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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024161025
(43)【公開日】2024-11-15
(54)【発明の名称】安定化された濾過装置
(51)【国際特許分類】
B01D 67/00 20060101AFI20241108BHJP
B01D 71/70 20060101ALI20241108BHJP
B01D 69/10 20060101ALI20241108BHJP
B01D 69/12 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/68 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/52 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/12 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/10 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/16 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/66 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/56 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/38 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/26 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/50 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/48 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/64 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/42 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/02 20060101ALI20241108BHJP
B01D 71/04 20060101ALI20241108BHJP
B01J 13/22 20060101ALI20241108BHJP
【ＦＩ】
B01D67/00
B01D71/70
B01D69/10
B01D69/12
B01D71/68
B01D71/52
B01D71/12
B01D71/10
B01D71/16
B01D71/66
B01D71/56
B01D71/38
B01D71/26
B01D71/50
B01D71/48
B01D71/64
B01D71/42
B01D71/02
B01D71/04
B01J13/22
【審査請求】有
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024135593
(22)【出願日】2024-08-15
(62)【分割の表示】P 2021550132の分割
【原出願日】2020-02-26
(31)【優先権主張番号】1950252-5
(32)【優先日】2019-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(71)【出願人】
【識別番号】521378587
【氏名又は名称】レテイン エービー
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イサクソン、シモン
(72)【発明者】
【氏名】アンデルソン、マルティン
(57)【要約】
【課題】水を通過させる膜内在性タンパク質を含む高分子膜構造体を提供する。
【解決手段】高分子膜構造体（２）は、水を通過させる膜内在性タンパク質（ＩＭＰ）（１）を有する膜（３）を含み、第１の表面上でシリカ層（４）で被覆されている。シリカ層（４）は、水を通過させるＩＭＰ（１）の水の通過機能を維持しながら、高分子膜構造体（２）および水を通過させるＩＭＰ（１）を安定化させる。この安定化の結果として、高分子膜構造体（２）は、浄水を含む様々な濾過操作のために濾過装置（５）で使用することができる。
【選択図】図１
【解決手段】高分子膜構造体（２）は、水を通過させる膜内在性タンパク質（ＩＭＰ）（１）を有する膜（３）を含み、第１の表面上でシリカ層（４）で被覆されている。シリカ層（４）は、水を通過させるＩＭＰ（１）の水の通過機能を維持しながら、高分子膜構造体（２）および水を通過させるＩＭＰ（１）を安定化させる。この安定化の結果として、高分子膜構造体（２）は、浄水を含む様々な濾過操作のために濾過装置（５）で使用することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）であって、前記膜（３）の第１の表面がシリカ層（４）で被覆された膜（３）を含む、高分子膜構造体（２）。
【請求項2】
前記膜（３）が、両親媒性分子を含む二重層膜（３）である、請求項１に記載の高分子膜構造体。
【請求項3】
前記膜（３）が、脂質二重層膜（３）であり、前記脂質二重層（３）の両親媒性脂質が、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、スフィンゴミエリン、アソレクチン、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ リゾＰＣ）または１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ リゾＰＣ）などのリゾＰＣ、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ リゾＰＥ）または１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ リゾＰＥ）などのリゾＰＥ、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＥＰＡ）、１，２－エルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジエルコイ－ｓｎ－アリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＬＰＡ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬＰＳ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＭＰＡ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＭＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＯＰＡ）、１，２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＰＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＳＰＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオステアルピル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、細胞膜からの脂質、細胞小器官からの脂質、架橋性脂質、およびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくはＰＯＰＣである、請求項２に記載の高分子膜構造体。
【請求項4】
前記両親媒性分子が、両親媒性ＡＢ、ＡＢＡおよびＡＢＣコポリマーならびにそれらの混合物、例えばポリ（メチルオキサゾリン）－ポリ（ジメチルシロキサン）－ポリ（メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳ－ＰＭＯＸＡ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）－ｂ－ポリ（ジメチルシロキサン）－ｂ－ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥｔＯｚ－ＰＤＭＳ－ＰＥｔＯｚ）およびそれらの混合物から選択される、請求項２に記載の高分子膜構造体。
【請求項5】
前記膜（３）が、プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソームであり、前記プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソームの外面が前記シリカ層（４）で被覆されている、請求項１～４のいずれかに記載の高分子膜構造体。
【請求項6】
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）が、アクアポリンであり、好ましくは、ｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ３、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、ｈＡＱＰ７、ｈＡＱＰ８、ｈＡＱＰ９、ｈＡＱＰ１０、ｈＡＱＰ１１、ｈＡＱＰ１２、好ましくはｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、またはｈＡＱＰ８、より好ましくはｈＡＰＱ４などのヒトアクアポリン（ｈＡＱＰ）；ｂＡＱＰ１などのウシアクアポリン；ｃｐＡＱＰ１ａａなどの魚アクアポリン；Ａｑｙ１などの酵母アクアポリン；ＳｏＰＩＰ２；１、ＡｔＴＩＰ２；１またはＡｔＰＩＰ２；４などの植物アクアポリン；ＡｑｐＺなどの細菌アクアポリン；およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１～５のいずれかに記載の高分子膜構造体。
【請求項7】
前記シリカ層（４）が、０．１ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ～１０ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有する、請求項１～６のいずれかに記載の高分子膜構造体。
【請求項8】
前記水を通過させる膜内在性タンパク質（１）が、前記シリカ層（４）の存在下で前記膜（３）に水を通すことができる、請求項１～７のいずれかに記載の高分子膜構造体。
【請求項9】
前記シリカ層（４）が、好ましくはフルオロアルキルシラン（ＦＡＳ）などのシラン、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＺ）などのアルコキシシラン、またはそれらの組合せを含む官能性シリカ層（４）である、請求項１～８のいずれかに記載の高分子膜構造体。
【請求項10】
濾過装置（５）であって、
複数の細孔（７）を含む多孔性支持体（６）と、
請求項１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）と
を含む、濾過装置（５）。
複数の細孔（７）を含む多孔性支持体（６）と、
請求項１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）と
を含む、濾過装置（５）。
【請求項11】
前記高分子膜構造体（２）が、前記多孔性支持体（６）の表面に設けられている、および／または前記多孔性支持体（６）の前記細孔（７）内に設けられている、請求項１０に記載の濾過装置。
【請求項12】
前記多孔性支持体（６）が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリエーテルエーテルスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンエーテル、ポリジフェニルフェニレンエーテル、セルロース、ポリビニレンセルロースアセタート、セルロースジアセタート、セルローストリアセタート、セルロースニトラート、ポリフェニレンスルフィド、ニトロセルロース、アセチル化メチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、有機シロキサンカーボネート、ポリエステルカーボネート、有機ポリシロキサン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリベンゾイミダゾール、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ナイロンおよびこれらの混合物などのポリマー；アルミニウム、チタン、ジルコニウム、鉄、またはそれらの酸化物などの金属、または前記金属の酸化物；二酸化ケイ素；ガラス繊維；ならびにそれらの混合物からなる群から選択される材料で形成されている、請求項１０または１１に記載の濾過装置。
【請求項13】
前記濾過装置（５）が、請求項９に記載の高分子膜構造体（２）を含み、および
官能性シリカ層（４）の官能基は、前記高分子膜構造体（２）を前記多孔性支持体（６）に連結する、
請求項１０～１２のいずれかに記載の濾過装置。
官能性シリカ層（４）の官能基は、前記高分子膜構造体（２）を前記多孔性支持体（６）に連結する、
請求項１０～１２のいずれかに記載の濾過装置。
【請求項14】
水濾液を調製する方法であって、請求項１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）または請求項１０～１３のいずれかに記載の濾過装置（５）を通して水溶液を濾過して前記水濾液を得ることを含む、方法。
【請求項15】
水溶液に溶解または分散した化合物を濃縮する方法であって、請求項１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）または請求項１０～１３のいずれかに記載の濾過装置（５）によって前記水溶液を濾過して、前記化合物を含まない水濾液および前記水溶液よりも高濃度で前記化合物を含む保持液を得ることを含む、方法。
【請求項16】
高分子膜構造体（２）を調製するための方法であって、水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（４）を形成することを含む、方法。
【請求項17】
濾過装置（５）の調製方法であって、
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）を多孔性支持体（６）上および／または多孔性支持体（６）内に沈着させることと、
前記多孔性支持体（６）上および／または前記多孔性支持体（６）内に沈着した水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む前記膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（５）を形成することと
を含む、方法。
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）を多孔性支持体（６）上および／または多孔性支持体（６）内に沈着させることと、
前記多孔性支持体（６）上および／または前記多孔性支持体（６）内に沈着した水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む前記膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（５）を形成することと
を含む、方法。
【請求項18】
前記シリカ前駆体が、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリケート、テトラブチルオルトシリケート、メチルトリエトキシシロキサン（ＭＴＥＳ）、ジメチルジエトキシシロキサン（ＤＭＤＥＳ）、テトラキス（グリセロール）オルトシリケート（ＴＧＳ）またはテトラキス－（２－ヒドロキシエチル）－オルトシリケート（ＴＨＥＯＳ）などのシリコンアルコキシド；アリルトリメトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、ブチルトリクロロシラン、クロロペンタメチルジシラン、１，２－ジクロロテトラメチルジシラン、ジエトキシジフェニルシラン、［３－（ジエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシ（メチル）オクチルシラン、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン、ヘキサメチルジシラン、イソブチル（トリメトキシ）シラン、メチルトリクロロシラン、ペンタメチルジシラン、ｎ－プロピルトリエトキシシラン、テトラエチルシラン、１，１，２，２－テトラメチルジシラン、テトラメチルシラン、トリエトキシメチルシラン、トリエトキシオクチルシラン、トリメトキシフェニルシラン、トリエトキシフェニルシラン、トリエトキシビニルシラン、トリメトキシメチルシラン、γ－アミノプロピルトリエトキシシラン、四塩化ケイ素（テトラクロロシラン）、四臭化ケイ素（テトラブロミドシラン）またはγ－アミノプロピルシラントリオール（ＡＰＳＴＯＬ）などのシラン：ケイ酸ナトリウムなどのシリケート：トリス（ｔｅｒｔ－ペントキシ）シラノールまたはトリス（ｔｅｒｔ－ブトキシ）シラノールなどのシラノール；シラザン、Ｎ－ｓｅｃ－ブチル（トリメチルシリル）アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくはＴＥＯＳである、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、高分子膜構造体、および当該高分子膜構造体を含む濾過装置、ならびに例えば水濾過におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
