特開 2024-160965 癌を治療するためのマウス抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子、ベクター及びその細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024160965

(43)【公開日】2024-11-15

(54)【発明の名称】癌を治療するためのマウス抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子、ベクター及びその細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20241108BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241108BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20241108BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20241108BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20241108BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20241108BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20241108BHJP

   A61K 35/17 20150101ALN20241108BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/12 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N5/0783

C07K14/725

C07K16/28

C07K19/00

A61P35/00

A61K35/17

【審査請求】有

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024072668

(22)【出願日】2024-04-26

(31)【優先権主張番号】18/311409

(32)【優先日】2023-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】521311643

【氏名又は名称】沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】林成龍

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA66

4C087ZB26

4H045AA10

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子を提供する。
【解決手段】前記ＣＡＲは、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインを含む一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片であって、前記マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片と、４－１ＢＢを含む共刺激構造ドメインと、ＣＤ３－ζの天然細胞内シグナル伝達構造ドメインを含む初代細胞内シグナル伝達構造ドメインとを含む。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体は、
重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２及び重鎖相補性決定領域３を含む重鎖可変領域と、
軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２及び軽鎖相補性決定領域３を含む軽鎖可変領域とを含むマウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインを含み、
前記重鎖相補性決定領域１は、配列番号１を含み、前記重鎖相補性決定領域２は、配列番号２を含み、前記重鎖相補性決定領域３は、配列番号３を含み、前記軽鎖相補性決定領域１は、配列番号４を含み、前記軽鎖相補性決定領域２は、配列番号５を含み、前記軽鎖相補性決定領域３は、配列番号６を含む一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片と、
４－１ＢＢを含む共刺激構造ドメインと、
ＣＤ３－ζの天然細胞内シグナル伝達構造ドメインを含む初代細胞内シグナル伝達構造ドメインと、
を含む、キメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項2】

前記マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、一本鎖可変断片、二本鎖可変断片、抗原結合断片、又はＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項3】

前記重鎖可変領域は、配列番号７又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号８又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項4】

前記マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項5】

前記マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、前記マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１０、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項6】

前記４－１ＢＢは、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項7】

前記４－１ＢＢは、前記４－１ＢＢをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１４、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項8】

前記ＣＤ３－ζは、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項9】

前記ＣＤ３－ζは、前記ＣＤ３－ζをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１６、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項10】

前記キメラ抗原受容体は、前記一本鎖抗体又は前記一本鎖抗体断片、前記共刺激構造ドメイン、及び前記初代細胞内シグナル伝達構造ドメインを順に含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項11】

ＣＤ８ヒンジの膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項12】

前記ＣＤ８ヒンジは、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項13】

前記ＣＤ８ヒンジは、前記ＣＤ８ヒンジをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１２、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項14】

前記キメラ抗原受容体は、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項15】

前記キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１８、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子。

【請求項16】

請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含む、ベクター。

【請求項17】

前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１６に記載のベクター。

【請求項18】

ＥＦ－１プロモーターをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。

【請求項19】

請求項１６に記載のベクターを含み、ヒトＴ細胞である、細胞。

【請求項20】

前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、キメラ抗原受容体に関し、特にマウス抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍細胞は、免疫逃避を促進する多くの特性を持っている。最近、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｔ；ＣＡＲ－Ｔ）は、腫瘍細胞治療を特異的に標的とするために設計される。ＣＡＲ－Ｔは、患者の自体Ｔ細胞を遺伝子改変することによって生成される。単離、賦活化、遺伝子改変及び増幅などのプロセスにより、あらかじめ設計された遺伝子を患者のＴ細胞に導入し、生成されたＣＡＲ－Ｔは、そのＣＡＲ構造により特定の癌標的モチーフ（ｍｏｔｉｆ）を同時に発現し、且つ癌細胞に対して強化される細胞毒性を示す。そして、完全に調製されたＣＡＲ－Ｔを患者の体内に再注入して癌を治療する。

