特開 2024-161365 ＡＡＶキャプシドの転写依存性定方向進化を使用するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024161365

(43)【公開日】2024-11-19

(54)【発明の名称】ＡＡＶキャプシドの転写依存性定方向進化を使用するための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/015 20060101AFI20241112BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20241112BHJP

【ＦＩ】

C07K14/015 ZNA

C12N15/35

C07K14/015

C12N15/864 100Z

【審査請求】有

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024113548

(22)【出願日】2024-07-16

(62)【分割の表示】P 2021544346の分割

【原出願日】2020-01-31

(31)【優先権主張番号】62/799,603

(32)【優先日】2019-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】503364445

【氏名又は名称】オレゴン・ヘルス・アンド・サイエンス・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】中井 浩之

(72)【発明者】

【氏名】ファン，サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】足立 圭

(57)【要約】      （修正有）

【課題】転写依存性定方向進化（ＴＲＡＤＥ）を実施する方法、およびその方法を使用して選択された新しいアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドを提供する。
【解決手段】ＴＲＡＤＥ技術は、静脈内投与の後に、脳でのニューロンの形質導入を媒介する新しいＡＡＶベクターを同定するために使用された。インビボのＴＲＡＤＥの適用は、新しいＡＡＶキャプシドの投与の後に、脳でニューロンをＡＡＶ９より効率的かつより特異的に形質導入することができる、新しいＡＡＶキャプシドの同定という結果をもたらした。開示される方法は、様々な細胞集団を標的にするＡＡＶキャプシドを同定するために使用されてもよい。
【選択図】図２Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸であって、該核酸は、
ＩＴＲ配列によって隣接されるパルボウイルス科ゲノムであって、該パルボウイルス科ゲノムは、パルボウイルス科イントロン、パルボウイルス科キャップ遺伝子、および第１配向の第１ポリアデニル化シグナルを含む、パルボウイルス科ゲノムと、
アデノウイルスのヘルパー機能の存在下でパルボウイルス科キャップ遺伝子の発現を推進させる前記第１配向の第１プロモーターと、
前記第１配向に対してアンチセンスである第２配向の第２プロモーターおよび第２ポリアデニル化シグナルであって、前記第２ポリアデニル化シグナルは、パルボウイルス科キャップ遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡ転写の終結を引き起こす位置に位置する、第２配向の第２プロモーターおよび第２ポリアデニル化シグナルと、を含む、核酸。

【請求項2】

前記第２プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記第２プロモーターは、ユビキタスプロモーターである、請求項１に記載の核酸。

【請求項4】

前記パルボウイルス科ゲノムは、ＡＡＶイントロンおよびＡＡＶキャップ遺伝子を含むＡＡＶゲノムである、請求項１～３のいずれかに記載の核酸。

【請求項5】

前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、野生型のＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項４に記載の核酸。

【請求項6】

前記ＡＡＶキャップ遺伝子の配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、または他の天然のＡＡＶ単離キャップ遺伝子配列である、請求項５に記載の核酸。

【請求項7】

前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、組み換えＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項４に記載の核酸。

【請求項8】

前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、多様なＡＡＶキャップ遺伝子のライブラリーの１つである、請求項４に記載の核酸。

【請求項9】

請求項４に記載の複数の核酸を含む核酸ライブラリーであって、前記核酸は、複数の固有のＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む、核酸ライブラリー。

【請求項10】

前記核酸ライブラリーは、約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７または１０^８を上回る固有のＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む、請求項９に記載の核酸ライブラリー。

【請求項11】

前記第２配向の対象遺伝子をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の核酸。

【請求項12】

前記第２ポリアデニル化シグナルは、ＡＡＶイントロン内に位置する、請求項４～８または１１のいずれかに記載の核酸。

【請求項13】

前記第２ポリアデニル化シグナルは、キャップ遺伝子が第１配向の完全長のキャプシドタンパク質に正確に翻訳され、およびキャップ遺伝子が、完全長のＡＡＶキャップ遺伝子コード配列を含むアンチセンスｍＲＮＡへと正確に転写されるように、位置する、請求項４～８または１１のいずれかに記載の核酸。

【請求項14】

異なるキャップ遺伝子配列を有する少なくとも１つの他のＡＡＶベクターと比較して、対象組織から細胞を形質導入する能力が増大したキャップ遺伝子配列を有するＡＡＶベクターを同定する方法であって、該方法は、
請求項９または１０に記載の核酸ライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へと導入し、およびパッケージング細胞株から第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収させることによって第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを調製する工程と、
第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入する工程と、
動物の対象組織の細胞内で富化されるＡＡＶベクターのキャップ遺伝子配列を回収する工程と、
前記豊化されたＡＡＶベクターの回収されたキャップ遺伝子配列を含む第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥ核酸ライブラリーを調製し、このライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へ導入し、パッケージング細胞株から第２回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収する工程と、
第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入し、および動物の対象組織の細胞内で豊化されるキャップ遺伝子配列を回収することによって第２回の富化を実施する工程と、
富化されたＡＡＶキャップ遺伝子配列を、第１回富化後、第２回富化後、およびその後任意の回の富化後に同定する工程と、を含む方法。

【請求項15】

ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクター、またはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを産生する方法であって、該方法は、
請求項４～８または１１～１３のいずれかに記載の核酸、または請求項９または１０に記載の核酸ライブラリーを、ＡＡＶパッケージング細胞株へと導入する工程と、ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターまたはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーをパッケージング細胞株から回収する工程と、を含む方法。

【請求項16】

対象組織の細胞を形質導入する能力が増大したＡＡＶベクターの新しいキャップ遺伝子の配列を決定する方法であって、該方法は、
請求項１４に記載の方法でＡＡＶベクターを同定する工程と、
キャップ遺伝子配列を含むアンチセンスｍＲＮＡを回収する工程と、
新しいキャップ遺伝子配列を決定する工程と、を含む方法。

【請求項17】

前記アンチセンスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲを使用して回収される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記キャップ遺伝子配列を決定する工程をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

請求項４～８または１１～１３のいずれかに記載の核酸を含む、ＡＡＶベクター。

【請求項20】

核酸であって、該核酸は、
ＩＴＲ配列によって隣接されるパルボウイルス科ゲノムであって、該パルボウイルス科ゲノムは、パルボウイルス科イントロン、パルボウイルス科キャップ遺伝子、および第１配向の第１ポリアデニル化シグナルを含む、パルボウイルス科ゲノムと、
アデノウイルスのヘルパー機能の存在下でパルボウイルス科キャップ遺伝子の発現を推進させる前記第１配向の第１プロモーターと、
アデノウイルスのヘルパー機能の不在下でパルボウイルス科キャップ遺伝子の発現を推進させる前記第１配向の第２プロモーターと、を含む核酸。

【請求項21】

前記第２プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである、請求項２０に記載の核酸。

【請求項22】

前記第２プロモーターは、ユビキタスプロモーターである、請求項２０に記載の核酸。

【請求項23】

前記パルボウイルス科キャップ遺伝子は、野生型のＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項２０～２２のいずれかに記載の核酸。

【請求項24】

前記ＡＡＶキャップ遺伝子配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、または他の天然のＡＡＶ単離キャップ遺伝子配列である、請求項２３に記載の核酸。

【請求項25】

前記パルボウイルス科キャップ遺伝子は、組み換えＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項２０～２２のいずれかに記載の核酸。

【請求項26】

前記パルボウイルス科キャップ遺伝子は、多様なＡＡＶキャップ遺伝子のライブラリーの１つである、請求項２０～２５のいずれかに記載の核酸。

【請求項27】

請求項２０に記載の複数の核酸を含む核酸ライブラリーであって、前記核酸は、複数の固有のパルボウイルス科キャップ遺伝子配列を含む、核酸ライブラリー。

【請求項28】

前記核酸ライブラリーは、約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７または１０^８を上回る固有のＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む、請求項２７に記載の核酸ライブラリー。

【請求項29】

対象遺伝子をさらに含む、請求項２０～２６のいずれかに記載の核酸。

【請求項30】

異なるキャップ遺伝子配列を有する少なくとも１つの他のＡＡＶベクターと比較して、対象組織から細胞を形質導入する能力が増大したキャップ遺伝子配列を有するＡＡＶベクターを同定する方法であって、該方法は、
請求項２７または２８に記載の核酸ライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へと導入し、およびパッケージング細胞株から第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収することによって第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを調製する工程と、
第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入する工程と、
動物に対象組織の細胞内で富化されるＡＡＶベクターのキャップ遺伝子配列を回収する工程と、
前記豊化されたＡＡＶベクターのキャップ遺伝子配列を含む第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥ核酸ライブラリーを調製し、このライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へ導入し、パッケージング細胞株から第２回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収する工程と、
第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入し、および動物に対象組織の細胞内で豊化されるキャップ遺伝子配列を回収することによって第２回の富化を実施する工程と、
富化されたＡＡＶキャップ遺伝子配列を、第１回富化後、第２回富化後、およびその後任意の回の富化後に同定する工程と、を含む方法。

【請求項31】

ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクター、またはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを産生する方法であって、該方法は、
請求項２３～２６または２９のいずれかに記載の核酸、または請求項２７または２８に記載の核酸ライブラリーを、ＡＡＶパッケージング細胞株へと導入する工程と、ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターまたはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーをパッケージング細胞株から回収する工程と、を含む方法。

【請求項32】

対象組織の細胞を形質導入する能力が増大したＡＡＶベクターの新しいキャップ遺伝子の配列を決定する方法であって、該方法は、
請求項３０に記載の方法でＡＡＶベクターを同定する工程と、
キャップ遺伝子配列を含むセンスｍＲＮＡを回収する工程と、
新しいキャップ遺伝子配列を決定する工程と、を含む方法。

【請求項33】

前記センスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲを使用して回収する、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記キャップ遺伝子配列を決定する工程をさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

請求項２３～２６または２９のいずれかに記載の核酸を含む、ＡＡＶベクター。

【請求項36】

前記第２配向の少なくとも１つのｍＲＮＡスプライシング抑制突然変異をさらに含む、請求項１～８または１１～１３のいずれかに記載の核酸。

【請求項37】

前記少なくとも１つのｍＲＮＡスプライシング抑制突然変異は、スプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター部位の１０のヌクレオチド内に位置する１つ以上のヌクレオチドの変質を含む、請求項３６に記載の核酸。

【請求項38】

前記変質は、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされたアミノ酸配列を変更しない、請求項３６または３７に記載の核酸。

【請求項39】

ＡＡＶキャップＯＲＦ配列であって、スプライシングドナー部位のエキソン－イントロン連結の１つ以上の以下の突然変異：
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００９－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１８＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００６－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１５＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２２８－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＡ－１２３７（配列番号：２００）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２３７－ＴＡＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＧ－１２４６（配列番号：２０１）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０（配列番号：２０２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４３４－ＧＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１４４３（配列番号：２０３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １５０２－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１５１０（配列番号：２０４）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０５）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８３５－ＴＧＴＡＣ（連結）ＣＴＧＣＡ－１８４４（配列番号：２０７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＡＣ－２１９８（配列番号：２０８）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＡＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＣ－２１９８（配列番号：２０９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１９４－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＣＧＴＣ－２２０３（配列番号：２１０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１はＯＲＦ ２１９４－ＣＴＣＡＣ（連結）ＡＣＧＡＡ－２２０３（配列番号：２１１）
（＊ヌクレオチド番号は異なるが、それらは配列アラインメントにおけるＡＡＶキャップＯＲＦの対応するヌクレオチドである。）を含む、ＡＡＶキャップＯＲＦ配列。

【請求項40】

ＡＡＶキャップＯＲＦ配列であって、スプライシングドナー部位のエキソン－イントロン連結の１つ以上の以下の突然変異：
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ３０５－ＡＧＣＧＴ（連結）ＣＴＧＣＡ－３１４（配列番号：２１２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１３３－ＴＣＡＣＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１１４２（配列番号：２１５）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１８１－ＡＣＴＧＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１１９０（配列番号：２１６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０＊＊（配列番号：２０２）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３２８－ＡＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３３７＊＊（配列番号：２１７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４６４－ＣＧＴＴＴ（連結）ＣＴＡＡＡ－１４７３（配列番号：２１８）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １６５３－ＡＡＡＣＡ（連結）ＣＴＧＣＡ－１６６２（配列番号：２１９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＧＣＡ－２０６３（配列番号：２２０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＡＣＡ－２０６３（配列番号：４６３）
（＊＊ヌクレオチド番号は異なっても、それらは配列アラインメントにおけるＡＡＶキャップＯＲＦの対応するヌクレオチドである。）を含む、ＡＡＶキャップＯＲＦ配列。

