基の形成により、肺炎球菌多糖を活性化し得る。
【0063】
同様に、本発明の精製された肺炎球菌多糖を、ＣＤＡＰ（１－シアノ－４－ジメチルアミノ－ピリジニウムテトラフルオロボレート）により活性化し、その後に１種又は複数種の担体タンパク質（例えば、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又はこれらの組合せ）にコンジュゲートさせ得る。他の実施形態では、ＣＤＡＰにより活性化されてシアン酸エステルを形成する肺炎球菌多糖を、１種又は複数種の担体タンパク質に直接コンジュゲートさせてもよいし、スペーサー（例えばリンカー）を介してコンジュゲートさせてもよい。このスペーサーは、担体タンパク質上のアミノ基に結合し得る。一部の実施形態では、このスペーサーは、シスタミン又はシステアミンであり得、これらはチオール化多糖を生成し、このチオール化多糖は、マレイミド活性化タンパク質へのチオエーテル結合を介して（例えばＧＭＢＳを使用する）、又はハロアセチル化担体タンパク質へのチオエーテル結合を介して（例えば、ヨードアセチミド（ｉｏｄｏａｃｅｔｉｍｉｄｅ）、ヨードアセチミドエチル、ＨＣｌ，ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、ＳＢＡＰ、及び／又はＮ－スクシンイミジルブロモアセテートを使用する）、担体タンパク質に結合し得る。他の実施形態では、ヘキサンジアミン又はアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を使用してシアン酸エステルを結合させ、カルボジイミド（例えばＥＤＡＣ又はＥＤＣ）化学を使用して、アミノ誘導体化糖を、担体タンパク質上のカルボキシル基を介してこの担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、国際公開第９３／１５７６０号パンフレット、同第９５／０８３４８号パンフレット、同第９６／２９０９４号パンフレット、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５－２５６で説明されている。
【0064】
本発明の多糖－タンパク質コンジュゲート及びワクチン組成物での使用に適した他の活性化及び／又は結合技術として、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ、及び国際公開第９８／４２７２１号パンフレットで説明されている他の方法の使用が挙げられる。例えば、コンジュゲーションは、サッカライドの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２－４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９－１８）、及びその後のタンパク質との結合によるカルバメート結合の形成により形成され得るカルボニルリンカーを伴い得る。一部の実施形態では、アノマー末
端を第１級ヒドロキシル基へと還元させ、この第１級ヒドロキシル基の任意選択的な保護／脱保護、この第１級ヒドロキシル基とＣＤＩとの、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する反応、及びＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基との結合を行うことができる。
端を第１級ヒドロキシル基へと還元させ、この第１級ヒドロキシル基の任意選択的な保護／脱保護、この第１級ヒドロキシル基とＣＤＩとの、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する反応、及びＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基との結合を行うことができる。
【0065】
例えば、本発明の多糖－タンパク質コンジュゲート及びワクチン組成物での使用に適した別の活性化及び／又は結合技術として、下記の方法が挙げられる：サイジングされた肺炎球菌多糖（例えば、約１０ｍｇ／ｍＬの濃度での約６ｍＬのサイジングされた多糖）及びＣＤＡＰ（例えば、アセトニトリル中に約１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））を、（例えば、約１分にわたり撹拌することにより）ガラスバイアル中において約１：約１の比で混合し得る。多糖溶液のｐＨを、必要に応じて調整し得る（例えば、約０．２Ｍのトリエチルアミンで約９．２５Ｍに調整し、室温にて３分にわたり撹拌し得る）。加えて、活性化された肺炎球菌多糖に、ＰｓａＡ（濃度が約１５ｍｇ／ｍＬである溶液 約４ｍＬ）を（例えば約１：約１（Ｐｓ：担体タンパク質）の比で）緩やかに添加し得る。この反応物のｐＨを（例えば、０．２Ｍのトリメチルアミンを使用して約９．０５に）調製し得、この反応を（例えば、室温で５時間にわたり撹拌することにより）継続させ得る。この反応混合物を、（例えば、過剰な濃度のグリシンの添加により）クエンチし得る。
【0066】
一部の実施形態では、この反応混合物を、膜（例えば１００ Ｋ ＭＷＣＯ膜）を使用して透析ろ過し得、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し得る。透析ろ過及び精製された画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ及びアントロン法を使用して分析し得る。コンジュゲートを含む分析画分を、プールして（例えば０．２μｍフィルターを使用して）無菌ろ過し得る。
【0067】
１種又は複数種の担体タンパク質への肺炎球菌多糖のコンジュゲーション後に、様々な技術により多糖－タンパク質コンジュゲートを精製し得る（例えば、多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化させ得る）。この技術として、濃縮／透析ろ過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、及び深層ろ過が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、このコンジュゲートを精製した後、このコンジュゲートを配合して、ワクチンとして使用され得る本発明の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲート組成物を製剤化し得る。
【0068】
一実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌の血清型からの多糖を含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、この血清型は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ、並びに追加の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆを含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0069】
一実施形態では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌の血清型からの多糖を含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、この血清型は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ、並びに追加の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆを含み、この担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0070】
一実施形態では、本発明は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも３種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、この２４種の血清型は、担体タンパク質にコンジュゲートしており、この
担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はＣＲＭ１９７及びＰｓｐＡの組合せ、又はＣＲＭ１９７及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＰｓａＡ及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＣＲＭ１９７、ＰｓａＡ、及び破傷風トキソイドの組合せから選択される、２４価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はＣＲＭ１９７及びＰｓｐＡの組合せ、又はＣＲＭ１９７及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＰｓａＡ及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＣＲＭ１９７、ＰｓａＡ、及び破傷風トキソイドの組合せから選択される、２４価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0071】
一実施形態では、本発明は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、この２４種の血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はＣＲＭ１９７及びＰｓａＡの組合せ、又はＣＲＭ１９７及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＰｓａＡ及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＣＲＭ１９７、ＰｓａＡ、及び破傷風トキソイドの組合せから選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、２４価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0072】
一実施形態では、本発明は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆから選択される１種又は複数種の追加の血清型からの多糖を含む多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であって、この血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はＣＲＭ１９７及びＰｓａＡの組合せ、又はＣＲＭ１９７及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＰｓａＡ及び破傷風トキソイドの組合せ、又はＣＲＭ１９７、ＰｓａＡ、及び破傷風トキソイドの組合せから選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0073】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明されている肺炎球菌ワクチン組成物の多糖－タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、この多糖－タンパク質コンジュゲートを、アジュバント、賦形剤、及び緩衝剤を含む肺炎球菌ワクチン組成物に製剤化するステップをさらに含む方法を提供する。
【0074】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明されている肺炎球菌ワクチン組成物の多糖－タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、アジュバントは、リン酸アルミニウムである、方法を提供する。
【0075】
別の実施形態では、本発明のワクチン又は免疫原性組成物を、肺炎連鎖球菌株により引き起こされる感染の予防に使用する。
一部の実施形態では、本発明は、処置が必要な対象を処置する方法であって、この処置が必要な対象に、本明細書で説明されている肺炎球菌ワクチン組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、処置が必要な対象を処置する方法であって、この処置が必要な対象に、本明細書で説明されている肺炎球菌ワクチン組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【0076】
一部の実施形態では、この対象は、肺炎連鎖球菌により媒介される疾患（例えば侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ））を有する。一実施形態では、この対象はヒトであり、例えば、乳児（約１歳未満）、幼児（約１２カ月齢～約２４カ月齢）、小児（約２歳～約５歳）、年長児（約５歳～約１３歳）、青年（約１３歳～約１８歳）、成人（約１８歳～約６５歳）、又は年長者（約６５歳超）である。
【0077】
一部の実施形態では、本発明は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫反応を誘発する方法であって、対象に、本明細書で説明されている肺炎球菌コンジュゲート
ワクチン組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含む方法を提供する。
ワクチン組成物の免疫学的に有効な量を投与するステップを含む方法を提供する。
【0078】