【0003】

上記の努力をしたにもかかわらず、より効果的なＣＡＲ－Ｔが求められ続けている。そのため、従来技術を改善する必要がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示における一実施形態は、キメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子を提供し、キメラ抗原受容体は、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインを含む一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片であって、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｈ１）、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖可変（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ；ＶＨ）領域と、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｌ１）、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ；ＶＬ）とを含み、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号１を含み、ＣＤＲ Ｈ２は、配列番号２を含み、ＣＤＲ Ｈ３は、配列番号３を含み、ＣＤＲ Ｌ１は、配列番号４を含み、ＣＤＲ Ｌ２は、配列番号５を含み、ＣＤＲ Ｌ３は、配列番号６を含む一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片と、４－１ＢＢを含む共刺激構造ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）と、ＣＤ３－ζ（ＣＤ３ ｚｅｔａ）の天然細胞内シグナル伝達構造ドメインを含む初代細胞内シグナル伝達構造ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）とを含む。

【0005】

いくつかの実施形態では、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）、二本鎖ｓｃＦｖ、抗原結合断片（Ｆａｂ）、又はＦ（ａｂ’）２である。

【0006】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７又はそれと少なくとも９０％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を持つ配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ配列を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１０、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、４－１ＢＢをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１４、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３－ζは、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３－ζは、ＣＤ３－ζをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１６、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片、共刺激構造ドメイン及び初代細胞内シグナル伝達構造ドメインを順に含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体をコードする単離核酸分子は、ＣＤ８ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）の膜貫通ドメインをさらに含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、ＣＤ８ヒンジをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１２、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１８、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0019】

本開示の別の実施形態は、上記のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。

【0020】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ＥＦ－１プロモーターをさらに含む。

【0022】

本開示の別の実施形態は、上記のベクターを含み、ヒトＴ細胞である細胞を提供する。

【0023】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はそれらの組み合わせである。

【図面の簡単な説明】

【0024】

図面を合わせて以下の詳細な説明を読むと、本開示の様々な態様が最も理解しやすい。注意すべきことに、業界標準の操作手順に従って、さまざまな特徴的構造が比例して描かれていない可能性がある。実際に、論述を明確にするために、様々な特徴的構造の寸法を任意に増減することができる。本開示の上記及びその他の目的、特徴、利点、及び実施例をより明確にわかりやすくするために、図面を以下のように説明する。

【図1】フローサイトメトリーを使用してＰ１ゲーティングされたＲａｊｉ癌細胞株の表面でのＣＤ１９の発現である。

【図2A】ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ癌細胞と５時間共培養した後に形質導入されていない（ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ；ＵＴＤ）及びＣＡＲ形質導入された初代Ｔ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＤ１９．ＢＢ．ｚ）のＣＤ１０７ａの脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）の度合である。

【図2B】ＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ亜集団（ＣＤ４ ＣＤ１９．ＢＢ．ｚ）及びＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ亜集団（ＣＤ８ ＣＤ１９．ＢＢ．ｚ）を含む初代Ｔ細胞とＣＤ１９＋Ｒａｊｉ癌細胞とを５時間共培養した後に、形質導入されていない（ＣＤ４ ＵＴＤ、ＣＤ８ ＵＴＤ）及びＣＡＲ形質導入された初代Ｔ細胞のＣＤ１０７ａの脱顆粒の度合である。

【図3】Ｒａｊｉ癌細胞と、形質導入されていない（ＵＴＤ）及びＣＡＲ形質導入された初代Ｔ細胞（ｍＣＤ１９）とを４８時間共培養した後、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；Ｌｕｃ）に基づく細胞毒性実験に基づいて測定された特異的細胞溶解である。

【図4】異なるＥ：Ｔの比でＲａｊｉ癌細胞を露出させないか又は露出させる場合に、ＣＡＲ形質導入された初代Ｔ細胞の増殖状況をフローサイトメトリーで測定する。

【図5】図４のＣＡＲ－Ｔ増殖モデルである。

【図6】白血病異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）動物モデルに対する研究設計である。

【図7】同じイメージング条件で指定された期間に得られたＧ１～Ｇ４マウスの生物発光画像である。

【図8】屠殺当日にＲａｊｉ／Ｌｕｃ癌細胞移植マウスの器官（心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳及び大腿骨）及び全身にわたるインビボ生物発光強度である。

