特開 2024-160318 ＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024160318

(43)【公開日】2024-11-13

(54)【発明の名称】ＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241106BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241106BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12P21/08

C12N5/10

C12N15/63 Z

A61K39/395 T

A61K39/395 S

A61K38/16

A61K45/00

A61P35/00

A61P43/00 121

C07K16/46

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024131936

(22)【出願日】2024-08-08

(62)【分割の表示】P 2021556753の分割

【原出願日】2020-03-20

(31)【優先権主張番号】62/822,124

(32)【優先日】2019-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ディミトリス スココス

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー ジェイ． マーフィー

(72)【発明者】

【氏名】ジョージ ディー． ヤンコポーロス

(72)【発明者】

【氏名】ローリック ハーバー

(72)【発明者】

【氏名】チア－ヤン リン

(57)【要約】

【課題】ＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗体の提供。
【解決手段】本発明は、ＥＧＦＲおよびＣＤ２８に結合する多特異性抗体（ＥＧＦＲｘＣＤ２８）ならびに抗ＥＧＦＲ抗体を提供する。かかる抗体は、例えば抗ＰＤ１抗体などのさらなる治療剤と組み合わせられ得る。当該抗体（および例えば抗ＰＤ１とのその組み合わせ）を投与することにより、癌（例えばＥＧＦＲ発現癌）を治療する方法も提供される。本発明のＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体は、ＰＤ－１阻害と組み合わされた、腫瘍標的化免疫療法モダリティを具現化するものである。これら二特異性抗体は、一つのアームで腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（ＥＧＦＲ）に結合し、他のアームでＴ細胞の共刺激性受容体、ＣＤ２８に結合する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２２，１２４号明細書に関連し、その利益を主張するものである。前述の出願の全内容は参照により本明細書に明示的に援用される。

【0002】

本発明は、ＥＧＦ受容体とＣＤ２８に結合する抗体、および例えば癌を治療または予防するためのその使用方法に関連する。

【0003】

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年３月１９日に作成され、１１８００３－１０６２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは６３，４８１バイトである。

【背景技術】

【0004】

Ｔ細胞が例えばウイルス感染細胞や腫瘍細胞などの自身の細胞標的を認識し、殺傷する能力は、協調的な一連の相互作用に依存する。その中でもＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（会合したＣＤ３γ、δ、εおよびζ鎖を含む）による標的細胞の認識と結合が挙げられ、この相互作用はＴ細胞活性化の「シグナル１」とも呼称されている。ＴＣＲは標的細胞の表面上に発現されたＭＨＣタンパク質の溝（ｇｒｏｏｖｅ）に提示されたウイルスペプチドまたは腫瘍ペプチドを認識する。そうした結合は一般的にアフィニティが低いため、「シグナル１」の誘発を成功させるためには、Ｔ細胞とその標的細胞の間のインターフェースに沿った多数のＴＣＲ複合体のクラスター形成が必要となる。このインターフェースは、「免疫シナプス」と呼称されている。Ｔ細胞の活性化は、追加の相互作用によってさらに促進することができる。例えばＴ細胞はその表面上にＣＤ２８と呼ばれる分子を有しており、この分子によって共刺激性の「シグナル２」が生じ、ＴＣＲ複合体を介した活性化を増大させることができる。Ｔ細胞が、自身のＴＣＲ複合体を介して標的細胞を認識し、次いで標的細胞上の同系リガンドに結合したＣＤ２８を介した「シグナル２」とさらに連動することで、Ｔ細胞活性化が増強される。「シグナル１」と同様に、ＣＤ２８介在性の「シグナル２」も、免疫シナプスでの共クラスター形成を介して発生すると考えられている。

【0005】

アゴニスト性の抗ＣＤ２８ ｍＡｂは、培養Ｔ細胞の持続的な生体外拡張に適用することができるが、ＣＤ２８に対する抗体の使用は、超アゴニスト性の抗ＣＤ２８ ｍＡｂを全身性に試験した第Ｉ相臨床試験での一連の急性で重篤な有害事象の発生を受けて停止されている（Ｈｕｎｉｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１２：３１７－３１８）。局所的な、または標的化された抗ＣＤ２８ ｍＡｂの使用は、抗腫瘍免疫の促進に関し、低リスクで使用することができる。Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００１ Ｊａｎ １５；９１（２）：２２５－３０。

【0006】

増殖因子および増殖因子受容体の様々なファミリーが、癌細胞の自律的増殖に関与していることが示されている。これらの中でも上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびペプチド増殖因子のＥＧＦファミリーは、様々な癌腫型の病態および進行において中心的な役割を担っている。ＥＧＦＲはＥｒｂＢ－２、ＥｒｂＢ－３、およびＥｒｂＢ－４の３種の追加タンパク質を包含する受容体ファミリーに属する。これらタンパク質とＥＧＦファミリーの増殖因子は、統合型システムを形成する。そのシステムにおいて、個々の受容体型にヒットするシグナルがしばしば同ファミリーの他の受容体へと伝達されてしまう。

【0007】

Ｔ細胞活性化を対象とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、抗腫瘍治療剤として臨床開発中である。しかし現行の治療法の大部分が、腫瘍微小環境の阻害的な性質の克服に苦労しており、効率的な腫瘍特異的Ｔ細胞活性化と、それに続く腫瘍細胞殺傷の創出に失敗している。例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＴＬＡ）－４やプログラム細胞死１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １、ＰＤ－１）／プログラム細胞死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）などのチェックポイント阻害物質を対象とする数種のブロッキングｍＡｂが、メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺癌および進行性転移性の皮膚扁平上皮細胞癌に対して臨床承認されている。ＰＤ－１のブロッキングはＴ細胞活性化のブレイクを発生させるが、単剤としてのその有効性はしばしば、腫瘍のクリアランスや持続的な抗腫瘍応答を得るに不充分であった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｈｕｎｉｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１２：３１７－３１８

【非特許文献2】Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００１ Ｊａｎ １５；９１（２）：２２５－３０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、分化抗原群２８（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
２８、ＣＤ２８）および上皮細胞増殖因子受容体を標的とする二特異性抗体（ＥＧＦＲｘＣＤ２８またはＣＤ２８ｘＥＧＦＲ）を使用した免疫治療モダリティを提供するものであり、当該二特異性抗体は、ＰＤ－１ブロッキング抗体と組み合わされたときに、長期的な抗腫瘍免疫を誘導し、安定的な腫瘍内Ｔ細胞活性化を促進しつつ、全身性のサイトカイン分泌の兆候は同系およびヒト腫瘍異種移植片モデルの両方において認められなかった。遺伝子改変ヒト化免疫能正常マウスおよびカニクイザルにおける毒性試験により、これら二特異性抗体が、いくらかの単剤活性を呈すること、そしてそれ自体の毒性、または抗ＰＤ－１抗体との併用の毒性はないことが示された。まとめると、これらのデータから、このＣＤ２８をベースとした二特異性抗体物質と、ＰＤ－１阻害との併用が、安全な生物学的解決法を提供し、際立って増強された、特異性のある相乗的な抗腫瘍活性を有することが示唆される。

【0010】

一つの態様では、本発明は、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定したときに、約１０^－６Ｍ未満のＫ_ＤでヒトＣＤ２８に結合する第一の抗原結合ドメインと、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定したときに、約１０^－９Ｍ未満のＫ_Ｄで標的腫瘍細胞上のヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインとを含む単離二特異性抗原結合分子を提供する。

【0011】

別の態様では、当該単離二特異性抗原結合分子は、抗ムチン（Ｍｕｃｉｎｅ）１６（ＭＵＣ１６）Ｘ ＣＤ３二特異性抗体と併せて使用され、ＥＧＦＲを発現する標的細胞に対して検証されたときに、共刺激性の効果を示す。一つの実施形態では、当該共刺激性の効果は、以下のうちの一つ以上により示される：（ａ）ヒトＴ細胞を活性化し、ＥＧＦＲを発現する標的細胞を殺傷するよう誘導する能力、（ｂ）Ｔ細胞上のＰＤ－１をアップレギュレートする能力、（ｃ）ＰＢＭＣからのサイトカインＩＦＮガンマとＴＮＦの放出を増大させる能力、（ｄ）腫瘍細胞を激減させる能力、または（ｆ）腫瘍クリアランスを増強する能力。別の実施形態では、当該共刺激性の効果は、以下のうちの一つ以上によりさらに示される：（ｇ）Ｔ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼ系レポーターアッセイにおける、ＮＦκＢ活性の活性化、または（ｈ）初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞／ＡＰＣ機能性アッセイを使用したＩＬ－２サイトカイン産生の測定。

【0012】

本発明は、以下を含む、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する多特異性（例えば、二特異性）抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を提供する：（１）（ａ）配列番号２、３０、４０、および５０からなる群から選択される一つに記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む重鎖可変領域のＨＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、および／または（ｂ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびにＣＤ２８結合アーム、または（２）（ｃ）配列番号１０、５９、および６３からなる群から選択される一つに記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む重鎖可変領域のＨＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、および／または（ｄ）配列番号１６および６７からなる群から選択される一つに記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、を含むＣＤ２８結合アーム、ならびにＥＧＦＲ結合アーム。

【0013】

例えば、本発明の一つの実施形態では、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する多特異性（例えば、二特異性）抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、（１）（ａ）配列番号２、２４、３０、４０、および５０に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸、もしくはそのバリアントを含む重鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、および／または（ｂ）配列番号１６および２８に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む軽鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびにＣＤ２８結合アーム、または（２）（ｃ）配列番号１０、２６、５９、および６３に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む重鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、および／または（ｄ）配列番号１６、２８、および６７に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む軽鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、を含むＣＤ２８結合アーム、ならびにＥＧＦＲ結合アーム、を含む。

【0014】

本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する多特異性抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、（１）（ａ）それぞれ、配列番号２、３０、４０、もしくは５０に記載されるアミノ酸配列、および配列番号２、３０、４０、もしくは５０に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、および／またはそれぞれ、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列、および配列番号１６に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびにＣＤ２８結合アーム、または（２）（ｃ）それぞれ、配列番号１０、５９、もしくは６３に記載されるアミノ酸配列、および配列番号１０、５９、もしくは６３に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、および／または（ｄ）それぞれ、配列番号１６、または６７に記載されるアミノ酸配列、および配列番号１６または６７に記載されるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖免疫グロブリン、もしくはその可変領域、を含むＣＤ２８結合アーム、ならびにＥＧＦＲ結合アーム、を含む。

【0015】

本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する当該多特異性（例えば、二特異性）抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、以下を含む：（１）
アミノ酸配列：ＧＤＳＩＩＴＦＹ（配列番号４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＡＲＶＳＥＤＳＹＦＨＹＧＭＤＶ（配列番号８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、ならびにアミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＣＤ２８結合アーム、
（２）
アミノ酸配列：ＧＦＴＦＳＴＦＩ（配列番号３２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＳＳＮＧＧＴＩ（配列番号３４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＴＲＧＧＤＦＷＳＧＹＹＰＦＤＹ（配列番号３６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、アミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびにアミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＣＤ２８結合アーム、
（３）
アミノ酸配列：ＧＦＳＦＲＤＡＷ（配列番号４２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＲＮＫＩＤＧＧＴＴ（配列番号４４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＴＴＤＩＷＮＹＶＬＦＹＹＹＧＬＤＶ（配列番号４６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、ならびにアミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、ならびにアミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＣＤ２８結合アーム、
（４）
アミノ酸配列：ＤＤＳＩＩＳＹＹ（配列番号５２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＲＴ（配列番号５４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＡＲＶＳＥＤＳＹＹＨＹＧＭＤＶ（配列番号５６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、およびアミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、ならびにアミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＣＤ２８結合アーム。

【0016】

本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する当該多特異性（例えば、二特異性）抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、以下を含む：
（１）
配列番号２に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ２８結合アーム、
（２）
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ２８結合アーム、
（３）
配列番号４０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ２８結合アーム、
（４）
配列番号５０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ２８結合アーム。

【0017】

本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する当該多特異性（例えば、二特異性）抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、以下を含む：
（１）
配列番号２４に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＣＤ２８結合アーム、
（２）
配列番号３８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＥＧＦＲ結合アーム、ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＣＤ２８結合アーム、
（３）
配列番号４８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＥＧＦＲ結合アーム、
ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＣＤ２８結合アーム、
（４）
配列番号５８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＥＧＦＲ結合アーム、
ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＣＤ２８結合アーム。

【0018】

本発明のある実施形態では、多特異性（例えば、二特異性）抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、ＲＥＧＮ７０７５（本明細書において、ｂｓＡｂ７０７５とも呼称される）、ＲＥＧＮ６３２１（本明細書において、ｂｓＡｂ６３２１とも呼称される）、ＲＥＧＮ６３２２（本明細書において、ｂｓＡｂ６３２２とも呼称される）、ＲＥＧＮ６３２３（本明細書において、ｂｓＡｂ６３２３とも呼称される）である。他の二特異性抗体は、本明細書において、表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに記載される親ＥＧＦＲ抗体を使用して生成されてもよく、それに伴い、親ＥＧＦＲ抗体のＨＣＶＲアームの配列は、ＷＯ２０１４／００４４２７に見出される配列であってもよく、および親ＣＤ２８抗体のＨＣＶＲアミノ酸配列は、本明細書において表３に見出される配列であってもよい。任意のＥＧＦＲ ＨＣＶＲアームを、本明細書に記載されるＣＤ２８ ＨＣＶＲアームのいずれかとペア形成させてもよい。

【0019】

本発明はまた、以下を含む、上皮細胞増殖因子受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を提供するものである：（ｉ）配列番号２、２４、３０、３８、４０、４８、５０もしくは５８に記載されるアミノ酸配列もしくはそのバリアントを含む重鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域、および／または（ｉｉ）配列番号１６もしくは２８に記載されるアミノ酸配列もしくはそのバリアントを含む軽鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域。本発明のある実施形態では、抗原結合タンパク質は、多特異性（例えば二特異性）である。

【0020】

本発明はまた、（例えば、腫瘍細胞の表面上の）ＥＧＦＲポリペプチドまたはその抗原性断片、および（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞の表面上の）ＣＤ２８ポリペプチドまたはその抗原性断片に結合される、本明細書に記載される多特異性抗原結合タンパク質を提供する。

【0021】

本発明はまた、以下を含む、本明細書に記載される多特異性（例えば二特異性）抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する：当該抗原結合タンパク質の免疫グロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内に導入すること、（ｂ）当該ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で当該宿主細胞を培養すること、ならびに（ｃ）任意で、当該宿主細胞から、および／または当該宿主細胞が増殖される培地から、当該抗原結合タンパク質または免疫グロブリン鎖を単離すること。当該方法の産物である抗原結合タンパク質または免疫グロブリン鎖のいずれもが、本発明の一部である。

【0022】

本発明はまた、本発明の多特異性（例えば二特異性）抗原結合タンパク質の免疫グロブリン鎖のうちの一つ以上をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも、本発明の一部であり、ならびに本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または抗原結合タンパク質を含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）も本発明の一部である。

【0023】

本発明はまた、一つ以上の他の物質または製品と関連付けられ、任意でさらなる治療剤（例えば、ＰＤ－１阻害剤、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、プラチナ系抗癌化学療法剤のパクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、抗癌抗体もしくはその抗原結合断片であるペムブロリズマブ、ニボルマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、および／またはセミプリマブ）と関連付けられた、本発明の多特異性抗原結合タンパク質のうちの一つ以上を含む組成物またはキットも提供する。本発明の多特異性抗原結合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤、および任意でさらなる治療剤を含む医薬製剤も、本発明の一部である。

【0024】

本発明はまた、本発明の多特異性抗原結合タンパク質、組成物および／または製剤を含む、容器および注射用デバイス（例えば、シリンジ、プレ充填型シリンジ、またはオートインジェクター）も提供する。

【0025】

本発明はまた、本発明の多特異性抗原結合タンパク質、その組成物または製剤を、対象（例えば、ヒト）に投与するための方法を提供するものであり、当該方法は、当該抗原結合タンパク質、組成物または製剤を、当該対象の身体内に、例えばシリンジ、プレ充填型シリンジまたはオートインジェクターなどを用いて注入することを含む。任意選択的にさらなる治療剤（例えば、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、またはニボルマブ）も当該対象に投与される。

【0026】

本発明はまた、その必要のある対象（例えば、ヒト）において過増殖性疾患（例えば、ＥＧＦＲ発現癌）を治療または予防するための方法を提供するものであり、当該方法は、多特異性抗原結合タンパク質または組成物または製剤の有効量を、任意でさらなる治療剤（例えば、セミプリマブ、ペムブロリズマブ、またはニボルマブ）と関連付けて（例えば皮下、静脈内または筋肉内）投与することを含む。本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲ発現癌は、食道癌、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、子宮頚扁平上皮細胞癌、子宮内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、皮膚癌、頭頚部扁平上皮細胞癌、脳腫瘍、多形性膠芽腫、乳癌、胃食道癌、胃食道腺癌、前立腺癌または卵巣癌である。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1A】図１Ａ～１Ｅは、内因性ＴＳＡを伴う癌細胞株において、ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体（ＲＥＧＮ７０７５）は、ＴＳＡｘＣＤ３（ＭＵＣ１６ｘＣＤ３）によるＴＣＲ刺激の存在下で、Ｔ細胞活性化を増強することを示す。図１Ａおよび１Ｂにおいて、フローサイトメトリー解析により、ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体が、ＣＤ２８＋細胞およびＥＧＦＲ＋細胞に結合することが示される。（図１Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２８＋細胞）。

【図1B】（図１Ｂ）ＰＥＯ１細胞（ＥＧＦＲ＋細胞）。

【図1C】図１Ｃ～１Ｅにおいて、内因性ＭＵＣ１６およびＥＧＦＲを発現する癌標的細胞（卵巣癌細胞株のＰＥＯ１）、および指定される二特異性物質とともにヒトＴ細胞が９６時間培養された。（図１Ｃ）腫瘍細胞殺傷、生存細胞の割合％。

【図1D】（図１Ｄ）ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の頻度（ＣＤ２中の割合％）。

【図1E】（図１Ｅ）細胞障害性アッセイからの上清を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キットを使用して解析した。放出されたＩＦＮは、ｐｇ／ｍｌとしてプロットされている。

【図2A】図２Ａ～２Ｄは、腫瘍細胞上のＣＤ２８リガンド（ＣＤ８６）の発現が、抗ＰＤ１処置との相乗効果を発揮し、ＣＤ８依存性抗腫瘍免疫を誘導することが示される。ＭＣ３８腫瘍細胞は、ＣＤ２８のリガンドであるＣＤ８６（ＭＣ３８／ＣＤ８６）、または空ベクター対照（ＭＣ３８／ＥＶ）で形質導入された。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ６マウスは、最初にマウス１匹当たり１ｘ１０^６個の腫瘍細胞が移植され、腫瘍移植後０、３、７、１０および１４日目に、ＰＤ－１ ｍＡｂまたはｒＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を用いて５ｍｇ／ｋｇで処置された。図２Ａ。経時的な平均腫瘍体積エラーバーは、±ＳＥＭを表す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定で判定された。

【図2B】図２Ｂ。経時的な生存率（＜２０００ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスのパーセンテージ）。移植後６０日目の統計的有意性は、ログランク（マンテル－コックス）検定で判定された。

【図2C】図２Ｃ。マウスはＣＤ８枯渇抗体（ＣＤ８が枯渇される）またはアイソタイプ対照（枯渇無し）で処置された。ＣＤ８枯渇（点線）と枯渇無し（実線）で、経時的な平均腫瘍体積が示される。±ＳＥＭ。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定で判定された。

【図2D】図２Ｄ。ＭＣ３８／ＣＤ８６が移植され、ＰＤ１ ｍＡｂで処置された無腫瘍マウスの２回目の腫瘍移植（再チャレンジ）。図２Ａ～２Ｄに関し、１群当たり１０匹のマウスを用いた１回の実験からのデータが示されている。データは、少なくとも４回の別個の実験の代表値である。統計的有意性が示されている（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、および^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）．

【図3A】図３Ａおよび３Ｂは、Ａ４３１ヒト異種移植片腫瘍モデルを示す。データは、図４および図５に対応している。図３Ａは、処置前の末梢血における、ヒトＣＤ４５＋細胞の生着を示す。

【図3B】図３Ｂは、Ａ４３１のＦＡＣＳ解析を示す。各プロットに対して対象マーカーが示されている。

【図4】図４および図５は、ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）は、抗ＰＤ１（セミプリマブ）処置との相乗効果を発揮し、ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞が生着したＶＨマウスにおいて抗腫瘍免疫を誘導したことを示す。具体的には、図４および図５において、Ａ４３１類表皮癌腫の腫瘍細胞（ＡＴＣＣから取得）が、胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞が生着したＳＩＲＰＡ^ｈ／ｈ ＴＰＯ^ｈ／ｍ Ｒａｇ２^－／－ Ｉｌ２ｒｇ^－／－に皮下移植された。マウスは、胎児肝臓のドナー、ヒト免疫細胞の生着頻度および性別に基づき指定される処置群に分けられた。マウスは腹腔内（ＩＰ）処置され、腫瘍チャレンジの日に開始して実験期間中２～３日ごとに投与された。抗ＰＤ－１の投与は１０ｍｇ／ｋｇであり、ＥＧＦＲｘＣＤ２８またはＰＳＭＡｘＣＤ２８は５ｍｇ／ｋｇであった。データは、チャレンジ後の日数に対してプロットされた各処置群の平均Ａ４３１腫瘍体積（ｍｍ^３±ＳＥＭ）を示している。二元配置ＡＮＯＮＡ、テューキーの比較：^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。（１群当たりｎ＝１０～１２匹のマウス）。 図４は、ヒトＣＤ３４＋細胞が生着したＶＨマウスにおいて腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットされた、各処置群（ｍｍ^３±ＳＥＭ）（アイソタイプ、坑ＰＤ１単剤療法（セミプリマブ）、ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）単剤療法、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）＋抗ＰＤ１併用療法）の平均Ａ４３１腫瘍体積を示す。二元配置ＡＮＯＮＡ、テューキーの比較：^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図5】図５は、ヒトＣＤ３４＋細胞が生着したＶＨマウスにおいて腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットされた、対照群（ｍｍ^３±ＳＥＭ）（アイソタイプ、坑ＰＤ１単剤療法（セミプリマブ）、ＰＳＭＡｘＣＤ２８単剤療法、またはＰＳＭＡｘＣＤ２８＋抗ＰＤ１併用療法）の平均Ａ４３１腫瘍体積を示す。二元配置ＡＮＯＮＡ、テューキーの比較：^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図6】図６は、Ａ４３１腫瘍細胞上のＰＳＭＡ発現の欠落に関する検証を示す。ＭＣ３８マウス腫瘍細胞株はヒトＰＳＭＡを発現するよう操作されており、陽性対照として使用された。

【図7A】図７Ａおよび７Ｂ。予防的（図７Ａ）または治療的（図７Ｂ）な処置のいずれかを受けたＮＳＧマウスにおける、腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットされた、ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）を投与された各処置群の平均Ａ４３１腫瘍体積（ｍｍ^３±ＳＥＭ）。二元配置ＡＮＯＮＡ、テューキーの比較：^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

【図7B】同上。

【図8】図８。ＮＳＧマウスにおける、腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットされた各処置群の平均Ａ５４９腫瘍体積（ｍｍ^３±ＳＥＭ）（アイソタイプまたはＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）で１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）。二元配置ＡＮＯＮＡ、テューキーの比較：^＊アイソタイプとＥＧＦＲｘＣＤ２８の比較、１ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０５）、^＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１；＄ アイソタイプとＥＧＦＲｘＣＤ２８の比較、１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０５）、＄＄＄：Ｐ＜０．００１、＄＄＄＄：Ｐ＜０．０００１；＠ ＥＧＦＲｘＣＤ２８ １ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの比較（Ｐ＜０．０５）。

【図9A】図９Ａ～９Ｄ。ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）は、抗ＰＤ１（セミプリマブ）処置との相乗効果を発揮し、ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞が生着したＶＨマウスにおいて抗腫瘍免疫を誘導した。（図９Ａ）ＣＩＴＲＵＳ（クラスターの特定、特徴解析および回帰）解析により特定される選択腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞クラスターのＭＦＩ、（図９Ｂ）指定処置群からの各クラスターにおける細胞頻度、（図９Ｃ）ＣＩＴＲＵＳ解析により特定される選択腫瘍ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターのＭＦＩ、（図９Ｄ）指定処置群からの各クラスターにおける細胞頻度。図９Ｂおよび９Ｄは、ＥＧＦＲｘＣＤ２８は、抗ＰＤ１処置との相乗効果を発揮し、ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞が生着したＶＨマウスにおいて抗腫瘍免疫を誘導したことを実証する。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図9D】同上。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｃ。ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）の単独、または抗ＰＤ１（セミプリマブ）療法との併用は、カニクイザルにおいてＣＤ２８スーパーアゴニストと比較し、全身的なＴ細胞の活性化を誘導しない。カニクイザルは、指定用量（ｍｇ／ｋｇ）で二特異性抗体の単回投与を用いて処置された。時間は、投与後（時間）を示し、血清サイトカイン（ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＩＬ－１０）（図１０Ａ）、相対的末梢血Ｔ細胞数（図１０Ｂ）、Ｋｉ６７＋およびＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の頻度（ＣＤ３の割合％）（図１０Ｃ）である。値は、平均±ＳＥＭを表す。１群当たり動物はＮ＝３匹。Ｐ値は、アイソタイプ対照との比較で、二元配置ＡＮＯＶＡで計算された（^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１、および^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。

【図10B】同上。

【図10C】同上。

【図11】図１１は、ＰＤ－１抗体（ＲＥＧＮ２８１０、米国特許出願公開第２０１５０２０３５７９号においてＨ２Ｍ７７９８ＮまたはＨ４Ｈ７７９８Ｎと記載されている）と併用されたときに、抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗体（ＲＥＧＮ７０７５）により介在される、経時的な用量依存性の抗腫瘍応答を示している。

【図12】図１２は、ＰＤ－１抗体（ＲＥＧＮ２８１０）と併用されたときに、抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗体（ＲＥＧＮ７０７５）により介在される用量依存性の抗腫瘍応答を示している。

【図13A】図１３Ａ～１３Ｃは、ヒトＴ細胞およびカニクイザルＴ細胞、ならびにＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２８＋エフェクター細胞）を含む様々な細胞に対する（図１３Ａ）、Ａ３７５メラノーマ細胞、２２ＲＶ１前立腺癌細胞、ＰＥＯ１卵巣細胞、ＣＡＰＡＮ膵臓細胞、ＳＷ１９９０膵臓細胞、およびＨ２９２肺細胞を含む様々な他の腫瘍標的細胞に対する（図１３Ｂおよび１３Ｃ）、様々な抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗体の結合を記載する。アイソタイプ対照のＩおよびＩＩは、それぞれＭｅｒｓおよびＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体である。