一実施形態では、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫反応を誘発する方法であって、対象に、本明細書で説明されている肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物を全身投与し、皮下投与し、及び／又は粘膜投与するステップを含む方法。
【0079】
一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物の用量中における各コンジュゲートの量は、免疫保護反応（例えば、顕著な副作用を引き起こさない免疫保護反応）を誘発するのに十分な量である。各コンジュゲートの量は、肺炎球菌血清型に応じて異なり得るが、ワクチン組成物の各用量は、担体タンパク質 約１．５μｇ～約５μｇを含む各担体タンパク質にコンジュゲートした、各肺炎球菌多糖 約０．１μｇ～約５０μｇ、各肺炎球菌多糖 約０．１μｇ～約１０μｇ又は約１μｇ～約５μｇを含み得る。
【0080】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型２からの莢膜多糖 ０．１μｇ～約１０μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0081】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ａからの莢膜多糖 ０．１μｇ～約１０μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0082】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃからの莢膜多糖 ０．１μｇ～約１０μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0083】
他の実施形態では、本発明は、担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂからの莢膜多糖 ０．１μｇ～約１０μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0084】
他の実施形態では、本発明は、ＣＲＭ１９７担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型２からの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の
（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0085】
他の実施形態では、本発明は、ＣＲＭ１９７担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ａからの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0086】
他の実施形態では、本発明は、ＣＲＭ１９７担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃからの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0087】
他の実施形態では、本発明は、ＰｓａＡ担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型２からの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0088】
他の実施形態では、本発明は、ＰｓａＡ担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ａからの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0089】
他の実施形態では、本発明は、ＰｓａＡ担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃからの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0090】
他の実施形態では、本発明は、ＰｓａＡ担体タンパク質 １．５μｇ～約５μｇにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂからの莢膜多糖 ０．５μｇ～約５μｇを含む肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物であって、多糖－タンパク質コンジュゲートは、平均分子量が５００ｋＤａ～約１５０００ｋＤａの範囲であり、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を有する、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0091】
好ましい実施形態では、本発明は、多価のコンジュゲートワクチン組成物であって、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量が５０～１０００ｋＤａである肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの少なくとも２種の多糖であり、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）のパーセント比を含む、多糖と、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又は担体タンパク質の組合せから選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆからの追加の多糖タンパク質コンジュゲートとを含む多価のコンジュゲートワクチン組成物を提供する。
【0092】
本発明の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物は、既知の方法を使用して製造し得る。例えば、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を、医薬的に許容できる希釈剤又はビヒクル（例えば、水又は生理食塩水）により製剤化し得る。加えて、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物は、下記の内の１つ又は複数をさらに含み得る：緩衝剤、保存剤若しくは安定剤、ポリソルベート、アジュバント、例えばアルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、若しくはヒドロキシリン酸アルミニウム）、及び／又は凍結乾燥用賦形剤。本発明の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物中での上記化合物のいずれか１つの包含を、必要な対象への投与様式及び投与経路に応じて選択し得、さらには標準的な薬務に基づき得る。
【0093】
本発明の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物は、対象に投与されると、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に、肺炎連鎖球菌の血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂに結合し得る抗体の形成を誘発する。このＥＬＩＳＡを、ＷＨＯ推奨プロトコルに従って実施した。簡潔に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートを、所与の血清型のＰｎＣＰＳでコーティングした（ＰＢＳを使用して１μｇ／５０μＬ／ウェル；無菌エンドトキシンフリー、０．０２％アジ化ナトリウムを含む）。プレートを、加湿用の濡れたペーパータオルと一緒に箱に入れ、５時間にわたり３７℃±２℃でインキュベートし、次いで、このプレートを、使用するまで５℃±３℃で保管した。
【実施例0094】
下記の実施例は、本発明を説明するために記載されており、単に説明目的のみにすぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
実施例１：
ａ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの調製
肺炎連鎖球菌株（血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ）の細胞バンクを、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＵＳＡから得た。
播種前調製：
培養（肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）血清型２）単離物 ０．４μｌを、
完全Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）培地 ６０ｍｌに接種した。接種したフラスコを、３５±１℃、５±０．５％ ＣＯ２で２～８時間にわたりインキュベートした。サンプルを回収し、６００ｎｍで光学密度に関して調べた。所望のＯＤが０．８±０．２に到達すると、サンプルを回収し、ｐＨ及びグラム染色に関して調べた。
播種調製：
播種前培養物の顕微鏡（グラム染色）による純度の確認後、播種前培養物 ４０ｍｌを
、ＭＨ培地 ７６０ｍＬが入った１リットルフラスコに接種した。接種した播種物を、３５±１℃、５±０．５％％ＣＯ２で３～１１時間にわたりインキュベートした。サンプルを回収し、６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）に関して調べた。所望のＯＤが４±２に到達すると、グラム染色、ｐＨのためにサンプルを回収した。血液寒天プレート上に蒔くことにより、純度を確認した。
発酵／培養：
播種物７５０ｍｌを、ＭＨ培地 １５リットルに接種し、７．１±０．３のｐＨでの１分当たり１００～１４０回転（ＲＰＭ）下で、３５±１℃にて、６００ｎｍでのＯＤが６±２に到達するまで、１分当たり３～５ｍｌの速度で３０～５０％のグルコースを補充した。
不活性化：
この発酵槽ブロスに、培養ブロスを不活性化させるためにデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）の１３％ストック溶液を添加し、１０±２時間にわたりインキュベートした。遠心分離：
ＤＯＣ処理培養物を回収し、２０℃にて１４０００相対遠心量（ＲＣＦ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、精製ステップ用に処理した。
実施例１：
ａ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂの調製
肺炎連鎖球菌株（血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ）の細胞バンクを、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＵＳＡから得た。
播種前調製：
培養（肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）血清型２）単離物 ０．４μｌを、
完全Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）培地 ６０ｍｌに接種した。接種したフラスコを、３５±１℃、５±０．５％ ＣＯ２で２～８時間にわたりインキュベートした。サンプルを回収し、６００ｎｍで光学密度に関して調べた。所望のＯＤが０．８±０．２に到達すると、サンプルを回収し、ｐＨ及びグラム染色に関して調べた。
播種調製：
播種前培養物の顕微鏡（グラム染色）による純度の確認後、播種前培養物 ４０ｍｌを
、ＭＨ培地 ７６０ｍＬが入った１リットルフラスコに接種した。接種した播種物を、３５±１℃、５±０．５％％ＣＯ２で３～１１時間にわたりインキュベートした。サンプルを回収し、６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）に関して調べた。所望のＯＤが４±２に到達すると、グラム染色、ｐＨのためにサンプルを回収した。血液寒天プレート上に蒔くことにより、純度を確認した。
発酵／培養：
播種物７５０ｍｌを、ＭＨ培地 １５リットルに接種し、７．１±０．３のｐＨでの１分当たり１００～１４０回転（ＲＰＭ）下で、３５±１℃にて、６００ｎｍでのＯＤが６±２に到達するまで、１分当たり３～５ｍｌの速度で３０～５０％のグルコースを補充した。
不活性化：
この発酵槽ブロスに、培養ブロスを不活性化させるためにデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）の１３％ストック溶液を添加し、１０±２時間にわたりインキュベートした。遠心分離：
ＤＯＣ処理培養物を回収し、２０℃にて１４０００相対遠心量（ＲＣＦ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、精製ステップ用に処理した。
【0095】
ｂ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２の精製