【図9】ＣＡＲ－ＴをＲａｊｉ／Ｌｕｃ癌モデルに投与したＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒの生存率曲線である。バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ）の無病生存率の曲線である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本開示の記述をより詳細かつ完全にするために、以下では本開示の実施形態と具体的な実施例について例示的に説明するが、これは本開示の具体的な実施例を実施又は運用する唯一の形式ではない。以下に開示される各実施例は、有益な場合には互いに組み合わされてもよいし、代替されてもよいし、さらなる記載や説明を必要とせずに、一実施例に他の実施例を追加してもよい。以下の説明では、読者が以下の実施例を十分に理解できるように、多くの特定の詳細を詳細に述べる。しかしながら、本開示の実施例は、このような特定の詳細なしで実施することもできる。

【0026】

本明細書では、冠詞について特に限定されない限り、「１つの」と「この」は、単一又は複数を一般的に指すことができる。さらに理解できるように、本明細書で使用される「含む」、「含有する」、「有する」及び類似語は、記載されている特徴、領域、整数、工程、操作、要素及び／又はコンポーネントを示すが、前記又はさらなる１つ又は複数の他の特徴、領域、整数、工程、操作、要素、コンポーネント、及び／又はその群を除外するものではない。

【0027】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子のＣＡＲは、一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片を含む。一本鎖抗体又は一本鎖抗体断片は、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインを含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジを含み、共刺激構造ドメインは、４－１ＢＢを含み、初代細胞内シグナル伝達構造ドメインは、ＣＤ３－ζの天然細胞内シグナル伝達構造ドメインを含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｈ１）、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域と、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｌ１）、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む。ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号１を含み、ＣＤＲ Ｈ２は、配列番号２を含み、ＣＤＲ Ｈ３は、配列番号３を含み、ＣＤＲ Ｌ１は、配列番号４を含み、ＣＤＲ Ｌ２は、配列番号５を含み、ＣＤＲ Ｌ３は、配列番号６を含む。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔの定義で限定されている。

【0029】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域の全長は、配列番号７を含み、軽鎖可変領域の全長は、配列番号８、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の全長は、配列番号９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１０、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、ＣＤ８ヒンジをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１２、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、４－１ＢＢをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１４、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３－ζは、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３－ζは、ＣＤ３－ζをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１６、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの全長は、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの全長は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１８、又はそれと少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、配列番号１０、１２、１４、１６、１８と少なくとも９０％の同一性を持つ核酸配列については、それぞれ配列番号１０、１２、１４、１６及び１８と９０％～９９％の同一性を持つ配列も本実施形態において同様な効果を提供することができる。例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はこれらの値のうちのいずれか２つの値の間の任意の値である。

【0037】

いくつかの実施例では、前記核酸配列は、配列番号１０、１２、１４、１６及び１８の縮重配列から選択される。「縮重配列」という用語とは、本開示において、ヌクレオチドの一部が置換された核酸配列である。つまり、配列番号１０、１２、１４、１６及び１８の縮重配列とは、配列番号１０、１２、１４、１６及び１８の配列長が一定である場合に、オリゴヌクレオチド配列と約１％～１０％の変異が許容され得ることを意味する。

【0038】

いくつかの実施例では、前記核酸配列は、配列番号１０、１２、１４、１６及び１８の誘導配列から選択される。「誘導配列」という用語とは、本開示におけるオリゴヌクレオチド配列の３’端及び／又は５’端が改変されており、且つオリゴヌクレオチド配列の一部又は全部が保持できることを意味する。

【0039】

「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」又は「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、２つのポリマー分子の間（例として、２つの核酸分子の間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子、又は２つのポリペプチド分子の間）のサブユニット配列の同一性を意味する。２つの分子のサブユニットの位置がいずれも同様なモノマーサブユニットによって占有された場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）によって占有される場合、この位置で相同又は同一である。２つの配列の間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数に直接関係し、例えば２つの配列における位置の半分（例えば１０サブユニット長のポリマーにおける５つの位置）が相同である場合に、２つの配列は、５０％相同であり、９０％の位置（例えば１０分の９）が相同又は同一である場合に、２つの配列は、９０％相同である。

【0040】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターに関する。一実施形態では、前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターからなる群から選択される。

【0041】

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、前記ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施例では、前記プロモーターは、ＥＦ－１プロモーターである。いくつかの実施例では、前記プロモーターは、ＥＦ－１αプロモーターである。いくつかの実施例では、前記ベクターは、インビトロ転写ベクター（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）である。

【0042】

いくつかの実施形態では、細胞は、上記のベクターを含む。一実施形態では、前記細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施例では、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0043】

