▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
特開2024-161413核酸ライブラリを生成する方法ならびにそれを実施するための組成物およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024161413
(43)【公開日】2024-11-19
(54)【発明の名称】核酸ライブラリを生成する方法ならびにそれを実施するための組成物およびキット
(51)【国際特許分類】
C40B 40/06 20060101AFI20241112BHJP
【ＦＩ】
C40B40/06 ZNA
C40B40/06
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024125563
(22)【出願日】2024-08-01
(62)【分割の表示】P 2020567787の分割
【原出願日】2019-06-05
(31)【優先権主張番号】62/681,524
(32)【優先日】2018-06-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】グリーン、 リチャード
(72)【発明者】
【氏名】カップ、 ジョシュア
(57)【要約】 （修正有）
【課題】核酸ライブラリを生成するための組成物を提供する。
【解決手段】一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物であって、複合体は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズした第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、かつ第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、これにより第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する組成物が提供される。
【選択図】図１
【解決手段】一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物であって、複合体は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズした第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、かつ第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、これにより第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する組成物が提供される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮ
Ａの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記
第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のア
ダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレ
オチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの
末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮ
Ａの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記
第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のア
ダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレ
オチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの
末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
【請求項2】
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末
端を共有結合させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
端を共有結合させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以
下である、請求項２に記載の方法。
下である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記複合体が、前記ＳＳＢと接触された前記ｓｓＮＡの８０％以上から形成される、請
求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、請求項１～４のいずれか一項
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項6】
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、請求項１～６のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項8】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、請求項１～７のいずれか一項に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項9】
前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、請求項８に記載
の方法。
の方法。
【請求項10】
前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって
前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記複合体の形成後、前記ｓｓＤＮＡを再ハイブリダイズさせて、ｄｓＤＮＡを生成す
ることをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
ることをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記生成されたｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法
。
。
【請求項13】
前記生成されたｄｓＤＮＡのサブサンプルが配列決定される、請求項１２に記載の方法
。
。
【請求項14】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、請求項１～６のいずれか一項に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項15】
前記組み合わせることが、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記
第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリ
ゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記
第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリ
ゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮ
Ａにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮ
Ａにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳ
Ｂ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のス
プリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ
た前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第２のアダ
プターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプタ
ーオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、請求項１～１６
のいずれか一項に記載の方法。
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳ
Ｂ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のス
プリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ
た前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第２のアダ
プターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプタ
ーオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、請求項１～１６
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末
端を共有結合させることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
端を共有結合させることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、請求
項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、請求項１９に記載の方
法。
法。
【請求項21】
アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が
、ブロッキング修飾を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
、ブロッキング修飾を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項２１に記
載の方法。
載の方法。
【請求項23】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌ
クレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能
な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
ｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌ
クレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能
な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキン
グ修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および
３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
ｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキン
グ修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および
３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項
１～２４のいずれか一項に記載の方法。
１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請
求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下
である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ増幅のためのアダプターまたはその相補
体を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
体を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、部分的もしくは完全な配列決定アダプターまた
はその相補体を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
はその相補体を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ｓｓＮＡの少なくとも一部分またはその誘導体を配列決定することをさらに含む、
請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
【請求項32】
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、請求項３１または請求項３２
に記載の組成物。
に記載の組成物。
【請求項34】
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、請求項３１～３３のいずれか一項
に記載の組成物。
に記載の組成物。
【請求項36】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、請求項３１～３５のいずれか一
項に記載の組成物。
項に記載の組成物。
【請求項37】
前記ｓｓＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、請求項３６に記
載の組成物。
載の組成物。
【請求項38】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、請求項３１～３５のいずれか一
項に記載の組成物。
項に記載の組成物。
【請求項39】
アダプターオリゴヌクレオチド末端を、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させ
るための試薬をさらに含む、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
るための試薬をさらに含む、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項40】
前記試薬が、リガーゼである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌ
クレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌ
クレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。
【請求項42】
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオ
リゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリ
ゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、請求項４１に記
載のキット。
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオ
リゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリ
ゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、請求項４１に記
載のキット。
【請求項43】
前記ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である、請求項４１または４２に記載のキ
ット。
ット。
【請求項44】
前記ＳＳＢが、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である、請求項４１または４２に記載のキ
ット。
ット。
【請求項45】
アダプターオリゴヌクレオチドの末端を、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖
核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）の末端に連結するための試薬をさらに含む、請求項４１～４
４のいずれか一項に記載のキット。
核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）の末端に連結するための試薬をさらに含む、請求項４１～４
４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項46】
前記試薬が、リガーゼである、請求項４５に記載のキット。
【請求項47】
アダプターオリゴヌクレオチドの末端が、ブロッキング修飾を含む、請求項４１～４６
のいずれか一項に記載のキット。
のいずれか一項に記載のキット。
【請求項48】
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項４７に記
載のキット。
載のキット。
【請求項49】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌ
クレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能
な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項４７または請求項４８に記載のキット。
ｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌ
クレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能
な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項４７または請求項４８に記載のキット。
【請求項50】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキン
グ修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および
３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項４７または請求項４８に記載のキッ
ト。
ｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキン
グ修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および
３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項４７または請求項４８に記載のキッ
ト。
【請求項51】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項
４１～５０に記載のキット。
４１～５０に記載のキット。
【請求項52】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請
求項４１～５１に記載のキット。
求項４１～５１に記載のキット。
【請求項53】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下
である、請求項４１～５２に記載のキット。
である、請求項４１～５２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６８１，５２４号
の利益を主張し、その出願はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６８１，５２４号
の利益を主張し、その出願はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
核酸配列決定は、診断および他の用途での使用により、ますます重要な遺伝子研究の分
野となっている。一般に、核酸配列決定は、ＲＮＡまたはＤＮＡの断片などの核酸のヌク
レオチドの順序を決定することからなる。相対的に短い配列が典型的に分析され、得られ
た配列情報は、断片が誘導されたはるかにより広範な長さの遺伝子材料の配列を確実に決
定するために、断片を参照配列に対して整列させるか、または断片を論理的に一緒に適合
させるために、様々なバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特徴的断片
の自動コンピュータベースの検査が開発され、ゲノムマッピング、個体間の遺伝的変異の
分析、遺伝子およびそれらの機能の識別などに最近より使用されている。
野となっている。一般に、核酸配列決定は、ＲＮＡまたはＤＮＡの断片などの核酸のヌク
レオチドの順序を決定することからなる。相対的に短い配列が典型的に分析され、得られ
た配列情報は、断片が誘導されたはるかにより広範な長さの遺伝子材料の配列を確実に決
定するために、断片を参照配列に対して整列させるか、または断片を論理的に一緒に適合
させるために、様々なバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特徴的断片
の自動コンピュータベースの検査が開発され、ゲノムマッピング、個体間の遺伝的変異の
分析、遺伝子およびそれらの機能の識別などに最近より使用されている。
【0003】
高スループットＤＮＡ配列決定に用いられるいくつかの方法は、ユニバーサル増幅反応
に依存し、それによって、ＤＮＡ試料はランダムに断片化され、次いで、異なる断片の末
端がすべて同じＤＮＡ配列を含むように処理される。ユニバーサル末端を有する断片は、
単一の増幅プライマー対を有する単一の反応において増幅され得る。ＰＣＲによって増幅
される標的の末端へのユニバーサルプライミング配列の付加は、様々な方法によって達成
され得る。例えば、その５’末端にユニバーサル配列およびその３’末端に縮重配列を有
するユニバーサルプライマーを使用して、複雑な標的配列または標的配列の複雑な混合物
からランダムに断片を増幅することができる。プライマーの３’縮重部分は、ＤＮＡ上の
ランダムな位置でアニーリングし、伸長して、その５’末端にユニバーサル配列を有する
標的のコピーを生成することができる。
に依存し、それによって、ＤＮＡ試料はランダムに断片化され、次いで、異なる断片の末
端がすべて同じＤＮＡ配列を含むように処理される。ユニバーサル末端を有する断片は、
単一の増幅プライマー対を有する単一の反応において増幅され得る。ＰＣＲによって増幅
される標的の末端へのユニバーサルプライミング配列の付加は、様々な方法によって達成
され得る。例えば、その５’末端にユニバーサル配列およびその３’末端に縮重配列を有
するユニバーサルプライマーを使用して、複雑な標的配列または標的配列の複雑な混合物
からランダムに断片を増幅することができる。プライマーの３’縮重部分は、ＤＮＡ上の
ランダムな位置でアニーリングし、伸長して、その５’末端にユニバーサル配列を有する
標的のコピーを生成することができる。
【0004】
あるいは、ユニバーサルプライミング配列を含むアダプターを標的配列の末端にライゲ
ーションすることができる。１つ以上のアダプターが、標的配列とのライゲーション反応
において使用され得る。ユニバーサル増幅のための１つ以上のアダプター配列のライゲー
ションを介して核酸配列決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、
かかる方法によって必要とされる時間および費用である。
ーションすることができる。１つ以上のアダプターが、標的配列とのライゲーション反応
において使用され得る。ユニバーサル増幅のための１つ以上のアダプター配列のライゲー
ションを介して核酸配列決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、
かかる方法によって必要とされる時間および費用である。
【発明の概要】
【0005】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結
合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプ
リント（splint：添え木）オリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末
端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌク
レオチドを含む複合体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末
端（ｅｎｄ）は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏ
ｎ）の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得
る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される
。
合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプ
リント（splint：添え木）オリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末
端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌク
レオチドを含む複合体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末
端（ｅｎｄ）は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏ
ｎ）の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得
る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される
。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】本開示の一実施形態による核酸ライブラリを生成する方法の概略図。
【図2】分解ＤＮＡ（上部パネル）および現代ＤＮＡ（下部パネル）についての、他の方法と本開示の例示的な方法の比較。
【図3】毛髪ＤＮＡ長さ分布。左のパネルは、現代の毛髪ＤＮＡからＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ法（ＳＲＬ３）によって生成されたテンプレート分子の観察された長さを示す。毛髪軸中のＤＮＡについて予想されるように、インタクトな分子の長さは概して短い。同様の長さ分布が右パネルに示される（ＳＲＬ４）。
【図4】ＳＲＬ３およびＳＲＬ４における推定ライブラリ複雑度（固有の分子の数）。
【図5】ライブラリの複雑度比較。配列決定ライブラリは、本開示の例示的な方法、ＳＳ２．０、ＢＥＳＴ、およびフォーク型アダプターライゲーションを使用して作製した。ライブラリの複雑度（ライブラリ中の固有の分子の数）は、３つ組の実験において、Ｐｒｅｓｅｑ（左）を用いて、またはｑＰＣＲ（右）を介して、数百万のリードから推定した。本開示の例示的な方法は、次の最良のプロトコルであるＳＳ２．０よりも２～３倍多くの抽出ＤＮＡを配列決定ライブラリに変換する。
【発明を実施するための形態】
【0007】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結
合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプ
リントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプター
オリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合
体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端は、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡの第１の末端領域の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させる
ことをさらに含み得る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物および
キットも提供される。
合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプ
リントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプター
オリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合
体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端は、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡの第１の末端領域の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させる
ことをさらに含み得る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物および
キットも提供される。
【0008】
本開示の方法、組成物、およびキットをより詳細に記載する前に、当該方法、組成物、
およびキットは、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得
ることが理解されるべきである。当該方法、組成物、およびキットの範囲は添付の特許請
求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を
説明する目的のためのものに過ぎず、限定的であることは意図していないこともまた理解
されたい。
およびキットは、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得
ることが理解されるべきである。当該方法、組成物、およびキットの範囲は添付の特許請
求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を
説明する目的のためのものに過ぎず、限定的であることは意図していないこともまた理解
されたい。
【0009】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上他に明確な指示の
ない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在値、およびいずれかの他の記載された値
またはその記載された範囲内の介在値が、方法、組成物、およびキットに包含されること
を理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲
に含まれ得、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界を除き、それらも方法、
組成物、およびキット内に包含される。記載された範囲が一方または両方の限界を含む場
合、それらの含まれる限界のうちの一方または両方を除外する範囲もまた、方法、組成物
、およびキットに含まれる。
ない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在値、およびいずれかの他の記載された値
またはその記載された範囲内の介在値が、方法、組成物、およびキットに包含されること
を理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲
に含まれ得、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界を除き、それらも方法、
組成物、およびキット内に包含される。記載された範囲が一方または両方の限界を含む場
合、それらの含まれる限界のうちの一方または両方を除外する範囲もまた、方法、組成物
、およびキットに含まれる。
【0010】
特定の範囲は、数値の前に「約」という用語が付されて本明細書で提示される。本明細
書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行
する数に近いかまたはほぼ等しい数のための文言的サポートを提供する。ある数が特定の
明記された数に近いかあるいはほぼ等しいかを決定するにあたり、近いかあるいはほぼ等
しいが明記はされていない数は、それが提示されている文脈において具体的に明記された
数と実質的に等価な数であり得る。
書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行
する数に近いかまたはほぼ等しい数のための文言的サポートを提供する。ある数が特定の
明記された数に近いかあるいはほぼ等しいかを決定するにあたり、近いかあるいはほぼ等
しいが明記はされていない数は、それが提示されている文脈において具体的に明記された
数と実質的に等価な数であり得る。
【0011】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当該方
法、組成物、およびキットが属する当該技術分野における当業者に一般的に理解されるも
のと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法、組成物
、およびキットもまた、当該方法、組成物、およびキットの実施または試験に使用するこ
とができるが、代表的な例示的方法、組成物、およびキットについてここで記載する。
法、組成物、およびキットが属する当該技術分野における当業者に一般的に理解されるも
のと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法、組成物
、およびキットもまた、当該方法、組成物、およびキットの実施または試験に使用するこ
とができるが、代表的な例示的方法、組成物、およびキットについてここで記載する。
【0012】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許
が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により
本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されたところの関連する方法および／または材
料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引
用は、出願日前のその開示についてであり、提供される刊行日は独立して確認する必要が
あり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法、組成物、およびキットが、
このような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。
が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により
本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されたところの関連する方法および／または材
料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引
用は、出願日前のその開示についてであり、提供される刊行日は独立して確認する必要が
あり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法、組成物、およびキットが、
このような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。
【0013】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、お
よび「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留
意されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意さ
れたい。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙に関連して「専ら」、「のみ」な
どのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役
割を果たすことを意図している。
よび「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留
意されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意さ
れたい。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙に関連して「専ら」、「のみ」な
どのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役
割を果たすことを意図している。
【0014】
明瞭さのために、別々の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキットの
特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される
。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキ
ットの様々な特徴はまた、別々に、またはいずれかの適切な部分的組み合わせで提供され
得る。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書に
おいて、このような組み合わせは、実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する
限り、まさに各々およびすべての組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのよう
に開示されている。加えて、こうした変形を記載する実施形態において列挙されるすべて
の部分的組み合わせも、本方法、組成物、およびキットによって具体的に包含され、本明
細書において、まさに各々およびすべてのこのような部分的組み合わせが本明細書に個別
かつ明示的に開示されているかのように開示されている。
特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される
。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキ
ットの様々な特徴はまた、別々に、またはいずれかの適切な部分的組み合わせで提供され
得る。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書に
おいて、このような組み合わせは、実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する
限り、まさに各々およびすべての組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのよう
に開示されている。加えて、こうした変形を記載する実施形態において列挙されるすべて
の部分的組み合わせも、本方法、組成物、およびキットによって具体的に包含され、本明
細書において、まさに各々およびすべてのこのような部分的組み合わせが本明細書に個別
かつ明示的に開示されているかのように開示されている。
【0015】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の
実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの
実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要
素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理
的に可能な他の順序で実施することができる。
実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの
実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要
素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理
的に可能な他の順序で実施することができる。
【0016】
方法
上に要約されるように、本開示は、核酸ライブラリを生成する方法を提供する。方法は
、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡを生成することを含む。方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、第１のアダプター
オリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のア
ダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴ
ヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含む。組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓｓ
ＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイ
ズされた第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、第１のアダプターオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーション領域を介して第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダ
イズされたその第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体の形成をもたらし、こ
れにより、第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末
端領域の末端に隣接する。いくつかの実施形態では、組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡと、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼ
ーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を
含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含み、形成され
た複合体は、第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた末端領域の反
対側のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域に、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領
域を介してハイブリダイズされた第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、第２のアダプ
ターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第２のアダプターオリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズされたその第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含
み、これにより、第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、第１のアダプターオリ
ゴヌクレオチドに隣接する末端の反対側のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に隣接する。
上に要約されるように、本開示は、核酸ライブラリを生成する方法を提供する。方法は
、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡを生成することを含む。方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、第１のアダプター
オリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のア
ダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴ
ヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含む。組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓｓ
ＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイ
ズされた第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、第１のアダプターオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーション領域を介して第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダ
イズされたその第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体の形成をもたらし、こ
れにより、第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末
端領域の末端に隣接する。いくつかの実施形態では、組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡと、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼ
ーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を
含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含み、形成され
た複合体は、第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた末端領域の反
対側のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域に、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領
域を介してハイブリダイズされた第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、第２のアダプ
ターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第２のアダプターオリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズされたその第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含
み、これにより、第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、第１のアダプターオリ
ゴヌクレオチドに隣接する末端の反対側のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に隣接する。
【0017】
第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよび第２のスプリントオリゴヌクレオチドを用
いる例示的な一実施形態を、図１に概略的に示す。この実施例では、ｓｓＮＡは、ｄｓＮ
Ａを変性させることによってｄｓＮＡから生成される（例えば、ｄｓＤＮＡから生成され
るｓｓＤＮＡ）。図１の上部に示されるのは、ｄｓＮＡ １０２である。ＤｓＮＡ １０
２が変性した際に、得られたｓｓＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させ
て、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成する。図１に示されるのは、ｄｓＮＡ １０２の鎖に由来
するＳＳＢ結合ｓｓＮＡ １０４である。この実施例では、ｓｓＮＡ １０４は、第１の
スプリントオリゴヌクレオチド１０８にハイブリダイズされた第１のアダプターオリゴヌ
クレオチド１０６、および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２にハイブリダイズ
された第２のアダプターオリゴヌクレオチド１１０と組み合わされる。第１のスプリント
オリゴヌクレオチド１０８の、第１のアダプターオリゴヌクレオチド１０６へのハイブリ
ダイゼーションは、第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の第１のアダプターオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域１１４を介する。第２のスプリントオリゴヌ
クレオチド１１２の、第２のアダプターオリゴヌクレオチド１１０へのハイブリダイゼー
ションは、第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の第２のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域１１６を介する。第１のスプリントオリゴヌクレオチ
ド１０８および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、ＳＳＢ結合ＮＡ １０４
、第１のアダプター領域１０６、および第２のアダプター領域１１０とのハイブリダイゼ
ーションは、複合体１２２を形成する。第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ １０４の５’末端領域へのハイブリダイゼーションは、第１のスプ
リントオリゴヌクレオチド１０８の第１のＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領
域１１８を介する。第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ
１０４の３’末端領域へのハイブリダイゼーションは、第２のスプリントオリゴヌクレ
オチド１１２の第２のＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域１２０を介する。
スプリントオリゴヌクレオチドは、スプリントオリゴヌクレオチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡ
ハイブリダイゼーション領域がＳＳＢ結合ｓｓＮＡのそれらの対応する末端領域にハイブ
リダイズされるとき、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端
に隣接するように設計される。隣接する末端の位置はアスタリスクで示されている。これ
らの隣接する末端は、共有結合して（例えば、酵素的ライゲーションによって）、アダプ
ター付ｓｓＮＡ（例えば、図１に示されるアダプター付ｓｓＮＡ １２４）を生成するこ
とができ、次いで、アダプター付ｓｓＮＡのアダプター部分における１つ以上の配列によ
って促進される目的の下流アプリケーション（例えば、ＰＣＲ増幅、次世代配列決定、お
よび／または同等物）で使用され得る。図１に示されるように、隣接する末端の共有結合
の際に、任意のクリーンアップステップを実行して、アダプター付ｓｓＮＡを、形成され
た複合体の１つ以上の試薬または構成成分、例えば、共有結合に使用される酵素、スプリ
ントオリゴヌクレオチド、ＳＳＢ、および／または同等物から分離し得る。かかるクリー
ンアップステップのための好適なアプローチとしては、これらに限定されないが、固相可
逆的固定化（ＳＰＲＩ－例えば、磁気ビーズを使用する）および核酸カラム精製が挙げら
れる。図１に示される例では、ブロッキング修飾（blocking modification）が、スプリ
ントオリゴヌクレオチドの各末端に存在し（黒色の長方形）、ブロッキング修飾は、各ア
ダプターオリゴヌクレオチドの、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端にさらに存在
する（黒色の長方形）。ブロッキング修飾は、オリゴヌクレオチドおよびｓｓＮＡのそれ
らの末端へのライゲーションを防止する。
いる例示的な一実施形態を、図１に概略的に示す。この実施例では、ｓｓＮＡは、ｄｓＮ
Ａを変性させることによってｄｓＮＡから生成される（例えば、ｄｓＤＮＡから生成され
るｓｓＤＮＡ）。図１の上部に示されるのは、ｄｓＮＡ １０２である。ＤｓＮＡ １０
２が変性した際に、得られたｓｓＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させ
て、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成する。図１に示されるのは、ｄｓＮＡ １０２の鎖に由来
するＳＳＢ結合ｓｓＮＡ １０４である。この実施例では、ｓｓＮＡ １０４は、第１の
スプリントオリゴヌクレオチド１０８にハイブリダイズされた第１のアダプターオリゴヌ
クレオチド１０６、および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２にハイブリダイズ
された第２のアダプターオリゴヌクレオチド１１０と組み合わされる。第１のスプリント
オリゴヌクレオチド１０８の、第１のアダプターオリゴヌクレオチド１０６へのハイブリ
ダイゼーションは、第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の第１のアダプターオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域１１４を介する。第２のスプリントオリゴヌ
クレオチド１１２の、第２のアダプターオリゴヌクレオチド１１０へのハイブリダイゼー
ションは、第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の第２のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域１１６を介する。第１のスプリントオリゴヌクレオチ
ド１０８および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、ＳＳＢ結合ＮＡ １０４
、第１のアダプター領域１０６、および第２のアダプター領域１１０とのハイブリダイゼ
ーションは、複合体１２２を形成する。第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ １０４の５’末端領域へのハイブリダイゼーションは、第１のスプ
リントオリゴヌクレオチド１０８の第１のＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領
域１１８を介する。第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ
１０４の３’末端領域へのハイブリダイゼーションは、第２のスプリントオリゴヌクレ
オチド１１２の第２のＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域１２０を介する。
スプリントオリゴヌクレオチドは、スプリントオリゴヌクレオチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡ
ハイブリダイゼーション領域がＳＳＢ結合ｓｓＮＡのそれらの対応する末端領域にハイブ
リダイズされるとき、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端
に隣接するように設計される。隣接する末端の位置はアスタリスクで示されている。これ
らの隣接する末端は、共有結合して（例えば、酵素的ライゲーションによって）、アダプ
ター付ｓｓＮＡ（例えば、図１に示されるアダプター付ｓｓＮＡ １２４）を生成するこ
とができ、次いで、アダプター付ｓｓＮＡのアダプター部分における１つ以上の配列によ
って促進される目的の下流アプリケーション（例えば、ＰＣＲ増幅、次世代配列決定、お
よび／または同等物）で使用され得る。図１に示されるように、隣接する末端の共有結合
の際に、任意のクリーンアップステップを実行して、アダプター付ｓｓＮＡを、形成され
た複合体の１つ以上の試薬または構成成分、例えば、共有結合に使用される酵素、スプリ
ントオリゴヌクレオチド、ＳＳＢ、および／または同等物から分離し得る。かかるクリー
ンアップステップのための好適なアプローチとしては、これらに限定されないが、固相可
逆的固定化（ＳＰＲＩ－例えば、磁気ビーズを使用する）および核酸カラム精製が挙げら
れる。図１に示される例では、ブロッキング修飾（blocking modification）が、スプリ
