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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024160866
(43)【公開日】2024-11-15
(54)【発明の名称】二糖類およびセルラーゼ剤の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/12 20060101AFI20241108BHJP
C12P 7/08 20060101ALI20241108BHJP
C12N 9/42 20060101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
C12P19/12
C12P7/08
C12N9/42
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023076338
(22)【出願日】2023-05-02
(71)【出願人】
【識別番号】390006264
【氏名又は名称】関西化学機械製作株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】502059825
【氏名又は名称】Ｂｉｏ－ｅｎｅｒｇｙ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100182084
【弁理士】
【氏名又は名称】中道 佳博
(72)【発明者】
【氏名】▲濱▼ 真司
(72)【発明者】
【氏名】木原 真希
(72)【発明者】
【氏名】野田 秀夫
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AC03
4B064AF03
4B064CA06
4B064CA21
4B064CB30
4B064CD09
4B064CD24
4B064DA16
(57)【要約】
【課題】 希少な糖であるグルコース２分子が脱水縮合した糖の、従来の方法よりもコストや時間の観点から優れている、新たな製造方法を提供すること。
【解決手段】 本発明のグルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法は、グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む。本発明によれば、効率的にセルラーゼ等の誘導効果を有するグルコース２分子が脱水縮合した糖を製造することが可能となる。また、二糖類を用いることで、最終的にセルロース等を含む産業廃棄物などから糖化発酵産物を製造することも可能である。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明のグルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法は、グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む。本発明によれば、効率的にセルラーゼ等の誘導効果を有するグルコース２分子が脱水縮合した糖を製造することが可能となる。また、二糖類を用いることで、最終的にセルロース等を含む産業廃棄物などから糖化発酵産物を製造することも可能である。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む、グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法。
【請求項2】
該接触が、グルコースを含む培地中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記グルコース２分子が脱水縮合した糖が、ゲンチオビオース、セロビオース、ソホロース、ラミナリビオースからなる群から選択される糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記グルコース２分子が脱水縮合した糖が、ゲンチオビオース、ソホロースおよびラミナリビオースを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記β－グルコシダーゼ表層提示微生物が、β－グルコシダーゼ表層提示酵母である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記β－グルコシダーゼ表層提示酵母が、サッカロマイセス属である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記β－グルコシダーゼがアスペルギルス属菌に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～７に記載の方法により得られたグルコース２分子が脱水縮合した糖を含む培地で、糸状菌を培養することを含む、セルラーゼ剤の製造方法
【請求項9】
前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記トリコデルマ属菌が、トリコデルマ・リーセイである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
請求項８～１０に記載の方法により得られたセルラーゼ剤とセルロースとを含む培地で、β－グルコシダーゼ表層提示微生物を培養することを含む、糖化発酵産物の製造方法。
【請求項12】
前記糖化発酵産物が、エタノールである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルコース２分子が脱水縮合した糖（例：ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等）の製造方法、および該二糖類を用いたセルラーゼ剤の製造方法、ならびに該セルラーゼ剤を用いた糖化発酵産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、セルロース系バイオマスの糖化が、燃料エタノールの生産等の観点から注目されており、該糖化のために、セルラーゼ等の酵素が大量に必要となる。セルラーゼ等の生産菌としては、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）属糸状菌が知られているが、該菌は、セルロースやバイオマス前処理物等の固形分を酵素生産の原料として用いている。
【0003】
しかしながら固形分を酵素生産の原料とする場合、残存固形分への吸着による生産酵素の回収率低下や、誘導物質の比率の変化に起因する酵素生産性の低下が懸念される。このような背景から、可溶性炭素源を原料とした培養によるセルラーゼの生産に関する種々の取り組みがなされている。
【0004】
上記可溶性炭素源としては、ラクトースのほか、セロビオース、ソホロース、ゲンチオビオース等のβ結合を有する二糖類が使用し得る。しかしながら、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオースといったグルコース２分子が脱水縮合した糖は自然界では希少な糖であり、定量分析は可能であるものの大量に入手することが難しい。そのため、大量に入手することができるグルコース等を原料に縮合反応を利用して合成する方法が研究されている（非特許文献１）。また、該反応を触媒するβ－グルコシダーゼの改良も多大な労力をかけて研究されている（非特許文献２）。
【0005】
しかしながら、上述したような方法等によりソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等の可溶性炭素源を製造した場合、そのコストは高額なものとなり、ひいてはセルラーゼの価格自体にも多大な影響を及ぼすこととなる。また、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等を一旦製造した上で、新たにセルラーゼの製造を行う必要もあり、所望するセルラーゼを取得するまでに多くの時間が必要となることも否めない。そのため、これらの問題点を解消し得るようなソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等のグルコース２分子が脱水縮合した糖の新たな製造方法の確立が切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Margarita V. Semenovaら, Open Glycoscience, 2009, 2: 20-24
【非特許文献2】K. Niuら, Bioresour. Bioprocess. (2020) 7:45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
従って、本発明の課題は、希少な糖であるグルコース２分子が脱水縮合した糖（例：ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等）の、従来の方法よりもコストや時間の観点から優れている、新たな製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、以前の研究において、セルラーゼで処理したセルロース材料を含有する培地を用いて、β－グルコシダーゼ表層提示微生物を培養する工程を含む、β－グルコシダーゼ表層提示微生物の培養方法等を確立している（国際公開第２０２０／００４４７３号）。そのため、本発明者らは、まず、該β－グルコシダーゼ表層提示微生物を、所望するグルコース２分子が脱水縮合した糖（例：ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等）の生成に用いることができないかを検討した。この検討において、本発明者らは、β－グルコシダーゼの酵素反応に着目し、グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることで、所望するソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース等の二糖類を取得し得るのではないかと着想した。
【0009】
該着想に基づいて、鋭意検討を行ったところ、実際にグルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることで、所望する二糖類を取得し得ることを見出した。また、特定の濃度以上のグルコースを含む培地中で、該接触を行った場合、さらに所望する二糖類の収率がよいことも見出した。上記二糖類はセルラーゼ等の誘導について優れた効果を有するため、該二糖類を用いてセルラーゼ等を誘導し、該誘導により得られたものを用いることで、最終的に糖化発酵産物を従来よりもコストや時間の観点から優れた態様にて取得し得ることも見出した。該知見をもとに、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む、グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法。
［２］該接触が、グルコースを含む培地中で行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記グルコース２分子が脱水縮合した糖が、ゲンチオビオース、セロビオース、ソホロース、ラミナリビオースからなる群から選択される糖を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記グルコース２分子が脱水縮合した糖が、ゲンチオビオース、ソホロースおよびラミナリビオースを含む、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記β－グルコシダーゼ表層提示微生物が、β－グルコシダーゼ表層提示酵母である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記β－グルコシダーゼ表層提示酵母が、サッカロマイセス属である、［５］に記載の方法。
［７］前記β－グルコシダーゼがアスペルギルス属菌に由来する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］［１］～［７］に記載の方法により得られたグルコース２分子が脱水縮合した糖を含む培地で、糸状菌を培養することを含む、セルラーゼ剤の製造方法
［９］前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、[８]に記載の方法。
［１０］前記トリコデルマ属菌が、トリコデルマ・リーセイである、［９］に記載の方法。
［１１］［８］～［１０］に記載の方法により得られたセルラーゼ剤とセルロースとを含む培地で、β－グルコシダーゼ表層提示微生物を培養することを含む、糖化発酵産物の製造方法。
［１２］前記糖化発酵産物が、エタノールである、［１１］に記載の方法。
［１］グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む、グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法。