【図13B】同上。

【図13C】同上。

【図14A】図１４Ａおよび１４Ｂは、抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８二特異性抗体が、抗腫瘍特異積抗原（ＴＳＡ）Ｘ抗ＣＤ３二特異性抗体の細胞障害能力を増強することを示す。当該試験には、抗ＳＴＥＡＰ２Ｘ抗ＣＤ３二特異性抗体（図１４Ａ）または抗ＰＳＭＡＸ抗ＣＤ３二特異性抗体（図１４Ｂ）のいずれかと併用された抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗体が含まれた。抗ＳＴＥＡＰ２ｘ抗ＣＤ３抗体は、ＷＯ２０１８／０５８００１Ａに記載されている。抗ＰＳＭＡｘ抗ＣＤ３抗体は、ＷＯ２０１７／０５３８５６Ａ１に記載されている。

【図14B】同上。

【図15A】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは、抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗体が、ＰＥＯ１細胞（図１５Ａ）、ＣＡＰＡＮ２細胞（図１５Ｂ）、ＳＷ１９９０細胞（図１５Ｃ）、およびＨ２９２細胞（図１５Ｄ）を含む様々な細胞株にわたり、抗腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）Ｘ抗ＣＤ３二特異性抗体（抗ＭＵＣ１６Ｘ抗ＣＤ３）の細胞障害能力を増強することを示す。

【図15B】同上。

【図15C】同上。

【図15D】同上。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明を記載する前に、本発明は、記述される特定の方法および実験条件に限定されず、そうした方法および条件は変化し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、限定することは意図されておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることをも理解されたい。

【0029】

別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関連して使用される場合、当該値が、１％以下にまで当該列挙された値から変化し得ることを意味する。例えば本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１、ならびにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

【0030】

本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、本明細書には好ましい材料および方法が記載される。本明細書に置いて言及される全ての特許、特許出願および非特許公開文献は、参照によりその全体で本明細書に援用される。

【0031】

ＰＤ－１ブロッキングｍＡｂを用いたチェックポイント阻害は、Ｔ細胞活性化のブレイクを放出することが知られているが、単剤としてのその有効性はしばしば、多くの癌において腫瘍のクリアランスや持続的な抗腫瘍応答を常に得るに不充分であった。ＰＤ－１阻害に対する奏効率を改善するためのいくつかの方法が現在評価中である。実際に、ＰＤ－１ ｍＡｂに対する応答性を予測するバイオマーカーの特定、Ｔ細胞活性化を改善する共刺激性受容体を誘導するアゴニスト性抗体、または化学療法もしくは放射線療法とともにＰＤ－１阻害を使用した非腫瘍標的化併用療法が全て現在、前臨床試験および臨床試験中である。しかし課題は、これら併用の多くが真の仮説に導かれた方法ではなく、既存の薬剤の入手し易さ、および治療法を組み合わせることの事後的な論理的根拠に基づいていることが多く、一部の症例では患者に転帰の悪化をもたらしてしまうことである。免疫システムのチェックポイント阻害および再活性化は、多くの患者において長期的な寛解の可能性をもたらすことが明白であり、Ｔ細胞の活性をさらに改善または増強して、さらに長期的な応答を促進する方法が保証される。そこで、ＰＤ－１ ｍＡｂの抗腫瘍効果を改善するために、ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体を使用してＴ細胞のシグナル伝達および活性化を増強するというコンセプトが導入された。実際に、本発明の新規併用免疫療法は、ＣＤ２８共刺激性二特異性抗体は、ＰＤ－１ ｍＡｂとの相乗効果を発揮して、安定的なＴ細胞活性化を生じさせるだけでなく、全身的な毒性を伴わずに長期的な抗腫瘍応答をもたらすことが示された。その結果として、本発明の腫瘍標的化併用療法は、過去に報告されている非標的化方法を超える大幅な利点を提供するものである。ＣＤ２８二特異性抗体を使用することで、腫瘍細胞表面上でクラスター化しない限りＣＤ２８を直接的には活性化せず、従来的なＣＤ２８活性化抗体の全身的な毒性（ＣＬＴＡ－４およびＰＤ－１の遮断または他の共刺激性のアゴニスト二価抗体の併用でしばしば観察される毒性）を回避しながら、腫瘍部位でのみ共刺激を促進する可能性がもたらされた。遺伝子操作によりヒト化された正常免疫能マウス、ならびにカニクイザルにおける毒性試験により、これら二特異性物質は、単剤としての毒性は示さず、さらにＰＤ－１ ｍＡｂとの併用でも毒性は示さなかった。同系モデルおよび異種モデルにわたる、ＥＧＦＲｘＣＤ２８と抗ＰＤ－１ ｍＡｂによる同様の抗腫瘍効果の強化とともに、安全性プロファイルからも当該治療モダリティが安定的であり、腫瘍モデルに特異的であるとは限定されず、免疫療法の新規併用法として広範な有用性を有し得ることが示唆された。

【0032】

腫瘍細胞のＴ細胞介在性殺傷を強化するために、腫瘍標的化法が開発されている。実際に、ＣＤ３を基にした二特異性抗体は、Ｔ細胞と腫瘍細胞を連結させてＴＣＲ／ＣＤ３を活性化し、それに伴い正常な「シグナル１」を模倣することによりＴ細胞の活性化を効率的に誘発することができる新興抗体となっている。しかし、有望な臨床効果があるにもかかわらず、ＣＤ３－二特異性物質は、Ｔ細胞活性化を誘導するが、腫瘍のみという特異性が無いために、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）との関連性がある可能性がある。さらに、共刺激（シグナル２）の非存在下でのＴＣＲ／ＣＤ３活性化は、これら試薬の潜在的な抗腫瘍効果を限定し得る、または減少させ得るアネルギーまたは活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を生じさせる可能性がある。そこで本明細書において、ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性物質と抗ＰＤ－１ ｍＡｂの併用療法が、腫瘍特異的なＴ細胞活性化を誘導したことを最初に実証する。本明細書において示されるように、ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体は、「シグナル１」の非存在下では、限定的な活性であり、または活性がなく、そしてＰＤ－１遮断は、腫瘍ペプチドに対する内因性の抗原特異的Ｔ細胞応答に依存する。したがってＣＤ２８－二特異性物質は、ＰＤ－１遮断とともに、長期的な抗腫瘍応答を誘導する内因性ＴＣＲ／ＣＤ３依存性Ｔ細胞応答をブーストすることができる。

【0033】

ＰＤ－１ ｍＡｂの抗腫瘍活性はＣＤ２８依存性であり、Ｔ細胞活性化のＰＤ－１阻害は、ＴＣＲ／ＣＤ３および／またはＣＤ２８を介したシグナル伝達を減少させ、これら分子の空間的な局在に影響を与え得る。本明細書のデータは、ＰＤ－Ｌ１が標的細胞により発現されたときにＰＤ－１が免疫シナプスに蓄積すること、および当該蓄積が当該シナプスでのＣＤ２８の減少と関連することを実証しており、このことからＰＤ－１は、シナプスへのＣＤ２８の局在を妨害することによりＴ細胞阻害を行っている可能性が示唆される。さらにＰＤ－１遮断がＰＤ－１のシナプス局在を妨害し、それと同時にシナプスでのＣＤ２８の蓄積が増加していたことが判明した。このことから、ＰＤ－１ ｍＡｂがＴ細胞活性化を促進する能力をＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性物質が大幅に強化することが可能となる。このメカニズムは、ＰＤ－１ブロッキング抗体がＴ細胞活性化を促進するメカニズムの１つであり得る。全体として、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用および／またはＰＤ－１阻害の後の免疫シナプスでのＰＤ－１およびＣＤ２８の局在の視覚化を行うことにより、Ｔ細胞活性化に対するＰＤ－１遮断の効果、ならびに免疫シナプスレベルでのＥＧＦＲｘＣＤ２８とＰＤ－１ ｍＡｂの相乗効果に関する理解が進み得る。

【0034】

ＰＤ－１ ｍＡｂは、重要な新規免疫療法であるが、多くの症例で抗腫瘍活性のさらなる最適化が必要なことは確実である。ＣＡＲ－Ｔ法が、「シグナル１」と「シグナル２」の両方を人工的に活性化するキメラ受容体を採用して抗腫瘍活性を改善したのと同様に、本明細書において、抗腫瘍活性を強化するためにＰＤ－１阻害とＣＤ２８－二特異性物質（「シグナル２」を提供する）を組み合わせることの潜在的な利益について示す。当該方法は、各患者に対して個々にカスタマイズしなければならない多大な労力を要する細胞療法用の準備を必要とせず、さらには毒性のある化学療法で患者を先制的に「リンパ球枯渇」させること（しばしば有害な作用と関連付けられ、それゆえ患者が細胞療法を受け入れられない）も必要ないという点で、ＣＡＲ－Ｔ療法と比較していくつかの実益がある。当該二特異性物質によるアプローチは、作用の特異性を通じて、有効性の上昇ならびに安全性の上昇の可能性をもたらす。まとめると、本明細書のデータから、ＣＤ２８を基にした二特異性物質と、臨床的に実証された例えばセミプリマブなどのＰＤ－１ ｍＡｂとの併用は、大幅に増強され、相乗効果的な抗腫瘍活性を有する忍容性良好な生物製剤的解決法を提供し得ることが示される。

【0035】

定義
「ＥＧＦＲ」および「ＥＧＦＲ断片」とは本明細書において使用される場合、非ヒト種由来であることが特定されていない限り（例えば、「マウスＥＧＦＲ」、「マウスＥＧＦＲ断片」、「サルＥＧＦＲ」、「サルＥＧＦＲ断片」など）、公知のヒトのＥＧＦＲタンパク質またはその断片を指す。本発明のある実施形態では、ヒトＥＧＦＲは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９．２に記載されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ヒトＥＧＦＲ（アクセッション番号００５２２８．４のアミノ酸Ｌ２５－Ａ６４７）は、Ｃ末端のＣＰＧＧ．ｍｙｃエピトープ（Ｅ１－Ｌ１０）．ＧｌｙＧｌｙ．ｍｙｃエピトープ（Ｅ１－Ｌ１０）．ＳｅｒＧｌｙ．６ＸＨｉｓ．ＳＳＧタグ（配列番号６９）とともに示されている。

【0036】

本明細書において使用される場合、「ＣＤ２８」とは、非ヒト種由来であることが特定されていない限り、共刺激性受容体としてＴ細胞上に発現される公知のヒトＣＤ２８タンパク質を指す。本発明のある実施形態では、ヒトＣＤ２８は、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0037】

「単離された」抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターは、それらが生成される細胞または細胞培養物に由来する他の生物学的分子を少なくとも部分的に含まない。そのような生物学的分子としては核酸、タンパク質、他の抗体もしくはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、または例えば細胞残渣や増殖培地などの他の物質が挙げられる。単離された抗原結合タンパク質はさらに、例えば宿主細胞に由来する生物学的分子やその増殖培地の生物学的分子などの発現システムの構成要素を少なくとも部分的に含まなくてもよい。概して、「単離された」という用語は、そのような生物学的分子が完全に存在しないこと、または水、緩衝剤もしくは塩が存在しないこと、または抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）を含む医薬製剤の構成要素が存在しないことを指すことは意図されない。

【0038】

以下の参照文献は、配列解析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（２０）：５１０１－５１０９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０；アライメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５－３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．’’Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３－３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００；アライメント統計：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７）ｐｐ．１－１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．。

【0039】

本発明は、配列番号６、８、１０、１２、１４、２４、３４、３６、３８、４４、４６、４８、５４、５６および／または５８に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0040】

「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）を含む、免疫グロブリン分子である。各重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと省略される）と重鎖定常領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）とを含む。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３の三つのドメインを含む。各軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと省略される）と軽鎖定常領域（例えば、ラムダまたはカッパ）とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域はさらにフレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられたより保存的な領域と、その間に配置された相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域に分けられ得る。Ｖ_ＨとＶ_Ｌはそれぞれ３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲと呼称される場合もあり、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲと呼称される場合もある。本発明の異なる実施形態において、抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒトの生殖細胞系列の配列と同一であってもよく、または自然に、もしくは人為的に修飾されていてもよい。

【0041】

Ｙ型ＩｇＧ抗体の抗原結合アーム（例えば、ＣＤ２８結合アームまたはＥＧＦＲ結合アーム）とは、抗原に対する結合特異性を与える抗体の構造部分を指す。例えばＩｇＧ抗体の抗原結合アームは、軽鎖（ＬＣ）と関連付けられた重鎖（ＨＣ）を有する。

【0042】

例えば二特異性である抗体は、第一の抗原に結合するアームと、第二の抗原に結合する別のアームを含む。例えば、ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体は、ＥＧＦＲに結合する１つのアームと、ＣＤ２８に結合する別のアームを含む。

【0043】

二特異性抗原結合分子（例えば二特異性抗体）は、第一の抗原に結合するエフェクターアームと、第二の抗原に結合する標的化アームを有してもよい。エフェクターアームは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ２８）であってもよい。標的化アームは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の抗原に結合する第二の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）であってもよい。ある例示的な実施形態によると、エフェクターアームは、ＣＤ２８に結合し、標的化アームは、ＥＧＦＲに結合する。

【0044】

抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などは、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいずれか天然の、酵素処理により取得可能な、合成の、もしくは遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の多特異性抗原結合断片は、複数の抗原に結合する（例えば、断片が二特異性である場合には二つの異なる抗原に結合する）。抗体の抗原結合断片は、例えばタンパク質消化、または抗体の可変ドメインおよび（任意で）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作と発現を含む遺伝子組み換え操作法などの任意の適切な標準的技術を使用して完全抗体分子から誘導されてもよい。抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、および（ｖｉ）ｄＡｂ断片が挙げられる。

【0045】

抗体の抗原結合断片は、本発明のある実施形態では、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、概して一つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、または一つ以上のフレームワーク配列とともにフレーム中に存在する少なくとも一つのＣＤＲを含む。Ｖ_Ｌドメインと関連付けられたＶ_Ｈドメインを有する抗原結合断片において、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であってもよく、およびＶ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌの二量体を含有してもよい。あるいは抗体の抗原結合断片は、単量体のＶ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインを含有してもよい。

【0046】

ある実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有してもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に存在し得る可変ドメインと定常ドメインの非限定的な構成例としては：（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３；（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ；（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２；（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが挙げられる。上記の構成例のいずれかを含む、可変ドメインと定常ドメインの任意の構成において、可変ドメインと定常ドメインは互いに直接結合されてもよく、または完全もしくは部分的なヒンジまたはリンカー領域により結合されてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上）のアミノ酸からなる領域であってもよく、このヒンジ領域により単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間にフレキシブルな、またはセミフレキシブルな結合が生じる。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、（例えば、ジスルフィド結合により）互いに非共有結合された、および／または一つ以上の単量体Ｖ_ＨドメインもしくはＶ_Ｌドメインと非共有結合された、上記に列挙される可変ドメイン構成および定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。

【0047】

例えば抗体またはその抗原結合断片などの「組み換え」抗原結合タンパク質という用語は、例えばＤＮＡのスプライシングおよびトランスジェニック発現などを含む組み換えＤＮＡ技術として当分野に公知の技術もしくは方法により生成され、発現され、単離され、または取得される分子を指す。当該用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えばトランスジェニックマウスを含む）、または宿主細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、または細胞発現系で発現された抗体、または組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を含む。本発明は、本明細書に記載される組み換え抗原結合タンパク質を含む。

【0048】

「特異的結合する」または「特異的に結合する」という用語は、例えば、ＥＧＦＲまたはＣＤ２８タンパク質などの抗原に対し、例えば２５℃または３７℃で、例えばＯｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーなどのリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉分光アッセイ、または例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）などの表面プラズモン共鳴、または溶液－アフィニティＥＬＩＳＡにより測定されたときに、約１０^－６Ｍ（例えば、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、または１０^－１２Ｍ）未満の、Ｋ_Ｄとして表される結合アフィニティを有する抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）を指す。「抗ＥＧＦＲ」とは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質（または例えば抗原結合アームなどの他の分子）を指す。「抗ＣＤ２８」とは、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質（または例えば抗原結合アームなどの他の分子）を指す。「ＥＧＦＲｘＣＤ２８」とは、ＥＧＦＲとＣＤ２８（および任意で一つ以上の他の抗原）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質（または他の分子）を指す。

【0049】

本発明は、本発明の抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ７０７５（本明細書においてｂｓＡｂ７０７５とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２１（本明細書においてｂｓＡｂ６３２１とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２２（本明細書においてｂｓＡｂ６３２２とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２３（本明細書においてｂｓＡｂ６３２３とも呼称される）と同じＥＧＦＲエピトープおよびＣＤ２８エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片などの抗原結合タンパク質を含む。他の抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗原結合タンパク質は、表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに見出され得る。本明細書に記載される二特異性抗体のＥＧＦＲ ＨＣＶＲアームのアミノ酸配列は、表１に見出され、本明細書に記載される二特異性抗体のＣＤ２８ ＨＣＶＲアームのアミノ酸配列は、表３に見出され得る。本発明における使用のための他のＥＧＦＲ親抗体は、ＷＯ２０１４／００４４２７に記載される。ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、およびＲＥＧＮ６３２３のＥＧＦＲ ＨＣＶＲアームおよびＣＤ２８ ＨＣＶＲアームのアミノ酸配列は、表６に見出される。本発明に記載される共通軽鎖可変領域のアミノ酸配列も、表６に見出される。

【0050】

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域など、抗原結合タンパク質の特異的抗原結合部位と相互作用する（例えば、ＥＧＦＲまたはＣＤ２８上の）抗原性決定基を指す。一つの抗原が、複数のエピトープを有する場合もある。したがって、異なる抗体が、抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物効果を有する場合もある。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す場合もあり、ならびに／または抗体により結合される抗原の領域を指す場合もある。エピトープは構造的または機能的に定義される場合もある。機能的エピトープは概して構造的エピトープのサブセットであり、相互作用のアフィニティに直接的に寄与する残基を有する。エピトープは線形構造または立体構造であってもよい。すなわち、非線形状のアミノ酸から構成されてもよい。ある実施形態では、エピトープは、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面集団である決定基を含んでもよく、ある実施形態では、エピトープは、特定の三次元構造特性および／または特定の荷電特性を有してもよい。

【0051】

例えば抗体または断片またはポリペプチドなどの抗原結合タンパク質のエピトープの決定方法としては、アラニンスキャニング突然変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド開裂解析、結晶学的試験、およびＮＭＲ解析が挙げられる。さらに、例えば抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を採用してもよい（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗原結合タンパク質（例えば抗体または断片またはポリペプチド）と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するために使用され得るもう１つの方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換である。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。

【0052】

本発明は、ＣＤ２８およびＥＧＦＲへの結合に関し、本発明の抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ７０７５（本明細書においてｂｓＡｂ７０７５とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２１（本明細書においてｂｓＡｂ６３２１とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２２（本明細書においてｂｓＡｂ６３２２とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２３（本明細書においてｂｓＡｂ６３２３とも呼称される）ならびに表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに記載されるものと競合する抗原結合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「競合する」という用語は、抗原に結合し、別の抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）が当該抗原に結合することを阻害または妨害する抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）を指す。別段の記載が無い限り、当該用語はまた、例えば抗体などの２つの抗原結合タンパク質の間の両方向性における競合も含む。すなわち第一の抗体が抗原に結合し、第二の抗体による結合を妨害する。その逆も然り。したがって本発明のある実施形態では、競合は、そのような方向の一つで発生する。ある実施形態では、第一の抗原結合タンパク質（例えば抗体）と第二の抗原結合タンパク質（例えば抗体）は、同じエピトープに結合し得る。あるいは第一および第二の抗原結合タンパク質（例えば抗体）は、異なるが、しかし例えば重複するエピトープまたは重複しないエピトープに結合する場合もあり、この場合において、一方の結合が、例えば立体障害を介して第二の抗体の結合を阻害または妨害する。抗原結合タンパク質（例えば抗体）の間の競合は、例えばリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉分光アッセイなど、当分野に公知の方法により測定され得る。または抗原結合タンパク質（例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ））の間の結合競合は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４バイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）でのリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉分光アッセイを使用して決定することができる。

【0053】

典型的には、何等かの方法で改変された本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＥＧＦＲおよびＣＤ２８に対する特異的結合の能力を保持している。例えば、活性がモルベースで表される場合、（親抗体と比較して）ＥＧＦＲおよびＣＤ２８の結合活性を少なくとも１０％保持している。好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、親抗体のＥＧＦＲおよびＣＤ２８の結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％以上を保持している。また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、その生物活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的バリアント」または「機能保存的バリアント」と呼称される）を含み得ることも意図される。

【0054】

例えば免疫グロブリン鎖（例えば、本明細書に具体的に記載されるアミノ酸配列を含む、ＲＥＧＮ７０７５（本明細書においてｂｓＡｂ７０７５とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２１（本明細書においてｂｓＡｂ６３２１とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２２（本明細書においてｂｓＡｂ６３２２とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２３（本明細書においてｂｓＡｂ６３２３とも呼称される）のＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＨＣもしくはＬＣ、またはそのＣＤＲ）などのポリペプチドの「バリアント」とは、本明細書に記載される参照アミノ酸配列（例えば、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８－６７のいずれか）に対して、比較がＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われ、当該アルゴリズムのパラメーターが、各参照配列の全長での各配列間の最も大きな合致を与えるよう選択される場合（例えば、予測閾値：１０、ワードサイズ：３、クエリ範囲における最大合致：０、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス；ギャップコスト：実在１１、伸長１、条件付き組成スコアマトリクス調整）、少なくとも約７０～９９．９％（例えば、少なくとも７０、７２、７４、７５、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５または９９．９％）同一であるか、類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。

【0055】

さらにポリペプチドのバリアントは、そのアミノ酸配列が本明細書に具体的に記載されているが、一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の変異、例えば一つ以上のミスセンス変異（例えば保存的置換）、非センス変異、欠失または挿入に関しては記載されていない参照ポリペプチドのアミノ酸配列も含み得る、免疫グロブリン鎖（例えば、ＲＥＧＮ７０７５（本明細書においてｂｓＡｂ７０７５とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２１（本明細書においてｂｓＡｂ６３２１とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２２（本明細書においてｂｓＡｂ６３２２とも呼称される）；ＲＥＧＮ６３２３（本明細書においてｂｓＡｂ６３２３とも呼称される）のＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＨＣもしくはＬＣ、またはそのＣＤＲ）などのポリペプチドを含み得る。例えば本発明は、配列番号１６に記載されているが、そのような変異を一つ以上有するアミノ酸配列を含むＥＧＦＲ結合アームの免疫グロブリン軽鎖（またはＶ_Ｌ）バリアント、および／または配列番号２に記載されているが、そのような変異を一つ以上有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖（またはＶ_Ｈ）バリアントを含むＣＤ２８ｘＥＧＦＲ抗原結合タンパク質を含む。本発明のある実施形態では、ＣＤ２８ｘＥＧＦＲ抗原結合タンパク質は、当該ＣＤＲのうちの一つ以上（例えば、１、または２、または３）が、そのような変異（例えば保存的置換）のうちの一つ以上を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖バリアント、および／または当該ＣＤＲのうちの一つ以上（例えば、１、または２、または３）が、そのような変異（例えば保存的置換）のうちの一つ以上を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖バリアント、を含む。

【0056】

例えば本明細書に記載される免疫グロブリン鎖の「保存的改変バリアント」または「保存的置換」とは、ポリペプチド中に、類似した特性（例えば電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、骨格構造および剛性など）を有する他のアミノ酸とのアミノ酸の置換が一つ以上存在するバリアントを指す。そのような変化はしばしば、当該抗体または断片の生物活性を大きく損なうことなく発生し得る。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の単一アミノ酸の置換は概して、生物活性を大きくは変化させないと認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（第４版）を参照のこと）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を大きく損なう可能性は低い。本発明は、そのような保存的に改変されたバリアント免疫グロブリン鎖を含むＥＧＦＲｘＣＤ２８ならびに抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質および／または結合アームを含む。

【0057】

類似の化学特性を伴う側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－４５に開示されるＰＡＭ２５０ ｌｏｇ－尤度マトリクスにおいて正の値を有する任意の変化である。

【0058】

抗原結合分子
本発明の抗体は、一特異性、二特異性または多特異性であってもよい。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよく、または複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えば、Ｔｕｔｔ
ｅｔ ａＩ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照のこと。本発明の抗ＣＤ２８抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質と連結されることができ、または共発現されることができる。例えば、抗体またはその断片は、例えば別の抗体または抗体断片などの、一つ以上の他の分子実体に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合または別手段により）機能的に連結されて、第二の結合特異性を有する二特異性抗体、または多特異性抗体を生成することができる。

【0059】

本明細書において「抗ＣＤ２８抗体」という表現の使用は、一特異性抗ＣＤ２８抗体、ならびにＣＤ２８結合アームと標的抗原に結合する第二のアームを含む多特異性（例えば二特異性）抗体の両方を含むことが意図される。したがって本発明は、免疫グロブリンの一つのアームがヒトＣＤ２８に結合し、当該免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に特異的である、二特異性抗体を含む。ＣＤ２８二特異性抗体の他方のアームが結合する標的抗原は、標的化免疫応答が望ましい細胞、組織、器官、微生物またはウイルス上に発現される、またはそれらの近くで発現される任意の抗原であり得る。ＣＤ２８結合アームは、本明細書の表３および８に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかを含み得る。ある実施形態では、ＣＤ２８結合アームは、ヒトＣＤ２８に結合し、ヒトＴ細胞の増殖を誘導する。

【0060】

抗体の一つのアームがＣＤ２８に結合し、他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二特異性抗体の場合において、標的抗原は、例えばＥＧＦＲなどの腫瘍関連抗原であり得る。

【0061】

ある例示的実施形態によると、本発明は、ＣＤ２８とＥＧＦＲに特異的に結合する二特異性抗原結合分子を含む。そのような分子は本明細書において、例えば、「抗ＣＤ２８／抗ＥＧＦＲ」、または「抗ＣＤ２８ｘＥＧＦＲ」、または「ＣＤ２８ｘＥＧＦＲ」、または「ＥＧＦＲＸＣＤ２８」、または「抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ２８」、または「抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８」、または「ＥＧＦＲｘＣＤ２８」二特異性分子、または「抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８」、または「抗ＣＤ２８Ｘ抗ＥＧＦＲ」、または他の類似した用語として呼称される場合がある。

【0062】

ある例示的実施形態によると、二特異性抗原結合分子（例えば、二特異性抗体）は、エフェクターアームと標的化アームを有する場合がある。エフェクターアームは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原に結合する第一の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ２８抗体）であり得る。標的化アームは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の抗原に結合する第二の抗原結合ドメイン（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）であり得る。ある例示的な実施形態によると、エフェクターアームは、ＣＤ２８に結合し、標的化アームは、ＥＧＦＲに結合する。二特異性抗ＣＤ２８／ＥＧＦＲは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に共刺激性シグナルを送り得る。

【0063】

本明細書において使用される場合、「抗原結合分子」という表現は、単独で、または一つ以上の追加のＣＤＲおよび／もしくはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わされて特定の抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも一つ含む、もしくはそれからなるタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体を意味する。ある実施形態では、抗原結合分子は、抗体または抗体の断片であり、それら用語は本明細書において別段に規定される。