浄水を利用できることは、国際連合によって人権として定義されている。しかしながら、何億人もの人々は、きれいな飲料水を利用することができず、飲料水の毒性レベルの汚染物質にさらされる喫緊の危険にある。
【0003】
水処理には、飲料水浄化および廃水処理が含まれ、両方法は通常、所望のレベルの純度に達するためにいくつかの処理段階を含む。濾過は、これらの方法で一般的に使用され、例えば、飲料水中の望ましくない化合物を防止し、廃水排出によって海洋生態系に及ぼされる汚染の程度を制限するために使用される。
【0004】
水処理に使用されるフィルタは、サイズ排除フィルタと溶液拡散フィルタの２つの主なカテゴリーに分けることができる。サイズ排除フィルタは、特定の孔径を有し、したがって、細孔よりも大きい物質が、当技術分野では透過液とも呼ばれる濾液に入るのを防ぐ。これらのフィルタの限界は、例えば、ナトリウムイオンおよび塩化物イオンがフィルタを通過するのを止めるほど十分に小さい直径に孔径を調整できないことであり、これは、海水からの飲料水製造、すなわち脱塩に必要である。海水からの飲料水製造は、利用可能な十分に純粋な淡水の量が減少しているため、ますます普及しつつある。溶液拡散フィルタは脱塩において極めて重要であり、脱塩は一般に逆浸透（ＲＯ）によって行われる。ＲＯフィルタの選択層は、通常、界面重合法で形成された薄膜複合（ＴＦＣ）ポリマー膜からなる。ＴＦＣ膜を介した水の濾過は、溶液拡散機構に基づいており、水は最初に化学ポテンシャルの高い側でポリマーマトリックスに分子的に溶解し、それによって水はポリマーを通って化学ポテンシャル勾配へと拡散し、最終的に化学ポテンシャルの低い側で脱着する。関与する浸透圧を克服するために、ポンプを使用して濾過方法を推進する。律速段階は、ポリマーマトリックスを通る拡散であり、選択性の低下を犠牲にして改善することができる。したがって、溶液拡散フィルタは、最適ではない水拡散速度を抱えるため、水を浄化するために大量のエネルギーを必要とする。
【0005】
タンパク質工学およびナノテクノロジーの進歩は、高度に選択的な水処理を実行するために生体模倣を利用する可能性を切り開いた。この手法の背後にある主な推進力は、合成ＴＦＣ膜の使用では不可能な高い選択性と高い流束とを組み合わせる潜在力である。生体模倣に基づくフィルタの開発は、天然環境外で、アクアポリンなどの生体成分の安定性が限られているため、問題があることが判明している。したがって、現実世界での使用に十分な安定した生体模倣フィルタを製造するために、様々なアプローチが検討されている。アクアポリンを安定化するために検討された１つのアプローチは、アクアポリンを含有する支持脂質二重層（ＳＬＢ）またはプロテオリポソームを多孔性支持体上に沈着させることである。科学的成果から判断されるこれまでの最も一般的なアプローチは、両親媒性ブロックコポリマー（ＢＣＰ）二重層へのアクアポリンの挿入に基づいている。アクアポリンはまた、他の有機分子、例えば、ボラ両親媒性物質を使用して、および両親媒性ペプチドを最初のアクアポリン安定化、その後のポリマー安定化のために使用した２段階方法で安定化されている。
【0006】
米国特許第９，９４３，８１２号は、膜タンパク質を含む高分子膜構造体が、互いに、およびリンカーを介して支持細孔壁に固定された、多孔性支持体を含む、安定性および耐久性を高めるための濾過構造体に関する。
【0007】
国際公開第２０１０／０４０３５３号は、流体間で化合物を選択的に輸送および／または濾過するための膜または薄い布を製造する方法に関する。この文献は、糸に結合して小胞－糸複合体を形成するポリマー小胞に組み込まれた天然または遺伝子操作されたタンパク質を開示している。
【0008】
国際公開第２０１５／１４４７２４号は、多孔性支持体と、その表面に共有結合した、膜貫通タンパク質が組み込まれた複数の小胞を含む層とを含む濾過膜を開示している。小胞は両親媒性ブロックコポリマーから形成され、小胞は互いに共有結合して粘性塊を形成する。
【0009】
国際公開第２０１０／０９１０７８号は、重合プロテオリポソームを含むナノ加工膜を開示している。ナノ加工膜は、化学反応性生体適合性間質マトリックスを有するタンパク質組み込みＵＶ架橋性リポソームを使用したバイオナノ融合選択膜である。
【0010】
Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１７，２５：１６３９－１６５２は、金属および金属酸化物ナノ粒子、炭素系ナノ材料、金属有機構造体（ＭＯＦＳ）、水チャネルタンパク質、および有機マイクロナノ粒子を含むナノ濾過膜に関する研究の総説である。
【0011】
上記のアプローチにもかかわらず、ナノスケールの生体模倣水濾過の商業的可能性はまだほとんど検討されていない。商業的実施が限られている主な理由は、特に選択層における巨視的欠陥の形成およびアクアポリンを組み込んだ膜設計での実用に必要な安定性の欠如に関連する製造上の困難である。様々な創造的アプローチを通じて生体模倣水フィルタの開発に投資した努力にもかかわらず、この研究分野は、したがって、その予測される可能性と同等な実世界の性能をまだ提供できていない。
【発明の概要】
【0012】
機械的特性が改善された高分子膜構造体を提供することが一般的な目的である。
【0013】
濾過装置に使用されるのに十分な安定性を有する当該高分子膜構造体を提供することが特定の目的である。
【0014】
これらおよび他の目的は、本明細書に開示される実施形態によって満たされる。
【0015】
本発明は、独立請求項に定義される。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項に定義される。
【0016】
実施形態の一態様は、水を通過させる膜内在性タンパク質を含む膜であって、膜の第１の表面がシリカ層で被覆された膜を含む、高分子膜構造体に関する。
【0017】
実施形態の別の態様は、複数の細孔を含む多孔性支持体および上記の高分子膜構造体を含む濾過装置に関する。
【0018】
実施形態のさらなる態様は、水濾液を調製する方法に関する。この方法は、上記の高分子膜構造体または上記の濾過装置を通して水溶液を濾過して水濾液を得ることを含む。
【0019】
実施形態のさらに別の態様は、水溶液に溶解または分散した化合物を濃縮する方法に関する。この方法は、化合物を含まない水濾液および水溶液よりも高濃度で化合物を含む保持液を得るために、上記の高分子膜構造体または上記の濾過装置を通して水溶液を濾過することを含む。
【0020】
実施形態の一態様は、高分子膜構造体の調製方法に関する。この方法は、水を通過させる膜内在性タンパク質を含む膜をシリカ前駆体と接触させて、膜の第１の表面上に被覆されたシリカ層を形成することを含む。
【0021】
実施形態の別の態様は、濾過装置の調製方法に関する。この方法は、水を通過させる膜内在性タンパク質を含む膜を多孔性支持体上および／または多孔性支持体中に沈着させる（デポジットする）ことを含む。この方法は、多孔性支持体上および／または多孔質支持体中に沈着した、水を通過させる膜内在性タンパク質を含む膜をシリカ前駆体と接触させて、膜の第１の表面上に被覆されたシリカ層を形成することも含む。
【0022】
本発明は、濾過装置におけるおよび様々な濾過用途のためのこれらの構造体の使用を可能にするために、水を通過させる膜内在性タンパク質を組み込んだプロテオリポソームなどの高分子膜構造体の安定化を提供する。水を通過させる膜内在性タンパク質を有する膜をシリカ層で被覆することにより、水を通過させる内在性タンパク質の水を通過させる機能を依然維持しながら安定化が達成される。
【0023】
実施形態は、そのさらなる目的および利点と共に、添付の図面と共に以下の説明を参照することによって最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】プロテオリポソームのケイ化を示す概略図である。テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）の添加後、シリカシェルをヒトアクアポリン４（ｈＡＱＰ４）および１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）脂質からなるプロテオリポソーム上に沈着させる。
【図2A】ｈＡＱＰ４含有プロテオリポソームのケイ化方法を示すＳＡＮＳプロファイルである。
【図2B】プロテオリポソームのケイ化中のｈＡＱＰ４のＣＤスペクトルである。
【図3A】幾何学的パラメータが割り当てられた、部分的に開いたケイ化ｈＡＱＰ４含有プロテオリポソームを示す図である。ｔｉは内葉脂質頭部の厚みを表し、Ｄｃは両葉からの疎水性脂質尾部の厚みを表し、ｔ０は外葉脂質頭部の厚みを表し、ｔＳｉＯ２はシリカシェルの厚みを表す。
【図3B】リポソーム（四角）およびプロテオリポソーム（丸）のケイ化についての時間の関数としての沈着シリカ体積の比較である。表示する実線は、アヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）型方程式に適合する。
【図3C】ケイ化方法の概略図である。ｈＡＱＰ４含有プロテオリポソームをシリカ前駆体ＴＥＯＳと混合すると、プロテオリポソームの外側にシリカシェルが形成される。
【図4A】低倍率でのケイ化ｈＡＱＰ４含有ＰＯＰＣプロテオリポソームのＴＥＭ顕微鏡写真である。暗線はケイ化アクアポリン含有脂質二重層を示し、アクアポリン含有脂質二重層によって囲まれたまたは関連するより明るい領域はシリカを示す。
【図4B】高倍率でのケイ化ｈＡＱＰ４含有ＰＯＰＣプロテオリポソームのＴＥＭ顕微鏡写真である。暗線はケイ化アクアポリン含有脂質二重層を示し、アクアポリン含有脂質二重層によって囲まれたまたは関連するより明るい領域はシリカを示す。
【図4C】シリカ沈着物が明るい特徴として示されているケイ化プロテオリポソームのＳＴＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図4D】シリカ沈着物が明るい特徴として示されているケイ化プロテオリポソームのＳＴＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図5】走査型透過電子顕微鏡エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＳＴＥＭ－ＥＤＸ）画像化を、アクアポリンを含有する乾燥ケイ化小胞で行った。硫黄（アクアポリンにのみ存在）、ケイ素、炭素、リン（ＰＯＰＣ脂質にのみ存在）および酸素の元素マップを得た。個々の元素の元素マップは、アクアポリンを含有するケイ化小胞におけるこれらの元素の位置を特定した。これらの元素のすべてが、二重層およびその関連するシリカ被覆に優先的に位置することが示された。同じ試料領域のＳＴＥＭ高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）顕微鏡写真を左上位置に挿入する。
【図6】エネルギーフィルタ透過型電子顕微鏡法（ＥＦＴＥＭ）を、アクアポリンを含有する乾燥ケイ化小胞における特定元素の局在化のためのＳＴＥＭ－ＥＤＸに対する相補的方法として使用した。ＥＦＴＥＭは、より軽い元素に対する感度の増加により、ＳＴＥＭ－ＥＤＸによってマッピングされた元素に加えて、窒素と水素の両方をマッピングすることができた。ＥＦＴＥＭにより、関連する元素のすべてが優先的に二重層およびその関連するシリカ被覆に位置するという点でＳＴＥＭ－ＥＤＸの結果が確認された。同じ試料領域のプラズモンフィルタリングしたＥＦＴＥＭ画像を左上の位置に挿入する。
【図7】一実施形態による濾過装置の概略図である。
【図8】別の実施形態による濾過装置の概略図である。
【図9】さらなる実施形態による濾過装置の概略図である。
【図10】さらに別の実施形態による濾過装置の概略図である。
【図11】時間分解動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ケイ化方法中のリポソームおよびプロテオリポソームの凝集挙動を研究した。
【発明を実施するための形態】
【0025】
一般に、本明細書で使用されるすべての用語は、異なる意味が明確に与えられ、および／または使用される文脈から暗示されない限り、関連する技術分野における通常の意味に従って解釈されるべきである。元素、装置、成分、手段、段階などへのすべての言及は、別段に明記されない限り、元素、装置、成分、手段、段階などのうちの少なくとも１つの例を指すものとして公然と解釈されるべきである。本明細書に開示される任意の方法の段階は、段階が別の段階の後行または先行として明示的に記載されていない限り、および／または段階が別の段階に後行または先行しなければならないことが暗黙的である場合でない限り、開示された順序通りに実行する必要はない。本明細書に開示された実施形態のいずれの任意の特徴も、必要に応じて、任意の他の実施形態に適用され得る。同様に、任意の実施形態のいずれの利点も、任意の他の実施形態に適用することができ、その逆も可能である。添付の実施形態の他の目的、特徴および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【0026】
本発明は、一般に、高分子膜構造体、および当該高分子膜構造体を含む濾過装置、ならびに例えば水濾過におけるそれらの使用に関する。
【0027】
本発明は、膜貫通タンパク質（ＴＰ）などの膜内在性タンパク質（ＩＭＰ）を組み込んだ高分子膜構造体の安定性を、膜の表面をシリカ層で被覆することによって高めることができるという知見に基づいている。シリカによるこのような表面被覆はさらに、ＩＭＰまたはＴＰの機能性、および好ましくはＩＭＰおよびＴＰの天然の立体構造も維持しながら行うことができる。したがって、ケイ化は、生体模倣膜およびフィルタにおいて十分な安定性を達成する効率的な方法を構成し、例えば、濾過装置および水濾過における実際の用途で当該高分子膜構造体の現実の実施を可能にする。
【0028】
したがって、本発明は、水を通過させるＩＭＰまたはＴＰを含み、膜の第１の表面上にシリカ層で被覆された膜を含む高分子膜構造体に関する。
【0029】
図１は、水を通過させるＩＭＰ１を含む脂質二重層膜３の小胞２（水を通過させるＩＭＰ１を用いる当技術分野ではタンパク質含有リポソームまたはプロテオリポソーム２とも呼ばれる）の形態での当該高分子膜構造体の一例を概略的に示す。プロテオリポソーム２は、この例では、その外面にシリカ層またはシェル４を有する。
【0030】
高分子膜構造体２の膜３は、二重層膜３、すなわち２つの層を含む二重層膜３であることが好ましい。二重層膜３の層は、好ましくは両親媒性分子、すなわち、親水性部分と、親油性、つまり疎水性部分とを有する分子から構成される。
【0031】
特定の実施形態では、高分子膜構造体２の膜３は、脂質二重層膜３である。したがって、両親媒性分子は両親媒性脂質である。このような両親媒性脂質の非限定的であるが例示的な例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、スフィンゴミエリン、アソレクチン、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ リゾＰＣ）または１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ リゾＰＣ）などのリゾＰＣ、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ リゾＰＥ）または１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ リゾＰＥ）などのリゾＰＥ、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＥＰＡ）、１，２－エルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジエルコイ－ｓｎ－アリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＬＰＡ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬＰＳ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＭＰＡ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＭＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＯＰＡ）、１，２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＰＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＳＰＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオステアルピル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、およびそれらの混合物が含まれる。現在、両親媒性脂質の好ましい例は、ＰＯＰＣである。
