特開 2024-161437 精子の受精能獲得を決定することによる男性受精能の状態の特定、及びコンパニオン回収キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024161437

(43)【公開日】2024-11-19

(54)【発明の名称】精子の受精能獲得を決定することによる男性受精能の状態の特定、及びコンパニオン回収キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/92 20060101AFI20241112BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20241112BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20241112BHJP

   C12N 5/076 20100101ALN20241112BHJP

   C07K 14/76 20060101ALN20241112BHJP

【ＦＩ】

G01N33/92 C

G01N33/48 P

C12Q1/02

C12N1/02

C12N5/076

C07K14/76

【審査請求】有

【請求項の数】25

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024133326

(22)【出願日】2024-08-08

(62)【分割の表示】P 2021524139の分割

【原出願日】2019-11-01

(31)【優先権主張番号】62/755,087

(32)【優先日】2018-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/884,785

(32)【優先日】2019-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】518222620

【氏名又は名称】アンドロヴィア ライフサイエンシーズ， エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】110004381

【氏名又は名称】弁理士法人ＩＴＯＨ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー・トラヴィス

(72)【発明者】

【氏名】チャールズ・ジー・オスターマイアー

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ヒトの男性の受精能状態を特定するための方法。
【解決手段】ａ）ヒトの男性から精子サンプルを得る工程と、ｂ）希釈した精子サンプルを得るために、前記精子サンプルに、一定量の精液希釈剤溶液を希釈容量比で導入する工程と、ｃ）前記希釈した精子サンプルを、約４℃～約２５℃の温度範囲で２時間を超える長期間維持する工程と、ｄ）Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定するために、工程（ｃ）の前記希釈した精子サンプルに対してＣａｐ－Ｓｃｏｒｅアッセイを行う工程と、ｅ）前記ヒトの男性の受精能状態を決定する工程とを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトの男性の受精能状態を特定するための方法であって、
ａ）ヒトの男性から精子サンプルを得る工程と、
ｂ）希釈した精子サンプルを得るために、前記精子サンプルに、一定量の精液希釈剤溶液を希釈容量比で導入する工程と、
ｃ）前記希釈した精子サンプルを、約４℃～約２５℃の温度範囲で２時間を超える長期間維持する工程と、
ｄ）Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定するために、工程（ｃ）の前記希釈した精子サンプルに対してＣａｐ－Ｓｃｏｒｅアッセイを行う工程と、
ｅ）前記ヒトの男性の受精能状態を決定する工程とを含むことを特徴とする方法。

【請求項2】

前記希釈した精子サンプルについてＣａｐ－Ｓｃｏｒｅアッセイから得られたＣａｐ－Ｓｃｏｒｅが、同一個体から得た、同様に処理された新鮮なサンプルから得られたＣａｐ－Ｓｃｏｒｅと有意な差がない請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記温度範囲が、約４℃～約２０℃である請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記温度範囲が、約８℃～約１０℃である請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記精液希釈剤溶液が、重炭酸塩バッファー、クエン酸塩バッファー、ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー、ＴＲＩＳ／クエン酸バッファー、ＴＲＩＳ／クエン酸塩バッファー、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー、ＨＥＰＥＳ／ＴＲＩＳバッファー、Ｎ’－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタン（ＴＥＳ）及びヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー（ＴＥＳ／ＴＲＩＳバッファー）、及びそれらの組合せからなる群から選択されるバッファーを含む請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記バッファーが、ＴＥＳ／ＴＲＩＳバッファーである請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記精液希釈剤溶液が、アルブミン、胎児臍帯血清限外濾過液、プラズマネート、卵黄、スキムミルク、リポタンパク質、脂肪酸結合タンパク質、及びそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記タンパク質が、卵黄である請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記精液希釈剤溶液が、抗生物質を更に含む請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記抗生物質が、ゲンタマイシンである請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅアッセイが、（ｉ）前記精子サンプル及び前記精液希釈剤溶液から精子細胞を分離する工程と、（ｉｉ）前記精子細胞の第１の部分を受精能獲得刺激を含有する緩衝系（Ｃａｐ）に再懸濁し、前記精子細胞の第２の部分を受精能獲得刺激を含有しない緩衝系（ｎｏｎ－Ｃａｐ）に再懸濁する工程と、（ｉｉｉ）得られた細胞懸濁液を受精能獲得緩衝系及び非受精能獲得緩衝系で３７℃にて３時間インキュベートする工程とを含む請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記精子サンプル対前記精液希釈剤溶液の希釈体積比が、約１０：１～約１：１０である請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記精子サンプル対前記精液希釈剤溶液の希釈体積比が、約１：１である請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記精子サンプルが、円錐形の底部及び封止キャップを備えたプラスチックチューブに保存される請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記プラスチックチューブが、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリアロマー（ＰＡ）、及びポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記長期間が、２時間より長く約２４時間以内である請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記長期間が、少なくとも１８時間である請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記方法が、１以上の精子保存容器、トランスファーピペット、絶縁ポーチ、コールドパック、断熱容器、及び精液希釈剤溶液を含む精子サンプル回収キットを使用することを更に含む請求項１に記載の方法。