［２］該接触が、グルコースを含む培地中で行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記グルコース２分子が脱水縮合した糖が、ゲンチオビオース、セロビオース、ソホロース、ラミナリビオースからなる群から選択される糖を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記グルコース２分子が脱水縮合した糖が、ゲンチオビオース、ソホロースおよびラミナリビオースを含む、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記β－グルコシダーゼ表層提示微生物が、β－グルコシダーゼ表層提示酵母である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記β－グルコシダーゼ表層提示酵母が、サッカロマイセス属である、［５］に記載の方法。
［７］前記β－グルコシダーゼがアスペルギルス属菌に由来する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］［１］～［７］に記載の方法により得られたグルコース２分子が脱水縮合した糖を含む培地で、糸状菌を培養することを含む、セルラーゼ剤の製造方法
［９］前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、[８]に記載の方法。
［１０］前記トリコデルマ属菌が、トリコデルマ・リーセイである、［９］に記載の方法。
［１１］［８］～［１０］に記載の方法により得られたセルラーゼ剤とセルロースとを含む培地で、β－グルコシダーゼ表層提示微生物を培養することを含む、糖化発酵産物の製造方法。
［１２］前記糖化発酵産物が、エタノールである、［１１］に記載の方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明を利用することで、従来よりも、より安価に且つ効率的に、セルラーゼ等の誘導効果を有するグルコース２分子が脱水縮合した糖を製造することが可能となる。また、該二糖類を用いることで、最終的に、セルロース等を含む産業廃棄物などから、従来よりもコストや時間の面から有利な態様にて、糖化発酵産物を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図6】図６は、グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造から糖化発酵産物の製造までの工業規模での実装例を示す。図中の１は、β－グルコシダーゼ表層提示微生物（例：酵母など）を培養する工程である。図中の２は、１で培養した微生物の一部を糖転移反応用の触媒として流用する工程である。該流用により、β－グルコシダーゼという糖転移反応作用のある触媒を、外部から調達することなく安価に用意し得る。図中の３は、グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物を接触させて、グルコースの酵素反応（糖転移反応）を行う工程である。該工程では、グルコース溶液に触媒（β－グルコシダーゼ表層提示微生物）を投入し、緩やかに攪拌を行ってもよい。図中の４は、工程３により、糖転移反応物を含む流加液（グルコースのうち一部がラミナリビオース、ゲンチビオース、ソホロース等のセルラーゼの誘導物質に置き換わった可溶性糖質の溶液）を用意する工程である。これをタンクに溜めておき、セルラーゼ生産のフィードストックに用いる。図中の５は、該フィードストックを用いて、セルラーゼ生産用糸状菌（例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei））の培養を行う工程である。該工程により所望するセルラーゼ剤を取得し得る。工程５で取得したセルラーゼ剤を、セルロース材料（例えば、バガスなどの農業残渣を前処理した固形分）に振りかけて、液状化させる工程である。工程６だけでは完全な糖化が行われることがないため、次の発酵工程で糖化発酵を完結させることになる。図中の７は、発酵槽において液化物の糖化発酵を進める工程である。該工程により、例えば、エタノールなどの糖化発酵産物を効率的に得ることができる。該工程では、工程１で培養したβ－グルコシダーゼ表層提示微生物を用いることで、糖化発酵産物の収率を高めることが可能となる。また、上記の工程で用いたβ－グルコシダーゼ表層提示微生物は、回収して再利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法
本発明は、グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む、グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法（以下、「本発明の二糖類の製造方法」と称する場合がある。）を提供する。
本発明は、グルコースと、β－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させることを含む、グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法（以下、「本発明の二糖類の製造方法」と称する場合がある。）を提供する。
【0014】
本明細書において、「グルコース２分子が脱水縮合した糖」とは、具体的には、β,β－トレハロース（β１－β１結合）、ソホロース（β１－２結合）、ラミナリビオース(β１－３結合),セロビオース(β１－４結合)およびゲンチオビオース(β１－６結合)等をいう（以下、これらを「β－グルコ二糖類」あるいは「β－グルコ二糖」と称する場合がある。）。これらの糖は、後述するセルラーゼの誘導物質として優れている。
【0015】
（ｉ）接触条件
グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物との接触は、グルコースを含む溶液中で行い得、例えば、グルコースを含む溶液中にβ－グルコシダーゼ表層提示微生物を添加することで接触を開始してもよい。また、該接触は、静置にて行ってもよく、該溶液を攪拌して行ってもよい。
グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物との接触は、グルコースを含む溶液中で行い得、例えば、グルコースを含む溶液中にβ－グルコシダーゼ表層提示微生物を添加することで接触を開始してもよい。また、該接触は、静置にて行ってもよく、該溶液を攪拌して行ってもよい。
【0016】
上記溶液は、グルコースを溶解し得るものであり、且つグルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物との接触により上述のβ－グルコ二糖類が生成されるものであれば特に限定されず、グルコース以外では、例えば、水（例：蒸留水、脱イオン水）、緩衝液（例：酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等）、培地（ＹＰＤ培地、ＹＭ培地、ＰＤ培地）等を含んでもよい。β－グルコ二糖類の効率的な生成の観点からは、該グルコースを含む溶液は、β－グルコシダーゼ表層提示微生物が少なくとも維持培養されるようなものであってもよい。
【0017】
本発明の接触を行う溶液中のグルコース濃度は、グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物との接触によりβ－グルコ二糖類が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば、１００ｇ／Ｌ～８００ｇ／Ｌ、好ましくは４００ｇ／Ｌ～８００ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ～８００ｇ／Ｌである。グルコースを含む溶液のｐＨは、グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物との接触によりβ－グルコ二糖類が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ２～ｐＨ１０、好ましくはｐＨ４～ｐＨ８、より好ましくは、ｐＨ５～ｐＨ７である。好気条件での接触の場合、該溶液中の溶存酸素濃度は、例えば、０．１ｐｐｍ～７ｐｐｍ、好ましくは０．１ｐｐｍ～５ｐｐｍ、より好ましくは０．１ｐｐｍ～３ｐｐｍである。該溶液の温度は、例えば、２０℃～８０℃、好ましくは４０℃～６０℃、より好ましくは５０℃である。
【0018】
該溶液中のβ－グルコシダーゼ表層提示微生物の量は、所望する量のβ－グルコ二糖類が生成される限り特に限定されないが、例えば、該微生物が酵母の場合、４ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ（湿潤量）／Ｌ、より好ましくは２０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上である。また、グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物との接触の際に攪拌を行う場合、攪拌速度は、所望する量のβ－グルコ二糖類が生成される限り特に限定されないが、例えば、１０ｒｐｍ～５００ｒｐｍ、好ましくは、２０ｒｐｍ～４００ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ～２００ｒｐｍである。グルコースとβ－グルコシダーゼ表層提示微生物とを接触させる時間は、所望する量のβ－グルコ二糖類が生成される限り特に限定されないが、例えば、２４時間～９６時間程度である。
【0019】
（ｉｉ）表層提示微生物の作製
本発明の製造方法で用いる「β－グルコシダーゼ表層提示微生物」とは、β－グルコシダーゼをその菌体細胞の表層である細胞膜、細胞壁、あるいは細胞壁と細胞膜の間の空間（ペリプラズムやinner wall zone）に局在させた微生物をいう。例えば、後述するβ－グルコシダーゼ遺伝子を含む表層提示カセットを用いて宿主微生物の形質転換を行うことにより、β－グルコシダーゼ表層提示形質転換微生物（単に「β－グルコシダーゼ表層提示微生物」ともいう。）が作出される。β－グルコシダーゼは現在、２種類知られており、それぞれβ－グルコシダーゼ１、β－グルコシダーゼ２と称される。β－グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来β－グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）（例えば、国際公開第２０１５／３３９４８号）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）由来のβ－グルコシダーゼ遺伝子（GenBank Sequence ID:Ｘ１５４１５．１）が挙げられるが、これに限定されない。
本発明の製造方法で用いる「β－グルコシダーゼ表層提示微生物」とは、β－グルコシダーゼをその菌体細胞の表層である細胞膜、細胞壁、あるいは細胞壁と細胞膜の間の空間（ペリプラズムやinner wall zone）に局在させた微生物をいう。例えば、後述するβ－グルコシダーゼ遺伝子を含む表層提示カセットを用いて宿主微生物の形質転換を行うことにより、β－グルコシダーゼ表層提示形質転換微生物（単に「β－グルコシダーゼ表層提示微生物」ともいう。）が作出される。β－グルコシダーゼは現在、２種類知られており、それぞれβ－グルコシダーゼ１、β－グルコシダーゼ２と称される。β－グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来β－グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）（例えば、国際公開第２０１５／３３９４８号）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）由来のβ－グルコシダーゼ遺伝子（GenBank Sequence ID:Ｘ１５４１５．１）が挙げられるが、これに限定されない。
【0020】
表層提示微生物は、後述する本発明の糖化発酵産物の製造方法でも用いるために、β－グルコシダーゼおよびキシロシダーゼを共に表層提示するものであってもよい。β－グルコシダーゼおよびキシロシダーゼを共に表層提示する微生物は、例えば、微生物を培養する培地がセルロースおよびヘミセルロースを含む場合に有用である。「β－グルコシダーゼ表層提示微生物」は、β－グルコシダーゼを表層提示する限り、他の１又は２以上のタンパク質（例えば、キシロシダーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ等）をさらに表層提示する微生物もまた包含する。「キシロシダーゼ表層提示微生物」は、キシロシダーゼを表層提示する限り、他の１又は２以上のタンパク質（例えば、β－グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ等）をさらに表層提示する微生物もまた包含する。
【0021】