【0064】

本明細書において使用される場合、「二特異性抗原結合分子」という表現は、少なくとも第一の抗原結合ドメインと、第二の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体（例えば抗体またはその抗原結合断片）を意味する。二特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または一つ以上の追加のＣＤＲおよび／またはＦＲと組み合わされて、特定の抗原に特異的に結合するＣＤＲを少なくとも一つ含む。本発明の場合において、第一の抗原結合ドメインは、第一の抗原（例えば、ＣＤ２８）に特異的に結合し、第二の抗原結合ドメインは、第二の明白に異なる抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に特異的に結合する。

【0065】

本発明のある例示的実施形態では、二特異性抗原結合分子は、二特異性抗体である。二特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。

【0066】

第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインは、直接または間接的に互いに結合されて、本発明の二特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインはそれぞれ、別個の多量体化ドメインに結合され得る。一つの多量体化ドメインを、別の多量体化ドメインに関連付けることで、二つの抗原結合ドメインの間の関連付けが促進され、それにより二特異性抗原結合分子が形成される。本明細書において使用される場合、「多量体化ドメイン」は、同じもしくは類似した構造または構成の第二の多量体化ドメインと関連付けられる能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化の構成要素の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含む）、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択されるＩｇＧのＦｃドメインである。

【0067】

本発明の二特異性抗原結合分子は、典型的には二つの多量体化ドメイン、例えば二つのＦｃドメインを含み、当該Ｆｃドメインはそれぞれ個々に、別個の抗体重鎖部分である。第一および第二の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４など、同じＩｇＧアイソタイプのドメインであってもよい。あるいは第一および第二の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４など、異なるＩｇＧアイソタイプのドメインであってもよい。

【0068】

ある実施形態では、多量体化ドメインは、少なくとも一つのシステイン残基を含む、１～約２００アミノ酸の長さのＦｃ断片またはアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。その他の多量体化ドメインとしては、ロイシンジッパー、ヘリックス－ループモチーフもしくはコイルドコイルモチーフを含む、またはそれからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。

【0069】

任意の二特異性抗体の形式または技術を使用して、本発明の二特異性抗原結合分子を作製してもよい。例えば、第一の抗原結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片は、例えば第二の抗原結合特異性を有する別の抗体または抗体断片などの、一つ以上の他の分子実体に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合、または別手段により）機能的に連結されて、二特異性抗原結合分子を形成することができる。本発明に関して使用することのできる具体的な二特異性のフォーマットの例としては、非限定的に例えば、ｓｃＦｖ系二特異性フォーマットまたはダイアボディ二特異性のフォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＯＶＯ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＯ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｏｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＯＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ^２二特異性フォーマットが挙げられる（例えば、前述のフォーマットの概要に関し、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１および当該文献中に引用される参照文献を参照のこと）。

【0070】

本発明の二特異性抗原結合分子の場合において、例えばＦｃドメインなどの多量体化ドメインは、野生型、天然型のＦｃドメインと比較して、一つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎの間の結合相互作用が改変された（例えば強化された、または減弱された）改変Ｆｃドメインを生じさせるような改変をＦｃドメイン中に一つ以上含む二特異性抗原結合分子を含む。一つの実施形態では、二特異性抗原結合分子は、Ｃ_Ｈ２領域またはＣ_Ｈ３領域中に改変を含み、この場合において当該改変は、酸性環境下（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソーム）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインのアフィニティを増加させるものである。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、２５０位の改変（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位の改変（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位の改変（例えば、ＬＮ／ＦＩＷまたはＴ）、２５４位の改変（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位の改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／ＥＩＤまたはＴ）、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、ＵＲ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＶ）での改変、または２５０位および／もしくは４２８位での改変、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位での改変が挙げられる。一つの実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変、４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９１）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

【0071】

本発明はまた、第一のＣ_Ｈ３ドメインと第二のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインを含む二特異性抗原結合分子も含み、この場合において当該第一および第二のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸によって互いに異なり、そしてこの場合において、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、当該アミノ酸の差異を欠く二特異性抗体と比較して、二特異性抗体のタンパク質Ａへの結合を低下させる。一つの実施形態では、第一のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインはプロテインＡに結合し、第二のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）修飾などのプロテインＡ結合を減少または消失させる突然変異を含有する。第二のＣ_Ｈ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。第二のＣＨ３内に存在し得るさらなる改変としては、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合には、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合には、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合には、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。

【0072】

ある実施形態では、Ｆｃドメインは、複数の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を含むキメラであってもよい。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４のＣ_Ｈ２領域から誘導されたＣ_Ｈ２配列の一部または全てと、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４から誘導されたＣ_Ｈ３配列の一部または全てを含んでもよい。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域も含有してもよい。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から誘導された「下部ヒンジ」配列と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から誘導された「上部ヒンジ」配列を含み得る。本明細書に記載される抗原結合分子のいずれかに含有され得るキメラＦｃドメインの特定の例には、Ｎ末端からＣ末端に向けて、以下を含む：［ＩｇＧ４ Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ Ｃ_Ｈ３］。本明細書に記載される抗原結合分子のいずれかに含有され得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、以下を含む：［ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４
Ｃ_Ｈ２］－［ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ３］。本発明の抗原結合分子のいずれかに含有され得るキメラＦｃドメインのこれらの例、および他の例は、ＷＯ２０１４／０２２５４０ Ａ１に記載されている。これら一般構造配置を有するキメラＦｃドメイン、およびそのバリアントは、Ｆｃ受容体結合が変化している可能性があり、これはつまりＦｃのエフェクター機能に影響を与える。

【0073】

本発明の抗体および抗原結合断片は、本明細書に具体的に記載されるアミノ酸配列（およびそのバリアント）を含む免疫グロブリン鎖ならびに当該抗体または断片に対する細胞性改変またはインビトロでの翻訳後改変を含む。例えば本発明は、本明細書に記載される重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列を含む、ＥＧＦＲとＣＤ２８に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびに一つ以上のアスパラギン残基、セリン残基および／もしくはスレオニン残基がグリコシル化し、一つ以上のアスパラギン残基が脱アミド化し、一つ以上の残基（例えば、Ｍｅｔ、Ｔｒｐおよび／またはＨｉｓ）が酸化し、Ｎ末端グルタミンがピログルタミン酸塩（ｐｙｒｏＥ）であり、ならびに／またはＣ末端リシンもしくは他のアミノ酸が失われている抗体および断片を含む。

【0074】

上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合分子および抗ＥＧＦＲ抗原結合アーム
本発明は、一つ以上のＥＧＦＲ結合アームならびに一つ以上のＣＤ２８結合アームを含む、例えば抗体または抗原結合断片などの多特異性（例えば二特異性）抗原結合タンパク質を含む。

【0075】

ＥＧＦＲ結合アームは、タンパク質にＥＧＦＲ結合能を与える多特異性抗原結合タンパク質の部分である。本発明のある実施形態では、二特異性抗体ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、またはＲＥＧＮ６３２３のＥＧＦＲ結合アームは、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を妨害し、本発明の別の実施形態では、ＥＧＦＲ結合アームは、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を妨害しない。例えば、Ｙ型ＩｇＧ抗体のＥＧＦＲ結合アームとは、ＥＧＦＲに対する結合特異性を与える抗体の構造部分を指す。例えば、本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲ結合アームは、ＥＧＦＲに特異的に結合するＨＣＤＲ１、ＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３；ＨＣＶＲ（Ｖ_Ｈ）およびＬＣＶＲ（Ｖ_Ｌ）ならびに／またはＨＣおよびＬＣを含む。

【0076】

本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲ結合アームは、重鎖ＣＤＲの組み合わせ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含むＶ_Ｈを含む重鎖免疫グロブリン、および軽鎖ＣＤＲの組み合わせ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含むＶ_Ｌを含む対応する軽鎖免疫グロブリンを含み、それらは本明細書に記載され、または国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／００４４２７に記載されている。

【0077】

「０８５Ｎ」、「０８６Ｎ」、「０８９Ｎ」、「１０２Ｎ」、「１０３Ｎ」、「１１６Ｎ」、「１３４Ｐ」、「１３６Ｐ」、「１４１Ｐ」、「１４２Ｐ」、「１４３Ｐ」、「１４４Ｐ」、「１４５Ｐ」、「１４７Ｐ」、「１５１Ｐ」、「１５３Ｐ」、「１５５Ｐ」、「１５７Ｐ」、「１５８Ｐ」、「１５９Ｐ」、「１６１Ｐ」、「１６３Ｐ」、「１６９Ｐ」および「１７１Ｐ」とは、ＷＯ２０１４／００４４２７に記載されるいくつかの抗ＥＧＦＲ一特異性抗体の識別番号を指す。これら抗体のＨＣＶＲアームを使用して、表３に記載されるＨＣＶＲアミノ酸配列と、表６に記載されるアミノ酸配列を有する共通軽鎖を有する抗ＣＤ２８アームを組み合わせて、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞とＣＤ２８を発現するＴ細胞を標的とする二特異性抗体を作製してもよい。「ＲＥＧＮ７０７５」、「ＲＥＧＮ６３２１」、「ＲＥＧＮ６３２２」または「ＲＥＧＮ６３２３」はそれぞれ、「ｂｓＡｂ７０７５」、「ｂｓＡｂ６３２１」、「ｂｓＡｂ６３２２」または「ｂｓＡｂ６３２３」とも呼称され、表１、６および８に記載される免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）または全長重鎖（またはそのバリアント）、ならびに表１、６および８に記載される対応する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）または全長軽鎖（またはそのバリアント）とを含むＥＧＦＲ結合アームを含む二特異性抗体、またはそのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１（またはそのバリアント）、ＨＣＤＲ２（またはそのバリアント）、およびＨＣＤＲ３（またはそのバリアント））を含むＶ_Ｈ、ならびにそのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１（またはそのバリアント）、ＬＣＤＲ２（またはそのバリアント）およびＬＣＤＲ３（またはそのバリアント））を含む対応するＶ_Ｌとを含むＥＧＦＲ結合アームを含む二特異性抗体を指し、例えばこの場合において可変領域および／またはＣＤＲは、本明細書に記載される特定のアミノ酸配列を含み、バリアントではない。かかるＶ_Ｈは、ＣＤＲ－Ｈはバリアントではないバリアントアミノ酸配列を含む場合もあり、および／またはかかるＶ_Ｌは、ＣＤＲ－Ｌはバリアントではないバリアントアミノ酸配列を含む場合もある。かかるＥＧＦＲ結合アームは、ＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗原結合タンパク質を背景において呼称されてもよく、例えば０８５Ｎｘ１４２２６Ｐ２と呼称される場合がある。本発明のある実施形態では、Ｖ_Ｈは、ＩｇＧ重鎖定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４（例えば、Ｓ２２８Ｐ変異を含む））に連結され、および／またはＶ_Ｌは、ラムダまたはカッパ軽鎖定常ドメインに連結される。

【0078】

本発明はまた、ＥＧＦＲタンパク質またはその抗原性断片（例えば、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン）に特異的に結合する、例えば抗体（例えばヒト抗体、モノクローナル抗体および組み換え抗体）などの抗原結合タンパク質およびその抗原結合断片も提供する。本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかと同じＥＧＦＲ上のエピトープ、またはそれらとＥＧＦＲへの結合に関して競合する抗原結合タンパク質も、本発明の一部である。

【0079】

本発明の抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合断片としては、本明細書に記載される、またはＷＯ２０１４／００４４２７に記載される、０８５Ｎ、０８６Ｎ、０８９Ｎ、１０２Ｎ、１０３Ｎ、１１６Ｎ、１３４Ｐ、１３６Ｐ、１４１Ｐ、１４２Ｐ、１４３Ｐ、１４４Ｐ、１４５Ｐ、１４７Ｐ、１５１Ｐ、１５３Ｐ、１５５Ｐ、１５７Ｐ、１５８Ｐ、１５９Ｐ、１６１Ｐ、１６３Ｐ、１６９Ｐ、１７１Ｐ、ｍＡｂ１２９９９Ｐ２、ｍＡｂ１３００８Ｐ２、ｍＡｂ３５１９３Ｐ２、ｍＡｂ１３００６Ｐ２、ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、もしくはＲＥＧＮ６３２３のＥＧＦＲ結合アーム（またはそのバリアント）のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、Ｖ_Ｈまたは全長免疫グロブリン配列、および／または本明細書に記載される、またはＷＯ２０１４／００４４２７に記載される、０８５Ｎ、０８６Ｎ、０８９Ｎ、１０２Ｎ、１０３Ｎ、１１６Ｎ、１３４Ｐ、１３６Ｐ、１４１Ｐ、１４２Ｐ、１４３Ｐ、１４４Ｐ、１４５Ｐ、１４７Ｐ、１５１Ｐ、１５３Ｐ、１５５Ｐ、１５７Ｐ、１５８Ｐ、１５９Ｐ、１６１Ｐ、１６３Ｐ、１６９Ｐ、１７１Ｐ、ｍＡｂ１２９９９Ｐ２、ｍＡｂ１３００８Ｐ２、ｍＡｂ３５１９３Ｐ２、ｍＡｂ１３００６Ｐ２、ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、もしくはＲＥＧＮ６３２３のＥＧＦＲ結合アーム（またはそのバリアント）のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）、Ｖ_Ｌまたは全長免疫グロブリン配列を含むものも挙げられる。

【0080】

「ＲＥＧＮ７０７５」、「ＲＥＧＮ６３２１」、「ＲＥＧＮ６３２２」または「ＲＥＧＮ６３２３」は、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）または全長重鎖（またはそのバリアント）、および本明細書に記載される対応する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）または全長軽鎖（またはそのバリアント）を含む抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合断片（例えば、一特異性抗体および断片）を指す場合もあり、またはそのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１（またはそのバリアント）、ＨＣＤＲ２（またはそのバリアント）、およびＨＣＤＲ３（またはそのバリアント））を含むＶ_Ｈ、ならびにそのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１（またはそのバリアント）、ＬＣＤＲ２（またはそのバリアント）およびＬＣＤＲ３（またはそのバリアント））を含む対応するＶ_Ｌとを含む抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合断片（例えば、一特異性抗体および断片）を指す場合もあり、例えばこの場合において可変領域および／またはＣＤＲは、本明細書に記載される特定のアミノ酸配列を含み、バリアントではない。かかるＶ_Ｈは、ＣＤＲ－Ｈはバリアントではないバリアントアミノ酸配列を含む場合もあり、および／またはかかるＶ_Ｌは、ＣＤＲ－Ｌはバリアントではないバリアントアミノ酸配列を含む場合もある。本発明のある実施形態では、Ｖ_Ｈは、ＩｇＧ重鎖定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）に連結され、および／またはＶ_Ｌは、ラムダまたはカッパ軽鎖定常ドメインに連結される。

【0081】

抗原結合タンパク質のＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、およびＲＥＧＮ６３２３は、ＥＧＦＲ（および／または一つ以上の異なる抗原または異なるＥＧＦＲエピトープ）に結合する一つのＨＣＶＲアームと、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合する一つのＨＣＶＲアームとを有する二特異性抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）である。

【0082】

ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、およびＲＥＧＮ６３２３の免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列を以下に記載する：

【0083】

ＲＥＧＮ７０７５のＥＧＦＲ構成要素
親ＥＧＦＲ ｍＡｂ１２９９９Ｐ２に由来するＥＧＦＲアームのＨＣＶＲ）：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIITFYWSWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARVSEDSYFHYGMDVWGQGTTVTVSS
（配列番号２、下線部分はＣＤＲ）
CDR-H1：G D S I I T F Y（配列番号４）
CDR-H2：I Y Y S G I T（配列番号６）
CDR-H3：A R V S E D S Y F H Y G M
D V（配列番号８）

【0084】

二特異性抗体ＲＥＧＮ７０７５のＥＧＦＲアームの全長重鎖
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIITFYWSWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARVSEDSYFHYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
（配列番号２４）

【0085】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性抗体ＲＥＧＮ７０７５のＬＣＶＲ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６、下線部分はＣＤＲ）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0086】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性物質の両方の全長軽鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号２８）

【0087】

ＲＥＧＮ６３２１のＥＧＦＲ構成要素
親ＥＧＦＲ ｍＡｂ１３００８Ｐ２に由来するＥＧＦＲアームのＨＣＶＲ）：
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCTASGFTFSTFIMFWVRQAPGKGLEYVSSISSNGGTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCTRGGDFWSGYYPFDYWGQGTLVTVSS
（配列番号３０、下線部分はＣＤＲ）
CDR-H1：G F T F S T F I（配列番号３２）
CDR-H2：I S S N G G T I（配列番号３４）
CDR-H3：T R G G D F W S G Y Y P F
D Y（配列番号３６）

【0088】

二特異性抗体ＲＥＧＮ６３２１のＥＧＦＲアームの全長重鎖
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCTASGFTFSTFIMFWVRQAPGKGLEYVSSISSNGGTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCTRGGDFWSGYYPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
（配列番号３８）

【0089】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性抗体ＲＥＧＮ６３２１のＬＣＶＲ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６、下線部分はＣＤＲ）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0090】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性物質の両方の全長軽鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号２８）

【0091】

ＲＥＧＮ６３２２のＥＧＦＲ構成要素
親ＥＧＦＲ ｍＡｂ３５１９３Ｐ２に由来するＥＧＦＲアームのＨＣＶＲ）：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCTASGFSFRDAWMTWVRQVPGKGLEWVGRIRNKIDGGTTDYNTPVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDIWNYVLFYYYGLDVWGQGTTVTVSS
（配列番号４０、下線部分はＣＤＲ）
CDR-H1：G F S F R D A W（配列番号４２）
CDR-H2：I R N K I D G G T T（配列番号４４）
CDR-H3：T T D I W N Y V L F Y Y Y
G L D V（配列番号４６）

【0092】

二特異性抗体ＲＥＧＮ６３２２のＥＧＦＲアームの全長重鎖
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCTASGFSFRDAWMTWVRQVPGKGLEWVGRIRNKIDGGTTDYNTPVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDIWNYVLFYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
（配列番号４８）

【0093】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性抗体ＲＥＧＮ６３２２のＬＣＶＲ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６、下線部分はＣＤＲ）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0094】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性物質の両方の全長軽鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号２８）

【0095】

ＲＥＧＮ６３２３のＥＧＦＲ構成要素
親ＥＧＦＲ ｍＡｂ１３００６Ｐ２に由来するＥＧＦＲアームのＨＣＶＲ）：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSIISYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQVSLKLNSVIAADTAVYYCARVSEDSYYHYGMDVWGQGTTVTVSS
（配列番号５０、下線部分はＣＤＲ）
CDR-H1：D D S I I S Y Y（配列番号５２）
CDR-H2：I Y Y S G R T（配列番号５４）
CDR-H3：A R V S E D S Y Y H Y G M
D V（配列番号５６）

【0096】

二特異性抗体ＲＥＧＮ６３２３のＥＧＦＲアームの全長重鎖
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSIISYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQVSLKLNSVIAADTAVYYCARVSEDSYYHYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
（配列番号５８）

【0097】

EGFRおよびCD28親抗体ならびに二特異性抗体REGN6323のLCVR
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６、下線部分はＣＤＲ）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0098】

ＥＧＦＲおよびＣＤ２８親抗体、ならびに二特異性物質の両方の全長軽鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号２８）

【0099】

本発明のある実施形態では、ｍＡｂ１２９９９Ｐ２、ｍＡｂ１３００８Ｐ２、ｍＡｂ３５１９３Ｐ２、またはｍＡｂ１３００６Ｐ２の重鎖は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖とペア形成される：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６）；
および
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK
（配列番号６７）；

【0100】

ＣＤ２８（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ２８）結合アーム
本発明は、一つ以上のＣＤ２８結合アームならびに一つ以上のＥＧＦＲ結合アームを含む、例えば抗体または抗原結合断片などの多特異性（例えば二特異性）抗原結合タンパク質を含む。

【0101】

ＣＤ２８結合アームは、タンパク質にＣＤ２８結合能を与える多特異性抗原結合タンパク質の部分である。例えば、Ｙ型ＩｇＧ抗体のＣＤ２８結合アームとは、ＣＤ２８に対する結合特異性を与える抗体の構造部分を指す。例えば、本発明のある実施形態では、ＣＤ２８結合アームは、ＣＤ２８に特異的に結合するＨＣＤＲ１、ＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３；ＨＶＣＲ（Ｖ_Ｈ）およびＬＣＶＲ（Ｖ_Ｌ）ならびに／またはＨＣおよびＬＣを含む。

【0102】

本発明のある実施形態では、ＣＤ２８結合アームは、重鎖ＣＤＲの組み合わせ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含むＶ_Ｈを含む重鎖免疫グロブリン、および軽鎖ＣＤＲの組み合わせ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含むＶ_Ｌを含む対応する軽鎖免疫グロブリンを含み、それらは本明細書に記載されている。本発明のある実施形態では、ＣＤ２８結合アームは、本明細書に記載される重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と、対応する軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。

【0103】

親抗ＣＤ２８抗体の１４２２６Ｐ２、１４１９３Ｐ２、および１４２１６Ｐ２の免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列を以下に記載する：

【0104】

二特異性物質の調製に使用される親ＣＤ２８ ｍＡｂ
ｍＡｂ１４２２６Ｐ２
ｍＡｂ１４２２６Ｐ２のＨＣＶＲ
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
（配列番号１０）
CDR-H1：GGSISSYY（配列番号１２）
CDR-H2：IYYSGIT（配列番号６）
CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV（配列番号１４）

【0105】

ｍＡｂ１４２２６Ｐ２の全長重鎖
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
（配列番号２６）

【0106】

ｍＡｂ１４２２６Ｐ２のＬＣＶＲ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0107】

ｍＡｂ１４２２６Ｐ２の全長軽鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号２８）

【0108】

ｍＡｂ１４１９３Ｐ２
ｍＡｂ１４１９３Ｐ２のＨＣＶＲ
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGNNKYYADSVKGRFTVSRDNSKKTLYLQMNSLRSEDTAVYYCAKDSYYDFLTDPDVLDIWGQGTMVTVSS
（配列番号５９）
CDR-H1：GFTFSSYG（配列番号６０）
CDR-H2：ISYAGNNK（配列番号６１）
CDR-H3：AKDSYYDFLTDPDVLDI（配列番号６２）

【0109】

ｍＡｂ１４１９３Ｐ２のＬＣＶＲ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0110】

ｍＡｂ１４２１６Ｐ２
ｍＡｂ１４２１６Ｐ２のＨＣＶＲ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSS
（配列番号６３）
CDR-H1：GFTFSRNN（配列番号６４）
CDR-H2：ISSNGGRT（配列番号６５）
CDR-H3：TRDDELLSFDY（配列番号６６）

【0111】

ｍＡｂ１４２１６Ｐ２のＬＣＶＲ
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６）
CDR-L1：QSVSSSY（配列番号１８）
CDR-L2：GAS（配列番号２０）
CDR-L3：QQYGSSPWT（配列番号２２）

【0112】

本発明のある実施形態では、１４２２６Ｐ２、１４１９３Ｐ２、または１４２１６Ｐ２の重鎖は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖とペア形成される：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
（配列番号１６）；
ならびに
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK
（配列番号６７）；

【0113】

「１４２２６Ｐ２」、「１４１９３Ｐ２」または「１４２１６Ｐ２」または「ｍＡｂ１４２２６Ｐ２」、「ｍＡｂ１４１９３Ｐ２」または「ｍＡｂ１４２１６Ｐ２」とは、本明細書に記載される二特異性物質のＣＤ２８アームが取得される親一特異性抗体を指す。本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）または全長重鎖（またはそのバリアント）、および本明細書に記載される対応する免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）または全長軽鎖を含むＣＤ２８結合アーム、またはそのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１（またはそのバリアント）、ＨＣＤＲ２（またはそのバリアント）、およびＨＣＤＲ３（またはそのバリアント））を含むＶ_Ｈ、ならびにそのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１（またはそのバリアント）、ＬＣＤＲ２（またはそのバリアント）およびＬＣＤＲ３（またはそのバリアント））を含む対応するＶ_Ｌとを含むＣＤ２８結合アームは、例えばこの場合において可変領域および／またはＣＤＲは、本明細書に記載される特定のアミノ酸配列を含み、バリアントではない。かかるＶ_Ｈは、ＣＤＲ－Ｈはバリアントではないバリアントアミノ酸配列を含む場合もあり、および／またはかかるＶ_Ｌは、ＣＤＲ－Ｌはバリアントではないバリアントアミノ酸配列を含む場合もある。かかるＣＤ２８結合アームは、ＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗原結合タンパク質を背景において呼称されてもよく、例えば０８５Ｎｘ１４２２６Ｐ２と呼称される場合がある。本発明のある実施形態では、Ｖ_Ｈは、ＩｇＧ重鎖定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）に連結され、および／またはＶ_Ｌは、ラムダまたはカッパ軽鎖定常ドメインに連結される。

【0114】

本発明はまた、ＣＤ２８タンパク質またはその抗原性断片（例えば、ＣＤ２８の細胞外ドメイン）に特異的に結合する、例えば抗体（例えばヒト抗体、モノクローナル抗体および組み換え抗体）などの抗原結合タンパク質およびその抗原結合断片も提供する。本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかと同じＣＤ２８上のエピトープ、またはそれらとＣＤ２８への結合に関して競合する抗原結合タンパク質も、本発明の一部である。

【0115】

Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８に結合し、Ｔ細胞の活性化および／または増殖を強化するＣＤ２８シグナル伝達をアゴナイズする本発明の多特異性ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質は、本明細書において、「共－刺激性」または「共刺激性」と呼称される場合がある。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体が、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合することで始まり（シグナル１）、その後の活性化は、例えばＴ細胞上のＣＤ２８受容体が標的細胞上の自身の同系リガンドに結合するなど、第二の「共刺激性」受容体の連動（シグナル２）により強化される。例えばＣＤ２８二特異性抗体によるＴ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体による内因性腫瘍抗原の認識に反応したシグナルの増幅、またはＣＤ３－二特異性抗体を介した「シグナル１」活性化に反応したシグナルの増幅によりもたらされる場合がある。

【0116】

多特異性抗原結合タンパク質
本発明は、多特異性（例えば二特異性）で、少なくともＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する抗原結合タンパク質を提供する。本明細書において使用される場合、かかる抗体はＡｘＢの形式で呼称され、この場合においてＡとはＥＧＦＲに結合する多特異性分子中の結合アームを指し、ＢとはＣＤ２８に結合する多特異性分子中の結合アームを指す。逆の場合もある。ＥＧＦＲｘＣＤ２８またはＣＤ２８ｘＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する多特異性抗原結合タンパク質を指す。多特異性抗原結合タンパク質中の特定のＥＧＦＲおよびＣＤ２８の結合アームは、ＡｘＢの形式で特定される場合もあり、この場合においてＡは特異的アームを指し、Ｂは別の特異的アームを指す。例えば０８５Ｎｘ１４２２６Ｐ２とは、本明細書に記載される０８５Ｎの抗ＥＧＦＲ結合アームと、本明細書に記載される１４４２６Ｐ２の抗ＣＤ２８結合アームを有する多特異性抗原結合タンパク質を指す。例えば０８５Ｎは、０８５Ｎの免疫グロブリン重鎖および軽鎖、またはその可変領域、またはそのＣＤＲを含む結合アームであり、その配列は本明細書に具体的に記載され、またはそのバリアントである。

