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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024160399
(43)【公開日】2024-11-13
(54)【発明の名称】脳機能調整剤、およびこれを含む飲食品
(51)【国際特許分類】
C07K 5/093 20060101AFI20241106BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20241106BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20241106BHJP
【ＦＩ】
C07K5/093
A23L33/18
C07K14/78
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024144410
(22)【出願日】2024-08-26
(62)【分割の表示】P 2021502332の分割
【原出願日】2020-02-26
(31)【優先権主張番号】P 2019036417
(32)【優先日】2019-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000190943
【氏名又は名称】新田ゼラチン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小泉 聖子
(72)【発明者】
【氏名】井上 直樹
(72)【発明者】
【氏名】松下 綾
(72)【発明者】
【氏名】須永 克佳
(72)【発明者】
【氏名】菊地 秀与
(72)【発明者】
【氏名】木暮 里美
(57)【要約】 （修正有）
【課題】脳神経細胞に直接作用することにより脳機能改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するペプチドなどを含む脳機能調整剤、およびこれを含む飲食品を提供する。
【解決手段】脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。
【選択図】なし
【解決手段】脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する、脳機能調整剤。
【請求項2】
前記ペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体である、請求項１に記載の脳機能調整剤。
【請求項3】
前記ペプチドは、コラーゲン由来である、請求項１または２に記載の脳機能調整剤。
【請求項4】
前記ペプチドは、その重量平均分子量が３１５以上１００００以下である、請求項１～３のいずれかに記載の脳機能調整剤。
【請求項5】
前記脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤である、請求項１～４のいずれかに記載の脳機能調整剤。
【請求項6】
前記脳機能調整剤は、脳神経細胞の分化促進作用を有する、請求項１～５のいずれかに記載の脳機能調整剤。
【請求項7】
前記脳機能調整剤は、脳神経細胞の細胞死抑制作用を有する、請求項１～６のいずれかに記載の脳機能調整剤。
【請求項8】
前記脳機能調整剤は、記憶力または認知機能の改善作用を有する、請求項１～７のいずれかに記載の脳機能調整剤。
【請求項9】
請求項１～８のいずれかに記載の脳機能調整剤を含む、飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脳機能調整剤、およびこれを含む飲食品に関する。
【背景技術】
【0002】
コラーゲン加水分解物（以下、「コラーゲンペプチド混合物」とも記す）は、生体に対して様々な生理活性を示すことが公知である。最近、コラーゲンペプチド混合物が脳神経細胞などに対しても生理活性を示し、記憶力などの脳機能を改善する効果（以下、「脳機能改善効果」とも記す）を有することが報告され始めた。たとえば特開２０１０－１０５９９６号公報（特許文献１）は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇで表されるペプチドをはじめとする合計９つのコラーゲン由来ペプチドを含有する神経新生促進剤を開示している。特開２０１１－１１１４４０号公報（特許文献２）は、コラーゲン由来であってＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａで表されるペプチドに神経新生促進作用があることを開示している。非特許文献１は、魚由来のコラーゲンペプチド混合物を老化モデルマウスに投与することにより、海馬におけるＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）の発現量が増加し、もって空間学習記憶能力および受動的回避能力が高まることを報告している。非特許文献２は、ラットを用いた実験においてコラーゲン由来のＰｒｏ－Ｈｙｐで表されるジペプチドが、脳脊髄液に移行することにより抗うつ効果を発揮したことを報告している。非特許文献３は、コラーゲン加水分解物が海馬の神経新生を促進したことを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２０１０－１０５９９６号公報
【特許文献2】特開２０１１－１１１４４０号公報
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Pei Xinrong et al., "Preventive Effect of Marine Collagen Peptide on Learning and Memory Impairment in SAMP8 Mice", Food and Fermentation Industries, 2009, Vol 135(07)，p.1-5
【非特許文献2】永井ら、「コラーゲン由来抗うつペプチドの同定およびその脳脊髄液への移行」、２０１７年度農芸化学会大会講演要旨集、2017年3月5日、p．997
【非特許文献3】C.Kakoi et al., "Collagen peptides enhance hippocampal neurogenesis and reduce anxiety related behavior in mice", Biomedical Research ３３（５）, 2012, p.273-279
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記非特許文献１および非特許文献３に開示された脳機能改善効果、または神経新生作用は、コラーゲン由来のどのようなペプチドによって得られるのかが特定されていない。上記特許文献１に開示された神経新生促進作用は、９つのコラーゲン由来のペプチドのうち、どのペプチドによるのかが特定されていない。上記特許文献２に開示された神経新生促進作用は、ラットの副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞を用いた実験から得られた知見であり、脳神経細胞を対象とした実験から得られた知見ではない。さらに上記非特許文献２が開示するＰｒｏ－Ｈｙｐは、海馬歯状回における神経新生作用を有することを示唆するが、Ｐｒｏ－Ｈｙｐによって脳神経細胞が分化および成長することにより脳機能が改善するかどうかについては確認されていない。したがって、未だホルモンなどの生体内シグナル伝達物質を介することなく脳神経細胞に直接作用することによって脳機能改善効果を奏するコラーゲン由来のペプチドは知られておらず、その開発が切望されている。
【0006】
上記実情に鑑み、本発明は、脳神経細胞に直接作用することにより脳機能改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するペプチドなどを含む脳機能調整剤、およびこれを含む飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、脳神経細胞に直接作用することにより脳機能改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するペプチドなどを含む脳機能調整剤を開発する中で、コラーゲンペプチド混合物に含まれるペプチドのアミノ酸配列のうちＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（グルタミン酸－ヒドロキシプロリン－グリシン、以下、アミノ酸を一文字で表記する略号を用いて「ＥＯＧ」とも記す場合がある）に注目した。Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドを含有するコラーゲンペプチド混合物、具体的にはＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドなどを脳神経細胞に作用させた結果、これらが脳神経細胞の分化を促進し、もって脳機能改善効果および脳機能低下予防効果を奏することを知見し、本発明に到達した。本発明は、具体的には以下のとおりである。
【0008】
本発明に係る脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。
【0009】
上記ペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体であることが好ましい。
【0010】
上記ペプチドは、コラーゲン由来であることが好ましい。
上記ペプチドは、その重量平均分子量が３１５以上１００００以下であることが好ましい。
上記ペプチドは、その重量平均分子量が３１５以上１００００以下であることが好ましい。
【0011】
上記脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤であることが好ましい。
上記脳機能調整剤は、脳神経細胞の分化促進作用を有することが好ましい。
上記脳機能調整剤は、脳神経細胞の分化促進作用を有することが好ましい。
【0012】
上記脳機能調整剤は、脳神経細胞の細胞死抑制作用を有することが好ましい。
上記脳機能調整剤は、記憶力または認知機能の改善作用を有することが好ましい。
上記脳機能調整剤は、記憶力または認知機能の改善作用を有することが好ましい。
【0013】
本発明に係る飲食品は、上記脳機能調整剤を含む。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、脳神経細胞に直接作用することにより脳機能改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するペプチドなどを含む脳機能調整剤、およびこれを含む飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明に係る実施形態について、さらに詳細に説明する。ここで、本明細書において「Ａ～Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＢの単位とは同じである。
【0017】
［脳機能調整剤］
本発明に係る脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。このような特徴を備える脳機能調整剤は、脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化を促進し、もって脳機能改善効果および脳機能低下予防効果を奏することができる。
本発明に係る脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。このような特徴を備える脳機能調整剤は、脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化を促進し、もって脳機能改善効果および脳機能低下予防効果を奏することができる。
【0018】
＜Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体＞