【0032】
両親媒性脂質は、さらにまたは代替として、細胞膜および／または細胞小器官からの脂質などの天然源からも選択されてもよい。そのような細胞小器官の例としては、核、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体、ゴルジ体、リソソームが挙げられる。
【0033】
実のところ、高分子膜構造体の膜は、実際には、水を通過させるＩＭＰを含み、シリカ層で被覆された、酵母細胞または細菌細胞などの無傷の細胞膜であり得る。さらに、このような水を通過させるＩＭＰを含む細胞小器官をシリカ層で被覆して、本発明による高分子膜構造体を形成することができる。これらの場合、細胞または細胞小器官の膜は、典型的には、水を通過させるＩＭＰ以外の他の膜タンパク質を含む。
【0034】
膜３は、代替的または追加的に、架橋性脂質、すなわち両親媒性脂質分子の疎水性部分および／または親水性部分に架橋性化学構造を有する両親媒性脂質を含んでもよい。そのような架橋性脂質の例は、国際公開第２０１０／０９１０７８号に開示されており、とりわけ、１－パルミトイル－２－（１０Ｚ，１２Ｚ－トリコスジイノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－パルミトイル－２－（１０Ｚ，１２Ｚ－トリコスジイノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジ－（１０Ｚ，１２Ｚ－トリコスジイノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよび１－２－（１０Ｚ，１２Ｚ－トリコスジイノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンが挙げられる。架橋性脂質は、好ましくはＵＶ架橋性であり、すなわち架橋はＵＶ曝露によって誘導される。
【0035】
膜は、単一の種類もしくは種の両親媒性脂質、または複数の、すなわち少なくとも２つの異なる種類もしくは種の両親媒性脂質の混合物を含み得る。
【0036】
代替的または追加的に、膜３の両親媒性分子は、両親媒性ＡＢ、ＡＢＡおよび／またはＡＢＣブロックコポリマーなどの両親媒性コポリマーであり得る。このような両親媒性コポリマーの例示的であるが非限定的な例としては、ポリ（メチルオキサゾリン）－ポリ（ジメチルシロキサン）－ポリ（メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳ－ＰＭＯＸＡ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）－ｂ－ポリ（ジメチルシロキサン）－ｂ－ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥｔＯｚ－ＰＤＭＳ－ＰＥｔＯｚ）およびこれらの混合物が挙げられる。より一般的には、両親媒性コポリマーは、（ポリ）２－Ｃ１－３アルキル－２－オキサゾリンを含む少なくとも１つの親水性ブロックおよびＰＤＭＳを含む少なくとも１つの疎水性ブロック、例えば（（ポリ）２－Ｃ１－３アルキル－２－オキサゾリン）ａ－ＰＤＭＳｂ－（（ポリ）２－Ｃ１－３アルキル－２－オキサゾリン）ａを含んでよく、式中、各ａは、独立して、５～１００の数であり、ｂは５～１４０の数である。両親媒性コポリマーを有する膜３の場合、高分子膜構造体２はプロテオポリマーソームである。
【0037】
高分子膜構造体２は、好ましくは、図１に示されるような小胞、プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソーム２の形態である。そのような場合、膜３は、プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソーム２であり、プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソーム２の外面はシリカ層４で被覆される。
【0038】
別の実施形態では、高分子膜構造体２は、実質的に平坦または平面構造として膜３を有する実質的に平坦または２Ｄ膜構造である。次いで、シリカ層４は、平坦または平面的な膜３の表面の片方に適用される。
【0039】
一実施形態では、高分子膜構造体２の膜３に組み込まれた水チャネルＩＭＰ１はアクアポリン１である。
【0040】
水チャネルとも呼ばれるアクアポリンは、生体細胞の膜に細孔を形成し、主に細胞間の水の輸送を促進する主要な内因性タンパク質のより大きなファミリーに由来するＩＭＰである。様々な異なる細菌、真菌、動物および植物細胞の細胞膜は、アクアポリンを含有し、水は、アクアポリンを通って、リン脂質二重層を通って拡散するよりも、より迅速に細胞内外に流れることができる。アクアポリンは、細胞質側にカルボン酸末端およびアミノ末端の両方を有する６つの膜貫通アルファらせんドメインを有する。２つの疎水性ループは、保存されたアスパラギン－プロリン－アラニンＮＰＡモチーフを含有する。
【0041】
一実施形態では、アクアポリンは、ヒトアクアポリン（ｈＡＱＰ）、ウシアクアポリン（ｂＡＱＰ）、魚アクアポリン、酵母アクアポリン、植物アクアポリンおよび細菌アクアポリン、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
【0042】
１３個のヒトアクアポリンが存在し、これらは３つのサブグループに分けられる。水のみを輸送する水選択性（オルソドックス）アクアポリン（ｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＰＱ４、ｈＡＰＱ５、ｈＡＱＰ６、ｈＡＱＰ８）、水に加えて、グリセロールなどの小さな非荷電溶質を輸送するアクアグリセロポリン（ｈＡＱＰ３、ｈＡＱＰ７、ｈＡＱＰ９、ｈＡＱＰ１０）、および輸送特性がさらに解明されるべきであるスーパーアクアポリン（ｈＡＱＰ１１、ｈＡＱＰ１２）。一実施形態では、ｈＡＱＰは、ｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ３、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、ｈＡＱＰ７、ｈＡＱＰ８、ｈＡＱＰ９、ｈＡＱＰ１０、ｈＡＱＰ１１およびｈＡＱＰ１２からなる群から選択され、好ましくはｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６およびｈＡＱＰ８、すなわち、水選択性ヒトアクアポリンからなる群から選択され、より好ましくはｈＡＰＱ４である。
【0043】
ウシアクアポリンはｂＡＱＰ１が好ましく、魚アクアポリンはｃｐＡＱＰ１ａａが好ましい。酵母アクアポリンの好ましい例はＡｑｙ１であり、適切な細菌アクアポリンはＡｑｐＺである。使用可能な植物アクアポリンの実例としては、ＳｏＰＩＰ２；１、ＡｔＴＩＰ２；１およびＡｔＰＩＰ２；４が挙げられる。
【0044】
一実施形態では、膜３は、単一の種類または種のアクアポリン１を含む。別の実施形態では、膜３は、複数の種類または種のアクアポリン１を含む。
【0045】
一実施形態では、シリカ層４は、０．１～１０００ｎｍ、好ましくは１～１００ｎｍ、より好ましくは１～１０ｎｍの範囲内で選択された平均厚みを有する。特定の実施形態では、シリカ層は、２～６ｎｍ、好ましくは３～５ｎｍ、より好ましくは３～４ｎｍの範囲内の平均厚みを有する。
【0046】
本明細書で前述したように、水を通過させるＩＭＰ１を含む膜３は、水を通過させるＩＭＰ１の水の通過機能を維持しながら、本明細書に開示されるシリカ層４で被覆することができる。したがって、水チャネルＩＭＰ１は、シリカ層４の存在下で水を膜３に通して輸送することができるという点で、高分子膜構造体２において依然として機能的である。したがって、特定の実施形態では、シリカ層４は、水を通過させるＩＭＰ１の水の通過または輸送機能を防止または遮断しない。
【0047】
一実施形態では、シリカ層４は官能性シリカ層４である。したがって、シリカ層４は、高分子膜構造体２に対して所望の機能を発揮することができる官能性分子を含む。そのような機能の一例は、連結機能（結合機能）である。したがって、シリカ層４の官能性分子を使用して、高分子膜構造体２を支持体に固定、付着または連結、例えば共有結合することができる。
【0048】
特定の実施形態では、官能性シリカ層４は、フルオロアルキルシラン（ＦＡＳ）などのシラン、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＺ）などのアルコキシシラン、またはそれらの組合せを含む。次いで、これらの官能性分子を使用して、シラン化学を使用して高分子膜構造体２を支持体に共有結合させることができる。例えば、ＦＡＳを使用して、シリカ層とアルミナ支持体、またはアルミナ被覆を有する支持体との間に共有結合を形成することができる。
【0049】
高分子膜構造体２は、水を通過させるＩＭＰ１を含む膜３をシリカ前駆体と接触させて、膜３の第１の表面上に被覆されたシリカ層４を形成することを含む方法で調製することができる。
【0050】
一実施形態において、シリカ前駆体は、シリコンアルコキシド、シラン、シリケート、シラノール、シラザン、Ｎ－ｓｅｃ－ブチル（トリメチルシリル）アミンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0051】
一実施形態において、シリコンアルコキシドは、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリケート、テトラブチルオルトシリケート、メチルトリエトキシシロキサン（ＭＴＥＳ）、ジメチルジエトキシシロキサン（ＤＭＤＥＳ）、テトラキス（グリセロール）オルトシリケート（ＴＧＳ）、テトラキス－（２－ヒドロキシエチル）－オルトシリケート（ＴＨＥＯＳ）およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0052】
一実施形態において、シランは、アリルトリメトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、ブチルトリクロロシラン、クロロペンタメチルジシラン、１，２－ジクロロテトラメチルジシラン、ジエトキシジフェニルシラン、［３－（ジエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシ（メチル）オクチルシラン、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン、ヘキサメチルジシラン、イソブチル（トリメトキシ）シラン、メチルトリクロロシラン、ペンタメチルジシラン、ｎ－プロピルトリエトキシシラン、テトラエチルシラン、１，１，２，２－テトラメチルジシラン、テトラメチルシラン、トリエトキシメチルシラン、トリエトキシオクチルシラン、トリメトキシフェニルシラン、トリエトキシフェニルシラン、トリエトキシビニルシラン、トリメトキシメチルシラン、γ－アミノプロピルトリエトキシシラン、四塩化ケイ素（テトラクロロシラン）、四臭化ケイ素（テトラブロミドシラン）、γ－アミノプロピルシラントリオール（ＡＰＳＴＯＬ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0053】
一実施形態では、シリケートはケイ酸ナトリウム（水ガラス）である。
【0054】
一実施形態では、シラノールは、トリス（ｔｅｒｔ－ペントキシ）シラノール、トリス（ｔｅｒｔ－ブトキシ）シラノール、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0055】
一実施形態では、シリカ前駆体はＴＥＯＳである。
【0056】
一実施形態では、膜３は、緩衝剤を含む緩衝液中でシリカ前駆体と接触する。緩衝液で使用することができる緩衝剤の非限定的であるが例示的な例としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス：Ｔｒｉｓ）、ホスファート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）が挙げられる。適切な緩衝剤の一例は、トリスである。次いで、緩衝液はトリス－ＨＣｌ水溶液であり得る。
【0057】
一実施形態では、緩衝液は、緩衝液のイオン強度を調整または設定するための塩を含む。使用され得る塩の非限定的だが例示的な例としては、塩化物塩、硫酸塩、炭酸塩およびそれらの混合物が挙げられる。実施形態に従って使用することができる塩化物塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２が挙げられる。ＭｇＳＯ４およびＣａＳＯ４は硫酸塩の好適な例である一方、Ｎａ２ＣＯ３は炭酸塩の好ましい例である。
【0058】
緩衝液のｐＨは、１つまたは複数の緩衝剤に基づいて少なくとも部分的に決定される。緩衝液のｐＨは、酸性ｐＨ、すなわち７未満、中性ｐＨ、すなわち約７、または塩基性ｐＨ、すなわち７超であり得る。緩衝液のｐＨは、形成されるシリカ層４の特性に影響を及ぼす。例えば、ｐＨ２などの酸性ｐＨは、中性または塩基性緩衝液と比較して、より高密度のシリカ層４を生成する。これに対応して、わずかに塩基性の条件（ｐＨ８）でのシリカ層の形成は、膜３の周りのケイ酸の初期配置、続いて高密度化によって進行した。
【0059】
水に対する選択性を有する膜３中の水を通過させるＩＭＰ１により、ケイ化方法で使用される特定の試薬が水を通過させるＩＭＰ１を含む膜に入ることまたは通過することは、効果的に排除された。排除されない場合、試薬は膜３および高分子膜構造体２に悪影響を及ぼし、膜３を通過する濾液に混入する可能性があるため、これは本発明の重要かつ非常に予想外の利点であった。
【0060】
上述の方法に従って調製されるものなどの、実施形態の高分子膜構造体２は、膜３とシリカ層４との間に水の薄層を含んでもよい。そのような水層は、調製方法中に封入されてもよく、典型的にはｎｍまたはｎｍ未満の範囲の厚みを有する。
【0061】
アクアポリン１を含有するシリカ被覆プロテオリポソーム２の生産方法の一実施形態では、最初に、ホスファチジルコリン脂質、例えば１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を緩衝水溶液に均一に分散させ、この緩衝液は、例えば、ｐＨを設定するためのトリスまたはＰＢＳのいずれかと、イオン強度を設定するためのＮａＣｌなどの塩とを含有し得る。脂質は、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）などの水よりも極性の低い溶媒に溶解していても溶解していなくてもよく、続いて緩衝水溶液に分散させる前にＣＨＣｌ３が除去されていてもよい。ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（β－ＯＧ）またはｎ－ノニル－β－Ｄ－グルコシド（β－ＮＧ）などの穏やかな界面活性剤を添加して、リポソームを可溶化することができる。β－ＯＧまたはβ－ＮＧなどの穏やかな界面活性剤で安定化された精製アクアポリンをリポソーム混合物に添加する。次いで、例えばポリスチレンビーズ吸着に続く除去、または例えば１０００Ｄａまたは２０００Ｄａの分子カットオフを有する酢酸セルロース透析膜を使用する透析を使用して、混合物から界面活性剤を除去することが好ましい。この手順は、アクアポリン１を含有する多重層および多分散の小胞２をもたらす。
【0062】
一実施形態では、小胞２は、多重層性および多分散性の程度を低下させるために、ケイ化の前にさらに処理されてもよい。例えば、アクアポリン１を含有する小胞２は、例えば、３０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の直径を有するポリカーボネート押出膜またはナイロン遠心フィルタの細孔を通して押し出されて、多重層性および多分散性の程度を低下させることができる。
【0063】
次いで、０．１ｎｍ～１０００ｎｍの厚み範囲のシリカの層４を、アクアポリン１を含有する小胞上に形成することができる。例示的なシリカ被覆手順では、ＴＥＯＳなどのシリコンアルコキシド、またはカチオン交換ケイ酸ナトリウム（水ガラス）を、アクアポリン１を含有する小胞２に添加する。シリコンアルコキシドは、アクアポリン１を含有する小胞２に添加する前に、小胞２を含まない溶液中で予め加水分解するか、またはアクアポリン１を含有する小胞２に直接添加することができる。シリコンアルコキシドの加水分解は、オルトケイ酸ならびにシリコンアルコキシドのＱ１、Ｑ２およびＱ３種の形成をもたらし、ここで、０、１、２および３個のアルコキシド基は、シリコンアルコキシドの不完全な加水分解によりシリコンに共有結合している。アクアポリン１を含む小胞２の存在下でこれらの種が縮合すると、アクアポリン１を含む小胞２の外側にシリカの層４が形成される。アクアポリン１を含有するシリカ被覆小胞２は、縮合中に凝集することがあり、これにより、凝集体上に０．１ｎｍ～３００ｎｍの厚み範囲の第２のシリカ被覆が形成し得る。
【0064】
一実施形態では、シリカ層４の形成に続いて、アクアポリン１を含む小胞２の表面修飾を行ってもよい。例示的な手順では、官能基、例えばシランが、アクアポリン１を含有する小胞２のシリカ層４に導入される。例示的な手順では、アクアポリン１を含有する被覆小胞２を、１％（体積／体積）ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＺ）を含むヘキサンに配置する。シリカ表面上の利用可能なシラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）は、メチル化基で部分的に置換されている。使用され得るシランの他の例としては、フルオロアルキルシラン（ＦＡＳ）およびアルコキシシランが挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