肺炎連鎖球菌血清型２のＤＯＣ細胞溶解物を、バッチ式遠心分離機で遠心分離し、細胞残屑を除去した。次いで、細胞フリーブロスのｐＨを５．０に調整し、４時間にわたりインキュベートし、１４０００ｇで４５分にわたり遠心分離した。遠心分離後、上清を深層フィルターに通した。次いで、ろ液を４．２倍に濃縮し、３０～３００ｋＤａのＵＦ膜を使用して透析ろ過（４～１５倍の透析体積）した。界面活性剤（ＣＴＡＢ１％）を添加し、６℃で３０～９０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離することにより、多糖調製物（保持液）からさらなる不純物を除去した。続いて、このＣＴＡＢ処理上清を、活性炭カラム（３０～３００ｇ／Ｌ多糖調製物）に通した。炭素ろ過多糖調製物を、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）粒子（３～１０％、塩を含む）にさらし、２～４０℃で１５～１２０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離した。上清を２～５０μｍ深層フィルターに通し、深層ろ液を炭素フィルターに通し、続いて０．２２～０．６μｍフィルターに通した。次いで、ろ液（０．２２～０．６μｍ）を濃縮し、３０～３００ｋＤａのＵＦ膜で透析ろ過し、０．５～２％ ＮａＣｌ溶液により、又は水若しくは緩衝液中の塩を使用することなく透析ろ過して、実質的に純粋な形態で莢膜多糖血清型２を得た。
血清型１５Ａ及び１５Ｃからの肺炎球菌莢膜多糖の精製物を、血清型２に関して上記で説明した同様の手順で調製した。
肺炎連鎖球菌血清型２のＤＯＣ細胞溶解物を、バッチ式遠心分離機で遠心分離し、細胞残屑を除去した。次いで、細胞フリーブロスのｐＨを５．０に調整し、４時間にわたりインキュベートし、１４０００ｇで４５分にわたり遠心分離した。遠心分離後、上清を深層フィルターに通した。次いで、ろ液を４．２倍に濃縮し、３０～３００ｋＤａのＵＦ膜を使用して透析ろ過（４～１５倍の透析体積）した。界面活性剤（ＣＴＡＢ１％）を添加し、６℃で３０～９０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離することにより、多糖調製物（保持液）からさらなる不純物を除去した。続いて、このＣＴＡＢ処理上清を、活性炭カラム（３０～３００ｇ／Ｌ多糖調製物）に通した。炭素ろ過多糖調製物を、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）粒子（３～１０％、塩を含む）にさらし、２～４０℃で１５～１２０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離した。上清を２～５０μｍ深層フィルターに通し、深層ろ液を炭素フィルターに通し、続いて０．２２～０．６μｍフィルターに通した。次いで、ろ液（０．２２～０．６μｍ）を濃縮し、３０～３００ｋＤａのＵＦ膜で透析ろ過し、０．５～２％ ＮａＣｌ溶液により、又は水若しくは緩衝液中の塩を使用することなく透析ろ過して、実質的に純粋な形態で莢膜多糖血清型２を得た。
血清型１５Ａ及び１５Ｃからの肺炎球菌莢膜多糖の精製物を、血清型２に関して上記で説明した同様の手順で調製した。
【0096】
ｃ．肺炎球菌莢膜多糖血清型３５Ｂの精製
肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂ ＤＯＣ細胞溶解物を、バッチ式遠心分離機で遠心分離し、細胞残屑を除去した。次いで、細胞フリーブロスのｐＨを５．０に調整し、４時間にわたりインキュベートし、１４０００ｇで４５分にわたり遠心分離した。遠心分離後、上清を深層フィルターに通した。次いで、ろ液を７．５倍に濃縮し、３０～３００ｋＤａのＵＦ膜を使用して透析ろ過（４～１５倍の透析体積）した。界面活性剤（ＣＴＡＢ１％）を添加し、６℃で３０～９０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離することにより、多糖調製物（保持液）からさらなる不純物を除去した。続いて、このＣＴＡＢ処理上清を、活性炭カラム（３０～３００ｇ／Ｌ多糖調製物）に通した。炭素ろ過多糖調製物を、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）粒子（３～１０％、塩を含む）にさらし、２～４０℃で１５～１２０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離した。上清を２～５０μｍ深層フィルターに通し、深層ろ液を炭素フィルターに通し、続いて０．２２～０．６μｍフィルターに通した。次いで、ろ液（０．２２～０．６μｍ）を濃縮し、３０～３００ｋＤ
ａのＵＦ膜で透析ろ過し、０．５～２％ ＮａＣｌ溶液により、又は水若しくは緩衝液中の塩を使用することなく透析ろ過して、実質的に純粋な形態で莢膜多糖血清型３５Ｂを得た。
肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂ ＤＯＣ細胞溶解物を、バッチ式遠心分離機で遠心分離し、細胞残屑を除去した。次いで、細胞フリーブロスのｐＨを５．０に調整し、４時間にわたりインキュベートし、１４０００ｇで４５分にわたり遠心分離した。遠心分離後、上清を深層フィルターに通した。次いで、ろ液を７．５倍に濃縮し、３０～３００ｋＤａのＵＦ膜を使用して透析ろ過（４～１５倍の透析体積）した。界面活性剤（ＣＴＡＢ１％）を添加し、６℃で３０～９０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離することにより、多糖調製物（保持液）からさらなる不純物を除去した。続いて、このＣＴＡＢ処理上清を、活性炭カラム（３０～３００ｇ／Ｌ多糖調製物）に通した。炭素ろ過多糖調製物を、ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）粒子（３～１０％、塩を含む）にさらし、２～４０℃で１５～１２０分にわたりインキュベートし、続いて９０００～１４５００ｇで１５～６０分にわたり遠心分離した。上清を２～５０μｍ深層フィルターに通し、深層ろ液を炭素フィルターに通し、続いて０．２２～０．６μｍフィルターに通した。次いで、ろ液（０．２２～０．６μｍ）を濃縮し、３０～３００ｋＤ
ａのＵＦ膜で透析ろ過し、０．５～２％ ＮａＣｌ溶液により、又は水若しくは緩衝液中の塩を使用することなく透析ろ過して、実質的に純粋な形態で莢膜多糖血清型３５Ｂを得た。
【0097】
ｄ．精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型２のサイジング
上記で得た精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型２を、１～２０サイクルにわたり１００ＭＰａ（１０００ｂａｒ）で高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングした。サイジングされた多糖調製物を、３０ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜で１５ｍｇ／ｍＬに再び濃縮した。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させた。
血清型３５Ｂからの肺炎球菌莢膜多糖のサイジングを、血清型２に関して上記で説明した同様の手順を使用して実行した。
上記で得た精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型２を、１～２０サイクルにわたり１００ＭＰａ（１０００ｂａｒ）で高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングした。サイジングされた多糖調製物を、３０ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜で１５ｍｇ／ｍＬに再び濃縮した。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させた。
血清型３５Ｂからの肺炎球菌莢膜多糖のサイジングを、血清型２に関して上記で説明した同様の手順を使用して実行した。
【0098】
ｅ．精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型１５Ａのサイジング
精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型１５Ａを、１～２０サイクルにわたり１５０ＭＰａ（１５００ｂａｒ）で高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングした。サイジングされた多糖肺炎球菌血清型１５Ａ調製物を、３０ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜で１５ｍｇ／ｍＬに再び濃縮した。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させた。
精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型１５Ａを、１～２０サイクルにわたり１５０ＭＰａ（１５００ｂａｒ）で高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングした。サイジングされた多糖肺炎球菌血清型１５Ａ調製物を、３０ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜で１５ｍｇ／ｍＬに再び濃縮した。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させた。
【0099】
ｆ．精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型１５Ｃのサイジング
精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型１５Ｃを、１～２０サイクルにわたり１２０ＭＰａ（１２００ｂａｒ）で高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングした。サイジングされた多糖肺炎球菌血清型１５Ａ調製物を、３０ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜で１５ｍｇ／ｍＬに再び濃縮した。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させた。
精製された肺炎球菌莢膜多糖血清型１５Ｃを、１～２０サイクルにわたり１２０ＭＰａ（１２００ｂａｒ）で高圧ホモジナイザーを使用して機械的にサイジングした。サイジングされた多糖肺炎球菌血清型１５Ａ調製物を、３０ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜で１５ｍｇ／ｍＬに再び濃縮した。保持液を０．２２μｍフィルターに通し、－２０℃未満で凍結させた。
【0100】
肺炎球菌莢膜多糖血清型２、１５Ａ、及び１５ＣのＮＭＲ構造解析
血清型２、１５Ａ、及び１５Ｃの多糖同一性の確認を、ＮＭＲ解析により行った。この解析を、Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＭＲ ｂａｓｅｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，２２６－２４０（２０００）により公開された方法論に基づいて実施した。図１～３のＮＭＲデータに基づいて、ＮＭＲスペクトルのアノマー領域から多糖同一性を確認し、ピークから、各多糖血清型２、１５Ａ、及び１５Ｃに含まれる糖を同定する。
血清型２、１５Ａ、及び１５Ｃの多糖同一性の確認を、ＮＭＲ解析により行った。この解析を、Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＭＲ ｂａｓｅｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，２２６－２４０（２０００）により公開された方法論に基づいて実施した。図１～３のＮＭＲデータに基づいて、ＮＭＲスペクトルのアノマー領域から多糖同一性を確認し、ピークから、各多糖血清型２、１５Ａ、及び１５Ｃに含まれる糖を同定する。
【0101】
肺炎球菌莢膜多糖血清型３５ＢのＮＭＲ構造解析
血清型３５Ｂの多糖同一性の確認を、ＮＭＲ解析により行った。この解析を、Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＭＲ ｂａｓｅｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，２２６－２４０（２０００）により公開された方法論に基づいて実施した。図４のＮＭＲデータに基づく。血清型３５Ｂの１Ｈ ＮＭＲスペクトルピークの割り当てを、Ｌ．Ｍ．Ｂｅｙｎｏｎ．，Ｊ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ．，Ｍ．Ｂ．Ｐｅｒｒｙ．，Ｐ．Ｊ．Ｋｎｉｓｋｅｒｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３５Ｂ，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７３（１）：４１－４８（１９９５）により公開されたデータに従って行った。
血清型３５Ｂの多糖同一性の確認を、ＮＭＲ解析により行った。この解析を、Ａｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＭＲ ｂａｓｅｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，２２６－２４０（２０００）により公開された方法論に基づいて実施した。図４のＮＭＲデータに基づく。血清型３５Ｂの１Ｈ ＮＭＲスペクトルピークの割り当てを、Ｌ．Ｍ．Ｂｅｙｎｏｎ．，Ｊ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ．，Ｍ．Ｂ．Ｐｅｒｒｙ．，Ｐ．Ｊ．Ｋｎｉｓｋｅｒｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３５Ｂ，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７３（１）：４１－４８（１９９５）により公開されたデータに従って行った。
【0102】