上述のとおり脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。本明細書において「アミノ酸」は、特に明示しない限り、Ｌ型アミノ酸を意味する。「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド」とは、当該ペプチドを構成するアミノ酸配列中に「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（グルタミン酸－ヒドロキシプロリン－グリシン）」で表されるアミノ酸配列が１箇所以上含まれていることを意味する。
上述のとおり脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。本明細書において「アミノ酸」は、特に明示しない限り、Ｌ型アミノ酸を意味する。「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド」とは、当該ペプチドを構成するアミノ酸配列中に「Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（グルタミン酸－ヒドロキシプロリン－グリシン）」で表されるアミノ酸配列が１箇所以上含まれていることを意味する。
【0019】
上記脳機能調整剤において、上記ペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体であることが好ましい。この場合、脳機能調整剤は、脳神経細胞の分化を促進する作用をより顕著に示すことができる。
【0020】
上記ペプチドの「塩」は、たとえば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機塩基塩などとして形成されることができる。
【0021】
上記ペプチドの「化学修飾体」とは、構成単位であるアミノ酸残基が有する遊離の官能基が化学修飾されたペプチドをいう。化学修飾は、たとえばヒドロキシプロリンの水酸基、Ｎ末（アミノ末端）側のアミノ酸のアミノ基およびＣ末（カルボキシル末端）側のアミノ酸のカルボキシル基に対して実行することができる。化学修飾の具体的手段およびその処理条件は、従来公知のペプチドの化学修飾技術が適用される。このような化学修飾によって、上記ペプチドの化学修飾体は、弱酸性から中性で溶解性が向上する効果、他の有効成分との相溶性が向上する効果などを奏することができる。
【0022】
たとえばＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙのトリペプチドに対し、ヒドロキシプロリンにおける水酸基の化学修飾として、Ｏ－アセチル化などを行うことができる。このＯ－アセチル化は、たとえば水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることによって実行することができる。グリシンにおけるカルボキシル基の化学修飾として、エステル化、アミド化などを行うことができる。上記エステル化は、上記ペプチドをメタノールに懸濁した後、これに乾燥塩化水素ガスを通気することによって実行することができる。上記アミド化は、上記ペプチドにカルボジイミドなどを作用させることによって実行することができる。
【0023】
さらに上記トリペプチド中の遊離のアミノ基の化学修飾として、メチル化を行うことができる。上記トリペプチド中の遊離の水酸基の化学修飾として、リン酸化および硫酸化の少なくともいずれかを行うことができる。
【0024】
上記ペプチドは、コラーゲン由来であることが好ましい。この場合、原料としてのコラーゲンは、たとえば牛、豚、羊、鶏、ダチョウなどに代表される動物の皮、皮膚、骨、軟骨、腱など、あるいは魚類の骨、皮、鱗などに対して従来公知の脱脂または脱灰処理、抽出処理などを実行することにより得ることができる。さらに上記ペプチドの原料として、ゼラチンを用いることもできる。ゼラチンは、上述のようにして得たコラーゲンを熱水抽出などの従来公知の方法で処理することにより得ることができる。コラーゲンおよびゼラチンは、市販のものを原料として用いることもできる。
【0025】
上記ペプチドは、上記コラーゲンおよびゼラチンの両方またはいずれか一方に対し、エンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの２種以上を組み合わせて加水分解することによって得ることができる。上記ペプチドは、上記の加水分解によって他のコラーゲンペプチドとともに混在するコラーゲンペプチド混合物として得られるが、このコラーゲンペプチド混合物自体、およびこれを部分精製した混合物を本発明に係る脳機能調整剤として用いることができる。さらに、上記コラーゲンペプチド混合物をさらに精製することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドを高純度で得ることができる。上記ペプチドは、コラーゲン由来である場合、後述するコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法を用いることにより得ることが好ましい。
【0026】
さらに上記ペプチドは、その重量平均分子量が３１５以上１００００以下であることが好ましい。上記ペプチドの重量平均分子量は、より好ましくは３１５以上５０００以下であり、さらに好ましくは３１５以上２０００以下である。上記ペプチドの重量平均分子量が上述した範囲内である場合、脳機能調整剤は、脳神経細胞の分化を促進する作用をより顕著に示し、もって脳機能改善効果および脳機能低下予防効果をより十分に得ることができる。上記ペプチドの重量平均分子量が１００００を超える場合、脳機能調整剤は、脳機能改善効果および脳機能低下予防効果が不十分と恐れがある。
【0027】
上記ペプチドの重量平均分子量は、以下の測定条件の下でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実行することにより求めることができる。
機器 ：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（東ソー株式会社製)
カラム：ＴＳＫＧｅｌ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷXL
カラム温度：４０℃
溶離液：４５質量％アセトニトリル（０．１質量％ＴＦＡを含む）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出 ：ＵＶ２１４ｎｍ
分子量マーカー：以下の５種を使用
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ Ｃ Ｍｗ：１２０００
Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ Ｍｗ：６５００
Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｍｗ：１４５０
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ Ｍｗ：４５１
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ Ｍｗ：１８９。
機器 ：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（東ソー株式会社製)
カラム：ＴＳＫＧｅｌ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷXL
カラム温度：４０℃
溶離液：４５質量％アセトニトリル（０．１質量％ＴＦＡを含む）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出 ：ＵＶ２１４ｎｍ
分子量マーカー：以下の５種を使用
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ Ｃ Ｍｗ：１２０００
Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ Ｍｗ：６５００
Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｍｗ：１４５０
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ Ｍｗ：４５１
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ Ｍｗ：１８９。
【0028】
具体的には、約０．２ｇの上記ペプチドを含む試料（コラーゲンペプチド混合物）を約１００ｍｌの蒸留水に添加し、撹拌した後、０．２μｍフィルターを用いてろ過することにより、重量平均分子量を測定する試料（被測定物）を調製する。この被測定物を上述したサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより、上記ペプチドの重量平均分子量を求めることができる。なお、上記ペプチドがＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドである場合、その分子質量を重量平均分子量とすることができる。
【0029】
＜脳機能調整剤の製造方法＞
脳機能調整剤に含まれるＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、従来公知の液相または固相のペプチド合成方法、あるいはコラーゲンまたはゼラチンを加水分解する方法を用いることにより得ることができる。たとえば上記ペプチドは、効率性の観点から後述するアミノ酸を用いた化学合成方法、あるいは後述するコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法を用いることにより製造することが好ましい。さらに上記ペプチドは、コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法に代えて、１次酵素を省略し２次酵素のみにより酵素処理する方法、１次酵素および２次酵素による酵素処理を同時に行う方法を用いることにより製造することも可能である。
脳機能調整剤に含まれるＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、従来公知の液相または固相のペプチド合成方法、あるいはコラーゲンまたはゼラチンを加水分解する方法を用いることにより得ることができる。たとえば上記ペプチドは、効率性の観点から後述するアミノ酸を用いた化学合成方法、あるいは後述するコラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法を用いることにより製造することが好ましい。さらに上記ペプチドは、コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法に代えて、１次酵素を省略し２次酵素のみにより酵素処理する方法、１次酵素および２次酵素による酵素処理を同時に行う方法を用いることにより製造することも可能である。
【0030】
（化学合成方法）
上記ペプチドは、一般的なペプチド合成法を用いて得ることができる。このペプチド合成法としては、固相合成法および液相合成法が公知である。固相合成法には、Ｆｍｏｃ法とＢｏｃ法とが知られている。上記ペプチドは、Ｆｍｏｃ法およびＢｏｃ法のいずれの方法を用いても得ることができる。以下、ペプチドの固相合成法として、たとえばＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドの合成方法について説明する。
上記ペプチドは、一般的なペプチド合成法を用いて得ることができる。このペプチド合成法としては、固相合成法および液相合成法が公知である。固相合成法には、Ｆｍｏｃ法とＢｏｃ法とが知られている。上記ペプチドは、Ｆｍｏｃ法およびＢｏｃ法のいずれの方法を用いても得ることができる。以下、ペプチドの固相合成法として、たとえばＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドの合成方法について説明する。
【0031】