上記キシロシダーゼ表層提示微生物は、キシロシダーゼをその菌体細胞の表層である細胞膜、細胞壁、あるいは細胞壁と細胞膜の間の空間（ペリプラズムやinner wall zone）に局在させた微生物をいう。キシロシダーゼとして、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来β－キシロシダーゼ（ＸｙｌＡ）が挙げられる。キシロシダーゼ表層提示微生物は、キシロースを代謝する微生物を用いて作出される。キシロースを代謝することができるように遺伝子組換えされた微生物であってもよい。そのような遺伝子組換え微生物として、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（通常は六炭糖のグルコースを代謝し、五炭糖のキシロースは代謝することができない）が、キシロース代謝性遺伝子を有するように形質転換され得る。キシロース資化性遺伝子としては、キシロース代謝系酵素の遺伝子、例えば、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子（例えば、ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来：ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５９４６５またはＡ１６１６４）、およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（例えば、ピチア・スチピチス由来：ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５５３９２またはＡ１６１６６）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来：ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ８２４０８）が挙げられる。これらの３つの遺伝子を発現するように遺伝子組換えされたサッカロマイセス・セレビシエが、キシロシダーゼ表層提示微生物の作製のために用いられ得る。
【0022】
宿主微生物は、特に限定されないが、例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌等、より具体的には、例えば、酵母、乳酸菌、糸状菌、コリネバクテリウム属菌、大腸菌、ザイモナス菌などが挙げられる。アルコール製造への利用の観点からは、アルコール（例えば、エタノール）の発酵能を有する微生物が好ましく、このような微生物としては例えば、酵母が挙げられる。乳酸製造への利用の観点からは、好ましくは乳酸菌である。
【0023】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）などが挙げられる。サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがさらに好ましい。サッカロマイセス・セレビシエの菌株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手可能）、サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Moukamnerdら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2010年、第88巻、p.87-94）、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（EUROSCARF等より入手可能）およびサッカロマイセス・セレビシエＫＦ－７株（Tingら、Process Biochem.、2006年、第41巻、p.909-914）が挙げられる。さらに、酵母としては、以下の菌株も挙げられる：ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＧＳ１１５（Invitrogen社製）およびピキア・アノマラ（Pichia anomala）ＮＢＲＣ１０２１３株、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＢＲＣ１６２８株、クルイベロマイセス・ラクテイス（Kluyveromyces lactis）ＮＢＲＣ１２６７株およびクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）ＮＢＲＣ１７７７株（Yanaseら、Appl Microbiol Biotechnol、2010年、第88巻、p.381-388）、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）ＮＢＲＣ０９８８株（Tomitaら、PLoS One. 2012; 7(5): e37226）（ＮＢＲＣ株はいずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手可能）。
【0024】
乳酸菌とは、代謝または発酵によって糖類から乳酸を産生する細菌の総称である。乳酸菌は、主として、ビフィズス菌、エンテロコッカス菌、ラクトバチルス菌、ストレプトコッカス菌の４種に分類され得る。好ましくは、ラクトバチルス菌が用いられ得る。乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、またはリューコノストック属（Leuconostoc）に属する菌が挙げられる。乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ラクテイス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・ブルカリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブルツキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・アラビノースス（Lactobacillus arabinosus）、ラクトバチルス・カウカシクス（Lactobacillus caucasicus）、ラクトバチルス・ラクテイス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライシュマニ（Lactobacillus Leishmanni）、ラクトバチルス・ムシカス（Lactobacillus musicus）、ラクトバチルス・サーモフィルス（Lactobacillus thermophilus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ラクトコッカス・ラクテイス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、およびロイコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）などが挙げられる。乳酸菌には、有胞子性乳酸菌もまた包含される。有胞子性乳酸菌は、有胞子性の乳酸菌の総称である。有胞子性乳酸菌としては、例えば、バチルス属（Bacillus）に属する菌が挙げられる。バチルス属に属する有胞子性乳酸菌は、耐熱性（例えば４５℃のような高熱下にて生育可能）、高い発酵速度、および広い糖資化性を有するものであり得る。バチルス属（Bacillus）に属する菌としては、例えば、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans、「スポロ乳酸菌」としても知られる）およびバチルス・リンチェニフォルマイス（Bacillus lincheniformis）が挙げられる。
【0025】
乳酸菌は、遺伝子組換えがされたものであってもよい。例えば、Ｌ－またはＤ－乳酸合成酵素遺伝子のいずれかを組み込むあるいは破壊した組換え微生物が挙げられる。遺伝子組換え微生物として、例えば、ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株（Okanoら, Appl. Environ. Microbiol. 2009, Vol.75, 462-467）、およびラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株（Yoshidaら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, Vol.92, 67-76）が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株は、α－アミラーゼを分泌しグルコースからＤ－乳酸を生成する組換え株であり、ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株は、グルコースとキシロースの両方からＤ－乳酸を生成する組換え株である。
【0026】
大腸菌（Escherichia coli）としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60，160 (1968)〕、エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research，9，309 (1981)〕、エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology，120，517 (1978)〕、エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology，41，459 (1969)〕、エシェリヒア・コリC600〔Genetics，39，440 (1954)〕などが挙げられる。
【0027】
表層提示微生物は自体公知の方法により作出し得る。該作出のために用いられる、各種宿主微生物に関する表層提示技術としては、具体的には、例えば、特開平１１－２９００７８号公報、国際公開第０２／０８５９３５号、国際公開第２０１５／０３３９４８号、国際公開第２０１６／０１７７３６号、国際公開第２０２０／００４４７３号、Biotechnology for Biofuels, 7(1):8 (2014)、およびK. Onoderaら，Biochemical Engineering Journal 128 (2017) 195-200（酵母）；生物工学会誌，第89巻，第4号，154-160 (2011)、化学工学会第70年会研究発表講演要旨集、セッションＩＤ Ｆ１２３（http://doi.org/10.11491/scej.2005.0.255.0）、Appl. Environ. Microbiol., 72(1), 269-275 (2006) およびAppl. Environ. Microbiol., 74(4), 1117-1123 (2008)（乳酸菌）などに記載の技術を用いることができる。表層提示技術では表層提示カセットが用いられ、この表層提示カセットは、アンカータンパク質のアンカードメインをコードするＤＮＡおよび分泌シグナルをコードするＤＮＡを、表層提示されるべきβ－グルコシダーゼ等をコードするＤＮＡと共に、適切な配置で含み得る。表層提示カセットは、プロモーターとターミネーターとの間に配置され得る。アンカードメインおよび分泌シグナルに関してもまた、上記文献に記載される。
【0028】
上記アンカードメインとしては、例えば、酵母について、ＧＰＩアンカータンパク質（例えば、ＳＥＤ１、α－またはａ－アグルチニン（ＡＧα１、ＡＧＡ１）、ＦＬＯ１タンパク質（例：ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、ＦＬＯ１１等）、アルカリホスファターゼなど）のアンカードメインが挙げられる（特開２００６－１７４７６７号公報等）。本明細書において、「ＧＰＩアンカータンパク質」とは、細胞表層局在タンパク質であって、細胞膜上に存在するＧＰＩアンカーを介して細胞膜に結合し得るタンパク質を意味する。
【0029】
乳酸菌については、ペプチドグリカン結合タンパク質ＡｃｍＡのＣＡドメインおよびバシルス・ズブチリス（Baccilus subtilis）由来のポリ－γ－グルタミン酸生合成酵素複合体（ＰｇｓＢＣＡ）のサブユニットであるＰｇｓＡタンパク質などが挙げられる（国際公開第２００３／０１４３６０等）。
【0030】
また、上記以外のアンカータンパク質としては、例えば、大腸菌などの細菌の細胞の表層提示に用いられる、大腸菌由来のタンパク質ｓｌｐ、ｂｌｃ又はｈｄｅＤ（特開２０１２－１０５６１１号公報等）、コリネバクテリウム属菌由来のポーリン（例：ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣ、ＰｏｒＨ）（特開２００６－１７４７６７号公報）、コリネバクテリウム属菌由来のＡＢＣトランスポーター（amino acid ABC transporter ATP-binding protein：gluA）（Biotechnol Bioeng. 2019 Oct;116(10):2640-2651）などが挙げられる。
【0031】
本明細書において記載されるタンパク質やペプチド（例：β－グルコシダーゼ、キシロシダーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、アンカータンパク質など）は、該タンパク質やペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドであってもよく、ＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、そのようなタンパク質またはペプチドをコードするものを含んでもよい。