ントオリゴヌクレオチドの各末端に存在し（黒色の長方形）、ブロッキング修飾は、各ア
ダプターオリゴヌクレオチドの、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端にさらに存在
する（黒色の長方形）。ブロッキング修飾は、オリゴヌクレオチドおよびｓｓＮＡのそれ
らの末端へのライゲーションを防止する。
【0018】
上に要約されるように、１つ以上のアダプター配列のライゲーションを介して核酸配列
決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、かかる方法によって必要
とされる時間および費用を含む。本開示の方法は、Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．（２
０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９によっ
て記載されるアプローチ（「ｓｓＤＮＡ２．０」と指定される）などの、一本鎖ライブラ
リ調製に対する現在の最先端のアプローチの改善を構成し、本方法は、驚くべきことに、
より効率的であり、より少ない時間を必要とし、コストを低減することが見出された。本
開示の方法の態様は、ここでさらに詳細に説明される。
決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、かかる方法によって必要
とされる時間および費用を含む。本開示の方法は、Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．（２
０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９によっ
て記載されるアプローチ（「ｓｓＤＮＡ２．０」と指定される）などの、一本鎖ライブラ
リ調製に対する現在の最先端のアプローチの改善を構成し、本方法は、驚くべきことに、
より効率的であり、より少ない時間を必要とし、コストを低減することが見出された。本
開示の方法の態様は、ここでさらに詳細に説明される。
【0019】
主題の方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触
させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。「一本鎖核酸」または「ｓｓＮＡ」
とは、それらの長さの７０％以上にわたって一本鎖である（すなわち、分子間または分子
内でハイブリダイズされていない）ポリヌクレオチドの集合を意味する。いくつかの実施
形態では、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの長さの７５％以上、８０％以上、８５％以上
、９０％以上、９５％以上、または９９％以上にわたり一本鎖である。ある特定の態様で
は、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの全長にわたり一本鎖である。
させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。「一本鎖核酸」または「ｓｓＮＡ」
とは、それらの長さの７０％以上にわたって一本鎖である（すなわち、分子間または分子
内でハイブリダイズされていない）ポリヌクレオチドの集合を意味する。いくつかの実施
形態では、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの長さの７５％以上、８０％以上、８５％以上
、９０％以上、９５％以上、または９９％以上にわたり一本鎖である。ある特定の態様で
は、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの全長にわたり一本鎖である。
【0020】
ｓｓＮＡは、これらに限定されないが、単一の細胞、複数の細胞（例えば、培養細胞）
、組織、器官、または生物（例えば、細菌、酵母など）から単離された核酸試料を含む、
目的の任意の核酸試料であり得る（またはそれから調製され得る）。例示的な試料タイプ
としては、これらに限定されないが、血液、血清、唾液、痰、尿、排泄物、嘔吐物、粘液
、毛髪、爪（例えば、指の爪、足の爪）、スワブ（例えば、頬スワブ、咽頭スワブ、膣ス
ワブ）、生検組織（例えば、パンチ生検、細針生検、細針吸引生検）、細胞培養、環境試
料（例えば、水、土壌、空気、表面、タッチＤＮＡ）、およびメタゲノム試料が挙げられ
る。ある特定の態様では、核酸試料は、動物の単一の細胞、細胞の集合、組織、器官、お
よび／または同等物から単離される。いくつかの場合では、核酸試料は、これらに限定さ
れないが、胎児無細胞核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ））または循環腫
瘍核酸（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））などの無細胞核酸（例えば、無細胞Ｄ
ＮＡ（ｃｆＤＮＡ））を含む。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物（例えば、ヒ
ト属からの哺乳動物、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウ
シ、または目的の任意の他の哺乳動物）である。他の態様では、核酸試料は、細菌、酵母
、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、両生類（例えば、カエル（例えば、アフリカツメ
ガエル））、ウイルス、植物、または任意の他の非哺乳動物の核酸試料源などの、哺乳動
物以外の供給源から単離される／得られる。
、組織、器官、または生物（例えば、細菌、酵母など）から単離された核酸試料を含む、
目的の任意の核酸試料であり得る（またはそれから調製され得る）。例示的な試料タイプ
としては、これらに限定されないが、血液、血清、唾液、痰、尿、排泄物、嘔吐物、粘液
、毛髪、爪（例えば、指の爪、足の爪）、スワブ（例えば、頬スワブ、咽頭スワブ、膣ス
ワブ）、生検組織（例えば、パンチ生検、細針生検、細針吸引生検）、細胞培養、環境試
料（例えば、水、土壌、空気、表面、タッチＤＮＡ）、およびメタゲノム試料が挙げられ
る。ある特定の態様では、核酸試料は、動物の単一の細胞、細胞の集合、組織、器官、お
よび／または同等物から単離される。いくつかの場合では、核酸試料は、これらに限定さ
れないが、胎児無細胞核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ））または循環腫
瘍核酸（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））などの無細胞核酸（例えば、無細胞Ｄ
ＮＡ（ｃｆＤＮＡ））を含む。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物（例えば、ヒ
ト属からの哺乳動物、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウ
シ、または目的の任意の他の哺乳動物）である。他の態様では、核酸試料は、細菌、酵母
、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、両生類（例えば、カエル（例えば、アフリカツメ
ガエル））、ウイルス、植物、または任意の他の非哺乳動物の核酸試料源などの、哺乳動
物以外の供給源から単離される／得られる。
【0021】
いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、分解核酸試料からのものである。本明細書で使
用される場合、「分解核酸試料」は、酵素的、物理的、化学的、または他のプロセスによ
って断片化されたＤＮＡの試料である。分解核酸試料の例は、骨残留物から回収されたＤ
ＮＡ断片、毛髪、血漿からの無細胞ＤＮＡ、または土壌もしくは水から回収された環境Ｄ
ＮＡである。ある特定の態様では、ｓｓＮＡが、分解核酸試料からのものであるとき、ｓ
ｓＮＡは、古代核酸試料からのものである。「古代核酸試料」とは、生物学的残留物から
回収された核酸断片を意味する。目的の古代核酸試料の非限定的な例は、絶滅した生物ま
たは動物、例えば、絶滅した哺乳動物から得られる（例えば、単離される）核酸試料であ
る。ある特定の態様では、絶滅した哺乳動物は、ヒト属からのものである。いくつかの実
施形態では、ｓｓＮＡは、法医学核酸試料からのものである。本明細書で使用される場合
、「法医学核酸試料」は、犯罪の調査に関連する（例えば、その過程で得られた）核酸試
料である。
用される場合、「分解核酸試料」は、酵素的、物理的、化学的、または他のプロセスによ
って断片化されたＤＮＡの試料である。分解核酸試料の例は、骨残留物から回収されたＤ
ＮＡ断片、毛髪、血漿からの無細胞ＤＮＡ、または土壌もしくは水から回収された環境Ｄ
ＮＡである。ある特定の態様では、ｓｓＮＡが、分解核酸試料からのものであるとき、ｓ
ｓＮＡは、古代核酸試料からのものである。「古代核酸試料」とは、生物学的残留物から
回収された核酸断片を意味する。目的の古代核酸試料の非限定的な例は、絶滅した生物ま
たは動物、例えば、絶滅した哺乳動物から得られる（例えば、単離される）核酸試料であ
る。ある特定の態様では、絶滅した哺乳動物は、ヒト属からのものである。いくつかの実
施形態では、ｓｓＮＡは、法医学核酸試料からのものである。本明細書で使用される場合
、「法医学核酸試料」は、犯罪の調査に関連する（例えば、その過程で得られた）核酸試
料である。
【0022】
ある特定の態様では、ｓｓＮＡは、腫瘍核酸試料（すなわち、腫瘍から単離された核酸
試料）からのものである。本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性にか
かわらず、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の
細胞および組織を指す。「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増
殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記述する。癌の例と
しては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定
されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞
肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、
卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸大腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌
、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、様々な種類の頭頸
部癌などが挙げられる。
試料）からのものである。本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性にか
かわらず、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の
細胞および組織を指す。「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増
殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記述する。癌の例と
しては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定
されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞
肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、
卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸大腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌
、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、様々な種類の頭頸
部癌などが挙げられる。
【0023】
いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、無細胞核酸試料、例えば、無細胞ＤＮＡ、無細
胞ＲＮＡ、またはその両方からのものである。ある特定の態様では、無細胞核酸は、全血
、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液
、精液、腹水、胸水、および大便からなる群から選択される、体液試料から得られる。い
くつかの実施形態では、無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡである。ある特定の態様では、
無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、感染性
因子ＤＮＡを含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、移植片からのＤＮＡを含む。
胞ＲＮＡ、またはその両方からのものである。ある特定の態様では、無細胞核酸は、全血
、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液
、精液、腹水、胸水、および大便からなる群から選択される、体液試料から得られる。い
くつかの実施形態では、無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡである。ある特定の態様では、
無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、感染性
因子ＤＮＡを含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、移植片からのＤＮＡを含む。
【0024】
ある特定の態様では、ｓｓＮＡは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。目
的のｓｓＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するｓｓＤＮＡを含むが、これら
に限定されない。例えば、ｓｓＤＮＡは、ｓｓＤＮＡを生成するために変性（例えば、熱
変性および／または化学変性）された二本鎖ＤＮＡに由来し得る。いくつかの実施形態で
は、方法は、ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、ｄｓＤＮＡを変性させることによっ
てｓｓＤＮＡを生成することを含む。
的のｓｓＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するｓｓＤＮＡを含むが、これら
に限定されない。例えば、ｓｓＤＮＡは、ｓｓＤＮＡを生成するために変性（例えば、熱
変性および／または化学変性）された二本鎖ＤＮＡに由来し得る。いくつかの実施形態で
は、方法は、ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、ｄｓＤＮＡを変性させることによっ
てｓｓＤＮＡを生成することを含む。
【0025】
ｓｓＮＡがｄｓＤＮＡ試料に由来するｓｓＤＮＡである場合、方法は、複合体の形成後
、ｓｓＤＮＡ（この時点で、一方または両方の末端に１つ以上のアダプター（例えば、配
列決定アダプター）を含む）を再ハイブリダイズしてｄｓＤＮＡを生成することをさらに
含み得る。所望である場合、生成されたｄｓＤＮＡは、配列決定され得る。いくつかの実
施形態では、再ハイブリダイズは、ｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓ
ＤＮＡを生成するのに十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施さ
れる。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダ
イゼーション温度、選択された塩濃度、および／またはｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤ
ＮＡに類似するｄｓＤＮＡを生成するように選択された任意の他の好都合なハイブリダイ
ゼーションパラメータを含み得る。かかる生成されたｄｓＤＮＡの少なくともサブセット
の一方または両方の末端は、元のｄｓＤＮＡの末端（例えば、オーバーハング）の類似物
／複製物になるであろう。本開示の方法を使用して（例えば、配列決定によって）末端／
オーバーハング含量を決定することは、ｓｓＤＮＡが由来した核酸試料に関する様々な有
用な情報を提供し得る。例えば、オーバーハング含量を知ることは、例えば血漿または別
の好適な供給源からの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を分析するのに価値がある。ｃｆＤＮ
Ａは、血液細胞、妊婦の胎児細胞、癌を有する個体の腫瘍細胞、臓器移植レシピエントの
移植臓器組織などを含む様々な供給源に由来することが示されている。本開示の方法の実
施形態によって提供されるオーバーハング含量は、例えば診断目的のために起源によって
配列決定リードを分類するために使用され得る。
、ｓｓＤＮＡ（この時点で、一方または両方の末端に１つ以上のアダプター（例えば、配
列決定アダプター）を含む）を再ハイブリダイズしてｄｓＤＮＡを生成することをさらに
含み得る。所望である場合、生成されたｄｓＤＮＡは、配列決定され得る。いくつかの実
施形態では、再ハイブリダイズは、ｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓ
ＤＮＡを生成するのに十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施さ
れる。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダ
イゼーション温度、選択された塩濃度、および／またはｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤ
ＮＡに類似するｄｓＤＮＡを生成するように選択された任意の他の好都合なハイブリダイ
ゼーションパラメータを含み得る。かかる生成されたｄｓＤＮＡの少なくともサブセット
の一方または両方の末端は、元のｄｓＤＮＡの末端（例えば、オーバーハング）の類似物
／複製物になるであろう。本開示の方法を使用して（例えば、配列決定によって）末端／
オーバーハング含量を決定することは、ｓｓＤＮＡが由来した核酸試料に関する様々な有
用な情報を提供し得る。例えば、オーバーハング含量を知ることは、例えば血漿または別
の好適な供給源からの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を分析するのに価値がある。ｃｆＤＮ
Ａは、血液細胞、妊婦の胎児細胞、癌を有する個体の腫瘍細胞、臓器移植レシピエントの
移植臓器組織などを含む様々な供給源に由来することが示されている。本開示の方法の実
施形態によって提供されるオーバーハング含量は、例えば診断目的のために起源によって
配列決定リードを分類するために使用され得る。
【0026】
さらに、末端／オーバーハング含量は、法医学試料からの混合ＤＮＡを分析するために
使用され得る。例えば、精液、血液、または別の目的供給源からのＤＮＡは、その供給源
について診断的となる末端特徴を有し得、ＤＮＡ配列は、この情報に基づいて分割され得
る。
使用され得る。例えば、精液、血液、または別の目的供給源からのＤＮＡは、その供給源
について診断的となる末端特徴を有し得、ＤＮＡ配列は、この情報に基づいて分割され得
る。
【0027】
さらに、古代ＤＮＡ試料（例えば、絶滅した生物、植物、または動物からの試料）中の
オーバーハング含量を決定することは、そのような試料およびその試料が由来する生物、
植物、動物などを特徴付けるのに有用な情報を提供する。例えば、古代ＤＮＡ試料（例え
ば、絶滅した哺乳動物からのＤＮＡ試料）は、しばしば、混入ＤＮＡ（例えば、混入細菌
ＤＮＡなど）を含む。そのような場合、そのようなタイプのオーバーハングが特定のＤＮ
Ａ源に関連するとき、目的のＤＮＡ配列が、検出されたオーバーハングのタイプに基づい
て混入ＤＮＡ配列から分割され得る。
オーバーハング含量を決定することは、そのような試料およびその試料が由来する生物、
植物、動物などを特徴付けるのに有用な情報を提供する。例えば、古代ＤＮＡ試料（例え
ば、絶滅した哺乳動物からのＤＮＡ試料）は、しばしば、混入ＤＮＡ（例えば、混入細菌
ＤＮＡなど）を含む。そのような場合、そのようなタイプのオーバーハングが特定のＤＮ
Ａ源に関連するとき、目的のＤＮＡ配列が、検出されたオーバーハングのタイプに基づい
て混入ＤＮＡ配列から分割され得る。
【0028】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、オーバーハングの長さおよびタイプの関数
として、ＤＮＡ抽出物（例えば、古代ＤＮＡ抽出物）中の塩基損傷の速度および位置を決
定する際に用途を見出す。
として、ＤＮＡ抽出物（例えば、古代ＤＮＡ抽出物）中の塩基損傷の速度および位置を決
定する際に用途を見出す。
【0029】
したがって、いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｄｓＤＮＡ由来のｓｓＤＮＡをアダ
プターおよびスプリントオリゴヌクレオチドと組み合わせて、本明細書に記載されるアダ
プターおよびスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたＳＳＢ結合ｄｓＤＮ
Ａ由来ｓｓＤＮＡを含む複合体を形成することと、複合体形成の後に、ｓｓＤＮＡを再ハ
イブリダイズして、ｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓＤＮＡ（すなわ
ち、一方または両方の末端に１つ以上のアダプター（例えば、配列決定アダプター）を含
む「アダプター付」ｄｓＤＮＡ）を生成することと、を含む方法が提供される。かかる方
法は、アダプター付ｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含み得る。ある特定の態様で
は、配列決定は、ｓｓＤＮＡが由来したｄｓＤＮＡの末端／オーバーハング含量を決定す
るためのものである。配列決定を含む本開示の方法の任意の実施形態では、方法は、配列
決定中の複雑度を低減するために、アダプター付ｓｓＮＡのサブサンプル（subsample）
を配列決定することを含み得る。
プターおよびスプリントオリゴヌクレオチドと組み合わせて、本明細書に記載されるアダ
プターおよびスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたＳＳＢ結合ｄｓＤＮ
Ａ由来ｓｓＤＮＡを含む複合体を形成することと、複合体形成の後に、ｓｓＤＮＡを再ハ
イブリダイズして、ｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓＤＮＡ（すなわ
ち、一方または両方の末端に１つ以上のアダプター（例えば、配列決定アダプター）を含
む「アダプター付」ｄｓＤＮＡ）を生成することと、を含む方法が提供される。かかる方
法は、アダプター付ｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含み得る。ある特定の態様で
は、配列決定は、ｓｓＤＮＡが由来したｄｓＤＮＡの末端／オーバーハング含量を決定す
るためのものである。配列決定を含む本開示の方法の任意の実施形態では、方法は、配列
決定中の複雑度を低減するために、アダプター付ｓｓＮＡのサブサンプル（subsample）
を配列決定することを含み得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）である。目的の
ＲＮＡとしては、これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイク
ロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスアクティング低分
子干渉ＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、リ
ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓ
ｎｏＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ
）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔ
ｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的Ｒ
ＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉと相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌク
レアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シ
グナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、またはかかるＲＮＡタイプもしくはサ
ブタイプの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡがｓｓＲ
ＮＡである場合、ｓｓＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
ＲＮＡとしては、これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイク
ロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスアクティング低分
子干渉ＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、リ
ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓ
ｎｏＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ
）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔ
ｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的Ｒ
ＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉと相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌク
レアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シ
グナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、またはかかるＲＮＡタイプもしくはサ
ブタイプの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡがｓｓＲ
ＮＡである場合、ｓｓＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
【0031】
目的の供給源からＤＮＡおよびＲＮＡを単離、精製、および／または濃縮するためのア
プローチ、試薬、およびキットは、当該技術分野において既知であり、市販されている。
例えば、目的の供給源からＤＮＡを単離するためのキットには、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＤＮｅａｓｙ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録
商標）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）、およびＱＩＡｑｕｉ
ｃｋ（登録商標）核酸単離／精製キット；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ
．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＤＮＡｚｏｌ（登録商標）、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔ
ｃｈ（登録商標）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）、ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（登録商標
）核酸単離／精製キット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）、Ｎｕｃｌｅ
ｏＳｐｉｎ（登録商標）、およびＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）核酸単離／精製キッ
トが含まれる。ある特定の態様では、核酸は、固定された生物学的試料、例えば、ホルマ
リン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離される。ＦＦＰＥ組織からのゲノムＤ
ＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＡｌｌＰｒｅｐ
（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＦＦＰＥ用のＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商
標）全核酸単離キット、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰ
Ｅキットなどの市販のキットを用いて単離され得る。
プローチ、試薬、およびキットは、当該技術分野において既知であり、市販されている。
例えば、目的の供給源からＤＮＡを単離するためのキットには、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＤＮｅａｓｙ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録
商標）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）、およびＱＩＡｑｕｉ
ｃｋ（登録商標）核酸単離／精製キット；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ
．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＤＮＡｚｏｌ（登録商標）、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔ
ｃｈ（登録商標）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）、ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（登録商標
）核酸単離／精製キット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）、Ｎｕｃｌｅ
ｏＳｐｉｎ（登録商標）、およびＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）核酸単離／精製キッ
トが含まれる。ある特定の態様では、核酸は、固定された生物学的試料、例えば、ホルマ
リン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離される。ＦＦＰＥ組織からのゲノムＤ
ＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＡｌｌＰｒｅｐ
（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＦＦＰＥ用のＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商
標）全核酸単離キット、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰ
Ｅキットなどの市販のキットを用いて単離され得る。
【0032】
核酸試料が得られる（例えば、単離される）生物、植物、動物などが絶滅している場合
、かかる核酸を回収するための好適な戦略は、既知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ
ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８（５９７９）：７１０－７２２、Ｐｏｉｎａ
ｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１（５７５９）：３９２－３９４、
Ｓｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１
０３（３７）：１３５７８－１３５８４、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａ
ｔｕｒｅ ４５６（７２２０）：３８７－９０、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２
０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６３（７２８２）：７５７－７６２、および他の箇所に記載さ
れているものを含む。
、かかる核酸を回収するための好適な戦略は、既知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ
ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８（５９７９）：７１０－７２２、Ｐｏｉｎａ
ｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１（５７５９）：３９２－３９４、
Ｓｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１
０３（３７）：１３５７８－１３５８４、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａ
ｔｕｒｅ ４５６（７２２０）：３８７－９０、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２
０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６３（７２８２）：７５７－７６２、および他の箇所に記載さ
れているものを含む。
【0033】
上に要約されるように、主題の方法は、ｓｓＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ
）と接触させてＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。ＳＳＢは、ｓｓＮＡに協調的
な様式で結合し、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）にはうまく結合しない。ｓｓＤＮＡに結合する
と、ＳＳＢは螺旋二本鎖を不安定にする。主題の方法を実施する際に用いられ得るＳＳＢ
としては、原核ＳＳＢ（例えば、細菌または古細菌ＳＳＢ）および真核ＳＳＢが挙げられ
る。主題の方法を実施する際に用いられ得るＳＳＢの非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＳＳＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ、極限熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ
ＳＳＢ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝
子３２タンパク質、複製プロテインＡ（ＲＰＡ－真核ＳＳＢ）などが挙げられる。ＥＴ
ＳＳＢ、Ｔｔｈ ＲｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、なら
びにかかるＳＳＢを使用してＳＳＢ結合ｓｓＮＡを調製するための緩衝液および詳細なプ
ロトコルは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉ
ｃｈ，ＭＡ）から入手可能である。本発明者らは、インプットが等モル濃度だとすると、
より大きい平均断片長を有するｓｓＮＡにとって、ＳＳＢのより大きなインプットが有益
になると判定した。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するためにｓｓＮＡをＳＳＢと接触させる
ための例となるアプローチに関する詳細なガイダンスは、下記の実験セクションに提供さ
れる。
）と接触させてＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。ＳＳＢは、ｓｓＮＡに協調的
な様式で結合し、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）にはうまく結合しない。ｓｓＤＮＡに結合する
と、ＳＳＢは螺旋二本鎖を不安定にする。主題の方法を実施する際に用いられ得るＳＳＢ
としては、原核ＳＳＢ（例えば、細菌または古細菌ＳＳＢ）および真核ＳＳＢが挙げられ
る。主題の方法を実施する際に用いられ得るＳＳＢの非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＳＳＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ、極限熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ
ＳＳＢ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝
子３２タンパク質、複製プロテインＡ（ＲＰＡ－真核ＳＳＢ）などが挙げられる。ＥＴ
ＳＳＢ、Ｔｔｈ ＲｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、なら
びにかかるＳＳＢを使用してＳＳＢ結合ｓｓＮＡを調製するための緩衝液および詳細なプ
ロトコルは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉ
ｃｈ，ＭＡ）から入手可能である。本発明者らは、インプットが等モル濃度だとすると、
より大きい平均断片長を有するｓｓＮＡにとって、ＳＳＢのより大きなインプットが有益
になると判定した。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するためにｓｓＮＡをＳＳＢと接触させる
ための例となるアプローチに関する詳細なガイダンスは、下記の実験セクションに提供さ
れる。
【0034】
上に要約されるように、主題の方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴヌク
レオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域およびアダプターオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーション領域を含むスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合
わせて複合体を形成することを含む。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド
」は、５～５００ヌクレオチド、例えば、５～１００ヌクレオチドの一本鎖マルチマーで
ある。オリゴヌクレオチドは、合成されてもよく、または酵素的に作製されてもよく、い
くつかの実施形態では、５～５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌ
クレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「ＲＮＡオリゴヌクレオ
チド」であり得る）、デオキシリボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドまたは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）、またはそれらの組み
合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４
０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０
、または１５０～２００、または最大５００ヌクレオチド長であり得る。
レオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域およびアダプターオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーション領域を含むスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合
わせて複合体を形成することを含む。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド
」は、５～５００ヌクレオチド、例えば、５～１００ヌクレオチドの一本鎖マルチマーで
ある。オリゴヌクレオチドは、合成されてもよく、または酵素的に作製されてもよく、い
くつかの実施形態では、５～５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌ
クレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「ＲＮＡオリゴヌクレオ
チド」であり得る）、デオキシリボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドまたは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）、またはそれらの組み
合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４
０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０
、または１５０～２００、または最大５００ヌクレオチド長であり得る。
【0035】
本開示の「アダプターオリゴヌクレオチド」は、アダプターまたはその一部を含むオリ
ゴヌクレオチドである。「アダプター」とは、１つ以上の下流用途（例えば、アダプター
付ｓｓＮＡもしくはその誘導体のＰＣＲ増幅、アダプター付ｓｓＮＡもしくはその誘導体
の配列決定、および／または同等物）に有用なヌクレオチド配列を意味する。ある特定の
態様では、アダプターオリゴヌクレオチド中に存在するアダプターまたはその一部は、配
列決定アダプターである。「配列決定アダプター」とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）
によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅ
ｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム
）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、Ｍｉ
ｎＩＯＮ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏ
ｎ ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、
Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌまたはＰａｃＢｉｏ
ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば
、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ
＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）、または目的の任意の他の配列
決定プラットフォームなどの、目的の配列決定プラットフォームによって利用されるヌク
レオチド配列（またはその相補体）の少なくとも一部を含む１つ以上の核酸ドメインを意
味する。
ゴヌクレオチドである。「アダプター」とは、１つ以上の下流用途（例えば、アダプター
付ｓｓＮＡもしくはその誘導体のＰＣＲ増幅、アダプター付ｓｓＮＡもしくはその誘導体
の配列決定、および／または同等物）に有用なヌクレオチド配列を意味する。ある特定の
態様では、アダプターオリゴヌクレオチド中に存在するアダプターまたはその一部は、配
列決定アダプターである。「配列決定アダプター」とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）
によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅ
ｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム
）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、Ｍｉ
ｎＩＯＮ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏ
ｎ ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、
Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌまたはＰａｃＢｉｏ
ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば
、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ
＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）、または目的の任意の他の配列
決定プラットフォームなどの、目的の配列決定プラットフォームによって利用されるヌク
レオチド配列（またはその相補体）の少なくとも一部を含む１つ以上の核酸ドメインを意
味する。
【0036】
ある特定の態様では、配列決定アダプターは、表面結合配列決定プラットフォームオリ
ゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおいてフロ
ーセルの表面に結合したＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイ
ン（例えば、「捕捉部位」または「捕捉配列」）、配列決定プライマー結合ドメイン（例
えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのリード１またリード２プライマ
ーが結合し得るドメイン）、固有の識別子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、プロ
ーブ相補鎖オリゴヌクレオチド、もしくはその両方の３’領域を一意に識別する、および
／または特異的なバーコードもしくは「タグ」を用いて所与の試料からすべての分子をマ
ークすることによって試料多重化を可能にするように配列決定化ｒＲＮＡの試料供給源を
一意に識別する、バーコードもしくは他のドメイン）、バーコード配列決定プライマー結
合ドメイン（バーコードの配列決定に使用されるプライマーが結合するドメイン）、例え
ば固有のタグが配列決定される事象の数に基づいて発現レベルを決定するために、目的の
分子を一意にマークするための分子識別ドメイン（例えば、４、６、または他の数のヌク
レオチドのランダム化タグなどの分子インデックスタグ）、任意のかかるドメインの相補
体、またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸ドメインであるか、あるいはそ
れを含む。ある特定の態様では、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）
および分子の識別ドメイン（例えば、分子インデックスタグ）は、同じ核酸に含まれても
よい。
ゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおいてフロ
ーセルの表面に結合したＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイ
ン（例えば、「捕捉部位」または「捕捉配列」）、配列決定プライマー結合ドメイン（例
えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのリード１またリード２プライマ
ーが結合し得るドメイン）、固有の識別子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、プロ
ーブ相補鎖オリゴヌクレオチド、もしくはその両方の３’領域を一意に識別する、および
／または特異的なバーコードもしくは「タグ」を用いて所与の試料からすべての分子をマ
ークすることによって試料多重化を可能にするように配列決定化ｒＲＮＡの試料供給源を
一意に識別する、バーコードもしくは他のドメイン）、バーコード配列決定プライマー結
合ドメイン（バーコードの配列決定に使用されるプライマーが結合するドメイン）、例え
ば固有のタグが配列決定される事象の数に基づいて発現レベルを決定するために、目的の
分子を一意にマークするための分子識別ドメイン（例えば、４、６、または他の数のヌク
レオチドのランダム化タグなどの分子インデックスタグ）、任意のかかるドメインの相補
体、またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸ドメインであるか、あるいはそ
れを含む。ある特定の態様では、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）
および分子の識別ドメイン（例えば、分子インデックスタグ）は、同じ核酸に含まれても
よい。
【0037】
アダプターオリゴヌクレオチドが、配列決定アダプターの１つまたは一部を含むとき、
１つ以上のさらなる配列決定アダプターおよび／または配列決定アダプターの残りの部分
が、様々なアプローチを用いて付加され得る。例えば、配列決定アダプターのさらなる部
分および／または残りの部分は、ライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、および／または
同等物によって付加され得る。ＰＣＲの場合、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば
、アダプターオリゴヌクレオチドのアダプター領域にハイブリダイズするための）、なら
びに配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分を含む５’領域を含む
第１の増幅プライマーと、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ｓｓＮＡ分子の反
対側の末端に付加される第２のアダプターオリゴヌクレオチドのアダプター領域にハイブ
リダイズするための）、ならびに任意に配列決定アダプターのさらなる部分および／また
は残りの部分を含む５’領域を含む第２の増幅プライマーと、を含む増幅プライマー対を
用いることができる。
１つ以上のさらなる配列決定アダプターおよび／または配列決定アダプターの残りの部分
が、様々なアプローチを用いて付加され得る。例えば、配列決定アダプターのさらなる部
分および／または残りの部分は、ライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、および／または
同等物によって付加され得る。ＰＣＲの場合、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば
、アダプターオリゴヌクレオチドのアダプター領域にハイブリダイズするための）、なら
びに配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分を含む５’領域を含む
第１の増幅プライマーと、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ｓｓＮＡ分子の反
対側の末端に付加される第２のアダプターオリゴヌクレオチドのアダプター領域にハイブ
リダイズするための）、ならびに任意に配列決定アダプターのさらなる部分および／また
は残りの部分を含む５’領域を含む第２の増幅プライマーと、を含む増幅プライマー対を
用いることができる。
【0038】
本開示の「スプリントオリゴヌクレオチド」は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼー
ション領域およびアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含むオリ
ゴヌクレオチドである。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ＳＳＢ結合
ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズする領域（ヌクレオチド配列）である。アダプター
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、アダプターオリゴヌクレオチドのす
べてまたは一部にハイブリダイズする領域（ヌクレオチド配列）である。スプリントオリ
ゴヌクレオチドは、複合体形成時に、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合
ｓｓＮＡの末端領域の末端に隣接するように、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡおよびアダプターオリ
ゴヌクレオチドへの同時ハイブリダイゼーションのために設計される。
ション領域およびアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含むオリ
ゴヌクレオチドである。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ＳＳＢ結合
ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズする領域（ヌクレオチド配列）である。アダプター
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、アダプターオリゴヌクレオチドのす
べてまたは一部にハイブリダイズする領域（ヌクレオチド配列）である。スプリントオリ
ゴヌクレオチドは、複合体形成時に、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合
ｓｓＮＡの末端領域の末端に隣接するように、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡおよびアダプターオリ
ゴヌクレオチドへの同時ハイブリダイゼーションのために設計される。
【0039】
スプリントオリゴヌクレオチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、
任意の好適な長さおよび配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ
ハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチド以下である。ある特定の態様で
は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４～２０ヌクレオチド長、例え
ば、５～１５、５～１０、５～９、５～８、または５～７（例えば、６または７）ヌクレ
オチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション
領域は、ランダムヌクレオチド配列を含み（例えば、それからなり）、従って様々なラン
ダムＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一なスプリント
オリゴヌクレオチドが用いられる場合、その集合が、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の配
列にかかわらず、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチ
ドとして機能することができる。
任意の好適な長さおよび配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ
ハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチド以下である。ある特定の態様で
は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４～２０ヌクレオチド長、例え