まず表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として準備する。縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミドを別途準備する。次に、上記アミノ酸配列においてＣ末（カルボキシル末端）側のアミノ酸であるグリシンのアミノ基をＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ－ｍｅｔｈｏｘｙ－ｃａｒｂｏｎｙｌ）基で保護するとともに、上記縮合剤を用いた脱水反応により上記グリシンのカルボキシル基と上記固相の上記アミノ基とをペプチド結合させる。さらに上記固相を溶媒で洗浄することにより、残存する縮合剤およびアミノ酸を除去した後、上記固相にペプチド結合しているグリシンのアミノ基の保護基を除去（脱保護）する。
【0032】
続いて、Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したヒドロキシプロリンを準備し、このヒドロキシプロリンのカルボキシル基と、上記グリシンの脱保護したアミノ基とを上記縮合剤を用いることによりペプチド結合させる。以後、同様の要領で上記ヒドロキシプロリンのアミノ基の脱保護、Ｆｍｏｃ基で保護したグルタミン酸の準備、ならびにこのグルタミン酸と上記ヒドロキシプロリンとをペプチド結合させる反応を実行することにより、上記固相にＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドを合成する。最後に、上記グルタミン酸のアミノ基の脱保護を行い、かつ室温にてトリフルオロ酢酸を含む溶液を加えるとともに、一定時間振盪することによって上記固相から上記トリペプチドを切り離す。これにより上記トリペプチドを製造することができる。
【0033】
（コラーゲンまたはゼラチンを用いた製造方法）
以下、上記ペプチドの製造方法の一例として、コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド（以下、「特定のペプチド」とも記す）を製造する方法について説明する。
以下、上記ペプチドの製造方法の一例として、コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理することにより、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド（以下、「特定のペプチド」とも記す）を製造する方法について説明する。
【0034】
ここでコラーゲンまたはゼラチンを「２段階で酵素処理する」とは、次のことを意味する。すなわち、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断する従来公知の方法により１次酵素処理を実行した後に、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、アミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せにより２次酵素処理を実行することをいう。１次酵素処理を実行することにより、コラーゲンペプチド混合物前駆体を得ることができる。さらに２次酵素処理を実行することにより、上記コラーゲンペプチド混合物前駆体から上記特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法について、以下さらに詳述する。
【0035】
－１次酵素処理－
１次酵素処理で用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されるべきではなく、任意のタンパク質分解酵素を用いることができる。具体的には、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどを挙げることができ、これらの群から選ばれる１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。上記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどを用いることができる。酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシンなどを用いることができる。１次酵素処理で用いる酵素としては、本発明に係る脳機能調整剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
１次酵素処理で用いる酵素としては、コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切断することが可能な酵素であれば、特に限定されるべきではなく、任意のタンパク質分解酵素を用いることができる。具体的には、コラゲナーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどを挙げることができ、これらの群から選ばれる１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。上記チオールプロテアーゼとしては、植物由来のキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシン、動物由来のカテプシン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＤなどを用いることができる。酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、キモトリプシンなどを用いることができる。１次酵素処理で用いる酵素としては、本発明に係る脳機能調整剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
【0036】
１次酵素処理における酵素量としては、たとえばコラーゲンまたはゼラチン１００質量部に対し上述した酵素を０．１～５質量部とすることが好ましい。１次酵素処理における処理温度は３０～６５℃とし、処理時間は１０分～７２時間とすることが好ましい。上記１次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物前駆体の重量平均分子量は、好ましくは５００～１００００、より好ましくは５００～５０００、さらに好ましくは５００～２０００である。重量平均分子量が上述の範囲にあれば、分子量が適切なペプチドが十分に生成しているといえる。１次酵素処理の後に、必要に応じて酵素を失活させることができる。この場合の失活温度としては、たとえば７０～１００℃とすることが好ましい。コラーゲンペプチド混合物前駆体の重量平均分子量は、上述したＳＥＣを用いる方法によって求めることができる。
【0037】
－２次酵素処理－
２次酵素処理で用いる酵素としては、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、アミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せを挙げることができる。ここで本明細書において「アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素」とは、ペプチド鎖のＮ末側からアミノ酸を遊離させる働きを有するペプチダーゼであって、Ｎ末側から２番目にプロリンあるいはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合に作用する酵素をいう。本明細書において「プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素」とは、Ｎ末側から３番目がプロリンあるいはヒドロキシプロリンであるペプチドから、Ｎ末側の３アミノ酸残基のみを遊離するペプチダーゼをいう。２次酵素処理で用いる酵素も、本発明に係る脳機能調整剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
２次酵素処理で用いる酵素としては、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、アミノペプチダーゼＮ活性およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を併有する酵素、またはアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素およびプロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の組合せを挙げることができる。ここで本明細書において「アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素」とは、ペプチド鎖のＮ末側からアミノ酸を遊離させる働きを有するペプチダーゼであって、Ｎ末側から２番目にプロリンあるいはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合に作用する酵素をいう。本明細書において「プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素」とは、Ｎ末側から３番目がプロリンあるいはヒドロキシプロリンであるペプチドから、Ｎ末側の３アミノ酸残基のみを遊離するペプチダーゼをいう。２次酵素処理で用いる酵素も、本発明に係る脳機能調整剤を医薬、特定保健用食品などに用いることを考慮した場合、病原性微生物由来の酵素を用いることなく、それ以外の酵素を用いることが好ましい。
【0038】
アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素としては、たとえばアミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２．；T.Yoshimoto et al., Agric. Biol. Chem., 52:217-225(1988)）などを挙げることができる。またたとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素を挙げることができる。プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素としては、たとえばプロリルトリぺプチジルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．；A.Banbula et al., J.Biol. Chem., 274:9246-9252(1999)）などを挙げることができる。
【0039】
２次酵素処理を実行することにより、上記コラーゲンペプチド混合物前駆体に含まれていなかったペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。具体的には、上記特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物を得ることができる。
【0040】
２次酵素処理における酵素量としては、たとえば上記コラーゲンペプチド混合物前駆体１００質量部に対して上述した酵素を０．０１～５質量部とすることが好ましい。２次酵素処理における処理温度は３０～６５℃とし、処理時間は１～７２時間とすることが好ましい。上記２次酵素処理により得られるコラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量は、好ましくは３１５～１００００、より好ましくは３１５～５０００、さらに好ましくは３１５～２０００である。コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量も、上述したＳＥＣを用いる方法によって求めることができる。
【0041】
２次酵素処理は、上述した特定のペプチドを生成することを主たる目的として実行される。このため上記コラーゲンペプチド混合物前駆体に含まれるペプチドが過剰に加水分解されてしまわないように、２次酵素処理における酵素量、処理温度、処理時間およびｐＨを調整することが好ましい。これによりコラーゲンペプチド混合物を上述した重量平均分子量の範囲内とすることが好ましい。２次酵素処理の後に、酵素を失活させる必要がある。この場合の失活温度としては、たとえば７０～１００℃とすることが好ましい。さらに１２０℃で数秒以上の殺菌処理を行うことが好ましい。また、これに２００℃以上の熱をかけて噴霧乾燥させることも可能である。
【0042】