【0032】
本明細書において、「所望の機能または効果を実質的に有する」とは、β－グルコシダーゼ、キシロシダーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ等の酵素であれば、その活性部位が保持されており、触媒活性が失われていないことを意味する。また、アンカータンパク質であれば、β－グルコシダーゼ等の表層提示を所望するタンパク質を細胞膜、細胞壁、あるいは細胞膜と細胞壁の間の空間に局在させるためのアンカー機能が失われていないことを意味する。
【0033】
タンパク質やペプチドのアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異（例えば、欠失、置換もしくは付加）は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、１または数個であるが、その所望の機能または効果を実質的に有する限り特に限定されず、タンパク質またはペプチドの大きさにも依存し得る。変異の総数としては、例えば、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、または１個以上２個以下が挙げられるが、これらに限定されない。また、変異の総数は、例えば、以下に説明する配列同一性を満たす範囲内であり得る。アミノ酸置換の例としては、各機能または効果を実質的に保持する限りにおいていずれの置換であってもよい。例えば、保存的置換が挙げられる。保存的置換としては、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、（フェニルアラニン、チロシン）。
【0034】
他の実施形態としては、本明細書において記載されるタンパク質またはペプチドは、該タンパク質やペプチドのアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドであってもよく、ポリヌクレオチドは、そのようなタンパク質またはペプチドをコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドをコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であり得る。
【0035】
本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一連の、部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一連の、部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではなく、デフォルト値を用いてもよい。
【0036】
表層提示微生物は、担体に固定されてもよい。そのことにより、下述する方法において再使用が可能となる。固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられる。固定方法としては、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、５０～１０００μｍの範囲内が好ましい。また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは柱状（例えば、立方体状）が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が２～５０ｍｍ、柱状の場合、２～５０ｍｍ角が好ましい。
【0037】
上述のようにして作製した表層提示微生物は、グルコースを含む溶液中に該微生物を添加する前に、自体公知の方法により培養しておいてもよい。また、本発明のグルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法により得られたβ－グルコ二糖類（を含む溶液）は、後述する本発明のセルラーゼ剤の製造方法においてそのまま用いてもよく、例えば、遠心分離等の自体公知の方法により表層提示微生物を除去したり、β－グルコ二糖を濃縮等したりした上で用いてもよい。
【0038】
２．セルラーゼ剤の製造方法
本発明は、「１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法」により得られたβ－グルコ二糖類を含む培地で、糸状菌を培養することを含む、セルラーゼ剤の製造方法（以下、「本発明のセルラーゼ剤の製造方法」と称する場合がある。）を提供する。
本発明は、「１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法」により得られたβ－グルコ二糖類を含む培地で、糸状菌を培養することを含む、セルラーゼ剤の製造方法（以下、「本発明のセルラーゼ剤の製造方法」と称する場合がある。）を提供する。
【0039】
（ｉ）セルラーゼ剤
本明細書において、「セルラーゼ剤」とは、セルロースを含む植物細胞壁成分の分解能を有する酵素のうち、少なくとも１つの酵素を含み、セルラーゼ剤全体として植物細胞壁成分の分解能を有する組成物をいう。従って、本発明において、糸状菌の培養液自体をセルラーゼ剤と称してもよく、また、糸状菌の培養液から、所望するセルラーゼを少なくとも部分的に分離・精製・濃縮等したものをセルラーゼ剤と称してもよい。セルラーゼ剤が分解能を有する細胞壁成分としては、セルロースおよびヘミセルロース、ならびにそれらの分解物が挙げられ、この「分解物」は、二糖以上からなる糖である。セルロースは、グルコースがβ－１，４グリコシド結合（「β－１，４結合」ともいう）により直鎖状に重合した高分子である。また、ヘミセルロースは、植物細胞壁成分のうち、セルロースおよびペクチン以外の不溶性食物繊維の総称であり、キシラン、マンナン、ガラクタンなどから構成される。
本明細書において、「セルラーゼ剤」とは、セルロースを含む植物細胞壁成分の分解能を有する酵素のうち、少なくとも１つの酵素を含み、セルラーゼ剤全体として植物細胞壁成分の分解能を有する組成物をいう。従って、本発明において、糸状菌の培養液自体をセルラーゼ剤と称してもよく、また、糸状菌の培養液から、所望するセルラーゼを少なくとも部分的に分離・精製・濃縮等したものをセルラーゼ剤と称してもよい。セルラーゼ剤が分解能を有する細胞壁成分としては、セルロースおよびヘミセルロース、ならびにそれらの分解物が挙げられ、この「分解物」は、二糖以上からなる糖である。セルロースは、グルコースがβ－１，４グリコシド結合（「β－１，４結合」ともいう）により直鎖状に重合した高分子である。また、ヘミセルロースは、植物細胞壁成分のうち、セルロースおよびペクチン以外の不溶性食物繊維の総称であり、キシラン、マンナン、ガラクタンなどから構成される。
【0040】
本発明のセルラーゼ剤に含まれ得る、細胞壁成分の分解能を有する酵素としては、例えば、セルラーゼおよびヘミセルラーゼが挙げられる。
【0041】
本明細書において「セルラーゼ」とは、β－１，４－グルカン（例えば、セルロース）のβ－１，４結合を加水分解する酵素をいう。本明細書における「セルラーゼ」は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ－グルコシダーゼを含み得る。
【0042】
本明細書において、「エンドグルカナーゼ（エンドβ１，４－グルカナーゼ）」は、狭義にて「セルラーゼ」とも称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、および／またはセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして好ましくは１０以下であるが、これに限定されない）を生じる。
【0043】
本明細書において、「セロビオヒドロラーゼ（エキソグルカナーゼ）」は、セルロースをその還元末端または非還元末端のいずれかから分解し、セロビオースを遊離する。
【0044】
本明細書において、「β－グルコシダーゼ」は、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β－グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ－Ｄ－グルコースとのβ－１，４結合を切断し、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成する。β－グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解する酵素の一つの例である。
【0045】
本明細書において「ヘミセルラーゼ」とは、ヘミセルロースを分解する酵素の総称である。ヘミセルラーゼにはキシラン分解酵素が含まれ、キシラン分解酵素として、例えば、キシラナーゼおよびキシロシダーゼが挙げられる。本明細書において「キシラン」は、キシロースがβ－１，４結合により直鎖状に重合した高分子を主鎖とし、種々の糖を側鎖に有するヘテロ糖である。本明細書において、「キシラナーゼ（β１，４－キシラナーゼ）」は、キシランのβ－１，４結合を加水分解する酵素をいう。キシラナーゼは、キシランの主鎖部分を内部からランダムに切断し、キシロース、キシロビオースおよび／またはキシロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして好ましくは１０以下であるが、これに限定されない）を生じる。本明細書において、「キシロシダーゼ（β－キシロシダーゼ）」は、キシランを非還元末端からそのβ－１，４結合を加水分解してキシロースを遊離する酵素をいう。
【0046】
本明細書において「セルラーゼ活性」とは、セルロースのβ－１，４結合を加水分解する活性であり、例えば、濾紙分解活性（Filter Paper Unit：ＦＰＵ）がその指標とされる。濾紙分解活性は、Industrial Crops and Products 20 (2004) 49-57に記載のように、Mandelsら(1976)の方法に基づき測定され得る。濾紙分解活性は、濾紙（例えば、Advantec No.1：東洋濾紙株式会社）を基質として用いて１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１ユニット（ＦＰＵ）として表される。β－グルコシダーゼ活性は、Journal of Bioscience and Bioengineering, VOL.111 No.2, 121-127, 2011に記載のように、ｐ－ニトロフェニルβ－Ｄ－グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）を基質として用いて、BerghemおよびPetterssonの方法に基づいて測定され得る。β－グルコシダーゼ活性は、１分間に基質ｐ－ニトロフェニルβ－Ｄ－グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）から１μｍｏｌのニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表される。セロビオヒドロラーゼ活性は、基質としてｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－セロビオースに用いた以外はβ－グルコシダーゼ活性と同様にして測定され得る。セロビオヒドロラーゼ活性は、１分間に基質ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－セロビオースから１μｍｏｌのニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表される。
【0047】
（ｉｉ）糸状菌
本発明のセルラーゼ剤の製造方法で用いる糸状菌は、所望するセルラーゼ剤に含まれ得る酵素（例：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ等）を生成し得る限り特に限定されない。糸状菌としては、例えば、トリコデルマ属菌（Trichoderma）、アスペルギルス属菌（Aspergillus）、リゾープス属菌（Rhizopus）等が挙げられる。本発明で用いる細菌として好ましくは、トリコデルマ（Trichoderma）属菌である。トリコデルマ属菌に属するものの具体例としては、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）などが挙げられる。好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）であり、より好ましくはトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａおよびその派生株である（R. Petersonら，Microbiology (2012), 158, 58-68）。