【請求項19】

ヒトの男性個体の受精能状態を特定するための方法であって、
ａ）ヒトの男性から精子サンプルを得る工程と、
ｂ）希釈した精子サンプルを得るために、前記精子サンプルに、一定量の精液希釈剤溶液を希釈容量比で導入する工程と、
ｃ）冷却希釈精子サンプルを得るために、工程（ｂ）の前記希釈した精子サンプルを、断熱容器内で約８℃～約１０℃の範囲の温度に冷却する工程と、
ｄ）前記冷却希釈精子サンプルを約８℃～約２５℃の温度範囲で長期間維持し、前記温度が、前記希釈した精子サンプルを、所定温度に冷却されたコールドパックを備えた断熱ポーチに入れることによって維持される工程と、
ｅ）受精能獲得に起因するガングリオシドＧ_Ｍ１パターンの分布を決定するために、工程（ｄ）の前記希釈した精子サンプルに対してＣａｐ－Ｓｃｏｒｅアッセイを行い、前記ヒトの男性の受精能状態を決定する工程とを含むことを特徴とする方法。

【請求項20】

冷却工程（ｃ）が、約１時間に亘って行われる請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

工程（ｄ）の長期間が、少なくとも１８時間である請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記コールドパックが、４℃に冷却される請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記コールドパックが、－２０℃に冷却される請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

前記方法が、１以上の精子保存容器、トランスファーピペット、絶縁ポーチ、コールドパック、断熱容器、及び精液希釈剤溶液を含む精子サンプル回収キットを使用することを更に含む請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

男性の受精能状態を決定するためのキットであって、１以上の精子保存容器、トランスファーピペット、絶縁ポーチ、コールドパック、断熱性全体容器（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｏｖｅｒ－ａｌｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、精液希釈剤溶液、受精能獲得を刺激するための剤、受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定試薬、及びＧ_Ｍ１パターンの分布を決定するための試薬を含むことを特徴とするキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連技術の相互参照
本願は、参照によりその全体を本明細書に援用する、２０１９年８月９日出願の米国仮出願第６２／８８４，７８５号及び２０１８年１１月２日出願の米国仮出願第６２／７５５，０８７号に対する優先権を主張する。

【0002】

本発明は、一般に、男性受精能の分野に関し、より詳細には、約４℃～約２５℃に維持した希釈剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）溶液を含有する培地に２時間超保存した精子サンプルから精子の受精能獲得を決定した後に、ガングリオシド、Ｇ_Ｍ１の分布パターンに基づく男性受精能を決定すること、及びＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイで使用するためのコンパニオン回収キットに関する。

【背景技術】

【0003】

米国では、カップルの１０％が不妊症に関連する医学的所見を有しており、不妊症の約４０％～約５０％が男性に起因している。世界的規模に換算すると、これは７３００万人を超える不妊カップルに相当する。典型的な男性の生殖健常性検査は、精子の数、外観、及び運動性を評価する。残念なことに、不妊症男性の半数超は、これらの記述的基準の正常なパラメータを満たす精子を有しており、自然妊娠と、子宮内授精（ＩＵＩ）などの生殖補助医療技術との両方で失敗を繰り返した後、「特発性不妊症」であると判断される。失敗に終わった各サイクルは、カップルに大きな身体的、感情的、経済的な犠牲をもたらし、米国のヘルスケアシステムでは、年間５０億ドル超の費用が掛かるので、精子機能の実用試験に対する必要性が大きい（非特許文献１）。このような試験により、臨床医は、妊娠を引き起こす最良の機会を与える生殖補助医療技術に患者を導くことができる（非特許文献２）。

【0004】

精子は、女性の生殖管に侵入しても、直ちには卵子と受精することはできない。むしろ、それらは「受精能獲得」として知られる機能的成熟プロセスを経る必要がある。このプロセスは、細胞膜における特定の変化、即ち、受精能獲得のための刺激への曝露に応答するガングリオシドＧ_Ｍ１の分布パターンの変化を示すことによる特定刺激に対する応答能力に依存する。

【0005】

Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイは、精子サンプル中の特定のＧ_Ｍ１分布パターンの違いを測定することによって男性受精能を評価するために使用される。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイの際、通常は、精子サンプルを新たに調製し、体温で保温し、約３０分間以内に試験ラボに輸送していた。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイを行う際、精子サンプルを、２時間よりも長期間は保存していなかった（非特許文献２）。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、精子サンプルを希釈するための方法、及びＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイ用に精子サンプルを調製する前の精子サンプルの保存時間を延ばすための方法を提供する。より詳細には、本発明は、特定条件下で少なくとも２時間以上保存されたときに、精子細胞の受精能獲得に対する耐性を改善し、患者（又は医師）が精子サンプルを回収し、回収した精子サンプルを、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイを行うことができる実験室に送ることを可能にする。精子サンプルの在宅での回収の利便性は、正確性及び効率を損なうことなく、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイの利用性を大幅に向上させる。