【請求項41】

ＡＡＶキャップＯＲＦ配列であって、スプライシングドナーまたはスプライシングアクセプター部位のエキソン－イントロン連結の１つ以上の以下の突然変異：
スプライスドナー
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００９－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１８＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００６－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１５＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２２８－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＡ－１２３７（配列番号：２００）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２３７－ＴＡＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＧ－１２４６（配列番号：２０１）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０（配列番号：２０２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４３４－ＧＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１４４３（配列番号：２０３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １５０２－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１５１０（配列番号：２０４）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０５）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８３５－ＴＧＴＡＣ（連結）ＣＴＧＣＡ－１８４４（配列番号：２０７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＡＣ－２１９８（配列番号：２０８）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＡＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＣ－２１９８（配列番号：２０９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１９４－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＣＧＴＣ－２２０３（配列番号：２１０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１９４－ＣＴＣＡＣ（連結）ＡＣＧＡＡ－２２０３（配列番号：２１１）
スプライスアクセプター
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ３０５－ＡＧＣＧＴ（連結）ＣＴＧＣＡ－３１４（配列番号：２１２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１３３－ＴＣＡＣＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１１４２（配列番号：２１５）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１８１－ＡＣＴＧＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１１９０（配列番号：２１６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０＊＊（配列番号：２０２）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３２８－ＡＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３３７＊＊（配列番号：２１７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４６４－ＣＧＴＴＴ（連結）ＣＴＡＡＡ－１４７３（配列番号：２１８）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １６５３－ＡＡＡＣＡ（連結）ＣＴＧＣＡ－１６６２（配列番号：２１９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＧＣＡ－２０６３（配列番号：２２０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＡＣＡ－２０６３（配列番号：４６３）を含む、ＡＡＶキャップＯＲＦ配列。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅによって与えられた第ＮＳ０８８３９９号の下の政府支援で実施された。政府は本発明において一定の権利を有している。

【0002】

本開示は、遺伝子導入に使用されるウイルスベクターに関する。より具体的には、本開示は、転写依存性定方向進化のための方法、およびこの方法を使用することによって選択されるアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターに関する。

【背景技術】

【0003】

組み換え型アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、インビボの遺伝子導入のための最も有望なものの一つである。ＡＡＶベクターの有用性は、自然発生の新規な血清型およびサブタイプの多くがヒトと非ヒト霊長類の組織から分離されて以来、拡張した。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，６３８１－６３８８（２００４）ａｎｄ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，１１８５４－１１８５９（２００２）。新しく同定されたＡＡＶ分離株のうち、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）およびＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）が注目されており、なぜならこれらの２つの血清型に由来したＡＡＶベクターは、全身投与後に肝臓、心臓、骨格筋および中枢神経系を含む様々な器官を高効率で形質導入することができるからである。Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，７５０－７５５ （２００７）；Ｐａｃａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９９，３－９（２００６）；Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４，４５－５３ （２００６）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１２，２６５０－２６５９（２００５）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３２１－３２８（２００５）；Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，２１４－２２４（２００５）；ａｎｄ Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３２１－３２８（２００９）。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９のベクターによるこの安定した形質導入は、これらの細胞型の強力な屈性、ベクターの効率的な細胞取り込み、および／または細胞でのビリオンシェルの迅速な脱殻に帰着された。Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，３１１０－３１２２（２００４）。加えて、よりよい性能を有するキャプシドに組み換えされたＡＡＶベクターの発生は、ベクターツールキットとしてＡＡＶの効用を大幅に広げた。Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０，６９９－７０８（２０１２）。

【0004】

ＡＡＶに媒介された遺伝子治療を使用する概念実証は、ヒト疾患の多くの前臨床の動物モデルで示された。Ｉ／ＩＩ段階臨床研究は、血友病Ｂ（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ７１，１９９４－２００４（２０１４））リポプロテインリパーゼ欠損症（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９７，１６３５－１６４４（２０１２））、レーバー先天黒内障（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １３０，９－２４（２０１２）およびＰｉｅｒｃｅ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５，ａ０１７２８５（２０１５））、他のもの（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ａｎｄ Ｈｉｇｈ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １２，３４１－３５５（２０１１）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，３５８－３７８（２０１９）で掲載された）の処置のための有望な結果を示した。

【0005】

この期待にもかかわらず、人体研究は、ＡＡＶに媒介された遺伝子治療で意外な問題および潜在的困難をさらに明らかにした。Ｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １２，３４２－３４７（２００６）。加えて、ＡＡＶ生物学およびキャプシド表現型関係についての我々の理解（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，３０７５，（２０１４）；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２８，１０７５－１０８６，（２０１７）；およびＯｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６，１１３９－１１４３，（２０１９））の飛躍的進歩にもかかわらず、我々が合理的に設計することができない臨床的ＡＡＶベクターの多くの望ましい性質が残る。

【0006】

そのために、そのような望ましい表現型を有する新しいＡＡＶキャプシドを同定するハイスループットスクリーニング方法は使用されている。具体的に、インビボのＡＡＶライブラリー選択方略の発達によって、予め抵抗性のある細胞型の非常に効率的な形質導入に有能な様々なデザイナーＡＡＶ変異体（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １５，４４５－４５１（２０１４）およびＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３，１８１９－１８３１（２０１５）で掲載された）が産生された。

【0007】

インビボのライブラリー選択の最も初期の試み（第１世代）は、切開された組織からのベクターゲノムＤＮＡの回収に依存した。理論上、この方策は、両方の有効なＡＡＶ変異体と同様にいくつかを媒介するＡＡＶ変異体も回収させるが、ベクターに媒介された導入遺伝子発現（図１）にすべての工程が必要とされない。したがって、合成ＡＡＶ変異体の多様なライブラリーのスクリーニングは、場合によっては完全に不効果的遺伝子治療ベクターであるＡＡＶ変異体の高いバックグラウンド回収を引き起こす。さらに、特定細胞型を標的とすることは、蛍光活性化細胞選別またはレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションなどのさらなる処理を必要とする。それにもかかわらず、この技術を成功裡に使用することのいくつかの報告があった。Ｅｘｃｏｆｆｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６，３８６５－３８７０（２００９）；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２，５８８７－５９１１（２００８）；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０６，３８２－３８６（２０１４）；ａｎｄ Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８９ｒａ１７６（２０１３）。しかしながら、２０１６年のＤｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．の歴史的な研究は、このプロセスが、Ｃｒｅ依存性選択方策（第２世代）の使用によって大幅に改善することができることを示した。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９（２０１６）。Ｃｒｅ－依存性ライブラリー選択は、プライマー結合配列を含むベクターゲノムＤＮＡを逆にするために一本鎖ＤＮＡではなく二本鎖ＤＮＡに作用するＣｒｅレコンビナーゼの選択的な能力の利点を有する。この配列の反転は、方向選択的ＰＣＲが、二本鎖ＤＮＡが一本鎖のＡＡＶゲノムから形成される形質導入の後期を経ることができるＡＡＶ変異体によって細胞に送達されたウイルスＤＮＡを特異的に増幅することを可能にする。さらに、Ｃｒｅドライバラインの使用は、効率的に形質導入する新しいＡＡＶ変異体の選択を可能にし、細胞型特異的方法でＣｒｅレコンビナーゼの選択的遺伝子発現を促進する。確かに、Ｃｒｅ依存性選択の使用は、著者が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの全身投与後に親のＡＡＶ９より４０倍以上形質導入可能なＡＡＶ９変異体、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを開発することを可能にした。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９（２０１６）。あいにく、マウスにＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂによって示された増強が、非ヒト霊長類において通用しないことは最近明らかになった（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１８ および Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１９）。意外にも、その増強は、一般的に使用されるすべてのマウス株さえまで及ぼさない（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１８およびＨｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１９）。したがって、霊長類モデルにおいてＡＡＶライブラリー選択実験の実施によって臨床的に関係のあるＡＡＶベクターの発達を加速するように強力な推進力がある。しかしながら、多量の細胞型特異的トランスジェニックＣｒｅドライバラインが既に確立しているマウスでのＡＡＶ変異体の選択と異なり、非ヒト霊長類を含む臨床的に関連する大きい動物においてＣｒｅ依存性選択が扱いしやすはなく、Ｃｒｅトランスジェニック動物が容易に利用可能ではないからである。

【0008】

したがって、我々は、Ｃｒｅ依存性選択によって提供されると同様、またはそれよりよい選択的ストリンジェンシーを有するが、Ｃｒｅレコンビナーゼを必要としない次世代選択方策（第３世代）を開発しようと努力した。このゴールを遂行するために、我々は、転写依存性定方向進化（ＴＲＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）システム、またはＴＲＡＤＥを開発した。転写依存性選択では、我々は、ＡＡＶキャップ遺伝子を、細胞型特異的エンハンサー－プロモーターによって誘導される非コードのアンチセンスｍＲＮＡとして発現する。このアンチセンス転写産物をＲＴ－ＰＣＲによって回収させることは、Ｃｒｅレコンビナーゼを使用せず、特定細胞型でベクターに媒介されたｍＲＮＡ発現のレベルでＡＡＶキャップ遺伝子の厳密な回収を可能にする。様々な細胞型の標的化は、単に様々な細胞型特異的エンハンサー－プロモーターをプラスミド構築物へとクローニングすることを必要とする。したがって、ＴＲＡＤＥは、臨床の遺伝子治療のための増強されたＡＡＶベクターの発育のために非ヒト霊長類コンテキストを含む幅広い様々なコンテキストに適用することができる、高度な柔軟性のあるシステムである。同じ原理が、センス配向のＡＡＶキャップ遺伝子の発現のために使用され得ることに注目されたい。しかしながら、センス鎖アプローチは、標的細胞での免疫原のキャプシドタンパク質の発現という結果をもたらし、したがって、ＴＲＡＤＥシステムによって使用されるアンチセンス鎖アプローチほど理想的ではない。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、転写依存性定方向進化（ＴＲＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（「ＴＲＡＤＥ」）を名付けた次世代の定方向進化方策を提供し、それは、細胞型特異的またはユビキタスｍＲＮＡ発現のレベルでＡＡＶキャプシド形質導入のために選択する。本明細書に記載される方法は、Ｃｒｅ組み換えベースのＡＡＶ標的とされた進化（「ＣＲＥＡＴＥ」）、文献で報告されたＡＡＶキャプシド定方向進化の最先端の方法、に対して以下の利点を提供する。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３４，２０４－２０９ （２０１６）。まずは、ＣＲＥＡＴＥシステムは、Ｃｒｅ発現を必要とし、それは外生的に送達されるＣｒｅ発現、またはＣｒｅトランスジェニック動物の使用のいずれかによって到達され得る。これに対して、ＴＲＡＤＥシステムは、Ｃｒｅトランスジェニック動物を必要とすることなく、したがって、それは動物および任意の動物種に由来した培養細胞に適用され得、非ヒト霊長類を含む大きい動物に容易に適され得る。２番目に、細胞型特異的選択がＡＡＶウイルスゲノム転換のレベルで一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡに適用されるＣＲＥＡＴＥシステムと異なり、ＴＲＡＤＥは、ＡＡＶゲノム転写のレベルで細胞型特異的選択を可能にする。したがって、ＴＲＡＤＥシステムは、ＣＲＥＡＴＥシステムより大きな選択プレッシャを提供することができる。３番目に、複数の定方向進化スキーム（例えば、ニューロン特異的、アストロサイト特異的、オリゴデンドロサイト特異的、およびミクログリア特異的）は、１つのＡＡＶキャプシドライブラリーへと統合されることができ、各細胞型を標的とするＡＡＶベクターの選択は１匹の動物において実施されることができる。４番目に、任意の細胞型特異的、または、組織／器官特異的エンハンサー－プロモーター、あるいはユビキタスエンハンサー－プロモーターは、増強された効能を有する細胞型特異的、またはユビキタス新しいＡＡＶキャプシドの同定を目的とするＡＡＶキャプシド定方向進化のために容易に使用されることができる。５番目に、ＴＲＡＤＥ方法は、遺伝子送達に使用されていた一般のＡＡＶを含むデペンドパルボウウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に制限されないが、さらに広くＡＡＶ（例えば、ボカウイルス）以外の種類ボカパルボウイルス（Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）およびエリスロパルボウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）を含むファミリーパルボウイルス科、およびより広くＤＮＡウイルスにも適用されることができる。