２次酵素処理では、上記アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素、プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有する酵素の他に、異なる活性を併有する酵素を用いることができ、かつ異なる活性を有する酵素を２種以上併用することもできる。これにより副生成物を分解し除去することが可能となる。この場合において用いる酵素としては、原料となるコラーゲンの種類、１次酵素処理に用いる酵素の種類に応じて適宜選択することが好ましい。上述した異なる活性としては、たとえばプロリダーゼ活性、ヒドロキシプロリダーゼ活性などのジペプチダーゼ活性を挙げることができる。これにより副生成物となるジペプチドなどを分解除去することができる。
【0043】
さらにアミノペプチダーゼＮ活性は、基本的にＮ末端側のアミノ酸を１つずつ遊離させる活性である。このため１次酵素処理によって得られるコラーゲンペプチド混合物前駆体に分子量が極めて大きいペプチドが含まれる場合、２次酵素処理をアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素のみで実行したとき、その処理時間が著しく長期化する。このような場合に対応するため、２次酵素処理では、たとえばプロリンのカルボキシル基側を加水分解する活性（プロリダーゼ活性）を有するエンドペプチダーゼであるプロリルオリゴペプチダーゼを用いることができる。これにより２次酵素処理を効率的に行うことができる。
【0044】
コラーゲンまたはゼラチンを２段階で酵素処理する方法では、１次酵素処理によって比較的分子量の大きなペプチドを生成することができる。このペプチドは、たとえば［Ｘ1－Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］（Ｘ1およびＸ2≠Ｈｙｐ）で表されるアミノ酸配列を有することができる。続く２次酵素処理では、上記［Ｘ1－Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるペプチドにアミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素が作用し、Ｎ末端のＸ1が遊離することにより［Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが得られる。次に、上記［Ｇｌｙ－Ｘ2－Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるペプチドに、アミノペプチダーゼＮ活性を有する酵素が２度作用し、グリシンおよびＸ2が遊離することにより、［Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ］で表されるペプチドが得られる。以上から、特定のペプチドを生成することができる。
【0045】
－コラーゲンペプチド混合物の精製－
上述した２段階での酵素処理を実行することにより、特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物を製造することができる。上記コラーゲンペプチド混合物には、特定のペプチド以外のペプチド、すなわちＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド以外のペプチドも含まれているため、必要に応じて精製することが好ましい。この場合の精製方法としては、従来公知の方法を用いることができ、たとえば限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィーなどを用いることができる。
上述した２段階での酵素処理を実行することにより、特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物を製造することができる。上記コラーゲンペプチド混合物には、特定のペプチド以外のペプチド、すなわちＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド以外のペプチドも含まれているため、必要に応じて精製することが好ましい。この場合の精製方法としては、従来公知の方法を用いることができ、たとえば限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィーなどを用いることができる。
【0046】
具体的には、コラーゲンペプチド混合物を以下の操作により精製することができる。すなわち上記コラーゲンペプチド混合物の約２ｇ／１０ｍＬをイオン交換カラム（たとえば商品名：「トヨパール（登録商標）ＤＥＡＥ－６５０」、東ソー株式会社製）に負荷した後、蒸留水で溶出される第１ボイドボリューム画分を回収する。次いで、第１ボイドボリューム画分を上記イオン交換カラムとは逆のイオン交換基を有するカラム（たとえば商品名：「トヨパール（登録商標）ＳＰ－６５０」、東ソー株式会社製）に負荷した後、蒸留水で溶出される第２ボイドボリューム画分を回収する。
【0047】
次に、第２ボイドボリューム画分をゲル濾過カラム（たとえば商品名：「セファデックスＬＨ－２０」、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に負荷し、３０質量％メタノール水溶液で溶出することにより、上記特定のペプチドが含まれる画分を回収する。最後に、この画分に対して逆相カラム（たとえば商品名：「μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Åカラム」、ウォーターズ社製）を装填した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む３２質量％以下のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配で分画することにより、特定のペプチドを高純度で得ることができる。
【0048】
＜脳機能改善剤または脳機能低下予防剤＞
本発明に係る脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤であることが好ましい。脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有し、もって後述する［評価試験１］および［評価試験２］で説明するように、脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化促進作用を示すことができる。これにより脳機能調整剤は、脳機能改善効果および脳機能低下予防効果を奏することができる。したがって脳機能調整剤は、脳機能改善剤として脳機能が低下した患者の治療に用いることができる。脳機能調整剤は、脳機能低下予防剤として加齢などによる脳機能の低下を予防する目的で用いることもできる。
本発明に係る脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤であることが好ましい。脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有し、もって後述する［評価試験１］および［評価試験２］で説明するように、脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化促進作用を示すことができる。これにより脳機能調整剤は、脳機能改善効果および脳機能低下予防効果を奏することができる。したがって脳機能調整剤は、脳機能改善剤として脳機能が低下した患者の治療に用いることができる。脳機能調整剤は、脳機能低下予防剤として加齢などによる脳機能の低下を予防する目的で用いることもできる。
【0049】
上記脳機能調整剤は、脳神経細胞の分化促進作用を有することが好ましい。さらに脳機能調整剤は、脳神経細胞の細胞死抑制作用を有することが好ましい。脳機能調整剤は、記憶力または認知機能の改善作用を有することも好ましい。脳機能調整剤は、後述する［評価試験１］および［評価試験２］で説明するように、脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化促進作用を示すことができる。脳機能調整剤は、後述する［評価試験１］および［評価試験２］から、脳神経細胞の細胞死抑制作用を有することも考慮することができる。これらの作用を通じて脳機能調整剤は、記憶力または認知機能の改善作用を奏することができる。
【0050】
上記脳機能調整剤は、経口的にまたは非経口的に種々の形態で投与することができる。その形態としては、経口的に投与する場合、たとえば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁製剤、乳化製剤などの剤型とすることができる。さらに上述した剤型の脳機能調整剤を、飲食品に混合することもできる。
【0051】
上記脳機能調整剤は、非経口的に投与する場合、たとえば脳内への注入、注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤および吸入剤などの剤型とすることができる。脳機能調整剤の好ましい剤型としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、脳内へ直接注入するための液剤などを挙げることができる。脳機能調整剤は、たとえば上述したＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドを含むが、このトリペプチドは、腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が可能である。
【0052】
上記脳機能調整剤の投与量は、対象者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、製剤の種類などによって異なる。上記脳機能調整剤を経口投与する場合、当該投与量は、たとえば成人１日あたり０．０００１～２５００ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。上記脳機能調整剤は、その剤型がたとえば錠剤である場合、１錠当たり０．００１～８０質量％で脳機能調整剤が含まれる錠剤とし、たとえば粉剤である場合、０．００１～１００質量％で脳機能調整剤が含まれる粉剤とすることができる。上記投与量は、非経口的に投与する場合、その他の形態の製剤によって投与する場合などにおいて、経口投与の場合の投与量を参考にして適宜決めることができる。脳機能調整剤は、１日１～数回に分けて投与することができ、あるいは１～数日に１回投与することもできる。
【0053】
上記脳機能調整剤は、本発明の効果に悪影響を及ぼさない範囲で、他の有効成分、製剤用の担体などを適宜含有させることができる。他の有効成分として、たとえばドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アスタキサンチン、イチョウ葉エキス、アラキドン酸などを挙げることができる。さらに医薬製剤に製剤化する際に用いる薬学上許容される担体としては、希釈剤、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（乳糖、ショ糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（バレイショデンプン）および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム）などを挙げることができる。
【0054】
＜用途発明＞
本発明に係る脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、たとえばＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドの未知の属性として脳神経細胞の分化促進作用を有し、もって脳機能改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかの効果を得ることができる。換言すれば本発明は、脳機能調整用のＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩、もしくはその化学修飾体であるといえる。