【0007】

本発明の実施形態では、本開示は、男性受精能の状態を特定するための方法を提供する。

【0008】

一実施形態では、ヒトの男性の受精能状態を特定するための方法は、ａ）ヒトの男性から精子サンプルを得る工程と、ｂ）希釈した精子サンプルを得るために、前記精子サンプルに、一定量の精液希釈剤溶液を希釈容量比で導入する工程と、ｃ）前記希釈した精子サンプルを、約４℃～約２５℃の温度範囲で２時間を超える長期間維持する工程と、ｄ）受精能獲得を経験することができる精子の割合（Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ）を決定するために、工程（ｃ）の前記希釈した精子サンプルに対してＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイを行う工程と、ｅ）ヒトの男性の受精能状態を決定する工程とを含む。一実施形態では、希釈した精子サンプルについてＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイから得られたＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭは、同一個体から得た、同様に処理された新鮮なサンプルから得られたＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭと有意な差がない。

【0009】

一実施形態では、ヒトの男性の受精能状態を特定するための方法は、希釈した精子サンプルの温度を約４℃～約２５℃の範囲に２時間超維持することを含む。いくつかの実施形態では、ヒトの男性の受精能状態を特定するための方法は、希釈した精子サンプルの温度を約４℃～約１０℃の範囲に２時間超維持することを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、精子サンプルの保存のための長期間は、約２時間～約２４時間である。いくつかの実施形態では、精子サンプルの輸送における長期間は、約１２時間～約４８時間である。いくつかの実施形態では、精子サンプルの輸送における長期間は、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態では、精子サンプルの輸送における長期間は、少なくとも１８時間である。

【0011】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、緩衝系を含む。当技術分野で知られたいずれの緩衝系も、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、重炭酸塩バッファー、クエン酸塩バッファー、ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー、ＴＲＩＳ／クエン酸バッファー、ＴＲＩＳ／クエン酸塩バッファー、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー、ＨＥＰＥＳ／ＴＲＩＳバッファー、Ｎ’－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタン（ＴＥＳ）及びヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー（ＴＥＳ／ＴＲＩＳバッファー）、及びそれらの組合せからなる群から選択されるバッファーを含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、ＴＥＳ／ＴＲＩＳバッファー（又は「ＴＥＳＴ」バッファー）を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、少なくとも１種のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、アルブミン、ウマ血清、ウシ血清、大豆タンパク質、胎児臍帯血清限外濾過液、プラズマネート、卵黄、スキムミルク、リポタンパク質、脂肪酸結合タンパク質、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、精液希釈剤溶液は、卵黄、乳タンパク質、及びそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む。一実施形態では、精液希釈剤溶液は、卵黄を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、抗生物質を更に含む。いくつかの実施形態では、前記抗生物質は、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、及びそれらの組合せからなる群から選択される。実施形態では、前記抗生物質は、ゲンタマイシンである。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記方法は、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイを行う前に、１以上の追加工程を行うことを含む。いくつかの実施形態では、前記追加工程は、希釈した精液サンプルを遠心分離して精子細胞から精漿を分離し、精子細胞ペレットを回収すること、精子細胞ペレットを１以上の受精能獲得刺激を含有する、ｍＨＴＦなどの培地（Ｃａｐ）及び任意に、受精能獲得刺激を含有しない、ｍＨＴＦなどの培地（ｎｏｎ－Ｃａｐ）に再懸濁すること、及び得られた細胞懸濁液をＣａｐ培地及び任意にｎｏｎ－Ｃａｐ培地中、３７℃で３時間インキュベートすることから選択される工程を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１０：１～約１：１０である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１：１０である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１０：１である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１：１である。

【0016】

いくつかの実施形態では、精子サンプルは、円錐形の底部及び封止キャップを備えたプラスチックチューブに保存される。いくつかの実施形態では、前記プラスチックチューブは、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリアロマー（ＰＡ）、及びポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択される。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記方法は、精子保存容器、トランスファーピペット、絶縁ポーチ、コールドパック、断熱容器、及び精液希釈剤溶液のうちの１以上を含む精子サンプル回収キットを使用することを更に含む。