【0117】

ある実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、二特異性抗原結合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「二特異性抗原結合タンパク質」という表現は、少なくとも第一の抗原結合ドメインと、第二の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチドまたは分子複合体（例えば抗体またはその抗原結合断片）を意味する。二特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、または一つ以上の追加のＣＤＲおよび／またはＦＲと組み合わされて、特定の抗原に特異的に結合するＣＤＲを少なくとも一つ含む。本発明の場合において、第一の抗原結合ドメインは、第一の抗原（例えば、ＣＤ２８）に特異的に結合し、第二の抗原結合ドメインは、第二の明白に異なる抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に特異的に結合する。

【0118】

多特異的結合とは、二つ以上の異なるエピトープ（ＥＧＦＲおよびＣＤ２８、またはそれ以上）に結合することを指し、それらエピトープは同じ抗原上または異なる抗原上にあってもよい。多特異性には、二特異性、三特異性および四特異性が含まれる。

【0119】

本発明は、以下の多特異性抗原結合タンパク質（例えば、二特異性抗体またはその抗原結合断片）のいずれかを含む：ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３。ならびに表１のＥＧＦＲ ＨＣＶＲアームのいずれか（例えば親モノクローナル抗体のｍＡｂ１２９９９Ｐ２、ｍＡｂ１３００８Ｐ２、ｍＡｂ３５１９３Ｐ２およびｍＡｂ１３００６Ｐ２のＨＣＶＲアーム）と、表３のＣＤ２８ ＨＣＶＲアームのいずれか（例えば、親ｍＡｂ１４２２６、ｍＡｂ１４１９３およびｍＡｂ１４２１６のＨＣＶＲアーム）とを組み合わせることにより調製される二特異性抗体。また本発明は、本明細書に記載されるそれらの使用方法を含む。

【0120】

ポリヌクレオチド、および作製方法
本明細書に記載される任意のＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗原結合タンパク質または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質の免疫グロブリン鎖をコードする単離ポリヌクレオチドも本発明の一部を成し、同様に本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター、および／またはポリヌクレオチド、ベクターもしくは抗原結合タンパク質を含む宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）も本発明の一部である。

【0121】

ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明は、例えば、ＥＧＦＲ結合アームおよび／またはＣＤ２８結合アームの免疫グロブリンＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＣＤＲ－Ｈ、ＣＤＲ－Ｌ、ＨＣまたはＬＣをコードする本発明のポリヌクレオチドを含み、任意でそれらはプロモーターまたは他の発現制御配列に動作可能に連結されている。例えば本発明は、表２に記載されるヌクレオチド配列、および表４に記載されるヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を提供する。

【0122】

本発明は、任意でプロモーターまたは他の発現制御配列または他のポリヌクレオチド配列に動作可能に連結される配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３９、４１、４３、４５、４９、５１、５３および／または５５に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0123】

一般的に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに（例えば直接または他のプロモーター結合性のタンパク質もしくは物質を介して）結合し、コード配列の転写を開始する能力を有するＤＮＡ制御領域である。プロモーターは、エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列に、および／または本発明のポリヌクレオチドとともに、動作可能に連結されてもよい。遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端リピート中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１－１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；例えばベータ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクター（ＶＩＩＩａ－Ｋｏｍａｒｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５）、また“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４－９４も参照のこと、および例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターもしくはアルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌由来のプロモーター因子が挙げられる。

【0124】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターまたは他の発現制御配列に「動作可能に連結される」と、細胞または他の発現系において、コード配列は当該配列によりＲＮＡポリメラーゼ介在性にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへと転写され、次いでＲＮＡスプライシングを受け（イントロンを含む場合）、および任意で当該コード配列にコードされるタンパク質へと翻訳される。

【0125】

本発明は、そのヌクレオチド配列が本明細書に具体的に記載される免疫グロブリンポリペプチド鎖のバリアントである、免疫グロブリンポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの「バリアント」とは、本明細書に記載される参照ヌクレオチド配列に対し、比較がＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われ、当該アルゴリズムのパラメーターが、各参照配列の全長での各配列間の最も大きな合致を与えるよう選択される場合（例えば、予測閾値：１０、ワードサイズ：２８、クエリ範囲における最大合致：０、合致／非合致スコア：１、－２；ギャップコスト：線形）、少なくとも約７０～９９．９％（例えば、７０、７２、７４、７５、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９％）同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。本発明のある実施形態では、本明細書に具体的に記載されるヌクレオチド配列のバリアントは、一つ以上のヌクレオチドの点変異、挿入（例えばフレーム内挿入）、または欠失（例えばフレーム内欠失）を一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個）含む。そのような変異は、本発明のある実施形態では、ミスセンス変異またはノンセンス変異であってもよい。本発明のある実施形態では、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、ＥＧＦＲ結合アームおよび／またはＣＤ２８結合アーム内に組み込まれ得る免疫グロブリンポリペプチド鎖をコードする。すなわち当該タンパク質は、ＥＧＦＲおよび／またはＣＤ２８に対する特異的結合を保持する。

【0126】

哺乳動物細胞を含む真核細胞、および原核細胞の宿主細胞が、抗ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）またはその抗原結合アームの発現のための宿主として使用されてもよい。そのような宿主細胞は当分野に周知であり、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。これら宿主細胞としては特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物の宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスターの細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、昆虫細胞株（例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）またはイラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。真菌細胞としては、酵母および糸状菌が挙げられ、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブランファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ
ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、 クルベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フサリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フサリウム・ヴェネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＷＯ２０１４／００４４２７に見出されるＥＧＦＲ抗体）、または本発明の抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８抗原結合タンパク質、例えばＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、および表９Ａ、９Ｂもしくは９Ｃに示される抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗原結合タンパク質、またはその免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および／もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチド、および／または本発明の多特異性抗原結合タンパク質のＥＧＦＲ結合アームとＣＤ２８結合アームをコードする一つ以上のポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞または上述の宿主細胞セットのいずれかタイプ）を含む。

【0127】

本発明はまた、本発明のＥＧＦＲｘＣＤ２８および／または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、例えばＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、ならびに表３のＣＤ２８ ＨＣＶＲアーム（例えば親ｍＡｂ１４２２６、ｍＡｂ１４１９３およびｍＡｂ１４２１６のＨＣＶＲアーム）のいずれかと表１のＥＧＦＲ ＨＣＶＲアーム（例えば親モノクローナル抗体のｍＡｂ１２９９９Ｐ２、ｍＡｂ１３００８Ｐ２、ｍＡｂ３５１９３Ｐ２、およびｍＡｂ１３００６Ｐ２のＨＣＶＲアーム）を組み合わせることにより調製される二特異性抗体、または表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示される二特異性抗体のいずれかに結合される、ＥＧＦＲおよび／もしくはＣＤ２８、またはそれらの抗原性断片、または融合物（例えば、Ｈｉｓ_６（配列番号６８）、Ｆｃおよび／またはｍｙｃ）を発現する細胞も含み、例えばこの場合において当該細胞は、対象の身体内にあり、またはインビトロにある。

【0128】

さらに本発明はまた、本発明のＥＧＦＲｘＣＤ２８および／またはＥＧＦＲ抗原結合タンパク質を含む複合体、例えばＥＧＦＲおよび／もしくはＣＤ２８ポリペプチド、またはその抗原性断片またはその融合物と複合体化された本明細書に検討される抗体またはその抗原結合断片、および／または抗ＥＧＦＲ抗体もしくはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体もしくはその断片に特異的に結合する二次抗体またはその抗原結合断片（例えば検出可能に標識された二次抗体）を含む複合体を提供する。本発明のある実施形態では、複合体は、インビトロにあり（例えば固形基質に固定される）、または対象の身体内にある。本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲは、腫瘍細胞の表面上にあり、ＣＤ２８は、例えばＴ細胞などの免疫細胞の表面上にある。本発明のある実施形態では、Ｔ細胞は活性化される。

【0129】

組み換え抗体を生成する方法がいくつか存在し、それら方法は当分野に公知である。抗体の組み換え作製方法の一例は、米国特許第４８１６５６７号に開示されている。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法による形質転換であってもよい。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は当分野に周知であり、デキストラン介在トランスフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン介在トランスフェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、バイオリスティック注入法、および核への直接的なＤＮＡマイクロインジェクションが挙げられる。さらに核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳動物細胞内に導入されてもよい。細胞を形質転換させる方法は、当分野に周知である。例えば、米国特許第４３９９２１６号、同第４９１２０４０号、同第４７４０４６１号、および同第４９５９４５５号を参照のこと。

【0130】

本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８（例えば、ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、またはＲＥＧＮ６３２３）抗原結合タンパク質、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、またはその免疫グロブリン鎖を作製するための組み換え方法を含み、当該方法は、
（ｉ）宿主細胞内に、ＥＧＦＲｘＣＤ２８、または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質の抗原結合アームをコードする軽鎖および重鎖免疫グロブリンをコードする一つ以上のポリヌクレオチドを導入することであって、例えばこの場合において当該ポリヌクレオチドはベクター中にあり、および／または宿主細胞の染色体内に統合され、および／またはプロモーターに動作可能に連結されていること、
（ｉｉ）当該ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で当該宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはピキアまたはピキア・パストリス）を培養すること、および
（ｉｉｉ）任意で、当該宿主細胞から、および／または当該宿主細胞が増殖した培地から、抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合断片）または鎖を単離すること、を含む。本発明はまた、抗ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片も含み、それらは本明細書に記載される作製方法、および任意で本明細書に記載される精製方法の産物である。

【0131】

本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲｘＣＤ２８（例えばＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、またはＲＥＧＮ６３２３）抗原結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片を作製する方法は、例えばカラムクロマトグラフィー、沈殿および／またはろ過により当該抗原結合タンパク質を精製する方法を含む。検討されるように、当該方法の産物も、本発明の一部を成す。

【0132】

配列バリアント
本発明の抗体および二特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが誘導された対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域ならびに／またはＣＤＲ領域において、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから利用可能な生殖細胞系列の配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示される例示的アミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合断片を含んでもよく、この場合において一つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸は、当該抗体が由来する生殖細胞系列の配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基に、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換に、変異を受けている（そのような配列変化を本明細書において集合的に「生殖細胞系列変異」と呼称する）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を用いて開始して、一つ以上の個々の生殖細胞系列変異またはその組み合わせを含む多くの抗体および抗原結合断片を容易に作製することができる。ある実施形態では、Ｖ_Ｈおよび／もしくはＶ_Ｌドメイン内のフレームワークならびに／またはＣＤＲ残基の全てが、当該抗原結合ドメインが元々由来する元の生殖系列配列に存在する残基へと戻し変異される。他の実施形態では、特定の残基のみが、元の生殖細胞系列配列へと戻し変異される。例えばＦＲ１の最初の８アミノ酸内、またはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に存在する変異残基のみが、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に存在する変異残基のみが、戻し変異される。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲの残基のうちの一つ以上が、異なる生殖細胞系列の配列（すなわち、抗原結合ドメインが元々由来する生殖細胞系列の配列とは異なる生殖細胞系列の配列）の対応する残基へと変異される。さらに抗原結合ドメインは、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内に二つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異され、一方で元の生殖細胞系列配列とは異なる特定の他の残基は維持され、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異される。取得された時点で、一つ以上の生殖細胞系列変異を含有する抗原結合ドメインは、一つ以上の所望の特性に関して容易に検証することができる。所望の特性としては例えば結合特異性の改善、結合アフィニティの増加、アンタゴニスト性もしくはアゴニスト性の生物学的特性の改善または強化（場合によっては）、免疫原性の低下などが挙げられる。この一般的な方法で取得された一つ以上の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子は、本発明内に包含される。

【0133】

また本発明は、一つまたは両方の抗原結合ドメインが、一つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含有する、抗原結合分子も含む。例えば本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する、抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、似た化学的特性（例えば電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般的に保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させない。類似の化学特性を伴う側鎖を有するアミノ酸群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０ ｌｏｇ－尤度マトリクスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０ ｌｏｇ－尤度マトリクスにおいて、負ではない値を有する任意の変化である。

【0134】

本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子も含む。アミノ酸配列への言及であるとき、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、二つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重み付けを用いてプログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合には、配列同一性の百分率または類似性の程度は、置換の保存的性質に関して修正するために上向きに調整される場合がある。この調整を行う手段は、当業者に公知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２４：３０７－３３１を参照のこと。

【0135】

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼称され、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失およびその他の修飾に対して割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列を合致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有しており、これらプログラムをデフォルトのパラメーターで使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチド、または野生型タンパク質とその変異体との間の相同ポリペプチドなどの非常に近縁なポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルトパラメーターまたは推奨パラメーターのＧＣＧバージョン６．１のプログラムを使用したＦＡＳＴＡを使用して比較されることもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリと検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントおよび配列同一性の百分率を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）、上記）。本発明の配列を、異なる生物体からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴであり、特にデフォルトパラメーターを使用したＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．２１５：４０３－４１０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照のこと。

【0136】

Ｆｃバリアントを含む抗体
本発明のある実施形態によると、例えば中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化する、または減弱させる一つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域に変異を含む抗体および抗原結合分子を含み、この場合において当該変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインのアフィニティを増加させる。そのような変異によって、動物に投与されたときの抗体の血清半減期が延長され得る。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、
２５０（例えば、ＥまたはＱ）；
２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；
２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、
２５４（例えば、ＳまたはＴ）、ならびに／または
２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；
の位置での改変、または
４２８および／もしくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、ならびに／または
４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）；
の位置での改変、または
２５０および／もしくは４２８；
の位置での改変、または
３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および／または
４３４の位置での改変が挙げられる。

【0137】

一つの実施形態では、改変は、
４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；
４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；
４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変；
２５２、２５４および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変；
２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに／または
３０７および／もしくは３０８の改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

【0138】

例えば、本発明は、以下からなる群から選択される変異の一つ以上のペアまたは変異群を含むＦｃドメインを含むＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子を含む：
２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；
２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；
４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに
４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。

【0139】

前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能性のある組み合わせが、本発明の範囲内に予期される。

【0140】

抗体および抗原結合分子の生物学的特徴
本発明は、高いアフィニティでＣＤ２８およびＥＧＦＲに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む。本発明はまた、治療背景および望ましい特定の標的化特性に応じて、中程度または低いアフィニティでヒトＣＤ２８および／またはＥＧＦＲに結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。例えば一つのアームがＣＤ２８に結合し、別のアームが標的抗原（例えばＥＧＦＲ）に結合する二特異性抗原結合分子の場合、標的抗原結合アームは、高いアフィニティで標的抗原に結合し、一方で抗ＣＤ２８アームは中程度または低いアフィニティのみでＣＤ２８に結合することが望ましい場合がある。この様式において、標的抗原を発現する細胞に対する抗原結合分子の優先的標的化は、全般的な／非標的のＣＤ２８結合と、それに関連して生じる有害な副作用を回避しながら実現され得る。

【0141】

ある実施形態によると、本発明は、ヒトＣＤ２８に（例えば２５℃で）、例えば本明細書の実施例１および１３に規定されるようなアッセイフォーマットを使用して表面プラズモン共鳴により測定したときに約２００ｎＭ未満のＫ_Ｄで結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。ある実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例１および１３に規定されるアッセイフォーマットまたは非常に類似したアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により測定したときに、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満のＫ_Ｄで、ＣＤ２８に結合する。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、約５ｎＭ～約２０ｎＭのＫ_ＤでＣＤ２８に結合する。

【0142】

本発明はさらに、例えば本明細書の実施例１および１３に規定されるアッセイフォーマットまたは非常に類似したアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴により測定したときに、約３分を超える解離半減期（ｔ_１／２）でＣＤ２８に結合する抗体も含む。ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例１および１３に規定されるアッセイフォーマットまたは非常に類似したアッセイを使用して、２５℃または３７℃で表面プラズモン共鳴により測定したときに、約５分を超える、約１０分を超える、約２０分を超える、約３０分を超える、約４０分を超える、約５０分を超える、約６０分を超える、約７０分を超える、約８０分を超える、約９０分を超える、約１００分を超える、約２００分を超える、約３００分を超える、約４００分を超える、約５００分を超える、約６００分を超える、約７００分を超える、約８００分を超える、約９００分を超える、約１０００分を超える、または約１２００分を超えるｔ_１／２でＣＤ２８に結合する。

【0143】

本発明は、ヒトＣＤ２８とヒトＥＧＦＲに同時に結合する能力を有する二特異性抗原結合分子（例えば二特異性抗体）を含む。ある実施形態によると、本発明の二特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８および／またはＥＧＦＲを発現する細胞と特異的に相互作用する。二特異性抗原結合分子がＣＤ２８および／またはＥＧＦＲを発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例１０Ａおよび１０Ｂに解説されるように蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）により算定することができる。例えば本発明は、ＣＤ２８を発現するがＥＧＦＲを発現しないヒト細胞株（例えばＪｕｒｋａｔ細胞）、およびＥＧＦＲを発現するがＣＤ２８を発現しないヒト卵巣癌細胞株（例えばＰＥＯ１）に特異的に結合する二特異性抗原結合分子を含む。一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８を発現するヒトまたはカニクイザルのＴ細胞に、１ｘ１０^－５Ｍ未満のＥＣ５０値で結合する。一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８を発現するヒトまたはカニクイザルのＴ細胞に、１ｘ１０^－１２Ｍ～１ｘ１０^－５ＭのＥＣ５０値で結合する。ある実施形態では、二特異性抗原結合分子は、ＣＤ２８を発現するヒトまたはカニクイザルのＴ細胞に、１ｘ１０^－９Ｍ～１ｘ１０^－５ＭのＥＣ５０値で結合する。ある実施形態では、二特異性抗原結合分子は、ＥＧＦＲを発現する細胞株の表面に、約２．５ｘ１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０で結合する。細胞または細胞株の表面に対する二特異性抗原結合分子の結合は、実施例１０Ａおよび１０Ｂに記載されるようにインビトロでのＦＡＣＳ結合アッセイにより測定することができる。

【0144】

本明細書に記載されるＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質は、例えばバリアント免疫グロブリン鎖を含み、以下の特性のうちの一つ以上を呈してもよい：
－ ＣＤ３４＋細胞（例えば、胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞）が生着したマウス（例えば、ＶＨマウス（Ｒａｇ２^ｎｕｌｌ／γ_ｃ ^ｎｕｌｌ／ｈｕＳｉｒｐ－ａ／ｈｕＴＰＯ））において、ヒト腫瘍細胞（例えば、Ａ４３１腫瘍細胞）の増殖および／または生存を減少させる。任意でこの場合においてＥＧＦＲｘＣＤ２８は、ＰＤ１アンタゴニスト（例えばセミプリマブなどの抗ＰＤ１）と関連付けられて投与される。
－ ヒトＰＢＭＣを含むマウス（例えば（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ^ｎｕｌｌ））において、ヒト腫瘍細胞（例えば、Ａ４３１腫瘍細胞）の増殖および／または生存を減少させる（例えばこの場合において腫瘍細胞と混合されたヒトＰＢＭＣがマウスに皮下移植される）。任意でこの場合においてＥＧＦＲｘＣＤ２８は、ＰＤ１アンタゴニスト（例えばセミプリマブなどの抗ＰＤ１）と関連付けられて投与される。
－ ヒトＰＢＭＣを含むマウス（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ^ｎｕｌｌ）において、ヒト腫瘍細胞（例えば、Ａ５４９腫瘍細胞）の増殖および／または生存を減少させる（例えばこの場合においてヒトＰＢＭＣはマウスに腹腔内移植され、腫瘍細胞はマウスに皮下移植される）。任意でこの場合においてＥＧＦＲｘＣＤ２８は、ＰＤ１アンタゴニスト（例えばセミプリマブなどの抗ＰＤ１）と関連付けられて投与される。
－ Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ２８＋細胞に結合する。
－ ＰＥ０１ ＥＧＦＲ＋細胞に結合する。および／または
－ 例えば１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルに投与されたときに有意なサイトカイン放出（例えば、インターフェロンガンマ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８および／またはＩＬ－１０）を生じさせない。

【0145】

本発明は、対象において腫瘍細胞を激減させる能力を有する抗ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子を含む（例えば実施例３～５を参照）。例えばある実施形態によると、抗ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子が提供され、この場合において治療有効用量での対象への当該抗原結合分子の単回投与は、対象において多数の腫瘍細胞の減少を生じさせる。

【0146】

本発明は、Ａ３７５メラノーマ細胞、２２ＲＶ１前立腺細胞、ＰＥＯ１卵巣細胞、ＣＡＰＡＮ２膵臓細胞、ＳＷ１９９０膵臓細胞、およびＨ２９２胚細胞を含む様々な腫瘍細胞に対する結合能力を有する抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗原結合分子を含む（実施例１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと）。したがって本発明の二特異性抗体は、多数の癌症状の治療に有用であることが証明され得る。

【0147】

本発明は、様々な細胞株で抗腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）Ｘ抗ＣＤ３二特異性抗体の細胞障害の有効性を強化する能力を有する抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗原結合分子を含む（実施例１１を参照のこと）。この方法を使用する場合、ＴＳＡＸＣＤ３二特異性抗体は、抗ＳＴＥＡＰ２Ｘ抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡＸ抗ＣＤ３、または抗ＭＵＣ１６Ｘ抗ＣＤ３の二特異性物質が挙げられ得る。抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗体は、例えばＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に対する抗体などのチェックポイント阻害物質、または任意の他のチェックポイント阻害物質と組み合わされた時に有用であることも証明され得る（実施例９を参照のこと）。ある実施形態では、抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８と、抗ＴＳＡＸ抗ＣＤ３二特異性物質とチェックポイント阻害物質の両方とを組み合わせることが有益であり得る。

【0148】

本発明の抗体はさらに、水素－重水素交換を使用してヒトＥＧＦＲ上の特定のエピトープに結合することも証明された（実施例１２を参照のこと）。特に本発明の特定の抗体は、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸残基３４５－３６８（配列番号７０）、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸残基３９９－４１６（配列番号７１）、およびヒトＥＧＦＲのアミノ酸残基１３３－１５４（配列番号７２）に結合／相互作用することが見出された。

【0149】

エピトープマッピングおよび関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ２８またはＥＧＦＲ上のエピトープは、ＣＤ２８タンパク質またはＥＧＦＲタンパク質の３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のアミノ酸の単一連続配列からなる場合がある。あるいはエピトープは、ＣＤ２８またはＥＧＦＲの複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなる場合もある。本発明の抗体は、ＣＤ２８単量体内に含有されるアミノ酸と相互作用する場合があり、またはＣＤ２８二量体の二つの異なるＣＤ２８鎖上のアミノ酸と相互作用する場合もある。本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原性決定基を指す。一つの抗原が、複数のエピトープを有する場合もある。したがって、異なる抗体が、抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物効果を有する場合もある。エピトープは、立体構造的または直線状のいずれであってもよい。立体構造的エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントに由来する空間的に並置したアミノ酸によって生成される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。

【0150】

当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体の抗原結合ドメインが、ポリペプチドまたはタンパク質内の「一つ以上のアミノ酸と相互作用する」か否かを決定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインの決定に使用され得る技術の例としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載される定型的なクロスブロッキングアッセイ、点突然変異誘導法（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘導法、アルギニンスキャニング突然変異誘導法など）、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、プロテアーゼ保護およびペプチド切断解析が挙げられる。さらに例えば抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸の特定に使用され得るもう１つの方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換法である。総称的な用語として、水素／重水素交換法は、対象タンパク質を重水素標識すること、次いで抗体を当該重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次にタンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体により保護された残基（重水素標識の状態を維持する）を除く全ての残基で水素－重水素交換を発生させる。抗体を解離させた後、標的タンパク質にプロテアーゼ切断と質量分析を行い、それにより重水素標識残基が明らかとなり、当該重水素標識残基が、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に相当する。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。あるいはある実施形態では、対象タンパク質が抗体に結合し、次いで水素－重水素交換が行われる。抗体を解離させた後、標的タンパク質にプロテアーゼ切断と質量分析を行い、それにより重水素標識されていない残基が明らかとなり、当該重水素標識されていない残基が、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に相当する。Ｘ線結晶構造解析を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定することもできる。

【0151】

本発明は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、表１、３、６、９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）と同じエピトープに結合する抗ＣＤ２８および抗ＥＧＦＲ抗体をさらに含む。本発明は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、表１、３、６、９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＣＤ２８および／またはＥＧＦＲへの結合に関して競合する抗ＣＤ２８および／または抗ＥＧＦＲ抗体も含む。

【0152】

本発明はまた、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインと、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する第二の抗原結合断片を含む二特異性抗原結合分子も含み、この場合において当該第一の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的ＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じＣＤ２８上のエピトープに結合し、および／または当該第二の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的ＥＧＦＲ特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じＥＧＦＲ上のエピトープに結合する。

【0153】

ある実施形態では、本発明は、配列番号７２に記載されるＥＧＦＲのアミノ酸残基１３３－１５４、配列番号７０に記載されるＥＧＦＲのアミノ酸残基３４５－３６８、または配列番号７１に記載されるＥＧＦＲのアミノ酸残基３９９－４１６のうちの一つ以上と相互作用する二特異性抗原結合分子を含む。

【0154】

同様に本発明はまた、ヒトＣＤ２８に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインと、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する第二の抗原結合断片を含む二特異性抗原結合分子も含み、この場合において当該第一の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的ＣＤ２８特異的抗原結合ドメインのいずれかとＣＤ２８への結合に関して競合し、および／または当該第二の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例示的ＥＧＦＲ特異的抗原結合ドメインのいずれかとＥＧＦＲへの結合に関して競合する。

【0155】

特定の抗原結合分子（例えば抗体）またはその抗原結合ドメインが、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する、または競合するか否かを、当分野に公知の定型的な方法を使用して容易に決定することができる。例えば被験抗体が本発明の参照二特異性抗原結合分子と同じＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）上のエピトープに結合するかを決定するために、当該参照二特異性分子を最初にＣＤ２８タンパク質（またはＥＧＦＲタンパク質）に結合させる。次に、ＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）分子に結合する被験抗体の能力が評価される。被験抗体が、参照二特異性抗原結合分子で結合を飽和した後にＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）に結合することができた場合、当該被験抗体は、当該参照二特異性抗原結合分子とＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）への結合に関して競合しないこと、および／または抗原上の異なる部位に結合する抗体間に立体干渉があることが結論付けられ得る。他方で被験抗体が、参照二特異性抗原結合分子で結合を飽和した後にＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）分子に結合することができなかった場合、当該被験抗体は、本発明の参照二特異性抗原結合分子とＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）への結合に関して競合する。次いで追加の定型的な実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を実施して、観察された被験抗体の結合の欠落が実際に、参照二特異性抗原結合分子と同じエピトープに結合することが原因であるのか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明のある実施形態によると、競合結合アッセイにおいて測定したとき、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍余剰な一方の抗原結合タンパク質が、他方の抗体の結合を、少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％まで阻害する場合、二つの抗原結合タンパク質は、抗原への結合に関して競合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａＩ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を減少させる、または消滅させる、抗原中の本質的に全てのアミノ酸の変異が、他方の結合も減少または消滅させる場合、二つの抗原結合タンパク質は、同じエピトープに結合する可能性がある。一方の抗原結合タンパク質の結合を減少させるアミノ酸の変異のサブセットのみが、他方の結合も減少または消滅させる場合、二つの抗原結合タンパク質は、「重複するエピトープ」を有する可能性がある。