本発明のセルラーゼ剤の製造方法で用いる糸状菌は、所望するセルラーゼ剤に含まれ得る酵素（例：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ等）を生成し得る限り特に限定されない。糸状菌としては、例えば、トリコデルマ属菌（Trichoderma）、アスペルギルス属菌（Aspergillus）、リゾープス属菌（Rhizopus）等が挙げられる。本発明で用いる細菌として好ましくは、トリコデルマ（Trichoderma）属菌である。トリコデルマ属菌に属するものの具体例としては、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）などが挙げられる。好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）であり、より好ましくはトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａおよびその派生株である（R. Petersonら，Microbiology (2012), 158, 58-68）。
【0048】
トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａは、例えば、ＡＴＣＣより入手可能（ＡＴＣＣ１３６３１）であり、その派生株として、例えばトリコデルマ・リーセイＲＵＴ－Ｃ３０（ＡＴＣＣ５６７６５）やトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）が入手可能である。なお、製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）からもトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ（ＮＢＲＣ３１３２６）およびトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（ＮＢＲＣ３１３２９）などが入手可能である。１つの実施形態では、糸状菌（例：トリコデルマ属菌）は、セルラーゼ剤に関して非遺伝子組換え菌株（wild type）である。
【0049】
（ｉｉｉ）培養条件等
糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培養では、通常、マンデルス培地が用いられる。マンデルス培地は、例えば、M.MandelsおよびR.E.Andreotti，Problems and Challenges in the Cellulose to Cellulase Fermentation. Process Biochem 13 (1978) 6-13に記載の方法に従って調製され得る。糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培地は、本発明の二糖類の製造方法により得られたβ－グルコ二糖類（あるいはβ－グルコ二糖類を含む溶液）を含む。該β－グルコ二糖類により、糸状菌（例：トリコデルマ属菌）のセルラーゼ剤の生産が誘導され得る。該培地には、セロビオース、セロビオオリゴ糖、セルロース（例えば、結晶性セルロース（例えば、Avicel（アビセル））などをさらに添加してもよい。糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培地は、該細菌の培養に通常用いられる他の成分（例えば、ペプトン等）をさらに含んでもよい。
糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培養では、通常、マンデルス培地が用いられる。マンデルス培地は、例えば、M.MandelsおよびR.E.Andreotti，Problems and Challenges in the Cellulose to Cellulase Fermentation. Process Biochem 13 (1978) 6-13に記載の方法に従って調製され得る。糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培地は、本発明の二糖類の製造方法により得られたβ－グルコ二糖類（あるいはβ－グルコ二糖類を含む溶液）を含む。該β－グルコ二糖類により、糸状菌（例：トリコデルマ属菌）のセルラーゼ剤の生産が誘導され得る。該培地には、セロビオース、セロビオオリゴ糖、セルロース（例えば、結晶性セルロース（例えば、Avicel（アビセル））などをさらに添加してもよい。糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培地は、該細菌の培養に通常用いられる他の成分（例えば、ペプトン等）をさらに含んでもよい。
【0050】
本発明のセルラーゼ剤の製造方法において、糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培養の際のｐＨは、少なくとも糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の生存が維持でき、且つ所望するセルラーゼ剤に含まれ得る酵素（例：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ等）を生成し得る限り、特に限定されない。具体的には、例えば、ｐＨ１～ｐＨ１０、好ましくはｐＨ２～ｐＨ８．５である。上記のｐＨは塩の添加によって調整され得、このような塩としては、微生物培養の際にｐＨ調整に通常用いられる塩（例えば、水酸化ナトリウム）である。該培養におけるｐＨの調整のタイミングは、少なくとも糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の生存が維持でき、且つ所望するセルラーゼ剤に含まれ得る酵素（例：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ等）を生成し得る限り、如何なるタイミング（例：培養開始前、培養中）で行ってもよい。
【0051】
後述する本発明の糖化発酵産物の製造方法において用いるセルラーゼ剤に関しては、所望する糖化発酵産物が得られる限り特に限定はされないが、一態様では、以下のようなセルラーゼ剤を使用してもよい。
【0052】
所定のｐＨ範囲（ｐＨ１以上５未満、好ましくは、ｐＨ３以上５未満）で糸状菌（例：トリコデルマ属菌）を培養することにより、該菌により、濾紙分解活性に対するβ－グルコシダーゼ活性の比率が３より低いセルラーゼが生産され得る。１つの実施形態では、生産されるセルラーゼは、その濾紙分解活性に対するβ－グルコシダーゼ活性の比率が、１より低い、０．５より低い、０．３より低い、０．２より低い、０．１より低い、０．０６より低い、０．０４より低い、０．０３より低いまたは０．０２より低いものである。上記比率の数値は、β－グルコシダーゼ活性を５０℃（液化に通常用いられ得る温度）にて測定した場合に得られる値である。５０℃で測定したβ－グルコシダーゼ活性は、３５℃で測定した場合に比べると高い活性を示す傾向にある。生産されるセルラーゼ剤は、好ましくは、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを含む。ｐＨ１未満であれば、糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の生育を抑制するおそれがある。ｐＨ５以上であると、生産されるセルラーゼ剤において、β－グルコシダーゼ活性を高め得ても、セルラーゼ総体としての分解能力を示す濾紙分解活性およびセロビオヒドロラーゼ活性を損ない得る。１つの実施形態では、生産されるセルラーゼ剤は、キシラナーゼをさらに含む。生産されるセルラーゼ剤にはキシロシダーゼもまた含まれ得る。
【0053】
培養の際の温度、通気、細胞量等の培養条件は、糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培養で通常用いる条件を用いることができる。培養時間は、初期細胞量または回収する最終セルラーゼ活性に依存するが、例えば、２４時間～２４０時間、好ましくは、７２時間～１９２時間である。糸状菌（例：トリコデルマ属菌）の培養は、セルラーゼ剤の製造および回収のための培養（「本培養」）を行う前に、予備的な培養（「前培養」）を行ってもよい。
【0054】
一態様では、本発明のセルラーゼ剤の製造方法で製造されたセルラーゼ剤は、トリコデルマ属菌（例：トリコデルマ・リーセイ等）を用いたものである。該セルラーゼ剤は、例えば、固液分離（例えば、遠心分離およびフィルタ濾過）により、トリコデルマ属菌の培養液から回収され得る。該セルラーゼ剤は、回収後、必要に応じて、当業者が通常用いる方法（例えば、エバポレーターおよび膜の使用）によって濃縮されたものであってもよい。
【0055】
本発明のセルラーゼ剤の製造方法について上記以外の事項は、「１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法」に記載の内容を全て援用し得る。
【0056】
３．糖化発酵産物の製造方法
本発明は、「２．セルラーゼ剤の製造方法」により得られたセルラーゼ剤とセルロースとを含む培地で、β－グルコシダーゼ表層提示微生物を培養することを含む、糖化発酵産物の製造方法（以下、「本発明の糖化発酵産物の製造方法」と称する場合がある。）を提供する。
本発明は、「２．セルラーゼ剤の製造方法」により得られたセルラーゼ剤とセルロースとを含む培地で、β－グルコシダーゼ表層提示微生物を培養することを含む、糖化発酵産物の製造方法（以下、「本発明の糖化発酵産物の製造方法」と称する場合がある。）を提供する。
【0057】
（ｉ）表層提示微生物の培養方法および糖化発酵産物の製造方法
本発明においては、上記で得られたセルラーゼ剤（例：ＴＰセルラーゼ剤）で、該セルラーゼ剤が分解し得る多糖基質を含む材料を処理し、この処理物で表層提示微生物の培養を行うことで所望する糖化発酵産物を取得し得る。本発明の糖化発酵産物の製造方法において用いる表層提示微生物は、「１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法」で用いたものでもよく、その記載内容は全て援用し得る。
本発明においては、上記で得られたセルラーゼ剤（例：ＴＰセルラーゼ剤）で、該セルラーゼ剤が分解し得る多糖基質を含む材料を処理し、この処理物で表層提示微生物の培養を行うことで所望する糖化発酵産物を取得し得る。本発明の糖化発酵産物の製造方法において用いる表層提示微生物は、「１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法」で用いたものでもよく、その記載内容は全て援用し得る。
【0058】
上記材料としては、例えば、セルロース材料およびキシロース含有多糖を含む材料ならびにこれらの混合物が挙げられる。例えば、本発明のセルラーゼ剤でセルロース材料を処理し、この処理物をβ－グルコシダーゼ表層提示微生物の培養に用いることができる。β－グルコシダーゼ表層提示微生物は、このような培養によって、糖化発酵産物を生産し得る。本発明のセルラーゼ剤で、キシロース含有多糖を含む材料を処理し、この処理物を、キシロースの代謝能を有しかつキシロシダーゼを表層提示する微生物（以下、「キシロース代謝キシロシダーゼ表層提示微生物」と称する場合がある。）の培養に用いることができる。「キシロース含有多糖」とは、キシロースを構成成分に含む多糖をいい、少なくとも二糖のキシロースを含む。例えば、キシロース代謝キシロシダーゼ表層提示微生物は、このような培養によって、糖化発酵産物を生産し得る。
【0059】
セルロース材料とは、セルロースを含む任意の材料をいう。キシロース含有多糖としては、例えば、キシラン、キシランを含むヘミセルロースが挙げられる。セルロースおよびキシロース含有多糖はともに、加水分解によってより低分子の糖が生じる（例えば、セルロースからグルコースまたはセロビオース、キシロース含有多糖からキシロースまたはキシロビオース）（この反応を「糖化」ともいう）。糖化反応により得られるグルコースまたはキシロース、あるいはその両方を、発酵微生物（例えば、酵母、乳酸菌など）が基質として利用し、発酵産物（例えば、エタノール、乳酸など）を生産し得る（この反応を「発酵」または「発酵生産」ともいう）。糖化および当該糖化により得られる糖を基質に用いた微生物による発酵を合わせて「糖化発酵」ともいう。糖化発酵によって得られる産物を、本明細書では、「糖化発酵産物」ともいう。
【0060】
セルロース材料として、例えば、セルロース系バイオマスが挙げられる。セルロース系バイオマスとは、生物資源に由来する材料であって、セルロースを含むものをいう。セルロース系バイオマスの利用は、食糧と競合しない点で好ましい。キシロース含有多糖を含む材料としては、例えば、キシランを含む材料およびヘミセルロースを含む材料が挙げられる。セルロース系バイオマスとして植物バイオマスが挙げられる。植物バイオマスは、セルロースおよびヘミセルロースを含み、よって、セルロース材料としても、キシロース含有多糖を含む材料としても用いられ得る。セルロース系バイオマスまたは植物バイオマスとしては、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、パーム、木材（パルプ）、ネピアグラスなどの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などが挙げられる。セルロース系バイオマスまたは植物バイオマスとしては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、パーム空果房、バガス（サトウキビ搾汁後の残渣）などが挙げられる。