以下にいくつかの実施例及び実験例を挙げて、本開示のマウス抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をより詳細に説明するが、それらは、例示的な説明のためのものにすぎず、本開示を限定するためのものではなく、本開示の保護範囲は、後述の特許請求の範囲に規定されたものに準じている。

【0044】

実施例

【0045】

以下、一連の操作又は工程を用いて本開示の方法を説明するが、これらの操作又は工程に示される手順は、本開示の制限として解釈されるべきではない。例えば、いくつかの操作又は工程は、異なる手順で実行することができ、及び／又は他の工程と同時に実行することができる。さらに、本開示の実施形態を実現するために、すべての図示された操作、工程、及び／又は特徴を実行する必要はない。さらに、ここに記載の各操作又は工程は、複数のサブ工程又はサブ操作を含むことができる。

【0046】

実施例１ レンチウイルスの生成

【0047】

レンチウイルスは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための重要な材料であった。レンチウイルスは、特別に設計されたＣＡＲプラスミド配列をヒトＴ細胞に形質導入して、ＣＡＲを発現するＴ細胞を生成するために用いられた。

【0048】

レンチウイルス生成用の細胞を製造するために、培養フラスコで培養された付着された２９３Ｔ細胞をトリプシンで単離した。ＦＢＳ含有培地のトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）が停止した後、２９３Ｔ細胞を遠心分離によって収集し且つ２９３Ｔ培地（１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン及び１ｍＭのピルビン酸塩）に再懸濁した。アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム（ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を使用して細胞を染色し、ＬＵＮＡ－ＦＬ（商標）自動蛍光セルカウンター（ＡＯ／ＰＩ及びセルカウンターと略す）を使用して自動的に細胞計数を行って２９３Ｔ細胞の数及び生存率を決定した。Ｔ８７５培養フラスコにおける２９３Ｔ細胞を使用してレンチウイルスを生成する場合、１．５×１０^７個の細胞を２００ミリリットル（ｍＬ）の培地に再懸濁し、均一に混合し、そしてＴ８７５培養フラスコに移した。そして細胞を含有するＴ８７５を３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベータに置いて細胞培養を行った。

【0049】

３日培養した後、２９３Ｔ細胞と、トランスフェクション試薬Ｐｏｌｙｊｅｔ（商標）及びＧＡＧ－Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＶＳＶ－Ｇ、ＣＤ１９を遺伝子組換えして（上記のマウス抗ＣＤ１９結合構造ドメイン、ＣＤ８ヒンジ、４－１ＢＢ、及びＣＤ３－ζを含む）なる４つの単独ＤＮＡプラスミドを含有する、第５のＤＮＡプラスミドＴＡＴを含有する又は含有しない培地とを共培養することにより、レンチウイルスパッケージングを開始した。ＤＮＡプラスミドの樹立は、主に受託合成により分子クローン技術で改変され、メーカーのプロトコールに基づいてトランスフェクション試薬Ｐｏｌｙｊｅｔ（商標）を使用してトランスフェクションプロセスを行った。２９３Ｔの元の培地を吸い出し、８ｍＬのＰｏｌｙＪｅｔ／ＤＮＡプレミックスを含む１０８ｍＬの無血清ＤＭＥＭに交換した。そしてＴ８７５を３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベータに入れて細胞トランスフェクションを行った。

【0050】

１２～１８時間トランスフェクションした後、細胞培養物をＰＢＳですすぎ、レンチウイルスを含有する上清を採取するために、１００ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸、０．２５％のアルブミン、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を補充した。レンチウイルスを連続的に生成し採取するために、Ｔ８７５を３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベータに入れて培養した。具体的には、レンチウイルスを含有する上清を２４時間ごとに１～２回採取し、採取するごとに１００ｍＬの新鮮なＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地に交換した。

【0051】

レンチウイルスを含有する上清を採取するごとに、０．４５μｍのフィルターカップで浄化し且つ４℃で一時的に保管した。メーカーの指示に基づいて、タンジェンシャルフローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）装置ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）でレンチウイルスサンプルをさらに精製し、緩衝液を交換して濃縮した。特定の手順で接続された滅菌容器、チューブ、中空糸及びペリスタポンプによって生成される圧力によって駆動されるレンチウイルスサンプルを使用して、細胞や細胞破片など、レンチウイルス中の潜在的な汚染物を浄化し、Ｔ細胞の形質導入に対してより適するように、レンチウイルスを緩衝液に交換し、より高い濃度に濃縮した。ＴＦＦで処理されたレンチウイルスを０．２μｍのろ紙で滅菌し、－８０℃で保存した。