【0156】

抗体またはその抗原結合ドメインが、参照抗原結合分子と結合に関して競合するかを決定するために、以下の２つの方向性で上述の結合法が実施される：第一の方向性では、参照抗原結合分子は、飽和条件下でＣＤ２８タンパク質（またはＥＧＦＲタンパク質）に結合され、その後、ＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）分子への被験抗体の結合が評価される。第二の方向性では、被験抗体が、飽和条件下でＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）分子に結合され、その後、ＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）分子への参照抗原結合分子の結合が評価される。両方の方向性で、第一の（飽和）抗原結合分子のみがＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）分子に結合することができた場合、被験抗体と参照抗体は、ＣＤ２８（またはＥＧＦＲ）への結合に関して競合すると結論付けられる。当業者に認識されるように、参照抗原結合分子と結合に関して競合する抗体が必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合するわけではなく、重複エピトープまたは隣接エピトープにより参照抗体の結合が立体妨害されている可能性もある。

【0157】

抗原結合ドメインの調製と二特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当分野に公知の任意の抗体作製法により調製することができる。二つの異なる抗原（例えば、ＣＤ２８とＥＧＦＲ）に特異的な二つの異なる抗原結合ドメインが得られたら、定型的な方法を使用して、それらを互いに対して適切に配置し、本発明の二特異性抗原結合分子を作製することができる。（本発明の二特異性抗原結合分子の構築に使用され得る例示的な二特異性抗体形式の検討は、本明細書において別に提示される）。ある実施形態では、本発明の多特異性抗原結合分子の個々の構成要素（例えば重鎖と軽鎖）のうちの一つ以上が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体に由来する。そうした抗体の作製方法は、当分野に周知である。例えば本発明の二特異性抗原結合分子の重鎖および／または軽鎖のうちの一つ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体作製技術）を使用して、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する、特定抗原（例えばＣＤ２８またはＥＧＦＲ）に対して高アフィニティのキメラ抗体を最初に単離する。抗体を特徴解析し、アフィニティ、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴について選択する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域と置き換えて、完全ヒト重鎖および／または軽鎖を作製し、これを本発明の二特異性抗原結合分子に組み込んでもよい。

【0158】

遺伝子操作された動物を使用して、ヒト二特異性抗原結合分子を作製してもよい。例えば内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再構成および発現することができない遺伝子改変マウスを使用してもよく、この場合において当該マウスは、内因性のマウスカッパ座位で、マウスカッパ定常遺伝子に動作可能に連結されたヒト免疫グロブリン配列によりコードされる一つまたは二つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。そのような遺伝子改変マウスを使用して、二つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの一つに由来する可変ドメインを含む、同一軽鎖に関連付けられた二つの異なる重鎖を含む完全ヒト二特異性抗原結合分子を作製することができる。（例えば、二特異性抗原結合分子を作製するためのかかる改変マウスおよびその使用に関する詳細な検討について、米国特許出願公開第２０１１／０１９５４５４号を参照のこと）。

【0159】

生物学的均等
本発明は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるが、ＣＤ２８およびＥＧＦＲに結合する能力は保持しているアミノ酸配列を有する抗原結合分子を包含する。そのようなバリアント分子は、親配列を比較したときに、一つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含むが、記載される抗原結合分子と本質的に均等な生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗原結合分子をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較したときに、一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の記載される抗原結合分子と本質的に生物学的に均等な抗原結合分子をコードする配列を包含する。そのようなバリアントアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の例は、上記に検討される。

【0160】

本発明は、本明細書に記載される例示的抗原結合分子のいずれかに対して、生物学的に均等である抗原結合分子を含む。二つの抗原結合タンパク質または抗体が、薬学的な均等物または薬学的な代替物であり、類似した実験条件下で、単回投与または複数回投与のいずれかで同モル用量で投与されたときに、その吸収の速度および範囲が有意な差を示さない場合、それら二つの抗原結合タンパク質または抗体は生物学的に均等とみなされる。いくつかの抗体で、吸収の範囲は同等であるが、吸収の速度は同等ではなく、しかし吸収速度における当該差異が意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば慢性的使用での有効身体薬物濃度の獲得に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないとみなされるために、それら抗体が生物学的に均等であるとみなされ得る場合、それら抗体は均等物、または薬学的代替物とみなされる。

【0161】

一つの実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および有効性において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に均等である。

【0162】

一つの実施形態では、参照産物と生物学的産物の間の一回以上の交換が、当該交換が行われなかった場合の継続治療と比較して、免疫原性における臨床的に意義のある変化をはじめとする有害作用リスクの予測される上昇、または有効性の消失を伴わずに交換され得た場合、二つの抗原結合タンパク質は、生物学的に均等である。

【0163】

一つの実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、使用される疾患に関して当該機序で判明している程度まで共通の作用機序により両方ともが作用する場合、生物学的に均等である。

【0164】

生物学的に均等であることは、インビボおよびインビトロの方法により実証されてもよい。生物学的に均等であることの測定方法としては例えば、（ａ）時間関数として血液、血漿、血清または他の体液中で抗体またはその代謝物の濃度が測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボ生体利用効率に相関し、合理的な指標であるインビトロ検査、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的作用が時間関数として計測される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生体利用効率もしくは生物学的均等性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。

【0165】

本明細書に記載される例示的二特異性抗原結合分子の生物学的に均等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必須ではない末端もしくは内部の残基または配列を欠失させることにより構築されてもよい。例えば生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失させ、または他のアミノ酸と置換させて、再生時に不必要な、または不適切な分子内ジスルフィド架橋を形成させないようにできる。他の状況では、生物学的に均等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消滅または除去させる変異を含む、本明細書に記載される例示的二特異性抗原結合分子を含んでもよい。

【0166】

種選択性および種交差反応性
ある実施形態によると本発明は、ヒトのＣＤ２８には結合するが、他種由来のＣＤ２８には結合しない抗原結合分子を提供する。本発明はさらに、ヒトのＥＧＦＲには結合するが、他種由来のＥＧＦＲには結合しない抗原結合分子も提供する。本発明はさらに、ヒトＣＤ２８と、一種以上の非ヒト種由来のＣＤ２８に結合する抗原結合分子、および／またはヒトＥＧＦＲと、一種以上の非ヒト種由来のＥＧＦＲに結合する抗原結合分子も含む。

【0167】

本発明のある例示的実施形態によると、ヒトＣＤ２８および／またはヒトＥＧＦＲに結合し、場合によって、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルもしくはチンパンジーのＣＤ２８および／またはＥＧＦＲのうちの一つ以上にも結合してもよく、または結合しなくてもよい抗原結合分子が提供される。例えば本発明の特定の例示的実施形態では、ヒトＣＤ２８とカニクイザルＣＤ２８に結合する第一の抗原結合ドメインと、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する第二の抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子が提供される。

【0168】

免疫複合体
本発明は、例えば治療部分など、別の部分と複合体化された（「免疫複合体」）、例えばＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、または本明細書に記載されるＣＤ２８抗体のいずれかに由来するＨＣＶＲとペア形成される抗ＥＧＦＲ ＨＣＶＲの任意の組み合わせなどのＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質、例えば抗体または抗原結合断片を包含する。本発明のある実施形態では、抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質、例えば抗体または抗原結合断片は、本明細書に記載されるさらなる治療剤のいずれかと複合体化される。本明細書において使用される場合、「免疫複合体」という用語は、別の抗原結合タンパク質、薬剤、放射性医薬品、受容体部分、酵素、ペプチド、タンパク質もしくは治療剤に化学的に、または生物学的に連結された例えば抗体または抗原結合断片などの抗原結合タンパク質を指す。

【0169】

ある実施形態では、治療部分は、サイトカイン、化学療法剤、免疫抑制剤、または放射性同位体であってもよい。細胞障害剤としては、細胞に有害な任意の剤が挙げられる。免疫複合体の形成に適した細胞障害剤および化学療法剤の例は、当分野に公知である（例えばＷＯ ０５／１０３０８１を参照のこと）。

【0170】

投与および治療
本発明は、例えばＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、または本明細書に記載されるＣＤ２８抗体のいずれかに由来するＨＣＶＲとペア形成される抗ＥＧＦＲ ＨＣＶＲの任意の組み合わせなどのＥＧＦＲｘＣＤ２８多特異性抗原結合タンパク質、またはその医薬組成物を、対象（例えば、過増殖性障害に罹患するヒト）に投与するための方法を提供し、当該方法は、当該対象（例えば、ヒト）の身体内に、例えば非経口的に当該抗原結合タンパク質またはその医薬組成物を導入することを含む。例えば当該方法は、シリンジの針で、当該対象の身体を突き刺すこと、および当該対象の身体内、例えば対象の静脈、動脈、腫瘍、筋組織、または皮下組織に、抗原結合タンパク質または医薬組成物を注入すること、を含む。

【0171】

ＥＧＦＲｘＣＤ２８、もしくは抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、またはその医薬組成物を投与する様式は変化し得る。投与経路としては、非経口、経口、口腔、直腸、経粘膜、腸管、経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、くも膜腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、送気、局所、皮膚、眼内、硝子体内、経皮、または動脈内が挙げられる。

【0172】

本発明はまた、本発明のＥＧＦＲｘＣＤ２８もしくは抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、またはその医薬組成物を含む容器（例えば、キャップされたプラスチックもしくはガラスのバイアルまたはアンプル、クロマトグラフィーカラム、中空内径針またはシリンジシリンダー）も提供する。

【0173】

本発明はまた、ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲとＣＤ２８（ＥＧＦＲｘＣＤ２８）に特異的に結合する一つ以上の抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗原結合断片）、またはそれらの医薬製剤を含む注射用デバイスも提供する。注射用デバイスは、キット内にパッケージングされてもよい。注射用デバイスは、例えば筋肉内、皮下または静脈内などの非経口経路を介して対象の身体内に物質を導入するデバイスである。例えば注射用デバイスは、シリンジまたはオートインジェクター（例えば医薬製剤でプレ充填されている）であってもよく、それらは例えば、注入される液体（例えば抗体もしくは断片またはその医薬製剤を含む）を保持するためのシリンダーまたはバレル（ｂａｒｒｅｌ）、当該液体の注入のために皮膚、血管または他の組織を突き刺すための針、およびシリンダーから、針の内径を通して対象の身体内へと当該液体を押し出すためのプランジャーを含む。

【0174】

プレ充填されたシリンジは、組成物（例えば、多特異性抗原結合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物）で充填され、その後、患者／対象に当該組成物を投与する医師や介護者などのエンドユーザーに販売、または移送されるシリンジである。

【0175】

抗原結合分子の治療用途
本発明は、対象における過増殖性疾患を治療または予防する方法を提供するものであり、当該方法は、ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質（例えばＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、または本明細書に記載されるＣＤ２８抗体のいずれかに由来するＨＣＶＲとペア形成される抗ＥＧＦＲ ＨＣＶＲの任意の組み合わせなど）の治療有効量を当該対象に、任意で例えば抗体（例えばペムブロリズマブ、ニボルマブ、および／またはセミプリマブ）またはその抗原結合断片などのＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と関連付けて投与することを含む。本発明のある実施形態では、当該方法は、対象の癌がＥＧＦＲを発現しているかを判定することを含む。そのような発現が観察された場合、ＥＧＦＲｘＣＤ２８および／または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質が投与される。例えば本発明のある実施形態では、当該方法は、当該癌の生検を採取すること（例えば、治療担当医により実施される）、および当該癌の細胞がＥＧＦＲを発現しているかを判定し、または（例えば患者または対象の代わりに）別の個人または実体に指示してそのような判定を行い、ＥＧＦＲ発現が存在した場合、当該対象に抗ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質を投与すること、を含む。本発明のある実施形態では、医師が、（当該患者または対象の代わりに）例えば病理学者などの別の他の個人または実体に指示して、生検を実施する。本発明のある実施形態では、ＥＧＦＲ発現は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）で、またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）により検証される。

【0176】

本発明は、その必要のある対象に、ＥＧＦＲ、またはＣＤ２８とＥＧＦＲに特異的に結合する二特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を投与する工程を含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗体または二特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。

【0177】

本発明の抗体および二特異性抗原結合分子（およびそれらを含む治療用組成物）は特に、免疫応答の刺激、活性化および／または標的化が有益となる任意の疾患または障害の治療に有用である。特に本発明の抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子は、ＥＧＦＲの発現もしくは活性、またはＥＧＦＲ＋細胞の増殖と関連付けられる、またはそれらに介在される任意の疾患または障害の治療、予防および／または改善に使用され得る。本発明の治療方法が実現される作用機序には、例えばＴ細胞などのエフェクター細胞の存在下でＥＧＦＲを発現する細胞を殺傷することが含まれる。本発明の二特異性抗原結合分子を使用して阻害または殺傷され得るＥＧＦＲ発現細胞としては、例えば、肺癌細胞が挙げられる。

【0178】

本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ）、好ましくはＥＧＦＲ発現癌の予防および／または治療の必要のあるヒトである。対象は、ＥＧＦＲ発現癌を有してもよく、かかる状態を発現しやすい状態にあってもよく、および／またはＥＧＦＲ活性の阻害もしくは低下、またはＥＧＦＲ＋細胞の激減から利益を得てもよい。一つの実施形態では、対象は、過増殖性疾患を有してもよく、または発症するリスクがあってもよい。

【0179】

本明細書の目的に対する過増殖性疾患とは、異常で過剰な、および／または制御されていない細胞増殖を特徴とする疾患を指し、例えばこの場合において当該細胞はＥＧＦＲを発現する。例えば過増殖性疾患としてはＥＧＦＲ発現癌が挙げられる。様々な癌がＥＧＦＲを発現する。ＥＧＦＲ発現癌の例としては限定されないが、食道癌、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、子宮頚扁平上皮細胞癌、神経膠腫、甲状腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、結腸直腸癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、頭頚部癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃食道癌（例えば、胃食道腺癌）、およびメラノーマが挙げられる。したがって本発明の抗体および二特異性抗原結合分子は、様々な癌の治療に使用することができる。

【0180】

例えばこの場合において、治療される特定の対象の細胞においてＥＧＦＲ発現が確認されている、ＥＧＦＲ発現癌であり得る固形腫瘍細胞または癌性血液細胞を特徴とする癌としては、食道癌、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、子宮頚扁平上皮細胞癌、子宮内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、皮膚癌（例えば頭頚部扁平上皮細胞癌）、脳腫瘍（例えば、多形性膠芽腫）、乳癌、胃食道癌（例えば胃食道腺癌）、前立腺癌、および／または卵巣癌が挙げられる。

【0181】

本発明の抗原結合分子はまた、例えば結腸、肺、脳、腎臓の癌および膀胱に生じる（または本明細書に検討される任意の癌に由来する）原発性および／または転移性の腫瘍などの治療にも使用され得る。ある例示的実施形態によると、本発明の二特異性抗原結合分子は、卵巣癌の治療に使用される。

【0182】

本発明はまた、対象の残存癌の治療方法も含む。本明細書において使用される場合、「残存癌」という用語は、抗癌治療後の対象における、一つ以上の癌性細胞の存在または持続を意味する。

【0183】

ある態様によると、本発明は、例えばＥＧＦＲ発現と関連する過増殖性疾患（例えば肺癌）の治療のための方法を提供するものであり、当該方法は、例えば対象が他のタイプの抗癌治療に非応答性であることが示された後に、対象に、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子のうちの一つ以上を投与することを含む。例えば、本発明は、例えば肺癌などの過増殖性疾患を治療するための方法を含み、当該方法は、例えば肺癌などの癌に罹患する患者に対し、当該対象が標準治療を受けた１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週後、２週後、３週後もしくは４週後、２カ月後、４カ月後、６カ月後、８カ月後、１年、またはそれ以上の後に、当該患者または対象に、抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子を投与することを含む。他の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む本発明の抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗原結合分子は、最初に一回以上の時点で対象に投与され（例えば、安定的な卵巣癌細胞の初期の激減を提供する）、その後、例えばＩｇＧ１ Ｆｃドメインなどの異なるＩｇＧドメインを含む同等の二特異性抗原結合分子が、その後の時点で投与される。本発明の抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体は、例えば抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３二特異性抗体などの他の二特異性抗原結合分子と併せて使用され得ることが予期される。また、本発明の二特異性抗体は、例えばＰＤ－１を標的とする、および他を標的とするさらなる治療剤と併せて使用されることも予期される。同じ腫瘍抗原（例えばＥＧＦＲ）を標的とする二つの二特異性抗体を組み合わせることも有益であり得るが、一つはＴ細胞上のＣＤ３を標的とする二特異性物質で、他方はＣＤ２８のような共刺激性分子を標的とする二特異性物質を組み合わせることも有益であり得る。この組み合わせを単独で使用して腫瘍細胞殺傷を強化してもよく、またはチェックポイント阻害物質と組み合わせて使用してもよい。

【0184】

例えばＥＧＦＲ発現癌などの過増殖性疾患の治療または予防のための、例えば抗体もしくは抗原結合断片などのＥＧＦＲｘＣＤ２８、または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質の「有効」投与量または「治療有効」投与量は、治療対象における疾患の一つ以上の徴候および／または症状が、当該徴候および／もしくは症状の退行または消失を誘導することにより、または当該徴候および／もしくは症状の進行を阻害することにより、改善するために充分な抗原結合タンパク質の量である。本発明のある実施形態では、抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質の治療有効投与量は、０．１～２０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ ＩＶ（静脈内）Ｑ２Ｗ（二週ごと）～２０００ｍｇ ＩＶ Ｑ２Ｗである。投与量は、投与される対象の年齢および大きさ、標的の疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。ある実施形態では、初回投与量の後の、抗原結合タンパク質の第二の投与または継続する複数回の投与は、初回投与量とほぼ同じ、または初回投与量未満、または初回投与量よりも多くてもよい量であり得、この場合において継続投与は、２週間間隔である。

【0185】

患者に投与される抗原結合分子の投与量は、患者の年齢および大きさ、標的の疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。好ましい投与量は、典型的には体重または体表面積に従い計算される。状態の重症度に応じて、治療の頻度と期間が調節され得る。二特異性抗原結合分子を投与するための効果的な用量およびスケジュールは経験的に決定され得るが、例えば、患者の進行は定期的な評価によってモニタリングすることができ、それに応じて投与量が調整される。さらに用量の種間拡張は、当分野に公知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

【0186】

本発明のある実施形態によると、抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体、またはＥＧＦＲおよびＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子）の複数回投与は、既定の時間経過で対象に投与されてもよい。本発明の本態様による方法は、本発明の抗原結合分子の複数回投与量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与する」とは、抗原結合分子の各投与量が、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）をあけた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本発明は、抗原結合分子の一つの初回投与量、次いで当該抗原結合分子の一つ以上の第二の投与量、および任意で次いで当該抗原結合分子の一つ以上の第三の投与量を連続的に投与することを含む方法を含む。

【0187】

「初回投与量」、「第二の投与量」、および「第三の投与量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時間的な順序を指す。したがって、「初回投与量」は、治療レジメンの開始時に投与される投与量である（また「基準投与量」とも呼称される）、「第二の投与量」は、初回投与量の後に投与される投与量であり、「第三の投与量」は、第二の投与量の後に投与される投与量である。初回投与量、第二の投与量、および第三の投与量は全て、同じ量の抗原結合分子を含有し得るが、投与頻度に関しては概して互いに異なり得る。しかしある実施形態では、初回投与量、第二の投与量、および／または第三の投与量に含有される抗原結合分子の量は、治療経過の間に（例えば適宜調整されて加減され）、互いに異なっている。特定の実施形態では、二つ以上の投与量が、治療レジメンの開始時に「負荷投与量」として投与され、その後に続く投与量が、より低い頻度ベースで投与される（例えば、「維持投与量」）。

【0188】

本発明の一つの例示的実施形態では、第二および／または第三の各投与量は、直前の投与量の１～数週後に投与される。「直前の投与量」という文言は、本明細書において使用される場合、複数回の投与の順序を意味し、当該順序のまさに次の投与量の投与が、その間の投与を伴わずに行われる前に患者に投与される抗原結合分子の投与を意味する。

【0189】

本発明の本態様による方法は、患者に、抗原結合分子（例えば抗ＣＤ２８抗体、またはＥＧＦＲとＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子）の第二および／または第三の投与量を任意の回数投与することを含んでもよい。例えばある実施形態では、一つの第二の投与量のみが患者に投与される。他の実施形態では、二つ以上の第二の投与量が患者に投与される。同様にある実施形態では、一つの第三の投与量のみが患者に投与される。他の実施形態では、二つ以上の第三の投与量が患者に投与される。

【0190】

複数の第二の投与量を含む実施形態では、各第二の投与量は、他の第二の投与量と同じ頻度で投与されてもよい。同様に、複数の第三の投与量を含む実施形態では、各第三の投与量は、他の第三の投与量と同じ頻度で投与されてもよい。あるいは第二および／または第三の投与量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過中に変化し得る。投与頻度も、臨床検査後の個々の患者のニーズに応じて、医師により治療経過中に調整されてもよい。

【0191】

診断用途
また本発明の二特異性抗体を使用して、例えば診断目的など、サンプル中のＣＤ２８もしくはＥＧＦＲ、またはＣＤ２８発現細胞もしくはＥＧＦＲ発現細胞を検出および／または測定してもよい。例えば、抗ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体、またはその抗原結合断片を使用して、ＣＤ２８またはＥＧＦＲの異常発現（例えば過剰発現、過小発現、発現の欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。ＣＤ２８またはＥＧＦＲに関する例示的な診断アッセイは、例えば患者から取得されたサンプルを、本発明の抗体と接触させることなどを含んでもよく、この場合において当該抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。あるいは標識されていない抗体が、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わされて、診断応用に使用され得る。検出可能な標識またはレポーター分子は、例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２ｐ、^３５Ｓ、もしくは^１２５Ｉなどの放射性同位体、例えばフルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光部分または化学発光部分、または例えばアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。サンプル中のＣＤ２８もしくはＥＧＦＲを検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。本発明によるＣＤ２８またはＥＧＦＲの診断アッセイにおいて使用され得るサンプルとしては、正常な状態または病的な状態で、検出可能な量のＣＤ２８タンパク質もしくはＥＧＦＲタンパク質またはその断片を含有する、患者から取得可能な任意の組織サンプルまたは液体サンプルが挙げられる。概して、健常な患者（例えば異常なＣＤ２８もしくはＥＧＦＲのレベルまたは活性と関連した疾患または状態に罹患していない患者）から取得された特定のサンプル中のＣＤ２８またはＥＧＦＲのレベルを測定して、基準もしくは標準的なＣＤ２８またはＥＧＦＲのレベルを最初に確立する。次にＣＤ２８またはＥＧＦＲの基準レベルを、ＣＤ２８またはＥＧＦＲに関連する疾患または状態を有すると疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたＣＤ２８レベルまたはＥＧＦＲレベルと比較してもよい。

【0192】

組み合わせ、および医薬製剤
本発明は、ＥＧＦＲｘＣＤ２８、および／または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、ならびに一つ以上の成分を含む組成物、ならびにそれらの使用方法、ならびに当該組成物の作製方法を提供する。本発明のＥＧＦＲｘＣＤ２８、または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬製剤（例えば、水を含む水性医薬製剤）は、本発明の一部である。

【0193】

本発明は、本発明の抗原結合分子を含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の剤とともに製剤化されてもよい。数多くの適切な製剤が、全ての薬剤師に公知の以下の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）を含有する（カチオン性またはアニオン性の）脂質、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油および油中水のエマルション、乳剤カルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固形混合物が挙げられる。またＰｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照のこと。

【0194】

例えば抗体およびその抗原結合断片などのＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ７０７５；ＲＥＧＮ６３２１；ＲＥＧＮ６３２２；ＲＥＧＮ６３２３、または本明細書に記載されるＣＤ２８抗体のいずれかに由来するＨＣＶＲとペア形成される抗ＥＧＦＲ ＨＣＶＲの任意の組み合わせ）の医薬製剤を調製するために、抗原結合タンパク質は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と混合される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８４）；Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。本発明のある実施形態では、医薬製剤は、滅菌されている。そのような組成物は、本発明の一部である。

【0195】

本発明の医薬製剤は、ＥＧＦＲｘＣＤ２８、または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、ならびに例えば水、緩衝剤、保存剤、および／または洗剤をはじめとする薬学的に許容可能な担体を含む。

【0196】

本発明の範囲は、例えば例えば抗体またはその抗原結合断片などのＥＧＦＲｘＣＤ２８、または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質を含む、例えば凍結乾燥など乾燥した組成物、または薬学的に許容可能な担体を含むが、実質的に水を含まないその医薬製剤を含む。

【0197】

様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシスなどが挙げられる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａＩ．，１９８７，Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。導入方法としては限定されないが、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が挙げられる。組成物は、例えば点滴またはボーラス注射、上皮層または皮膚粘膜層（例えば口腔粘膜、直腸粘膜、および腸管粘膜など）を介した吸収など、任意の簡便な経路により投与されてもよく、他の生物活性剤とともに投与されてもよい。投与は、全身または局所であり得る。

【0198】

本明細書において検討されるように、本発明は、本明細書のＥＧＦＲｘＣＤ２８もしくは抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的に許容可能な担体もしくは賦形剤を含むその医薬製剤のいずれかを含む容器（例えば、プラスチックまたはガラスバイアル）または注射用デバイス（例えば、シリンジ、プレ充填されたシリンジ、またはオートインジェクター）を提供する。

【0199】

本発明の医薬組成物は、標準的な針とシリンジを用いて皮下送達されてもよく、または静脈内送達されてもよい。さらに皮下送達に関しては、ペン送達デバイスが、本発明の医薬組成物の送達に容易に応用される。そのようなペン送達デバイスは、再利用可能であり、またはディスポーザブルであり得る。再利用可能なペン送達デバイスは一般的に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用している。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与され、カートリッジが空になった時点で、その空のカートリッジは容易に廃棄することができ、そして医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン送達デバイスは再利用されることができる。ディスポーザブルのペン送達デバイスの場合、交換可能なカートリッジはない。むしろディスポーザブルなペン送達デバイスが、医薬組成物でプレ充填されて販売されており、医薬組成物はデバイス内の貯蔵部に保持されている。貯蔵部の医薬組成物が空になった時点で、デバイス全体が廃棄される。

【0200】

多くの再利用可能な、およびディスポーザブルのペン送達デバイスならびにオートインジェクター送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達に応用される。例えば、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、英国ウッドストック）またはＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ社、イリノイ州アボットパーク）を参照のこと。

【0201】

ある状況下では、医薬組成物は、放出制御システムで送達され得る。一つの実施形態では、ポンプを使用してもよい（上記のＬａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施形態では、多量体性材料を使用してもよい。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照のこと。さらに別の実施形態では、放出制御システムを組成物の標的の近傍に配置してもよい。それに伴い、全身投与量のほんの一部のみで充分となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照のこと）。他の放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３によるレビューに検討されている。