【0061】
上記材料は、前処理が施されたものであってもよい。前処理とは、酵素で基質を分解する前に、その基質を含む材料に対して行う処理であり、これにより、その材料中に含まれていた基質への酵素の作用を容易にする。例えば、セルロースをグルコースまで加水分解するために、セルロース加水分解酵素で処理する前に、酵素のセルロースへの作用を容易にするために、酵素反応の前にセルロースをセルロース材料（例えば、バイオマス）から分離し、露出させる処理をいう。前処理法としては、特に限定されないが、例えば、水熱分解、圧搾、蒸煮などが挙げられ、また、これらの方法を組み合わせて用いてもよい。水熱分解法では、例えば、セルロース系バイオマスを、必要に応じて粉砕し、例えば、約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、この混合物を熱処理する。水熱処理は、１２０℃～３００℃、好ましくは１５０℃～２８０℃、より好ましくは１８０℃～２５０℃にて、１５秒間～１時間行われる。処理温度および時間は用いるバイオマスによって変動し得、処理温度の上昇は処理時間を短縮し得る。なお、熱処理中に加圧してもよい。圧搾としては、特に限定されないが、例えば、油圧式圧搾機、スクリュープレス、採肉機、プレス脱水機、または遠心分離機等によりセルロース系バイオマスを圧搾する方法が挙げられる。蒸煮方法としては、特に限定されないが、例えば、セルロース系バイオマスを高温の水蒸気により蒸煮する方法が挙げられる。蒸煮するための条件としては、特に限定されないが、例えば、リグノセルロース系バイオマスに対して１質量％～５質量％の硫酸を含浸させて、１．０Ｍｐａ～１．６Ｍｐａの圧力下、１８０℃～２００℃にて５分～３０分間蒸煮する条件が挙げられる。植物バイオマスの場合、前処理によって得られるセルロースおよびヘミセルロースの量を調整することができる。材料が植物バイオマスである場合、例えば、植物バイオマスを必要に応じて脱リグニン処理後、シュウ酸アンモニウムで処理してペクチンを除去し、次いでアルカリで処理してヘミセルロースを得ることができる。例えば、アンモニア爆砕処理、粉砕処理、イオン液体処理のような前処理法を用いる場合、植物バイオマスからセルロースおよびヘミセルロースを取得することができる。
【0062】
本発明のセルラーゼ剤での上記材料の処理について、好ましくは撹拌下、混合することによりなされ得る。上記処理について、当該材料の固形分が液化されれば、処理条件は特に限定されない。例えば、本発明のセルラーゼ剤のセルロース材料に対する量は、用いるセルロース材料の種類に依存するが、例えば、１～５０ＦＰＵ／ｇ乾燥材料重量、好ましくは５～２０ＦＰＵ／ｇ乾燥材料重量である。例えば、本発明のセルラーゼ剤（例、ＴＰセルラーゼ剤）のキシロース含有多糖を含む材料に対する量は、用いる材料の種類に依存するが、例えば、１０～２０００ｇ／ｋｇ乾燥材料重量、好ましくは５０～８００ｇ／ｋｇ乾燥材料重量である。処理の温度は、例えば、２５～７０℃、好ましくは、３５～５５℃である。
【0063】
β－グルコシダーゼ表層提示微生物は、本発明のセルラーゼ剤で処理されたセルロース材料を含有する培地にて培養される。このような培養によって、β－グルコシダーゼ表層提示微生物は、糖化発酵産物を生産し得る。
【0064】
１つの実施形態では、β－グルコシダーゼ表層提示微生物の酵素力価は、セルロース材料の処理のために（当該微生物の外部から）添加したセルラーゼ（本方法では、本発明のセルラーゼ剤（例：ＴＰセルラーゼ剤））の濾紙分解活性に対する該微生物のβ－グルコシダーゼ活性の比率として表した場合、０．０２～２．５、好ましくは、０．１～０．７である。上記数値は、β－グルコシダーゼ表層提示微生物が示すβ－グルコシダーゼ活性を３５℃（糖化発酵のための微生物培養に通常用いられ得る温度）にて測定した場合に得られる値である。このようなこの酵素力価の比率の範囲内にあることで、β－グルコシダーゼ表層提示微生物による糖化発酵産物の製造を効率的に行い得る。β－グルコシダーゼ表層提示微生物の酵素力価、すなわち本発明のセルラーゼ剤の濾紙分解活性に対する該微生物のβ－グルコシダーゼ活性の比率は、β－グルコシダーゼ表層提示微生物の種類、培養（例えば、糖化発酵のための培養）の際の初期菌体濃度および温度（例えば、β－グルコシダーゼ表層提示酵母の場合３５℃または５０℃に設定し得る）によって調整され得る。
【0065】
キシロシダーゼ表層提示微生物は、本発明のセルラーゼ剤（例：ＴＰセルラーゼ剤）で処理されキシロース含有多糖を含む材料を含有する培地にて培養される。このような培養によって、キシロシダーゼ表層提示微生物は、糖化発酵産物を生産し得る。
【0066】
上記培養培地は、処理された上述の材料および本発明のセルラーゼ剤（例：ＴＰセルラーゼ剤）を含むものであってよい。培養培地は、表層提示微生物の培養において通常用いる他の成分をさらに含んでもよい。本発明のセルラーゼ剤での上述の材料の処理は、表層提示微生物の培養前に予め行い得る。また、本発明のセルラーゼ剤での上述の材料の処理と、表層提示微生物の培養とを並行して行ってもよい。
【0067】
表層提示微生物の培養条件は、宿主の微生物の種類に依存するが、当該微生物の生育速度、当該微生物による糖化発酵産物の生産量、および表層提示された酵素（β－グルコシダーゼ、キシロシダーゼなど）の活性などを考慮して、自体公知の方法により、適宜設定され得る。培養の条件について、β－グルコシダーゼ表層提示微生物がβ－グルコシダーゼ表層提示酵母である場合を例示して以下に説明するが、これに限定されない。開始時の菌体濃度は特に限定されず、例えば、２ｇ～２０ｇ湿重量／Ｌ（１×１０７個／ｍＬ～１×１０８個／ｍＬ）程度が、挙げられる。培養条件は特に限定されず、通常、グルコースを基質としてエタノール発酵する際の条件であってよい。培養温度は、例えば、３０℃～３７℃であり、培養ｐＨは、例えば、ｐＨ４～ｐＨ８である。培養時間は、例えば、２日間～３日間である。発酵の終了は、例えば、炭酸ガスの発生量が発酵開始時の１０分の１以下になったことなどを目安に判断してもよい。
【0068】
表層提示微生物は、培養終了後に回収し、次の培養に繰り返し利用してもよい。このような微生物の回収および繰り返し培養について、例えば、国際公開第２０１３／１４６５４０号に記載された方法が用いられ得る。
【0069】
上述したように表層提示微生物の培養の工程により、当該微生物によって、セルロース材料からの糖化発酵産物が生産され得る。糖化発酵産物は、培養する表層提示微生物の種類に依存するが、例えば、エタノール（例えば、表層提示酵母の培養により）、乳酸（例えば、表層提示乳酸菌の培養により）などが挙げられる。表層提示微生物は、上記のような表層提示技術以外の改変（例えば、遺伝子組換えによる）を行ってもよい。このような改変として、例えば、生産される糖化発酵産物の変更または糖化発酵産物の生産効率の改善などを目的とした、発酵の代謝系の改変が挙げられる。
【0070】
１つの実施形態では、上記の糖化発酵産物の製造方法は、上記のセルラーゼ剤製造方法によりセルラーゼ剤を製造する工程をさらに含む。例えば、糖化発酵産物（例えば、エタノール）を製造する際に用いるセルラーゼ剤を上記セルラーゼ剤の製造方法により製造することによって、当該糖化発酵産物を製造する現場でセルラーゼ剤の調製を行うことができる。
【0071】
上記表層提示微生物の培養により得られた糖化発酵産物は、当業者が通常用いる方法によって微生物培養培地から回収され、必要に応じて分離および精製され得る。本発明の糖化発酵産物の製造方法について上記以外の事項は、「１．グルコース２分子が脱水縮合した糖の製造方法」および「２．セルラーゼ剤の製造方法」に記載の内容を全て援用し得る。
【0072】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例0073】
（測定方法）
本実施例においては、種々の測定を下記のように行った。
本実施例においては、種々の測定を下記のように行った。
【0074】
セルラーゼ活性として、濾紙分解活性（ＦＰ活性）をIndustrial Crops and Products 20 (2004) 49-57に記載のように、Mandelsら(1976)の方法に基づき測定した。より詳細には、１ｃｍ×６ｃｍの濾紙（Advantec No.1：東洋濾紙株式会社）を基質として用いて、これを試料溶液（0.5mLの希釈セルラーゼ液（培養上清）および１．０ｍＬの０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を含む）に添加し、５０℃にて６０分間置いた後、３ｍＬのＤＮＳ試薬を添加して反応を停止させた。この混合物の還元糖量をＤＮＳ法でアッセイした。ＤＮＳ法では、混合物を１００℃にて５分間加熱した後、５分間氷冷し、ボルテックス後に１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を０．２ｍＬ得た。次いでこの上清を蒸留水２．５ｍＬに添加してＯＤ＝５４０にて測定した。濾紙分解活性は、この方法で１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１ＦＰＵ／ｍＬとして表した。
【0075】
タンパク質濃度をQuick StartTM Bradford(Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いてブラッドフォード法にて測定した（検量線の基質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた）。
【0076】
β－グルコシダーゼ活性（ＢＧＬ活性）をJournal of Bioscience and Bioengineering, VOL.111 No.2, 121-127, 2011に記載のように、ｐ－ニトロフェニルβ－Ｄ－グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）を基質として用いて、BerghemおよびPetterssonの方法に基づいて行った。より詳細には、１００μＬの３ｍＭ ｐＮＰＧ、１５μＬの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１５５μＬの滅菌水および３０μＬの酵素希釈液からなる反応液を５０℃または３５℃にて１０分間撹拌した後、０．３ｍＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを添加して反応を停止させた。遊離したｐ－ニトロフェノールをマイクロプレートリーダー（SH-1000Lab、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いて４００ｎｍにて測定した。β－グルコシダーゼ活性は、１分間に基質から１μｍｏｌのニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表した。
【0077】
セロビオヒドロラーゼ活性（ＣＢＨ活性）は、基質としてｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－セロビオースを用いた以外はβ－グルコシダーゼ活性と同様にして測定した。セロビオヒドロラーゼ活性は、１分間に基質から１μｍｏｌのニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表した。エンドグルカナーゼ活性（ＥＧ活性）は、基質としてｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いた以外はβ－グルコシダーゼ活性と同様にして測定した。エンドグルカナーゼ活性は、１分間に基質から１μｍｏｌのニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表した。
【0078】
キシラナーゼ活性（Ｘｙｎ活性）の測定では、１．５ｍＬチューブに０．１ｍＬの希釈した試料と０．１ｍＬの２（ｗ／ｖ）％キシラン基質溶液とを加え、撹拌しながら５０℃で３０分間反応させ、ＤＮＳ試薬０．６ｍＬを加えて反応を停止し、１００℃で５分間加熱し、発色させた。氷上に置き急冷した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）で上清０．４ｍＬを２ｍＬのイオン交換水と混合し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、生成した遊離還元糖をキシロース量に換算した。２（ｗ／ｖ）％キシラン基質溶液は２（ｗ／ｖ）％のブナ（Beechwood）由来キシラン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、４℃で１６時間撹拌したものを遠心分離（１００００×ｇ、１０分、４℃）により不溶性のキシランを集め１０ｍＬの同緩衝液に懸濁し、キシラナーゼ活性測定用の基質溶液とした。コントロール値は５０℃で３０分間撹拌した試料に２（w/v）％キシラン基質溶液を加え５０℃でのインキュベーションを行わずに発色させたものとした。キシラナーゼ活性は、１分間に基質からキシロースを１μｍｏｌ生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表した。