【0010】

本開示は、新しいＡＡＶキャプシド突然変異体をさらに提供する。ＴＲＡＤＥ技術は、静脈内投与後に、脳でのニューロン形質導入を媒介する新しいＡＡＶベクターを同定するために使用された。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびアカゲザルにおいてＴＲＡＤＥの適用は、静脈内投与後にマウスおよび非ヒト霊長類の脳においてＡＡＶ９よりニューロンを形質導入し得る新しいＡＡＶキャプシドをより効率的におよびより具体的に同定することという結果をもたらした。加えて、我々は、不確定の細胞集団、または肺に存在し、潜在的にニューロンの起原である細胞集団を形質導入し得る新しいＡＡＶキャプシドをＡＡＶ９より５～１８倍よく同定した。

【0011】

本開示は、さらにＡＡＶキャプシド遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡのスプライシングを防ぐ方法を提供する。ＡＡＶキャップ遺伝子オープン・リーディング・フレーム（「ＯＲＦ」）から転写されたアンチセンスｍＲＮＡ前駆体は、（ａ）切断したｍＲＮＡ種を作ってスプライシングされることができる。我々が知っている限りでは、これは以前報告されていない新しい発見である。そのようなスプライシングは、ＡＡＶキャップＯＲＦの全長アンチセンスｍＲＮＡの有効な回収を妨害する可能性を有しており、それは、キャップＯＲＦの幅広い部位に突然変異が起こされるときにＴＲＡＤＥにとって不可欠である。本開示は、キャップ遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡのスプライシングを防ぐために新しい方策を提供する。

【0012】

本明細書に記載されるＴＲＡＤＥシステムは、キャプシド配列情報を回収するためにアンチセンスｍＲＮＡを使用し、センス鎖ｍＲＮＡを使用するＴＲＡＤＥ（すなわち、センス鎖ＴＲＡＤＥ）も、同じ原理を使用して、実施可能である。しかしながら、センス鎖ＴＲＡＤＥアプローチが、標的細胞の免疫原のキャプシドタンパク質の発現、したがって、アンチセンス鎖アプローチほど推測上理想的でないという結果をもたらすことは注目されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＡＡＶキャプシドの定方向進化のために利用されたインビボのライブラリー選択方策の概略である。ＡＡＶのベクターに媒介された形質導入は、多段階プロセスであり、それは、ビリオンが、細胞外のバリアを克服し、標的細胞上でレセセプターを結合し、エンドサイトーシスを介して細胞に入り、エンドソームを逃れ、核への通行し、脱殻し、二本鎖ＤＮＡ構成を達成し、最後に転写／翻訳を経ることを必要とする。最初期のインビボのライブラリー選択方策（第１世代）は、組織サンプルからすべてのベクターゲノムＤＮＡを回収した。理論上、この方策は、有効なＡＡＶ変異体とともに、ベクターに媒介された導入遺伝子発現に必要なステップすべてではないが、いくつかの工程の媒介するＡＡＶ変異体の両方を回収するであろう。加えて、この方策は、さらに細胞に入らず、細胞外マトリックスでとどまるＡＡＶベクター粒子からＡＡＶベクターゲノムＤＮＡを回収するであろう。このように、合成ＡＡＶ変異体の多様なライブラリーのスクリーニングは、完全に非効果的遺伝子治療ベクターであるＡＡＶ変異体の比較的高いバックグラウンド回収をもたらす。さらに、特定細胞型に集中することは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）などのさらなる処理を必要とする。ライブラリー選択の第２世代（第２世代）は、形質導入の二本鎖ＤＮＡ段階を達成することができるＡＡＶ変異体のみのＣｒｅ依存性回収の利用によって選択ストリンジェンシーを実質的に増大させた。さらに、細胞型特異的エンハンサー－プロモーターでＣｒｅ発現を誘導することは、大量の組織サンプルを処理する利点を保持しながら特定細胞型を標的とすることを可能にする。ライブラリー選択の第３の世代（第３世代）は、Ｃｒｅ発現を要求せず、細胞型特異的エンハンサー－プロモーターの導入遺伝子ｍＲＮＡ発現を媒介することができるＡＡＶ変異体の転写依存性回収の使用によるＡＡＶ定方向進化技術に基づく。

【図2A】ＴＲＡＤＥの原理。ＴＲＡＤＥ構成（ＡＡＶ－ＴＲＡＤＥ）のＡＡＶベクターゲノムのマップ。細胞型特異的エンハンサー－プロモーターは、アンチセンスｍＲＮＡとしてＡＡＶキャップ遺伝子転写発現を誘導するために、アンチセンス配向に置かれる。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ゲノムに由来したポリアデニル化シグナル（ｐＡ）は、アンチセンスＡＡＶキャップ遺伝子ｍＲＮＡ転写を終結させるために、アンチセンス配向のＡＡＶゲノムイントロン内に置かれる。ｅＧＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、描写されるように、レポーターとして機能する、またはＦＡＣＳによって形質導入された細胞の富化を促進するために置くことができるが、そのような標識遺伝子は、ＴＲＡＤＥのために厳密に必要とされない。ＣＡＧプロモーターなどのユビキタスプロモーターは、ＴＲＡＤＥにおいて様々な細胞型を形質導入することができるＡＡＶキャプシドを同定するために細胞型特異的エンハンサー－プロモーターに置かれ使用されることができる。細胞型特異的エンハンサー－プロモーターは、ＡＡＶキャップ遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の発現をセンス配向に誘導する（つまりセンス鎖ＴＲＡＤＥ）ために、ＡＡＶキャップ遺伝子ＯＲＦ上流に置くことができる。しかしながら、このアプローチは、ＴＲＡＤＥのために理想的ではないこともあり得、なぜならＡＡＶキャプシドタンパク質が標的細胞で発現され、それは定方向進化プロセスでの望ましくない生体影響をもたらす場合があるからである。

【図2B】ＴＲＡＤＥの原理。ＨＥＫ２９３細胞でのＡＡＶベクター産生中に、およびアデノウイルスのヘルパー機能の存在下において、ＡＡＶ２ウイルスｐ４０プロモーターは、キャップ遺伝子発現（フォーワード転写）を誘導し、かつ細胞型特異的転写産物は抑制され、ＡＡＶ－ＴＲＡＤＥベクターゲノムを含む組み換え体ＡＡＶベクターの優れた産生が引き起こされる。特定細胞型の形質導入の後で、細胞型特異的エンハンサー－プロモーターは、活性化され、ｅＧＦＰおよびアンチセンスキャップｍＲＮＡ配列の発現を誘導する一方、ｐ４０プロモーターの転写活性は、アデノウイルスのヘルパー機能の不足により形質導入された細胞において不活性のままである。キャップ遺伝子ＯＲＦ全体は、細胞型特異的方法で発現される鋳型としてアンチセンスキャップ遺伝子ｍＲＮＡを使用して、逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲによって回収され得る。我々は、組み換え体ＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞のヒトシナプシンＩ遺伝子（ｈＳｙｎＩ）エンハンサー－プロモーターから漏出発現による発現されるアンチセンスｍＲＮＡ転写産物の存在下でさえ高レベルで成功裡に産生することができる、と観察した。さらに、我々は、組み換え体ＡＡＶベクターが、高レベルでアンチセンスＡＡＶキャップｍＲＮＡ転写産物の発現を誘導するＣＡＧプロモーターを使用する場合でさえ、高滴定量で成功裡に産生することができる、と観察した。

【図3A】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥベクターゲノムのマップ。

【図3B】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。ＴＲＡＤＥシステムを実証するために、このＡＡＶベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡゲノムとしてＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドへパッケージングされ、および結果として生じるＡＡＶベクターは、１つのマウス当たり３×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）の投与量で２匹の８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内で注入された。脳組織は、注射１２日後に採取された。１匹の動物の脳組織は、４％のパラホルムアルデヒドで固定され、免疫蛍光顕微鏡検査法に使用され、および、他の動物の脳組織は、固定されることなく、ＡＡＶベクターゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの分子分析に使用された。

【図3C】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。抗ＧＦＰ抗体で染色された脳の部分の免疫蛍光顕微鏡検査法画像は、細胞型特異的エンハンサー－プロモーターによって誘導される転写産物の発現を確認した。

【図3D】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーターによって誘導されるＧＦＰ発現は、特異的にニューロン（抗ＨｕＣ／Ｄ＋）において観察された。

【図3E】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。ＲＴ－ＰＣＲは、全長キャップＯＲＦ配列（ＲＴ＋）を回収するために使用された。ＲＴ－、逆転写酵素対照なし；Ｐｌａｓ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥベクターゲノム配列を含むプラスミド鋳型を使用して、ＤＮＡ－ＰＣＲで得られた陽性対照）；ＮＴ、鋳型ＰＣＲ対照なし。

【図3F】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。ＲＴ－ＰＣＲ産物のサンガー法シーケンシングは、ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーター（配列番号：１９０）によって発現されたアンチセンス転写産物のＭＶＭイントロンの予想されるスプライシングを示した。エキソン－エキソン連結は、グレーでハイライトされている。

【図3G】脳ニューロンを標的とするＴＲＡＤＥシステムの検証。 サンガー法シーケンシングは、ＰＨＰ．Ｂペプチド（グレーでハイライトされている）（配列番号：１９１）の挿入を確認した。

【図4】ＡＡＶ９キャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡのスプライシング。２つの細胞株、ＨＥＫ２９３およびＮｅｕｒｏ２ａは、ＧＦＰレポーターで、またはそのレポーターなしで、ＴＲＡＤＥ構成にＡＡＶ９キャップＯＲＦを含むプラスミドでトランスフェクトされた。それらはそれぞれ、図で、「ＧＦＰ ＴＲＡＤＥ」および「ＴＲＡＤＥ」として示される。細胞は、トランスフェクション３日後に採取され、ＲＮＡは抽出され、およびＲＴ－ＰＣＲは、完全なキャップＯＲＦ配列を増幅する１セットのＰＣＲプライマーで実施された。陽性対照（ＰＣ）レーンで示されるように、２．４ｋｂの予想されたアンプリコンサイズを回収する代わりに、我々は、約０．７ｋｂのアンプリコンを着実に回収した。これらのＲＴ－ＰＣＲ産物のサンガー法シーケンシングは、図５に示されるＡＡＶ９キャップＯＲＦの１．７ｋｂの領域のスプライシングと一致する切断を同定した。ＰＣ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥベクターゲノム配列を含むプラスミド鋳型を使用する陽性対照；ＮＣ、鋳型ＰＣＲ対照なし。

【図5】ＡＡＶ９キャップ遺伝子（配列番号：１９２）に由来したアンチセンスｍＲＮＡにおいて同定されたイントロン。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャップ遺伝子配列が、ニューロン特異的ヒトシナプシンＩ（ｈＳｙｎＩ）エンハンサー－プロモーターの制御下でＨＥＫ２９３細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞においてアンチセンス配向で転写された時、スプライシング事象は、潜在スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位で同定された（同様に図６を参照）。下線された配列は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦ内に見つかったイントロンを示す。このスプライシング事象は、マウス脳ニューロンで観察されなかった。（１）ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーターはニューロン特異的エレメントとして使用されているが、ＨＥＫ２９３細胞内で漏出発現を誘導することを示された；および（２）イントロンスプライシング実験に使用されたＡＡＶ９キャップＯＲＦ配列はＣ末端付近に以下のサイレント突然変異を有した：ｇａａｃｃｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇｇｃａｃＧＣｇＴｔａｃＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＡ（配列番号：１）ことに注目されるべきである。イントロン配列は下線され、およびＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）認識部位を作成するためにイントロンへと導入されたサイレント突然変異は、大文字で示される。

【図6】エキソン－イントロン連結の共有の特徴を有する潜在スプライスドナー（ＳＤ）およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位は、ＡＡＶキャップＯＲＦでアンチセンス配向で存在する。１２２の自然発生のＡＡＶ株（血清型および変異体）に由来したキャップ遺伝子のヌクレオチド配列は、多数の配列アラインメントプログラムを使用して整列される（配列番号２２３－３１６）。ＡＡＶ９キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたエキソン－イントロン連結は、実線で示される。スプライスアクセプター部位の点線は、配列保存の予想された位置でのスプライスアクセプターＡＧ／ＴＣ配列が欠けているＡＡＶキャップＯＲＦを推定的スプライスアクセプター部位を示す。スプライスドナー領域の点線は、ＡＡＶ３キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたスプライスドナー部位を示す（図７を参照）。Ｔ’ｓのストレッチが後に続くＧＴ／ＣＡスプライスドナー部位およびＡＧ／ＴＣスプライスアクセプターモチーフは、エキソン－イントロン連結の共通特徴であり、多くのＡＡＶ株にわたって非常によく保存される。この図で示されるＡＡＶ９キャップＯＲＦで同定されたスプライスドナーおよびアクセプター部位は、ＡＡＶ１キャップＯＲＦでも同定された。ＡＡＶ１、３、５および９、以外の血清型については、ＡＡＶキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡのスプライシング事象は現在調査中である。ハイライトされた変異体は共通のＡＡＶ血清型である。