【0066】
一実施形態において、高分子膜構造体２は、多孔性支持体６の表面に設けられる。例示的な実施形態では、水を通過させるＩＭＰを含有する小胞２は、例えば０．５～５０ｎｍの範囲の孔幅を有する表面に接触可能な細孔７を有する多孔性支持体６に導入される。小胞２は、多孔性支持体６上に吸着され、単細孔を貫通するアクアポリンを含有する担持脂質二重層または複数のアクアポリンを含有する互いに積み重ねられた担持脂質二重層へと崩壊する。
【0067】
代替的または追加的に、高分子膜構造体２は、多孔性支持体６の細孔７中に設けられる。多孔性支持体６の材料に応じて、細孔７は、規則的であっても不規則であってもよく、５０ｎｍ～５０００ｎｍなどの特定の直径を有する明確に画定された細孔７を有するか、またはネットワーク構造によって曖昧に画定されてもよい。孔幅は、多孔性支持体６の厚み全体にわたって同じであってもよく、または多孔性支持体６の一端において他端と比較して幅広くてもよい。孔幅はまた、厚みの位置とは無関係に多孔性支持体６全体にわたって変化してもよい。水を通過させるＩＭＰ１を含有する小胞２は、小胞２の溶液中に多孔性支持体６を配置することによって細孔７に導入することができる。例えば、圧力または吸引を加えることによって導入された外力は、導入を成功させるために使用されても使用されなくてもよい。一例では、多孔性支持体６は、チューブを介してシリンジポンプに接続されたフィルタホルダ内に配置される。
【0068】
多孔性支持体６は、高分子膜構造体２と共に、本明細書にさらに開示されるように、様々な液体を濾過するために使用することができる濾過装置５またはフィルタを形成する。膜３をシリカ層４で被覆することにより、高分子膜構造体２および水を通過させるＩＭＰ１の安定性が向上し、それらをそのような濾過操作に使用することが可能になり、依然として十分な操作寿命または貯蔵寿命を有する。そうでなければ、これは、従来技術の生体模倣濾過装置の重大な問題である。
【0069】
多孔性支持体６は、半透性である任意の支持体であり、すなわち、濾液が多孔性支持体６およびその中またはその上に存在する高分子膜構造体２を通過することを可能にする。多孔性構造体６は、高分子膜構造体２を支持するが、特定の圧力または化学的環境に耐えることができるなど、実行される操作または方法にも耐久性であるべきである。多孔性支持体は、実行される操作または方法に適合するために、平膜、円形膜などを含む任意の形状をとることができる。
【0070】
多孔性支持体６は、一実施形態では、ポリマー、金属、金属の酸化物、二酸化ケイ素、ガラス繊維、またはそれらの混合物から製造することができる。多孔性支持体６用のポリマー材料の非限定的だが例示的な例としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリエーテルエーテルスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンエーテル、ポリジフェニルフェニレンエーテル、セルロース、ポリビニレンセルロースアセタート、セルロースジアセタート、セルローストリアセタート、セルロースニトラート、ポリフェニレンスルフィド、ニトロセルロース、アセチル化メチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、有機シロキサンカーボネート、ポリエステルカーボネート、有機ポリシロキサン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリベンゾイミダゾール、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ナイロンおよびそれらの混合物が挙げられる。多孔性支持体６用の金属（酸化物）材料の非限定的だが例示的な例には、アルミニウム、酸化アルミニウム（アルミナ）、チタン、二酸化チタン、ジルコニウム、二酸化ジルコニウム（ジルコニア）、鉄、酸化鉄、およびそれらの混合物が含まれる。
【0071】
高分子膜構造体２は、図８に示すように単層の形態で多孔性支持体６上および／または多孔性支持体６の細孔７内に設けられてもよく、または典型的には複数層の高分子膜構造体２を含む図７に示すような高分子膜構造体２のより厚い層を含む。
【0072】
図１０は、濾過装置５の実施形態を示し、水を通過させるＩＭＰ１を含む膜３は、多孔性支持体６上に沈着された平面構造の形態であり、細孔７を含む。多孔性支持体６に面する膜３の面と反対側の膜３の面は、シリカ層４で被覆されている。
【0073】
高分子膜構造体２のシリカ層４が本明細書で前述したように官能基を有する場合、官能性シリカ層の官能基は、高分子膜構造体２を多孔性支持体６に共有結合などで連結してもよい。例えば、官能基は、高分子膜構造体２を多孔性支持体６の細孔７の壁および／または多孔性支持体６の上面に固定、付着および固着することができる。
【0074】
一実施形態では、濾過装置５の多孔性支持体６上および／または多孔性支持体６内に高分子膜構造体２を沈着させる前に、高分子膜構造体２をシリカ層４で被覆する。別の実施形態では、例えばプロテオリポソーム２の形態の水を通過させるＩＭＰ２を含む膜３を、最初に多孔性支持体６上および／または多孔性支持体６中に沈着させ、次いでケイ化方法を実施してプロテオリポソーム２を被覆する。
【0075】
この後者の実施形態では、濾過装置５を調製するための方法は、多孔性支持体６上および／または多孔性支持体６内に水を通過させるＩＭＰ１を含む膜３、例えばプロテオリポソーム２を沈着させることと、多孔性支持体６上および／または多孔性支持体６内に沈着した水を通過させるＩＭＰ１を含む膜３をシリカ前駆体と接触させて、膜３の第１の表面上に被覆されたシリカ層４を形成することとを含む。
【0076】
一実施形態では、プロテオリポソーム２の形態などの膜３は、ケイ化方法の前に多孔性支持体６に固定または付着され得る。そのような実施形態では、プロテオリポソーム２は、多孔性支持体６の上面および／または多孔性支持体６の細孔７内の壁に接続および固着することができる。付着および固定は、米国第９，９４３，８１２号に開示されているようなリンカーによって達成することができる。そのようなリンカーは、第一級アミン架橋剤、スルフヒドリル架橋剤、炭水化物架橋剤、カルボキシル架橋剤および光反応性架橋剤からなる群から選択することができる。第一級アミン架橋剤は、イミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはグルタルアルデヒドであり、スルフヒドリル架橋剤は、マレイミド、ハロアセチル、またはピリジルジスルフィドであり得る。炭水化物反応性架橋剤は、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミドハイドロクロライドまたは１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、光反応性架橋剤は、アリールアジドまたはジアジリンであり得る。
【0077】
実施形態の高分子膜構造体２および濾過装置５を、浄水に用いて、水濾液を調製することができる。このような用途では、高分子膜構造体２または濾過装置５を介して水溶液を濾過し、水濾液を得る。
【0078】
水溶液は、例えば、混入または汚染された水、塩水、または実際には、純水濾液を生成するために水から塩イオンなどの混入または汚染を除去することによって濾過または精製されるべき任意の水溶液であり得る。
【0079】
実施形態の高分子膜構造体２および濾過装置５は、水溶液に溶解または分散した化合物を濃縮する方法にも用いることができる。この方法は、高分子膜構造体２または濾過装置５を通して水溶液を濾過して、化合物を含まない水濾液、および水溶液よりも高い濃度で化合物を含む当技術分野で残留供給物とも呼ばれる保持液を得ることを含む。
【0080】
したがって、高分子膜構造体２または濾過装置５を通して水溶液を濾過することによって、水濾液が得られ、保持液に溶解または分散している化合物に関して保持液が濃縮される。
【0081】
したがって、水を通過させるＩＭＰ１を含む高分子膜構造体２が沈着し、任意で、多孔性支持体６上および／または多孔性支持体６内に固定されると、得られる濾過装置５は、純水濾液を提供するための水濾過の方法に有用であり得る。これは、正浸透、逆浸透または圧力遅延浸透などの方法を使用して行うことができる。標的分子を含有する溶液から過剰な水を除去することによって標的分子の溶液を濃縮するためにも、同じ構成が使用され得る。
【0082】
アクアポリン１を含む水を通過させるＩＭＰ１を含有する膜３または小胞２は、再構成と呼ばれる方法によって、水を通過させるＩＭＰ１を膜３または小胞２に組み込むことによって形成され得、これは一般に、特定の界面活性剤を使用することによって、水を通過させるＩＭＰ１を可溶化することを含み、これは、水を通過させるＩＭＰ１の完全性および生物学的機能を維持しながら、それらの供給源膜からの水を通過させるＩＭＰ１の除去を補助する。一旦可溶化されると、水を通過させるＩＭＰ１は、目的の標的膜３または小胞２に再挿入され得る。
【0083】
水を通過させるＩＭＰ１を含む膜３または小胞２は、供給源膜を膜３および小胞２に変換し、したがってそれらの自然環境を可能な限り保持することによっても形成され得る。そのような変換は、所定の孔径を有する多孔性フィルタを通して供給源膜を押し出し、したがって、供給源膜を特定サイズの小断片および小胞２に縮小することによって実施される。
【実施例0084】
実施例
本例は、プロテオリポソームをシリカの薄層で被覆する方法を開示する。より具体的には、受動的水輸送体のヒトアクアポリン４（ｈＡＱＰ４）をホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）リポソーム中で再構成し、次いでこれをシリカの薄層で被覆した。プロテオリポソームのケイ化方法を詳細に監視して、シリカシェル成長の機構を解明した。ｈＡＱＰ４の二次構造も、ケイ化方法全体を通して監視して、このタイプのケイ化におけるタンパク質適合性の評価を提供した。
本例は、プロテオリポソームをシリカの薄層で被覆する方法を開示する。より具体的には、受動的水輸送体のヒトアクアポリン４（ｈＡＱＰ４）をホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）リポソーム中で再構成し、次いでこれをシリカの薄層で被覆した。プロテオリポソームのケイ化方法を詳細に監視して、シリカシェル成長の機構を解明した。ｈＡＱＰ４の二次構造も、ケイ化方法全体を通して監視して、このタイプのケイ化におけるタンパク質適合性の評価を提供した。
【0085】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるｈＡＱＰ４産生およびタンパク質精製
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質産生を、遺伝子最適化されたｈＡＱＰ４の産生に基づくプロトコル［Ｎｙｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００７，５６（１）：１１０－１２０］に従って行い、培養物１Ｌあたり３００ｇ超の湿細胞の収量を得た。細胞を遠心分離（６０００ｇ、４５分、４℃）によって回収し、－２０℃で保存した。膜調製のために、８５ｇの細胞を４℃で解凍し、２００ｍＬの破壊緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｆｌｕｋａ ＡＧ）、および２つのＥＤＴＡ非含有ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））に再懸濁した。Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏ Ｓｐｅｃ）を使用して、０．５ｍｍガラスビーズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で細胞を破壊し、１２×３０秒間粉砕し、運転間に６０秒間冷却した。未破壊細胞を遠心分離（６０００ｇ、１０分、４℃）によって回収し、その後、超遠心分離（１９０００ｇ、６０分、４℃）によって上清から粗膜を回収した。得られた膜をホモジナイザーを用いて尿素緩衝液（４Ｍ尿素、５ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ）で洗浄し、再度遠心分離した（１９０００ｇ、６０分、４℃）。得られたペレットをホモジナイズし、水酸化ナトリウム洗浄を行い（２０ｍＭ ＮａＯＨ）、その後の遠心分離段階を行った（１９０００ｇ、６０分、４℃）。膜再懸濁緩衝液（２０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１０％（重量／体積）グリセロール）中で膜をホモジナイズすることによって微量のＮａＯＨを除去するために最終洗浄を行った。最終遠心分離（１９０００ｇ、６０分、４℃）後、洗浄した膜ペレットを約４００ｍｇ膜／ｍｌの濃度で再懸濁緩衝液に再懸濁した。
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質産生を、遺伝子最適化されたｈＡＱＰ４の産生に基づくプロトコル［Ｎｙｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００７，５６（１）：１１０－１２０］に従って行い、培養物１Ｌあたり３００ｇ超の湿細胞の収量を得た。細胞を遠心分離（６０００ｇ、４５分、４℃）によって回収し、－２０℃で保存した。膜調製のために、８５ｇの細胞を４℃で解凍し、２００ｍＬの破壊緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｆｌｕｋａ ＡＧ）、および２つのＥＤＴＡ非含有ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））に再懸濁した。Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏ Ｓｐｅｃ）を使用して、０．５ｍｍガラスビーズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で細胞を破壊し、１２×３０秒間粉砕し、運転間に６０秒間冷却した。未破壊細胞を遠心分離（６０００ｇ、１０分、４℃）によって回収し、その後、超遠心分離（１９０００ｇ、６０分、４℃）によって上清から粗膜を回収した。得られた膜をホモジナイザーを用いて尿素緩衝液（４Ｍ尿素、５ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ）で洗浄し、再度遠心分離した（１９０００ｇ、６０分、４℃）。得られたペレットをホモジナイズし、水酸化ナトリウム洗浄を行い（２０ｍＭ ＮａＯＨ）、その後の遠心分離段階を行った（１９０００ｇ、６０分、４℃）。膜再懸濁緩衝液（２０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１０％（重量／体積）グリセロール）中で膜をホモジナイズすることによって微量のＮａＯＨを除去するために最終洗浄を行った。最終遠心分離（１９０００ｇ、６０分、４℃）後、洗浄した膜ペレットを約４００ｍｇ膜／ｍｌの濃度で再懸濁緩衝液に再懸濁した。
【0086】
ｈＡＱＰ４の膜可溶化は、１：１の体積比でＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を補充した可溶化緩衝液（２５ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１０％（重量／体積）グリセロール、４００ｍＭ ｎ－オクチル－β－グルコピラノシド（ＯＧ、分析グレード、Ａｎａｔｒａｃｅ））と膜を混合することによって行った。４℃で９０分間穏やかに撹拌した後、不溶化物質を超遠心分離（１９０００ｇ、６０分、４℃）によって除去し、イミダゾールの最終濃度が５０ｍＭに相当するようにイミダゾールを上清に添加した。
【0087】
ｈＡＱＰ４の精製のために、上清を予め平衡化した５ｍｌのＮｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、少なくとも２時間循環した。上清を充填する前に、カラムの平衡化を３ＣＶ（２０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、４０ｍＭ ＯＧ、５０ｍＭイミダゾール）行った。カラムマトリックスを２０ｍｌの平衡緩衝液で洗浄することによって、非特異的に結合したタンパク質を除去した。タンパク質を２０ｍｌの溶出緩衝液（２０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、４０ｍＭ ＯＧ、３００ｍＭイミダゾール）で溶出し、画分に回収した。タンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析し、タンパク質含有画分をまとめて貯留した。後続の保存緩衝液（２５ｍＭシトラート ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％（重量／体積）グリセロール、４０ｍＭ ＯＧ、２ｍＭ ＤＴＴ）への緩衝液交換はその後即時に行った。最後に、ｈＡＱＰ４を、５０ｋＤａカットオフ濃縮器（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して９．７ｍｇ／ｍｌの最終濃度に濃縮し、－８０℃で保存した。