【0018】

実施形態では、本開示は、ヒトの男性個体の受精能状態を特定するための方法であって、ａ）ヒトの男性から精子サンプルを得る工程と、ｂ）希釈した精子サンプルを得るために、前記精子サンプルに、一定量の精液希釈剤溶液を希釈容量比で導入する工程と、ｃ）冷却希釈精子サンプルを得るために、工程ｂ）の前記希釈した精子サンプルを、断熱容器内で約４℃～約１０℃の範囲の温度に冷却する工程と、ｄ）前記冷却希釈精子サンプルを約４℃～約２５℃の温度範囲で長期間維持し、前記温度が、希釈した精子サンプルを、所定温度に冷却されたコールドパックを備えた断熱ポーチに入れることによって維持される工程と、ｅ）工程（ｄ）の前記希釈精子サンプルに対してＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイ（受精能獲得に起因するＧ_Ｍ１パターンの分布の決定）を行い、前記ヒトの男性の受精能状態を決定する工程とを含む方法を提供する。

【0019】

いくつかの実施形態では、冷却工程（ｃ）は、約１時間に亘って行われる。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）における長期間は、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態では、コールドパックは、４℃に冷却される。いくつかの実施形態では、コールドパックは、－２０℃に冷却される。いくつかの実施形態では、前記方法は、精子保存容器、トランスファーピペット、絶縁ポーチ、コールドパック、断熱容器、及び精液希釈剤溶液のうちの１以上を含むコンパニオン精子サンプル回収キットを使用することを更に含む。

【0020】

実施形態では、本発明は、精子保存容器、トランスファーピペット、絶縁ポーチ、コールドパック、断熱容器、精液希釈剤溶液、受精能獲得を刺激するための剤、受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定試薬、及びＧ_Ｍ１パターンの分布を決定するための試薬のうちの１以上を含む男性の受精能状態を決定するためのキットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、精液サンプルの調製とタイムラインを示すフローチャートを示す。

【0022】

【図2】図２は、図２Ａ～図２Ｅを含むが、４℃に冷却されたコールドパックを含む在宅回収キットを使用した、希釈したヒトの未処理射精液の輸送を示す。

【0023】

【図3】図３は、封止断熱発泡スチロール容器内で４℃に冷却したコールドパックの、２４時間に亘って測定された温度プロファイルを示す。

【0024】

【図4】図４は、図４Ａ～図４Ｄを含むが、４℃の冷蔵庫に維持された精液サンプルの温度プロファイルのモニタリングを示す。

【0025】

【図5】図５は、冷蔵庫で４℃にて２４時間に亘って維持したサンプルの温度プロファイルを示す。

【0026】

【図6】図６は、封止断熱発泡スチロール容器内で、４℃に冷却したコールドパックで保存したサンプルのＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ試験の結果を示す。

【0027】

【図7】図７は、４℃で冷蔵庫内に維持されたサンプルのＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ試験の結果を示す。

【0028】

【図8】図８は、図８Ａ～図８Ｅを含むが、－２０℃に冷却したコールドパックを含む在宅回収キットを使用した、希釈したヒトの未処理射精液の輸送を示す。

【0029】

【図9】図９は、封止断熱発泡スチロール容器内で－２０℃に冷却したコールドパックによって生成された、２４時間に亘って測定された温度プロファイルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本開示は、特定のＧ_Ｍ１分布パターンが男性の受精能状態に関する情報を提供し得るという知見に基づいている。Ｇ_Ｍ１パターンの決定は、例えば、参照により開示内容を本明細書に援用する米国特許第７，１６０，６７６号明細書、同第７，６７０，７６３号明細書、及び同第８，３６７，３１３号明細書、並びに米国公開第２０１７０２４８５８４号明細書に記載されている。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイは、受精能獲得刺激への曝露による特定のＧ_Ｍ１分布パターンの頻度の変化に基づいている。本開示は、男性の受精能状態を決定するための方法及びコンパニオン回収／輸送キットを提供する。コンパニオンキットは、２時間を超える長期間の精子の保存及び輸送中に、精子細胞の生存率を維持するための精液希釈剤溶液を含む。

【0031】

本開示においては、精液を、患者の自宅などの私的な環境で回収でき、得られるＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭに著しい悪影響及び著しい変化を伴わずに、一晩の輸送用に調製及び保存することができるという予想外の知見が示される。
定義

【0032】

先行するセクション及び本明細書中の後続する全体を通して、特段の断りがない限り、本明細書中で使用される技術的及び科学的な用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本明細書中で言及される特許及び刊行物はいずれも、それらの全体を参照により援用する。

【0033】

本明細書で使用される用語「受精能獲得」（Ｃａｐ）条件は、一般に、精子細胞が受精能獲得のための１以上の刺激と共にインキュベートされる条件を意味する。具体的には、これは、培地中の重炭酸塩及び／又はカルシウムイオンの存在、及び血清アルブミン又はシクロデキストリンなどのステロール受容体の存在を必要とする。受精能獲得条件に首尾よく応答した精子は、先体エキソサイトーシスを起こす能力を獲得すると共に運動性の過剰活性化パターンを獲得する。