上記で説明したように調製した肺炎球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの
精製及びサイジングされた多糖の顕著な特徴を、下記の表１に示す。
精製及びサイジングされた多糖の顕著な特徴を、下記の表１に示す。
【0103】
【表1】
【0104】
実施例２：担体タンパク質の調製
ａ．ＣＲＭ１９７の調製
ＣＲＭ１９７を、米国特許第５，６１４，３８２号明細書で説明されている方法に従う組み換え法により調製し得る。或いは、ＣＲＭ１９７を、文献で既知の方法に従うか又は国際公開第２０１６／０７９７５５号パンフレット、同第２０１７／０８１７００号パンフレット、及び同第２０１８／１９３４７５号パンフレットで開示されている方法に従って、組み換えにより調製する。ＣＲＭ１９７を、当分野で公知の方法である限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿、及びイオン交換クロマトグラフィーにより精製し得る。
ｂ．ＰｓａＡの調製
ＰｓａＡ遺伝子を、疎水性リーダーペプチド配列を使用することなく、肺炎連鎖球菌血清型４からＰＣＲ増幅させた。この遺伝子配列を検証し、高発現用にインハウスで構築したベクター（ｐＢＥ６６）を使用して大腸菌（Escherichia coli）にクローニングした。
ａ．ＣＲＭ１９７の調製
ＣＲＭ１９７を、米国特許第５，６１４，３８２号明細書で説明されている方法に従う組み換え法により調製し得る。或いは、ＣＲＭ１９７を、文献で既知の方法に従うか又は国際公開第２０１６／０７９７５５号パンフレット、同第２０１７／０８１７００号パンフレット、及び同第２０１８／１９３４７５号パンフレットで開示されている方法に従って、組み換えにより調製する。ＣＲＭ１９７を、当分野で公知の方法である限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿、及びイオン交換クロマトグラフィーにより精製し得る。
ｂ．ＰｓａＡの調製
ＰｓａＡ遺伝子を、疎水性リーダーペプチド配列を使用することなく、肺炎連鎖球菌血清型４からＰＣＲ増幅させた。この遺伝子配列を検証し、高発現用にインハウスで構築したベクター（ｐＢＥ６６）を使用して大腸菌（Escherichia coli）にクローニングした。
【0105】
ＰｓａＡ遺伝子をコードするグリセロールストック培養物を、１５０ｍＬの三角フラスコ中において、グリセロールストック １ｍＬを含むＬＢ培地 ２０ｍＬで回復させた。この培養物を、２００ｒｐｍ下で３７℃にて約６時間にわたり３．５ＯＤの最終ＯＤ６００ｎｍまでインキュベートした。この回復培養物を、５Ｌの三角フラスコ中の播種培養物１Ｌに移した。この培養物を、２００ｒｐｍ下で３７℃にて約１０時間にわたり３の最終ＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。この播種培養物を、下記の培養成分が入った２０Ｌの発酵槽に無菌的に移した：ＨｙＰｅｐｔｏｎｅ ６ｇ／Ｌ、酵母抽出物 １２／Ｌ、オルトリン酸水素二カリウム １３．５ｇ／Ｌ、リン酸アンモニウム二塩基性 ４ｇ／Ｌ、クエン酸 １．７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ １．２ｇ／Ｌ、グルコース ４ｇ／Ｌ、チアミン ＨＣＬ １０ｍｇ／Ｌ、及び１ｍＬ／Ｌの微量元素（例えば、１００ｍＬ組成物の場合の微量元素、ＦｅＣｌ３ ２．７ｇ、ＺｎＣｌ２ ０．２ｇ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、ＣｕＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、ホウ酸 ０．０５ｇ、ＣａＣｌ２ ２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、濃ＨＣＬ １０ｍＬ）。最初の発酵を、ＯＤ６００ｎｍ ０．２ＯＤで開始した。２０％のオルトリン酸及び１２．５％の水酸化アンモニウムを使用して、この発酵全体を通してｐＨを７±０．２で維持した。グルコースレベルが０．５ｇ／Ｌを下回ると、３～４ｇ／Ｌ／時間の安定した速度で供
給バッチを開始し、酸素富化により、この発酵全体を通してＤＯ％を＞２０％に維持した。発酵槽中で細胞を増殖させ、遠心分離により細胞ペレットを回収した。細胞を、細胞破壊装置（Ｐａｎｄａ）を使用して溶解させた。溶解物を１００００ｇで遠心分離し、清澄な上清を精製に供した。
給バッチを開始し、酸素富化により、この発酵全体を通してＤＯ％を＞２０％に維持した。発酵槽中で細胞を増殖させ、遠心分離により細胞ペレットを回収した。細胞を、細胞破壊装置（Ｐａｎｄａ）を使用して溶解させた。溶解物を１００００ｇで遠心分離し、清澄な上清を精製に供した。
【0106】
ＰｓａＡの精製を、Ｌａｒｅｎｔｉｓ他、２０１１（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７８（２０１１）３８）で説明されている手順と同様に実施した。ＤＥＡＥ後に混合モードクロマトグラフィー（Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ－ＩＩ）を使用することにより精製をさらに最適化して、ＰｓａＡのより高い純度を達成した。
【0107】
陰イオン交換クロマトグラフィー：ＤＥＡＥセファロース（ＧＥ）樹脂 ３０ｍＬを、ＸＫ１６／２０カラムに充填した。この樹脂を、５カラム体積の無菌蒸留水で洗浄し、続いて１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（平衡緩衝液）で洗浄した。上清 ３０ｍＬを平衡緩衝液で１００ｍＬまで希釈し、カラムにローディングし、フロースルーを回収した。このカラムを、５体積の平衡緩衝液で洗浄した。（０～１００％Ｂ）の１２体積の直線勾配でＰｓａＡを溶出させた。（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０を含む緩衝液Ａ；２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ８．０を含む緩衝液Ｂ）。この後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０でカラムを洗浄した。
【0108】
混合モードクロマトグラフィー：Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ（ＣＨＴ－ＩＩ） ２５ｍｌを、カラムに充填した。この樹脂を、所定体積の無菌蒸留水で洗浄し、続いて１０体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ６．８で洗浄した。ＳＤＡ ＰＡＧＥでＰｓａＡの約３７ＫＤの良好な濃度の主要な可視バンドを明確に示す、ＤＥＡＥ樹脂からの溶出画分を、プールし、ＣＨＴ－ＩＩ樹脂にローディングした。フロースルーを回収し、このカラムを、５カラム体積の平衡緩衝液で洗浄した。（１５％Ｂ、２０％Ｂ、５０％Ｂ、及び１００％Ｂ）の５カラム体積の段階勾配でタンパク質を溶出させた。緩衝液Ａは、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ６．８を含み、緩衝液Ｂは、２５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．８を含む。
【0109】
ＰｓａＡの予想されるサイズで明確なバンドを示す溶出画分を全てプールし、１０ｋＤａ ＭＷＣＯカセットで濃縮し、２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．５で透析ろ過した。精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングして、純度を評価した。
【0110】
実施例３：肺炎球菌莢膜多糖血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂのコンジュゲーション
ａ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２とＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型２ １０００ｍｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ２００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １２．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．７ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
ａ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２とＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型２ １０００ｍｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ２００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １２．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．７ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
【0111】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２．８ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図５Ａ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリ
ングした。
ングした。
【0112】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、８１６８ｋＤａであった。
ｂ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２とＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型２ １０００ｍｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ２００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １６．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＰｓａＡ
８００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ５３．３３ｍＬ）を、１．０：０．８（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
ｂ．肺炎球菌莢膜多糖血清型２とＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型２ １０００ｍｇ（５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ２００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １６．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＰｓａＡ
８００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ５３．３３ｍＬ）を、１．０：０．８（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
【0113】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ３．５ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図５Ｂ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0114】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、６２９５ｋＤａであった。
ｃ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＡとＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ａ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度
６６．７ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１０．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．０（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １８．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ１９７ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ５３．３ｍＬ）を、１．０：０．８（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
ｃ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＡとＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ａ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度