【0088】
プロテオリポソームの調製
プロテオリポソームをＰＯＰＣリポソームから形成し、再構成方法でｈＡＱＰ４を精製した。ＰＯＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を含むクロロホルム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０℃で３時間回転蒸発させ、引き続いて窒素下で残留クロロホルムを除去した。脂質フィルムを１０ｍｇｍｌ－１の濃度で再構成緩衝液（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＳＡＮＳ実験（ｐＨ８．４）用にＤ２Ｏ（９９．８原子％Ｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で、残りの実験用にＭｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した。最終脂質濃度４ｍｇｍｌ－１のプロテオリポソーム１ｍｌについては、１０ｍｇｍｌ－１ ＰＯＰＣを含む再構成緩衝液４００μｌを、３０μｌの１Ｍ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０μｌの１Ｍ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および４３０μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水と混合した。次いで、９９μｌの１０％（重量／体積）ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシドを混合して添加し、続いて５分間インキュベーションした。次いで、９．７ｍｇｍｌ－１の精製ｈＡＱＰ４を、ＣＤ測定用には質量で１つのｈＡＱＰ４対６つのＰＯＰＣ脂質（１：６）の最終タンパク質対脂質比（ＰＬＲ）をもたらす量で、残りの実験用には１：５０をもたらす量で加えた。溶液を穏やかに混合し、２０℃で１０分間インキュベーションした。Ｂｉｏｂｅａｄｓ ＳＭ２吸着剤（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を再構成緩衝液で平衡化し、次いで試料体積の３０％（重量／体積）の湿潤画分で添加し、引き続いて暗所の回転テーブル上で２０℃で６～１０時間インキュベーションした。Ｂｉｏｂｅａｄｓを試料から除去することにより、使用前に試料を０．２μｍスピンカラムフィルタ（ＷＶＲ）を通して１１０００ｒｐｍで遠心分離した。
プロテオリポソームをＰＯＰＣリポソームから形成し、再構成方法でｈＡＱＰ４を精製した。ＰＯＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）を含むクロロホルム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０℃で３時間回転蒸発させ、引き続いて窒素下で残留クロロホルムを除去した。脂質フィルムを１０ｍｇｍｌ－１の濃度で再構成緩衝液（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＳＡＮＳ実験（ｐＨ８．４）用にＤ２Ｏ（９９．８原子％Ｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で、残りの実験用にＭｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した。最終脂質濃度４ｍｇｍｌ－１のプロテオリポソーム１ｍｌについては、１０ｍｇｍｌ－１ ＰＯＰＣを含む再構成緩衝液４００μｌを、３０μｌの１Ｍ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０μｌの１Ｍ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および４３０μｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水と混合した。次いで、９９μｌの１０％（重量／体積）ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシドを混合して添加し、続いて５分間インキュベーションした。次いで、９．７ｍｇｍｌ－１の精製ｈＡＱＰ４を、ＣＤ測定用には質量で１つのｈＡＱＰ４対６つのＰＯＰＣ脂質（１：６）の最終タンパク質対脂質比（ＰＬＲ）をもたらす量で、残りの実験用には１：５０をもたらす量で加えた。溶液を穏やかに混合し、２０℃で１０分間インキュベーションした。Ｂｉｏｂｅａｄｓ ＳＭ２吸着剤（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を再構成緩衝液で平衡化し、次いで試料体積の３０％（重量／体積）の湿潤画分で添加し、引き続いて暗所の回転テーブル上で２０℃で６～１０時間インキュベーションした。Ｂｉｏｂｅａｄｓを試料から除去することにより、使用前に試料を０．２μｍスピンカラムフィルタ（ＷＶＲ）を通して１１０００ｒｐｍで遠心分離した。
【0089】
ＤＬＳによるプロテオリポソームの特性評価
ＤＬＳ分析は、使い捨てＵＶｅｔｔｅ（登録商標）キュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）機器において、１７３°の固定検出角度で、０．０５ｍｇｍｌ－１脂質を含む１５０μｌのリポソームおよびプロテオリポソーム試料で行った。温度は２０℃であり、提示データは、連続して実施された３回の反復からの平均である。
ＤＬＳ分析は、使い捨てＵＶｅｔｔｅ（登録商標）キュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）機器において、１７３°の固定検出角度で、０．０５ｍｇｍｌ－１脂質を含む１５０μｌのリポソームおよびプロテオリポソーム試料で行った。温度は２０℃であり、提示データは、連続して実施された３回の反復からの平均である。
【0090】
プロテオリポソームのケイ化
時間分解（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ＤＬＳおよびストップトフロー（ｓｔｏｐｐｅｄ－ｆｌｏｗ）光散乱を除くすべての実験について、４ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液８００μｌに添加した７．６μｌのテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して、ケイ化リポソームおよびプロテオリポソームを形成し、３．８μｌのＴＥＯＳを、２ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液８００μｌに添加した。ケイ化は、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ＳＡＮＳケイ化動態実験を除くすべての場合において、２５℃で４時間～１６時間撹拌せずにガラスバイアルで行った。
時間分解（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ＤＬＳおよびストップトフロー（ｓｔｏｐｐｅｄ－ｆｌｏｗ）光散乱を除くすべての実験について、４ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液８００μｌに添加した７．６μｌのテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して、ケイ化リポソームおよびプロテオリポソームを形成し、３．８μｌのＴＥＯＳを、２ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液８００μｌに添加した。ケイ化は、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ＳＡＮＳケイ化動態実験を除くすべての場合において、２５℃で４時間～１６時間撹拌せずにガラスバイアルで行った。
【0091】
ＴＥＭ、ＳＴＥＭ、ＳＡＮＳ、ＤＬＳ、ストップトフロー光散乱およびＣＤによる特性評価
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析のために、４ｍｇｍｌ－１ケイ化リポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液の２μｌ液滴をＬａｃｅｙ炭素３００メッシュ銅グリッズ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）上に置き、周囲空気中で乾燥させた。ＴＥＭ分析は、３００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｉｔａｎ８０－３００および２００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ ＴＦ２０を使用して行った。走査型ＴＥＭ（ＳＴＥＭ）用の試料をＴＥＭ用と同じ方法で調製し、ＳＴＥＭ分析を、３００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｉｔａｎ８０－３００を使用して行った。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析のために、４ｍｇｍｌ－１ケイ化リポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液の２μｌ液滴をＬａｃｅｙ炭素３００メッシュ銅グリッズ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）上に置き、周囲空気中で乾燥させた。ＴＥＭ分析は、３００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｉｔａｎ８０－３００および２００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ ＴＦ２０を使用して行った。走査型ＴＥＭ（ＳＴＥＭ）用の試料をＴＥＭ用と同じ方法で調製し、ＳＴＥＭ分析を、３００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｉｔａｎ８０－３００を使用して行った。
【0092】
中性子小角散乱（ＳＡＮＳ）実験を、ＩＬＬ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｌａｕｅ－Ｌａｎｇｅｖｉｎ、フランス、グルノーブル）のＤ１１機器およびＦＲＭＩＩ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎｅｕｔｒｏｎ ｓｏｕｒｃｅ Ｈｅｉｎｚ－Ｍａｉｅｒ Ｌｅｉｂｎｉｔｚ、ドイツ、ガルヒング）のＫＷＳ－１機器で行った。
【0093】
ＦＲＭＩＩでは、狭い石英セルを使用した。回転は加えなかった。４ｍｇｍｌ－１の非ケイ化試料およびケイ化試料をＭｉｌｌｉ－Ｑ水およびＤ２Ｏの両方で調製した。これらの試料は、ＳＬＤが３．４７のシリカおよびＳＬＤが２．０７のケイ素でコントラストが一致するように混合された。それらはそのまま研究され、ケイ化の前、間および後にプロテオリポソーム試料を分析する「動態」研究も行われた。λ＝７Åを使用した。検出器は、データセット間の良好な重複を伴って広いｑ範囲に及ぶように１．５ｍ、８ｍ、および２０ｍに配置された。ＱｔｉＫＷＳソフトウェアを使用してデータを削減およびモデル化した。
【0094】
ＩＬＬでは、２ｍｍの光路を有するＨｅｌｌｍａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ１２０－ＱＳ石英セルを使用した。それらは、ケイ化方法中の沈降を防止するために、試料を毎分５．５回回転させる電動ホルダに取り付けられた。４ｍｇｍｌ－１のプロテオリポソーム試料を含むＤ２Ｏを、３．４７のＳＬＤでシリカとコントラストが一致するように希釈した。事前にケイ化されたプロテオリポソーム、およびプロテオリポソームのケイ化方法を研究した。λ＝５Åを使用して、可能な限り高い強度を得た。検出器は、データセット間の良好な重複を伴って広いｑ範囲に及ぶように１．４ｍ、８ｍ、および３９ｍに配置された。両方のＳＡＮＳ実験について温度は２５℃であった。ＢｅｒＳＡＮＳソフトウェア［Ｋｅｉｄｅｒｌｉｎｇ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ－Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｒｏｃｅｓｓ２００２，７４：Ｓ１４５５－Ｓ１４５７］を使用してデータを削減した一方、ＱｔｉＫＷＳソフトウェアを使用してデータをモデル化した。
【0095】
使い捨てＵＶｅｔｔｅ（登録商標）キュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）機器において１７３°の固定検出角度で、２ｍｇｍｌ－１の脂質を含むリポソームおよびプロテオリポソーム試料１５０μｌに対して時間分解ＤＬＳケイ化分析を行った。最初のＤＬＳ記録に続いて、２ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液８００μｌに３．８μｌのＴＥＯＳを添加した。１５０μｌの試料を３０分ごとにＤＬＳによって分析し、その時点で試料をケイ化バイアルに戻した。温度は２０℃であり、提示データは、連続して実施された３回の反復からの平均である。
【0096】
２ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームのケイ化試料を含む再構成緩衝液（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を、高浸透圧溶液（３００ｍＭスクロースを含む再構成緩衝液）と迅速に混合することによって、時間分解ストップトフロー光散乱実験を行った。最初の記録に続いて、２ｍｇｍｌ－１のリポソームおよびプロテオリポソームを含む再構成緩衝液８００μｌに３．８μｌのＴＥＯＳを添加した。実験は、８０μＬの試料および８０μＬの高浸透圧緩衝液を必要とする各迅速混合で、ＳＦＭ２０００（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で１時間間隔で行った。散乱を９０°の固定角度で監視し、データを４３８ｎｍの波長で収集した。水輸送の速度定数を得るために、収集データを２指数関数に適合させ、これをｋ値として示した。
【0097】
円二色性（ＣＤ）スペクトルは、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラを備えたＣｈｉｒａｓｃａｎ（商標）円二色性分光計で得た。ランプ、モノクロメーターおよび試料チャンバーをＮ２（ｇ）で５分間パージした後、それぞれ１リッター／分、３リッター／分および１リッター／分の流速で分析した。１ｎｍの帯域幅および１０秒の時定数を使用して、１ｍｍの経路長の石英キュベットにおいて１９０ｎｍ～２５０ｎｍでスペクトルを記録した。２００ｎｍ未満のデータは、緩衝液吸光度が１９８ｎｍ未満で７００Ｖの閾値を超える高圧電圧（ＨＶ）を引き起こすために省略された。提示データは、２５℃で記録された３回のスキャンの平均である。データは、提示前に背景（純粋な緩衝液）差分に供された。１ｍｇｍｌ－１脂質濃度、ＬＰＲ６の質量で再構成緩衝液で測定を行った。シリカシェルの形成によって引き起こされる吸収の増加を説明するために、印加されたＨＴ電圧のシフトに対してＣＤデータを正規化した。
【0098】
ケイ化プロテオリポソームについてのＳＡＮＳモデルの導出
ケイ化プロテオリポソームのＳＴＥＭ分析は、プロテオリポソームが薄いシリカシェルで覆われているコア－シェル構造を示す。ＳＡＮＳデータ分析に使用される二重層およびシリカシェルの幾何学的モデルパラメータを図３Ａに示す。各プロテオリポソームは、半径Ｒｃｏｒｅの液体充填コアを包含する球形構造のアクアポリン含有脂質二重層からなる。プロテオリポソームのシェルを構成するタンパク質含有脂質二重層は、組成に基づいて放射状に３つの層、厚みｔｉの内側親水性脂質頭部領域層、タンパク質を含む厚みＤｃの疎水性脂質尾部層、および厚みｔｏの外側親水性頭部層に分割される。したがって、プロテオリポソームの全半径は、赤道での全半径Ｒｔｏｔによって定義され、Ｒｔｏｔは、コア半径Ｒｃｏｒｅと、脂質二重層の３つの層の厚み、ｔｉ、Ｄｃおよびｔｏの合計との合計である。このモデルは、脂質二重層の外側に位置する厚みｔｓｉｌｉｃａのシリカ層も含む。
ケイ化プロテオリポソームのＳＴＥＭ分析は、プロテオリポソームが薄いシリカシェルで覆われているコア－シェル構造を示す。ＳＡＮＳデータ分析に使用される二重層およびシリカシェルの幾何学的モデルパラメータを図３Ａに示す。各プロテオリポソームは、半径Ｒｃｏｒｅの液体充填コアを包含する球形構造のアクアポリン含有脂質二重層からなる。プロテオリポソームのシェルを構成するタンパク質含有脂質二重層は、組成に基づいて放射状に３つの層、厚みｔｉの内側親水性脂質頭部領域層、タンパク質を含む厚みＤｃの疎水性脂質尾部層、および厚みｔｏの外側親水性頭部層に分割される。したがって、プロテオリポソームの全半径は、赤道での全半径Ｒｔｏｔによって定義され、Ｒｔｏｔは、コア半径Ｒｃｏｒｅと、脂質二重層の３つの層の厚み、ｔｉ、Ｄｃおよびｔｏの合計との合計である。このモデルは、脂質二重層の外側に位置する厚みｔｓｉｌｉｃａのシリカ層も含む。