ば、５～１５、５～１０、５～９、５～８、または５～７（例えば、６または７）ヌクレ
オチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション
領域は、ランダムヌクレオチド配列を含み（例えば、それからなり）、従って様々なラン
ダムＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一なスプリント
オリゴヌクレオチドが用いられる場合、その集合が、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の配
列にかかわらず、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチ
ドとして機能することができる。
【0040】
したがって、ある特定の態様では、方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴ
ヌクレオチドと、未定の配列の末端領域を有するＳＳＢ結合ｓｓＮＡの非均一集団のため
のスプリントオリゴヌクレオチドとして機能することができる様々なランダムＳＳＢ結合
ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の非均一スプリントオリゴヌクレオチ
ドとを組み合わせることによって複合体を形成することを含む。
ヌクレオチドと、未定の配列の末端領域を有するＳＳＢ結合ｓｓＮＡの非均一集団のため
のスプリントオリゴヌクレオチドとして機能することができる様々なランダムＳＳＢ結合
ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の非均一スプリントオリゴヌクレオチ
ドとを組み合わせることによって複合体を形成することを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、既知の
配列のＳＳＢ結合ｓｓＮＡ末端領域にハイブリダイズするように設計された既知の配列を
含む。ある特定の態様では、既知の配列のそれぞれのＳＳＢ結合ｓｓＮＡ末端領域にハイ
ブリダイズするように設計された既知の配列の異なるＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼ
ーション領域を有する２つ以上の不均一スプリントオリゴヌクレオチドが用いられる。Ｓ
ＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が既知の配列を有する実施形態は、例えば
、既知の配列の末端領域を有するＳＳＢ結合ｓｓＮＡのサブセットのみから核酸ライブラ
リを生成することが望ましい場合、用途を見出す。したがって、ある特定の態様では、方
法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴヌクレオチドと、既知の配列の１つ以上
の末端領域を有する１つ以上のＳＳＢ結合ｓｓＮＡのためのスプリントオリゴヌクレオチ
ドとして機能することができる既知の配列の１つ以上の異なるＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブ
リダイゼーション領域を有する１つ以上の不均一スプリントオリゴヌクレオチドとを組み
合わせることによって複合体を形成することを含む。
配列のＳＳＢ結合ｓｓＮＡ末端領域にハイブリダイズするように設計された既知の配列を
含む。ある特定の態様では、既知の配列のそれぞれのＳＳＢ結合ｓｓＮＡ末端領域にハイ
ブリダイズするように設計された既知の配列の異なるＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼ
ーション領域を有する２つ以上の不均一スプリントオリゴヌクレオチドが用いられる。Ｓ
ＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が既知の配列を有する実施形態は、例えば
、既知の配列の末端領域を有するＳＳＢ結合ｓｓＮＡのサブセットのみから核酸ライブラ
リを生成することが望ましい場合、用途を見出す。したがって、ある特定の態様では、方
法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴヌクレオチドと、既知の配列の１つ以上
の末端領域を有する１つ以上のＳＳＢ結合ｓｓＮＡのためのスプリントオリゴヌクレオチ
ドとして機能することができる既知の配列の１つ以上の異なるＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブ
リダイゼーション領域を有する１つ以上の不均一スプリントオリゴヌクレオチドとを組み
合わせることによって複合体を形成することを含む。
【0042】
ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、１つ以上の
ユニバーサル塩基を含む。本明細書で使用される場合、「ユニバーサル塩基」は、４つの
標準ヌクレオチド塩基：Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの各々と無差別に塩基対合することができ
る塩基である。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込まれ得るユニバ
ーサル塩基としては、これらに限定されないが、２’－デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎ
ｏｓｉｎｅ）および５－ニトロインドールが挙げられる。
ユニバーサル塩基を含む。本明細書で使用される場合、「ユニバーサル塩基」は、４つの
標準ヌクレオチド塩基：Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの各々と無差別に塩基対合することができ
る塩基である。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込まれ得るユニバ
ーサル塩基としては、これらに限定されないが、２’－デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎ
ｏｓｉｎｅ）および５－ニトロインドールが挙げられる。
【0043】
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレ
オチドを組み合わせる方法は、変化し得る。いくつかの実施形態では、組み合わせること
は、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡとを組み合わせることを含む。他の態様では、組み合わせることは、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリ
ダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、アダプターオリゴヌクレオ
チドとを組み合わせることを含む。さらに他の態様では、組み合わせることは、ＳＳＢ結
合ｓｓＮＡ、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組
み合わせることを含み、３つの構成成分のいずれも、組み合わせる前に別の構成成分と予
め複合体化（すなわち、ハイブリダイズ）されていない。
オチドを組み合わせる方法は、変化し得る。いくつかの実施形態では、組み合わせること
は、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡとを組み合わせることを含む。他の態様では、組み合わせることは、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリ
ダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、アダプターオリゴヌクレオ
チドとを組み合わせることを含む。さらに他の態様では、組み合わせることは、ＳＳＢ結
合ｓｓＮＡ、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組
み合わせることを含み、３つの構成成分のいずれも、組み合わせる前に別の構成成分と予
め複合体化（すなわち、ハイブリダイズ）されていない。
【0044】
組み合わせることは、複合体が、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介
してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチ
ドと、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドとを含むように
、ハイブリダイゼーション条件下で実施される。特異的なハイブリダイゼーションが起こ
るかどうかは、スプリントオリゴヌクレオチドの関連する（すなわちハイブリダイゼーシ
ョンする）領域と、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域と、アダプターオリゴヌクレオチドと
の間の相補性の程度、ならびにそれらの長さ、塩濃度、およびハイブリダイゼーションが
起こる温度（関連する領域の融解温度（ＴＭ）によって通知され得る）のような要因によ
って決定される。融解温度は、関連する領域の半分がハイブリダイズされたままであり、
関連する領域の半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、以下の式Ｔｍ＝８
１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ割合）－（６０／Ｎ）を
使用して実験的に決定または予測することができ、式中、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は
１Ｍ未満である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１；Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照されたい。様々なパラメータに依存する他のより
先進的なモデルも、様々なハイブリダイゼーション条件に応じて、関連する領域のＴｍを
予測するために使用することができる。特異的核酸ハイブリダイゼーションを達成するた
めのアプローチは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，
ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に
見出され得る。
してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチ
ドと、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドとを含むように
、ハイブリダイゼーション条件下で実施される。特異的なハイブリダイゼーションが起こ
るかどうかは、スプリントオリゴヌクレオチドの関連する（すなわちハイブリダイゼーシ
ョンする）領域と、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域と、アダプターオリゴヌクレオチドと
の間の相補性の程度、ならびにそれらの長さ、塩濃度、およびハイブリダイゼーションが
起こる温度（関連する領域の融解温度（ＴＭ）によって通知され得る）のような要因によ
って決定される。融解温度は、関連する領域の半分がハイブリダイズされたままであり、
関連する領域の半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、以下の式Ｔｍ＝８
１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ割合）－（６０／Ｎ）を
使用して実験的に決定または予測することができ、式中、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は
１Ｍ未満である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１；Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照されたい。様々なパラメータに依存する他のより
先進的なモデルも、様々なハイブリダイゼーション条件に応じて、関連する領域のＴｍを
予測するために使用することができる。特異的核酸ハイブリダイゼーションを達成するた
めのアプローチは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，
ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に
見出され得る。
【0045】
本明細書で使用される「相補的」または「相補性」という用語は、標的核酸の領域への
非共有結合によって塩基対合するヌクレオチド配列、例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端
領域にハイブリダイズするＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域のヌクレオチ
ド配列、およびプローブ相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするアダプターオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域のヌクレオチド配列を指す。正準ワトソン－
クリック型塩基対において、ＤＮＡでグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と塩基対を形成す
るように、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対合する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラ
シル（Ｕ）で置き換えられる。したがって、Ａは、Ｔに相補的であり、Ｇは、Ｃに相補的
である。ＲＮＡでは、Ａは、Ｕに相補的であり、その逆もまた同様である。典型的には、
「相補的」または「相補性」とは、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す
。これらの用語はまた、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが対応する位置の他方の鎖のす
べてのヌクレオチドに相補的であるように完全に相補的な二本鎖も包含し得る。場合によ
っては、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であり得、その場合、すべての対応
する位置において、すべてのヌクレオチドが標的核酸中のすべてのヌクレオチドに相補的
であるとは限らない。例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ＳＳ
Ｂ結合ｓｓＮＡの末端領域に完全に（すなわち、１００％）相補的であり得るか、または
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、完全ではないある程度の（例えば、
７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％の）相補性を共有し得る。２つのヌク
レオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列させることによ
って決定することができる（例えば、最適な整列のために第１の配列の配列にギャップを
導入することができる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較し、２つの配列間
の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわ
ち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列中の位置が他方の配列
中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、それらの分子は、そ
の位置で同一である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例はＫａｒｌｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７
７（１９９３）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３８９－３４０２（１９９７）
に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．
０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用
するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使
用することができる。一態様では、配列比較のためのパラメータは、スコア＝１００、ワ
ード長＝１２に設定することができ、または変更することができる（例えば、ワード長＝
５またはワード長＝２０）。
非共有結合によって塩基対合するヌクレオチド配列、例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端
領域にハイブリダイズするＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域のヌクレオチ
ド配列、およびプローブ相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするアダプターオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域のヌクレオチド配列を指す。正準ワトソン－
クリック型塩基対において、ＤＮＡでグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と塩基対を形成す
るように、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対合する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラ
シル（Ｕ）で置き換えられる。したがって、Ａは、Ｔに相補的であり、Ｇは、Ｃに相補的
である。ＲＮＡでは、Ａは、Ｕに相補的であり、その逆もまた同様である。典型的には、
「相補的」または「相補性」とは、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す
。これらの用語はまた、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが対応する位置の他方の鎖のす
べてのヌクレオチドに相補的であるように完全に相補的な二本鎖も包含し得る。場合によ
っては、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であり得、その場合、すべての対応
する位置において、すべてのヌクレオチドが標的核酸中のすべてのヌクレオチドに相補的
であるとは限らない。例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ＳＳ
Ｂ結合ｓｓＮＡの末端領域に完全に（すなわち、１００％）相補的であり得るか、または
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、完全ではないある程度の（例えば、
７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％の）相補性を共有し得る。２つのヌク
レオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列させることによ
って決定することができる（例えば、最適な整列のために第１の配列の配列にギャップを
導入することができる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較し、２つの配列間
の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわ
ち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列中の位置が他方の配列
中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、それらの分子は、そ
の位置で同一である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例はＫａｒｌｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７
７（１９９３）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３８９－３４０２（１９９７）
に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．
０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用
するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使
用することができる。一態様では、配列比較のためのパラメータは、スコア＝１００、ワ
ード長＝１２に設定することができ、または変更することができる（例えば、ワード長＝
５またはワード長＝２０）。
【0046】
複合体は、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末
端に隣接するように形成される。「に隣接する」とは、アダプターオリゴヌクレオチドの
末端の末端ヌクレオチド、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端
が互いに十分に近接しており、それらの末端ヌクレオチドが、例えば、化学ライゲーショ
ン、酵素的ライゲーションなどによって共有結合し得ることを意味する。いくつかの実施
形態では、それらの末端は、アダプターオリゴヌクレオチドの末端にある末端ヌクレオチ
ドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端とが、スプリントオリゴヌ
クレオチドの隣接するヌクレオチドにハイブリダイズすることにより互いに隣接する。ス
プリントオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓ
ＮＡの末端領域の末端に隣接することを確実にするように設計され得る。かかるスプリン
トオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の実験セクションに提供されている。
端に隣接するように形成される。「に隣接する」とは、アダプターオリゴヌクレオチドの
末端の末端ヌクレオチド、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端
が互いに十分に近接しており、それらの末端ヌクレオチドが、例えば、化学ライゲーショ
ン、酵素的ライゲーションなどによって共有結合し得ることを意味する。いくつかの実施
形態では、それらの末端は、アダプターオリゴヌクレオチドの末端にある末端ヌクレオチ
ドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端とが、スプリントオリゴヌ
クレオチドの隣接するヌクレオチドにハイブリダイズすることにより互いに隣接する。ス
プリントオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓ
ＮＡの末端領域の末端に隣接することを確実にするように設計され得る。かかるスプリン
トオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の実験セクションに提供されている。
【0047】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳ
Ｂ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得る。共有結合は、
隣接する末端をライゲーションすることを含み得る。隣接する末端のライゲーションは、
任意の好適なアプローチを使用して実施され得る。ある特定の態様では、ライゲーション
は、化学ライゲーションによるものである。他の態様では、ライゲーションは、酵素的ラ
イゲーションによるものである。酵素的ライゲーション反応を行うための好適な試薬（例
えば、リガーゼおよび対応する緩衝液など）およびキットは、既知であり、例えば、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能なＩｎｓｔ
ａｎｔ Ｓｔｉｃｋｙ－ｅｎｄ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘが利用可能である
。用いられ得るリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（例えば、低濃度また
は高濃度）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｌｉｇａｓｅ（登録商標）などが挙げられる。ライゲーション反
応を行うのに好適な条件は、使用されるリガーゼの種類に応じて変化するであろう。かか
る条件に関する情報は、容易に利用可能である。必要な場合、例えば、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ＰＮＫ）などの好適なキナーゼを使用して、アダプターオリゴヌクレオチ
ドまたはＳＳＢ結合ｓｓＮＡの５’末端にリン酸基が付加され得る。かかるキナーゼおよ
びかかるキナーゼを使用して５’末端をリン酸化するためのガイダンスは、例えば、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から利用可能
である。
Ｂ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得る。共有結合は、
隣接する末端をライゲーションすることを含み得る。隣接する末端のライゲーションは、
任意の好適なアプローチを使用して実施され得る。ある特定の態様では、ライゲーション
は、化学ライゲーションによるものである。他の態様では、ライゲーションは、酵素的ラ
イゲーションによるものである。酵素的ライゲーション反応を行うための好適な試薬（例
えば、リガーゼおよび対応する緩衝液など）およびキットは、既知であり、例えば、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能なＩｎｓｔ
ａｎｔ Ｓｔｉｃｋｙ－ｅｎｄ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘが利用可能である
。用いられ得るリガーゼとしては、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（例えば、低濃度また
は高濃度）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｌｉｇａｓｅ（登録商標）などが挙げられる。ライゲーション反
応を行うのに好適な条件は、使用されるリガーゼの種類に応じて変化するであろう。かか
る条件に関する情報は、容易に利用可能である。必要な場合、例えば、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ＰＮＫ）などの好適なキナーゼを使用して、アダプターオリゴヌクレオチ
ドまたはＳＳＢ結合ｓｓＮＡの５’末端にリン酸基が付加され得る。かかるキナーゼおよ
びかかるキナーゼを使用して５’末端をリン酸化するためのガイダンスは、例えば、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から利用可能
である。
【0048】
いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオ
チド、またはその両方は、ブロッキング修飾を含む。例えば、スプリントオリゴヌクレオ
チドの一方または両方の末端がブロッキング修飾を含み得、かつ／または、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がブロッキング修飾を含み
得る。「ブロッキング修飾」とは、アダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓ
ＮＡの隣接する末端を共有結合させるために利用されるアプローチを使用して、当該末端
が他のオリゴヌクレオチド成分の末端に連結される能力がないことを意味する。ある特定
の態様では、ブロッキング修飾は、ライゲーションをブロックする修飾である。スプリン
トオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方の末端、および／または、アダプターオリゴヌ
クレオチドのうちＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端に含まれ得るブロッキング修
飾の例としては、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの
末端での３’ＯＨの不在、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴ
ヌクレオチドの末端でアクセス不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端がアクセス不可能な
３’ＯＨを有するブロッキング修飾の非限定的な例としては、アミノ修飾因子、スペーサ
ー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、３’ホスフェートなどが挙げられる。
チド、またはその両方は、ブロッキング修飾を含む。例えば、スプリントオリゴヌクレオ
チドの一方または両方の末端がブロッキング修飾を含み得、かつ／または、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がブロッキング修飾を含み
得る。「ブロッキング修飾」とは、アダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓ
ＮＡの隣接する末端を共有結合させるために利用されるアプローチを使用して、当該末端
が他のオリゴヌクレオチド成分の末端に連結される能力がないことを意味する。ある特定
の態様では、ブロッキング修飾は、ライゲーションをブロックする修飾である。スプリン
トオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方の末端、および／または、アダプターオリゴヌ
クレオチドのうちＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端に含まれ得るブロッキング修
飾の例としては、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの
末端での３’ＯＨの不在、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴ
ヌクレオチドの末端でアクセス不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端がアクセス不可能な
３’ＯＨを有するブロッキング修飾の非限定的な例としては、アミノ修飾因子、スペーサ
ー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、３’ホスフェートなどが挙げられる。
【0049】
ある特定の態様では、スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド
、またはその両方は、１つ以上の非天然ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログとも称され
得る）を含む。スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、または
その両方に含まれ得る非天然ヌクレオチドの非限定的な例は、ＬＮＡ（ロックド核酸）、
ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＦＡＮＡ（２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノヌクレオ
チド）、ＧＮＡ（グリコール核酸）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮ
Ａ、２’－フルオロＲＮＡ、モルホリノヌクレオチド、およびそれらの任意の組み合わせ
である。
、またはその両方は、１つ以上の非天然ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログとも称され
得る）を含む。スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、または
その両方に含まれ得る非天然ヌクレオチドの非限定的な例は、ＬＮＡ（ロックド核酸）、
ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＦＡＮＡ（２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノヌクレオ
チド）、ＧＮＡ（グリコール核酸）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮ
Ａ、２’－フルオロＲＮＡ、モルホリノヌクレオチド、およびそれらの任意の組み合わせ
である。
【0050】
アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させ
ることにより、アダプター付（adapted）ｓｓＮＡが生成され、ここで「アダプター付」
とは、ｓｓＮＡが１つ以上のアダプター配列またはそのサブ領域を含むことを意味する。
アダプター付ｓｓＮＡは、目的の下流アプリケーションにおいてインプットとして使用さ
れる前に精製され得る。例えば、複合体は、アダプター付ｓｓＮＡをスプリントオリゴヌ
クレオチドから分離するために変性（例えば、熱変性）されてもよく、アダプター付ｓｓ
ＮＡは、ＳＳＢ、および／または、（例えば固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）、カラム精製、
および／または同等物による）接触および／または組み合わせステップ中に存在する任意
の他の構成成分から、またはそれらの組み合わせから、精製されてもよい。
ることにより、アダプター付（adapted）ｓｓＮＡが生成され、ここで「アダプター付」
とは、ｓｓＮＡが１つ以上のアダプター配列またはそのサブ領域を含むことを意味する。
アダプター付ｓｓＮＡは、目的の下流アプリケーションにおいてインプットとして使用さ
れる前に精製され得る。例えば、複合体は、アダプター付ｓｓＮＡをスプリントオリゴヌ
クレオチドから分離するために変性（例えば、熱変性）されてもよく、アダプター付ｓｓ
ＮＡは、ＳＳＢ、および／または、（例えば固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）、カラム精製、
および／または同等物による）接触および／または組み合わせステップ中に存在する任意
の他の構成成分から、またはそれらの組み合わせから、精製されてもよい。
【0051】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列またはそのサブ領域は、１つ以上
の配列決定アダプターまたはそのサブ領域であり、方法は、アダプター付ｓｓＮＡまたは
その誘導体（例えば、アダプター付ｓｓＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅に
よって生成される増幅体）の少なくとも一部を配列決定することをさらに含む。配列決定
は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）（または「次世代配列決定（ＮＧＳ）」）プラ
ットフォームなどを含む任意の好適な配列決定プラットフォーム上で実施され得る。目的
のＨＴＳ／ＮＧＳ配列決定プラットフォームとしては、これらに限定されないが、Ｉｌｌ
ｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳ
ｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（
商標）配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ（商標）、ＧｒｉｄＩＯＮｘ５（商標）、Ｐｒｏｍｅｔ
ｈＩＯＮ（商標）、またはＳｍｉｄｇＩＯＮ（商標）ナノポアベースの配列決定システム
）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／または
Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌまたはＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、
Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決
定システム）その他の配列決定プラットフォームが挙げられる。直接配列決定すること（
例えば、ナノポアベースの配列決定によって）または特定のプラットフォームで配列決定
するために適合可能な核酸分子を調製すること（例えば、増幅によって、例えば、固相増
幅など）、適合可能な分子を配列決定すること、および配列決定データを分析することの
ための詳細なプロトコルは、目的の配列決定プラットフォームの製造業者から入手可能で
ある。
の配列決定アダプターまたはそのサブ領域であり、方法は、アダプター付ｓｓＮＡまたは
その誘導体（例えば、アダプター付ｓｓＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅に
よって生成される増幅体）の少なくとも一部を配列決定することをさらに含む。配列決定
は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）（または「次世代配列決定（ＮＧＳ）」）プラ
ットフォームなどを含む任意の好適な配列決定プラットフォーム上で実施され得る。目的
のＨＴＳ／ＮＧＳ配列決定プラットフォームとしては、これらに限定されないが、Ｉｌｌ
ｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳ
ｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（
商標）配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ（商標）、ＧｒｉｄＩＯＮｘ５（商標）、Ｐｒｏｍｅｔ
ｈＩＯＮ（商標）、またはＳｍｉｄｇＩＯＮ（商標）ナノポアベースの配列決定システム
）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／または
Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌまたはＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、
Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決
定システム）その他の配列決定プラットフォームが挙げられる。直接配列決定すること（
例えば、ナノポアベースの配列決定によって）または特定のプラットフォームで配列決定
するために適合可能な核酸分子を調製すること（例えば、増幅によって、例えば、固相増
幅など）、適合可能な分子を配列決定すること、および配列決定データを分析することの
ための詳細なプロトコルは、目的の配列決定プラットフォームの製造業者から入手可能で
ある。
【0052】
上に要約されるように、本開示の方法は、Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７
）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９によって記載
されるアプローチ（「ｓｓＤＮＡ２．０」と称される）などの、一本鎖ライブラリ調製に
対する現在の最先端のアプローチの改善を構成し、本方法は、驚くべきことに、より効率
的であり、より少ない時間を必要とし、コストを低減することが見出された。いくつかの
実施形態では、方法が、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接す
る末端を共有結合させることを含む場合、組み合わせおよび共有結合ステップの合計時間
は、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下である。ある特定の態様で
は、方法が、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共
有結合させることを含む場合、接触、組み合わせ、および共有結合ステップの合計時間は
、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下である。いくつかの実施形態
では、方法の効率は、接触ステップ中にＳＳＢと接触されたｓｓＮＡの７０％以上、７５
％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上から複合
体が形成されるようになるものである。
）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９によって記載
されるアプローチ（「ｓｓＤＮＡ２．０」と称される）などの、一本鎖ライブラリ調製に
対する現在の最先端のアプローチの改善を構成し、本方法は、驚くべきことに、より効率
的であり、より少ない時間を必要とし、コストを低減することが見出された。いくつかの
実施形態では、方法が、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接す
る末端を共有結合させることを含む場合、組み合わせおよび共有結合ステップの合計時間
は、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下である。ある特定の態様で
は、方法が、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共
有結合させることを含む場合、接触、組み合わせ、および共有結合ステップの合計時間は
、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下である。いくつかの実施形態
では、方法の効率は、接触ステップ中にＳＳＢと接触されたｓｓＮＡの７０％以上、７５
％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上から複合
体が形成されるようになるものである。
【0053】
組成物
上に要約されるように、本開示はまた、組成物を提供する。組成物は、例えば、本開示
の方法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの１つ以上を実施するこ
とを含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使
用を見出す。したがって、組成物は、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴ
ヌクレオチド（非均一オリゴヌクレオチドの複数／集合を含む）、ｓｓＮＡ、ＳＳＢ、他
の試薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
上に要約されるように、本開示はまた、組成物を提供する。組成物は、例えば、本開示
の方法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの１つ以上を実施するこ
とを含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使
用を見出す。したがって、組成物は、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴ
ヌクレオチド（非均一オリゴヌクレオチドの複数／集合を含む）、ｓｓＮＡ、ＳＳＢ、他
の試薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
【0054】
ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドとを含む
組成物が提供される。かかる組成物は、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーション領域を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとをさらに含み得
る。
、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドとを含む
組成物が提供される。かかる組成物は、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーション領域を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとをさらに含み得
る。
【0055】
ある特定の態様では、ハイブリダイズされた複合体として存在する（例えば、ＳＳＢ結
合ｓｓＮＡの不在下で）、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を
介してアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオ
チドを含む複合体を含む組成物が提供される。他の態様では、ハイブリダイズされた複合
体として存在する、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合
ｓｓＮＡにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成
物が提供される。
合ｓｓＮＡの不在下で）、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を
介してアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオ
チドを含む複合体を含む組成物が提供される。他の態様では、ハイブリダイズされた複合
体として存在する、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合
ｓｓＮＡにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成
物が提供される。
【0056】
ｓｓＮＡは、ｓｓＤＮＡであり得る。ｓｓＮＡがｓｓＤＮＡである場合、ｓｓＤＮＡは
ｄｓＤＮＡに由来し得る。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、ｓｓＲＮＡである。い
くつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、分解された核酸試料からのものである。ある特定の
態様では、ｓｓＮＡが分解核酸試料からのものであるとき、そのｓｓＮＡは、絶滅した生
物または動物、例えば、絶滅した哺乳動物から得られる（例えば、単離される）核酸試料
などの、古代核酸試料からのものである。ある特定の態様では、絶滅した哺乳動物は、ヒ
ト属からのものである。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、法医学核酸試料からのも
のである。
ｄｓＤＮＡに由来し得る。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、ｓｓＲＮＡである。い
くつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、分解された核酸試料からのものである。ある特定の
態様では、ｓｓＮＡが分解核酸試料からのものであるとき、そのｓｓＮＡは、絶滅した生
物または動物、例えば、絶滅した哺乳動物から得られる（例えば、単離される）核酸試料
などの、古代核酸試料からのものである。ある特定の態様では、絶滅した哺乳動物は、ヒ
ト属からのものである。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、法医学核酸試料からのも
のである。
【0057】
本開示の組成物は、アダプターオリゴヌクレオチド末端をＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に
共有結合させるための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、化学ラ
イゲーション試薬または酵素的ライゲーション試薬、例えば、リガーゼである。
共有結合させるための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、化学ラ
イゲーション試薬または酵素的ライゲーション試薬、例えば、リガーゼである。
【0058】
本開示の組成物は、容器内に存在する１つ以上の構成成分を含み得る。好適な容器とし
ては、これらに限定されないが、チューブ、バイアル、およびプレート（例えば、９６ウ
ェルプレートまたは他のウェルプレート）が挙げられる。
ては、これらに限定されないが、チューブ、バイアル、およびプレート（例えば、９６ウ
ェルプレートまたは他のウェルプレート）が挙げられる。
【0059】
ある特定の態様では、組成物は、液体媒体中の１つ以上の構成成分を含む。液体媒体は
、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例
えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２
－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２
－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスル
ホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ
）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ
）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌク
レアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などが、かかる組成物中に存在し得る。
、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例
えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２
－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２
－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスル
ホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ
）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ
）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌク
レアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などが、かかる組成物中に存在し得る。
【0060】
キット
上記に要約したように、本開示は、キットを提供する。キットは、例えば、本開示の方
法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの１つ以上を実施することを
含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使用を
見出す。したがって、キットは、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴヌク
レオチド（非均一オリゴヌクレオチドの複数／集合を含む）、ｓｓＮＡ、ＳＳＢ、他の試
薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
上記に要約したように、本開示は、キットを提供する。キットは、例えば、本開示の方
法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの１つ以上を実施することを
含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使用を
見出す。したがって、キットは、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴヌク
レオチド（非均一オリゴヌクレオチドの複数／集合を含む）、ｓｓＮＡ、ＳＳＢ、他の試
薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ、例
えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質、またはその両方）と
、第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション
領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１
のスプリントオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、お
よび第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指
示とを含む。ある特定の態様では、かかるキットは、第２のアダプターオリゴヌクレオチ
ドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌ
クレオチドを含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとをさらに含み、この場合の指示
は、ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチ
ド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を使用して核酸ライブラリを生成するためのものである。
えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質、またはその両方）と
、第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション
領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１
のスプリントオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、お
よび第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指
示とを含む。ある特定の態様では、かかるキットは、第２のアダプターオリゴヌクレオチ
ドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌ
クレオチドを含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとをさらに含み、この場合の指示
は、ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチ
ド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を使用して核酸ライブラリを生成するためのものである。
【0062】
本開示のキットは、アダプターオリゴヌクレオチド末端をＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に
共有結合させるための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、化学ラ
イゲーション試薬または酵素的ライゲーション試薬、例えば、リガーゼである。
共有結合させるための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、化学ラ
イゲーション試薬または酵素的ライゲーション試薬、例えば、リガーゼである。
【0063】
いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオ
チド、またはその両方は、ブロッキング修飾を含む。例えば、スプリントオリゴヌクレオ
チドの一方または両方の末端がブロッキング修飾を含み得、かつ／または、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がブロッキング修飾を含み