【0052】

ＣＤ１９ ＣＡＲ構築体は、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激構造ドメイン、及び初代細胞内シグナル伝達構造ドメインを含む一本鎖抗体を含んだ。マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含んだ。重鎖可変領域は、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）及びＣＤＲ Ｈ３（配列番号３）を含み、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号５）及びＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）を含んだ。重鎖可変領域の全長は、配列番号７を含み、軽鎖可変領域の全長は、配列番号８を含んだ。マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインのｓｃＦｖの全長は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、マウス抗ＣＤ１９結合構造ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１０であった。膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジであり、ＣＤ８ヒンジは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤ８ヒンジをコードする核酸配列は、配列番号１２であった。共刺激構造ドメインは、４－１ＢＢであり、４－１ＢＢは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、４－１ＢＢをコードする核酸配列は、配列番号１４であった。初代細胞内シグナル伝達構造ドメインは、ＣＤ３－ζの天然細胞内シグナル伝達構造ドメインであり、ＣＤ３－ζは、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ζをコードする核酸配列は、配列番号１６であった。ＣＡＲの全長は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１８であった。

【0053】

実施例２ ＣＡＲ－Ｔの生成

【0054】

メーカーの手順に基づいて、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ密度勾配培地及びＳｅｐＭａｔｅ（商標）で健常な患者の全血サンプルから末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣｓ）を単離した。単離後、ＰＢＭＣｓを２％のヒトアルブミンを含むＰＢＳに２×１０^７個の細胞／ｍＬ～５×１０^７個の細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。

【0055】

ＰＢＭＣを同定するために、ＡＯ／ＰＩ及びセルカウンターを使用して細胞を染色することにより、細胞のサイズ、生存率、及び総数を決定した。Ｔ細胞の数を定量するために、ＤｕｒａＣｌｏｎｅ ＩＭ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＢＡＳＩＣチューブを使用してＰＢＭＣを染色し、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ）によりそのＣＤ３＋細胞の百分率（％）を分析した。

【0056】

再懸濁したＰＢＭＣサンプルからＴ細胞を単離し、それらを賦活化するために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁気ビーズをＰＢＭＣ細胞懸濁液に添加し、添加量は、特定のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）とＴ細胞との比を満たすようにＣＤ３＋Ｔ細胞の総数に基づいて決定された。混合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）及びＰＢＭＣサンプルをゆっくりと回転させ、そして磁力ホルダーに置いて固定し、ビーズ及び細胞を選択して磁気ビーズ－細胞複合体を形成した。そして２％のヒトアルブミンを含むＰＢＳの細胞懸濁緩衝液をＴ細胞培養用の完全なＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地と置き換えた。

【0057】

Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で単離されるＴ細胞の総数を（ＡＯ／ＰＩ及びセルカウンターで）定量し、Ｔ細胞（磁気ビーズ－細胞複合体）を１×１０^６個の細胞／ｍＬの細胞密度で培養フラスコに接種した。そしてＴ細胞を含有する培養フラスコを３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベータに入れて一晩培養した。

【0058】

一晩培養した後、あらかじめ力価を測定したレンチウイルスを解凍し、Ｔ細胞を含有する培養フラスコに添加し、少なくとも２０回軽くピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）し、培地と混合した。培養フラスコを３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベータに戻してレンチウイルス形質導入及びＴ／ＣＡＲ－Ｔ細胞のさらなる増幅を行った。

【0059】

２日培養した後、磁力固定装置を使用して磁気ビーズを固定し、そして磁気ビーズにおける細胞をあらかじめ存在した培地ですすぎ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を磁気ビーズ－細胞複合体から分離した。磁気ビーズを細胞から完全に分離することを確保し、磁気ビーズによる細胞生成物の汚染を最小限に抑えるために、ビーズ除去プロセスを複数回繰り返した。そしてＡＯ／ＰＩ染色及びセルカウンターを用いて、分離したＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞サイズの特徴、生存率及び総数を検査した。