【0202】

注射用調製物は、静脈内注射、皮下注射、皮内注射および筋肉内注射、静注点滴などのための剤形が含まれ得る。これら注射用調製物は、公的に知られている方法により調製され得る。例えば注射用調製物は、例えば注射に従来使用される無菌の水性媒体または油性媒体に、上述される抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。注射用の水性媒体としては、例えば生理食塩水、および適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る他の等張性溶液がある。注射用の油性媒体も、本発明の一部である。そのような油性媒体は、可溶化剤と混合され得る。

【0203】

上述の経口使用または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の投与量に適合した単位投与量の剤形に調製されることが有益である。そのような単位投与量の剤形としては例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射液（アンプル）、座薬などが挙げられる。前述の含有される抗体の量は、単位投与量の特に注射液の形態での剤形当たり、概して約０．１～約２０００ｍｇである。

【0204】

本発明は、一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わされた、本明細書に記載される例示的な抗体および二特異性抗原結合分子のいずれかを含む組成物および治療用製剤を含み、および当該組み合わせを、その必要のある対象に投与することを含む治療方法を含む。

【0205】

本発明の抗原結合分子と混合され得る、または関連付けられて投与され得る例示的な追加治療剤としては例えば、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、またはオキサリプラチンなどの抗癌化学療法剤）、放射線療法、ＰＤ－１（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブまたはセミプリマブ（米国特許第９，９８７，５００号を参照のこと）などの抗ＰＤ－１抗体）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびその他を標的とするチェックポイント阻害剤、例えばＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４－１ＢＢなどの分子を標的とする共刺激性アゴニスト二価抗体、他の共刺激性ＣＤ２８二特異性抗体、ならびに腫瘍関連抗原（例えばＭＵＣ１６（ムチン（ｍｕｃｉｎ）１６）、ＰＳＭＡ、またはＳＴＥＡＰ２）と例えばＣＤ３（ＭＵＣ１６ｘＣＤ３、ＰＳＭＡｘＣＤ３、またはＳＴＥＡＰ２ｘＣＤ３）に結合する多特異性（例えば二特異性）抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含む例示的な二特異性抗体としては限定されないが、例えばＷＯ２０１７／０５３８５６Ａ１、ＷＯ２０１４／０４７２３１Ａ１、ＷＯ２０１８／０６７３３１Ａ１、およびＷＯ２０１８／０５８００１Ａ１に記載されているものが挙げられる。ＥＧＦＲは、多様な癌において発現される。したがって本発明の二特異性抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体は、様々な癌の治療において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含む様々な二特異性抗体と組み合わされて使用することができる。

【0206】

本発明のさらなる実施形態では、ＥＧＦＲｘＣＤ２８、および／またはＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片と関連付けられて対象に投与されるさらなる治療剤は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；５７^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖ．１，２００２））に従って、または特定の剤とともに通常提供される承認済みの処方情報に従って対象に投与される。

【0207】

さらなる治療剤と関連付けて治療有効投与量のＥＧＦＲｘＣＤ２８および／または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質を投与することによる、治療または予防の必要のある対象におけるＥＧＦＲ発現癌の治療方法または予防方法は、本発明の一部である。

【0208】

「～と関連付けられる」という用語は、本発明の構成要素であるＥＧＦＲｘＣＤ２８、または抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片が、例えばセミプリマブなどのさらなる治療剤とともに、一つの組成物中に、例えば同時送達用に製剤化されることができ、または二つ以上の組成物（例えば当該構成要素を含むキット）中に別々に製剤化されることができることを示す。互いに関連付けられて投与される構成要素は、対象に、他の構成要素が投与されるときとは異なるときに投与されることができる。例えば各投与は、治療レジメンの一部として所与の期間を超える間隔で、同時ではなく（例えば別々に、または連続して）投与されてもよい。互いに関連付けられて投与される別個の構成要素は、同じ投与セッション中、本質的に同時ではあるが、連続して投与されてもよい。さらに互いに関連付けられて投与される別個の構成要素は、同じ経路で、または別の経路で対象に投与されてもよい。

【実施例0209】

以下の実施例は、当業者に、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示と説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。

【0210】

実施例１：抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体の構築
抗ＥＧＦＲ抗体の作製
抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖と、ユニバーサル軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、ＥＧＦＲ発現細胞株（Ａ４３１）をアジュバントとともに直接投与して免疫応答を刺激することにより取得された。すなわち、当該マウスで生成された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有している。

【0211】

抗体の免疫反応は、ＥＧＦＲ特異的免疫アッセイによりモニタリングされた。望ましい免疫応答が獲得されたときに、米国特許第７，５８２，２９８号に記載されるように、ミエローマ細胞と融合させることなく抗原陽性Ｂ細胞から抗ＥＧＦＲ抗体は直接単離された。

【0212】

表１は、本発明の選択された抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列の識別子は、表２に記載される。
表１：親ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のアミノ酸配列識別子

【表1】

表２：親ＥＧＦＲの核酸配列識別子モノクローナル抗体（ｍＡｂ）

【表2】

【0213】

抗ＣＤ２８抗体の作製
抗ＣＤ２８抗体は、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分と融合されたヒトＣＤ２８タンパク質を用いて、またはＣＤ２８を発現する細胞を用いて、またはＣＤ２８をコードするＤＮＡを用いて、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖とユニバーサル軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）を免疫化することにより取得された。

【0214】

抗体の免疫反応は、ＣＤ２８特異的免疫アッセイによりモニタリングされた。望ましい免疫応答が獲得されたときに、米国特許第７，５８２，２９８号に記載されるように、抗ＣＤ２８抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離された。

【0215】

表３は、本発明の選択された抗ＣＤ２８抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列の識別子は、表４に記載される。

【0216】

本実施例の方法にしたがって作製された例示的な抗ＣＤ２８抗体の特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
表３：親ＣＤ２８のアミノ酸配列識別子モノクローナル抗体（ｍＡｂ）

【表3】

表４：親ＣＤ２８抗体の核酸配列識別子

【表4】

【0217】

ＣＤ２８とＥＧＦＲに結合する二特異性抗体（ｂｓＡｂ）の作製
抗ＥＧＦＲ特異的結合ドメインと、抗ＣＤ２８特異的結合ドメインを含む二特異性抗体は、標準的な方法を使用して構築された。この場合において当該抗ＥＧＦＲ抗原結合ドメインと、当該抗ＣＤ２８抗原結合ドメインは各々、共通ＬＣＶＲとペア形成された異なる別個のＨＣＶＲを含む。一部の例では、二特異性抗体は、抗ＣＤ２８抗体の重鎖、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖、および共通軽鎖を利用して構築され、以下の表５、６、７および８に示される抗体をコードするアミノ酸および核酸の配列といった構成要素を含有する。ＥＧＦＲとＣＤ２８に結合する追加的な二特異性抗体は、表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示される名称を有する親モノクローナル抗体を使用して調製されてもよい。
表５：抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８二特異性抗体のＨＣＶＲアームに対する抗体名称の要約

【表5】

表６：抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８二特異性抗体のアミノ酸配列

【表6】

表７：抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８二特異性抗体をコードする核酸配列

【表7】

表８．二特異性抗体ｂｓＡｂ７０７５、ｂｓＡｂ６３２１、ｂｓＡｂ６３２２、およびｂｓＡｂ６３２３の全長免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列とヌクレオチド配列

【表8】

D＝指定配列をコードするDNAのヌクレオチド配列
P＝指定配列のポリペプチドのアミノ酸
数は、指定配列の配列番号を指す。
HCは、指定抗体の全長重鎖である。
LCは、指定抗体の全長軽鎖である。

【0218】

親ＥＧＦＲ抗体由来の一つのＨＣＶＲと、親ＣＤ２８抗体由来の他のＨＣＶＲアームを含む追加的な二特異性抗体が、本明細書に記載される技術を使用して作製されてもよい。これら追加的な抗ＥＧＦＲ Ｘ 抗ＣＤ２８二特異性抗体を作製するために使用される親ＥＧＦＲ抗体は、ＷＯ２０１４／００４４２７に記載されるＨＣＶＲ配列を有する。これら追加的な抗ＥＧＦＲ Ｘ 抗ＣＤ２８二特異性抗体を作製するために使用される親ＣＤ２８抗体は、表３に上述されるアミノ酸配列を有する。これら抗ＥＧＦＲおよび抗ＣＤ２８結合ドメイン（ペア形成）は、以下の表９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示される。
表９Ａ：抗ＥＧＦＲ ｘ 抗ＣＤ２８の追加的二特異性抗体のＨＣＶＲアームに対する親抗体名称の要約

【表9A-1】

【表9A-2】

表９Ｂ：抗ＥＧＦＲｘ抗ＣＤ２８の追加的二特異性抗体のＨＣＶＲアームに対する親抗体名称の要約

【表9B】

表９Ｃ：抗ＥＧＦＲ ｘ 抗ＣＤ２８の追加的二特異性抗体のＨＣＶＲアームに対する親抗体名称の要約

【表9C】

【0219】

以下の実施例に記載される二特異性抗体は、ヒト可溶性ヘテロ二量体ｈＣＤ２８タンパク質、およびヒトＥＧＦＲに結合することが判明している結合アームからなる（以下のＢｉａｃｏｒｅ結合データを参照のこと）。例示される二特異性抗体は、２０１４年８月２８日に公開された米国特許出願公開第２０１４０２４３５０４Ａ１号に記載される改変（キメラ）ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有するよう改変された。

【0220】

本実施例に従い生成された二特異性抗体は、二つの別個の抗原結合ドメイン（すなわち結合アーム）を含む。第一の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２８抗体に由来する重鎖可変領域（ＣＤ２８－ＶＨ）を含み、第二の抗原結合ドメインは、抗ＥＧＦＲ抗体に由来する重鎖可変領域（ＥＧＦＲ－ＶＨ）を含む。抗ＥＧＦＲと抗ＣＤ２８の両方とも、共通軽鎖を共有する。ＣＤ２８－ＶＨ／ＥＧＦＲ－ＶＨのペア形成によって、Ｔ細胞上のＣＤ２８と、腫瘍細胞上のＥＧＦＲを特異的に認識する抗原結合ドメインが生成される。

【0221】

ＣＤ２８とＥＧＦＲに結合する二特異性抗体の特徴解析
ＳＰＲ反応速度法：反応速度法の結合パラメーターは、Ｔ－２００装置およびＣＭ５センサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定された。二重参照（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）センサーグラムを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ（ＢｉｏＬｏｇｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して１：１の結合モデルに広く適合させた。解離速度定数（ｋｄ）は、解離フェーズ中の結合反応における変化を適合させることにより決定され、結合速度定数（ｋａ）は、異なる濃度での分析物の結合を適合させることにより決定された。Ｋ_Ｄは、ｋｄとｋａの比率から計算された。解離半減期（ｔ１／２）は、ｌｎ２／ｋｄとして計算されて、分単位に転換された。

【0222】

ＥＧＦＲ特定法：抗ｈＦｃモノクローナルＡｂ（ＲＥＧＮ２５６７）は、従来的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学法を使用してＣＭ５センサー表面にカップリングされた。２００～２５０ＲＵのＥＧＦＲｘＣＤ２８ Ａｂが、この表面上に捕捉された。３０ｎＭで始まる６点の３倍希釈のｈＥＧＦＲ．ｍｍＨを、５分間、５０ｕＬ／分の流速でこの表面上に注入した。表面は、２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４の１０秒間のパルスで再生された。解離は１０分間測定された。センサーグラムが処理され、上述のように適合された。

【0223】

ＣＤ２８捕捉方法の詳細：抗ｍＦｃポリクローナルＡｂ（ＧＥ）は、従来的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学法を使用してＣＭ５センサー表面にカップリングされた。約３０ＲＵのｈＣＤ２８．ｍＦｃがこの表面上に捕捉された。９０ｎＭで始まる６点の３倍希釈のＥＧＦＲｘＣＤ２８ Ａｂを、４分間、５０ｕＬ／分の流速でこの表面上に注入した。解離は５分間測定された。表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を４０秒間注入して再生された。センサーグラムが処理され、上述のように適合された。

【0224】

Ｂｉａｃｏｒｅ解析は、ＥＧＦＲｘＣＤ２８が、約９．３Ｅ－１０のＫ_ＤでｈＥＧＦＲに結合したこと、および約５．２Ｅ－０８のＫ_ＤでｈＣＤ２８に結合したことを示した（表１０および１１）。
表１０：ＥＧＦＲへの結合に関するＢｉａｃｏｒｅ反応速度

【表10】

表１１：ＣＤ２８への結合に関するＢｉａｃｏｒｅ反応速度

【表11】

【0225】

次にヒトＴ細胞含有末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とＰＥＯ－１の共培養を使用して、ＥＧＦＲｘＣＤ２８が細胞障害活性とＴ細胞活性化を誘導する能力を検証した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健康なドナーの白血球パックから単離された。ＰＢＭＣ単離は、５０ｍＬ ＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブをメーカーの推奨プロトコールに従い使用した密度勾配遠心分離法により行われた。簡潔に述べると、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ ＰＬＵＳを、５０ｍＬ ＳｅｐＭａｔｅチューブ内に層状にして、次いでＤ－ＰＢＳで１：２希釈された３０ｍＬの白血球を加えた。その後の工程は、ＳｅｐＭａｔｅのメーカープロトコールに従った。その後、ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キットをメーカーの推奨説明書に従い使用してＰＢＭＣから単離された。単離されたＣＤ３＋ Ｔ細胞は、１バイアル当たり５０×１０^６細胞の濃度で１０％ ＤＭＳＯ含有ＦＢＳ中に凍結された。

【0226】

ＥＧＦＲｘＣＤ２８は、ＭＵＣ１６ｘＣＤ３によるＴ細胞の腫瘍細胞殺傷の誘導能力（データは示さず）を、１８．８％から７１．５％へと著しく上昇させた（図１Ｃ）。このＴ細胞の細胞殺傷の強化と一致して、ＥＧＦＲｘＣＤ２８は、ＣＤ２５発現とＩＦＮγサイトカイン放出により評価した場合のＴ細胞の活性化も強化した（図１Ｄおよび１Ｅ）。注目すべきは、非標的化ＣＤ３結合対照の存在下（「シグナル１」の非存在下）でのＥＧＦＲｘＣＤ２８は、Ｔ細胞の細胞傷害性にも活性化にも作用しなかったことである（図１Ｃ～１Ｅ）。

【0227】

実施例２：腫瘍細胞上の天然ＣＤ２８リガンドの過剰発現は、ＰＤ－１ ｍＡｂ治療との相乗効果を発揮して、インビボでのＣＤ８ Ｔ細胞依存性の長期的な抗腫瘍活性を誘導する。
ＣＤ２８と、その天然リガンドの結合は、インビボでＰＤ－１ ｍＡｂの抗腫瘍効果を強化することができるかを判定するために、ＭＣ３８腫瘍細胞を操作して、ＣＤ２８の共刺激性リガンドの一つであるＣＤ８６を過剰発現させた。具体的には、共刺激性リガンドを発現するよう操作された腫瘍細胞株を作製するために、マウスＣＤ８６または空のベクター、およびピューロマイシン抵抗性遺伝子（それぞれ、（ｐＬＶＸ．ＥＦ１ａ．ＣＤ８６－ｐｕｒｏおよびｐＬＶＸ．ＥＦ１ａ．ＥＶ－ｐｕｒｏ）をコードする、ＥＦ１ａプロモーターを有するｐＬＶＸレンチウイルスプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ウイルス粒子の産生を促進した。次にこれを使用して、ＭＣ３８（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を感染させた。ＣＤ８６を発現する操作細胞株は、蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）により単離した。ＡＴＣＣの推奨条件下、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で細胞を維持した。得られた細胞株は、ＭＣ３８／ＣＤ８６およびＭＣ３８／ＥＶと指定した。

【0228】

ＭＣ３８／ＣＤ８６細胞と、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ治療の組み合わせは、腫瘍増殖を有意に阻害し（図２Ａ）、空ベクター対照をトランスフェクトされた陰性対照のＭＣ３８（ＭＣ３８－ＥＶ）と比較して、安定的な生存利益が得られたことと関連して、完全な腫瘍退縮がもたらされた（図２Ｂ）。治療経過中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の枯渇は、ＭＣ３８／ＣＤ８６と抗ＰＤ－１ ｍＡｂ治療の併用により惹起された抗腫瘍効果を完全に消滅させたことから、ＣＤ８^＋Ｔ細胞への依存性が示された（図２Ｃ）。注目すべきは、最初にＭＣ３８／ＣＤ８６を移植され、抗ＰＤ－１ ｍＡｂで治療された無腫瘍マウスは、初回の腫瘍移植から６０日よりも後に移植された２回目のＭＣ３８親腫瘍を拒絶したことであり、このことからＴ細胞メモリー応答の存在が示唆される（図２Ｄ）。結論として、これらのデータから、ＣＤ２８リガンドの構成的発現と抗ＰＤ－１治療の相乗効果によって、インビボで長期的なＣＤ８依存性の抗腫瘍免疫がもたらされ得ることが示される。

【0229】

実施例３：抗ＰＤ－１抗体と併用されたＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体の投与は、マウスヒトの腫瘍異種移植片を制御し、排除した。Ｖ_Ｈは、ヒトＣＤ３４^＋幹細胞が生着された。
ＰＤ－１ブロッキングＡｂ（ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）、Ｅ．Ｂｕｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－ＰＤ－１
Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＲＥＧＮ２８１０ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ Ｋｎｏｃｋ－Ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １６，８６１－８７０（２０１７））と併用されたＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体の有効性が、ヒト腫瘍異種移植片モデルを使用して検証された。ヒト免疫細胞群の生着は、ＦＡＣＳにより実証された（図３Ａ）。Ａ４３１類表皮癌腫の腫瘍細胞（ＡＴＣＣから取得）を、胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞が生着したＳＩＲＰＡ^ｈ／ｈ ＴＰＯ^ｈ／ｍ Ｒａｇ２^－／－ Ｉｌ２ｒｇ^－／－に皮下移植した。マウスは、胎児肝臓のドナー、ヒト免疫細胞の生着頻度および性別に基づき、４群に分けられた。マウスは、移植当日（０日）に始まり、１週当たり２回、アイソタイプ対照、５ｍｇ／ｋｇのＥＧＦＲｘＣＤ２８、１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１、またはその併用が腹腔内注射で投与された。その後、実験期間中、２～３日おきに抗体注射が投与された。腫瘍は二次元（長さｘ幅）で測定され、腫瘍体積が計算された（長さｘ幅^２ｘ０．５）。腫瘍が指定される腫瘍エンドポイント（腫瘍体積＞２０００ｍｍ^３または腫瘍潰瘍形成）に到達したときに、マウスは安楽死された。

【0230】

Ａ４３１腫瘍細胞上のＥＧＦＲおよびＰＤ－Ｌ１の発現は、ＦＡＣＳにより実証された（図３Ｂ）。各群は、腫瘍チャレンジの当日に始まり、以下を用いて腹腔内（ＩＰ）で治療された：
（１）１０ｍｇ／ｋｇ ヒトアイソタイプ対照Ｎｏ．１＋５ｍｇ／ｋｇ ヒトアイソタイプ対照Ｎｏ．２
（２）１０ｍｇ／ｋｇ 抗ヒトＰＤ－１（ＲＥＧＮ２８１０、セミプリマブ）＋５ｍｇ／ｋｇ ヒトアイソタイプ対照Ｎｏ．２
（３）５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）＋１０ｍｇ／ｋｇ ヒトアイソタイプ対照Ｎｏ．１、または
（４）５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）＋１０ｍｇ／ｋｇ 抗ヒトＰＤ－１（ＲＥＧＮ２８１０）。その後、実験期間中、１週当たり２回、抗体注射が投与された。腫瘍は二次元（長さｘ幅）で測定され、腫瘍体積が計算された（長さｘ幅^２ｘ０．５）。腫瘍が指定される腫瘍エンドポイント（腫瘍体積＞２０００ｍｍ^３または腫瘍潰瘍形成）に到達したときに、マウスは安楽死された。
アイソタイプ対照Ｎｏ．１およびアイソタイプ対照Ｎｏ．２は、Ｆｅｌ ｄ１に結合する陰性対照抗体である。

【0231】

各処置群における経時的なＡ４３１腫瘍のサイズを、図４に記載する。抗ＰＤ－１と併用されたＥＧＦＲｘＣＤ２８は、ヒト化マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を相乗効果的に制御し、排除した。ＥＧＦＲｘＣＤ２８の単剤療法は、腫瘍の増殖を有意に遅延させることができ、抗ＰＤ－１ Ａｂとの併用はさらに腫瘍の進行を阻害した。対照のＰＳＭＡｘＣＤ２８ Ａｂを同じ治療設定で使用した場合、抗ＰＤ１治療と併用してもしなくても、腫瘍増殖阻害は観察されなかった（図５）。Ａ４３１腫瘍細胞上にＰＳＭＡは発現していないことは、ＦＡＣＳにより実証された（図６）。

【0232】

これらのデータから、抗ＰＤ１単剤療法では限定的な抗腫瘍応答であり、抗ＥＧＦＲ単剤療法では部分的な抗腫瘍応答であったが、併用療法では強力で安定的な抗腫瘍免疫応答があったことが示された。

【0233】

実施例４：単剤療法としてのＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体の投与は、ヒトＰＢＭＣ細胞が生着したＮＳＧマウスにおいて、ヒトＡ４３１腫瘍異種移植片を制御し、排除した。
Ａ４３１類表皮癌腫の腫瘍細胞（ＡＴＣＣから取得）を、ヒトＰＢＭＣと混合し、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ^ｎｕｌｌ）の皮下に移植した。マウスを、予防的（０、３、７日目に治療）または治療的（３、７、１０日目）のいずれかのプロトコールで処置した。

【0234】

予防的プロトコールについて、マウスは４つの処置群に分けられた。各群は、以下を用いて腹腔内（ＩＰ）処置された：
（１）５ｍｇ／ｋｇ 対照Ａｂ ＥＧＲｖＩＩＩｘＣＤ３（ｂｓ１７６６４Ｄ）
（２）５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）
（３）０．５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）
（４）０．０５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）

【0235】

治療的プロトコールについて、マウスは３つの処置群に分けられた。各群は、以下を用いて処置された：
（１）５ｍｇ／ｋｇ 対照Ａｂ ＥＧＲｖＩＩＩｘＣＤ３（ｂｓ１７６６４Ｄ）
（２）５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）
（３）０．０５ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）

【0236】

腫瘍は二次元（長さｘ幅）で測定され、腫瘍体積が計算された（長さｘ幅^２ｘ０．５）。腫瘍が指定される腫瘍エンドポイント（腫瘍体積＞２０００ｍｍ^３または腫瘍潰瘍形成）に到達したときに、マウスは安楽死された。

【0237】

各処置群で処置されたマウスの平均腫瘍サイズを、図７Ａおよび７Ｂに要約する。これらのデータから、予防的処置では、強力な抗腫瘍応答が検証された３つ全ての投与量で観察されたが、応答は、治療的処置での完全性よりは低かった。

【0238】

実施例５：単剤療法としてのＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体の投与は、ヒトＰＢＭＣ細胞が生着したＮＳＧマウスにおいて、ヒトＡ５４９腫瘍異種移植片を制御し、排除した。
Ａ５４９肺腺癌腫の腫瘍細胞（ＡＴＣＣから取得）を、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ^ｎｕｌｌ）に０日目で皮下移植した。ヒトＰＢＭＣは、３日目に腹腔内生着させた。マウスは４つの処置群に分けられた。各群は、以下を用いて腹腔内（ＩＰ）処置された：
（１）１０ｍｇ／ｋｇ 対照Ａｂ ＥＧＲｖＩＩＩｘＣＤ３（ｂｓ１７６６４Ｄ）
（２）１ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）
（３）１０ｍｇ／ｋｇ ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）

【0239】

Ａｂ処置は、１５、２２および２９日目に投与された。腫瘍は二次元（長さｘ幅）で測定され、腫瘍体積が計算された（長さｘ幅^２ｘ０．５）。腫瘍が指定される腫瘍エンドポイント（腫瘍体積＞２０００ｍｍ^３または腫瘍潰瘍形成）に到達したときに、マウスは安楽死された。

【0240】

各処置群で処置されたマウスの平均腫瘍サイズを、図８に要約する。生着腫瘍を用いた治療的処置の状況下で、有意な用量依存性の抗腫瘍応答が観察された。

【0241】

実施例６：ＥＧＦＲｘＣＤ２８共刺激性二特異性抗体は、ＣＤ２８＋およびＥＧＦＲ＋細胞に結合する。
フローサイトメトリー解析を利用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２８＋細胞）およびＰＥＯ１細胞（ＥＧＦＲ＋細胞）に対するＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ６３２３）の結合が判定された。各細胞型への抗体の結合が観察された。図１Ａおよび１Ｂを参照のこと。

【0242】

内生的にＥＧＦＲを発現する細胞株（ＰＥＯ１、ＥＧＦＲ^＋）を、１μＭのＶｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで標識し、３７℃で一晩置いた。それとは別にヒトＰＢＭＣ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）またはカニクイザルのＰＢＭＣ（Ｃｏｖａｎｃｅ社、ニュージャージー州クランフォード）を、１ｘ１０^６細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地に播種し、３７℃で一晩インキュベートして、付着マクロファージ、樹状細胞、および一部の単球を激減させることによりリンパ球を富化させた。翌日、標的細胞を、付着細胞激減ナイーブヒトＰＢＭＣ（エフェクター／ターゲット細胞は４：１の比率）、および単独または固定濃度（２．５μｇ／ｍｌ）のＴＳＡｘＣＤ２８二特異性物質と組み合わされたＴＳＡｘＣＤ３または非標的化ＣＤ３系二特異性物質のいずれかの連続希釈とともに３７℃で９６時間共インキュベートした。無酵素細胞解離緩衝液を使用して細胞培養プレートから細胞を取り出し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析した。

【0243】

ＦＡＣＳ解析について、細胞は、ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｆａｒ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色され、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５（ＢＤ社）に対する抗体と直接結合された。細胞計数のために、較正ビーズとともにサンプルに解析が行われた。殺傷の特異性を評価するために、標的細胞は、Ｖｉｏｌｅｔ ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ陽性群としてゲーティングされた。生きている標的細胞の百分率は、以下のように計算された：生細胞％＝（Ｒ１／Ｒ２）＊１００、式中、Ｒ１＝抗体存在下での生きている標的細胞％、およびＲ２＝被験抗体の非存在下での生きている標的細胞％。Ｔ細胞活性化は、ＣＤ２^＋／ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ２^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞のうちの活性化（ＣＤ２５^＋）Ｔ細胞の百分率により測定された。Ｔ細胞数は、較正ビーズ当たりの生きているＣＤ４^＋細胞またはＣＤ８^＋細胞の数を計算することにより測定された。

【0244】

培地中に蓄積されたサイトカインのレベルは、メーカーのプロトコールに従い、ＢＤ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキットを使用して解析された。