得る。ある特定の態様では、ブロッキング修飾は、ライゲーションをブロックする修飾で
ある。スプリントオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方の末端、および／またはＳＳＢ
結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端に含まれ得るブロッ
キング修飾の例としては、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレ
オチドの末端での３’ＯＨの不在、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプタ
ーオリゴヌクレオチドの末端でアクセス不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端がアクセス
不可能な３’ＯＨを有することになるブロッキング修飾の非限定的な例としては、アミノ
修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、３’ホスフェートなどが
挙げられる。
チド、またはその両方は、ブロッキング修飾を含む。例えば、スプリントオリゴヌクレオ
チドの一方または両方の末端がブロッキング修飾を含み得、かつ／または、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がブロッキング修飾を含み
得る。ある特定の態様では、ブロッキング修飾は、ライゲーションをブロックする修飾で
ある。スプリントオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方の末端、および／またはＳＳＢ
結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端に含まれ得るブロッ
キング修飾の例としては、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレ
オチドの末端での３’ＯＨの不在、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプタ
ーオリゴヌクレオチドの末端でアクセス不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端がアクセス
不可能な３’ＯＨを有することになるブロッキング修飾の非限定的な例としては、アミノ
修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、３’ホスフェートなどが
挙げられる。
【0064】
いくつかの実施形態では、本開示のキットにおいて提供される１つ以上のスプリントオ
リゴヌクレオチドは、ランダムヌクレオチド配列を含む（例えば、それからなる）ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含み、従ってキットが様々なランダムＳＳＢ
結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一なスプリントオリゴヌク
レオチドを含む場合において、その集合が、目的のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の配列
にかかわらず、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチド
として機能することができる。
リゴヌクレオチドは、ランダムヌクレオチド配列を含む（例えば、それからなる）ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含み、従ってキットが様々なランダムＳＳＢ
結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一なスプリントオリゴヌク
レオチドを含む場合において、その集合が、目的のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の配列
にかかわらず、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチド
として機能することができる。
【0065】
ある特定の態様では、本開示のキットで提供されるスプリントオリゴヌクレオチドは、
１つ以上のユニバーサル塩基を含むＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含
む。ＳＳＢ結合のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込まれ得るユニバーサル塩
基としては、これらに限定されないが、２’－デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎｏｓｉｎ
ｅ）および５－ニトロインドールが挙げられる。
１つ以上のユニバーサル塩基を含むＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含
む。ＳＳＢ結合のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込まれ得るユニバーサル塩
基としては、これらに限定されないが、２’－デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎｏｓｉｎ
ｅ）および５－ニトロインドールが挙げられる。
【0066】
いくつかの実施形態では、本開示のキットにおいて提供されるスプリントオリゴヌクレ
オチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチド以
下である。ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４
～２０ヌクレオチド長、例えば、５～１５、５～１０、５～９、５～８、または５～７（
例えば、６または７）ヌクレオチド長である。
オチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチド以
下である。ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４
～２０ヌクレオチド長、例えば、５～１５、５～１０、５～９、５～８、または５～７（
例えば、６または７）ヌクレオチド長である。
【0067】
主題のキットの構成成分は、別々の容器に存在してもよく、または複数の構成成分が単
一の容器に存在してもよい。好適な容器には、単一チューブ（例えば、バイアル）、１つ
以上のウェルのプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）な
どが含まれる。
一の容器に存在してもよい。好適な容器には、単一チューブ（例えば、バイアル）、１つ
以上のウェルのプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）な
どが含まれる。
【0068】
ＳＳＢ、１つ以上のアダプターオリゴヌクレオチド、および１つ以上のスプリントオリ
ゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示は、好適な記録媒体に記
録され得る。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができ
る。そのようにして、指示は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成
成分のラベルなどに（すなわち、包装または副包装に付随して）存在し得る。他の実施形
態では、指示は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット
などの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在
する。さらに他の実施形態では、実際の指示はキット内には存在しないが、例えば、イン
ターネットを介してリモートソースから指示を取得するための手段が提供される。この実
施形態の一例は、指示を閲覧することができかつ／または指示をダウンロードできるウェ
ブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るための手段は、適切な基材上
に記録される。
ゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示は、好適な記録媒体に記
録され得る。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができ
る。そのようにして、指示は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成
成分のラベルなどに（すなわち、包装または副包装に付随して）存在し得る。他の実施形
態では、指示は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット
などの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在
する。さらに他の実施形態では、実際の指示はキット内には存在しないが、例えば、イン
ターネットを介してリモートソースから指示を取得するための手段が提供される。この実
施形態の一例は、指示を閲覧することができかつ／または指示をダウンロードできるウェ
ブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るための手段は、適切な基材上
に記録される。
【0069】
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
【実施例0070】
実験
実施例１
１つの反応における一本鎖ＤＮＡへの迅速で効率的で標的化されたアダプターのライゲ
ーションのためのアプローチがここに開示される。以下の実施例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｐ７またはＰ５アダプター配列を含む配列決定アダプターオリゴヌクレオチドが、Ｐ７
スプリントについては一連の３プライムＮおよびＰ５スプリントについては一連の５プラ
イムＮを含むスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。スプリントは、二
本鎖ライゲーションのみ高効率で行うことができるリガーゼに、アダプターを標的一本鎖
ＤＮＡにライゲーションさせるための機会を作り出す。ライゲーションに関与することが
必要とされないすべてのオリゴヌクレオチドＤＮＡ末端は、ライゲーションを防止するオ
リゴヌクレオチド修飾（例えばアミノ修飾）によってブロックされる。
実施例１
１つの反応における一本鎖ＤＮＡへの迅速で効率的で標的化されたアダプターのライゲ
ーションのためのアプローチがここに開示される。以下の実施例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｐ７またはＰ５アダプター配列を含む配列決定アダプターオリゴヌクレオチドが、Ｐ７
スプリントについては一連の３プライムＮおよびＰ５スプリントについては一連の５プラ
イムＮを含むスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。スプリントは、二
本鎖ライゲーションのみ高効率で行うことができるリガーゼに、アダプターを標的一本鎖
ＤＮＡにライゲーションさせるための機会を作り出す。ライゲーションに関与することが
必要とされないすべてのオリゴヌクレオチドＤＮＡ末端は、ライゲーションを防止するオ
リゴヌクレオチド修飾（例えばアミノ修飾）によってブロックされる。
【0071】
アッセイへの一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の添加は、反応の効率を増加させる。標
的ＤＮＡの濃度および長さを使用して、最適なライゲーション効率を達成するために適切
なＳＳＢの量を計算する。ＳＳＢは、二次構造を防止しながら、一本鎖ＤＮＡの再アニー
リングを防止し得る。
的ＤＮＡの濃度および長さを使用して、最適なライゲーション効率を達成するために適切
なＳＳＢの量を計算する。ＳＳＢは、二次構造を防止しながら、一本鎖ＤＮＡの再アニー
リングを防止し得る。
【0072】
この方法は、ＳＳ２．０として知られている、Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０
１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９によって
記載されている一本鎖ライブラリ調製に比べて勝るとも劣らない。ＳＳ２．０と比較して
、本方法は、有意に少ない時間を要し、配列決定され得る適切なアダプターライゲーショ
ンＤＮＡ分子へのＤＮＡの変換の著しく増加した効率を呈する。加えて、本アプローチは
、ＳＳ２．０と比較して試薬コストを削減する。
１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９によって
記載されている一本鎖ライブラリ調製に比べて勝るとも劣らない。ＳＳ２．０と比較して
、本方法は、有意に少ない時間を要し、配列決定され得る適切なアダプターライゲーショ
ンＤＮＡ分子へのＤＮＡの変換の著しく増加した効率を呈する。加えて、本アプローチは
、ＳＳ２．０と比較して試薬コストを削減する。
【0073】
アダプターおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、適切なアダプターライゲーション
には関与するべきでないすべての末端に、ライゲーションをブロックする修飾を担持する
ように操作される。これには、Ｐ５アダプターの５プライム末端、Ｐ７アダプターの３プ
ライム末端、およびスプリントのすべての末端をブロックすることが含まれる。これらの
ライゲーションブロッキング修飾は、アミノ修飾因子、炭素スペーサー、ジデオキシ塩基
、または、３プライム末端の３プライムヒドロキシル基もしくは５プライム末端の５プラ
イムホスフェートへのリガーゼのアクセスを防止する任意の他の好適な修飾であり得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ（ＩＤＴ）によって合成され得る。例のオリゴヌクレオチドを以下の表１に示す。
には関与するべきでないすべての末端に、ライゲーションをブロックする修飾を担持する
ように操作される。これには、Ｐ５アダプターの５プライム末端、Ｐ７アダプターの３プ
ライム末端、およびスプリントのすべての末端をブロックすることが含まれる。これらの
ライゲーションブロッキング修飾は、アミノ修飾因子、炭素スペーサー、ジデオキシ塩基
、または、３プライム末端の３プライムヒドロキシル基もしくは５プライム末端の５プラ
イムホスフェートへのリガーゼのアクセスを防止する任意の他の好適な修飾であり得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ（ＩＤＴ）によって合成され得る。例のオリゴヌクレオチドを以下の表１に示す。
【表1】
【0074】
この実施例で用いられるプロトコルでは、テンプレートＤＮＡをＳＳＢと組み合わせ、
熱変性させた。変性後、反応物を氷上または４℃におけるＰＣＲ冷却器上に置いた。冷却
後、各反応物にアダプターを添加した。次いで、反応マスター混合物を添加し、続いて混
合する。３７℃でのインキュベーションで直ちにライゲーションが開始し、４５分間まで
にほとんどのライゲーションが起こる。反応物は、確立された方法でクリーンアップする
ことができ、増幅および配列決定などの下流アプリケーションは変わらない。
熱変性させた。変性後、反応物を氷上または４℃におけるＰＣＲ冷却器上に置いた。冷却
後、各反応物にアダプターを添加した。次いで、反応マスター混合物を添加し、続いて混
合する。３７℃でのインキュベーションで直ちにライゲーションが開始し、４５分間まで
にほとんどのライゲーションが起こる。反応物は、確立された方法でクリーンアップする
ことができ、増幅および配列決定などの下流アプリケーションは変わらない。
【0075】
アダプターを調製するために、最終濃度１０ｕＭのＰ５アダプター、および最終濃度２
０μＭのＰ５スプリントオリゴヌクレオチドを、１倍の最終濃度のＴ４ ＲＮＡリガーゼ
緩衝液（カタログ番号Ｂ０２１６Ｌ）と組み合わせた。Ｐ７アダプターおよびＰ７スプリ
ントオリゴヌクレオチドを使用して、類似の別個の混合物を調製した。９５℃に１０秒間
加熱し、次いで０．１℃／秒の速度で１０℃までランプダウンすることによってアダプタ
ーをハイブリダイズさせた。
０μＭのＰ５スプリントオリゴヌクレオチドを、１倍の最終濃度のＴ４ ＲＮＡリガーゼ
緩衝液（カタログ番号Ｂ０２１６Ｌ）と組み合わせた。Ｐ７アダプターおよびＰ７スプリ
ントオリゴヌクレオチドを使用して、類似の別個の混合物を調製した。９５℃に１０秒間
加熱し、次いで０．１℃／秒の速度で１０℃までランプダウンすることによってアダプタ
ーをハイブリダイズさせた。
【0076】
例のプロトコルの例を以下に提供する。
１．試料インプット（３６ｕＬ）
ａ．剪断ＤＮＡおよびＥＴ ＳＳＢ（カタログ番号Ｍ２４０１Ｓ）を３６ｕＬの体積
に組み合わせる
ｉ．１ｕＬのＥＴ ＳＳＢは、試験したほとんどの試料タイプに対して阻害するこ
となくライゲーションを促進する
ｉｉ．緩衝液ＥＢＴ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および０．０５％
のＴｗｅｅｎ ２０）で残りの体積を充填する
２．試料変性
ａ．９５℃に予熱した蓋を有するサーモサイクラー中で試料を３分間インキュベート
する
ｂ．直ちに変性試料を氷またはＰＣＲ冷却器上に３０秒間置く。
３．２ｕＬのプールされたアダプター混合物（等しい体積のＰ５およびＰ７アダプター
）を添加する
ａ．アダプターインプットは、インプットのモル濃度に依存する。６～１０対１のモ
ル比のアダプター対テンプレートが好ましい。
４．反応マスター混合物を添加し、ピペッティングにより十分に混合する
ａ．８ｕＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）
ｂ．３２ｕＬの５０％ＰＥＧ ８０００（カタログ番号Ｂ０２１６Ｌ）
ｃ．１ｕＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ－１０，０００Ｕ／ｍＬ（カタログ番号
Ｍ０２０１Ｌ）
ｄ．１ｕＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ－２，０００，０００Ｕ／ｍＬ（カタログ番号Ｍ
０２０２Ｍ）
５．３７℃で最大６０分間インキュベートする
ａ．ほとんどのライゲーションは最初の１５分で生じるが、プラトーは約４５分まで
達成されない。
６．反応物をクリーンアップする
ａ．カラムクリーンアップ（例えば、分解ＤＮＡ用）またはＳＰＲＩ（例えば、現代
試料用）。
１．試料インプット（３６ｕＬ）
ａ．剪断ＤＮＡおよびＥＴ ＳＳＢ（カタログ番号Ｍ２４０１Ｓ）を３６ｕＬの体積
に組み合わせる
ｉ．１ｕＬのＥＴ ＳＳＢは、試験したほとんどの試料タイプに対して阻害するこ
となくライゲーションを促進する
ｉｉ．緩衝液ＥＢＴ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および０．０５％
のＴｗｅｅｎ ２０）で残りの体積を充填する
２．試料変性
ａ．９５℃に予熱した蓋を有するサーモサイクラー中で試料を３分間インキュベート
する
ｂ．直ちに変性試料を氷またはＰＣＲ冷却器上に３０秒間置く。
３．２ｕＬのプールされたアダプター混合物（等しい体積のＰ５およびＰ７アダプター
）を添加する
ａ．アダプターインプットは、インプットのモル濃度に依存する。６～１０対１のモ
ル比のアダプター対テンプレートが好ましい。
４．反応マスター混合物を添加し、ピペッティングにより十分に混合する
ａ．８ｕＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）
ｂ．３２ｕＬの５０％ＰＥＧ ８０００（カタログ番号Ｂ０２１６Ｌ）
ｃ．１ｕＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ－１０，０００Ｕ／ｍＬ（カタログ番号
Ｍ０２０１Ｌ）
ｄ．１ｕＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ－２，０００，０００Ｕ／ｍＬ（カタログ番号Ｍ
０２０２Ｍ）
５．３７℃で最大６０分間インキュベートする
ａ．ほとんどのライゲーションは最初の１５分で生じるが、プラトーは約４５分まで
達成されない。
６．反応物をクリーンアップする
ａ．カラムクリーンアップ（例えば、分解ＤＮＡ用）またはＳＰＲＩ（例えば、現代
試料用）。
【0077】
比較および最適化アッセイ
クリーンアップ後、予め増幅したライブラリの希釈物に対してｑＰＣＲを行い、ライゲ
ーション効率を決定した。より低いＣＴ値は、より高いＣＴ値を有する同じ試験の別の試
料と比較して、より高いライゲーション効率を示す。１の差は、ライブラリ効率の２倍の
差にほぼ等しい。予め増幅したライブラリのアリコートを、インデックスＰＣＲ反応でも
増幅した。インデックス化後、ライブラリをＳＰＲＩでクリーニングし、Ａｇｉｌｅｎｔ
ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ２２００システム上で可視化して、各ライブラリ内のアダプ
タアーティファクトの割合を推定した。
クリーンアップ後、予め増幅したライブラリの希釈物に対してｑＰＣＲを行い、ライゲ
ーション効率を決定した。より低いＣＴ値は、より高いＣＴ値を有する同じ試験の別の試
料と比較して、より高いライゲーション効率を示す。１の差は、ライブラリ効率の２倍の
差にほぼ等しい。予め増幅したライブラリのアリコートを、インデックスＰＣＲ反応でも
増幅した。インデックス化後、ライブラリをＳＰＲＩでクリーニングし、Ａｇｉｌｅｎｔ
ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ２２００システム上で可視化して、各ライブラリ内のアダプ
タアーティファクトの割合を推定した。
【0078】
一本鎖結合タンパク質
ＮＥＢによって供給されるＥＴ ＳＳＢタンパク質などの一本鎖結合タンパク質（ＳＳ
Ｂ）は、一本鎖ライゲーションのライゲーション効率を向上させることが観察された。イ
ンプットのモル濃度が等しいとすると、より高い平均断片長を有する試料は、ピークライ
ゲーションを達成するためにＳＳＢのより大きなインプットを必要とした。反応物中のＤ
ＮＡのモル濃度も、必要とされるＳＳＢの量に影響する。ＥＴ ＳＳＢは過剰が膨大であ
ればライゲーションを阻害する潜在能力を有する。
ＮＥＢによって供給されるＥＴ ＳＳＢタンパク質などの一本鎖結合タンパク質（ＳＳ
Ｂ）は、一本鎖ライゲーションのライゲーション効率を向上させることが観察された。イ
ンプットのモル濃度が等しいとすると、より高い平均断片長を有する試料は、ピークライ
ゲーションを達成するためにＳＳＢのより大きなインプットを必要とした。反応物中のＤ
ＮＡのモル濃度も、必要とされるＳＳＢの量に影響する。ＥＴ ＳＳＢは過剰が膨大であ
ればライゲーションを阻害する潜在能力を有する。
【0079】
プロトコル比較
本プロトコルの効率を、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キット（ｄｓＤＮＡ）、ＳＳ２．０（
Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９）、ならびにＣａｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ９（２）：４１０－
４１９およびＭａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＧｉｇａＳｃｉｅｎｃｅ ６：１－１３
に記載されている平滑末端単一チューブ（ＢＥＳＴ）法と比較した。平均断片長が約３５
０ｂｐの現代ヒトＤＮＡと、平均断片長が約３５～４０ｂｐで分解が激しい古代バイソン
試料とを使用して比較結果を得た。
本プロトコルの効率を、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キット（ｄｓＤＮＡ）、ＳＳ２．０（
Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ４５（１０）：ｅ７９）、ならびにＣａｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ９（２）：４１０－
４１９およびＭａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＧｉｇａＳｃｉｅｎｃｅ ６：１－１３
に記載されている平滑末端単一チューブ（ＢＥＳＴ）法と比較した。平均断片長が約３５
０ｂｐの現代ヒトＤＮＡと、平均断片長が約３５～４０ｂｐで分解が激しい古代バイソン
試料とを使用して比較結果を得た。
【0080】
ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キットは、現代試料のための非常に効率的なライブラリ調製方
法として認識されており、一方で、ＳＳ２．０は、分解された試料のための非常に効率的
なライブラリ調製方法として認識されている。ＢＥＳＴプロトコルは、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼおよびＴ４ ＰＮＫを使用して、ＤＮＡを平滑末端化し（尾部なし）５’末端を
リン酸化する、平滑末端修復が関わるものである。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し
てその平滑末端に平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターをライゲーションし、続いて、Ｂｓｔ
２．０ Ｗａｒｍｓｔａｒｔポリメラーゼを使用して充填反応させ、ＳＰＲＩビーズまた
はカラムを使用してクリーンアップする。
法として認識されており、一方で、ＳＳ２．０は、分解された試料のための非常に効率的
なライブラリ調製方法として認識されている。ＢＥＳＴプロトコルは、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼおよびＴ４ ＰＮＫを使用して、ＤＮＡを平滑末端化し（尾部なし）５’末端を
リン酸化する、平滑末端修復が関わるものである。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し
てその平滑末端に平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターをライゲーションし、続いて、Ｂｓｔ
２．０ Ｗａｒｍｓｔａｒｔポリメラーゼを使用して充填反応させ、ＳＰＲＩビーズまた
はカラムを使用してクリーンアップする。
【0081】
比較結果を図２に提供する。上部パネルの左から右に、この実施例で説明されている方
法（アスタリスク）、ｓｓ２．０、およびＢＥＳＴである。下部パネルの左から右に、こ
の実施例で説明されている方法（アスタリスク）、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キット、ｓｓ
２．０、およびＢＥＳＴである。この実施例に記載される方法は、ｓｓ２．０と比較して
、古代試料についてはるかに高いライゲーション効率を呈する。現代試料については、こ
の実施例に記載される方法は、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キットより０．３～０．５ｑＰＣ
Ｒサイクル遅れる。
法（アスタリスク）、ｓｓ２．０、およびＢＥＳＴである。下部パネルの左から右に、こ
の実施例で説明されている方法（アスタリスク）、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キット、ｓｓ
２．０、およびＢＥＳＴである。この実施例に記載される方法は、ｓｓ２．０と比較して
、古代試料についてはるかに高いライゲーション効率を呈する。現代試料については、こ
の実施例に記載される方法は、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ２キットより０．３～０．５ｑＰＣ
Ｒサイクル遅れる。
【0082】
実施例２－毛髪ＤＮＡ
標準的なプロテイナーゼＫ処理を使用して、高温で毛髪からＤＮＡを収集した。ライブ
ラリを作製するためのテンプレートとして６ナノグラムのＤＮＡを使用した。上に記載さ
れるようにプロトコルに従った。アダプターライゲーション生成物から２つの配列決定ラ
イブラリを生成した。１つは、５０μＬの全ライゲーション生成物のうちの１μＬを使用