【図7A】ＡＡＶ３キャップ遺伝子に由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたイントロン。ｐＡＡＶ３－ｈｎＬＳＰ－ＭＣＳ－ＴＲＡＤＥ２は、ＭＶＭイントロン（ｈｎＬＳＰ）を有する肝臓特異的エンハンサー－プロモーターの下に置かれた野生型のＡＡＶ３キャップＯＲＦを運ぶプラスミドである。ＡＡＶ３キャップＯＲＦのヌクレオチド配列は、自然に同定されたＡＡＶ３と同様である。ＨｅｐＧ２細胞、ヒト肝癌細胞株は、プラスミドｐＡＡＶ３－ｈｎＬＳＰ－ＭＣＳ－ＴＲＡＤＥ２でトランスフェクトされた。その後、ＡＡＶ３キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲによって分析された。２つの切断したＲＴ－ＰＣＲ産物の配列は、ＰＣＲ産物の平滑末端ＴＯＰＯクローニング後のサンガー法シーケンシングによって決定され、それは、アンチセンスＡＡＶ３キャップＯＲＦ（パネルＡおよびＢ、配列番号：１９３）内で見つかったイントロンを明らかにした。イントロン配列は、下線の小文字である。最上流のスプライスドナー部位は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦで同定されたスプライスドナー部位のわずか３ｂｐ離れていると確認され、それは図６で点線で示される。最下流のスプライスアクセプター部位は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦの約８０ｂｐ上流に見つかる。ＡＡＶ３キャップＯＲＦで同定されたすべてのスプライスドナーおよびアクセプター部位は、ＡＡＶ１キャップＯＲＦでも同定されたことに注目されたい。

【図7B】ＡＡＶ３キャップ遺伝子に由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたイントロン。ｐＡＡＶ３－ｈｎＬＳＰ－ＭＣＳ－ＴＲＡＤＥ２は、ＭＶＭイントロン（ｈｎＬＳＰ）を有する肝臓特異的エンハンサー－プロモーターの下に置かれた野生型のＡＡＶ３キャップＯＲＦを運ぶプラスミドである。ＡＡＶ３キャップＯＲＦのヌクレオチド配列は、自然に同定されたＡＡＶ３と同様である。ＨｅｐＧ２細胞、ヒト肝癌細胞株は、プラスミドｐＡＡＶ３－ｈｎＬＳＰ－ＭＣＳ－ＴＲＡＤＥ２でトランスフェクトされた。その後、ＡＡＶ３キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲによって分析された。２つの切断したＲＴ－ＰＣＲ産物の配列は、ＰＣＲ産物の平滑末端ＴＯＰＯクローニング後のサンガー法シーケンシングによって決定され、それは、アンチセンスＡＡＶ３キャップＯＲＦ（パネルＡおよびＢ、配列番号：１９３）内で見つかったイントロンを明らかにした。イントロン配列は、下線の小文字である。最上流のスプライスドナー部位は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦで同定されたスプライスドナー部位のわずか３ｂｐ離れていると確認され、それは図６で点線で示される。最下流のスプライスアクセプター部位は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦの約８０ｂｐ上流に見つかる。ＡＡＶ３キャップＯＲＦで同定されたすべてのスプライスドナーおよびアクセプター部位は、ＡＡＶ１キャップＯＲＦでも同定されたことに注目されたい。

【図8A】さらなる潜在スプライスアクセプター部位はＡＡＶキャップＯＲＦで存在する。１２２の自然発生のＡＡＶ株（血清型および変異体）に由来したキャップ遺伝子のヌクレオチド配列は、多数の配列アラインメントプログラムを使用して整列される（配列番号：３１７－４２０）。ＡＡＶ９キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたスプライスアクセプター部位のエキソン－イントロン連結は、実線で示される。パネルＡの点線は、実験的に決定されたスプライスアクセプター部位の付近で代替の推定のスプライスアクセプター部位を示す。Ｔ’ｓのストレッチが後に続くＡＧ／ＴＣスプライスアクセプター部位は、スプライスアクセプター部位のエキソン－イントロン連結の共通の特徴であり、多くのＡＡＶ株にわたって非常によく保存される。ＡＡＶ３キャップＯＲＦがハイライトされている。パネルＡおよびＢで示されるＡＡＶ３キャップＯＲＦで同定されたスプライスアクセプター部位は、ＡＡＶ１キャップＯＲＦでも同定されている。ＡＡＶ５キャップＯＲＦに関しては、スプライシング事象は、アンチセンスｍＲＮＡ転写のいずれかの部位でも観察されていない。ＡＡＶ１、３、５および９、以外の血清型については、ＡＡＶキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡのスプライシング事象は現在調査中である。

【図8B】さらなる潜在スプライスアクセプター部位はＡＡＶキャップＯＲＦで存在する。１２２の自然発生のＡＡＶ株（血清型および変異体）に由来したキャップ遺伝子のヌクレオチド配列は、多数の配列アラインメントプログラムを使用して整列される（配列番号：３１７－４２０）。ＡＡＶ９キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたスプライスアクセプター部位のエキソン－イントロン連結は、実線で示される。パネルＡの点線は、実験的に決定されたスプライスアクセプター部位の付近で代替の推定のスプライスアクセプター部位を示す。Ｔ’ｓのストレッチが後に続くＡＧ／ＴＣスプライスアクセプター部位は、スプライスアクセプター部位のエキソン－イントロン連結の共通の特徴であり、多くのＡＡＶ株にわたって非常によく保存される。ＡＡＶ３キャップＯＲＦがハイライトされている。パネルＡおよびＢで示されるＡＡＶ３キャップＯＲＦで同定されたスプライスアクセプター部位は、ＡＡＶ１キャップＯＲＦでも同定されている。ＡＡＶ５キャップＯＲＦに関しては、スプライシング事象は、アンチセンスｍＲＮＡ転写のいずれかの部位でも観察されていない。ＡＡＶ１、３、５および９、以外の血清型については、ＡＡＶキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡのスプライシング事象は現在調査中である。

【図9】ＡＡＶキャップＯＲＦで存在するさらなる潜在的スプライスドナー部位。１２２の自然発生のＡＡＶ株（血清型および変異体）に由来したキャップ遺伝子のヌクレオチド配列は、多数の配列アラインメントプログラムを使用して整列される（配列番号：４２１－４６１）。ＡＡＶ３キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡで同定されたスプライスドナー部位のエキソン－イントロン連結は、実線で示される。この位置でのＧＴ／ＣＡスプライス・ドナー・コンセンサス配列は、ＡＡＶ株の半分のみによって保持される。このスプライスドナー部位は、ＡＡＶ１キャップＯＲＦで同定された。

【図10】ＡＡＶ１キャップＯＲＦで同定されたスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位。ＡＡＶ１キャップＯＲＦのヌクレオチド配列は示される（配列番号：１９４）。ＡＡＶ１キャップＯＲＦは、アンチセンス配向のヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞のｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーターによって発現された。その後、ＡＡＶ１キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲによって分析された。ＲＴ－ＰＣＲ産物の配列は、ＰＣＲ産物の平滑末端ＴＯＰＯクローニング後にサンガー法シーケンシングによって決定され、それは、ＡＡＶ１キャップＯＲＦ内に見つかったイントロンを明らかにした。アンチセンスＡＡＶ１キャップｍＲＮＡで同定されたエキソン－イントロン連結は、スプライスドナー部位のためにＡＧ／ＴＣ、およびスプライスアクセプター部位のためにＧＴ／ＣＡで示される。大文字のＡＧ／ＴＣおよびＧＴ／ＣＡは、それぞれイントロンの５’末端および３’末端のコンセンサス２ヌクレオチドである。スプライシングがＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡに起こるので、イントロン配列は、ＣＴ（スプライスアクセプター）とＡＣ（スプライスドナー）の間で、上記の配列の様々な組み合わせである。観察されたスプライスドナーおよびアクセプターの組み合わせに関する詳細情報は示されない。太字体で示されたエキソン－イントロン連結（ＣＴまたはＡＣ）の２つの保存されたヌクレオチドは、様々なＡＡＶ血清型にわたって高度に保存されるものである。下線されるエキソン－イントロン連結（ＣＴまたはＡＣ）の２つの保存されたヌクレオチドは、アンチセンスＡＡＶ３またはＡＡＶ９キャップｍＲＮＡ転写産物で同定されたものである。

【図11】ＡＡＶ９キャップＯＲＦのスプライシング抑制突然変異誘発。サイレント突然変異は、アンチセンスｍＲＮＡ転写産物上で観察されたスプライシングを抑制するために、ＡＡＶ９キャップＯＲＦのスプライスアクセプター（ＳＡ）部位および／またはスプライスドナー（ＳＤ）部位のまわりで導入される。天然の配列（配列番号：１９５、配列番号：１９６）のスプライシングされたイントロンは、下線で示される。ＡＡＶ９ＮＳ１ゲノム（配列番号：１９７）は、ＳＡ部位のまわりの１セットの突然変異を有する一方、ＡＡＶ９ＮＳ２ゲノム（配列番号：１９８）は、ＳＤ部位のまわりの１セットの突然変異を有する。ＡＡＶ９ＮＳ３ゲノムは、突然変異の両方のセットを有する。右の数は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦの第１ヌクレオチドに対するヌクレオチド位置を示す。

【図12】スプライスドナーおよび／またはアクセプター部位のまわりで導入された突然変異は、ＡＡＶ９キャップＯＲＦに由来したアンチセンスｍＲＮＡのスプライシングを有効に抑制する。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、ＴＲＡＤＥ構成にＡＡＶ９キャップＯＲＦおよび様々な潜在的にスプライシング抑制突然変異（ＮＳ１－３）を含むプラスミドでトランスフェクトされた。ＲＮＡは、トランスフェクションの３日後に採取され、ＲＴ－ＰＣＲは、キャップＯＲＦ配列全体を回収することができる１セットのＰＣＲプライマーで実施された。図４で見られた結果に全く対照的に、全長のアンプリコンは成功裡に回収された。ＮＳ１、コドン修飾スプライスアクセプターを有するＡＡＶ９－ＴＲＡＤＥベクターゲノム。ＮＳ２、コドン修飾スプライスドナーを有するＡＡＶ９－ＴＲＡＤＥベクターゲノム。ＮＳ３、コドン修飾スプライスアクセプターおよびスプライスドナーを有するＡＡＶ９－ＴＲＡＤＥベクターゲノム。ＰＣ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥベクターゲノム配列を含むプラスミド鋳型を使用する陽性対照；ＮＣ、鋳型ＰＣＲ性対照なし。

【図13A】全身的なＡＡＶベクター注射後の脳ニューロン形質導入のための増強されたＡＡＶ変異体を同定するＴＲＡＤＥの適用のための研究設計。ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－ＰｅｐＬｉｂベクターゲノムのマップ。ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーターは特異的にニューロン中で発現を誘導するために利用される。肝臓標的解除ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａキャップ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８０５０）は、ＡＡＶライブラリー生成のためのプラットフォームとして機能する。（ＮＮＫ）８でコードされ、かつグリシン・セリン・リンカー（配列番号：２）によって隣接される、ランダムの８つのアミノ酸ペプチドは、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａキャップ配列（配列番号：２２２）のＱ５８８に置換された。

【図13B】全身的なＡＡＶベクター注射後の脳ニューロン形質導入のための増強されたＡＡＶ変異体を同定するＴＲＡＤＥの適用のための研究設計。プラスミドライブラリーは、トリプルトランスフェクションプロトコルを使用して、ＡＡＶライブラリーを産生するために使用された。ライブラリーは、ＰＥＧ沈澱反応および２回のＣｓＣｌ超遠心分離を通じて精製され、その後、３×１０１１ｖｇ／マウスの投与量で尾静脈を介して注入された。脳組織は、注射１２日後に採取された。ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌを使用して、回収され、およびＲＴ－ＰＣＲは、ペプチド挿入を含むキャップの断片を回収するために使用され、それはその後、ＡＡＶベクタープラスミド骨格に再クローンされた。これは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて３回の選択のために反復された。平行して、１回の選択は、２．７×１０^１２ｖｇ／ｋｇの投与量を使用して、アカゲザルにおいて実施された。