【0034】

本明細書で使用される用語「非受精能獲得」（ｎｏｎ－Ｃａｐ）条件は、精子細胞が受精能獲得のための１以上の刺激と共にインキュベートされない条件を意味する。受精能獲得条件に曝露されていない、又は曝露されたが受精能獲得条件に応答しない精子は、透明帯、透明帯からの可溶化タンパク質、又はプロゲステロンなどの生理学的リガンドによって誘発される先体エキソサイトーシスを起こさない。更に、そのような精子は、過剰に活性化された運動性を示さない。

【0035】

本明細書で使用される用語「Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイ」は、一般に、以下の（１）～（３）の工程を含む、ヒトの男性個体の受精能状態を特定するための方法を意味する。（１）Ｇ_Ｍ１について、同一個体から得た、固定され且つ受精能が獲得された精子サンプル及び任意に固定され且つ受精能が獲得されていない精子サンプルを染色する工程。（２）染色した固定精子サンプルを画像化して、受精能を獲得した精子及び任意に受精能を獲得していない精子における、選択したＧ_Ｍ１パターンの頻度を決定する工程。（３）受精能獲得条件に応答する精子に関連する選択したＧ_Ｍ１パターンの頻度を、精子のＧ_Ｍ１パターンの合計頻度と比較し、その値を既知の受精能を有する集団における参照値と比較する工程。この試験は、分子レベルでの精子の分析を提供し、受精能獲得が可能な精子の割合を決定する（Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ）。

【0036】

いくつかの実施形態では、男性の受精能状態を特定するための方法が記載される。いくつかの実施形態では、前記方法は、個体から精子サンプルを得ることを含む。いくつかの実施形態では、精子サンプルは、本明細書でより詳細に記載されるように、在宅回収キットを使用して得られる。いくつかの実施形態では、精子サンプルは、在宅環境で個体によって回収される。いくつかの実施形態では、精子サンプルは、診療所、実験室、又はクリニックで回収される。

【0037】

いくつかの実施形態では、精液サンプルは、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイを行う前に、開閉可能な蓋を備えた容器に保存される。いくつかの実施形態では、前記容器は、プラスチック、ガラス、又は他の耐久性を有する材料であることができる。いくつかの実施形態では、前記容器は、プラスチックである。いくつかの実施形態では、前記容器は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリアロマー（ＰＡ）、及びポリカーボネート（ＰＣ）からなる群から選択されるプラスチックを含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、精子サンプルは、精液希釈剤と混合される。

【0039】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤の使用は、精子サンプルの生存を延ばすために採用される。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、任意の市販の又は後に開発された精液希釈剤溶液である。精液希釈剤は、浸透圧的に平衡な塩溶液を表し、エネルギー源（例えば、グルコース、フルクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、ピルビン酸塩などの糖）、脂質（例えば、大豆レシチン、卵黄脂質、乳脂質）、タンパク質源（例えば、カゼイン、アルブミン、精漿）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン）、緩衝系及び／又は電解質（例えば、平衡及び等張電解質溶液、ＴＲＩＳ、ＴＥＳ、ＴＥＳ／ＴＲＩＳ（ＴＥＳＴ）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ）のうちの１以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、卵黄、グルコース、及びクエン酸塩を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、低温ショック保護剤としての使用のための１以上のタンパク質又は脂質を含む。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、アルブミン、ウマ血清、ウシ血清、大豆タンパク質、大豆レシチン、胎児臍帯血清限外濾過液、プラズマネート、卵黄、卵黄レシチン、スキムミルク、カゼイン、リポタンパク質、脂肪酸結合タンパク質、及びそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、卵黄、大豆タンパク質、ミルク、及びそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、卵黄を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、鶏卵黄を含む。卵黄血漿の主成分は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）である。卵黄のＬＤＬは、リン脂質に囲まれた液体脂質コアを有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＬＤＬを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、全卵黄を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、全卵黄の画分、例えば、全卵黄の遠心分離によって調製された清澄化卵黄、又は卵黄血漿からのＬＤＬ画分の抽出によって調製された低密度タンパク質を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、動物源に由来するリン脂質、例えば、ＬＤＬのリン脂質（卵黄レシチン）を含む。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、非動物源に由来するリン脂質、例えば、大豆レシチンを含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、細胞の生存率を維持するｐＨを示すように、生物学的に緩衝化することができる。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、精液希釈剤において約６．９～約７．５のｐＨを維持するためのバッファーを含む。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、又は７．５に維持される。一般に使用される生物学的バッファーは、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、及びＴＥＳなどの名称で入手できる。希釈剤に含有される生物学的バッファーの量は、生物学的バッファーの強度及び希釈剤の所望の緩衝能に依存し、例えば、一般に使用されるバッファーの濃度は、約１０ｍＭの重炭酸塩、２０～２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、又は約２０～２５ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌが挙げられる。