【0060】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標） １０Ｍ急速増殖細胞培養システムを使用してＣＡＲ－Ｔ細胞をさらに４日増幅した。３×１０^６個のＣＡＲ－Ｔ細胞をＧ－Ｒｅｘ（登録商標）に添加し、１００ｍＬの完全なＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５で培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有するＧ－Ｒｅｘ（登録商標）を３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベータに置いて４日培養した。

【0061】

Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）で４日培養した後、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）を反転して混合し、増幅したＣＡＲ－Ｔをシリンジ及び三方バルブでサンプリングした。ＡＯ／ＰＩ染色及びセルカウンターを用いて、増幅倍数を計算するためのＣＡＲ－Ｔ細胞の総数を定量した。Ｔ細胞の百分率、より具体的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞の百分率を決定するために、細胞に対して、ＤｕｒａＣｌｏｎｅ ＩＭ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＢＡＳＩＣチューブでそのＣＤ３＋細胞の百分率（％）を染色して分析するだけではなく、さらにビオチン化したα－マウスＦ（ａｂ’）２抗体でそのＣＡＲ＋細胞の百分率（％）を測定し、いずれもフローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ）で定量した。そして、得られた特徴付けられた（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ＣＡＲ－Ｔ細胞を様々な実験に用いた。

【0062】

実施例３ ＣＡＲ－Ｔの賦活化と毒性

【0063】

ＣＤ１０７ａの脱顆粒過程は、顆粒膜と免疫エフェクター細胞の細胞質膜との融合に伴う結果、リソソーム関連タンパク質の表面が露出した。ＣＤ１０７ａなどのこれらのリソソーム関連タンパク質は、一般的に溶解顆粒の周辺の脂質二重層にあった。そのため、細胞質膜でのＣＤ１０７ａの発現は、免疫細胞が賦活化され及び細胞毒性が脱顆粒されるマーカーとして使用することができる。

【0064】

Ｒａｊｉ癌細胞株は、ＣＤ１９＋細胞であり、フローサイトメトリーによりＰ１ゲーティング（Ｐ１ ｇａｔｉｎｇ）されると、表面でのＣＤ１９の発現率は、９９．９６％に達した（図１）。Ｒａｊｉ癌細胞と、形質導入されていない又はＣＡＲ形質導入された初代Ｔ細胞とを異なるエフェクター細胞と腫瘍細胞との比（エフェクター：ターゲットの比、ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ（Ｅ：Ｔ）ｒａｔｉｏ）（０．３：１、１：１、３：１及び１０：１）で５時間培養し、ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞でのみ明らかなＣＤ１０７ａの脱顆粒が観察された（図２Ａ）。ＣＤ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞亜集団は、ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ亜集団よりも明らかな脱顆粒効果があるようであった（図２Ｂ）。

【0065】

ルシフェラーゼに基づく細胞毒性実験は、ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞と１：１、３：１及び１０：１のＥ：Ｔの比でそれぞれ４８時間共培養すると、２０％、４０％及び８０％を超えるＣＤ１９＋Ｒａｊｉ癌細胞が溶解されたことを示した（図３）。細胞毒性は、高いＥ：Ｔの比で強化され、明らかな用量依存性の効果があった。

【0066】

実施例４ ＣＡＲ－Ｔの増殖

【0067】

ベースラインの時にカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＣＦＳＥ）をマーカーとしてＣＡＲ－Ｔ細胞を染色し、７２時間から開始して６日継続し、異なるＥ：Ｔの比のＲａｊｉ癌細胞と接触した後、ＣＦＳＥ強度の低下及びＣＡＲ形質導入されたＴ細胞の増殖状況を観察した。Ｒａｊｉ癌細胞と接触した後、明らかなＣＡＲ－Ｔの増殖が観察され（図４）、ＣＡＲ－Ｔの細胞分裂のモードを示した（ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）７、Ｄｅ Ｎｏｖｏソフトウェア、カリフォルニア州、米国）（図５）。

【0068】

実施例５ 白血病異種移植動物モデル

【0069】

Ｒａｊｉ／Ｌｕｃ癌細胞を６～８週齢の雄ＡＳＩＤマウス（０日目とした）の尾静脈（１×１０^６個の細胞／２００μＬ／マウス）に注射した。７日目（Ｄ７）に、マウスにＣＡＲ－Ｔ細胞を１回静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。予定された日に生物発光イメージング（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ；ＢＬＩ）により腫瘍の進行を監視した。マウスの体重及び臨床徴候（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎ）の観察を毎週記録した。蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）によりＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を週１回に監視した。ＢＬＩにより器官（心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳及び大腿骨）のルシフェラーゼ活性（図６）を測定した。