本発明に係る脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、たとえばＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドの未知の属性として脳神経細胞の分化促進作用を有し、もって脳機能改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかの効果を得ることができる。換言すれば本発明は、脳機能調整用のＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩、もしくはその化学修飾体であるといえる。
【0055】
［飲食品］
本発明に係る飲食品は、上記脳機能調整剤を含む。たとえば脳機能調整剤に含まれることが好ましいＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドは、上述のとおり腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が可能である。したがって、本発明は、上記脳機能調整剤を含む飲食品として食事または飲料に混ぜて摂取することができる。さらに本発明に係る飲食品は、特定保健用食品、または機能性表示食品として用いることもできる。飲食品に含まれる脳機能調整剤の濃度としては、０．００１～１００質量％であることが好ましい。
本発明に係る飲食品は、上記脳機能調整剤を含む。たとえば脳機能調整剤に含まれることが好ましいＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドは、上述のとおり腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が可能である。したがって、本発明は、上記脳機能調整剤を含む飲食品として食事または飲料に混ぜて摂取することができる。さらに本発明に係る飲食品は、特定保健用食品、または機能性表示食品として用いることもできる。飲食品に含まれる脳機能調整剤の濃度としては、０．００１～１００質量％であることが好ましい。
【実施例0056】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0057】
［評価試験１：臨床試験］
＜試験食品（脳機能調整剤を含む飲食品）＞
試験食品として、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むコラーゲンペプチド混合物（商品名：「コラーゲンペプチドＣＰ－Ｂ」、新田ゼラチン株式会社製）を用いた。後述する試験期間中、被験者に対し１日１回５ｇの上記試験食品を、任意の飲料に添加することにより摂取させた。上記飲料の摂取時間については、特定しなかった。
＜試験食品（脳機能調整剤を含む飲食品）＞
試験食品として、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むコラーゲンペプチド混合物（商品名：「コラーゲンペプチドＣＰ－Ｂ」、新田ゼラチン株式会社製）を用いた。後述する試験期間中、被験者に対し１日１回５ｇの上記試験食品を、任意の飲料に添加することにより摂取させた。上記飲料の摂取時間については、特定しなかった。
【0058】
＜試験デザイン＞
試験期間は２０１６年１０月２０日から１１月２１日までの期間から選ばれる連続した４週間とした。オープンラベル介入前後の比較試験を、京都大学こころの未来研究センターで実行した。本試験では世界医師会の「ヘルシンキ宣言」の主旨の下、被験者全員に対してインフォームドコンセントを実施し、被験者全員から書面による同意を得た。本試験に対し、２０１５年９月１８日に京都大学心の先端研究ユニット倫理審査委員会から承認（承認番号：２７－Ｐ－１３）を得た。
試験期間は２０１６年１０月２０日から１１月２１日までの期間から選ばれる連続した４週間とした。オープンラベル介入前後の比較試験を、京都大学こころの未来研究センターで実行した。本試験では世界医師会の「ヘルシンキ宣言」の主旨の下、被験者全員に対してインフォームドコンセントを実施し、被験者全員から書面による同意を得た。本試験に対し、２０１５年９月１８日に京都大学心の先端研究ユニット倫理審査委員会から承認（承認番号：２７－Ｐ－１３）を得た。
【0059】
本試験では、灰白質量－脳健康管理指数（ＧＭ－ＢＨＱ：Gray Matter Volume－Brain Healthcare Quotient）スコア、神経線維の異方性－脳健康管理指数（ＦＡ－ＢＨＱ：Fractional Anisotropy－Brain Healthcare Quotient）スコア、軽度認知障害（ＭＣＩ）スコアおよび標準的言語対関連学習（Ｓ－ＰＡ）スコアを得ることにより、上記試験食品の脳機能に対する作用効果を評価した。
【0060】
＜被験者＞
本試験では、４９歳から６３歳（平均５６．１±３．６歳）の健康な３０名を被験者とした。被験者の主な採用基準としては、「コラーゲン加水分解物を試験開始以前１カ月間摂取していない者」、「ゼラチンを含め、主な食物アレルギーの既往歴がない者」、「脳梗塞および認知症などの神経疾患、精神疾患の既往歴のない者」である。その他、「https://www.acrin.org/Portals/0/Protocols/6684/ACRIN6684_Amend7_012412_master_ForOnline.pdf」のsection６に記載された事項を、被験者から除外する基準とした。試験期間中において、被験者の自己都合を理由とする１名の脱落者があった。さらに上記Ｓ－ＰＡスコアを得るための試験を、５名の被験者が自己都合により受けなかった。このためＳ－ＰＡスコアを得るための試験については２４名、それ以外の試験については２９名により、各プロトコールに従って統計解析を行った。
本試験では、４９歳から６３歳（平均５６．１±３．６歳）の健康な３０名を被験者とした。被験者の主な採用基準としては、「コラーゲン加水分解物を試験開始以前１カ月間摂取していない者」、「ゼラチンを含め、主な食物アレルギーの既往歴がない者」、「脳梗塞および認知症などの神経疾患、精神疾患の既往歴のない者」である。その他、「https://www.acrin.org/Portals/0/Protocols/6684/ACRIN6684_Amend7_012412_master_ForOnline.pdf」のsection６に記載された事項を、被験者から除外する基準とした。試験期間中において、被験者の自己都合を理由とする１名の脱落者があった。さらに上記Ｓ－ＰＡスコアを得るための試験を、５名の被験者が自己都合により受けなかった。このためＳ－ＰＡスコアを得るための試験については２４名、それ以外の試験については２９名により、各プロトコールに従って統計解析を行った。
【0061】
＜評価方法および評価結果＞
（ＭＲＩスキャン）
磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャンは、上記試験食品の摂取開始日の前日（以下、「介入前」とも記す）および上記試験食品の摂取終了日の翌日（摂取開始日から２９日目、以下、「介入後」とも記す）に実施した。介入前のＭＲＩの撮像は、２０１６年１０月２０日から１０月２４日までの間に実行し、介入後のＭＲＩの撮像は、２０１６年１１月１８日から１１月２１日までの間に実行した。ＭＲＩの撮像は、京都大学こころの未来研究センターで実行した。具体的なＭＲＩスキャンの方法については、『Nemoto K et al., "MRI-based Brain Healthcare Quotients: A bridge between neural and behavioral analyses for keeping the brain healthy", PLoS ONE, 2017, 12(10): e0187137（https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187137）』に記載された方法に従った。
（ＭＲＩスキャン）
磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャンは、上記試験食品の摂取開始日の前日（以下、「介入前」とも記す）および上記試験食品の摂取終了日の翌日（摂取開始日から２９日目、以下、「介入後」とも記す）に実施した。介入前のＭＲＩの撮像は、２０１６年１０月２０日から１０月２４日までの間に実行し、介入後のＭＲＩの撮像は、２０１６年１１月１８日から１１月２１日までの間に実行した。ＭＲＩの撮像は、京都大学こころの未来研究センターで実行した。具体的なＭＲＩスキャンの方法については、『Nemoto K et al., "MRI-based Brain Healthcare Quotients: A bridge between neural and behavioral analyses for keeping the brain healthy", PLoS ONE, 2017, 12(10): e0187137（https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187137）』に記載された方法に従った。
【0062】
ＭＲＩ装置は独Ｓｉｅｍｅｎｓ社の３Ｔスキャナー「Ｖｅｒｉｏ」を使用し、３２チャンネルヘッドアレイコイルを用いて撮像した。３次元Ｔ１強調画像は、ＭＰ－ＲＡＧＥパルスシーケンスを使用した。パラメータは次のとおりである。反復時間（ＴＲ） １９００ｍｓ； エコー時間（ＴＥ） ２．５２ｍｓ； 反転時間（ＴＩ） ９００ｍｓ； フリップ角 ９°； マトリクスサイズ ２５６×２５６； 視野（ＦＯＶ） ２５６ｍｍ； スライス厚 １ｍｍである。拡散テンソル画像（ＤＴＩ）については、ＧＲＡＰＰＡを用いたスピンエコー・エコープレナーイメージング（ＳＥ－ＥＰＩ）を用いることにより収集した。拡散テンソル画像のスライスは、ＯＭ ｌｉｎｅに平行とした。
【0063】
パラメータは次のとおりである。反復時間（ＴＲ） １４１００ｍｓ； エコー時間（ＴＥ） ８１ｍｓ； フリップ角 ９０°； マトリクスサイズ １１４×１１４； 視野（ＦＯＶ） ２２４ｍｍ； スライス厚 ２ｍｍである。ベースライン画像（ｂ＝０ｓ／ｍｍ2）およびｂ＝１０００ｓ／ｍｍ2の３０軸の拡散方向の画像を得た。
【0064】
Ｔ１強調画像から脳機能マッピングツールであるＳＰＭ１２を用いて灰白質を抽出し、灰白質容積と頭蓋内容積とを用いて全脳のＧＭ－ＢＨＱスコアを算出した。拡散テンソル画像からソフトウエアであるＦＳＬ ５．０．１１を用いてｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ（ＦＡ）画像を生成し、これに基づいて全脳のＦＡ－ＢＨＱスコアを算出した。
【0065】
ここでＧＭ－ＢＨＱスコア、およびＦＡ－ＢＨＱスコアを算出する過程で行う統計処理に用いたツールは、医学用統計プログラムである「ＳＴＡＴ ＭａｔｅＩＩＩ」である。有意性の評価は、介入前後の群内比較をウィルコクソンの順位和検定に基づいて行い、有意水準（Ｐ値）が０．０５以下である場合に介入前後で有意性ありと判断した。ＧＭ－ＢＨＱスコアおよびＦＡ－ＢＨＱスコアの介入前後の値、その差、Ｐｖａｌｕｅ（Ｐ値）を下記表１に示す。表１中、「Ｎ」が被験者数を意味し、「Ｂａｓｅｌｉｎｅ」が介入前を意味し、「Ｐｏｓｔ」が介入後を意味し、「Δ」が介入前後の差を示す。
【0066】
【表1】
【0067】
表１によれば、ＦＡ－ＢＨＱスコアにおいて介入前後で有意性のある改善が見られた。ＧＭ－ＢＨＱスコアにおいて有意性のある改善は得られなかった。したがって、上記試験食品（脳機能調整剤としてのＧｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物）には、脳機能を調整する作用を有することが分かった。
【0068】
（ＭＣＩスコア）
認知機能確認スケールである「あたまの健康チェック（ミレニア株式会社製）」を用いることにより、軽度認知障害（ＭＣＩ）スコアを算出した。具体的には、被験者に１０個の単語を覚えさせ、試験とは無関係の解説をはさんだ後、上記１０個の単語のうち何個を口頭で回答できるかを測定した。各被験者のＭＣＩスコアは、被験者の性別、年齢、学習年数、人種などの情報を基に、各被験者の試験結果を同年齢グル―プと比較し、人口統計学的に客観評価することにより校正した。本試験については、各被験者に対してＭＲＩスキャンが行われた日と同日に実施した。