６６．７ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１０．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．０（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １８．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ１９７ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ５３．３ｍＬ）を、１．０：０．８（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
【0115】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １．０ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図６Ａ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0116】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、４２７２ｋＤａであった。
ｄ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＡとＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ａ １０００ｍｇ（１４．０ｍｇ／ｍＬ濃度
７１．４ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１０．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．０（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２０．５ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、Ｐ
ｓａＡ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
ｄ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＡとＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ａ １０００ｍｇ（１４．０ｍｇ／ｍＬ濃度
７１．４ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１０．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．０（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２０．５ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、Ｐ
ｓａＡ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
【0117】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ０．９ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図６Ｂ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0118】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、９７７６ｋＤａであった。
ｅ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＣとＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ｃ １０００ｍｇ（１０．０ｍｇ／ｍＬ濃度
１００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２４．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ１９７ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
ｅ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＣとＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ｃ １０００ｍｇ（１０．０ｍｇ／ｍＬ濃度
１００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２４．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ１９７ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
【0119】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２．８ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図７Ａ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0120】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、１０４９０ｋＤａであった。ｆ．肺炎球菌莢膜多糖血清型１５ＣとＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ｃ １０００ｍｇ（１０．０ｍｇ／ｍＬ濃度
１００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２４．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＰｓａＡ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
機械的にサイズが減少した多糖血清型１５Ｃ １０００ｍｇ（１０．０ｍｇ／ｍＬ濃度
１００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））１５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：１．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２４．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＰｓａＡ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
【0121】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２．８ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図７Ｂ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0122】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルター
で無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、８７１９ｋＤａであった。
ｇ．肺炎球菌莢膜多糖血清型３５ＢとＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型３５Ｂ １０００ｍｇ（１０．０ｍｇ／ｍＬ濃度
１００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ５．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ１９７ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．７ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
で無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、８７１９ｋＤａであった。
ｇ．肺炎球菌莢膜多糖血清型３５ＢとＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型３５Ｂ １０００ｍｇ（１０．０ｍｇ／ｍＬ濃度
１００．０ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））５．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．５（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ５．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＣＲＭ１９７ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．７ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＣＲＭ）の比で緩やかに添加した。
【0123】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン １．６ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図８Ａ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0124】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、８５７２ｋＤａであった。
ｈ．肺炎球菌莢膜多糖血清型３５ＢとＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型３５Ｂ １０００ｍｇ（７．０ｍｇ／ｍＬ濃度 １４２．８ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））６．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．６（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ７．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＰｓａＡ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
ｈ．肺炎球菌莢膜多糖血清型３５ＢとＰｓａＡとのコンジュゲーション
機械的にサイズが減少した多糖血清型３５Ｂ １０００ｍｇ（７．０ｍｇ／ｍＬ濃度 １４２．８ｍＬ）、及びＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ））６．０ｍＬを、ガラス瓶中において１．０：０．６（ＰＳ：ＣＤＡＰ）の比で混合し、１分にわたり撹拌した。この多糖溶液のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ７．０ｍＬで９．０に調整し、室温（ＲＴ）で１分にわたり撹拌した。この活性化された多糖に、ＰｓａＡ １０００ｍｇ（１５．０ｍｇ／ｍＬ濃度 ６６．６ｍＬ）を、１．０：１．０（ＰｎＰ：ＰｓａＡ）の比で緩やかに添加した。
【0125】
この反応物のｐＨを０．２Ｍのトリエチルアミン ２．２ｍＬで９．０に調整し、この反応を、室温での３～５時間にわたる撹拌下で継続させ、続いて、過剰な濃度のグリシン（１００ｍＭ）を添加することにより、この反応をクエンチした。反応のコンジュゲーション反応速度論（図８Ｂ）を、この反応の各時間でＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用してモニタリングした。
【0126】
反応混合物を透析ろ過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＴＦＦ膜を使用して濃縮した。濃縮液を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ、アントロン法により分析し、コンジュゲートを含む画分をプールして、０．２ｐｍフィルターで無菌ろ過した。得られたコンジュゲートの平均分子量は、６９４４ｋＤａであった。
【0127】
実施例４：肺炎球菌莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンの製剤化
多価のコンジュゲートワクチンを、実施例３で調製した、ＣＲＮ１９７タンパク質 約８～１０μｇにコンジュゲートした、血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇを含む０．５ｍＬ用量として製剤化した。全てのコンジュゲートを、０．５ｍＬの用量当たりＡｌ３＋ ０．５ｍｇに相当するリン酸アルミニウムゲル上に吸着させた。０．９Ｗ／Ｖ％の生理食塩水を、この製剤の希釈剤及びビヒクルとして使用し、最終的な製剤ｐＨを、１Ｎの塩酸を使用してｐＨ ６に調整した。ｐＨ調整後の効果的な吸着のために、この製剤を、一定した撹拌下で２時間にわたり混合した。ブレンドの２時間後、製剤化されたブレンドを、１つのバイアル当たり０．５８ｍＬの充填量で３ｍＬの無菌非シリコン処理バイアルに無菌的に充填し、無菌の１３ｍｍゴム栓で閉じ、１