【0245】

実施例７：腫瘍内Ｔ細胞クラスターの解析。
Ａ４３１腫瘍異種移植片モデルにおいて、ヒトＴ細胞の活性化に対し、処置が大きな影響を与えたか否かを検証するために、腫瘍内Ｔ細胞がプロファイリングされた。ＣＩＴＲＵＳ（クラスターの特定、特徴解析および回帰：ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）は、統計的に有意に異なるＴ細胞クラスターを独立して階層化する方法であり、この方法を使用して、単一処置または併用処置を行った際の応答性ヒトＣＤ８＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞クラスターを特定した。

【0246】

インビボ実験のフローサイトメトリー解析については、腫瘍が採取され、単一細胞懸濁液が調製されて、赤血球がＡＣＫ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して溶解された。生／死細胞の識別は、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ
ｆｉｘａｂｌｅ ｂｌｕｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して実施された。サンプルは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で獲得され、Ｃｙｔｏｂａｎｋソフトウェア（Ｃｙｔｏｂａｎｋ社、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して解析された。解析は、１サンプル当たり、等しい数のイベントを用いて実施された。イベントの範囲は、最も少ないイベントが取得されたサンプルにより決定された。特定のマーカーに基づきＴ細胞を自動的にクラスター化するため、Ｃｙｔｏｂａｎｋ社のＣＩＴＲＵＳ解析を使用した。

【0247】

ＥＧＦＲｘＣＤ２８（ＲＥＧＮ７０７５）および抗ＰＤ－１ Ａｂ（セミプリマブ）の両方の単剤処置が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞クラスターＣ１を減少させた。当該クラスターは、高レベルのＰＤ－Ｌ１とＩＣＯＳを発現している（図９Ａおよび９Ｂを参照のこと）。ＰＤ－１単独遮断は高活性化の表現型（高レベルのＣＤ２、ＣＤ８６、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴおよびＩＣＯＳ）を伴うＣＤ８＋ Ｔ細胞クラスターＣ２の拡張を安定的に誘導した。驚くべきことに、より多様なＣＤ４＋ Ｔ細胞クラスターが、単剤処置または併用処置に応答したことが観察された（図９Ｃおよび９Ｄ）。併用処置のみが、エフェクターメモリー様の表現型が増殖したクラスターＣ２を有意に拡張させて（高Ｋｉ６７、低ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７）、疲弊エフェクターメモリー様クラスターＣ３はあまり拡張させなかった（低ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞と同様に、併用処置が、高レベルのＰＤＬ１発現を伴うクラスターＣ１を有意に減少させた。ＰＤ－１遮断の単剤療法は、より活性化した表現型を象徴する、高レベルのＣＤ３８発現（Ｃ４）を伴うエフェクターメモリー細胞の拡張を誘導した。ＥＧＦＲｘＣＤ２８単剤療法は、腫瘍において、小群のナイーブ様ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｃ５）を維持したが、抗ＰＤ１ Ａｂ処置を行うことでさらにプライミング／活性化される可能性がある。

【0248】

これらのデータからは、ヒト化マウスにおけるヒト異種移植片腫瘍モデルは、単剤療法として、およびＰＤ－１遮断薬との併用でのＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体を検証するための強力なプラットフォームを提供したことが示される。高次ＦＡＣＳ解析、および完全自動化クラスター形成識別法を使用して、ヒト免疫系を再構成されたマウスにおける、基盤免疫メカニズムの詳細解析が可能となる。ＰＤ１遮断単独で活性化表現型を有するＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の強固な拡張の誘導が可能であるが、メモリー発達を促進し、顕著な腫瘍阻害を誘導するには不充分であった。ＥＧＦＲｘＣＤ２８処置と組み合わせることで、バランスの取れたＴ細胞の活性化状態が獲得され、強固な抗腫瘍応答が誘導され得る。

【0249】

実施例８：ＥＧＦＲｘＣＤ２８の単独、または抗ＰＤ１療法との併用は、カニクイザルにおいて、ＣＤ２８スーパーアゴニストと比較し、全身的なＴ細胞の活性化は誘導しない。
ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性物質（ＲＥＧＮ７０７５）単独での忍容性を評価するために、または抗ＰＤ１抗体との併用における相乗的な薬理作用の可能性について評価するために、カニクイザルの試験を実施した。一つの処置群当たり三匹のサルに、ＥＧＦＲｘＣＤ２８の単独、またはＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用での単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）を、静脈内点滴を介して投与した（併用群では連続点滴を与えた）。

【0250】

カニクイザル試験は、ＩＡＣＵＣガイドラインに準拠して実施された。ＥＧＦＲｘＣＤ２８を用いた試験に関して、メスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をＳＮＢＬ ＵＳＡで実施した（実験動物管理公認協会（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ、ＡＡＡＬＡＣ）により認定を受け；実験動物福祉局（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ、ＯＬＡＷ）により公表された動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ）；米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、ＵＳＤＡ）および実験動物委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）に登録される）。フローサイトメトリーに関しては、拘束され意識のある動物の末梢血管から、ＥＤＴＡカリウム管に血液を採取した。１００μｌの全血を、指定抗体で染色した。フローサイトメトリーデータの取得は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを使用して実施された。個々の群の絶対数は、以下の式に従い、親／祖父母の群のゲーティングから導かれる相対パーセンテージ、および認証済みの血液分析器からの親／祖父母群の総数から計算された：群の絶対数（ｘ１０^３／μＬ）＝（群の相対割合％ｘ親／祖父母群の総数）／１００。血清サイトカインに関しては、血液は、抗凝固剤を含む血清分離器に採取された。血清は、４℃に設定された遠心分離機で遠心分離により分離された。ＭＳＤ Ｕ－Ｐｌｅｘプラットフォームを使用して解析された（ＩＬ－２、４、６、８、１０、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）。

【0251】

毒性評価は、臨床観察、定性的な食物摂取、体重およびバイタルサイン（体温、心拍、パルスオキシメトリー、および呼吸数）、ならびに実験完了時の臨床的および解剖学的な病理所見に基づいた。サイトカイン解析およびＦＡＣＳ免疫表現型解析のために血液サンプルが採取された。単独、またはセミプリマブとの併用でのＥＧＦＲｘＣＤ２８は忍容性良好であり、全ての動物が予定された剖検時まで生存した。被験物質に関連した臨床観察事項は認められなかった（データは示さず）。臓器重量の変化は認められず、最終剖検時にも肉眼的変化は何も記録されなかった（データは示さず）。さらに有意なサイトカイン放出、Ｔ細胞の周縁化または活性化も観察されなかった（図１０Ａ～１０Ｃ）。対照的に、ＣＤ２８「スーパーアゴニスト」の投与を受けたサルにおいて、有意なサイトカイン放出、リンパ球周縁化、およびＴ細胞の活性化が認められた（データは示さず）。ＥＧＦＲｘＣＤ２８を単独、またはセミプリマブと併用して投与されたサルには、有意な処置関連の組織学的変化は認められなかった。

【0252】

実施例９．ＥＧＦＲＸＣＤ２８二特異性抗体（ＲＥＧＮ７０７５）と抗ＰＤ－１抗体（ＲＥＧＮ２８１０）の併用療法により介在される、用量依存性の抗腫瘍応答
材料と方法
ＮＣＩ－Ｈ２９２

【0253】

ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞株は、３２歳の女性患者から単離されたヒト粘膜表皮肺癌の細胞株である（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８４８）。当該細胞株は、ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン）を補充された１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０中に維持された。

【0254】

末梢血単核球（ＰＢＭＣ）
ヒトＰＢＭＣは、ＲｅａｃｈＢｉｏ社、カタログ番号０５００－４０１から取得され、ドナー番号０１９０２０５を本試験で使用した。

【0255】

腫瘍試験に使用した手順：
メスのＮＳＧマウス（約１０週齢）を本実験に使用した。マウスに、２ｘ１０^６個のＰＢＭＣと混合された４ｘ１０^６個の腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍増殖は、試験期間中、週に二回、ノギスによりモニタリングした。表１２に指定される抗体を、単剤療法または併用療法で腹腔内注射により規定用量で、腫瘍移植後の指定日に投与した。実験は、ＩＡＣＵＣ基準に従い、マウスが潰瘍化腫瘍となったとき、または腫瘍体積が１５００ｃｍ^３を超えたときに終了した。統計解析を表１３に示す。データは、図１１および１２に要約される。
表１２－試験デザイン

【表12】

アイソタイプ対照No.1およびアイソタイプ対照No.2は、Feld1に結合する陰性対照抗体である。
REGN7075は、抗EGFRＸCD28二特異性抗体であり、bsAb7075とも呼称される。
REGN2810は、抗PD-1抗体である。

表１３：３２日目の統計解析：混合効果モデル（ＲＥＭＬ）解析

【表13-1】

【表13-2】

【0256】

要約
図１１および１２に示されるように、データから、本モデルで検証した場合、いずれか抗体を単独で使用したときに取得された結果と比較して、ＲＥＧＮ７０７５（抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８）を抗ＰＤ－１抗体（ＲＥＧＮ２８１０）と組み合わせたときに最も強固な抗腫瘍応答が観察されたことが示された。

【0257】

実施例１０Ａ：ＲＥＧＮ６３２３を使用したフローサイトメトリー結合力価測定
フローサイトメトリー解析を利用して、数種の癌細胞株（Ａ３７５、２２ＲＶ１、ＰＥＯ１、ＣＡＰＡＮ２、ＳＷ１９９０、Ｈ２９２）、ヒトおよびカニクイザルのＴ細胞、ならびにＪｕｒｋａｔ細胞に対する抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗体の結合を判定し、標識抗ヒト二次ＩｇＧ抗体を用いて検出した。簡潔に述べると、１ｘ１０^５細胞／ウェルを、連続希釈したＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体または対照抗体（ヒトまたはカニクイザルのＣＤ２８に対する交差反応性が無いヒト抗原に結合するヒトＩｇＧ４抗体）とともに４℃で３０分間インキュベートした。当該抗体は、ヒトおよびカニクイザルのＴ細胞に対しては１００ｎＭ～１．５ｐＭの範囲、ＥＧＦＲ発現細胞に対しては１３３ｎＭ～２ｐＭの範囲であった。インキュベーション後、１％ろ過ＦＢＳを含有する冷却ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、フルオロフォア結合抗ヒト二次抗体を細胞に添加してさらに３０分間インキュベートした。生／死色素を、ヒトおよびカニクイザルのＴ細胞インキュベーション物に添加した。被験抗体を含まず、二次抗体のみを含むウェルを対照として使用した。

【0258】

ＥＧＦＲ発現細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、１％ろ過ＦＢＳを含有する冷却ＰＢＳ ２００μＬ中に再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩのフローサイトメトリーにより解析した。

【0259】

ヒトまたはカニクイザルのＴ細胞とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液中、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８抗体のカクテルを用いてさらに２０分間、４℃のインキュベーションで染色した。洗浄後、細胞を、１％ろ過ＦＢＳを含有する冷却ＰＢＳ ２００μＬ中に再懸濁し、生／ＣＤ２＋／ＣＤ４＋／ＣＤ１６－または生／ＣＤ２＋／ＣＤ８＋／ＣＤ１６－でゲーティングし、ＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でフローサイトメトリーにより解析した。

【0260】

フローサイトメトリー結合力価測定の結果（表１４Ａおよび１４Ｂ、ならびに図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃを参照のこと）
ヒトＴ細胞およびカニクイザルＴ細胞の表面に対する抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗体（ＲＥＧＮ６３２３）の結合は、フローサイトメトリーにより上述のように検証された。結果から、ＲＥＧＮ６３２３はヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に結合したこと、選択された濃度範囲内では飽和に到達しなかったことが示された（図１３Ａ）。

【0261】

ＥＧＦＲを発現する他の細胞株の表面に対する抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗体（ＲＥＧＮ６３２３）の結合も、フローサイトメトリーにより検証された。使用された細胞株は、ヒトＴリンパ球細胞の不死化株であるＪｕｒｋａｔ細胞（図１３Ｃを参照）、上皮メラノーマ細胞株であるＡ３７５細胞、上皮前立腺癌である２２ＲＶ１細胞、腹水に由来する卵巣癌細胞株であるＰＥＯ１細胞、膵臓腺癌細胞株であるＣＡＰＡＮ２、転移部位（脾臓）に由来する膵臓腺癌であるＳＷ１９９０、肺上皮癌細胞株であるＨ２９２であった。結果から、ＲＥＧＮ６３２３は、Ａ３７５に、１．４８Ｅ－０９ＭのＥＣ５０で結合したことが示された。ＲＥＧＮ６３２３は、２２ＲＶ１に、５．５４Ｅ－１０ＭのＥＣ５０で結合した。ＲＥＧＮ６３２３は、ＰＥＯ１に、６．６７Ｅ－１０のＥＣ５０で結合した。ＲＥＧＮ６３２３は、ＣＡＰＡＮ２に、１．２９Ｅ－０９ＭのＥＣ５０で結合した。ＲＥＧＮ６３２３は、ＳＷ１９９０に、２．９６Ｅ－０９ＭのＥＣ５０で結合した。またＲＥＧＮ６３２３は、Ｈ２９２細胞に、６．７４Ｅ－１０のＥＣ５０で結合した（図１３Ｂを参照のこと）。

【0262】

アイソタイプ対照抗体は、ヒトまたはカニクイザルのＴ細胞にいずれも結合せず、そしてＥＧＦＲを発現する細胞株にも結合しなかった。

【0263】

これらのデータから、ＲＥＧＮ６３２３は、ＥＧＦＲを発現する様々な癌細胞株に結合する能力を有すること、したがって複数の癌症状の治療に有効であり得ることが示唆される。

【0264】

実施例１０Ｂ：ＲＥＧＮ６３２１およびＲＥＧＮ６３２２を使用したフローサイトメトリー結合力価測定
他の抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８二特異性抗体も、複数の細胞株に対する結合を呈し得るかを判定するための実験も行われた。上述のプロトコールに従い、ＲＥＧＮ６３２１およびＲＥＧＮ６３２２を、同様の方法で検証した。ＲＥＧＮ６３２３も本試験に含めた。

【0265】

図１３Ｃに示されるように、結果から、ＲＥＧＮ６３２１、ＲＥＧＮ６３２２、およびＲＥＧＮ６３２３が、前立腺癌株２２ＲＶ１、ならびに卵巣癌細胞株であるＰＥＯ１という名称の細胞株に対する結合を呈することが示された。これらの結果から、これら追加の抗ＥＧＦＲＸ抗ＣＤ２８抗体も、ＥＧＦＲを発現する他の癌細胞株に結合する能力を有することが示された。
表１４：様々なＥＧＦＲＸＣＤ２８二特異性抗体を用いたフローサイトメトリー結合試験の要約

【表14-1】

【表14-2】

NC：EC50は計算されず：NT：検証されていない抗体。

【0266】

実施例１１：フローサイトメトリーにより測定される細胞毒性
抗ＴＳＡ Ｘ 抗ＣＤ３抗体およびＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体の組み合わせの存在下での、様々なサイズの腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を発現する細胞の殺傷をモニタリングするために、２２ＲＶ１（ＰＳＭＡ＋、ＳＴＥＡＰ２＋）細胞、またはＰＥＯ１（ＭＵＣ１６＋）細胞、またはＣＡＰＡＮ２（ＭＵＣ１６＋）細胞、またはＳＷ１９９０（ＭＵＣ１６＋）細胞、またはＨ２９２（ＭＵＣ１６＋）細胞を、１μＭの蛍光トラッキング色素のＶｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで標識した。標識後、細胞を３７℃で一晩静置した。それとは別にヒトＰＢＭＣを、１ｘ１０^６細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地中に播種して一晩、３７℃でインキュベートし、付着マクロファージ、樹状細胞および一部の単球を激減させることによりリンパ球を富化させた。翌日、標的細胞は、付着細胞激減ナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞が４：１の比率）、連続希釈された標的化ＴＳＡｘＣＤ３二特異性抗体、または対照ＴＳＡｘＣＤ３二特異性抗体（濃度範囲は、６６．７ｎＭ～０．２ｐＭ）、および固定濃度のＥＧＦＲｘＣＤ２８共刺激性分子ＲＥＧＮ６３２３を２．５ｕｇ／ｍｌ（１６．７ｎＭ）とともに３７℃で９６時間、共インキュベートした。トリプシン－ＥＤＴＡ解離緩衝液を使用して細胞を細胞培養プレートから取り出し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でフローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリー解析に関して、細胞は、ｄｅａｄ／ｌｉｖｅ Ｎｅａｒ ＩＲ Ｒｅａｃｔｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）色素を用いて染色された。５Ｅ０５の計数ビーズを各ウェルに添加し、直後にフローサイトメトリー解析を行った。１Ｅ０５のビーズを各サンプルに対して収集した。殺傷の特異性を評価するために、細胞は、ｌｉｖｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識群に対してゲーティングされた。生細胞群の割合が記録され、生存率の計算に使用された。

【0267】

Ｔ細胞活性化は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５に対する直接結合抗体とともに細胞をインキュベートし、総Ｔ細胞数（ＣＤ２＋）またはＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの後期活性化Ｔ細胞の百分率を記録することにより評価された。

【0268】

フローサイトメトリーを基にした細胞障害アッセイの結果（表１５ならびに図１４および１５を参照のこと）
共刺激性ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体のＲＥＧＮ６３２３を、様々なサイズ、およびいくつかの癌適応症の細胞表面抗原を標的とするＴＳＡｘＣＤ３抗体の細胞障害能を強化する能力について検証した。

【0269】

ＲＥＧＮ６３２３は、非刺激ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＰＳＭＡまたはＭＵＣ１６またはＳＴＥＡＰ２を標的とする様々なＴＳＡｘＣＤ３二特異性抗体の細胞障害能の強化に成功した。標的細胞の殺傷は、ＴＳＡｘＣＤ３の単剤処置と比較して、ＥＧＦＲｘＣＤ２８とＴＳＡｘＣＤ３の二特異性抗体の組み合わせの存在下で強化されており、細胞は、ｐＭのＥＣ５０で用量依存性に殺傷された。

【0270】

観察された標的細胞の溶解の強化は、Ｔ細胞上のＣＤ２５＋発現の強化と関連しており、繰り返すが、ｐＭのＥＣ５０であった。
表１５

【表15-1】

【表15-2】

【0271】

実施例１２：ＨＤＸ－ＭＳによる、ＲＥＧＮ７０７５、ＲＥＧＮ６３２３、およびＲＥＧＮ６３２２を用いたＥＧＦＲ上のエピトープマッピング
水素－重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施して、ＲＥＧＮ７０７５（ｍＡｂ１２９９９Ｐ２ ｘ ｍＡｂ１４２２６Ｐ２）、ｍＡｂ１３００６Ｐ（ＲＥＧＮ６３２３
ＥＧＦＲ アーム親）、およびｍＡｂ３５１９３Ｐ（ＲＥＧＮ６３２２ ＥＧＦＲ アーム親）と相互作用する上皮細胞増殖因子受容体（組み換えヒトＥＧＦＲ、付録にアミノ酸配列）のアミノ酸残基を決定した。ＨＤＸ－ＭＳの概要説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；およびＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａに記載されている。結果を、表１６、１７および１８に示す。

【0272】

ＨＤＸ－ＭＳ実験は、統合型ＭＳプラットフォーム上で実施された。当該プラットフォームは、重水素の標識およびクエンチ用のＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステム、サンプル消化とローディング用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、分析的勾配用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、およびペプチド質量測定用のＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析器からなる。

【0273】

標識溶液は、Ｄ_２Ｏ中、ｐＤ ７．０でＰＢＳ緩衝液として調製された（１０ｍＭ リン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、および３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４に等しい）。重水素標識については、ＲＥＧＮ７０７５と１：１のモル比で予混合された、１１μＬの５２．０μＭ ｈＥＧＦＲ．ｍｍｈ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社の社内作製タンパク質
ＲＥＧＮ３５５）またはｈＥＧＦＲ．ｍｍｈ（Ａｇ－Ａｂ複合体）、ｍＡｂ１３００６Ｐ２と１：０．６のモル比で予混合された、１１μＬの３４．３μＭ ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社の社内作製タンパク質 ＲＥＧＮ３５５）またはｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（Ａｇ－Ａｂ複合体）、ｍＡｂ３５１９３Ｐ２と１：０．６のモル比で予混合された、１１μＬの３１．４μＭ ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社の社内作製タンパク質 ＲＥＧＮ３５５）またはｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（Ａｇ－Ａｂ複合体）を、２０℃で、４４μＬのＤ_２Ｏ標識溶液中、様々な時点に関し、二重でインキュベートした（例えば、非重水素化対照＝０秒、重水素標識化は、５分および１０分）。重水素反応は、予め冷却されたクエンチ緩衝液（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、および１％ギ酸）５５μＬを各サンプルに２０℃、５分間のインキュベーションで添加することにクエンチされた。次いでクエンチされたサンプルをＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入し、オンラインのペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化を行った。消化ペプチドは、－９．５℃、０％～９０％Ｂ（移動相Ａ：０．５％ギ酸および４．５％アセトニトリル水溶液、移動相Ｂ：０．５％ギ酸のアセトニトリル溶液）の２２分の勾配でＣ８カラム（１．０ｍｍ ｘ ５０ｍｍ、ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ社）により分離された。溶出されたペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳモードで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析器により分析された。

【0274】

非重水素化ＥＧＦＲサンプルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ３５５）配列とそのリバース配列を含むデータベースに対して、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ社）を使用して検索した。検索パラメーターは、共通可変改変として非特異的酵素消化とヒトグリコシル化を使用したデフォルトとして設定された。次いで特定されたペプチドのリストを、ＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）にインポートして、全ての重水素化サンプルからＬＣ－ＭＳにより検出された各ペプチドの重水素取り込みを計算した。所与のペプチドに対し、各時点での質量中心（強度－重み付け平均質量）を使用して、重水素取り込み（Ｄ）と、重水素取り込みのパーセンテージ（％Ｄ）を計算した。

重水素取り込み（Ｄ－取り込み）＝平均質量（重水素化）－平均質量（非重水素化）

【数1】

【0275】

ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ３５５）に由来する総数で２７１個のペプチドが、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ単独、またはＲＥＧＮ７０７５と複合体化されたｈＥＧＦＲ．ｍｍＨサンプルから特定され、これはｈＥＧＦＲ．ｍｍＨの８４．４％の配列カバー率を表している。５％を超える、異なる百分率のＤ－取り込み値を呈するペプチドは全て、有意に保護されたと規定された。ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ上のアミノ酸３４５－３６８（ＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬ 配列番号７０）および３９９－４１６（ＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶ 配列番号７１）に対応するペプチドが、ＲＥＧＮ７０７５により有意に保護されていた（ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ残基は、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ配列に従い番号付けされている）。

【0276】

ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ３５５）に由来する総数で３４１個のペプチドが、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ単独、またはｍＡｂ１３００６Ｐと複合体化されたｈＥＧＦＲ．ｍｍＨサンプルから特定され、これはｈＥＧＦＲ．ｍｍＨの８５．８％の配列カバー率を表している。５％を超える、異なる百分率のＤ－取り込み値を呈するペプチドは全て、有意に保護されたと規定された。ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ上のアミノ酸３４５－３６８（ＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬ 配列番号７０）および３９９－４１６（ＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶ 配列番号７１）に対応するペプチドが、ｍＡｂ１３００６Ｐにより有意に保護されていた（ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ残基は、付録のｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ配列に従い番号付けされている）。

【0277】

ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ３５５）に由来する総数で３３５個のペプチドが、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ単独、またはｍＡｂ３５１９３Ｐと複合体化されたｈＥＧＦＲ．ｍｍＨサンプルから特定され、これはｈＥＧＦＲ．ｍｍＨの８５．５％の配列カバー率を表している。５％を超える、異なる百分率のＤ－取り込み値を呈するペプチドは全て、有意に保護されたと規定された。ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ上のアミノ酸１３３－１５４（ＣＮＶＥＳＩＱＷＲＤＩＶＳＳＤＦＬＳＮＭＳＭ 配列番号７２）に対応するペプチドが、ｍＡｂ３５１９３Ｐにより有意に保護されていた（ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ残基は、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ配列に従い番号付けされている）。
表１６：ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ単独と比較し、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ－ＲＥＧＮ７０７５複合体の形成時に、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨペプチドは有意な保護を受ける

【表16】

表１７：ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ単独と比較し、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ－ｍＡｂ１３００６Ｐ複合体の形成時に、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨペプチドは有意な保護を受ける

【表17-1】

【表17-2】

表１８：ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ単独と比較し、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ－ｍＡｂ３５１９３Ｐ複合体の形成時に、ｈＥＧＦＲ．ｍｍＨペプチドは有意な保護を受ける

【表18】

【0278】

ｈＥＧＦＲ．ｍｍｈのアミノ酸配列
ｈＥＧＦＲ（ＥＣＤ）．ＣＰＧＧ．ＭＭＨ６（ＲＥＧＮ３５５）：ヒトＥＧＦＲ（アミノ酸Ｌ２５－Ａ６４７、アクセッション番号ＮＭ＿００５２２８．４）、Ｃ末端 ＣＰＧＧ．ｍｙｃエピトープ（Ｅ１－Ｌ１０）．ＧｌｙＧｌｙ．ｍｙｃ エピトープ（Ｅ１－Ｌ１０）．ＳｅｒＧｌｙ．６ＸＨｉｓ．ＳＳＧタグを含む（ｍｍｈタグは下線部分）
LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIACPGGEQKLISEEDLGGEQKLISEEDLSGHHHHHHSSG(配列番号69)

【0279】

実施例１３：ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性物質、ならびにＥＧＦＲおよびＣＤ２８に対する関連親抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび反応速度定数
ＥＧＦＲ実験手順
捕捉された抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性ＡｂへのｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ３５５）の結合に対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）が、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００装置を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定された。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＲＥＧＮ２５６７、ロット番号 ＲＥＧＮ２５６７－Ｌ１）とのアミンカップリングにより誘導体化して、精製抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性Ａｂが捕捉された。Ｂｉａｃｏｒｅ結合実験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）から構成される緩衝液中で実施された。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを含む様々な濃度のｈＥＧＦＲ．ｍｍＨ（ＲＥＧＮ３５５）が、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製され（３０ｎＭ～１２０ｐＭの範囲で３倍連続希釈）、３０μＬ／分の流速でＡｂ捕捉表面に注入された。結合は５分間モニタリングされ、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中のｈＥＧＦＲ．ｍｍＨの解離は、１０分間モニタリングされた。結合反応速度実験は全て２５℃で実施された。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ 曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルに適合させることにより、結合（ｋ_ａ）および解離（ｋ_ｄ）の反応速度定数が決定された。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）を、反応速度定数から以下のように計算した：
Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａおよびｔ_１／２（分）＝０．６９３／ｋ_ｄ／６０