認知機能確認スケールである「あたまの健康チェック（ミレニア株式会社製）」を用いることにより、軽度認知障害（ＭＣＩ）スコアを算出した。具体的には、被験者に１０個の単語を覚えさせ、試験とは無関係の解説をはさんだ後、上記１０個の単語のうち何個を口頭で回答できるかを測定した。各被験者のＭＣＩスコアは、被験者の性別、年齢、学習年数、人種などの情報を基に、各被験者の試験結果を同年齢グル―プと比較し、人口統計学的に客観評価することにより校正した。本試験については、各被験者に対してＭＲＩスキャンが行われた日と同日に実施した。
【0069】
（Ｓ－ＰＡスコア）
標準的言語対関連学習（Ｓ－ＰＡ）スコアは、ヒトの言語性記憶を把握する目的で日本高次脳機能障害学会によって開発された。Ｓ－ＰＡスコアの具体的な試験の内容は、次のとおりである。まず有関係対語（意味的に関連のある単語）１０対と、無関係対語（意味的関連が希薄な単語）１０対より構成されたシートが準備される。次に、そのシートに記載された１０対の有関係対語を検査者が読み上げ、被験者に記憶してもらう。その後、これらの対となる単語の一方を提示し、これと対をなしていた他方の単語を回答させる。さらに、上記シートに記載された１０対の無関係対語を検査者が読み上げ、被験者に記憶してもらう。その後、これらの対となる単語の一方を提示し、これと対をなしていた他方の単語を回答させる。最後に、回答の正答数から各被験者のＳ－ＰＡスコアが算出される。なお介入前および介入後においては、それぞれ異なる１０対の有関係対語および１０対の無関係対語が記載されたシートが準備される。本試験についても、各被験者に対してＭＲＩスキャンが行われた日と同日に実施した。
標準的言語対関連学習（Ｓ－ＰＡ）スコアは、ヒトの言語性記憶を把握する目的で日本高次脳機能障害学会によって開発された。Ｓ－ＰＡスコアの具体的な試験の内容は、次のとおりである。まず有関係対語（意味的に関連のある単語）１０対と、無関係対語（意味的関連が希薄な単語）１０対より構成されたシートが準備される。次に、そのシートに記載された１０対の有関係対語を検査者が読み上げ、被験者に記憶してもらう。その後、これらの対となる単語の一方を提示し、これと対をなしていた他方の単語を回答させる。さらに、上記シートに記載された１０対の無関係対語を検査者が読み上げ、被験者に記憶してもらう。その後、これらの対となる単語の一方を提示し、これと対をなしていた他方の単語を回答させる。最後に、回答の正答数から各被験者のＳ－ＰＡスコアが算出される。なお介入前および介入後においては、それぞれ異なる１０対の有関係対語および１０対の無関係対語が記載されたシートが準備される。本試験についても、各被験者に対してＭＲＩスキャンが行われた日と同日に実施した。
【0070】
ここでＭＣＩスコアおよびＳ－ＰＡスコアを算出する過程で行う統計処理に用いたツールも上記「ＳＴＡＴ ＭａｔｅＩＩＩ」とした。有意性の評価は、介入前後の群内比較をウィルコクソンの順位和検定に基づいて行い、有意水準（Ｐ値）が０．０５以下である場合に介入前後で有意性ありと判断した。ＭＣＩスコアおよびＳ－ＰＡスコアの介入前後の値、その差、Ｐｖａｌｕｅ（Ｐ値）を下記表２に示す。表２中、「Ｎ」が被験者数を意味し、「Ｂａｓｅｌｉｎｅ」が介入前を意味し、「Ｐｏｓｔ」が介入後を意味し、「Δ」が介入前後の差を示す。
【0071】
【表2】
【0072】
表２によれば、ＭＣＩスコアおよびＳ－ＰＡスコアの両者において介入前後で有意性のある改善が見られた。表２の結果を、表１の結果を踏まえて考察すれば、上記試験食品は、脳機能を調整する作用を通じて記憶力または認知機能の改善作用を有し、もって脳機能改善効果が得られることが示唆される。さらに上述の結果から試験食品は、脳機能低下予防効果も得られることが示唆される。このため脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤として用いることができる。
【0073】
（被験者個々人の脳機能に対する脳機能調整剤の作用効果）
被験者個々人におけるＧＭ－ＢＨＱスコアの増減およびＦＡ－ＢＨＱスコアの増減と、ＭＣＩスコアの増減およびＳ－ＰＡスコアの増減との相関性の有無を調べることにより、被験者個々人の脳機能に対して、脳機能調整剤が及ぼす作用効果について検討した。上記の相関性については、各測定値を用いてスピアマンの順位相関係数（ｒ）を算出し、介入前後で統計処理を行った。この統計処理に用いたツールも上記「ＳＴＡＴ ＭａｔｅＩＩＩ」とした。ｒが０．２以下である場合を「相関なし」と、ｒが０．２超過０．４以下である場合を「低い相関あり」と、ｒが０．４超過０．７以下である場合を「相関あり」と、ｒが０．７超過１未満を「強い相関あり」と、ｒが１である場合を「完全な相関」とそれぞれ評価した。その結果であるｒの値を表３に示す。
被験者個々人におけるＧＭ－ＢＨＱスコアの増減およびＦＡ－ＢＨＱスコアの増減と、ＭＣＩスコアの増減およびＳ－ＰＡスコアの増減との相関性の有無を調べることにより、被験者個々人の脳機能に対して、脳機能調整剤が及ぼす作用効果について検討した。上記の相関性については、各測定値を用いてスピアマンの順位相関係数（ｒ）を算出し、介入前後で統計処理を行った。この統計処理に用いたツールも上記「ＳＴＡＴ ＭａｔｅＩＩＩ」とした。ｒが０．２以下である場合を「相関なし」と、ｒが０．２超過０．４以下である場合を「低い相関あり」と、ｒが０．４超過０．７以下である場合を「相関あり」と、ｒが０．７超過１未満を「強い相関あり」と、ｒが１である場合を「完全な相関」とそれぞれ評価した。その結果であるｒの値を表３に示す。
【0074】
【表3】
【0075】
表３によれば、ＧＭ－ＢＨＱスコアの増減とＭＣＩスコアの増減との間に相関が認められ、ＦＡ－ＢＨＱスコアの増減とＳ－ＰＡスコアの増減との間に相関が認められた。
【0076】
＜考察＞
上記によれば、特定のペプチドを含有する脳機能調整剤は、被験者個々人の脳機能に及ぼす作用効果に注目すれば、ＦＡ－ＢＨＱスコアが改善することによってＳ－ＰＡスコアが改善し、ＧＭ－ＢＨＱスコアが改善することによってＭＣＩスコアが改善することが推定された。このため脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤として用いることができる。
上記によれば、特定のペプチドを含有する脳機能調整剤は、被験者個々人の脳機能に及ぼす作用効果に注目すれば、ＦＡ－ＢＨＱスコアが改善することによってＳ－ＰＡスコアが改善し、ＧＭ－ＢＨＱスコアが改善することによってＭＣＩスコアが改善することが推定された。このため脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤として用いることができる。
【0077】
［評価試験２：細胞生物学的試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）］
＜試料の準備＞
すべての実験動物は、総理府の「実験動物の飼育および保管などに関する基準」および城西大学生命科学研究センターの「動物実験に関するガイドライン」に従った。１５～２５週齢雄性および雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。その後、上記ラットを湿度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、照明サイクル１２時間、明期７：００～１９：００、固形試料（商品名：「ＣＥ－２」、日本クレア株式会社製）および自由飲水の条件の下で飼育するとともに、同じ条件下で交配させることにより生後７日齢ラットを得た。さらに生後３～８日齢の上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。
＜試料の準備＞
すべての実験動物は、総理府の「実験動物の飼育および保管などに関する基準」および城西大学生命科学研究センターの「動物実験に関するガイドライン」に従った。１５～２５週齢雄性および雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。その後、上記ラットを湿度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、照明サイクル１２時間、明期７：００～１９：００、固形試料（商品名：「ＣＥ－２」、日本クレア株式会社製）および自由飲水の条件の下で飼育するとともに、同じ条件下で交配させることにより生後７日齢ラットを得た。さらに生後３～８日齢の上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。
【0078】
（初代培養小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の調製および培養）
上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットを上述した条件下で生後７～９日齢まで飼育した後、これらから小脳を摘出し、これを表４に示す各分散溶液（Ｉ液～Ｖ液）を用いた後述の方法により分散することにより、上記小脳から顆粒細胞およびその他の脳神経細胞（以下、これらの細胞を総称して「小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）」とも記す）を含む分散液を得た。この小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）は、脳神経細胞である。その後、当該分散液に含まれるＣＧＣを培養した。上記分散溶液の「溶液名」、「含有試薬」および「その量」を表４に示す。小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の調製方法は、次のとおりである。
上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットを上述した条件下で生後７～９日齢まで飼育した後、これらから小脳を摘出し、これを表４に示す各分散溶液（Ｉ液～Ｖ液）を用いた後述の方法により分散することにより、上記小脳から顆粒細胞およびその他の脳神経細胞（以下、これらの細胞を総称して「小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）」とも記す）を含む分散液を得た。この小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）は、脳神経細胞である。その後、当該分散液に含まれるＣＧＣを培養した。上記分散溶液の「溶液名」、「含有試薬」および「その量」を表４に示す。小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の調製方法は、次のとおりである。
【0079】
【表4】
【0080】
まず、生後７～９日齢の上記ラット１０匹を断頭し、クリーンベンチ内で小脳を摘出し、余分な組織、血管、漿膜などを除去した後、それをカミソリでミンチ状のペーストにした。このペーストにＩ液を添加することにより懸濁液とし、この懸濁液を１０００ｒｐｍで３０秒間遠心することにより上清と細胞群と含む第１分離液を得た。この第１分離液から上清を除去した後、残存する細胞群に対し、あらかじめ恒温槽内で３７℃に加温しておいたＩＩ液を少量ずつ加え撹拌し、これを５０ｍＬメディウム瓶に移し、さらに３７℃で１５分間撹拌することによりｔｒｙｐｓｉｎによる組織消化を行った。
【0081】
次に、上記メディウム瓶にＩＶ液を加えて上記ｔｒｙｐｓｉｎを失活させ、さらに１０００ｒｐｍで３０秒間遠心することにより、上清と細胞群と含む第２分離液を得た。この第２分離液から上清を除去した後、残存する細胞群に対しパスツールピペットを用いて少量のＩＩＩ液を添加することにより、これを分散させた。その後、１５分間静置することにより上清と細胞群と含む第３分離液を得、その上清をＶ液中に採取した。さらに第３分離液中に残存する細胞群に対し少量のＩＩＩ液を添加することにより、これを再分散させた。その後、５～１０分間静置することにより上清と細胞群と含む第４分離液を得、その上清を第３分離液の上清を含む上記Ｖ液に採取した。
【0082】