３ｍｍの無菌のピンク色のフリップオフアルミニウムシールで密閉し、続いて光学的に検査し、充填されたバイアルにラベルを貼った。このロットから、いくつかのバイアルを無作為にピックアップし、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、全多及びタンパク質含有量（μｇ／ＳＨＤ）、吸着％、アルミニウム含有量（ｍｇ／ＳＨＤ）に関して分析した。
多価のコンジュゲートワクチンを、実施例３で調製した、ＣＲＮ１９７タンパク質 約８～１０μｇにコンジュゲートした、血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇを含む０．５ｍＬ用量として製剤化した。全てのコンジュゲートを、０．５ｍＬの用量当たりＡｌ３＋ ０．５ｍｇに相当するリン酸アルミニウムゲル上に吸着させた。０．９Ｗ／Ｖ％の生理食塩水を、この製剤の希釈剤及びビヒクルとして使用し、最終的な製剤ｐＨを、１Ｎの塩酸を使用してｐＨ ６に調整した。ｐＨ調整後の効果的な吸着のために、この製剤を、一定した撹拌下で２時間にわたり混合した。ブレンドの２時間後、製剤化されたブレンドを、１つのバイアル当たり０．５８ｍＬの充填量で３ｍＬの無菌非シリコン処理バイアルに無菌的に充填し、無菌の１３ｍｍゴム栓で閉じ、１
３ｍｍの無菌のピンク色のフリップオフアルミニウムシールで密閉し、続いて光学的に検査し、充填されたバイアルにラベルを貼った。このロットから、いくつかのバイアルを無作為にピックアップし、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、全多及びタンパク質含有量（μｇ／ＳＨＤ）、吸着％、アルミニウム含有量（ｍｇ／ＳＨＤ）に関して分析した。
【0128】
実施例５：肺炎球菌莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンの製剤化
多価のコンジュゲートワクチンを、実施例３で調製した、ＰｓａＡ担体タンパク質 約８～１０μｇにコンジュゲートした、血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇを含む０．５ｍＬ用量として製剤化した。全てのコンジュゲートを、アルミニウム上に吸着させた。全てのコンジュゲートを、０．５ｍＬの用量当たりＡｌ３＋ ０．５ｍｇに相当するリン酸アルミニウムゲル上に吸着させた。０．９Ｗ／Ｖ％の生理食塩水を、この製剤の希釈剤及びビヒクルとして使用し、最終的な製剤ｐＨを、１Ｎの塩酸を使用してｐＨ ６に調整した。ｐＨ調整後の効果的な吸着のために、この製剤を、一定した撹拌下で２時間にわたり混合した。ブレンドの２時間後、製剤化されたブレンドを、１つのバイアル当たり０．５８ｍＬの充填量で３ｍＬの無菌非シリコン処理バイアルに無菌的に充填し、無菌の１３ｍｍゴム栓で閉じ、１３ｍｍの無菌のピンク色のフリップオフアルミニウムシールで密閉し、続いて光学的に検査し、充填されたバイアルにラベルを貼った。このロットから、いくつかのバイアルを無作為にピックアップし、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、全多及びタンパク質含有量（μｇ／ＳＨＤ）、吸着％、アルミニウム含有量（ｍｇ／ＳＨＤ）に関して分析した。
多価のコンジュゲートワクチンを、実施例３で調製した、ＰｓａＡ担体タンパク質 約８～１０μｇにコンジュゲートした、血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇを含む０．５ｍＬ用量として製剤化した。全てのコンジュゲートを、アルミニウム上に吸着させた。全てのコンジュゲートを、０．５ｍＬの用量当たりＡｌ３＋ ０．５ｍｇに相当するリン酸アルミニウムゲル上に吸着させた。０．９Ｗ／Ｖ％の生理食塩水を、この製剤の希釈剤及びビヒクルとして使用し、最終的な製剤ｐＨを、１Ｎの塩酸を使用してｐＨ ６に調整した。ｐＨ調整後の効果的な吸着のために、この製剤を、一定した撹拌下で２時間にわたり混合した。ブレンドの２時間後、製剤化されたブレンドを、１つのバイアル当たり０．５８ｍＬの充填量で３ｍＬの無菌非シリコン処理バイアルに無菌的に充填し、無菌の１３ｍｍゴム栓で閉じ、１３ｍｍの無菌のピンク色のフリップオフアルミニウムシールで密閉し、続いて光学的に検査し、充填されたバイアルにラベルを貼った。このロットから、いくつかのバイアルを無作為にピックアップし、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、全多及びタンパク質含有量（μｇ／ＳＨＤ）、吸着％、アルミニウム含有量（ｍｇ／ＳＨＤ）に関して分析した。
【0129】
実施例５：肺炎球菌莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンの製剤化
２４価のコンジュゲートワクチンを、ＣＲＮ１９７ ２５～４０μｇにコンジュゲートした、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇ（但し、６Ｂは４．４μｇ）を含む０．５ｍＬ用量として製剤化し、血清型３、６Ａ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、及び３５Ｂからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇは、ＰｓａＡ ２５～４０μｇにコンジュゲートした。全てのコンジュゲートを、０．５ｍＬの用量当たりＡｌ３＋ ０．５ｍｇに相当するリン酸アルミニウムゲル上に吸着させた。０．９Ｗ／Ｖ％の生理食塩水を、この製剤の希釈剤及びビヒクルとして使用し、最終的な製剤ｐＨを、１Ｎの塩酸を使用してｐＨ ６に調整した。ｐＨ調整後の効果的な吸着のために、この製剤を、一定した撹拌下で２時間にわたり混合した。ブレンドの２時間後、製剤化されたブレンドを、１つのバイアル当たり０．５８ｍＬの充填量で３ｍＬの無菌非シリコン処理バイアルに無菌的に充填し、無菌の１３ｍｍゴム栓で閉じ、１３ｍｍの無菌のピンク色のフリップオフアルミニウムシールで密閉し、続いて光学的に検査し、充填されたバイアルにラベルを貼った。このロットから、いくつかのバイアルを無作為にピックアップし、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、全多及びタンパク質含有量（μｇ／ＳＨＤ）、吸着％、アルミニウム含有量（ｍｇ／ＳＨＤ）に関する分析に送った。
２４価のコンジュゲートワクチンを、ＣＲＮ１９７ ２５～４０μｇにコンジュゲートした、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇ（但し、６Ｂは４．４μｇ）を含む０．５ｍＬ用量として製剤化し、血清型３、６Ａ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、及び３５Ｂからの各肺炎球菌多糖 ２．２μｇは、ＰｓａＡ ２５～４０μｇにコンジュゲートした。全てのコンジュゲートを、０．５ｍＬの用量当たりＡｌ３＋ ０．５ｍｇに相当するリン酸アルミニウムゲル上に吸着させた。０．９Ｗ／Ｖ％の生理食塩水を、この製剤の希釈剤及びビヒクルとして使用し、最終的な製剤ｐＨを、１Ｎの塩酸を使用してｐＨ ６に調整した。ｐＨ調整後の効果的な吸着のために、この製剤を、一定した撹拌下で２時間にわたり混合した。ブレンドの２時間後、製剤化されたブレンドを、１つのバイアル当たり０．５８ｍＬの充填量で３ｍＬの無菌非シリコン処理バイアルに無菌的に充填し、無菌の１３ｍｍゴム栓で閉じ、１３ｍｍの無菌のピンク色のフリップオフアルミニウムシールで密閉し、続いて光学的に検査し、充填されたバイアルにラベルを貼った。このロットから、いくつかのバイアルを無作為にピックアップし、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、全多及びタンパク質含有量（μｇ／ＳＨＤ）、吸着％、アルミニウム含有量（ｍｇ／ＳＨＤ）に関する分析に送った。
【0130】
実施例６：０．５ｍＬ用量によるウサギの免疫化
Ａ）免疫化及びＥＬＩＳＡ
それぞれ１．５～２ｋｇの健康なウサギを、収容施設（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｆａｃｉｌｉｔｙ）で飼育した。ウサギを、実施例４及び５で説明されている多価ＰＣＶの単回０．５ｍＬ用量で免疫化した。７匹のウサギからなる各群を、１日目、１５日目、及び２９日目に製剤で免疫化した。０日目（免疫化前）、１５日目（試験血液）、及び３６日目（最終血液）に血液サンプルを採取した。０日目（ＰＤ１）及び４０日目（ＰＤ３）に採取したウサギ血清を、ＥＬＩＳＡを使用して、血清型特異的免疫反応に関して分析した。このＥＬＩＳＡを、ＷＨＯ推奨プロトコルに従って実施した。このＥＬＩＳＡを、ＷＨＯ推奨プロトコルに従って実施した。簡潔に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートを、所与の血清型のＰｎＣＰＳでコーティングした。このＥＬＩＳＡを、ＷＨ
Ｏ推奨プロトコルに従って実施した。簡潔に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートを、所与の血清型のＰｎＣＰＳでコーティングした（ＰＢＳを使用して１μｇ／５０μＬ／ウェル；無菌エンドトキシンフリー、０．０２％アジ化ナトリウムを含む）。プレートを、加湿用の濡れたペーパータオルと一緒に箱に入れ、５時間にわたり３７℃±２℃でインキュベートし、次いで、このプレートを、使用するまで５℃±３℃で保管した。
Ａ）免疫化及びＥＬＩＳＡ
それぞれ１．５～２ｋｇの健康なウサギを、収容施設（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｆａｃｉｌｉｔｙ）で飼育した。ウサギを、実施例４及び５で説明されている多価ＰＣＶの単回０．５ｍＬ用量で免疫化した。７匹のウサギからなる各群を、１日目、１５日目、及び２９日目に製剤で免疫化した。０日目（免疫化前）、１５日目（試験血液）、及び３６日目（最終血液）に血液サンプルを採取した。０日目（ＰＤ１）及び４０日目（ＰＤ３）に採取したウサギ血清を、ＥＬＩＳＡを使用して、血清型特異的免疫反応に関して分析した。このＥＬＩＳＡを、ＷＨＯ推奨プロトコルに従って実施した。このＥＬＩＳＡを、ＷＨＯ推奨プロトコルに従って実施した。簡潔に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートを、所与の血清型のＰｎＣＰＳでコーティングした。このＥＬＩＳＡを、ＷＨ
Ｏ推奨プロトコルに従って実施した。簡潔に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートを、所与の血清型のＰｎＣＰＳでコーティングした（ＰＢＳを使用して１μｇ／５０μＬ／ウェル；無菌エンドトキシンフリー、０．０２％アジ化ナトリウムを含む）。プレートを、加湿用の濡れたペーパータオルと一緒に箱に入れ、５時間にわたり３７℃±２℃でインキュベートし、次いで、このプレートを、使用するまで５℃±３℃で保管した。
【0131】
試験血清をＣＷＰＳ Ｍｌｔｉ（商標）に予め吸着させて、細胞壁多糖に由来するバックグラウンド反応性を排除した。これを達成するために、試験血清及び陽性対照血清 ２μＬを、吸着前溶液（１ｍＬ－ＰＢＳＴ中の１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標） ９９９μＬ中におけるＣＷＰＳ Ｍｕｌｔｉ（商標） １μＬ）９９８μＬを使用して、１：５００の最終希釈で希釈した。この希釈されたサンプルを、連続的に振盪させつつ１時間にわたり室温（２５℃±５℃）でインキュベートした。プレートをはじくことにより非結合ＰｎＣＰＳを除去し、ブロッカー（ＰＢＳ中における２０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標））２００μｌを添加することにより、ウェル中のフリーの場所をブロックした。プレートを、振盪させることなく１時間にわたり室温（２５±５℃）でインキュベートした。
【0132】
Ｂ）試験サンプル及び対照の添加
Ａ１～Ａ１２を除く全てのウェルに、希釈剤（ＰＢＳＴ中における１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標））５０μＬを添加した。この後、１００μＬ／ウェルの予め吸着された試験血清サンプルを、Ａ１～Ａ１０に添加し、対照血清サンプルを、Ａ１１及びＡ１２に添加した。１回目から２回目等（即ち、Ａ１～Ａ１０からＨ１～Ｈ１０）で５０μＬを移すことにより、試験サンプルの２倍連続希釈を実施した。同様に、Ａ１１及び１２からＥ１１及びＥ１２への対照サンプル（００７ＳＰ）の連続希釈を実施した。希釈しないＦ１１及びＦ１２からＨ１１及びＨ１２を、ブランクと設定した。プレートを、振盪させることなく２時間にわたり室温（２５℃±５℃）でインキュベートした。このインキュベーションステップの後、内容物を廃棄し、プレートを、手動で又はプレート洗浄機により、ＰＢＳＴ（約２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。
Ａ１～Ａ１２を除く全てのウェルに、希釈剤（ＰＢＳＴ中における１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標））５０μＬを添加した。この後、１００μＬ／ウェルの予め吸着された試験血清サンプルを、Ａ１～Ａ１０に添加し、対照血清サンプルを、Ａ１１及びＡ１２に添加した。１回目から２回目等（即ち、Ａ１～Ａ１０からＨ１～Ｈ１０）で５０μＬを移すことにより、試験サンプルの２倍連続希釈を実施した。同様に、Ａ１１及び１２からＥ１１及びＥ１２への対照サンプル（００７ＳＰ）の連続希釈を実施した。希釈しないＦ１１及びＦ１２からＨ１１及びＨ１２を、ブランクと設定した。プレートを、振盪させることなく２時間にわたり室温（２５℃±５℃）でインキュベートした。このインキュベーションステップの後、内容物を廃棄し、プレートを、手動で又はプレート洗浄機により、ＰＢＳＴ（約２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。