【0099】
したがって、総散乱強度Ｉ（ｑ）は、次のように書くことができる。
式中、φは体積分率である。
【数1】
式中、φは体積分率である。
【0100】
個々の同心球状層の散乱振幅は、下記により説明でき、
式中、ａ（ｑ、ｘ）＝３・（ｓｉｎ（ｑ・ｘ）－ｘ・ｑ・ｃｏｓ（ｑ・ｘ））／（ｑ・ｘ）３であり、小胞の内部体積Ｖｃｏｒｅは、
として定義され、
内側脂質頭部の体積Ｖｉは、
として定義され、
脂質尾部の体積Ｖｃは、
として定義され、
外側脂質頭部の体積Ｖｏは、
として定義され、
プロテオリポソームの総量Ｖｔｏｔは、
として定義され、
シリカシェルの体積Ｖｓｉｌｉｃａは、
として定義される。
【数2】
式中、ａ（ｑ、ｘ）＝３・（ｓｉｎ（ｑ・ｘ）－ｘ・ｑ・ｃｏｓ（ｑ・ｘ））／（ｑ・ｘ）３であり、小胞の内部体積Ｖｃｏｒｅは、
【数3】
として定義され、
内側脂質頭部の体積Ｖｉは、
【数4】
として定義され、
脂質尾部の体積Ｖｃは、
【数5】
として定義され、
外側脂質頭部の体積Ｖｏは、
【数6】
として定義され、
プロテオリポソームの総量Ｖｔｏｔは、
【数7】
として定義され、
シリカシェルの体積Ｖｓｉｌｉｃａは、
【数8】
として定義される。
【0101】
プロテオリポソームへのシリカ沈着の方法を説明するために、ｆｓｉｌｉｃａを導入して、シリカシェルに覆われたプロテオリポソームの画分を示した。パラメータｆｐｒｏｔｅｉｎを同様に使用して、試料中のタンパク質の体積分率を示した。シリカおよびタンパク質の両方は、内側脂質頭部層（ｆｓｉｌ，ｉ、ｆｐｒｏｔ，ｉ）、脂質尾部層（ｆｓｉｌ，ｃ、ｆｐｒｏｔ，ｃ）、および外側脂質頭部層（ｆｓｉｌ，ｏ、ｆｐｒｏｔ，ｏ）において、
ｆｘ，ｉ＋ｆｘ，ｃ＋ｆｘ，ｏ＝１
に制約される比率で、存在することができ、式中、下付き文字ｘは、ｓｉｌまたはｐｒｏｔを表す。各プロテオリポソーム中の脂質の数Ｐは、
として算出され、
式中、Ｖｔａｉｌは、２つの炭化水素鎖で構成される脂質尾部の体積である。内側脂質頭部、外側脂質頭部およびシリカ層の成分として、それぞれｆｗ，ｉ、ｆｗ，ｏおよびｆｗ，ｓｉｌｉｃａとして、水を含めた。ケイ化プロテオリポソームの「乾燥体積」は、
Ｖｔｏｔ＝Ｖｉ・（１－ｆｗ，ｉ）＋Ｖｃ＋Ｖｏ・（１－ｆｗ，ｏ）＋Ｖｓｉｌｉｃａ・（１－ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ）
によって与えられた。
ｆｘ，ｉ＋ｆｘ，ｃ＋ｆｘ，ｏ＝１
に制約される比率で、存在することができ、式中、下付き文字ｘは、ｓｉｌまたはｐｒｏｔを表す。各プロテオリポソーム中の脂質の数Ｐは、
【数9】
として算出され、
式中、Ｖｔａｉｌは、２つの炭化水素鎖で構成される脂質尾部の体積である。内側脂質頭部、外側脂質頭部およびシリカ層の成分として、それぞれｆｗ，ｉ、ｆｗ，ｏおよびｆｗ，ｓｉｌｉｃａとして、水を含めた。ケイ化プロテオリポソームの「乾燥体積」は、
Ｖｔｏｔ＝Ｖｉ・（１－ｆｗ，ｉ）＋Ｖｃ＋Ｖｏ・（１－ｆｗ，ｏ）＋Ｖｓｉｌｉｃａ・（１－ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ）
によって与えられた。
【0102】
異なる層のコントラストは、
Δｐｉ＝ｐｈｅａｄ・（１－ｆｐｒｏｔ，ｉ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｓｉｌ，ｉ・ｆｓｉｌｉｃａ－ｆｗ，ｉ）＋ｐｐｒｏｔ・ｆｐｒｏｔ，ｉ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ＋ｐｓｉｌｉｃａ・ｆｓｉｌ，ｉ・ｆｓｉｌｉｃａ＋ｐｓｏｌｖｅｎｔ・ｆｗ，ｉ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
Δｐｃ＝ｐｔａｉｌ・（１－ｆｐｒｏｔ，ｃ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｓｉｌ，ｃ・ｆｓｉｌｉｃａ）＋ｐｐｒｏｔ・ｆｐｒｏｔ，ｃ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ＋ｐｓｉｌｉｃａ・ｆｓｉｌ，ｃ・ｆｓｉｌｉｃａ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
Δｐｏ＝ｐｈｅａｄ・（１－ｆｐｒｏｔ，ｏ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｓｉｌ，ｏ・ｆｓｉｌｉｃａ－ｆｗ，ｏ）＋ｐｐｒｏｔ・ｆｐｒｏｔ，ｏ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ＋ｐｓｉｌｉｃａ・ｆｓｉｌ，ｏ・ｆｓｉｌｉｃａ＋ｐｓｏｌｖｅｎｔ・ｆｗ，ｏ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
Δｐｓｉｌｉｃａ＝ｐｓｉｌｉｃａ・（１－ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ）＋ｐｓｏｌｖｅｎｔ・ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
によって定義され、
式中、ｐｈｅａｄ、ｐｔａｉｌ、ｐｓｉｌｉｃａおよびｐｓｏｌｖｅｎｔは、それぞれ脂質頭部、脂質尾部、シリカおよびバルク溶媒の散乱長密度（ＳＬＤ）である。
Δｐｉ＝ｐｈｅａｄ・（１－ｆｐｒｏｔ，ｉ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｓｉｌ，ｉ・ｆｓｉｌｉｃａ－ｆｗ，ｉ）＋ｐｐｒｏｔ・ｆｐｒｏｔ，ｉ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ＋ｐｓｉｌｉｃａ・ｆｓｉｌ，ｉ・ｆｓｉｌｉｃａ＋ｐｓｏｌｖｅｎｔ・ｆｗ，ｉ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
Δｐｃ＝ｐｔａｉｌ・（１－ｆｐｒｏｔ，ｃ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｓｉｌ，ｃ・ｆｓｉｌｉｃａ）＋ｐｐｒｏｔ・ｆｐｒｏｔ，ｃ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ＋ｐｓｉｌｉｃａ・ｆｓｉｌ，ｃ・ｆｓｉｌｉｃａ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
Δｐｏ＝ｐｈｅａｄ・（１－ｆｐｒｏｔ，ｏ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｓｉｌ，ｏ・ｆｓｉｌｉｃａ－ｆｗ，ｏ）＋ｐｐｒｏｔ・ｆｐｒｏｔ，ｏ・ｆｐｒｏｔｅｉｎ＋ｐｓｉｌｉｃａ・ｆｓｉｌ，ｏ・ｆｓｉｌｉｃａ＋ｐｓｏｌｖｅｎｔ・ｆｗ，ｏ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
Δｐｓｉｌｉｃａ＝ｐｓｉｌｉｃａ・（１－ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ）＋ｐｓｏｌｖｅｎｔ・ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ－ｐｓｏｌｖｅｎｔ
によって定義され、
式中、ｐｈｅａｄ、ｐｔａｉｌ、ｐｓｉｌｉｃａおよびｐｓｏｌｖｅｎｔは、それぞれ脂質頭部、脂質尾部、シリカおよびバルク溶媒の散乱長密度（ＳＬＤ）である。
【0103】
最後に、各リポソーム／プロテオリポソーム上に沈着したシリカの乾燥体積を、
を用いて算出した。
【数10】
を用いて算出した。
【0104】
結果
リポソームおよびプロテオリポソームの構造的特徴を、ＤＬＳおよびＳＡＮＳを用いて評価した。ＤＬＳによって決定された多分散性指数（ＰＤＩ）は、リポソームについては０．１５、プロテオリポソームについては０．２７であった。小胞サイズ（約２×１０－３Å－１に位置する）に対応するＳＡＮＳピークの広さも、試料サイズの多分散性を示唆した。リポソームおよびプロテオリポソームは、それぞれ１２４．８ｎｍ±２．９ｎｍおよび１３２．９±７．０ｎｍのＺ－ａｖｇ直径を有していた。また、両試料の多分散性のために明らかに存在した大きな小胞からの非比例的な光散乱寄与を補償するために、データを数に応じて重み付けした。次いで、加重平均直径は、リポソームについては７８．０ｎｍ±５．１ｎｍになり、プロテオリポソームについては６６．０ｎｍ±３．２ｎｍになった。
リポソームおよびプロテオリポソームの構造的特徴を、ＤＬＳおよびＳＡＮＳを用いて評価した。ＤＬＳによって決定された多分散性指数（ＰＤＩ）は、リポソームについては０．１５、プロテオリポソームについては０．２７であった。小胞サイズ（約２×１０－３Å－１に位置する）に対応するＳＡＮＳピークの広さも、試料サイズの多分散性を示唆した。リポソームおよびプロテオリポソームは、それぞれ１２４．８ｎｍ±２．９ｎｍおよび１３２．９±７．０ｎｍのＺ－ａｖｇ直径を有していた。また、両試料の多分散性のために明らかに存在した大きな小胞からの非比例的な光散乱寄与を補償するために、データを数に応じて重み付けした。次いで、加重平均直径は、リポソームについては７８．０ｎｍ±５．１ｎｍになり、プロテオリポソームについては６６．０ｎｍ±３．２ｎｍになった。
【0105】
シリカ前駆体添加前の試料のＳＡＮＳ特性評価を、Ｄ２Ｏおよびシリカ（ＣＭＳｉＯ２）の散乱長密度（ＳＬＤ）とコントラストが一致する２つのコントラストで行った。カスタム設計されたコア－マルチシェルモデルへのこれらのコントラストの同時フィッティングにより、リポソームおよびプロテオリポソームの両方について、４５ｎｍの直径、９Åの内部脂質頭部厚および３４Åの脂質尾部層厚が得られた。外側脂質頭部の厚みは、リポソームについては１０Å、プロテオリポソームについては１２Åであった。
【0106】
ＳＡＮＳを使用して、ケイ化方法およびシリカシェルの進化を研究して、リポソームおよびプロテオリポソームが方法においてどのように影響を受けるかを解明した。二重層区画およびシリカシェルのサイズおよび組成を得た。プロテオリポソームのケイ化の過程で得られたＳＡＮＳプロファイルを図２Ａに示す。ケイ化方法に対する妥当な適合は、５つの適合パラメータ、中性子ビーム中の種の濃度（ｃｏｎｃ．）、シリカ被覆されたリポソーム／プロテオリポソームの割合（ｆｓｉｌｉｃａ）、外側脂質頭部の厚み（ｔｏ）、シリカシェルの厚み（ｔｓｉｌｉｃａ）、およびシリカシェルの含水量（ｆｗ，ｓｉｌｉｃａ）を変えることによって得られた。シリカシェルの乾燥体積（Ｖｓｉｌｉｃａ，ｄｒｙ、式１を用いて導出）と共に選択されたパラメータの初期および最終適合値を表２に示す。
【数11】
【0107】
Ｖｓｉｌｉｃａ，ｄｒｙは、図３Ｂに時間の関数としても示されている。図３Ｂに示されるデータを、以下のアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）型成長関数［Ａｖｒａｍｉ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９４０，８：２１２－２２４、および、Ａｖｒａｍ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９４１，９（２）：１７７－１８４］に適合させた。
式中、Ｖｉｎｉｔｉａｌは初期体積、Ｖｆｉｎａｌは最終体積、ｋはシリカ形成の速度定数、βはアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）指数である。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアを使用してリポソームおよびプロテオリポソームのケイ化方法を適合させると、表３に示される値に戻ったが、これらのデータに基づく形成機構を図３Ａおよび図３Ｃに示す。異なるアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）指数にもかかわらず、リポソームとプロテオリポソームの適合を比較する手段として、シリカ形成半減時間パラメータ（ｔ１／２）を導入した。式
を用いて分析を行った。
式中、ｋｎ（Ｔ）およびβの値は、フィッティングから得られた。
【数12】
式中、Ｖｉｎｉｔｉａｌは初期体積、Ｖｆｉｎａｌは最終体積、ｋはシリカ形成の速度定数、βはアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）指数である。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアを使用してリポソームおよびプロテオリポソームのケイ化方法を適合させると、表３に示される値に戻ったが、これらのデータに基づく形成機構を図３Ａおよび図３Ｃに示す。異なるアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）指数にもかかわらず、リポソームとプロテオリポソームの適合を比較する手段として、シリカ形成半減時間パラメータ（ｔ１／２）を導入した。式
【数13】
を用いて分析を行った。
式中、ｋｎ（Ｔ）およびβの値は、フィッティングから得られた。
【0108】
時間分解ＤＬＳを利用して、ケイ化方法中のリポソームおよびプロテオリポソームの凝集挙動を研究した。散乱光強度は、リポソームおよびプロテオリポソームの両試料において、ケイ化の約３時間後に増加し始めた（図１１）。この散乱の増加は、ケイ化リポソームおよびプロテオリポソームの凝集に起因する。
【0109】
ケイ化方法中およびケイ化時のアクアポリンの機能性を、時間分解ストップトフロー光散乱を用いて評価した。表１に見られるように、ｋ値の小さな変化によって検証されるように、プロテオリポソームは、ケイ化時に高度にそれらの水輸送能力を保持する。脂質膜自体は、わずかに水透過性になるようである。１０時間のフィッティングから得られた比較的低いＲ２値は、大きな凝集体が存在することによる小胞収縮のより低いシグナル対ノイズ比に起因する。
【表1】
【0110】
【0111】
完全なケイ化および乾燥時にＴＥＭを使用して、シリカ被覆リポソームおよびプロテオリポソームを研究した。ＴＥＭ（図４Ａ、図４Ｂ）およびＳＴＥＭ（図４Ｃ、図４Ｄ）を使用して収集した結果により、ケイ化試料の幾何学的および組成的特性がさらに説明された。ＳＴＥＭ特性評価は、ケイ化リポソームおよびプロテオリポソームがコア－シェル構築物を主に適合させることを示す。
【0112】
ケイ化プロテオリポソームも元素マッピングに供した。図５に見られるように、ＳＴＥＭエネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）を使用して、異なる元素を局在化した。同じ試料領域のＳＴＥＭ高角度環状暗視野（ＨＡＡＤＦ）顕微鏡写真も挿入した。結果は、可視化された元素が、プロテオリポソームを裏打ちするケイ化アクアポリン含有脂質二重層に沿ってより豊富であることを示唆した。
【0113】
エネルギー濾過（ＥＦ）ＴＥＭを使用して、追加の元素マッピングを行った。これは、ＥＤＸと比較してより軽い元素に対してより感受性があり、したがって、硫黄、ケイ素、炭素、リンおよび酸素に加えて窒素および水素の両方を検出することができた（図６）。
【0114】
ＳＡＮＳデータモデリングにより、系を記述するために使用されるパラメータのほとんどが、リポソームおよびプロテオリポソームの両ケイ化中、一定のままであることが明らかになった。実際、同じ５つのパラメータ（ｔｏ、ｆｓｉｌｉｃａ、ｃｏｎｃ．、ｔｓｉｌｉｃａ、およびｆｗ，ｓｉｌｉｃａ）の変化は、両試料の変化を正確に記述するのに十分であった。このモデルでは、濃度（ｃｏｎｃ．）を浮動パラメータとして使用し、他のパラメータと直接相互接続した。シリカ被覆リポソーム／プロテオリポソーム（ｆｓｉｌｉｃａ）の画分は、リポソームおよびプロテオリポソームのケイ化の最初の１時間および３．５時間、それぞれ０で一定のままであった。この「遅滞期」はアルコキシド前駆体の加水分解に関連し、その間にＴＥＯＳエステル結合が切断されて最終的にケイ酸およびエタノールが形成された。ｐＨ８では、加水分解反応が酸および塩基によって触媒されるため、この方法はゆっくりと進行すると予想される。
【0115】
前駆体の加水分解後、ｆｓｉｌｉｃａは、リポソームおよびプロテオリポソームでそれぞれ１．５時間および３時間の期間中に１に増加した。これは、シリカ沈着が、ケイ化の持続時間全体にわたって連続的ではなく、限られた時間枠内で起こったことを示した。興味深い観察結果は、シリカシェルの厚みが時間と共に直線的に増加しなかったことであった。代わりに、ケイ酸および緩衝液で構成される脂質二重層厚み（約４ｎｍ）程度の層が、沈着が始まるとすぐにリポソームおよびプロテオリポソーム上に配置された。リポソームおよびプロテオリポソーム（シリカシェルを含まない）は、膨潤を経験した外側脂質頭部層を除いて変化しないままであった。脂質二重層の外葉は、沈着したケイ酸と直接接触しており、したがって周囲環境の変化を受けやすい。このモデルによれば、鋳型試料の外側脂質頭部層は、リポソームおよびプロテオリポソームについて、それぞれ８２％および８６％の緩衝液から構成された。特に最初に沈着したケイ酸層中の緩衝液の割合が高いこと（沈着開始までにリポソームで９６％の緩衝液およびプロテオリポソームで９８％）を考慮すると、ケイ酸は外側脂質頭部層と密接に相互作用した。ｔｏの全体的な肥厚は、脂質二重層とシリカシェルとの間の界面水層の存在に起因する可能性がある。
【0116】