【図14A】マウスおよび非ヒト霊長類におけるＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列による２６の新しいＡＡＶキャプシドのニューロン形質導入の検証。二本鎖（ｄｓ）ＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣベクターのマップ。１対の２つの１２ヌクレオチドの長さのＤＮＡバーコード（ＶＢＣｘ－ＬおよびＶＢＣｘ－Ｒ）は、ヒトシナプシンＩ（ｈＳｙｎＩ）遺伝子エンハンサー－プロモーターの下に置かれる。これらの２つのウイルスバーコード（ＶＢＣ）は、特異的にｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーターが能動的である細胞（つまりニューロン）の転写産物として発現することができる。

【図14B】マウスおよび非ヒト霊長類におけるＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列による２６の新しいＡＡＶキャプシドのニューロン形質導入の検証。ＴＲＡＤＥによって同定された、２６の新しいＡＡＶ変異体、ＨＮ１～ＨＮ２６（マウスにおいて同定された５つの変異体、および非ヒト霊長類において同定された２１の変異体）およびＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウスの３つの対照ＡＡＶキャプシド（ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）のニューロン形質導入。ＴＲＡＤＥによって同定された２６の新しいＡＡＶ変異体（マウスにおいてＴＲＡＤＥによって同定された５つの変異体、および非ヒト霊長類においてＴＲＡＤＥによって同定された２１の変異体）および対照ＡＡＶキャプシド（ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）を含むＤＮＡ／ＲＮＡバーコード化されたｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣライブラリー（ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂ）は、１匹のマウス当たり５×１０^１１ｖｇの投与量で３匹の成体オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび３匹の成体オスのＢＡＬＢｃＪマウスに静脈内注射された。注射２週間後に様々な組織が採取され、およびＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列によってＡＡＶベクターゲノム転写産物レベルで形質導入が分析された。形質導入レベルは、参照対照、ＡＡＶ９に対して表現型差異（ＰＤ）の値として発現される。ＨＮ１～ＨＮ２６変異体のＡＡＶキャプシドアミノ酸配列情報については、表３を参照する。

【図14C】マウスおよび非ヒト霊長類におけるＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列による２６の新しいＡＡＶキャプシドのニューロン形質導入の検証。アカゲザルの海馬の２６の新しいＡＡＶ変異体、および３つの対照ＡＡＶキャプシドのニューロンの形質導入。同じＤＮＡ／ＲＮＡバーコード化ＡＡＶライブラリーは、２×１０^１３ｖｇ／ｋｇの投与量で１匹の若いオスのアカゲザルに静脈内に注射された。注射２週間後に様々な脳領域が採取され、およびＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列によって形質導入が分析された。

【図14D】マウスおよび非ヒト霊長類におけるＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列による２６の新しいＡＡＶキャプシドのニューロン形質導入の検証。３つのＴＲＡＤＥ変異体、ＨＮ１、ＨＮ２およびＨＮ３およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの相対的なニューロン形質導入の効率は、パネルＣに使用された１匹のアカゲザルの１２の様々な脳領域においてＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列によって分析された。パネルＢ、ＣおよびＤでは、点線は、ＡＡＶ９のＰＤ値（つまり、１．０）を示す。

【図15A】従来のｅＧＦＰレポーターベクターおよび組織学的定量化を使用してマウスのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の増強されたニューロン形質導入の検証。我々は、ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーター（ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ｅＧＦＰ）の制御下でｅＧＦＰを発現する自己相補的ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターを産生した。精製されたベクターは、３×１０^１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝４マウス／ベクター／マウス株）へと尾静脈を介して投与された。注射３週間後、マウスは４％のパラホルムアルデヒドで経心的にかん流させられ、および脳組織は免疫組織化学的検査のために処理された。自己相補的なｈＳｙｎＩ－ｅＧＦＰベクターゲノムのマップ。

【図15B】従来のｅＧＦＰレポーターベクターおよび組織学的定量化を使用してマウスのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の増強されたニューロン形質導入の検証。我々は、ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーター（ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ｅＧＦＰ）の制御下でｅＧＦＰを発現する自己相補的ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターを産生した。精製されたベクターは、３×１０^１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝４マウス／ベクター／マウス株）へと尾静脈を介して投与された。注射３週間後、マウスは４％のパラホルムアルデヒドで経心的にかん流させられ、および脳組織は免疫組織化学的検査のために処理された。抗ＧＦＰ抗体で染色された矢状断面の代表的なタイルスキャン画像。

【図15C】従来のｅＧＦＰレポーターベクターおよび組織学的定量化を使用してマウスのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の増強されたニューロン形質導入の検証。我々は、ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーター（ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ｅＧＦＰ）の制御下でｅＧＦＰを発現する自己相補的ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターを産生した。精製されたベクターは、３×１０^１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝４マウス／ベクター／マウス株）へと尾静脈を介して投与された。注射３週間後、マウスは４％のパラホルムアルデヒドで経心的にかん流させられ、および脳組織は免疫組織化学的検査のために処理された。４つの脳領域のｅＧＦＰおよびＮｅｕＮを発現する細胞の自動計算に基づく（Ｂ）のニューロン形質導入の定量化。

【図15D】従来のｅＧＦＰレポーターベクターおよび組織学的定量化を使用してマウスのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の増強されたニューロン形質導入の検証。我々は、ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーター（ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ｅＧＦＰ）の制御下でｅＧＦＰを発現する自己相補的ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターを産生した。精製されたベクターは、３×１０^１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝４マウス／ベクター／マウス株）へと尾静脈を介して投与された。注射３週間後、マウスは４％のパラホルムアルデヒドで経心的にかん流させられ、および脳組織は免疫組織化学的検査のために処理された。（Ｂ）および（Ｃ）の自動計算プロセスの検証。視覚野の代表的な２０Ｘ共焦点画像が示される。スケールバーは１００μｍである。

【図15E】従来のｅＧＦＰレポーターベクターおよび組織学的定量化を使用してマウスのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の増強されたニューロン形質導入の検証。我々は、ｈＳｙｎＩエンハンサー－プロモーター（ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ｅＧＦＰ）の制御下でｅＧＦＰを発現する自己相補的ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターを産生した。精製されたベクターは、３×１０^１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝４マウス／ベクター／マウス株）へと尾静脈を介して投与された。注射３週間後、マウスは４％のパラホルムアルデヒドで経心的にかん流させられ、および脳組織は免疫組織化学的検査のために処理された。ｅＧＦＰおよびＮｅｕＮを発現する細胞の盲検観察者による手集計に基づいく（Ｄ）のニューロン形質導入の定量化。エラーバーは、＋／－平均値の標準誤差（ＳＥＭ）＊＊＊ｐ＜０．００１を示す。

【図16A】エピトープ標識ｅＧＦＰレポーターベクターを使用してアカゲザルのＡＡＶ９に対して増強されたＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の形質導入の検証。この研究に使用されたＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰベクター。我々は４つのＡＡＶベクターを産生した：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＦＬＡＧｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＨＡｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂ、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１－ＣＡＧ－ＦＬＡＧｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂ、およびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１－ＣＡＧ－ＨＡｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂ。ｎｌｓＧＦＰ（ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来した核定位シグナルを有するｅＧＦＰ）は、Ｎ末端のＦＬＡＧタグまたはＨＡタグのいずれかで標識された。各ベクターは、９つの様々なＤＮＡ／ＲＮＡバーコード化ウイルスクローンのおよそ１対１の混合物を含むＤＮＡ／ＲＮＡバーコード化ライブラリーであったが、この特徴はこの研究で使用されなかった。パネルＡで描写された上部半分の２つのベクターは、ＡＡＶライブラリー１（ＡＡＶＬｉｂ１）を作るために１：１の比率で混合され、および下部半分の２つのベクターは、ＡＡＶライブラリー２（ＡＡＶＬｉｂ２）を作るために１：１の比率で混合された。この実験スキームでは、ＡＡＶＬｉｂ１およびＡＡＶＬｉｂ２の各々は、１：１の比率でエピトープ標識ｎｌｓＧＦＰを発現するＡＡＶ９およびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターを含むが、キャプシド－エピトープ関係は下流質量スペクトル分析で潜在的抗体バイアスを回避するために反転されている。

【図16B】エピトープ標識ｅＧＦＰレポーターベクターを使用してアカゲザルのＡＡＶ９に対して増強されたＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の形質導入の検証。ＡＡＶＬｉｂを受け入れる１匹の動物の代表的なタイルスキャンされた脳の断面。各ＡＡＶライブラリーは、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇの投与量で若いアカゲザルへ静脈内に投与された。組織は、注射３週間後に採取され、４ｍｍのスラブに切られ、４％のパラホルムアルデヒドで固定され、および免疫組織化学法のために抗ＧＦＰ、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ抗体で処理された。ｅＧＦＰ発現は、細胞がＡＡＶ９またはＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１のいずれか、あるいは両方によって形質導入されたことを示す。ＦＬＡＧ着色は、ＡＡＶ９キャプシドが形質導入を媒介したことを示す一方、ＨＡ着色は、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１が形質導入を媒介したことを示す。右上の挿入紙、運動皮質、右下の挿入紙、被殻。この実験は、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１が、脳細胞をＡＡＶ９と比較して、強力なニューロン屈性を有してＡＡＶ９より数倍良く形質導入することを明らかにした。したがって、ニューロン形質導入を考慮する限り、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１はＡＡＶ９よりはるかに高いニューロン形質導入を媒介する。

【図17A】マウスおよびアカゲザルにおける全身的な送達後の主要な末梢器官へのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の生体内分布。我々は、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（パネルＡ、ＢおよびＣ）に含まれた各ＡＡＶキャプシドによって送達された、各々の末梢器官のＡＡＶベクターゲノムＤＮＡの相対存在量を決定するためにＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列を使用した。上記に説明されるように、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーは、対照、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２ＡおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとともに、マウスおよび非ヒト霊長類においてＴＲＡＤＥによって同定された２６のＡＡＶ変異体を含んでいた。ＤＮＡは、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（表３を参照）の投与後に様々な組織から抽出され、ＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列分析にかけられた。さらに、我々は、図１６Ａ（パネルＤ）で描写されたｓｓＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーで静脈注射されたアカゲザルの各々の末梢器官のＡＡＶ９と比較して相対的な形質導入効率を決定するためにＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列を使用した。ＡＡＶ９に対するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスおよびアカゲザルにおけるＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＴＲＡＤＥ変異体の肝臓に対する生体内分布。

【図17B】マウスおよびアカゲザルにおける全身的な送達後の主要な末梢器官へのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の生体内分布。我々は、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（パネルＡ、ＢおよびＣ）に含まれた各ＡＡＶキャプシドによって送達された、各々の末梢器官のＡＡＶベクターゲノムＤＮＡの相対存在量を決定するためにＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列を使用した。上記に説明されるように、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーは、対照、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２ＡおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとともに、マウスおよび非ヒト霊長類においてＴＲＡＤＥによって同定された２６のＡＡＶ変異体を含んでいた。ＤＮＡは、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（表３を参照）の投与後に様々な組織から抽出され、ＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列分析にかけられた。さらに、我々は、図１６Ａ（パネルＤ）で描写されたｓｓＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーで静脈注射されたアカゲザルの各々の末梢器官のＡＡＶ９と比較して相対的な形質導入効率を決定するためにＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ｎ＝３マウス／株）におけるＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の肝臓以外の主要な末梢器官に対する生体内分布。

【図17C】マウスおよびアカゲザルにおける全身的な送達後の主要な末梢器官へのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の生体内分布。我々は、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（パネルＡ、ＢおよびＣ）に含まれた各ＡＡＶキャプシドによって送達された、各々の末梢器官のＡＡＶベクターゲノムＤＮＡの相対存在量を決定するためにＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列を使用した。上記に説明されるように、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーは、対照、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２ＡおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとともに、マウスおよび非ヒト霊長類においてＴＲＡＤＥによって同定された２６のＡＡＶ変異体を含んでいた。ＤＮＡは、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（表３を参照）の投与後に様々な組織から抽出され、ＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列分析にかけられた。さらに、我々は、図１６Ａ（パネルＤ）で描写されたｓｓＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーで静脈注射されたアカゲザルの各々の末梢器官のＡＡＶ９と比較して相対的な形質導入効率を決定するためにＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列を使用した。ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣ分析に基づくアカゲザル（ｎ＝１）におけるＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の肝臓以外の主要な末梢器官に対する生体内分布。この実験のために、ＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列分析は、図１４Ｄで示されるｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーを注射された１匹のアカゲザルから採集されたサンプルで実施された。