【0044】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、重炭酸塩バッファー、クエン酸塩バッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー、ＴＲＩＳ／クエン酸バッファー、ＴＲＩＳ／クエン酸塩バッファー、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー、ＨＥＰＥＳ／ＴＲＩＳバッファー、Ｎ’－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタン（ＴＥＳ）及びヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー（ＴＥＳ／ＴＲＩＳバッファー）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、２－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ビシン）バッファー、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（トリシン）バッファー、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）バッファー、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）バッファー、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー、及びそれらの組合せからなる群から選択されるバッファーを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、卵黄ベースの希釈剤である。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、１６．０体積％～２４．０体積％の卵黄及び４５．０体積％～７０．０体積％のバッファー溶液を含むことができる。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、全鶏卵黄を含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、１６．０体積％、２０．０体積％、又は２４．０体積％の卵黄を含むことができる。

【0046】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、卵黄及びクエン酸塩バッファーを含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、卵黄及びＴＲＩＳバッファーを含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、卵黄及びＴＲＩＳ／クエン酸塩バッファーを含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、卵黄及びＴＲＩＳ／クエン酸塩バッファーを含む。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、全鶏卵黄及びクエン酸塩バッファーを含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、全鶏卵黄及びＴＲＩＳバッファーを含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、全鶏卵黄及びＴＲＩＳ／クエン酸塩バッファーを含む。いくつかの実施形態では、卵黄ベースの希釈剤は、全鶏卵黄及びＴＲＩＳ／クエン酸バッファーを含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、約２５０ｍＯｓＭ～約３５０ｍＯｓＭの浸透圧を示す。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、約２９０ｍＯｓＭ～約３２０ｍＯｓＭの浸透圧を示す。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、少なくとも約９０重量％の水を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、精子細胞にエネルギーを与えるための炭水化物などのエネルギー源を含むことができる。いくつかの実施形態では、炭水化物は、単糖である。いくつかの実施形態では、炭水化物は、ソルビトール、フルクトース、スクロース、デキストロース、グルコース、及びラクトースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、炭水化物は、単独で、又は１以上の他のエネルギー源と組み合わせて使用することができる。本発明の実施形態では、炭水化物は、細胞にエネルギーを与えるのに十分な量で存在する。一実施形態では、炭水化物源としてのグルコースの量は、約０．０９ｇ／Ｌ～約１．８ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、炭水化物源としてのグルコースの量は、約０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は３．０ｇ／Ｌである。

【0049】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質は、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、リンコマイシン、マクロライド、グリコペプチド、アミノグリコシド、カルバペネム、及びそれらの組合せからなる群から選択される化合物である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アモキシシリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、エラバサイクリン、セファレキシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、アジスロマイシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、セフロキシム、セフトリアキソン、セフジニル、ダルババンシン、オリタバンシン、テラバンシン、バンコマイシン、エルタペネム、ドリペネム、メロペネム、イミペネム／シラスタチン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、アンフォテリシン、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、ゲンタマイシンである。

【0050】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、初期の精子サンプルの生存率及び運動性を維持する能力に関連して選択される。いくつかの実施形態では、精子サンプルの生存率は、初期の生存率の少なくとも４０％であり、運動性は、初期の運動性の少なくとも４０％のレベルに相当する。いくつかの実施形態では、生存率及び運動性の各レベルは、初期の値の少なくとも約７０％である。いくつかの実施形態では、本発明に係る在宅回収キットに含まれる精液希釈剤組成物の成分は、精子細胞の生存率及び運動性の維持を助長するように選択することができる。

【0051】

本発明において有用であり得る精液希釈剤としては、（１）ＣＹＢ培地（Ｗｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｎｄｒｏｌ． ８： ４１－４７ （１９８７））及び（２）冷蔵培地－ゲンタマイシン含有ＴＹＢ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ； ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃９０１２９）が挙げられる。

【0052】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、動物源に由来する成分を含むことができる及び／又は精液希釈剤組成物は、非動物源に由来する成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、動物源に由来する成分を実質的に含まないことを特徴とすることができる。「実質的に含まない」は、希釈剤が含む動物源由来の成分が、約０．１重量％未満であることを意味すると理解すべきである。動物源に由来する成分を含む又は含まないという精液希釈剤の特徴は、精液希釈剤組成物に添加される精液又は射精液を反映することを意図しないと理解すべきである。

【0053】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、動物源に由来する如何なる成分も含まないことができる。いくつかの実施形態では、精液希釈剤組成物は、動物に由来する１つ又は複数の成分を含むことができ、これらの成分は、精液希釈剤組成物の重量に基づいて０．１重量％を超える量で精液希釈剤組成物中に存在することができる。

【0054】

いくつかの実施形態では、精子サンプルは、約１０：１～約１：１０の精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比で精液希釈剤溶液に導入される。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、又は１：１０である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約３：１、２：１、又は１：１である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１：１０である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１：１０である。いくつかの実施形態では、精子サンプル対精液希釈剤溶液の希釈体積比は、約１：１である。