第３分離液の上清および第４分離液の上清を含む上記Ｖ液を、１０００ｒｐｍで５分間遠心することにより上清と細胞群と含む第５分離液を得た。この第５分離液から上清を除去した後、残存する細胞群に対して基礎培地（ＢＭＥ：Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ、シグマアルドリッチ社製）を添加し、撹拌することにより、小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）およびＢＭＥを含む混合液を得た。その後、この混合液を０．４質量％濃度のｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ液で染色し、染色された細胞数と、その生存率を計測した。
【0083】
次に、上記混合液に対し、生存している細胞の細胞密度が１．２×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬとなるようにＫ+５ｍＭ血清（＋）ＢＭＥを添加し、懸濁することにより培養用試料を得た。この培養用試料を、あらかじめ５０μｇ／ｍＬ濃度のｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎ（ＰＬＬ）でコーティングされた１２ｗｅｌｌプレートに０．７６６ｍＬずつ播種し、３７℃、５体積％濃度のＣＯ2としたインキュベーターの環境下で培養した（この日を「培養０日目」とする）。
【0084】
培養１日目に各ｗｅｌｌに対し、ＣＧＣのみを維持し、非神経細胞の増殖を抑制する目的で、最終濃度が１０μＭとなるようにｃｙｔｏｓｉｎｅ β－Ｄ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ）を添加した。さらにＫＣｌを、後述する対照試料において最終濃度が２５ｍＭとなるように添加し、それ以外の試料（後述する表５～７に示すペプチドまたはアミノ酸を添加した試料）においては、最終濃度が１５ｍＭとなるように調整して添加した。
【0085】
さらに培養１日目および培養４日目に、下記表５～７に示すペプチドまたはアミノ酸を、それぞれ表５～７に示す最終濃度となるように添加することにより各試料を調製した。
【0086】
培養７日目には、ＭＴＴアッセイ法を用い、ＣＧＣの細胞生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を計測することにより、各試料のＣＧＣに対する分化促進作用の有無を調べた。具体的には、ＫＣｌ濃度が２５ｍＭである対照試料の細胞生存数に対する各試料の細胞生存数の百分率を求め、これを統計処理することにより、ＣＧＣに対する分化促進作用の有意性を評価した。この有意性の評価は、統計処理としてソフトウエア（商品名：「エクセル統計（Ｖｅｒ２．１）」、株式会社社会情報サービス製」を用い、Ｓｍｉｒｎｏｖ－Ｇｒｕｂｂｓ（両側検定）を実行し、かつ有意水準（Ｐ値）を０．０５として棄却した。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ（ｔ検定）を実行することにより判断した。結果を表５～表７示す。表５～７中「＊（アスタリスク）」が付された試料において、ＣＧＣの分化促進作用を有する（有意性がある）と判断された。
【0087】
ここで表５中、「対照（Ｋ+）」は、対照試料を意味する。「ＮＭＤＡ」（商品名：「Ｍ３２６２」、シグマアルドリッチ社製）は、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸を添加した試料を意味し、「ＢＤＮＦ」（商品名：「ＳＲＰ３０１４」、シグマアルドリッチ社製）は、脳由来神経栄養因子を添加した試料を意味する。「ＮＭＤＡ」および「ＢＤＮＦ」は、脳神経細胞の分化に関与することが知られ、いずれも本試験において参考例となる。
【0088】
さらに表５～表７中に表されるペプチドについては、アミノ酸を一文字で表記する略号を用いる。Ｃは環状（Ｃｙｃｌｉｃ）を表し、Ｈはヒスチジンを表し、Ｐはプロリンを表し、Ｇはグリシンを表し、Ｏはヒドロキシプロリンを表し、Ｅはグルタミン酸を表し、Ａはアラニンを表す。すなわち表５中、「Ｃ－ＨＰ」は、ヒスチジン－プロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「Ｃ－ＧＰ」は、グリシン－プロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「ＴＲＨ」は、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。これらは、脳血液脳関門を通過することが知られ、いずれも比較例となる。表５中、「グルタミン酸」は、抗酸化作用が知られるグルタミン酸（商品名：「Ｇ１２５１」、シグマアルドリッチ社製）を添加した試料を意味する。「グルタチオン」は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＥＯＧ）に化学構造が類似するグルタチオン（商品名：「Ｇ６０１３」、シグマアルドリッチ社製）を添加した試料を意味する。「ＧＰＯ」は、グリシン－プロリン－ヒドロキシプロリンからなるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を意味する。「グルタミン酸」、「グルタチオン」および「ＧＰＯ」は、いずれも比較例となる。
【0089】
表６中、「Ｃ－ＰＯ」は、プロリン－ヒドロキシプロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「Ｃ－ＯＧ」は、ヒドロキシプロリン－グリシンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「Ｃ－ＥＯ」は、グルタミン酸－ヒドロキシプロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。表６中、「ＰＯ」は、プロリン－ヒドロキシプロリンからなるジペプチド（商品名：「Ｇ－３０２５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）を添加した試料を、「ＯＧ」は、ヒドロキシプロリン－グリシンからなるジペプチド（商品名：「Ｇ－２３６５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）を添加した試料を、「ＡＯ」は、アラニン－ヒドロキシプロリンからなるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。「ＰＯ」については、脳血液脳関門を通過することが知られている。「Ｃ－ＰＯ」、「Ｃ－ＯＧ」、「Ｃ－ＥＯ」、「ＰＯ」、「ＯＧ」および「ＡＯ」は、いずれも比較例となる。
【0090】
表７中、「ＧＰ」は、グリシン－プロリンからなるジペプチド（商品名：「Ｇ－３０１５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）を添加した試料を、「ＥＯ」は、グルタミン酸－ヒドロキシプロリンからなるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。「ＧＰ」および「ＥＯ」は、いずれも比較例となる。「ＥＯＧ」は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を意味し、本試験において実施例となる。
【0091】
【表5】
【0092】
【表6】
【0093】
【表7】
【0094】
＜考察＞
表５～７によれば、ＥＯＧは、ＮＭＤＡおよびＢＤＮＦを添加した参考例と同様に、直接ＣＧＣに作用することにより、ＣＧＣの分化を促進する作用を有することが分かった。表５～７からＥＯＧは、ＣＧＣの細胞死を抑制する作用を有することも示唆された。
表５～７によれば、ＥＯＧは、ＮＭＤＡおよびＢＤＮＦを添加した参考例と同様に、直接ＣＧＣに作用することにより、ＣＧＣの分化を促進する作用を有することが分かった。表５～７からＥＯＧは、ＣＧＣの細胞死を抑制する作用を有することも示唆された。
【0095】
＜評価試験１および評価試験２から得られる考察＞
上述した評価試験１および評価試験２によれば、本発明に係る脳機能調整剤およびそれを含む飲食品は、脳神経細胞に直接作用することにより、脳神経細胞の分化を促進することができる。このような作用により脳機能調整剤およびそれを含む飲食品は、記憶力または認知機能の改善作用を奏することができる。もって脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤として用いることができる。
上述した評価試験１および評価試験２によれば、本発明に係る脳機能調整剤およびそれを含む飲食品は、脳神経細胞に直接作用することにより、脳神経細胞の分化を促進することができる。このような作用により脳機能調整剤およびそれを含む飲食品は、記憶力または認知機能の改善作用を奏することができる。もって脳機能調整剤は、脳機能改善剤または脳機能低下予防剤として用いることができる。
【0096】
［評価試験３：ＥＯＧの有効濃度を分析するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験］
培養１日目および培養４日目にＥＯＧを、表８に示す最終濃度となるように添加した以外は、評価試験２と同じ方法を用いることにより、ＣＧＣに対して分化促進作用を奏することができるＥＯＧの有効濃度を調べた。結果を表８に示す。
培養１日目および培養４日目にＥＯＧを、表８に示す最終濃度となるように添加した以外は、評価試験２と同じ方法を用いることにより、ＣＧＣに対して分化促進作用を奏することができるＥＯＧの有効濃度を調べた。結果を表８に示す。
【0097】
【表8】
【0098】
＜考察＞
表８によれば、ＥＯＧは、その濃度が７μＭ以上である場合、ＣＧＣに対して分化促進作用を有意に奏することができる。
表８によれば、ＥＯＧは、その濃度が７μＭ以上である場合、ＣＧＣに対して分化促進作用を有意に奏することができる。
【0099】
［評価試験４：経口摂取したＥＯＧの脳実質への送達性を分析する評価試験］
＜試料の準備＞
すべての実験動物は、総理府の「実験動物の飼育および保管などに関する基準」に従った。８週齢ｄｄｙ系雄性マウスを三協ラボサービス株式会社から２匹購入した。その後、上記雄性マウスを１週間順化させて９週齢雄性マウスとした後、１２時間絶食させた。次いで、上記雄性マウスに対しＥＯＧ（Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、株式会社ピーエイチジャパン製、純度９５％以上）２０ｍｇを、２５０μＬの水溶液として強制的に経口投与することにより、ＥＯＧの脳実質への送達性を分析する雄性マウスを２匹準備した。
＜試料の準備＞
すべての実験動物は、総理府の「実験動物の飼育および保管などに関する基準」に従った。８週齢ｄｄｙ系雄性マウスを三協ラボサービス株式会社から２匹購入した。その後、上記雄性マウスを１週間順化させて９週齢雄性マウスとした後、１２時間絶食させた。次いで、上記雄性マウスに対しＥＯＧ（Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、株式会社ピーエイチジャパン製、純度９５％以上）２０ｍｇを、２５０μＬの水溶液として強制的に経口投与することにより、ＥＯＧの脳実質への送達性を分析する雄性マウスを２匹準備した。
【0100】
上記雄性マウスに対し、経口投与前（０時間）、経口投与１時間経過後、２時間経過後および４時間経過後の各１０分前に麻酔剤を皮下注射した。上記麻酔剤は、三種混合麻酔と呼ばれ、塩酸メデトミジン０．３ｍｇ／ｋｇと、ミダゾラム４ｍｇ／ｋｇと、酒石酸ブトルファノール４ｍｇ／ｋｇとを含む。上記麻酔剤を注射した時点から１０分後に、上記雄性マウスからそれぞれ脳脊髄液を０．５～７μＬ採取し、尾静脈から血液を２０～８０μＬ採取し、さらに脳実質の一部（以下、単に「脳」とも記す）を０．２８～０．３３ｍｇ摘出した。
【0101】
上記血液に対しては、まず４℃、遠心加速度２０４００Ｇで１０分間遠心分離することにより血漿を得、これを一時的に－８０℃で保存した。次いで、上記血漿の液量の３倍量のエタノールと混合した後、４℃、遠心加速度１０００Ｇおよび１０分間の条件で遠心分離を行うことにより上清を得た。その後、上記上清に対して５０ｍＭに調製した重炭酸アンモニウムを上記上清の液量の４倍量加えて混合した。さらに上記重炭酸アンモニウムを含む上記上清を０．２μｍフィルター（ザルトリウス株式会社製）で濾過することにより、上記雄性マウスの血漿中のＥＯＧ量を測定するための各試料（経口投与前（０時間）、経口投与１時間経過後、２時間経過後および４時間経過後の各試料。これらを総称して以下、「試料ａ」とも記す）を得た。