【0280】

２５℃での精製ＥＧＦＲｘＣＤ２８ Ａｂに対するｈＥＧＦＲ．ｍｍＨの結合反応速度パラメーターを、以下の表１９に示す。

【0281】

ＣＤ２８実験手順
捕捉されたｈＣＤ２８．ｍＦｃ（ＲＥＧＮ２０１２）に対する精製二特異性Ａｂ結合の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）が、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００装置を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定された。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、ポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号ＢＲ１００８３８）でアミンカップリングされることにより誘導体化され、Ｃ末端Ｆｃタグを有する精製ｈＣＤ２８（ｈＣＤ２８．ｍＦｃ、ＲＥＧＮ２０１２）が捕捉された。Ｂｉａｃｏｒｅ結合実験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）から構成される緩衝液中で実施された。ＨＢＳ－ＥＰ（９０ｎＭ～１．１ｎＭの範囲で３倍連続希釈）中で調製された様々な濃度の二特異性Ａｂが、５０μＬ／分の流速でｈＣＤ２８．ｍＦｃ捕捉表面に注入された。結合は４分間モニタリングされ、ＨＢＳ－ＥＰ中の二特異性Ａｂの解離は、１０分間モニタリングされた。結合反応速度実験は全て２５℃で実施された。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルに適合させることにより、結合（ｋ_ａ）および解離（ｋ_ｄ）の反応速度定数が決定された。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）を、反応速度定数から以下のように計算した：
Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａおよびｔ_１／２（分）＝０．６９３／ｋ_ｄ／６０

【0282】

２５℃でのｈＣＤ２８．ｍＦｃに対するＥＧＦＲｘＣＤ２８ Ａｂの結合反応速度パラメーターを、以下の表２０に示す。

【0283】

表形式でのデータ要約
表１９：２５℃での抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性ｍＡｂに対するｈＥＧＦＲ．ｍｍＨの結合反応速度

【表19】

表２０：２５℃での抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性ｍＡｂに対するｈＣＤ２８．ｍＦｃの結合反応速度

【表20】

【0284】

実施例１４：ヒトＥＧＦＲを過剰発現するよう操作されたＢａＦ３細胞を使用した、リガンド介在性細胞増殖アッセイにおけるＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体の特徴解析。
ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）受容体は、多細胞生物の細胞の増殖、生存、分化および遊走を制御する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの一種である。受容体の活性化は、その可溶性リガンドの例えばＥＧＦまたはＴＧＦβ等の結合を介して発生し、ＥＧＦＲのホモ二量体化および自己リン酸化を誘導し、最終的に例えばＲａｓ／ＭＡＰＫ、ＰＬＣγ１／ＰＫＣ、ＰＩ３－キナーゼ／Ａｋｔ、およびＳＴＡＴ経路など、多数の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらす（Ｗｉｅｄｕｗｉｌｔ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ｍａｙ；６５（１０）：１５６６－１５８４）。

【0285】

ＥＧＦＲシグナル伝達に対する抗ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体のブロッキング効果を試験するために、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ－Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９．２のアミノ酸Ｍ１～Ａ１２１０）を安定的に過剰発現するよう遺伝子改変された操作ＩＬ－３依存性Ｂａ／Ｆ３マウス造血細胞株を使用した増殖アッセイを展開した（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｖｏｌ．８，（Ｎｏ．２２），ｐｐ：３５４８８－３５４８９）。操作ＢａＦ３／ｈＥＧＦＲ細胞は、力価測定された抗体の存在下で、リガンド（ヒトＥＧＦまたはＴＧＦβ）で刺激され、細胞増殖は、細胞増殖の関数としてのトリチウム取り込みにより測定された。

【0286】

実験手順
操作ＢａＦ３／ｈＥＧＦＲ細胞は、培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン＋１０μｇ／ｍＬ マウスＩＬ－３＋０．５μｇ／ｍＬ ピューロマイシン）中で増殖され、２４時間、ＩＬ－３を含まない培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ ＦＢＳ）中で飢餓状態に置かれ、その後、細胞増殖アッセイに使用した。簡潔に述べると、９６ウェルの丸底組織培養プレートに、１２．５×１０＾５細胞／ウェルを、１５．２ｐＭ～１００ｎＭの範囲で１：３の連続希釈された抗体を、一定のリガンドのｈＥＧＦ（０．５ｎＭ）またはｈＴＧＦβ（０．５ｎＭ）の存在下で添加した（抗体を含有しない対照を含む）。３７℃／５％ ＣＯ_２で７２時間、プレートをインキュベートし、０．３μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジンを細胞に加え、プレートをさらに１６時間インキュベートした。チミジン、すなわちトリチウムは、分割細胞で新たに合成されるＤＮＡに多量に取り込まれる。インキュベーション後、細胞を９６ウェルのＵｎｉＦｉｌｔｅｒプレートに採取し、３０μＬのシンチレーション液を各ウェルに加えた。トリチウム取り込みは、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ＆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ装置を使用して、１分当たりのカウント数（ＣＰＭ）として測定された。細胞、抗体およびリガンドは、アッセイ培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１％ウシ血清アルブミン）中で調製され、全ての連続希釈は二重で試験された。

【0287】

抗体のＩＣ_５０／ＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用した１０点の用量応答性曲線での４－パラメーターロジスティック方程式から決定された。増殖の最大阻害は、以下の式により決定された：

【数2】

【0288】

結果の要約：
ＥＧＦＲ ｘ ＣＤ２８二特異性物質（ＲＥＧＮ６３２２；ＲＥＧＮ６３２３およびＲＥＧＮ７０７５）およびその対応する親ＥＧＦＲ抗体（ｍＡｂ３５１９３Ｐ２；ｍＡｂ１３００６Ｐ２およびｍＡｂ１２９９９Ｐ２）は、社内製造された比較抗体（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ））およびアイソタイプ合致陰性対照とともに、０．５ｎＭ ｈＥＧＦまたはｈＴＧＦβの存在下で検証された（表２１を参照のこと）。

【0289】

０．５ｎＭ ＥＧＦの存在下：
二特異性抗体（（ＲＥＧＮ６３２２；ＲＥＧＮ６３２３およびＲＥＧＮ７０７５）はいずれも用量依存性の増殖阻害を示さなかった。その最大阻害値は３０．５～－６．８％の範囲であった（マイナス値は、増殖の上昇を意味する）。一方でｍＡｂ３５１９３Ｐ２、ｍＡｂ１２９９９Ｐ２、および社内製造されたアービタックスは、ＢａＦ３／ｈＥＧＦＲ細胞の増殖を阻害し、そのＩＣ_５０および最大阻害値はそれぞれ、２．５５ｎＭ／２９．６％、１９．８ｎＭ／９１．８％、および６．６９ｎＭ／９７．６％であった。ｍＡｂ１３００６Ｐ２は、９３．２％の最大阻害を示し、ＩＣ_５０値は計算できなかった。陰性アイソタイプ対照抗体は、予測されたように阻害を示さなかった。

【0290】

０．５ｎＭ ｈＴＧＦβの存在下：
ＲＥＧＮ６３２２は、４０．６％の増殖の上昇を示し、ＥＣ_５０は３．６７ｎＭであった。一方でＲＥＧＮ６３２３およびＲＥＧＮ７０７５は、陰性アイソタイプ対照抗体と同じように反応を示さなかった。対照的に、ｍＡｂ１３００６Ｐ２、ｍＡｂ１２９９９Ｐ２、および社内製造のアービタックスは増殖を阻害し、ＩＣ_５０および最大阻害値はそれぞれ、６．５５ｎＭ／９７．２％、７．７９ｎＭ／９５．９％、および１．３８ｎＭ／９９．８％であった。ｍＡｂ３５１９３Ｐ２は、３２．７％までの増殖の上昇を示し、ＥＣ_５０値は９１４ｐＭであった。
表２１：抗体の最大阻害および有効値

【表21-1】

【表21-2】

略語 ND：未決定；NC：計算できず；有効値は、PRISMにより決定できなかった。

実施例１５：ＮＣＩ－Ｈ２９２およびヒト初代Ｔ細胞を使用した同種Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体の特徴解析
表２２：試薬／抗体情報／材料：

【表22】

【0291】

背景
「シグナル１」と「シグナル２」の２つのシグナルが、適切なＴ細胞の活性化に必要である。「シグナル１」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチドが結合した主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合することにより誘導される。一方で「シグナル２」は、Ｔ細胞上の共刺激性ＣＤ２８受容体が、ＡＰＣ上に存在するリガンドのｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０または８６（ＣＤ８０／ＣＤ８６）に会合することにより生じる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ
ａｌ．１９８６；Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．１９８７；Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９２）。ゆえにＣＤ２８シグナル伝達の活性化により、既存のＴＣＲシグナル伝達を強化する標的化方法がもたらされる。

【0292】

ＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体は、同種Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ＥＧＦＲ^＋標的細胞とＣＤ２８^＋Ｔ細胞を架橋することにより天然リガンドのＣＤ２８を模倣し、「シグナル２」を生じさせて、既存の「シグナル１」の存在下でＴ細胞の活性化を強化するように設計されている。しかしＴ細胞活性化は、Ｔ細胞上のプログラム細胞死タンパク質１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）受容体（ＰＤ－１）と、そのリガンドのＡＰＣ上のＰＤ－Ｌ１とがライゲーションすることにより阻害され得る。ＰＤ－１のライゲーションによって、ＣＤ２８およびＴＣＲ複合体へのホスファターゼのリクルートが生じ（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）、次いでＴＣＲシグナル伝達とＣＤ２８刺激が減弱される。したがってＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体と併用してセミプリマブを用いてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断することにより、Ｔ細胞機能を強化し、例えば癌中の標的細胞の殺傷が促進され得る。

【0293】

実験手順
ＥＧＦＲとＣＤ２８を会合させて「シグナル２」を伝達することにより、ヒト初代Ｔ細胞を活性化するＥＧＦＲｘＣＤ２８二特異性抗体の能力は、ＩＬ－２の放出とＴ細胞の増殖により判定され、「シグナル１」としての役割を果たすのに充分な同種ＴＣＲ応答を生じさせるＥＧＦＲ^＋／ＰＤ－Ｌ１^＋ヒト肺癌細胞株（ＮＣＩ－Ｈ２９２）の存在下で評価された。

【0294】

ヒト初代ＣＤ３ ^＋ Ｔ細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ドナー５５５０１５）から、健康なドナーの白血球パックより、メーカーの推奨プロトコールに従ってＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ ヒトＰＢＭＣ単離キットを使用して単離され、凍結された。ＣＤ３^＋ Ｔ細胞は、凍結ＰＢＭＣのバイアルを溶解させて単離された。ドナーＰＢＭＣは、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３^＋ Ｔ細胞単離キットをメーカーの推奨説明書に従い使用してＣＤ３^＋ Ｔ細胞を富化された。

【0295】

ＩＬ－２放出アッセイ
富化ＣＤ３^＋ Ｔ細胞を、刺激培地中に再懸濁し、１×１０^５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルの丸底プレートに添加された。増殖停止したＮＣＩ－Ｈ２９２細胞は、内因性のＥＧＦＲとＰＤ－Ｌ１を発現しており、これを５×１０^４細胞／ウェルの最終濃度でＣＤ３^＋ Ｔ細胞に添加した。続いて、ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、ＲＥＧＮ７０７５、非ＴＡＡｘＣＤ２８、およびそれらのアイソタイプ合致対照（ＩｓｏＣ－２）を、１：４希釈で０．７６ｐＭ～５０ｎＭに濃度測定し、ウェルに添加した。１０点希釈の最終点は、濃度測定抗体を含まない。濃度測定抗体の添加後、セミプリマブ、またはそのアイソタイプ合致対照（ＩｓｏＣ－１）のいずれかの一定濃度の２０ｎＭをウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で９６時間インキュベートし、５０μＬの総上清を取り出し、収集された上清から５μＬをＩＬ－２の測定に使用した。アッセイ上清中のＩＬ－２の量は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＡｌｐｈａＬｉｓａキットをメーカーのプロトコールに従い使用して決定された。ＩＬ－２測定値は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のマルチラベルプレートリーダーのＥｎｖｉｓｉｏｎで取得され、値はｐｇ／ｍＬとして報告された。全ての連続希釈が三重で検証された。

【0296】

抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用した１０点の用量応答性曲線での４－パラメーターロジスティック方程式から決定された。最大ＩＬ－２は、検証された用量範囲内で検出された平均最大応答として与えられる。

【0297】

Ｔ細胞増殖アッセイ
３７℃、５％ＣＯ_２で９６時間インキュベーションした後、上清を取り出し（ＩＬ－２放出アッセイを参照のこと）、０．２５ｍＣｉ／ウェルの濃度測定されたチミジンを細胞に添加し、プレートをさらに６～８時間インキュベートした。チミジン、すなわちトリチウムは、分割細胞で新たに合成されるＤＮＡに多量に取り込まれる。インキュベーション後、細胞を９６ウェルのＵｎｉＦｉｌｔｅｒプレートに採取し、３０μＬのシンチレーション液を各ウェルに加えた。トリチウム取り込みは、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ＆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔ
ＮＸＴ装置を使用して、１分当たりのカウント数（ＣＰＭ）として測定された。全ての連続希釈が三重で検証された。

【0298】

抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用した１０点の用量応答性曲線での４－パラメーターロジスティック方程式から決定された。最大ＣＰＭは、検証された用量範囲内で検出された平均最大応答として与えられる。

【0299】

結果の要約（表２３）
セミプリマブの存在下で、ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体処置（ＲＥＧＮ６３２２、ＲＥＧＮ６３２３、およびＲＥＧＮ７０７５）により、非ＴＡＡｘＣＤ２８、およびＩｓｏＣ－２、ＣＤ２８二特異性物質の各アイソタイプ合致対照と比較して高いＩＬ－２および増殖応答が得られた。一方でセミプリマブの非存在下でも、ＥＧＦＲｘＣＤ２８抗体処置は、非ＴＡＡｘＣＤ２８、およびＩｓｏＣ－１と比較して高いＩＬ－２と増殖応答が得られたが、最大値は低かった。
表２３：最大ＩＬ－２放出および増殖、ならびに抗体の有効値

【表23】

略語 ND：未決定；NC：計算できず；有効値は、PRISMにより決定できなかった。

【0300】

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態により、その範囲は限定されない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な改変が前述の説明および添付の図面から当業者には明白である。そうした改変は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
単離された多特異性抗原結合分子であって、
ａ）３７℃で表面プラズモン共鳴により測定されたときに、ヒトＣＤ２８に約２ｘ１０^－７Ｍ未満のＫ_Ｄで結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）、および
ｂ）３７℃で表面プラズモン共鳴により測定されたときに、標的腫瘍細胞上のヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に約１０^－８Ｍ未満のＫ_Ｄで特異的に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）、を含む、単離された多特異性抗原結合分子。
(項目２)
前記二特異性抗原結合分子が、インビトロでのＦＡＣＳ結合アッセイにより測定されたときに、約１０^－５Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＴ細胞の表面に結合する、項目１に記載の単離された多特異性抗原結合分子。
(項目３)
前記二特異性抗原結合分子が、インビトロでのＦＡＣＳ結合アッセイにより測定されたときに、約１０^－５Ｍ未満のＥＣ_５０でカニクイザルのＴ細胞の表面に結合する、項目１に記載の単離された多特異性抗原結合分子。
(項目４)
前記二特異性抗原結合分子が、インビトロでのＦＡＣＳ結合アッセイにより測定されたときに、約２．５ｘ１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でＥＧＦＲを発現する細胞株の表面に結合する、項目１に記載の単離された多特異性抗原結合分子。
(項目５)
前記Ｄ２ドメインが、
（ａ）配列番号２、３０、４０および５０からなる群から選択される一つに記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む重鎖可変領域のＨＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、および／または
（ｂ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、を含み、または
前記Ｄ１ドメインが、
（ｃ）配列番号１０、５９および６３からなる群から選択される一つに記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む重鎖可変領域のＨＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、および／または
（ｄ）配列番号１６および６７からなる群から選択される一つに記載されるアミノ酸配列、もしくはそのバリアントを含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲを含む免疫グロブリン鎖、を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
(項目６)
前記Ｄ２ドメインが、
（ａ）配列番号２、２４、３０、３８、４０、４８、５０および５８に記載されるアミノ酸配列もしくはそのバリアントに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域、および／または
（ｂ）配列番号１６および２８に記載されるアミノ酸配列もしくはそのバリアントに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域を含み、
または前記Ｄ１ドメインが、
（ｃ）配列番号１０、２６、５９および６３に記載されるアミノ酸配列もしくはそのバリアントに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域、および／または
（ｄ）配列番号１６、２８および６７に記載されるアミノ酸配列もしくはそのバリアントに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域を含む、項目５に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
(項目７)
前記Ｄ２ドメインが、
（ａ）配列番号２、３０、４０または５０に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号２、３０、４０または５０に記載される前記アミノ酸配列に対してそれぞれ少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域、および／または
（ｂ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、配列番号１６に記載される前記アミノ酸配列に対してそれぞれ少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域を含み、
または前記Ｄ１ドメインが、
（c）配列番号１０、５９または６３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、配列番号１０、５９または６３に記載される前記アミノ酸配列に対してそれぞれ少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域、および／または
（ｄ）配列番号１６または６７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、配列番号１６または６７に記載される前記アミノ酸配列に対してそれぞれ少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖免疫グロブリンもしくはその可変領域を含む、項目５に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
(項目８)
（１）アミノ酸配列：ＧＤＳＩＩＴＦＹ（配列番号４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、
アミノ酸配列：ＡＲＶＳＥＤＳＹＦＨＹＧＭＤＶ（配列番号８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
アミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ１ドメイン
（２）アミノ酸配列：ＧＦＴＦＳＴＦＩ（配列番号３２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＳＳＮＧＧＴＩ（配列番号３４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
アミノ酸配列：ＴＲＧＧＤＦＷＳＧＹＹＰＦＤＹ（配列番号３６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、
アミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ１ドメイン、
（３）アミノ酸配列：ＧＦＳＦＲＤＡＷ（配列番号４２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＲＮＫＩＤＧＧＴＴ（配列番号４４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
アミノ酸配列：ＴＴＤＩＷＮＹＶＬＦＹＹＹＧＬＤＶ（配列番号４６またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
アミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ１ドメイン、または
（４）アミノ酸配列：ＤＤＳＩＩＳＹＹ（配列番号５２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＲＴ（配列番号５４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
アミノ酸配列：ＡＲＶＳＥＤＳＹＹＨＹＧＭＤＶ（配列番号５６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
アミノ酸配列：ＧＧＳＩＳＳＹＹ（配列番号１２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ１、
アミノ酸配列：ＩＹＹＳＧＩＴ（配列番号６、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
アミノ酸配列：ＡＲＷＧＶＲＲＤＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号１４、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｈ３、
ならびに
アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号１８、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ１、
アミノ酸配列：ＧＡＳ（配列番号２０、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２２、またはそのバリアント）を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含むＤ１ドメイン、を含む項目５～７のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
(項目９)
（１）配列番号２に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ１ドメイン、
（２）配列番号３０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ１ドメイン、
（３）配列番号４０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ１ドメイン、または
（４）配列番号５０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号１０に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖可変領域、および
配列番号１６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含むＤ１ドメイン、を含む、ＥＧＦＲおよびＣＤ２８に結合する項目５～８のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
(項目１０)
（１）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ１ドメイン、
（２）配列番号３８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ１ドメイン、
（３）配列番号４８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ１ドメイン、または
（４）配列番号５８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ２ドメイン、
ならびに
配列番号２６に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む重鎖、および
配列番号２８に記載されるアミノ酸配列（またはそのバリアント）を含む軽鎖、を含むＤ１ドメイン、を含む、ＥＧＦＲおよびＣＤ２８に結合する項目５～９のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
(項目１１)
二特異性である、項目５～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
(項目１２)
ヒトＥＧＦＲおよびヒトＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子であって、第一の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＣＤ２８への結合に関して競合し、ＨＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、二特異性抗原結合分子。
(項目１３)
ヒトＥＧＦＲおよびヒトＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子であって、第一の抗原結合ドメインが、配列番号１０、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＣＤ２８への結合に関して競合する、二特異性抗原結合分子。
(項目１４)
ヒトＥＧＦＲおよびヒトＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子であって、第二の抗原結合ドメインが、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＥＧＦＲへの結合に関して競合し、ＨＣＤＲ１が、配列番号４、３２、４２および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６、３４、４４および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８、３６、４６および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、二特異性抗原結合分子。
(項目１５)
ヒトＥＧＦＲおよびヒトＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子であって、第二の抗原結合ドメインが、配列番号２、３０、４０および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＥＧＦＲへの結合に関して競合する、二特異性抗原結合分子。
(項目１６)
ヒトＥＧＦＲおよびヒトＣＤ２８に特異的に結合する二特異性抗原結合分子であって、第一の抗原結合ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＣＤ２８への結合に関して競合し、第二の抗原結合ドメインが、配列番号２、３０、４０および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む参照抗原結合タンパク質と、ヒトＥＧＦＲへの結合に関して競合する、二特異性抗原結合分子。
(項目１７)
（ａ）前記抗原結合タンパク質の免疫グロブリン鎖をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入すること、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で前記宿主細胞を培養すること、および
（ｃ）任意で、前記宿主細胞から、および／または前記宿主細胞が増殖した培地から、前記抗原結合タンパク質または免疫グロブリン鎖を単離すること、を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を作製する方法。
(項目１８)
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
項目１７～１８のいずれか１項に記載の方法の産物である、抗原結合タンパク質または免疫グロブリン鎖。
(項目２０)
項目１～１６および１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチド。
(項目２１)
項目２０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目２２)
項目１～１６および１９～２１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質もしくはポリヌクレオチド、および／またはベクターを含む、宿主細胞。
(項目２３)
項目１～１６および１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質のうちの一つ以上を、任意でさらなる治療剤と関連付けて含有する組成物またはキット。
(項目２４)
項目１～１６および１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、ならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤、ならびに任意でさらなる治療剤を含む、医薬製剤。
(項目２５)
ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、プラチナ系抗癌化学療法剤のパクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、抗癌抗体またはその抗原結合断片であるペムブロリズマブ、ニボルマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、およびセミプリマブからなる群から選択されるさらなる治療剤と関連付けられた、項目１～１６、１９、２３および２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、組成物または製剤。
(項目２６)
項目１～１６、１９、２３、２４または２５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質または組成物または製剤を含む、容器または注射用デバイス。
(項目２７)
項目１～１６、１９、２３、２４または２５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、組成物または製剤を対象に投与するための方法であって、前記抗原結合タンパク質、組成物または製剤を、前記対象の身体内に注入することを含む、方法。
(項目２８)
その必要のある対象において、過増殖性疾患を治療または予防する方法であって、前記対象に、項目１～１６、１９、２３、２４または２５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質または組成物または製剤の有効量を投与することを含む、方法。
(項目２９)
前記過増殖性疾患が、癌であり、ならびに前記抗原結合タンパク質を投与する前に、前記癌の細胞がＥＧＦＲを発現するかを判定すること、または別の個人もしくは実体にそのような判定を実施することを指示すること、およびＥＧＦＲ発現が存在した場合、前記対象にＥＧＦＲｘＣＤ２８抗原結合タンパク質を投与することをさらに含む、項目２８に記載の方法。
(項目３０)
前記過増殖性疾患が、ＥＧＦＲ発現癌である、項目２８～２９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３１)
前記過増殖性疾患が、食道癌、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、子宮頚扁平上皮細胞癌、子宮内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、皮膚癌、頭頚部扁平上皮細胞癌、脳腫瘍、多形性膠芽腫、乳癌、胃食道癌、胃食道腺癌、前立腺癌または卵巣癌である癌である、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記抗原結合タンパク質が、前記対象の身体内への、皮下注射、静脈内注射または筋肉内注射により投与される、項目２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
(項目３３)
前記抗原結合分子が、１ｘ１０^－１２Ｍ～１ｘ１０^－５ＭのＥＣ_５０値で、ＣＤ２８発現ヒトＴ細胞に結合する、項目１～１６のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子。
(項目３４)
前記抗原結合分子が、１ｘ１０^－９Ｍ～１ｘ１０^－５ＭのＥＣ_５０値で、ＣＤ２８発現ヒトＴ細胞に結合する、項目１～１６のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子。
(項目３５)
前記抗原結合分子が、ヒトＣＤ２８を発現するヒト細胞、およびカニクイザルＣＤ２８を発現するカニクイザル細胞に結合する、項目３３または３４に記載の多特異性抗原結合分子。
(項目３６)
項目３３～３５のいずれか１項に記載の二特異性抗原結合分子、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
(項目３７)
項目３３～３５のいずれか１項に記載の二特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
(項目３８)
項目３７に記載の核酸を含む発現ベクター。
(項目３９)
項目３８に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
(項目４０)
対象において癌の増殖を阻害する方法であって、項目３３～３５のいずれか１項に記載の単離二特異性抗体、または項目３６に記載の医薬組成物を、前記対象に投与し、それにより前記対象において前記癌の増殖を阻害することを含む、方法。
(項目４１)
第二の治療剤を投与することをさらに含む、項目２８または４０に記載の方法。
(項目４２)
抗腫瘍剤、放射線療法、抗体薬剤結合物質、チェックポイント阻害物質、同じ腫瘍標的抗原に結合する第一の抗原結合ドメインとＴ細胞上のＣＤ３に結合する第二の抗原結合ドメインを含む別の異なる二特異性抗体、異なる腫瘍標的抗原に結合する第一の抗原結合ドメインとＴ細胞上のＣＤ３に結合する第二の抗原結合ドメインを含む別の異なる二特異性抗体、またはそれらの組み合わせである、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
対象において癌を治療する方法であって、前記対象に、項目２４または３６に記載の医薬組成物を投与することを含み、それにより前記対象において前記癌を治療することを含む、方法。
(項目４４)
前記癌が、ＥＧＦＲ発現癌である、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記ＥＧＦＲ発現癌が、食道癌、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、子宮頚扁平上皮細胞癌、子宮内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、皮膚癌、頭頚部扁平上皮細胞癌、脳腫瘍、多形性膠芽腫、乳癌、胃食道癌、胃食道腺癌、前立腺癌および卵巣癌からなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
(項目４６)
前記対象に、第二の治療剤を投与することをさらに含む、項目４３～４５のいずれか１項に記載の方法。
(項目４７)
前記第二の治療剤が、抗腫瘍剤、放射線療法、抗体薬剤結合物質、チェックポイント阻害物質、同じ腫瘍標的抗原に結合する第一の抗原結合ドメインとＴ細胞上のＣＤ３に結合する第二の抗原結合ドメインを含む別の異なる二特異性抗体、異なる腫瘍標的抗原に結合する第一の抗原結合ドメインとＴ細胞上のＣＤ３に結合する第二の抗原結合ドメインを含む別の異なる二特異性抗体、またはそれらの組み合わせである、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記チェックポイント阻害物質が、セミプリマブである、項目４２または４７に記載の方法。
(項目４９)
前記異なる二特異性抗体が、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１６、およびＳＴＥＡＰ２からなる群から選択される異なる腫瘍抗原に結合する第一の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する第二の抗原結合ドメインを含む、項目４２または４７に記載の方法。
(項目５０)
前記二特異性抗原結合分子が、配列番号７２に記載されるＥＧＦＲのアミノ酸残基１３３－１５４、または配列番号７０に記載されるＥＧＦＲのアミノ酸残基３４５－３６８、または配列番号７１に記載されるＥＧＦＲのアミノ酸残基３９９－４１６のうちの一つ以上と相互作用する、項目１～１６のいずれか１項に記載の二特異性抗原結合分子。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【配列表】

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