【0079】
キシロシダーゼ活性（Ｘｙｄ活性）の測定では、１．５ｍＬチューブに試料と合成基質ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－キシロピラノシド（和光純薬工業株式会社製）とを加え、１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０ｍＭになるように調整し、５０℃で３０分間撹拌しながら反応させ、同量の１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、発色させた。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）後の上清を４４０ｎｍにおける吸光度を測定し、生じたｐ－ニトロフェノール量を換算した。コントロール値は５０℃でのインキュベーション操作を行わずに発色させたものとした。キシロシダーゼ活性は、１分間に基質から１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）として表した。
【0080】
微生物菌体の酵素活性の測定では、基質との反応のために、酵素希釈液として培養上清または菌体懸濁液を用い、５０℃または３５℃にて行った。培養上清は、以下に示す７２時間フラスコ培養後の菌体培養液を１ｍＬ分取し、３５００ｒｐｍにて５分間の遠心分離により上清を得ることで調製した。菌体懸濁液は、７２時間フラスコ培養後の菌体培養液を１ｍＬ分取し、３５００ｒｐｍにて５分間の遠心分離して沈殿物を得、これを滅菌水で洗浄後、湿菌体重量を測定し、このペレットを滅菌水１ｍＬに懸濁して調製した。菌体の酵素活性を、菌体の湿重量１ｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｇ）として決定した。
【0081】
液化液および糖化発酵培養液中のエタノール濃度および糖（例えば、セロビオース、グルコース、キシロースおよび還元糖）濃度は、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社日立ハイテクフィールディング、LaChrom Elite）により定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはULTRON PS-80H（信和化工株式会社，３００ｍｍ（Ｌ）×８ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相には超純水（日本ミリポア株式会社製Milli-Qによる精製水）に過塩素酸を添加した３ｍＭ過塩素酸水を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量０．７ｍＬ／分およびカラム温度８０℃とした。
【0082】
各種の二糖の濃度は、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatographyシステム；株式会社島津製作所、Prominence）により定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはAsahipak NH2P-50 4E（昭和電工株式会社、２５０ｍｍ（Ｌ）×４．６ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相にはアセトニトリル／水（７５／２５、ｖ／ｖ）を用い、そして検出器には示差屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量１．０ｍＬ／分およびカラム温度４０℃とした。
【0083】
（調製例１：β－グルコシダーゼ表層提示酵母の調製）
β－グルコシダーゼ表層提示酵母の調製のため、宿主酵母としてサッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Moukamnerdら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2010年、第88巻、p.87-94）を用いた。プラスミドpAUR101-TDH3p-OptBGL-AG-SAG1t（K. Onoderaら，Biochemical Engineering Journal 128 (2017) 195-200：アスペルギウス・アクレアータス由来のβ－グルコシダーゼ遺伝子を含む）をＳｔｕＩで切断後、酢酸リチウム法によりＴＪ１４株を形質転換し、β－グルコシダーゼ表層提示酵母を得た。なお、該β－グルコシダーゼ表層提示酵母の作製は、国際公開第２０２０／００４４７３号と上記文献に記載の自体公知の方法に基づいて行った。
β－グルコシダーゼ表層提示酵母の調製のため、宿主酵母としてサッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Moukamnerdら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2010年、第88巻、p.87-94）を用いた。プラスミドpAUR101-TDH3p-OptBGL-AG-SAG1t（K. Onoderaら，Biochemical Engineering Journal 128 (2017) 195-200：アスペルギウス・アクレアータス由来のβ－グルコシダーゼ遺伝子を含む）をＳｔｕＩで切断後、酢酸リチウム法によりＴＪ１４株を形質転換し、β－グルコシダーゼ表層提示酵母を得た。なお、該β－グルコシダーゼ表層提示酵母の作製は、国際公開第２０２０／００４４７３号と上記文献に記載の自体公知の方法に基づいて行った。
【0084】
（実施例１：ＴＪ１４－ＢＧＬ（ＡＧ）でのセルラーゼ誘導物質の生成検討１）
菌体を、３０℃のＹＰＤ液体培地で３日間フラスコ培養した後、遠心分離で回収した湿潤ペレットを用いた。上記の菌体を接触させるための反応液として、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）とグルコース６００ｇ／Ｌを含む液体（水溶液）を調製した。対照実験では、湿菌体を添加しない反応液１０ｍLを用いた。β－グルコシダーゼ表層提示酵母の湿潤ペレット２７ｇを１Ｌの反応液に添加した。菌体濃度がグルコースの縮合反応に及ぼす影響を検討するために、β－グルコシダーゼ表層提示酵母の湿潤ペレット２．２ｇを１０ｍLの反応液に添加した。図１に示す、１０ｍＬの反応液を使用する「グルコースと水のみ」と「ＢＧＬ表層提示酵母２２０ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」の実験では、酵母を添加後、５０℃の条件下、マグネティックスターラーバーを使って２００ｒｐｍで撹拌した。撹拌２４ｈと９６ｈのサンプルを採取した。図１に示す１Ｌの反応液を使用する「ＢＧＬ表層提示酵母２７ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」でも、マグネティックスターラーバーを使って２００ｒｐｍで撹拌した。撹拌２４ｈと９６ｈのサンプルを採取した。
菌体を、３０℃のＹＰＤ液体培地で３日間フラスコ培養した後、遠心分離で回収した湿潤ペレットを用いた。上記の菌体を接触させるための反応液として、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）とグルコース６００ｇ／Ｌを含む液体（水溶液）を調製した。対照実験では、湿菌体を添加しない反応液１０ｍLを用いた。β－グルコシダーゼ表層提示酵母の湿潤ペレット２７ｇを１Ｌの反応液に添加した。菌体濃度がグルコースの縮合反応に及ぼす影響を検討するために、β－グルコシダーゼ表層提示酵母の湿潤ペレット２．２ｇを１０ｍLの反応液に添加した。図１に示す、１０ｍＬの反応液を使用する「グルコースと水のみ」と「ＢＧＬ表層提示酵母２２０ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」の実験では、酵母を添加後、５０℃の条件下、マグネティックスターラーバーを使って２００ｒｐｍで撹拌した。撹拌２４ｈと９６ｈのサンプルを採取した。図１に示す１Ｌの反応液を使用する「ＢＧＬ表層提示酵母２７ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」でも、マグネティックスターラーバーを使って２００ｒｐｍで撹拌した。撹拌２４ｈと９６ｈのサンプルを採取した。
【0085】
図１に示すように、「グルコースと水のみ」では、２４ｈ後も９６ｈ後もグルコ二糖（具体的には、セロビオース、ソホロース、ゲンチオビオース）がほとんど生成していなかった。一方で、図１に示すように、「ＢＧＬ表層提示酵母２７ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」では、２４ｈでセロビオース、ソホロース、ゲンチオビオースがそれぞれ２．８ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、１３．４ｇ／Ｌ生成しており、９６ｈでは６．４ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、４０．８ｇ／Ｌに達した。反応時間の延長以外にも、接触させる菌体量の増加によっても影響が見られた。図１に示すように、「ＢＧＬ表層提示酵母２２０ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」では２４ｈでセロビオース、ソホロース、ゲンチオビオースがそれぞれ９．１ｇ／Ｌ、９．６ｇ／Ｌ、３６．８ｇ／Ｌ生成しており、９６ｈでは２３．４ｇ／Ｌ、１６．５ｇ／Ｌ、８１．０ｇ／Ｌに達した。これら生成する二糖類の成分比は、反応温度、反応時間、そして接触させる菌体量以外にも、選定するβ－グルコシダーゼの種類によっても影響があると考えられる。ここでは比較的少ない菌体量であっても十分にセルラーゼの生産とそれを用いた糖化発酵産物の生産が増強されることを示すために、１Ｌで大量調製した「ＢＧＬ表層提示酵母２７ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」の反応液（９６ｈ後）を、以降の実施例に用いることにした。
【0086】
（実施例２：グルコース溶液でのトリコデルマ・リーセイ（RUT－C30）培養に関する検討）
図２は、対照実験としてTrichoderma reesei RUT-C30をグルコースで流加培養したデータであり、培養時間ごとの乾燥菌体濃度（ｇ－ｄｒｙ／Ｌ）、培養上清のセルラーゼ活性（５０℃での濾紙分解活性、ＦＰＵ／ｍｌ）、そして培養上清のタンパク質濃度（ｇ／Ｌ）を示している。
トリコデルマ・リーセイＲＵＴ－Ｃ３０（ＡＴＣＣ５６７６５）のポテトデキストロース寒天培地での培養菌糸懸濁液２ｍＬを、５００ｍＬバッフル付き三角フラスコ中に入れた前培養培地（１０ｇ／ＬのＣＳＬ（コーンスティープリカー）を含む培地に５ｇ／Ｌとなるようグルコースを添加したもの）１００ｍＬに接種し、２８℃にて１５０ｒｐｍで２４時間、前培養した。次いで、この前培養液全量（約１００ｍＬ）を、３Ｌジャー中の本培養培地（マンデルス培地に０．２（ｗ／ｖ）％ペプトンおよび１（ｗ／ｖ）％アビセルと１（ｗ／ｖ）％グルコースを添加したもの）１Ｌに接種し、通気条件１．０Ｌ／分にて上記菌株を培養した。
図２は、対照実験としてTrichoderma reesei RUT-C30をグルコースで流加培養したデータであり、培養時間ごとの乾燥菌体濃度（ｇ－ｄｒｙ／Ｌ）、培養上清のセルラーゼ活性（５０℃での濾紙分解活性、ＦＰＵ／ｍｌ）、そして培養上清のタンパク質濃度（ｇ／Ｌ）を示している。
トリコデルマ・リーセイＲＵＴ－Ｃ３０（ＡＴＣＣ５６７６５）のポテトデキストロース寒天培地での培養菌糸懸濁液２ｍＬを、５００ｍＬバッフル付き三角フラスコ中に入れた前培養培地（１０ｇ／ＬのＣＳＬ（コーンスティープリカー）を含む培地に５ｇ／Ｌとなるようグルコースを添加したもの）１００ｍＬに接種し、２８℃にて１５０ｒｐｍで２４時間、前培養した。次いで、この前培養液全量（約１００ｍＬ）を、３Ｌジャー中の本培養培地（マンデルス培地に０．２（ｗ／ｖ）％ペプトンおよび１（ｗ／ｖ）％アビセルと１（ｗ／ｖ）％グルコースを添加したもの）１Ｌに接種し、通気条件１．０Ｌ／分にて上記菌株を培養した。
【0087】
マンデルス培地は、M.MandelsおよびR.E.Andreotti，Problems and Challenges in the Cellulose to Cellulase Fermentation. Process Biochem 13 (1978) 6-13に記載の方法に従って調製した。すなわち（ＮＨ４）２ＳＯ４：２．８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：４．０ｇ／Ｌ、ｕｒｅａ：０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：０．００７４ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：０．００３４ｇ／ＬおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．００２８ｇ／Ｌになるようイオン交換水に混合して使用した。