【0102】
上記脳脊髄液に対しては、上記脳脊髄液の液量の３倍量のエタノールと混合した後、４℃、遠心加速度１０００Ｇおよび１０分間の条件で遠心分離を行った。その後、上記遠心分離を行った脳脊髄液に対して５０ｍＭに調製した重炭酸アンモニウムを５０μＬ加えて混合した。さらに上記重炭酸アンモニウムを含む上記脳脊髄液を０．２μｍフィルター（ザルトリウス株式会社製）で濾過することにより、上記雄性マウスの脳脊髄液中のＥＯＧ量を測定するための各試料（経口投与前（０時間）、経口投与１時間経過後、２時間経過後および４時間経過後の各試料。これらを総称して以下、「試料ｂ」とも記す）を得た。
【0103】
上記脳に対しては、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した後、アルミホイルで包み、次いで液体窒素中で凍結後、冷凍庫（－８０℃）で凍結保存した。その後上記脳を解凍し、上記脳と等量のＰＢＳでホモジネートし、さらに上記脳の重量に対して３倍量のアセトニトリルと混合した後、４℃、遠心加速度１０００Ｇおよび１０分間の条件で遠心分離を行うことにより懸濁液を得た。次に、上記懸濁液に対して５０ｍＭに調製した重炭酸アンモニウムを上記懸濁液の液量の２倍量加えて混合した。さらに上記重炭酸アンモニウムを含む上記懸濁液を０．２μｍフィルター（ザルトリウス株式会社製）で濾過することにより、脳中のＥＯＧ量を測定するための各試料（経口投与前（０時間）、経口投与１時間経過後、２時間経過後および４時間経過後の各試料。これらを総称して以下、「試料ｃ」とも記す）を得た。
【0104】
上記試料ａ、試料ｂおよび試料ｃ中のＥＯＧ量を、後述する条件のＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量解析した。各試料については適宜希釈されているため、以下の計算式を用いて補正することにより実際のＥＯＧ量を求めた。
実際のＥＯＧ量（μＭ）＝分析値（ｎＭ）×希釈換算係数／１０００（単位換算）。
実際のＥＯＧ量（μＭ）＝分析値（ｎＭ）×希釈換算係数／１０００（単位換算）。
【0105】
結果を、図１、図２および図３に示す。図１は、雄性マウスに対しＥＯＧを強制的に経口投与した後、所定時間後の雄性マウスの血漿（試料ａ）中のＥＯＧ量を表すグラフである。図２は、雄性マウスに対しＥＯＧを強制的に経口投与した後、所定時間後の雄性マウスの脳脊髄液（試料ｂ）中のＥＯＧ量を表すグラフである。図３は、雄性マウスに対しＥＯＧを強制的に経口投与した後、所定時間後の雄性マウスの脳（試料ｃ）中のＥＯＧ量を表すグラフである。また図１～図３に示すＥＯＧ量は、２匹の雄性マウスから得られた平均値である。
【0106】
なお、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量解析は、次の条件で実行した。
ＨＰＬＣ装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ ２．１×１５０ｍｍ、５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ． Ｉｎｃ製）
カラム温度：４０℃（リニアグラジエント）
移動相：（Ａ）０．２％ギ酸および２ｍＭ酢酸アンモニウム含有水溶液
（Ｂ）１００％メタノール
（グラジエント設定）
Ｔｉｍｅ（分） 流速（μＬ／分） 移動相（Ａ）の質量％
イニシャル ２００ ９８
３．５０ ２００ ９８
３．５１ ４００ ５
７．００ ４００ ５
７．１０ ２００ ９８
１７．００ ２００ ９８
注入量：０．５μｌ。
ＨＰＬＣ装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ ２．１×１５０ｍｍ、５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ． Ｉｎｃ製）
カラム温度：４０℃（リニアグラジエント）
移動相：（Ａ）０．２％ギ酸および２ｍＭ酢酸アンモニウム含有水溶液
（Ｂ）１００％メタノール
（グラジエント設定）
Ｔｉｍｅ（分） 流速（μＬ／分） 移動相（Ａ）の質量％
イニシャル ２００ ９８
３．５０ ２００ ９８
３．５１ ４００ ５
７．００ ４００ ５
７．１０ ２００ ９８
１７．００ ２００ ９８
注入量：０．５μｌ。
【0107】
ＭＳ／ＭＳ装置：「Ｘｅｖｏ ＴＱ－ＸＳ」、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製
イオン化法：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＥＳＩ
Ｃａｐｉｌａｒｙ （ｋＶ）：１
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：５００
Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：１５０
ＭＲＭ条件：
ペプチド（略号） precursor ion（ｍ／ｚ） product ion（ｍ／ｚ）
Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＥＯＧ） ３１８ ２２５。
イオン化法：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＥＳＩ
Ｃａｐｉｌａｒｙ （ｋＶ）：１
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：５００
Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）：１５０
ＭＲＭ条件：
ペプチド（略号） precursor ion（ｍ／ｚ） product ion（ｍ／ｚ）
Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＥＯＧ） ３１８ ２２５。
【0108】
＜考察＞
図１～図３によれば、強制的にＥＯＧが経口投与された雄性マウスでは、ＥＯＧが血液中に移行し、次いで脳脊髄液に移行することが理解される。脳脊髄液に移行したＥＯＧは、経口投与後１時間程度の短時間で脳組織にも移行することが理解される。以上より、経口摂取したＥＯＧは血液を介することにより、その一部が脳脊髄液を経て脳組織に送達されることが示唆された。
図１～図３によれば、強制的にＥＯＧが経口投与された雄性マウスでは、ＥＯＧが血液中に移行し、次いで脳脊髄液に移行することが理解される。脳脊髄液に移行したＥＯＧは、経口投与後１時間程度の短時間で脳組織にも移行することが理解される。以上より、経口摂取したＥＯＧは血液を介することにより、その一部が脳脊髄液を経て脳組織に送達されることが示唆された。
【0109】
以上のように本発明の実施の形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施の形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。
【0110】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する、脳機能調整剤。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0077】
［評価試験２：細胞生物学的試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）］
＜試料の準備＞
すべての実験動物は、総理府の「実験動物の飼育および保管などに関する基準」および城西大学生命科学研究センターの「動物実験に関するガイドライン」に従った。１５～２５週齢雄性および雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。その後、上記ラットを温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、照明サイクル１２時間、明期７：００～１９：００、固形飼料（商品名：「ＣＥ－２」、日本クレア株式会社製）および自由飲水の条件の下で飼育するとともに、同じ条件下で交配させることにより生後７日齢ラットを得た。さらに生後３～８日齢の上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。
＜試料の準備＞
すべての実験動物は、総理府の「実験動物の飼育および保管などに関する基準」および城西大学生命科学研究センターの「動物実験に関するガイドライン」に従った。１５～２５週齢雄性および雌性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。その後、上記ラットを温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、照明サイクル１２時間、明期７：００～１９：００、固形飼料（商品名：「ＣＥ－２」、日本クレア株式会社製）および自由飲水の条件の下で飼育するとともに、同じ条件下で交配させることにより生後７日齢ラットを得た。さらに生後３～８日齢の上記Ｗｉｓｔａｒ系ラットを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0088】
さらに表５～表７中に表されるペプチドについては、アミノ酸を一文字で表記する略号を用いる。Ｃは環状（Ｃｙｃｌｉｃ）を表し、Ｈはヒスチジンを表し、Ｐはプロリンを表し、Ｇはグリシンを表し、Ｏはヒドロキシプロリンを表し、Ｅはグルタミン酸を表し、Ａはアラニンを表す。すなわち表５中、「Ｃ－ＨＰ」は、ヒスチジン－プロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「Ｃ－ＧＰ」は、グリシン－プロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「ＴＲＨ」は、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。これらは、血液脳関門を通過することが知られ、いずれも比較例となる。表５中、「グルタミン酸」は、抗酸化作用が知られるグルタミン酸（商品名：「Ｇ１２５１」、シグマアルドリッチ社製）を添加した試料を意味する。「グルタチオン」は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＥＯＧ）に化学構造が類似するグルタチオン（商品名：「Ｇ６０１３」、シグマアルドリッチ社製）を添加した試料を意味する。「ＧＰＯ」は、グリシン－プロリン－ヒドロキシプロリンからなるトリペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を意味する。「グルタミン酸」、「グルタチオン」および「ＧＰＯ」は、いずれも比較例となる。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0089】
表６中、「Ｃ－ＰＯ」は、プロリン－ヒドロキシプロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「Ｃ－ＯＧ」は、ヒドロキシプロリン－グリシンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料を、「Ｃ－ＥＯ」は、グルタミン酸－ヒドロキシプロリンからなる環状ジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。表６中、「ＰＯ」は、プロリン－ヒドロキシプロリンからなるジペプチド（商品名：「Ｇ－３０２５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）を添加した試料を、「ＯＧ」は、ヒドロキシプロリン－グリシンからなるジペプチド（商品名：「Ｇ－２３６５」、ＢＡＣＨＥＭ社製）を添加した試料を、「ＡＯ」は、アラニン－ヒドロキシプロリンからなるジペプチド（株式会社ピーエイチジャパン製）を添加した試料をそれぞれ意味する。「ＰＯ」については、血液脳関門を通過することが知られている。「Ｃ－ＰＯ」、「Ｃ－ＯＧ」、「Ｃ－ＥＯ」、「ＰＯ」、「ＯＧ」および「ＡＯ」は、いずれも比較例となる。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
【表7】