ｔｏもｔｓｉｌｉｃａも、どちらの試料においても方法全体を通して安定した増減を示さず、わずかな偏向が全体的なパターンを中断した。したがって、式１を採用して、ｔｏおよびｔｓｉｌｉｃａを残りの幾何学的パラメータおよびｆｗ，ｓｉｌｉｃａに結び付けることによってシリカシェルの成長速度を研究した。時間の関数としての、緩衝液を含まないシリカシェルの体積Ｖｓｉｌｉｃａ，ｄｒｙを図３Ｂに示す。シリカシェル体積の経時変化は、相変態方法、特に結晶化のために最初に導出されたアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）型成長関数（式２）に適合させたシグモイドパターンに従う。異なる長さの遅滞期は、リポソームおよびプロテオリポソームのケイ化に異なるアヴラミ（Ａｖｒａｍｉ）パラメータβをもたらした。したがって、反応速度ｋの比較は簡単ではなかった。したがって、βの差に対応するためにケイ化の半減期（ｔ１／２）を算出した（式３）。表３に示すように、プロテオリポソームのケイ化は、リポソームのケイ化のｔ１／２のほぼ２倍であり、これは、リポソームのケイ化が、プロテオリポソームのケイ化の半分より僅かに短い時間でプラトー体積の半分に達したことを意味する。ｔ１／２は遅滞期および指数期の開始の複合尺度であるため、比較のために別の手法も利用した。初期前駆体の加水分解相を除いて、指数関数的成長の開始から両方のシェル成長過程をプロットした。成長相は著しく類似していた。したがって、リポソームおよびプロテオリポソームのケイ化の差は、方法の第１の部分、すなわち前駆体加水分解の中で生じたと結論付けられた。試料間の唯一の違いはタンパク質であったため、タンパク質の存在はシリカシェルの形成機構を変化させた。シリカシェル形成に影響を及ぼし得る２つの主要なタンパク質特性があり、静電反発および立体障害である。ＰＯＰＣ脂質は双性イオンであるため、ｐＨ８で中性である。一方、ｈＡＱＰ４は、７．６の等電点のためにわずかに負の正味電荷を有する。ＴＥＯＳがケイ酸に加水分解されると、ケイ酸のごく一部がイオン化され、したがって負に帯電する。したがって、タンパク質のわずかに負の正味電荷は、ケイ酸の一部が脂質二重層頭部にアクセスするのを妨げ得る静電反発を導入する。しかしながら、これは、特に、シリカシェルが、正に帯電したコリン部分ではなく、負に帯電したホスファチジル部分への水素結合を介して脂質頭部と相互作用するため、唯一の説明である可能性はあまり高くない。したがって、立体障害は、おそらく静電反発と組み合わせて、より可能性の高い選択肢として提示される。ｈＡＱＰ４のＣ末端ドメインはバルクに達するが、このことが、プロテオリポソームが直接接触しないことを引き起こす可能性がある。これはまた、ケイ化リポソームと同程度に凝集しなかったケイ化プロテオリポソームについても当てはまるようであった。立体障害は、脂質へのケイ酸のアクセス性が低いという点で、プロテオリポソームのケイ化の長期の遅滞期の理由であり得る。
【0117】
リポソームとプロテオリポソームのケイ化の類似性はシリカシェルの厚みであり、これはこれらの形成条件を使用して約４ｎｍになった。興味深いことに、ケイ化および乾燥した試料中にはより小さいシリカ粒子が存在し、これはＴＥＭで明確に見られた（図４Ｂ）。これは、シリカシェルを形成する際に消費されたものよりも多くの材料が利用可能であることを示した。両試料について、シリカ形成の大部分は二重層で起こったようであった（図４）。元のプロテオリポソーム組成物がどのように変化したかについての指標を得るために、ケイ化時の他の元素の配置を研究することも興味深いものであった。ＳＴＥＭ－ＥＤＸは、検出された元素がプロテオリポソームのシリカ裏層に沿って最も豊富であることを示し、アクアポリン含有脂質二重層が無傷であることを示した。マッピングは透過方式で行われたため、マップは３Ｄ試料の２Ｄ投影を示し、したがって、より低い濃度ではあるが、ケイ化プロテオリポソームの他の部分でも同様に元素が検出された。より軽い元素に対してより感受性であるＥＦＴＥＭを使用して相補的元素マッピングを行った。したがって、ＥＤＸによって検出された元素に加えて、生物学的材料の一般的な成分である窒素および水素も検出することができた。ＥＦＴＥＭ元素マッピングは、ＥＤＸを使用する際に提供される指標を確認し、アクアポリン含有脂質二重層に関連する元素は、プロテオリポソームを裏打ちするケイ化領域で濃縮されていた。
【0118】
ＣＤ研究により、ケイ化方法全体を通してタンパク質が無傷のままであることが明らかになった（図２Ｂ）。タンパク質構造のらせん度の変化は、典型的には、ペプチド結合におけるｎ→π＊遷移に対応する吸収２２２ｎｍの吸収バンドへの変化によって評価される。ＣＤデータから判断して、２２２ｎｍでの吸収はほぼ同一であり、これはｈＡＰＱ４の膜貫通部分が無傷であったことを意味する。したがって、脂質二重層の疎水性尾部領域は同じままであり、結果としてタンパク質二次構造が保持された。２０９ｎｍでの振幅の小さな変化の理由は、タンパク質の不規則な部分に対する小さな修飾である可能性があり、これは、それらの部分の一部がシリカに曝露されるため、妥当であろう。
【0119】
この例は、薄いシリカシェルに被覆することによってｈＡＱＰ４含有プロテオリポソームを安定化する方法を開示した。重要なことに、タンパク質の天然の立体構造はケイ化時に維持された。
【0120】
上記の実施形態は、本発明のいくつかの例示的な例として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に様々な修正、組合せ、および変更を加えることができることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決策は、技術的に可能な場合、他の構成で組み合わせることができる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
膜（３）を含む高分子膜構造体（２）であって、
前記膜（３）が、水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含み、前記膜（３）の第１の表面全体が、前記の水を通過させる膜内在性タンパク質（１）の水を通過させる機能を維持しながら、１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有するシリカ層（４）で直接的に被覆されていることを特徴とする、高分子膜構造体（２）。
前記膜（３）が、水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含み、前記膜（３）の第１の表面全体が、前記の水を通過させる膜内在性タンパク質（１）の水を通過させる機能を維持しながら、１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有するシリカ層（４）で直接的に被覆されていることを特徴とする、高分子膜構造体（２）。
【請求項2】
高分子膜構造体（２）を調製するための方法であって、
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記の水を通過させる膜内在性タンパク質（１）の水を通過させる機能を維持しながら、前記膜（３）の第１の表面全体の上に直接的に被覆されたシリカ層（４）を形成することを含み、ここで、前記シリカ層（４）は１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有することによって特徴付けられる、方法。
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記の水を通過させる膜内在性タンパク質（１）の水を通過させる機能を維持しながら、前記膜（３）の第１の表面全体の上に直接的に被覆されたシリカ層（４）を形成することを含み、ここで、前記シリカ層（４）は１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有することによって特徴付けられる、方法。
【請求項3】
濾過装置（５）の調製方法であって、
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）を多孔性支持体（６）上および／または多孔性支持体（６）内に沈着させることと、
前記多孔性支持体（６）上および／または前記多孔性支持体（６）内に沈着した水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む前記膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記の水を通過させる膜内在性タンパク質（１）の水を通過させる機能を維持しながら、前記膜（３）の第１の表面全体の上に直接的に被覆されたシリカ層（４）を形成することと
を含み、
ここで、前記シリカ層（４）は１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有することによって特徴付けられる、方法。
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）を多孔性支持体（６）上および／または多孔性支持体（６）内に沈着させることと、
前記多孔性支持体（６）上および／または前記多孔性支持体（６）内に沈着した水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む前記膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記の水を通過させる膜内在性タンパク質（１）の水を通過させる機能を維持しながら、前記膜（３）の第１の表面全体の上に直接的に被覆されたシリカ層（４）を形成することと
を含み、
ここで、前記シリカ層（４）は１ｎｍ～１００ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有することによって特徴付けられる、方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0120】
上記の実施形態は、本発明のいくつかの例示的な例として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に様々な修正、組合せ、および変更を加えることができることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決策は、技術的に可能な場合、他の構成で組み合わせることができる。
本発明に包含され得る諸態様または諸実施形態は、以下のとおり要約される。
［１］．
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）であって、前記膜（３）の第１の表面がシリカ層（４）で被覆された膜（３）を含む、高分子膜構造体（２）。
［２］．
前記膜（３）が、両親媒性分子を含む二重層膜（３）である、上記項目１に記載の高分子膜構造体。
［３］．
前記膜（３）が、脂質二重層膜（３）であり、前記脂質二重層（３）の両親媒性脂質が、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、スフィンゴミエリン、アソレクチン、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ リゾＰＣ）または１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ リゾＰＣ）などのリゾＰＣ、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ リゾＰＥ）または１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ リゾＰＥ）などのリゾＰＥ、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＥＰＡ）、１，２－エルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジエルコイ－ｓｎ－アリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＬＰＡ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬＰＳ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＭＰＡ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＭＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＯＰＡ）、１，２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＰＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＳＰＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオステアルピル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、細胞膜からの脂質、細胞小器官からの脂質、架橋性脂質、およびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくはＰＯＰＣである、上記項目２に記載の高分子膜構造体。
［４］．
前記両親媒性分子が、両親媒性ＡＢ、ＡＢＡおよびＡＢＣコポリマーならびにそれらの混合物、例えばポリ（メチルオキサゾリン）－ポリ（ジメチルシロキサン）－ポリ（メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳ－ＰＭＯＸＡ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）－ｂ－ポリ（ジメチルシロキサン）－ｂ－ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥｔＯｚ－ＰＤＭＳ－ＰＥｔＯｚ）およびそれらの混合物から選択される、上記項目２に記載の高分子膜構造体。
［５］．
前記膜（３）が、プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソームであり、前記プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソームの外面が前記シリカ層（４）で被覆されている、上記項目１～４のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［６］．
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）が、アクアポリンであり、好ましくは、ｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ３、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、ｈＡＱＰ７、ｈＡＱＰ８、ｈＡＱＰ９、ｈＡＱＰ１０、ｈＡＱＰ１１、ｈＡＱＰ１２、好ましくはｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、またはｈＡＱＰ８、より好ましくはｈＡＰＱ４などのヒトアクアポリン（ｈＡＱＰ）；ｂＡＱＰ１などのウシアクアポリン；ｃｐＡＱＰ１ａａなどの魚アクアポリン；Ａｑｙ１などの酵母アクアポリン；ＳｏＰＩＰ２；１、ＡｔＴＩＰ２；１またはＡｔＰＩＰ２；４などの植物アクアポリン；ＡｑｐＺなどの細菌アクアポリン；およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記項目１～５のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［７］．
前記シリカ層（４）が、０．１ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ～１０ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有する、上記項目１～６のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［８］．
前記水を通過させる膜内在性タンパク質（１）が、前記シリカ層（４）の存在下で前記膜（３）に水を通すことができる、上記項目１～７のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［９］．
前記シリカ層（４）が、好ましくはフルオロアルキルシラン（ＦＡＳ）などのシラン、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＺ）などのアルコキシシラン、またはそれらの組合せを含む官能性シリカ層（４）である、上記項目１～８のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［１０］．
濾過装置（５）であって、
複数の細孔（７）を含む多孔性支持体（６）と、
上記項目１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）と
を含む、濾過装置（５）。
［１１］．
前記高分子膜構造体（２）が、前記多孔性支持体（６）の表面に設けられている、および／または前記多孔性支持体（６）の前記細孔（７）内に設けられている、上記項目１０に記載の濾過装置。
［１２］．