した（ＳＲＬ３）。もう１つはこの生成物を２．５μＬ使用した（ＳＲＬ４）。両方のラ
イブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォーム上で配列決定して、
ライブラリの特徴および複雑度（固有のライブラリ分子の数）を評価した。
標準的なプロテイナーゼＫ処理を使用して、高温で毛髪からＤＮＡを収集した。ライブ
ラリを作製するためのテンプレートとして６ナノグラムのＤＮＡを使用した。上に記載さ
れるようにプロトコルに従った。アダプターライゲーション生成物から２つの配列決定ラ
イブラリを生成した。１つは、５０μＬの全ライゲーション生成物のうちの１μＬを使用
した（ＳＲＬ３）。もう１つはこの生成物を２．５μＬ使用した（ＳＲＬ４）。両方のラ
イブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォーム上で配列決定して、
ライブラリの特徴および複雑度（固有のライブラリ分子の数）を評価した。
【0083】
２×７５のペア・エンド配列決定後、ＳｅｑＰｒｅｐプログラムを使用して、互いに重
複するフォワードリードおよびリバースリードの対を組み合わせた。これは、元のＤＮＡ
テンプレートが十分に短いためにフォワードリードとリバースリードとがいくらかの同じ
配列（本明細書では「マージされたリード」と称される）をカバーする場合に生じる。マ
ージ後、マージされたリードおよびマージされていないリードを参照ヒトゲノム配列にマ
ッピングした。図３に示されるのは、ＳＲＬ３およびＳＲＬ４ライブラリの両方について
、マージされかつマッピングされた、マージされたがマッピングされない、ならびにマー
ジされたがマッピングされないリードの、観察された元のテンプレート長の分布である。
なお、マージされずかつマッピングされない場合では、テンプレートＤＮＡの長さを推測
することは不可能である。
複するフォワードリードおよびリバースリードの対を組み合わせた。これは、元のＤＮＡ
テンプレートが十分に短いためにフォワードリードとリバースリードとがいくらかの同じ
配列（本明細書では「マージされたリード」と称される）をカバーする場合に生じる。マ
ージ後、マージされたリードおよびマージされていないリードを参照ヒトゲノム配列にマ
ッピングした。図３に示されるのは、ＳＲＬ３およびＳＲＬ４ライブラリの両方について
、マージされかつマッピングされた、マージされたがマッピングされない、ならびにマー
ジされたがマッピングされないリードの、観察された元のテンプレート長の分布である。
なお、マージされずかつマッピングされない場合では、テンプレートＤＮＡの長さを推測
することは不可能である。
【0084】
Ｐｒｅｓｅｑソフトウェアプログラムを使用して、両方のライブラリにおける固有のラ
イブラリ分子の数を推定した。このプログラムは、ここで生成されたような、観察された
リードの大きなサンプルからの核酸ライブラリの複雑度をモデル化するために、観察され
た重複分子の数をカウントする。このプログラムは、ライブラリ配列決定の様々な深度に
おいて、固有であると予測される観察されたリードの画分についての推定値を示す。図４
に示されるように、両方のライブラリが、２５０，０００，０００超の固有分子の複雑度
を有すると予測される。２．５μＬのアダプターライゲーションテンプレートから作製さ
れたＳＲＬ４は、ＳＲＬ３よりも多くの固有分子を有している。
イブラリ分子の数を推定した。このプログラムは、ここで生成されたような、観察された
リードの大きなサンプルからの核酸ライブラリの複雑度をモデル化するために、観察され
た重複分子の数をカウントする。このプログラムは、ライブラリ配列決定の様々な深度に
おいて、固有であると予測される観察されたリードの画分についての推定値を示す。図４
に示されるように、両方のライブラリが、２５０，０００，０００超の固有分子の複雑度
を有すると予測される。２．５μＬのアダプターライゲーションテンプレートから作製さ
れたＳＲＬ４は、ＳＲＬ３よりも多くの固有分子を有している。
【0085】
実施例３－バイソン骨由来の古代ＤＮＡ
古代バイソン骨から抽出したＤＮＡを用いて、テンプレートＤＮＡ分子から配列決定ラ
イブラリへの変換効率を比較した。上に記載されるプロトコルを含む４つの異なるプロト
コルを用いて、同じ抽出物からの同じ量のＤＮＡからライブラリを生成した。
古代バイソン骨から抽出したＤＮＡを用いて、テンプレートＤＮＡ分子から配列決定ラ
イブラリへの変換効率を比較した。上に記載されるプロトコルを含む４つの異なるプロト
コルを用いて、同じ抽出物からの同じ量のＤＮＡからライブラリを生成した。
【0086】
アダプターライゲーション生成物のｑＰＣＲおよび直接配列決定という２つのアプロー
チを使用して、ライブラリの複雑度を測定した。ｑＰＣＲ推定は、３つ組で行った。図５
に示される両方のアプローチは、ＤＮＡを配列決定ライブラリに変換することにおいて、
本明細書に記載されるアプローチの方が効率的であることを示している。
チを使用して、ライブラリの複雑度を測定した。ｑＰＣＲ推定は、３つ組で行った。図５
に示される両方のアプローチは、ＤＮＡを配列決定ライブラリに変換することにおいて、
本明細書に記載されるアプローチの方が効率的であることを示している。
【0087】
このように、上記は単に本開示の原理を説明しているにすぎない。当業者であれば、た
とえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化しその
趣旨および範囲内に含まれる、様々な構成を工夫できることが理解されよう。さらに、本
明細書に記載されたすべての例および条件語句は、本発明の原理および発明者らにより当
該技術分野の促進のために寄与される概念を理解する上で読者を助けることを主として意
図しており、このような具体的に記載された例および条件への限定ではないと解釈される
べきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を記
載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含す
ることを意図している。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将
来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいかなる開発
要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載
された例示的な実施形態に限定されることを意図していない。
とえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化しその
趣旨および範囲内に含まれる、様々な構成を工夫できることが理解されよう。さらに、本
明細書に記載されたすべての例および条件語句は、本発明の原理および発明者らにより当
該技術分野の促進のために寄与される概念を理解する上で読者を助けることを主として意
図しており、このような具体的に記載された例および条件への限定ではないと解釈される
べきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を記
載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含す
ることを意図している。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将
来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいかなる開発
要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載
された例示的な実施形態に限定されることを意図していない。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0069】
本開示は以下の実施形態を含む。
実施形態１
核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
実施形態２
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以下である、実施形態２に記載の方法。
実施形態４
前記複合体が、前記ＳＳＢと接触された前記ｓｓＮＡの８０％以上から形成される、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９
前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０
前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１
前記複合体の形成後、前記ｓｓＤＮＡを再ハイブリダイズさせて、ｄｓＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態９または実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２
前記生成されたｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３
前記生成されたｄｓＤＮＡのサブサンプルが配列決定される、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５
前記組み合わせることが、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１７
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１８
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９
前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２０
前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１
アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ブロッキング修飾を含む、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２２
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、実施形態２１または実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２７
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ増幅のためのアダプターまたはその相補体を含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、部分的もしくは完全な配列決定アダプターまたはその相補体を含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０
前記ｓｓＮＡまたはその誘導体の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３１
一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
実施形態３２
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態３３
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、実施形態３１または実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、実施形態３１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３６
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、実施形態３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３７
前記ｓｓＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態３８
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、実施形態３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３９
アダプターオリゴヌクレオチド末端を、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させるための試薬をさらに含む、実施形態３１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４０
前記試薬が、リガーゼである、実施形態３９に記載の組成物。
実施形態４１
一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。
実施形態４２
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、実施形態４１に記載のキット。
実施形態４３
前記ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である、実施形態４１または４２に記載のキット。
実施形態４４
前記ＳＳＢが、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である、実施形態４１または４２に記載のキット。
実施形態４５
アダプターオリゴヌクレオチドの末端を、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）の末端に連結するための試薬をさらに含む、実施形態４１～４４のいずれか一項に記載のキット。
実施形態４６
前記試薬が、リガーゼである、実施形態４５に記載のキット。
実施形態４７
アダプターオリゴヌクレオチドの末端が、ブロッキング修飾を含む、実施形態４１～４６のいずれか一項に記載のキット。
実施形態４８
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、実施形態４７に記載のキット。
実施形態４９
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、実施形態４７または実施形態４８に記載のキット。
実施形態５０
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、実施形態４７または実施形態４８に記載のキット。
実施形態５１
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態４１～５０に記載のキット。
実施形態５２
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、実施形態４１～５１に記載のキット。
実施形態５３
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、実施形態４１～５２に記載のキット。
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
実施形態１
核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
実施形態２
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以下である、実施形態２に記載の方法。
実施形態４
前記複合体が、前記ＳＳＢと接触された前記ｓｓＮＡの８０％以上から形成される、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９
前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０
前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１
前記複合体の形成後、前記ｓｓＤＮＡを再ハイブリダイズさせて、ｄｓＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態９または実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２
前記生成されたｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３
前記生成されたｄｓＤＮＡのサブサンプルが配列決定される、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５
前記組み合わせることが、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１７
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１８
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９
前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２０
前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１
アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ブロッキング修飾を含む、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２２
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、実施形態２１または実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２７
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ増幅のためのアダプターまたはその相補体を含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、部分的もしくは完全な配列決定アダプターまたはその相補体を含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０
前記ｓｓＮＡまたはその誘導体の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３１
一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
実施形態３２
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態３３
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、実施形態３１または実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、実施形態３１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３６
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、実施形態３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３７
前記ｓｓＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態３８
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、実施形態３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３９
アダプターオリゴヌクレオチド末端を、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させるための試薬をさらに含む、実施形態３１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４０
前記試薬が、リガーゼである、実施形態３９に記載の組成物。
実施形態４１
一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。
実施形態４２
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、実施形態４１に記載のキット。
実施形態４３
前記ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である、実施形態４１または４２に記載のキット。
実施形態４４
前記ＳＳＢが、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である、実施形態４１または４２に記載のキット。
実施形態４５
アダプターオリゴヌクレオチドの末端を、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）の末端に連結するための試薬をさらに含む、実施形態４１～４４のいずれか一項に記載のキット。
実施形態４６
前記試薬が、リガーゼである、実施形態４５に記載のキット。
実施形態４７
アダプターオリゴヌクレオチドの末端が、ブロッキング修飾を含む、実施形態４１～４６のいずれか一項に記載のキット。
実施形態４８
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、実施形態４７に記載のキット。
実施形態４９
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、実施形態４７または実施形態４８に記載のキット。
実施形態５０
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、実施形態４７または実施形態４８に記載のキット。
実施形態５１
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態４１～５０に記載のキット。
実施形態５２
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、実施形態４１～５１に記載のキット。
実施形態５３
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、実施形態４１～５２に記載のキット。
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一本鎖核酸結合タンパク質が結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）；
第１のアダプターオリゴヌクレオチド；および
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域と第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とを含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を含む複合体を含む、組成物であって、
前記複合体は、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズした前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、かつ前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、
組成物。
第１のアダプターオリゴヌクレオチド；および
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域と第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とを含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を含む複合体を含む、組成物であって、
前記複合体は、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズした前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、かつ前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、
組成物。
【請求項2】
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ライゲーションブロッキング修飾を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
リガーゼをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端が共有結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記ライゲーションブロッキング修飾が、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記ライゲーションブロッキング修飾が、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨを含む前記ライゲーションブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、または３’ホスフェートを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
第２のアダプターオリゴヌクレオチド；および
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域と第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とを含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域と第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とを含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記複合体は、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていない末端領域に、前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドの前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、かつ前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、これにより、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記末端領域の末端に隣接する、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドのうち、前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ライゲーションブロッキング修飾を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
リガーゼをさらに含む、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端が共有結合している、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ライゲーションブロッキング修飾が、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ライゲーションブロッキング修飾が、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨを含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨを含む前記ライゲーションブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、または３’ホスフェートを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記ｓｓＮＡは一本鎖ＤＮＡである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
前記ｓｓＮＡはＲＮＡである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１７に記載の組成物。
【外国語明細書】