【図17D】マウスおよびアカゲザルにおける全身的な送達後の主要な末梢器官へのＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の生体内分布。我々は、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（パネルＡ、ＢおよびＣ）に含まれた各ＡＡＶキャプシドによって送達された、各々の末梢器官のＡＡＶベクターゲノムＤＮＡの相対存在量を決定するためにＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列を使用した。上記に説明されるように、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーは、対照、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－Ｎ２７２ＡおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとともに、マウスおよび非ヒト霊長類においてＴＲＡＤＥによって同定された２６のＡＡＶ変異体を含んでいた。ＤＮＡは、ｄｓＡＡＶ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリー（表３を参照）の投与後に様々な組織から抽出され、ＡＡＶ ＤＮＡバーコード－配列分析にかけられた。さらに、我々は、図１６Ａ（パネルＤ）で描写されたｓｓＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂライブラリーで静脈注射されたアカゲザルの各々の末梢器官のＡＡＶ９と比較して相対的な形質導入効率を決定するためにＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列を使用した。ｓｓＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰ－ＢＣ分析に基づくアカゲザル（ｎ＝２）におけるＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１の肝臓以外の主要な末梢器官に対する生体内分布。この実験のために、ＡＡＶ ＲＮＡバーコード－配列分析は、図１６Ａで示されるｓｓＡＡＶ－ＧＡＧ－ｎｌｓＧＦＰ－ＢＣＬｉｂベクターを注射されたアカゲザルから採集されたサンプル上で実施された。エラーバーは、＋／－平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１キャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドと比較して、より低い程度まで末梢器官を形質導入した。

【図18A】ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１は、マウスにおいて全身投与後で高度な神経向性を有する。強力なユビキタスＣＡＧプロモーターの制御下でｎｌｓＧＦＰを発現するＡＡＶ９およびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターは、３×１０１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃＪマウスに静脈内に注射された。組織は、注射１２日後で採取され、抗ＧＦＰおよび抗ＮｅｕＮ抗体で免疫染色することによって分析された。この研究で使用される一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰベクターゲノムのマップ。

【図18B】ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１は、マウスにおいて全身投与後で高度な神経向性を有する。強力なユビキタスＣＡＧプロモーターの制御下でｎｌｓＧＦＰを発現するＡＡＶ９およびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターは、３×１０１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃＪマウスに静脈内に注射された。組織は、注射１２日後で採取され、抗ＧＦＰおよび抗ＮｅｕＮ抗体で免疫染色することによって分析された。ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰで形質導入されたマウス大脳皮質の代表的な画像。さらに、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１－ＣＡＧ－ｎｌｓＧＦＰで形質導入された広大な大半の細胞は、ニューロンマーカーＮｅｕＮにも陽性である。スケールバーは１００μｍである。

【図18C】ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１は、マウスにおいて全身投与後で高度な神経向性を有する。強力なユビキタスＣＡＧプロモーターの制御下でｎｌｓＧＦＰを発現するＡＡＶ９およびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１ベクターは、３×１０１１ｖｇ／マウスの投与量で８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃＪマウスに静脈内に注射された。組織は、注射１２日後で採取され、抗ＧＦＰおよび抗ＮｅｕＮ抗体で免疫染色することによって分析された。ＡＡＶ９およびＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１キャプシドのニューロン特異性。ニューロンの特異性の定量化は、二重陽性の細胞（ｅＧＦＰ＋／ＮｅｕＮ＋）の数をＧＦＰ＋細胞の合計数で割ることによって決定された。ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＨＮ１は、ＡＡＶ９（５６％）と比較して、ニューロン（９６％）に高度に特異的である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＲＡＤＥシステムを提供し、それは、細胞型特異的またはユビキタスの方法で発現されたキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡを使用して、ＡＡＶキャプシドの定方向進化を可能にする。そのようなシステムは、Ｃｒｅトランスジェニック動物を必要としない。したがって、それは、Ｃｒｅトランスジェニック株が容易に利用可能でない非ヒト霊長類を含む大きい動物の細胞型特異的ＡＡＶキャプシド進化に適用され得る。いずれかの細胞型特異的または組織／器官特異的エンハンサー－プロモーターまたはユビキタスエンハンサー－プロモーターは、形質転換を必要とせず容易にシステムに適用され得る。細胞型特異的選択は、ｍＲＮＡレベルで与えられる。ある実施形態では、複数の定方向進化スキームは、１つの定方向進化スキームに組み合わせられてもよい。例えば、細胞型特異的導入遺伝子ｍＲＮＡ発現に基づくニューロン特異的ＡＡＶキャプシド、アストロサイト特異的ＡＡＶキャプシド、オリゴデンドロサイト特異的ＡＡＶキャプシドおよびミクログリア特異的ＡＡＶキャプシドの選択は、1匹の動物において同時に実施され得る。

【0015】

いくつかの実施形態では、本開示は、センス鎖ＴＲＡＤＥシステムを提供し、それは、標的細胞のＡＡＶキャプシドタンパク質を発現可能な細胞型特異的またはユビキタス方法で発現されたキャップＯＲＦのｍＲＮＡを使用して、ＡＡＶキャプシドの定方向進化を可能にする。センス鎖ＴＲＡＤＥは、ここで、データで紹介されるアンチセンス鎖ＴＲＡＤＥの同じ利点を有しており、それは、Ｃｒｅトランスジェニック動物を必要としないこと、細胞型特異的選択はｍＲＮＡレベルで与えられること、および複数の定方向進化スキームを1匹の動物において行われる１つの定方向進化に組み合わせられ得ることである。しかしながら、見込まれる損失は、免疫原ＡＡＶキャプシドタンパク質が標的細胞中で不可避的に持続的に発現される場合があり、それは、キャプシド選択工程の望ましくない結果をもたらす場合がある。

【0016】

いくつかの実施形態では、本開示はさらに新しいＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、これらの新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてＡＡＶ９より何倍よく脳ニューロンを形質導入することができる。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてＡＡＶ９より最大８倍よく形質導入された。ニューロン形質導入レベルは、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂで得られたレベルに到達しない場合があっても、ＡＡＶ９と比較して、非常に増強される場合がある。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、脳ニューロンをＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂより効率的に形質導入する場合がある。

【0017】

いくつかの実施形態では、本開示は、静脈内注射後にＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＡＡＶ９より何倍よく脳ニューロンを形質導入することができる新しいＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＡＡＶ９より脳ニューロンを最大７倍よく形質導入することができる。形質導入レベルはＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂよりはるかに高い。

【0018】

いくつかの実施形態では、本開示は、静脈内注射後にアカゲザルにおいてＡＡＶ９より何倍よく脳ニューロンを形質導入することができる新しいＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にアカゲザルにおいてＡＡＶ９より脳ニューロンを最大４倍よく形質導入することができる。これらの形質導入レベルは、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂより良い。

【0019】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶ９より数倍よくニューロンの細胞マーカ発現で肺細胞を形質導入し得るＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、そのような細胞をＡＡＶ９より最大１７倍よく形質導入することができる。

【0020】

いくつかの実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは肝臓標的解除表現型を示す。

【0021】

いくつかの実施形態では、本開示は、アンチセンス方向に発現される時スプライシングされないコドン修飾ＡＡＶキャップ配列を提供する。我々は、未修飾ＡＡＶキャップＯＲＦがアンチセンス方向に発現された時（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３およびＡＡＶ９）、スプライシングされると観察した。これに対して、本開示に記載されるコドン修飾ＡＡＶキャップＯＲＦのうちのいくつかはスプライシングされない。推定上のスプライスドナーおよびアクセプター部位に関する我々が展開した知識に基づいて、そのようなスプライシングされていないＡＡＶキャップＯＲＦのバージョンを設計することは可能になった。そのようなスプライシングされていないキャップＯＲＦの使用は、キャップ遺伝子の突然変異誘発がキャップＯＲＦの幅広い領域上に起こるときＴＲＡＤＥシステムを使用して、定方向進化に使用されてもよい。

【0022】

本明細書で使用されるような用語「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶのコンポーネントを含む、またはＡＡＶのコンポーネントに由来する任意のベクターを意味し、脳、心臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓または膵臓などの多くの組織型のうちのいずれかの、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞をインビトロまたはインビボ感染させることに適切である。用語「ＡＡＶベクター」は、少なくとも対象タンパク質をコードする核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子（またはビリオン）を呼ぶために使用されてもよい。

【0023】

さらに、本明細書に開示されるＡＡＶは、血清型の組み合わせ（例えば、「偽型」ＡＡＶ）を含む様々な血清型、または様々なゲノム（例えば、一本鎖または自己補正的）に由来してもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはタンパク質変異体を含んでもよい。本明細書で使用されるような「変異体」は、１つ以上のアミノ酸によって変更されるアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されたアミノ酸が、類似した構造的または化学的性質を有する「保守的な」変化、例えば、ロイシンをイソロイシンで置き換えることを有してもよい。代替的に、変異体は「非保守的」変化、例えば、グリシンをトリプトファンで置き換えることを有してもよい。類似した小さな変更は、さらにアミノ酸の欠失または挿入、あるいは両方を含んでもよい。

【0024】

本開示のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドなどのヌクレオチド配列は、本明細書に提供される。本開示のヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかからなり得る。本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対して配列で相補的ポリヌクレオチドをさらに包含する。

【0025】

遺伝子コードの縮退のため、多様な様々なポリヌクレオチドの配列は、本開示のタンパク質をコードすることができる。加えて、それは、本明細書に開示されるタンパク質と同様の、または本質的に同様のものをコードする、代替的ポリヌクレオチド配列を作成するように当技術分野において訓練された人の技術において適切である。これらの変異体または代替的ポリヌクレオチド配列は、本開示の範囲内である。本明細書で使用されるように、「本質的に同様の配列」の言及は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの検出力を除去しないアミノ酸の置換、欠失、添加または挿入をコードする１つ以上の配列を呼ぶ。

【0026】

本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体をさらに含む。変異体配列は、配列の１つ以上のペプチドまたはヌクレオチドが置換され、欠失させられおよび／または挿入された配列を含む。

【0027】

本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの特定の同一性および／または類似性の観点から定義され得る。配列同一性は、典型的に６０％上回り、好ましくは７５％上回り、さらに好ましくは８０％上回り、さらにいっそう好ましくは９０％上回り、および９５％上回ることがあり得る。配列の同一性および／または類似性は、本明細書に開示される配列と比較して、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。別段の定めがない限り、本明細書で使用されるように、２つの配列のパーセント配列同一性および／または類似性は、（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）で修飾されたようなＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムを使用して決定され得る。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。ＢＬＡＳＴ検索は、所望のパーセント配列同一性を有する配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施され得る。比較の目的のためにギャップされた（ｇａｐｐｅｄ）アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）に記載されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。

【0028】

本明細書に開示されるようなＡＡＶベクターを産生する方法は、例えば、パッケージング細胞、補助のウイルスまたはプラスミド、および／またはバキュロウイルスシステムの使用の方法を含んで、当技術分野において公知されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３，３８２２（１９８９）；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２２２４（１９９８）；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，７０２４（１９９８）；ＷＯ１９９８／０２２６０７；およびＷＯ２００５／０７２３６４を参照。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、キメラ（例えば、偽型）ＡＡＶウイルスを産生するためにともに混合され得るまたは他のタイプのウイルスと混合され得るＡＡＶの様々な血清型から調製または由来され得る。

【0029】

インビボの投与上、それらの免疫原性を減少させるために、偽型ＡＡＶベクターを産生する方法（例えば、ＷＯ００／２８００４を参照）とともに、ＡＡＶベクターの様々な修飾または製剤も知られている（例えば、ＷＯ０１／２３００１；ＷＯ００／７３３１６；ＷＯ０４／１１２７２７；ＷＯ０５／００５６１０；またＷＯ９９／０６５６２を参照）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、キメラ（例えば、偽型）ＡＡＶウイルスを産生するために、ともに混合される、または他のタイプのウイルスと混合されてもよいＡＡＶの様々な血清型から調製されるまたはそれに由来してもよい。

【0030】

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはヒト血清型ＡＡＶベクターであってもよい。そのような実施形態では、ヒトＡＡＶは、任意の既知の血清型、例えば、血清型１－１１のうちのいずれか１つの、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９に由来してもよい。