【0133】
Ｃ）一次抗体の添加
全てのウェルに、５０μＬ／ウェルの組み換えタンパク質Ａ／Ｇペルオキシダーゼ（ＰＢＳＴ中における１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）を使用して１：２００００に希釈した）を添加し、プレートを、振盪させることなく室温（２５℃±５℃）で１時間にわたりインキュベートした。この後、プレートを、手動で又はプレート洗浄機により、ＰＢＳＴ（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。
全てのウェルに、５０μＬ／ウェルの組み換えタンパク質Ａ／Ｇペルオキシダーゼ（ＰＢＳＴ中における１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）を使用して１：２００００に希釈した）を添加し、プレートを、振盪させることなく室温（２５℃±５℃）で１時間にわたりインキュベートした。この後、プレートを、手動で又はプレート洗浄機により、ＰＢＳＴ（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した。
【0134】
Ｄ）発現及び読み取り
５０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加することにより発色反応を発現させ、振盪させることなく室温（２５℃±５℃）で１５分にわたりインキュベートした。５０μＬ／ウェルの１．２５Ｍの硫酸を添加することにより、この反応を停止させた。４５０ｎｍでのＯＤを測定した。
５０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加することにより発色反応を発現させ、振盪させることなく室温（２５℃±５℃）で１５分にわたりインキュベートした。５０μＬ／ウェルの１．２５Ｍの硫酸を添加することにより、この反応を停止させた。４５０ｎｍでのＯＤを測定した。
【0135】
Ｅ）力価の推定
免疫化動物での抗体価を、希釈係数の逆数として割り当てた。免疫前の力価（約０．２）の２倍のＯＤ４５０ｎｍを示す最高希釈を、力価として報告した。各血清型に対する血清抗体価をプロットし、様々な処置群と比較した。
免疫化動物での抗体価を、希釈係数の逆数として割り当てた。免疫前の力価（約０．２）の２倍のＯＤ４５０ｎｍを示す最高希釈を、力価として報告した。各血清型に対する血清抗体価をプロットし、様々な処置群と比較した。
【0136】
Ｆ）ウサギにおける免疫反応
ウサギを、実施例５で説明されている製剤で免疫化した。この研究デザインは、それぞ
れ７匹のウサギの２つの群からなった。動物を、製剤化されたワクチンの３回の用量で免疫化した。
ウサギを、実施例５で説明されている製剤で免疫化した。この研究デザインは、それぞ
れ７匹のウサギの２つの群からなった。動物を、製剤化されたワクチンの３回の用量で免疫化した。
【0137】
この免疫化ウサギからの血清を、指定の間隔で採取した。血清型特異的ＩｇＧ力価レベルをＥＬＩＳＡで推定し、このＥＬＩＳＡは、ヒト血清中での血清抗体価を評価するために、ＷＨＯ推奨ＥＬＩＳＡから適合されている。抗体価を、カットオフ限界を超えるＯＤ４５０ｎｍ値が得られる血清の最大希釈として推定した。ワクチン接種前の動物のＩｇＧ力価値を使用して、血清ＩｇＧ力価の幾何平均倍数上昇（ＧＭＦＲ）を算出した。上記で説明した２４価のＰＣＶ製剤の投与後に、動物は、ワクチン中のコンジュゲートの多糖の各血清型に対する抗体を有することが見出されており、従って、このワクチンは免疫原性である。
【0138】
（図９に）示すように、力価を、カットオフ値（免疫前血清で観察されるＯＤ４５０ｎｍの２倍；約０．１のＯＤ値）を超えるＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０ｎｍを生じた最大血清希釈として推定する。各血清型に関する幾何平均倍数上昇（ＧＭＦＲ）をプロットした。免疫化の３回の用量後（用量３の後）に得られた血清を使用して、免疫原性を評価した。黒色の棒は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした肺炎球菌多糖を示し、内側が白色の棒は、ＰｓａＡにコンジュゲートした肺炎球菌多糖を示す。
【0139】
上述から、本発明の具体的な実施形態は説明を目的として本明細書で説明されているが、本発明の範囲を逸脱することなく様々な改変を行うことができることが理解されるだろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～５００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、担体タンパク質が、ＰｓａＡであり、この組成物は、約０．７～約１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含み、莢膜多糖が、１－シアノ－４－ジメチルアミノ－ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により活性化され、その後に担体タンパク質にコンジュゲートされている、肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項2】
担体タンパク質ＰｓａＡにコンジュゲートした、平均分子量５０～５００ｋＤａを有する、血清型２からの多糖を含み、この組成物は、約０．７～約１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項3】
担体タンパク質ＰｓａＡにコンジュゲートした、平均分子量５０～５００ｋＤａを有する、血清型１５Ａからの多糖を含み、この組成物は、約０．７～約１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項4】
担体タンパク質ＰｓａＡにコンジュゲートした、平均分子量５０～５００ｋＤａを有する、血清型１５Ｃからの多糖を含み、この組成物は、約０．７～約１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項5】
担体タンパク質ＰｓａＡにコンジュゲートした、平均分子量５０～５００ｋＤａを有する、血清型３５Ｂからの多糖を含み、この組成物は、約０．７～約１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、請求項１に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項6】
コンジュゲートが、下記範囲の平均分子量：５００ｋＤａ～５０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ～２５，０００ｋＤａ、又は３，０００ｋＤａ～３０，０００ｋＤａを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項7】
肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの糖コンジュゲート中の莢膜多糖は、平均分子量５０～５００ｋＤａを有し、担体タンパク質にコンジュゲートしており、担体タンパク質が、ＰｓａＡであり、この組成物は、約０．７～約１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含み、莢膜多糖が、１－シアノ－４－ジメチルアミノ－ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により活性化され、その後に担体タンパク質にコンジュゲートされている、免疫原性組成物。
【請求項8】
ＰｓａＡ及びＣＲＭ１９７から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆからの糖コンジュゲートをさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
組成物が、多価の免疫原性組成物であり、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、又はそれより高い原子価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項７又は８に記載の免疫原性組成物。
【請求項10】
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも３種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲート組成物であり、血清型は、ＰｓａＡ及びＣＲＭ１９７から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲート組成物であり、血清型は、ＰｓａＡ及びＣＲＭ１９７から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆから選択される１種又は複数の追加の血清型からの多糖を含む多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、ＰｓａＡ及びＣＲＭ１９７から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項13】
組成物が、担体タンパク質にコンジュゲートした肺炎連鎖球菌の血清型からの多糖を含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ、並びに追加の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆを含み、担体タンパク質は、ＰｓａＡ及びＣＲＭ１９７から選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項14】
ワクチン又は免疫原性組成物が、肺炎連鎖球菌感染の予防に有用である、請求項１～５のいずれか一項に記載のワクチン、又は請求項７～１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項15】
糖コンジュゲートが、下記範囲の平均分子量：５００ｋＤａ～５０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ～２５，０００ｋＤａ、又は３，０００ｋＤａ～３０，０００ｋＤａを有する、請求項７～１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0139】
本発明の態様には、下記も含まれる。
態様１
平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖。
態様２
平均分子量（Ｍｗ）５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～５００ｋＤａを有する、態様１に記載の肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製された莢膜多糖。
態様３
５～１８％の範囲内のグリセロール含有量を有する、態様１に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ａ又は１５Ｃの精製された莢膜多糖。
態様４
５～１０％のグリセロール含有量を有する、態様３に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ａの精製された莢膜多糖。
態様５
５～１０％のグリセロール含有量を有する、態様３に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃの精製された莢膜多糖。
態様６
２～１０％の範囲内、好ましくは２～８％の範囲内のアセテート含有量を有する、態様１に記載の肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの精製された莢膜多糖。
態様７
肺炎連鎖球菌血清型の精製及びサイジングされた莢膜多糖を調製する方法であって、
ａ．肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂを適切な培養培地で培養するステップ；
ｂ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを不活性化するステップ；
ｃ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを遠心分離にかけるステップ；
ｄ．培養ブロスから前記肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を精製するステップ；
及び
ｅ．精製された肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を高圧均質化にかけて、平均分子量（ＭＷ）５０～１０００ｋＤａを有するサイジングされた莢膜多糖を得るステップ
を含む方法。
態様８
均質化が、５０～２００ＭＰａ（５００～２０００ｂａｒ）の範囲の圧力で行われる、態様７に記載の方法。
態様９
態様７に記載の方法により得られた、平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製された莢膜多糖。
態様１０