【0055】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約１℃～約２５℃、約１℃～約２４℃、約１℃～約２３℃、約１℃～約２２℃、約１℃～約２１℃、約１℃～約２０℃、約１℃～約１９℃、約１℃～約１８℃、約１℃～約１７℃、約１℃～約１６℃、約１℃～約１５℃、約１℃～約１４℃、約１℃～約１３℃、約１℃～約１２℃、約１℃～約１１℃、約１℃～約１０℃、約１℃～約９℃、約１℃～約８℃、約１℃～約７℃、約１℃～約６℃、約１℃～約５℃、約１℃～約４℃、約１℃～約３℃、及び約１℃～約２℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0056】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約２℃～約２５℃、約２℃～約２４℃、約２℃～約２３℃、約２℃～約２２℃、約２℃～約２１℃、約２℃～約２０℃、約２℃～約１９℃、約２℃～約１８℃、約２℃～約１７℃、約２℃～約１６℃、約２℃～約１５℃、約２℃～約１４℃、約２℃～約１３℃、約２℃～約１２℃、約２℃～約１１℃、約２℃～約１０℃、約２℃～約９℃、約２℃～約８℃、約２℃～約７℃、約２℃～約６℃、約２℃～約５℃、約２℃～約４℃、及び約２℃～約３℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0057】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約３℃～約２５℃、約３℃～約２４℃、約３℃～約２３℃、約３℃～約２２℃、約３℃～約２１℃、約３℃～約２０℃、約３℃～約１９℃、約３℃～約１８℃、約３℃～約１７℃、約３℃～約１６℃、約３℃～約１５℃、約３℃～約１４℃、約３℃～約１３℃、約３℃～約１２℃、約３℃～約１１℃、約３℃～約１０℃、約３℃～約９℃、約３℃～約８℃、約３℃～約７℃、約３℃～約６℃、約３℃～約５℃、及び約３℃～約４℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0058】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約４℃～約２５℃、約４℃～約２４℃、約４℃～約２３℃、約４℃～約２２℃、約４℃～約２１℃、約４℃～約２０℃、約４℃～約１９℃、約４℃～約１８℃、約４℃～約１７℃、約４℃～約１６℃、約４℃～約１５℃、約４℃～約１４℃、約４℃～約１３℃、約４℃～約１２℃、約４℃～約１１℃、約４℃～約１０℃、約４℃～約９℃、約４℃～約８℃、約４℃～約７℃、約４℃～約６℃、及び約４℃～約５℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0059】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約５℃～約２５℃、約５℃～約２４℃、約５℃～約２３℃、約５℃～約２２℃、約５℃～約２１℃、約５℃～約２０℃、約５℃～約１９℃、約５℃～約１８℃、約５℃～約１７℃、約５℃～約１６℃、約５℃～約１５℃、約５℃～約１４℃、約５℃～約１３℃、約５℃～約１２℃、約５℃～約１１℃、約５℃～約１０℃、約５℃～約９℃、約５℃～約８℃、約５℃～約７℃、及び約５℃～約６℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0060】

本発明の実施形態では、希釈された精子サンプルは、約６℃～約２０℃の温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約６℃～約２５℃、約６℃～約２４℃、約６℃～約２３℃、約６℃～約２２℃、約６℃～約２１℃、約６℃～約２０℃、約６℃～約１９℃、約６℃～約１８℃、約６℃～約１７℃、約６℃～約１６℃、約６℃～約１５℃、約６℃～約１４℃、約６℃～約１３℃、約６℃～約１２℃、約６℃～約１１℃、約６℃～約１０℃、約６℃～約９℃、約６℃～約８℃、及び約６℃～約７℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0061】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約７℃～約２５℃、約７℃～約２４℃、約７℃～約２３℃、約７℃～約２２℃、約７℃～約２１℃、約７℃～約２０℃、約７℃～約１９℃、約７℃～約１８℃、約７℃～約１７℃、約７℃～約１６℃、約７℃～約１５℃、約７℃～約１４℃、約７℃～約１３℃、約７℃～約１２℃、約７℃～約１１℃、約７℃～約１０℃、約７℃～約９℃、及び約７℃～約８℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0062】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約８℃～約２５℃、約８℃～約２４℃、約８℃～約２３℃、約８℃～約２２℃、約８℃～約２１℃、約８℃～約２０℃、約８℃～約１９℃、約８℃～約１８℃、約８℃～約１７℃、約８℃～約１６℃、約８℃～約１５℃、約８℃～約１４℃、約８℃～約１３℃、約８℃～約１２℃、約８℃～約１１℃、約８℃～約１０℃、及び約８℃～約９℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0063】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約９℃～約２５℃、約９℃～約２４℃、約９℃～約２３℃、約９℃～約２２℃、約９℃～約２１℃、約９℃～約２０℃、約９℃～約１９℃、約９℃～約１８℃、約９℃～約１７℃、約９℃～約１６℃、約９℃～約１５℃、約９℃～約１４℃、約９℃～約１３℃、約９℃～約１２℃、約９℃～約１１℃、及び約９℃～約１０℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0064】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約１０℃～約２５℃、約１０℃～約２４℃、約１０℃～約２３℃、約１０℃～約２２℃、約１０℃～約２１℃、約１０℃～約２０℃、約１０℃～約１９℃、約１０℃～約１８℃、約１０℃～約１７℃、約１０℃～約１６℃、約１０℃～約１５℃、約１０℃～約１４℃、約１０℃～約１３℃、約１０℃～約１２℃、及び約１０℃～約１１℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。