前記多孔性支持体（６）が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリエーテルエーテルスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンエーテル、ポリジフェニルフェニレンエーテル、セルロース、ポリビニレンセルロースアセタート、セルロースジアセタート、セルローストリアセタート、セルロースニトラート、ポリフェニレンスルフィド、ニトロセルロース、アセチル化メチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、有機シロキサンカーボネート、ポリエステルカーボネート、有機ポリシロキサン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリベンゾイミダゾール、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ナイロンおよびこれらの混合物などのポリマー；アルミニウム、チタン、ジルコニウム、鉄、またはそれらの酸化物などの金属、または前記金属の酸化物；二酸化ケイ素；ガラス繊維；ならびにそれらの混合物からなる群から選択される材料で形成されている、上記項目１０または１１に記載の濾過装置。
［１３］．
前記濾過装置（５）が、上記項目９に記載の高分子膜構造体（２）を含み、および
官能性シリカ層（４）の官能基は、前記高分子膜構造体（２）を前記多孔性支持体（６）に連結する、
上記項目１０～１２のいずれかに記載の濾過装置。
［１４］．
水濾液を調製する方法であって、上記項目１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）または上記項目１０～１３のいずれかに記載の濾過装置（５）を通して水溶液を濾過して前記水濾液を得ることを含む、方法。
［１５］．
水溶液に溶解または分散した化合物を濃縮する方法であって、上記項目１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）または上記項目１０～１３のいずれかに記載の濾過装置（５）によって前記水溶液を濾過して、前記化合物を含まない水濾液および前記水溶液よりも高濃度で前記化合物を含む保持液を得ることを含む、方法。
［１６］．
高分子膜構造体（２）を調製するための方法であって、水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（４）を形成することを含む、方法。
［１７］．
濾過装置（５）の調製方法であって、
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）を多孔性支持体（６）上および／または多孔性支持体（６）内に沈着させることと、
前記多孔性支持体（６）上および／または前記多孔性支持体（６）内に沈着した水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む前記膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（５）を形成することと
を含む、方法。
［１８］．
前記シリカ前駆体が、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリケート、テトラブチルオルトシリケート、メチルトリエトキシシロキサン（ＭＴＥＳ）、ジメチルジエトキシシロキサン（ＤＭＤＥＳ）、テトラキス（グリセロール）オルトシリケート（ＴＧＳ）またはテトラキス－（２－ヒドロキシエチル）－オルトシリケート（ＴＨＥＯＳ）などのシリコンアルコキシド；アリルトリメトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、ブチルトリクロロシラン、クロロペンタメチルジシラン、１，２－ジクロロテトラメチルジシラン、ジエトキシジフェニルシラン、［３－（ジエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシ（メチル）オクチルシラン、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン、ヘキサメチルジシラン、イソブチル（トリメトキシ）シラン、メチルトリクロロシラン、ペンタメチルジシラン、ｎ－プロピルトリエトキシシラン、テトラエチルシラン、１，１，２，２－テトラメチルジシラン、テトラメチルシラン、トリエトキシメチルシラン、トリエトキシオクチルシラン、トリメトキシフェニルシラン、トリエトキシフェニルシラン、トリエトキシビニルシラン、トリメトキシメチルシラン、γ－アミノプロピルトリエトキシシラン、四塩化ケイ素（テトラクロロシラン）、四臭化ケイ素（テトラブロミドシラン）またはγ－アミノプロピルシラントリオール（ＡＰＳＴＯＬ）などのシラン：ケイ酸ナトリウムなどのシリケート：トリス（ｔｅｒｔ－ペントキシ）シラノールまたはトリス（ｔｅｒｔ－ブトキシ）シラノールなどのシラノール；シラザン、Ｎ－ｓｅｃ－ブチル（トリメチルシリル）アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくはＴＥＯＳである、上記項目１６または１７に記載の方法。
本発明に包含され得る諸態様または諸実施形態は、以下のとおり要約される。
［１］．
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）であって、前記膜（３）の第１の表面がシリカ層（４）で被覆された膜（３）を含む、高分子膜構造体（２）。
［２］．
前記膜（３）が、両親媒性分子を含む二重層膜（３）である、上記項目１に記載の高分子膜構造体。
［３］．
前記膜（３）が、脂質二重層膜（３）であり、前記脂質二重層（３）の両親媒性脂質が、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、スフィンゴミエリン、アソレクチン、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＨＰＣ）、１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ リゾＰＣ）または１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ リゾＰＣ）などのリゾＰＣ、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ リゾＰＥ）または１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ リゾＰＥ）などのリゾＰＥ、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＥＰＡ）、１，２－エルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジエルコイ－ｓｎ－アリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＯＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＬＰＡ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬＰＳ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＭＰＡ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＭＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＯＰＡ）、１，２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＰＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセルコ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファート（ＤＳＰＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオステアルピル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＭＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＰＰＣ）、細胞膜からの脂質、細胞小器官からの脂質、架橋性脂質、およびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくはＰＯＰＣである、上記項目２に記載の高分子膜構造体。
［４］．
前記両親媒性分子が、両親媒性ＡＢ、ＡＢＡおよびＡＢＣコポリマーならびにそれらの混合物、例えばポリ（メチルオキサゾリン）－ポリ（ジメチルシロキサン）－ポリ（メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳ－ＰＭＯＸＡ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）－ｂ－ポリ（ジメチルシロキサン）－ｂ－ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥｔＯｚ－ＰＤＭＳ－ＰＥｔＯｚ）およびそれらの混合物から選択される、上記項目２に記載の高分子膜構造体。
［５］．
前記膜（３）が、プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソームであり、前記プロテオリポソームまたはプロテオポリマーソームの外面が前記シリカ層（４）で被覆されている、上記項目１～４のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［６］．
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）が、アクアポリンであり、好ましくは、ｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ３、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、ｈＡＱＰ７、ｈＡＱＰ８、ｈＡＱＰ９、ｈＡＱＰ１０、ｈＡＱＰ１１、ｈＡＱＰ１２、好ましくはｈＡＱＰ０、ｈＡＱＰ１、ｈＡＱＰ２、ｈＡＱＰ４、ｈＡＱＰ５、ｈＡＱＰ６、またはｈＡＱＰ８、より好ましくはｈＡＰＱ４などのヒトアクアポリン（ｈＡＱＰ）；ｂＡＱＰ１などのウシアクアポリン；ｃｐＡＱＰ１ａａなどの魚アクアポリン；Ａｑｙ１などの酵母アクアポリン；ＳｏＰＩＰ２；１、ＡｔＴＩＰ２；１またはＡｔＰＩＰ２；４などの植物アクアポリン；ＡｑｐＺなどの細菌アクアポリン；およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記項目１～５のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［７］．
前記シリカ層（４）が、０．１ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ～１０ｎｍの範囲内で選択される平均厚みを有する、上記項目１～６のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［８］．
前記水を通過させる膜内在性タンパク質（１）が、前記シリカ層（４）の存在下で前記膜（３）に水を通すことができる、上記項目１～７のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［９］．
前記シリカ層（４）が、好ましくはフルオロアルキルシラン（ＦＡＳ）などのシラン、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＺ）などのアルコキシシラン、またはそれらの組合せを含む官能性シリカ層（４）である、上記項目１～８のいずれかに記載の高分子膜構造体。
［１０］．
濾過装置（５）であって、
複数の細孔（７）を含む多孔性支持体（６）と、
上記項目１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）と
を含む、濾過装置（５）。
［１１］．
前記高分子膜構造体（２）が、前記多孔性支持体（６）の表面に設けられている、および／または前記多孔性支持体（６）の前記細孔（７）内に設けられている、上記項目１０に記載の濾過装置。
［１２］．
前記多孔性支持体（６）が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリエーテルエーテルスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンエーテル、ポリジフェニルフェニレンエーテル、セルロース、ポリビニレンセルロースアセタート、セルロースジアセタート、セルローストリアセタート、セルロースニトラート、ポリフェニレンスルフィド、ニトロセルロース、アセチル化メチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、有機シロキサンカーボネート、ポリエステルカーボネート、有機ポリシロキサン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリベンゾイミダゾール、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ナイロンおよびこれらの混合物などのポリマー；アルミニウム、チタン、ジルコニウム、鉄、またはそれらの酸化物などの金属、または前記金属の酸化物；二酸化ケイ素；ガラス繊維；ならびにそれらの混合物からなる群から選択される材料で形成されている、上記項目１０または１１に記載の濾過装置。
［１３］．
前記濾過装置（５）が、上記項目９に記載の高分子膜構造体（２）を含み、および
官能性シリカ層（４）の官能基は、前記高分子膜構造体（２）を前記多孔性支持体（６）に連結する、
上記項目１０～１２のいずれかに記載の濾過装置。
［１４］．
水濾液を調製する方法であって、上記項目１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）または上記項目１０～１３のいずれかに記載の濾過装置（５）を通して水溶液を濾過して前記水濾液を得ることを含む、方法。
［１５］．
水溶液に溶解または分散した化合物を濃縮する方法であって、上記項目１～９のいずれかに記載の高分子膜構造体（２）または上記項目１０～１３のいずれかに記載の濾過装置（５）によって前記水溶液を濾過して、前記化合物を含まない水濾液および前記水溶液よりも高濃度で前記化合物を含む保持液を得ることを含む、方法。
［１６］．
高分子膜構造体（２）を調製するための方法であって、水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（４）を形成することを含む、方法。
［１７］．
濾過装置（５）の調製方法であって、
水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む膜（３）を多孔性支持体（６）上および／または多孔性支持体（６）内に沈着させることと、
前記多孔性支持体（６）上および／または前記多孔性支持体（６）内に沈着した水を通過させる膜内在性タンパク質（１）を含む前記膜（３）をシリカ前駆体と接触させて、前記膜（３）の第１の表面上に被覆されたシリカ層（５）を形成することと
を含む、方法。
［１８］．
前記シリカ前駆体が、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラプロピルオルトシリケート、テトラブチルオルトシリケート、メチルトリエトキシシロキサン（ＭＴＥＳ）、ジメチルジエトキシシロキサン（ＤＭＤＥＳ）、テトラキス（グリセロール）オルトシリケート（ＴＧＳ）またはテトラキス－（２－ヒドロキシエチル）－オルトシリケート（ＴＨＥＯＳ）などのシリコンアルコキシド；アリルトリメトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、ブチルトリクロロシラン、クロロペンタメチルジシラン、１，２－ジクロロテトラメチルジシラン、ジエトキシジフェニルシラン、［３－（ジエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシ（メチル）オクチルシラン、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン、ヘキサメチルジシラン、イソブチル（トリメトキシ）シラン、メチルトリクロロシラン、ペンタメチルジシラン、ｎ－プロピルトリエトキシシラン、テトラエチルシラン、１，１，２，２－テトラメチルジシラン、テトラメチルシラン、トリエトキシメチルシラン、トリエトキシオクチルシラン、トリメトキシフェニルシラン、トリエトキシフェニルシラン、トリエトキシビニルシラン、トリメトキシメチルシラン、γ－アミノプロピルトリエトキシシラン、四塩化ケイ素（テトラクロロシラン）、四臭化ケイ素（テトラブロミドシラン）またはγ－アミノプロピルシラントリオール（ＡＰＳＴＯＬ）などのシラン：ケイ酸ナトリウムなどのシリケート：トリス（ｔｅｒｔ－ペントキシ）シラノールまたはトリス（ｔｅｒｔ－ブトキシ）シラノールなどのシラノール；シラザン、Ｎ－ｓｅｃ－ブチル（トリメチルシリル）アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくはＴＥＯＳである、上記項目１６または１７に記載の方法。
【外国語明細書】