担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の精製及びサイジングされた莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、この組成物は、約０．５～約２．０のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１１
担体タンパク質が、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はこれらの組合せから選択される、態様１０に記載のコンジュゲートワクチン。
態様１２
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型２からの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１３
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型１５Ａからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１４
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型１５Ｃからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１５
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型３５Ｂからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１６
コンジュゲートが、下記範囲の平均分子量：５００ｋＤａ～５０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ～２５，０００ｋＤａ、又は３，０００ｋＤａ～３０，０００ｋＤａを有する、態様１０～１５のいずれか一項に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１７
肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、糖コンジュゲート中の多糖は、態様１に記載の精製された莢膜多糖である、免疫原性組成物。
態様１８
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質、又は担体タンパク質の組合せにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆからの糖コンジュゲートをさらに含む、態様１７に記載の免疫原性組成物。
態様１９
組成物が、多価の免疫原性組成物であり、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、又はそれより高い原子価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１７又は１８に記載の組成物。
態様２０
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも３種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲート組成物であり、血清型は、担体タンパク質にコンジュゲートしており、担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２１
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲートであり、血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２２
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆから選択される１種又は複数の追加の血清型からの多糖を含む多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２３
組成物が、担体タンパク質にコンジュゲートした肺炎連鎖球菌の血清型からの多糖を含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ、並びに追加の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆを含み、担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２４
多糖が、ワクチン又は免疫原性組成物の調製に有用である、態様１に記載の精製された莢膜多糖。
態様２５
ワクチン又は免疫原性組成物が、肺炎連鎖球菌感染の予防に有用である、態様１０～１６のいずれか一項に記載のワクチン、又は態様１７～２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
上述から、本発明の具体的な実施形態は説明を目的として本明細書で説明されているが、本発明の範囲を逸脱することなく様々な改変を行うことができることが理解されるだろう。
態様１
平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製及びサイジングされた莢膜多糖。
態様２
平均分子量（Ｍｗ）５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～５００ｋＤａを有する、態様１に記載の肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製された莢膜多糖。
態様３
５～１８％の範囲内のグリセロール含有量を有する、態様１に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ａ又は１５Ｃの精製された莢膜多糖。
態様４
５～１０％のグリセロール含有量を有する、態様３に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ａの精製された莢膜多糖。
態様５
５～１０％のグリセロール含有量を有する、態様３に記載の肺炎連鎖球菌血清型１５Ｃの精製された莢膜多糖。
態様６
２～１０％の範囲内、好ましくは２～８％の範囲内のアセテート含有量を有する、態様１に記載の肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの精製された莢膜多糖。
態様７
肺炎連鎖球菌血清型の精製及びサイジングされた莢膜多糖を調製する方法であって、
ａ．肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂを適切な培養培地で培養するステップ；
ｂ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを不活性化するステップ；
ｃ．肺炎連鎖球菌の培養ブロスを遠心分離にかけるステップ；
ｄ．培養ブロスから前記肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を精製するステップ；
及び
ｅ．精製された肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を高圧均質化にかけて、平均分子量（ＭＷ）５０～１０００ｋＤａを有するサイジングされた莢膜多糖を得るステップ
を含む方法。
態様８
均質化が、５０～２００ＭＰａ（５００～２０００ｂａｒ）の範囲の圧力で行われる、態様７に記載の方法。
態様９
態様７に記載の方法により得られた、平均分子量（Ｍｗ）５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂの精製された莢膜多糖。
態様１０
担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の精製及びサイジングされた莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、この組成物は、約０．５～約２．０のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１１
担体タンパク質が、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、又はこれらの組合せから選択される、態様１０に記載のコンジュゲートワクチン。
態様１２
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型２からの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１３
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型１５Ａからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１４
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型１５Ｃからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１５
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、又は破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートした、平均分子量５０～１０００ｋＤａを有する、血清型３５Ｂからの多糖を含み、この組成物は、約０．５～約２．０、好ましくは０．７～１．２のタンパク質対多糖（タンパク質／ＰＳ）の（ｗ／ｗ）パーセント比を含む、態様１０に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１６
コンジュゲートが、下記範囲の平均分子量：５００ｋＤａ～５０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ～２５，０００ｋＤａ、又は３，０００ｋＤａ～３０，０００ｋＤａを有する、態様１０～１５のいずれか一項に記載の肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
態様１７
肺炎連鎖球菌血清型２、１５Ａ、１５Ｃ、又は３５Ｂからの少なくとも１種の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、糖コンジュゲート中の多糖は、態様１に記載の精製された莢膜多糖である、免疫原性組成物。
態様１８
ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質、又は担体タンパク質の組合せにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆからの糖コンジュゲートをさらに含む、態様１７に記載の免疫原性組成物。
態様１９
組成物が、多価の免疫原性組成物であり、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、又はそれより高い原子価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１７又は１８に記載の組成物。
態様２０
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも３種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲート組成物であり、血清型は、担体タンパク質にコンジュゲートしており、担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２１
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆを含む追加の血清型からの多糖を含む２４価の肺炎球菌コンジュゲートであり、血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２２
組成物が、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂから選択される少なくとも２種の肺炎球菌血清型、並びに１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆから選択される１種又は複数の追加の血清型からの多糖を含む多価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される担体タンパク質にコンジュゲートしている、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２３
組成物が、担体タンパク質にコンジュゲートした肺炎連鎖球菌の血清型からの多糖を含む１７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物であり、血清型は、２、１５Ａ、１５Ｃ、及び３５Ｂ、並びに追加の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆを含み、担体タンパク質は、ＰｓａＡ、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、破傷風トキソイド（ＴＴ）から選択される、態様１９に記載の免疫原性組成物。
態様２４
多糖が、ワクチン又は免疫原性組成物の調製に有用である、態様１に記載の精製された莢膜多糖。
態様２５
ワクチン又は免疫原性組成物が、肺炎連鎖球菌感染の予防に有用である、態様１０～１６のいずれか一項に記載のワクチン、又は態様１７～２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
上述から、本発明の具体的な実施形態は説明を目的として本明細書で説明されているが、本発明の範囲を逸脱することなく様々な改変を行うことができることが理解されるだろう。
【外国語明細書】