【0070】

表１は、群分け及び投与を示した。Ｒａｊｉ／Ｌｕｃ癌細胞注射群の第１のブロック因子（ｂｌｏｃｋ ｆａｃｔｏｒ）は、マウスの体重であった。体重に基づいて、マウスを１０個のレベル（低から高まで、１つのレベルに４匹のマウス）に分けた。各レベルのマウスを各群にランダムに分けた。ＣＡＲ－Ｔ細胞注射群の第２のブロック因子は、生物発光シグナルであった。生物発光シグナルに基づいて、マウスを１０個のレベル（低から高まで、１つのレベルに４匹のマウス）に分けた。各レベルのマウスを各群にランダムに分けた。

【0071】

【表1】

【0072】

同じイメージングの条件で指定された期間に得られたＧ１～Ｇ４マウスの生物発光画像である図７を参照されたい。符号Ｘ、▲、及び●は、それぞれＤ１７～Ｄ２５の人道的エンドポイント（ほとんどのマウスが麻痺症状を発症）、Ｄ２８～Ｄ５６の人道的エンドポイント（ほとんどのマウスの体重が減少）及びＤ５６の実験的エンドポイント（生存）を表した。各群の生物発光強度の平均値（ｘ１０^３、光子／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）は、表２に示した。

【0073】

【表2】

【0074】

結果によれば、Ｇ１群の生理食塩水群マウスは、Ｒａｊｉ癌細胞が注射された後、２～３週間以内に死亡したことを示した。逆に、Ｅ：Ｔの比が高い場合に、生物発光強度は、最初の週から３週間にかけて明らかに用量依存的に減少し、その中でＤ１７～Ｄ２５の間に、ほとんどのマウスは、癌により麻痺症状を伴って死亡した（図７において符号ｘで示した）。なお、Ｄ２８～Ｄ５６の間に、ほとんどのマウスは、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ、一般的に拒絶反応として呼ばれる）により体重減少を伴って死亡し（図７において符号▲で示す）、病理学的セクションによりさらに証明された。なお、Ｇ４群に示すように、最初の週から２週間にかけての生物発光強度の減少は、腫瘍が初期の数週に減少したことを示したが、Ｄ２８～Ｄ５６の間に、ほとんどのマウスは、ＧＶＨＤにより体重減少を伴って死亡した。

【0075】

図８は、屠殺当日にＲａｊｉ／Ｌｕｃ癌細胞移植マウスの器官（心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳及び大腿骨）及び全身のインビボ生物発光強度であった。屠殺当日に各群の指定された器官の生物発光強度の平均値（光子／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）は、表３に示した。

【0076】

【表3】

【0077】

結果によれば、生物発光強度は、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳及び大腿骨などの全身にわたるＲａｊｉ癌細胞の分布を表すことを示した。すべての器官の生物発光強度は、高いＥ：Ｔの比でいずれも低減し、明らかな用量依存性の効果があった。

【0078】

図９に示すように、図９は、ＣＡＲ－Ｔを投与したＲａｊｉ／Ｌｕｃ癌モデルのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率曲線である。ＣＡＲ－Ｔ投与後の実際の生存率を分析するために、ＧＶＨＤにより死亡したマウスを除外した。バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ）の無病生存率曲線において、生理食塩水のみを投与したＧ１群のマウスは、すべてＲａｊｉ癌細胞移植後の２４日で死亡した。これに対して、Ｅ：Ｔ＝１：１のＧ２群の生存率は、２５％、Ｅ：Ｔ＝３：１のＧ３群の生存率は、７０％、そして驚くべきことに、Ｅ：Ｔ＝１０：１のＧ４群のＲａｊｉ癌細胞移植後２８日以内の生存率は、１００％であった。

【0079】

本開示は、上記のように実施形態で開示されているが、本開示を限定するために使用されるものではなく、いかなる当業者であれば、本開示の精神と範囲を逸脱することなく、様々な変更と修正を行うことができるので、本開示の保護範囲は、後に添付された特許請求の範囲によって規定されている者を基準とする。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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