【0088】
上記培地組成で、ディスクタービン２枚を備える培養槽（東京理化器械株式会社製のファーメンタ：ＭＢＦ－３００ＭＥ）を使って本培養した。培養２４ｈ以降、６００ｇ／Ｌのグルコース（実施例１の対照実験に相当するもの）を２倍希釈した液を０．０４ｇ／分で流加して培養を継続した。５Ｎのアンモニア水を使って培養液のｐＨを４．２に制御した。本培養開始直後は、撹拌回転数を２００ｒｐｍに設定したが、培地中の溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の２０%以上になるよう撹拌速度を２００ｒｐｍ～９００ｒｐｍの範囲で調整した。図２に培養１４４時間までの経過を示す。グルコースを流加することで、培地中のグルコースの過剰な蓄積がなく、菌体濃度は最終的に２９．５ｇ／Ｌまで増加した。しかし、セルラーゼ活性は最高値で１．０ＦＰＵ／ｍｌ（タンパク質濃度の最高値は１．０７ｇ／Ｌ）となり、培養後期に大幅な増加は見られなかった。
【0089】
（実施例３：糖転移反応物を含むグルコース溶液でのトリコデルマ・リーセイ（RUT－C30）培養に関する検討）
実施例２と同様の方法により、まず、トリコデルマ・リーセイ（RUT－C30）培養を行った。培養２４ｈ以降、６００ｇ／Ｌのグルコースの糖転移反応物（実施例１の「ＢＧＬ表層提示酵母２７ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」の反応後の液体に相当するもの）を２倍希釈し、８０℃で３０分加熱（酵母の生理活性が次の培養結果に及ぼす影響を完全に無くすため）してから室温まで冷却した液を、０．０３６ｇ／分で流加して培養を継続した。５Ｎのアンモニア水を使って培養液のｐＨを４．２に制御した。本培養開始直後は、撹拌回転数を２００ｒｐｍに設定したが、培地中の溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の２０％以上になるよう撹拌速度を２００ｒｐｍ～９００ｒｐｍの範囲で適宜調整した。図３に培養１４４時間までの経過を示す。β－グルコシダーゼ表層提示微生物と接触させてグルコース２分子を脱水縮合した糖液を流加することで、菌体濃度は１５．５ｇ／Ｌに達した。一方で、培養上清のセルラーゼ活性は６．４３ＦＰＵ／ｍｌ（タンパク質濃度７．５７ｇ／Ｌ）となり、図２よりも低い菌体濃度で高いセルラーゼ活性およびタンパク質濃度の値を得た。これは、流加した液体がセルラーゼの生産を誘導していることを示唆している。
実施例２と同様の方法により、まず、トリコデルマ・リーセイ（RUT－C30）培養を行った。培養２４ｈ以降、６００ｇ／Ｌのグルコースの糖転移反応物（実施例１の「ＢＧＬ表層提示酵母２７ｇ－ｗｅｔ／Ｌ」の反応後の液体に相当するもの）を２倍希釈し、８０℃で３０分加熱（酵母の生理活性が次の培養結果に及ぼす影響を完全に無くすため）してから室温まで冷却した液を、０．０３６ｇ／分で流加して培養を継続した。５Ｎのアンモニア水を使って培養液のｐＨを４．２に制御した。本培養開始直後は、撹拌回転数を２００ｒｐｍに設定したが、培地中の溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の２０％以上になるよう撹拌速度を２００ｒｐｍ～９００ｒｐｍの範囲で適宜調整した。図３に培養１４４時間までの経過を示す。β－グルコシダーゼ表層提示微生物と接触させてグルコース２分子を脱水縮合した糖液を流加することで、菌体濃度は１５．５ｇ／Ｌに達した。一方で、培養上清のセルラーゼ活性は６．４３ＦＰＵ／ｍｌ（タンパク質濃度７．５７ｇ／Ｌ）となり、図２よりも低い菌体濃度で高いセルラーゼ活性およびタンパク質濃度の値を得た。これは、流加した液体がセルラーゼの生産を誘導していることを示唆している。
【0090】
（実施例４：ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の組成検討）
実施例２と３の方法で得られたセルラーゼ剤（培養２４ｈ、９２ｈ、１４４ｈの培養上清を原液のままで用いたもの）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、タンパク質の組成を調べた。なお、実施例３の原液（図中のMGD（Mixture of Glucose and β-Disaccharide）培養液）ではタンパク質濃度が高すぎてバンドの位置が明瞭に観察されなかったので、希釈した液体もＳＤＳ－ＰＡＧＥに供することで、市販の酵素Cellic CTec2（ノボザイムズ社製）やバガスおよびアビセルを含む培地でセルラーゼが誘導生産されたセルラーゼ剤と比較した。図４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の分離および検出（クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色による）の結果を示す電気泳動図である（レーンＭ：分子量マーカー、マーカーの横は左から実施例２の２４ｈ、９２ｈ、１４４ｈの培養上清を原液のままで用いたもの、実施例３の２４ｈ、９２ｈ、１４４ｈの培養上清を原液のままで用いたもの、さらに右のマーカーの横左から実施例３の培養上清を希釈したもの、バガスで誘導された培養上清の希釈液、アビセルで誘導された培養上清の希釈液、最後にCellic CTec2）。
実施例２と３の方法で得られたセルラーゼ剤（培養２４ｈ、９２ｈ、１４４ｈの培養上清を原液のままで用いたもの）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、タンパク質の組成を調べた。なお、実施例３の原液（図中のMGD（Mixture of Glucose and β-Disaccharide）培養液）ではタンパク質濃度が高すぎてバンドの位置が明瞭に観察されなかったので、希釈した液体もＳＤＳ－ＰＡＧＥに供することで、市販の酵素Cellic CTec2（ノボザイムズ社製）やバガスおよびアビセルを含む培地でセルラーゼが誘導生産されたセルラーゼ剤と比較した。図４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の分離および検出（クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色による）の結果を示す電気泳動図である（レーンＭ：分子量マーカー、マーカーの横は左から実施例２の２４ｈ、９２ｈ、１４４ｈの培養上清を原液のままで用いたもの、実施例３の２４ｈ、９２ｈ、１４４ｈの培養上清を原液のままで用いたもの、さらに右のマーカーの横左から実施例３の培養上清を希釈したもの、バガスで誘導された培養上清の希釈液、アビセルで誘導された培養上清の希釈液、最後にCellic CTec2）。
【0091】
図４に示すように、実施例３の培養上清（原液）では、実施例２よりも明らかに太いバンドが確認され、タンパク質の濃度が高いことが分かる（即ち、セルラーゼが適切に、強力に誘導されている）。既報（D. Tanedaら，Bioresource Technology 121 (2012) 154-160）に基づいて分子量から酵素種（エンドグルカナーゼＥＧ、セロビオヒドロラーゼＣＢＨ、β－グルコシダーゼＢＧＬ）を推定すると、ＢＧＬ（７８ｋＤａ）、ＣＢＨ１（６３ｋＤａ）、ＣＢＨ２（５８ｋＤａ）、ＥＧ１（５５ｋＤａ）およびＥＧ２（４３ｋＤａ）となる。実施例４の方法で得られたセルラーゼは、図４では分子量マーカーの３７ｋＤａから７５ｋＤａの範囲にほとんどのタンパク質が含まれていることから、ＣＢＨおよびＥＧを主体とするセルラーゼであることが分かる。
【0092】
一方で、Cellic CTec2のレーンでは、上記の範囲より高い分子量および低い分子量の両方で、数多くのバンドが検出される傾向があった。本酵素はさまざまなバイオマス種に対して高い糖化能力を示すセルラーゼ製剤であり、上記で推定された酵素種（ＣＢＨ１（６３ｋＤａ）、ＣＢＨ２（５８ｋＤａ）、ＥＧ１（５５ｋＤａ）およびＥＧ２（４３ｋＤａ））以外にも、セルロース系バイオマスの糖化を直接的に触媒する、あるいは間接的に触媒を介助するさまざまなタンパク質を含むものと考えられる。
【0093】
実施例３の方法で得られたセルラーゼ剤は、トリコデルマ属セルラーゼの主要な酵素のファミリー７に属するＣＢＨ１を最も多く含み、さらに同じくトリコデルマ属セルラーゼの主要な酵素種であるＣＢＨ２、ＥＧ１、およびＥＧ２と推定されるバンドも比較的多い傾向がみられた。このように、実施例１の方法で得られたセルラーゼ剤は、煩雑なセルラーゼ蛋白質群（アクセサリー酵素と呼ばれるマイナーな酵素種を含む）の混合比の調整を伴うことなく、主要なセルラーゼ群が大部分を占める酵素であるということが分かった。
【0094】
（実施例５：糖化発酵産物（エタノール）の製造検討）
酵母（TJ14のwild typeとpAUR101-TDH3p-OptBGL-AG-SAG1t導入株）について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ）を含む試験管で種培養を６時間行い、次いで培養液を１００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を３日間行った。この培養液を遠心分離し（１２００ｇ、５分間）、２００ｇ－湿重量／Ｌの菌体濃度になるように培養上清の液を使って懸濁した。セルラーゼ剤として、実施例３のトリコデルマ培養上清を８０００ｇにて１０分間遠心分離後、ナイロンフィルター（１１μｍ）を通して濾液を回収し、次いでこの濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮液は、濾紙分解活性が１１７．８ＦＰＵ／ｍＬであった。このようにして得られた濃縮液をセルラーゼ剤として用いた。
酵母（TJ14のwild typeとpAUR101-TDH3p-OptBGL-AG-SAG1t導入株）について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ）を含む試験管で種培養を６時間行い、次いで培養液を１００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を３日間行った。この培養液を遠心分離し（１２００ｇ、５分間）、２００ｇ－湿重量／Ｌの菌体濃度になるように培養上清の液を使って懸濁した。セルラーゼ剤として、実施例３のトリコデルマ培養上清を８０００ｇにて１０分間遠心分離後、ナイロンフィルター（１１μｍ）を通して濾液を回収し、次いでこの濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮液は、濾紙分解活性が１１７．８ＦＰＵ／ｍＬであった。このようにして得られた濃縮液をセルラーゼ剤として用いた。
【0095】
セルロースのモデル基質としてアビセルを１０％または２０％（ｗ／ｗ）含む発酵液１０ｇ（終濃度０．０５Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨは５．０）を含み、実施例３から得られたセルラーゼ剤を２０ＦＰＵ／ｇ－アビセルの量で添加し、上記の２００ｇ－湿重量／Ｌの酵母液を１．０ｍｌ（終濃度は２０ｇ－湿重量／Ｌ）含み、残りを滅菌水で１０ｇに調整した液体物）を調製した。この発酵液を５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ－０６ＢＮ）を用いて、３５℃にて３５ｒｐｍの回転速度でインキュベートした。０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈの発酵液を少量ずつサンプリングしてＨＰＬＣでエタノール濃度を測定したところ、β－グルコシダーゼを表層提示する酵母の方が高いエタノール濃度を示した。つまり、アビセル１０％をセルロース原料に用いた発酵系で、TJ14よりもTJ14-BGLの方が０ｈ以降のエタノール濃度が高く、アビセル２０％の発酵液でもTJ14よりTJ14-BGLの方が０ｈ以降のエタノール濃度が高かった。上記の実施例のように二糖で誘導生産されたセルラーゼ剤を使ってβ－グルコシダーゼ層提示微生物がセルロースの発酵を行うことで、糖化発酵産物がより効率的に生産されることを示した。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明によれば、従来よりも、より安価に且つ効率的に、セルラーゼ等の誘導効果を有するグルコース２分子が脱水縮合した糖を製造することが可能となるため有用である。また、本発明では、該二糖類を用いることで、最終的に、セルロース等を含む産業廃棄物などから、従来よりもコストや時間の面から有利な態様にて、糖化発酵産物を製造することが可能となるため有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