【0031】

本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、対象タンパク質をコードする核酸を含んでもよい。様々な実施形態では、核酸は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム導入部位（「ＩＲＥＳ」）、タンパク質形質導入ドメイン（「ＰＴＤ」）をコードする配列、２Ａペプチド等などの対象タンパク質の発現、およびいくつかの実施形態では分泌を可能にする、１つ以上の制御配列をさらに含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、核酸は、感染細胞に対象タンパク質の発現を引き起こすまたは改善するために、コード配列に動作可能に連結したプロモーター領域を含んでもよい。そのようなプロモーターは、例えば、感染した組織でタンパク質の効率的で安定した産生を可能にするために、ユビキタス、細胞または組織に特異的、強く、弱く、調節された、キメラなどであってもよい。一般的に、開示された方法の使用プロモーターは、ヒト細胞において官能性であるが、プロモーターは、コードされたタンパク質に対して相同であってもよく、または異種であってもよい。調節されたプロモーターの例は、限定されることなく、テトオン／オフ要素含有のプロモーター、ラパマイシン誘導可能なプロモーター、タモキシフェン誘導可能なプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。使用されてもよい他のプロモーターは、腎臓、脾臓および膵臓などの組織に組織特異的プロモーターを含む。ユビキタスプロモーターの例は、ウイルスプロモーター、具体的にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、およびホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびβ－アクチンプロモーターなどの細胞のプロモーターを含む。

【0032】

本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、１つ以上のフィードバック要素は、対象タンパク質の過剰発現を弱めるために使用されてもよい。例えば、ＡＡＶベクターのいくつかの実施形態は、外因性の転写産物を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡ配列を含んでもよい。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、抑制的な転写因子によって認識され得る、１つ以上のさらなるプロモーターを含んでもよい。様々な実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、生理的なレベルで対象タンパク質の発現レベルを維持し得る恒常性フィードバックループを作成し得る構築物を含んでもよい。

【0033】

本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、ゲノムを編集する機構は、部位特異的な方法で細胞ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ転写産物を遺伝子的に修飾するために使用されてもよい。Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６８，２０－３６（２０１７）；およびＫａｔｒｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：２３９－２４２，２０１９。例えば、ＡＡＶベクターのいくつかの実施形態は、部位特異的な方法で細胞の核酸を修飾するために、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲに関連された酵素、ＤＮＡ塩基エディター、ＲＮＡエディターゼ（ｅｄｉｔａｓｅ）および／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでもよい。さらに、ＡＡＶベクターは、ゲノム編集のための相同性修復鋳型（ＨＤＲ）を含んでもよい。

【0034】

様々な実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、コードされたタンパク質の分泌を可能にする先導配列を含む場合がある核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子と、分泌シグナルペプチド（通常、分泌されたポリペプチドのＮ末端に位置する）をコードする配列との融合は、形質導入された細胞から分泌され得る形態の治療用タンパク質の産生を可能にする場合がある。そのようなシグナルペプチドの例は、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、またはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含む。

【0035】

本明細書に記載されるように、脳、心臓、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、または膵臓において治療用の対象タンパク質の効率的および長期的な発現は、ＡＡＶ９配列を有する非ＡＡＶ９ベクターなどの特定のＡＡＶベクターの末梢投与を通じて非侵襲性技術を用いて達成することができる。そのような末梢投与は、脳、心臓、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、または膵臓へ直接注入を必要としない任意の投与経路を含んでもよい。より具体的に、末梢投与は、筋肉内注射、血管内（静脈内などの）注射、腹腔内注射、動脈内注射、または皮下注射などの全身的注射を含んでもよい。いくつかの実施形態では、末梢投与は、さらに経口投与（例えば、ＷＯ９６／４０９５４を参照）、植込剤を使用する送達（例えば、ＷＯ０１／９１８０３を参照）、または呼吸器システムによる点滴注入による投与、例えば、噴霧剤、エアゾール剤または他の適切な製剤の使用を含んでもよい。

【0036】

様々な実施形態では、ＡＡＶベクターの所望の投与量は、例えば、病状、被験体、治療スケジュールなどに応じて当業者によって適合されてもよい。いくつかの実施形態では、投与当たり１０^５～１０^１２のウイルスゲノム、例えば、１０^６～１０^１１、１０^７～１０^１１、１０^８～１０^１１が投与される。他の実施形態では、治療効果を達成するための例示的な投与は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、または１０^１１ウイルスゲノムのウイルス力価を含むことがある。ウイルス力価は、形質導入単位の観点では発現されてもよく、それは当業者によって容易に計算されてもよい。

【0037】

様々な実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、任意の適切な形態で、例えば、液体溶液または懸濁液のいずれとして、注射の前に液体の溶解または懸濁に適している固体形態として、ゲル、またはエマルジョンとして投与されてもよい。ベクターは、任意の適切で薬学的に許容可能な賦形剤、キャリヤ、アジュバント、希釈液などで製剤されてもよい。例えば、注射については、適切なキャリヤまたは希釈液は、等張液、緩衝液、無菌および発熱物質なしの水、または例えば、無菌・発熱物質なしのリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。吸入剤については、キャリヤは微粒子の形態であってもよい。

【0038】

ベクターは、「治療上有効な」量で、例えば、疾患状態に関連した症状の少なくとも１つを緩和する（例えば、減少する、縮小する）、または被験体の状態の改善を提供することに十分な量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、反復投与が、例えば、同じまたは異なる末梢投与経路および／または、同じベクターまたは明確なベクターを使用して、実施されてもよい。

【実施例0039】

以下の実施例は説明のみを目的とする。本開示に照らして、当業者は、これらの実施例の変形および開示される主題の他の実施形態が、過度の実験無しに可能であることを認識するであろう。

【0040】

全身性送達後に脳ニューロンを効率的に形質導入する、新しいＡＡＶキャプシドを同定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとアカゲザルの両方に、ＴＲＡＤＥシステムを適用した。ＴＲＡＤＥシステムは、ＩＴＲ配列によって隣接される、重なり合った、２シストロン性のＡＡＶゲノムを含むプラスミド構築物を利用する（図２Ａ）。センス方向では、ＡＡＶ２ ｐ４０プロモーターは、ＡＡＶキャップ遺伝子の発現を誘導して、ウイルス粒子の効率的な産性を促進する（図２Ｂ）。アンチセンス方向では、細胞型に特異的なエンハンサープロモーター（例えば、ヒトシナプシＩ（ｈＳｙｎＩ）エンハンサープロモーター）は、ＧＦＰと、ＡＡＶ２ゲノムに存在するイントロンに埋め込まれるポリアデニル化シグナル（ポリＡ）で終結するアンチセンスキャップ配列とをコード化する、転写産物の発現を誘導する（図２Ｂ）。ＴＲＡＤＥ構築物をクローニングバックボーン（ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ）として利用し、グリシン・セリン・リンカー（５’－ＧＧＧＳ；３’－ＧＧＧＧＳ）と共に、ＡＡＶ９キャプシドのＱ５８８位で置換される無作為の８量体ペプチドを含む、肝臓－標的解除（ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ）ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８０５０）キャップ遺伝子プラットフォームに基づいて、ＡＡＶライブラリーを生成した。特定の細胞型（ニューロンなど）におけるインビボ選択は、ＲＴ－ＰＣＲによって脳組織から、アンチセンスキャップＯＲＦ ｍＲＮＡとしてキャプシド配列を回収することによって実行された。この方法は、回収された配列が、対象の感染細胞におけるＲＮＡ発現を仲介することができる、ＡＡＶ変異体に由来するのみであることを保証する。ｈＳｙｎＩエンハンサープロモーターが使用される場合、ニューロンを形質導入することができるＡＡＶキャプシドの配列のみが取り出され、そのため、ＡＡＶキャプシドのニューロンに特異的な選択を可能にする。

【0041】

最初に、ＴＲＡＤＥシステムが、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥベクターを使用して、細胞型に特異的なアンチセンスｍＲＮＡからＡＡＶキャップ遺伝子の配列を回収する能力をテストした（図３）。ｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター誘導ＧＦＰ発現カセットは、ＴＲＡＤＥ構成のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシド遺伝子含有ＡＡＶベクターゲノムに取り込まれた（図３Ａ）。このベクターゲノムはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドの中へパッケージ化され、そして、結果として生じるＡＡＶベクターは、２匹の８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内注射された（図３Ｂ）。注射の１２日後に、脳組織が採取された。４％のパラホルムアルデヒドで固定された組織が、免疫蛍光顕微鏡検査法によって分析された。取り外された組織は、ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲ分析のために利用された。ｅＧＦＰがニューロンでのみ発現する（図３Ｃと３Ｄ）ことを確認し、このことは、キャップ遺伝子から転写されたアンチセンスｍＲＮＡが、細胞型に特異的な方法で発現することを示す。キャップ遺伝子のアンチセンスのｍＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲによって効率的に回収した（図３Ｅ）。アンチセンスｍＲＮＡに固有なスプライス連結のサンガー法で、ＲＴ－ＰＣＲ産物が実際にｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター活性化アンチセンスｍＲＮＡに由来していたことが確認された（図３Ｆ）。さらに、サンガー法によって、ＰＨＰ．Ｂペプチド挿入の配列が確認された（図３Ｆ）。それと共に、これらの観察は、ＡＡＶベクター形質導入脳ニューロンにおいて発現したｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター誘導アンチセンスｍＲＮＡから、ＡＡＶキャップ配列を成功裡に回収する、ＴＲＡＤＥシステムの能力を確立した。

【0042】

ＴＲＡＤＥシステムの成功的確率によって、２つのＡＡＶキャプシド指向進化実験を実施した；一方は８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用し、そして他方は８か月齢のオスのアカゲザルを使用した。Ｑ５８８の位置でＧＧＧＳ（Ｎ_８）ＧＧＧＧＳ（配列番号：２）ペプチド挿入を有するＡＡＶ９由来の突然変異体キャプシドで構成される、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂライブラリーを作り出し、ここで、Ｎ_８は、（ＮＮＫ）_８によってコード化された無作為の８量体ペプチドを表わす。ペプチド挿入については、Ｑ５８８が各ペプチド配列で置換された。ＡＡＶライブラリーの多様性は、少なくとも１０^７だった。マウス指向進化実験では、ＡＡＶライブラリーを、マウス１匹あたり３×１０^１１のベクターゲノム（ｖｇ）の投与量で、尾静脈を介して注射した。２回目の選択については、２匹のマウスを使用して、１×１０^１２、１×１０^１１、１×１０^１０、または１×１０^９のベクターゲノム（ｖｇ）の投与量で、ＡＡＶライブラリー注射した。３回目の選択については、２匹のマウスを使用して、１×１０^１１ｖｇの投与量で、ＡＡＶライブラリーを注射した。注射後１２日で脳組織を採取し、それを３つの領域（つまり大脳、小脳、脳幹）に分離した。大脳サンプルだけが指向進化実験に使用された。大脳から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを使用してＲＮＡを逆転写し、そして１対のキャップ遺伝子特異的ＰＣＲプライマーによる隣接領域を含む、ペプチド領域を増幅させた。その後、ＲＴ－ＰＣＲ産物を使用して、次のＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂプラスミドライブラリーを作成し、該ライブラリーは、その後、次のＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂウイルスライブラリーを産生するのに使用された。２回目と３回目の選択については、ＧＦＰ ＯＲＦを欠くＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂゲノムをパッケージ化した。非ヒト霊長類指向進化実験では、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂライブラリーを、１ｋｇ当たり２．０×１０^１２ｖｇの投与量で、伏在静脈を介して注射した。注射後１２日で、脳全体を採取し、そして脳マトリックスを使用してスライスし、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で処理し、そして冷凍保存した。その後、全ＲＮＡを以下の脳領域から抽出した：前頭皮質、後頭皮質、小脳（プルキンエと顆粒層）、髄質、脳橋、前頭皮質、視床下部、視床、帯状回、尾状核、被殻、海馬、および視索前野。ペプチド配列を、ネステッドＰＣＲを実施した以外は上記と同じ方法で、ＲＴ－ＰＣＲによって取り出し、下流工程のイルミナシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはサンガー法の手順に十分なＰＣＲ産物を取得した。いくつかのサンプルについては、サンガー法のためにネステッドＰＣＲを実施せず、プラスミドバックボーンに直接、第１のＰＣＲ産物のクローンを作成した。マウスにおける３回の選択（表１）と、非ヒト霊長類における１回の選択の後に、ＡＡＶ９キャプシドに挿入された、いくつかの潜在的な形質導入増強ペプチドを同定した（表２）。その後、バーコード化ＡＡＶライブラリーを生成し、そして２つの一般に使用されるマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＢＡＬＢ／ｃＪ）および１匹のアカゲザルに静脈内投与し、その後に、以前Ｎａｋａｉ Ｌａｂ（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，３０７５ （２０１４）；およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８０５０）で開発されたＤＮＡ／ＲＮＡバーコード－配列技術を利用して、２６の選択された新しいＡＡＶ変異体の、形質導入効率、向性／生体内分布、および薬物動態を比較した（表３）。結果として、以下を確認した。（１）ＴＲＡＤＥ技術によって同定された新しい変異体のいくつか、特にＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）とＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＱＱＮＧＴＲＰＳ（ＨＮ２）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳において、ＡＡＶ９より、最大で８倍優れた性能を見せた（図１４Ｂと１４Ｃ）。ＨＮｘ指定に関しては、表３を参照。（２）以前にＨｏｒｄｅａｕｘ等によって報告されたように（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ． ２０１８）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの脳を、ＡＡＶ９に匹敵するレベル以下にのみ形質導入し（図１４Ｂと１４Ｃ）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの堅調な神経向性増強に対するマウス株の依存性を実証している。（３）対照的に、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）とＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＱＱＮＧＴＲＰＳ（ＨＮ２）は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける堅調なニューロン形質導入を保持し、ＡＡＶ９より、最大で７倍優れた形質導入を示した（図１４Ｂ）。（４）アカゲザルでは、新しいＡＡＶ突然変異体の多くが、特定の脳領域でＡＡＶ９よりも最大で４倍大きなニューロン形質導入の増強を示す一方で、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂは、非ヒト霊長類の脳では、ＡＡＶ９同等以下で形質導入した。特に、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）は、複数の脳領域において、非ヒト霊長類脳の最も優れた形質導入を示した（図１４Ｃと１４Ｄ）。（５）ＨＮ１、ＨＮ２、およびＨＮ３を含む、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ由来の変異体の全ては、マウスとアカゲザルで、様々な程度の肝臓－標的解除特性を示した（図１７Ａ）。（６）ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）とＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＱＱＮＧＴＲＰＳ（ＨＮ２）は、マウスのＡＡＶ９よりも、最大で１７倍優れた肺のｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター転写活性を有して、細胞を、形質導入することができる（図１７Ｂ、表４と６）。（７）ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）は、ＡＡＶ９と比較して、より低程度の末梢器官へのベクターゲノムの広がりを示す（図１７Ｃと１７Ｄ）。ＡＡＶバーコード－配列データを、表４～９にまとめる。表４～９に提示された代表的データはまた、図１４と図１７でグラフフォーマットで示される。

【0043】

【表1-1】

【0044】

【表1-2】

【0045】

【表1-3】

【0046】

【表1-4】

【0047】

【表2】

【0048】

【表3-1】

【0049】

【表3-2】

【0050】

【表4】

【0051】

【表5】

【0052】

【表6】

【0053】

【表7】

【0054】

【表8】

【0055】

【表9】

【0056】

【表10】

【0057】

実験中、ＡＡＶ９キャップ遺伝子ＯＲＦがＨＥＫ２９３細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞のアンチセンス配向で発現すると、アンチセンスＡＡＶ９キャップ遺伝子の、ｍＲＮＡ由来のＲＴ－ＰＣＲ産物の大部分は、およそ１．７ｋｂで切断される（図４）が、このことは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－形質導入マウス脳組織（図３）から回収されたＲＮＡの場合にはあてはまらない。切断したＲＴ－ＰＣＲ産物の配列決定は、１６９４ｂｐの長さの領域がＡＡＶ９キャップＯＲＦ内で欠けていることを明らかにした（図５）。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、切断は、エキソン－イントロン連結の一般的特徴を有するＰＣＲ産物において、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とを同定することができた観察に基づいて、スプライシングイベントに起因すると思われる。興味深いことに、配列アラインメント試験は、エキソン－イントロン連結の一般的特徴を有する、潜在性スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とがまた、ＡＡＶ９キャップ遺伝子で同定されるスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とに対応する領域における多くの自然発生のＡＡＶ血清型で同定することができ、そしてそれらが高度に保存されていることを明らかにした（図６）。これは、スプライシングが、ＡＡＶ９のキャップＯＲＦ由来アンチセンスｍＲＮＡだけでなく、潜在的に、他のＡＡＶ株のキャップＯＲＦ由来のアンチセンスｍＲＮＡでも生じ得ることを示す。今日までに、スプライシングは、ＨｅｐＧ２細胞のヒト肝臓に特異的なプロモーター（ＬＳＰ）の制御化で発現する時に、ＡＡＶ３キャップＯＲＦ－由来アンチセンスｍＲＮＡで生じることがわかっている。完全な特徴付けが完了していなくても、アンチセンスｍＲＮＡに特異的なＲＴプライマーを使用する予備ＲＴ－ＰＣＲ（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ＲＴ－ＰＣＲ）は、完全長の、スプライシングされなかった産物に加えて、切断ＲＴ－ＰＣＲ産物を産生した。２つの切断ＲＴ－ＰＣＲ産物の配列決定分析は、複数のスプライシングイベントが、アンチセンスｍＲＮＡに存在したことを明らかにした（図７）。配列決定アライメント試験は、追加的で潜在的なスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位を同定した（図８と図９）。また、アンチセンスｍＲＮＡがＨＥＫ２９３細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞のｈＳｙｎＩエンハンサープロモーターによって転写された時に、ＡＡＶ１キャップＯＲＦ由来のアンチセンスｍＲＮＡにおけるスプライシングイベントが確認された（図１０）。同定されたスプライスドナー部位（ＧＴ／ＣＡ）とスプライスアクセプター部位（ＡＧ／ＴＣ）の多くは、異なる血清型にわたって高度に保存されており、これらの部位が潜在的に、未調査のＡＡＶ血清型のスプライシングドナー部位とスプライシングアクセプター部位としても利用されることを示す。実際、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ９キャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡ転写産物のスプライシングが、いくつかの共通のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とを使用することが確認された（図１０）。今日まで、ＡＡＶ５キャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡ転写産物のスプライシングは、未だ観察されていない。ＡＡＶ１、３、５、および９以外の血清型については、ＡＡＶキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡにおけるスプライシングイベントは未だ調査されていない。

【0058】

キャップＯＲＦ由来のアンチセンスｍＲＮＡの潜在的なスプライシングは、科学的には興味深いが、完全長のキャップＯＲＦ配列をアンチセンスｍＲＮＡから回収する必要がある場合に、ＴＲＡＤＥシステムを妨げ得る。この潜在的問題を克服するために、エキソン－イントロン連結と分岐点とにおいて、おそらくは保存配列を妨害するサイレント突然変異を導入した。このアプローチの原理の証拠を実証するために、プラスミド、ｐＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ１－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥに含有されるＡＡＶ９キャップＯＲＦの中へサイレント突然変異を導入し、これが、スプライスアクセプター（ＳＡ）コンセンサス配列（ｐＡＡＶ９ＮＳ１構築物）、スプライスドナー（ＳＤ）コンセンサス配列（ｐＡＡＶ９ＮＳ２構築物）、およびスプライスアクセプターとスプライスドナー両方のコンセンサス配列（ｐＡＡＶ９ＮＳ３構築物）を妨害する。ＮＳが「スプライシングされていない」を省略したものであることに留意されたい。これらのコンセンサス配列を妨害するために使用する方法を、以下に説明する。

【0059】

ヒト細胞発現のためのＡＡＶキャップＯＲＦ配列をコドン最適化する。

【0060】

キャップＯＲＦに由来するアンチセンスｍＲＮＡで、潜在的なスプライスドナーとスプライスアクセプターとを同定するために、我々の実験的および生物情報科学的観察（つまり図５、６、７、８、９、および１０）に基づいたアンチセンスｍＲＮＡの潜在的なスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とに関する、独自のデータベースを開発および使用する。

【0061】

コドン最適化配列を使用して、少なくとも１つのヌクレオチドを変更することによって、ＧＴ（スプライスドナー）および／またはＡＧ（スプライスアクセプター）コンセンサス配列を破壊する。コドン最適化配列が利用可能でない場合、コンセンサス配列を破壊することができる代替ヌクレオチドを使用する。

【0062】

コドン最適化配列に基づくサイレンス突然変異を導入することによって、スプライスアクセプター部位のＴ’ｓの上流のストレッチを取り出す。コドン最適化配列がＴ’ｓのストレッチを破壊するのには十分でない場合には、代替ヌクレオチドを使用する。

【0063】

また、可能な限り、エキソン終端のＧを回避する。

【0064】

分岐点を予測することができるいくつかのプログラム（例えば、ヒトスプライシングファインダー（Ｄｅｓｍｅｔ，Ｈａｍｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ． ２００９））を使用して、潜在的な分岐点を同定し、そしてそれらをコドン最適化配列で置き換える。この方法で達成可能なヌクレオチド変化の程度が十分でない場合には、潜在的な分岐点を分裂させるために、代替ヌクレオチドを導入する。

【0065】

この方法で、ＡＡＶ９ＮＳ１（ＳＡ、破壊されている）、ＡＡＶ９ＮＳ２（ＳＤ、破壊されている）、およびＡＡＶ９ＮＳ３（ＳＤとＳＡの両方、破壊されている）のキャップＯＲＦを作成した（図９）。アンチセンス配向のこれらのＯＲＦを、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞のｈＳｙｎＩエンハンサープロモーターの制御化で、一時的なプラスミドトランスフェクションによって発現させ、そしてアンチセンス転写産物をＲＴ－ＰＣＲによって分析した。この実験は、スプライシングが、ＮＳ１、ＮＳ２、およびＮＳ３キャップＯＲＦのすべてにおいて有効に抑制され得ることを明らかにした（図１０）。スプライシングがキャップＯＲＦ由来アンチセンスｍＲＮＡで生じた場合でも、キャップＯＲＦの比較的小さなペプチド挿入領域を、ＲＴ－ＰＣＲによってｍＲＮＡ前駆体から回収することがなお可能であることに留意されたい。

【0066】

本明細書に記載のＴＲＡＤＥ方法は、ウイルスタンパク質の進化にアンチセンスｍＲＮＡを使用して、原理の実証を確立し、そして実施するべき方法が成功裡に削減されることを示す。ＴＲＡＤＥシステムはまた、ウイルスを産生することができ、そして指向進化手順中の標的細胞におけるウイルスタンパク質の潜在的発現が新しいキャプシドの連続的進化を妨げない限り、ｍＲＮＡをセンス配向で利用することができる。

【0067】

核酸スプライシングとＡＡＶに関係する追加情報は、Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７，ｅ６７ （２００９）；Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ６６５，１８２－１８８ （２０１８）；および、Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，６６４－６６８ （２０１８）に確認することができる。

【0068】

本開示で引用される全ての参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【配列表】

2024161365000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-08-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

アミノ酸挿入を含むアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）キャプシドタンパク質であって、前記アミノ酸挿入は、配列番号１２８を含む、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項2】

アミノ酸挿入を含むアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）キャプシドタンパク質であって、前記アミノ酸挿入は、表３に列挙されているペプチド挿入部位の配列番号のうちのいずれか１つを含む、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項3】

前記アミノ酸挿入を含まないＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、配列番号２２１に対して９０％の配列同一性を含む、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項4】

前記ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、Ｎ２７２Ａ突然変異体を含む、請求項３に記載のＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項5】

前記アミノ酸挿入を含まないＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、配列番号２２に対して９０％の配列同一性を含む、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項6】

前記アミノ酸挿入は、配列番号２２１の５８８位の前記アミノ酸挿入への置換を含む、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項7】

前記アミノ酸挿入は、リンカーをさらに含む、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶ９キャプシドタンパク質。

【請求項8】

アミノ酸挿入を含むアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）キャプシドタンパク質をコードする核酸分子であって、前記アミノ酸挿入は、配列番号１２８を含む、核酸分子。

【請求項9】

アミノ酸挿入を含むアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）キャプシドタンパク質をコードする核酸分子であって、前記アミノ酸挿入は、表３に列挙されているペプチド挿入部位の配列番号のうちのいずれか１つを含む、核酸分子。

【請求項10】

前記アミノ酸挿入を含まないＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、配列番号２２１に対して９０％の配列同一性を含む、請求項８または請求項９に記載の核酸分子。

【請求項11】

前記ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、Ｎ２７２Ａ突然変異体を含む、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項12】

前記アミノ酸挿入を含まないＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、配列番号２２に対して９０％の配列同一性を含む、請求項８または請求項９に記載の核酸分子。

【請求項13】

前記アミノ酸挿入は、配列番号２２１の５８８位の前記アミノ酸挿入への置換を含む、請求項８または請求項９に記載の核酸分子。

【請求項14】

前記アミノ酸挿入は、リンカーをさらに含む、請求項８または請求項９に記載の核酸分子。

【外国語明細書】