【0065】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約１１℃～約２５℃、約１１℃～約２４℃、約１１℃～約２３℃、約１１℃～約２２℃、約１１℃～約２１℃、約１１℃～約２０℃、約１１℃～約１９℃、約１１℃～約１８℃、約１１℃～約１７℃、約１１℃～約１６℃、約１１℃～約１５℃、約１１℃～約１４℃、約１１℃～約１３℃、及び約１１℃～約１２℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１２℃～約２５℃、約１２℃～約２４℃、約１２℃～約２３℃、約１２℃～約２２℃、約１２℃～約２１℃、約１２℃～約２０℃、約１２℃～約１９℃、約１２℃～約１８℃、約１２℃～約１７℃、約１２℃～約１６℃、約１２℃～約１５℃、約１２℃～約１４℃、及び約１２℃～約１３℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１３℃～約２５℃、約１３℃～約２４℃、約１３℃～約２３℃、約１３℃～約２２℃、約１３℃～約２１℃、約１３℃～約２０℃、約１３℃～約１９℃、約１３℃～約１８℃、約１３℃～約１７℃、約１３℃～約１６℃、約１３℃～約１５℃、及び約１３℃～約１４℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１４℃～約２５℃、約１４℃～約２４℃、約１４℃～約２３℃、約１４℃～約２２℃、約１４℃～約２１℃、約１４℃～約２０℃、約１４℃～約１９℃、約１４℃～約１８℃、約１４℃～約１７℃、約１４℃～約１６℃、及び約１４℃～約１５℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１５℃～約２５℃、約１５℃～約２４℃、約１５℃～約２３℃、約１５℃～約２２℃、約１５℃～約２１℃、約１５℃～約２０℃、約１５℃～約１９℃、約１５℃～約１８℃、約１５℃～約１７℃、及び約１５℃～約１６℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１６℃～約２５℃、約１６℃～約２４℃、約１６℃～約２３℃、約１６℃～約２２℃、約１６℃～約２１℃、約１６℃～約２０℃、約１６℃～約１９℃、約１６℃～約１８℃、及び約１６℃～約１７℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１７℃～約２５℃、約１７℃～約２４℃、約１７℃～約２３℃、約１７℃～約２２℃、約１７℃～約２１℃、約１７℃～約２０℃、約１７℃～約１９℃、及び約１７℃～約１８℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１８℃～約２５℃、約１８℃～約２４℃、約１８℃～約２３℃、約１８℃～約２２℃、約１８℃～約２１℃、約１８℃～約２０℃、及び約１８℃～約１９℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１９℃～約２５℃、約１９℃～約２４℃、約１９℃～約２３℃、約１９℃～約２２℃、約１９℃～約２１℃、及び約１９℃～約２０℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約２０℃～約２５℃、約２０℃～約２４℃、約２０℃～約２３℃、約２０℃～約２２℃、及び約２０℃～約２１℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約２１℃～約２５℃、約２１℃～約２４℃、約２１℃～約２３℃、及び約２１℃～約２２℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約２２℃～約２５℃、約２２℃～約２４℃、及び約２２℃～約２３℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約２３℃～約２５℃及び約２３℃～約２４℃からなる群から選択される温度範囲で維持される。いくつかの実施形態では、サンプルは、約２４℃～約２５℃の範囲の温度で維持される。

【0066】

いくつかの実施形態では、サンプルは、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、及び約２５℃からなる群から選択される温度で維持される。

【0067】

いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、約２時間～９６時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、又は９６時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、２時間超である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも３６時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも４８時間である。いくつかの実施形態では、希釈された精子サンプルを保存する時間は、少なくとも６０時間である。

【0068】

いくつかの実施形態では、前記方法は、精子サンプルにバッファーを添加して、サンプルのｐＨを維持することを含む。いくつかの実施形態では、そのようなバッファーは、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、重炭酸塩、ＴＲＩＳ、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0069】

実施形態では、本発明は、精子サンプルを精液希釈剤で約１０：１～１：１０の比で希釈することと、希釈したサンプルを封止された断熱容器内に、約４℃～約２５℃で２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、又は９６時間保存することとを含む、精子サンプルを保存する方法を提供する。

【0070】

本発明はまた、男性個体の受精能状態を特定するためのＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイでの使用のためなどの、本発明の方法で使用するための回収キットを提供する。いくつかの実施形態では、回収キットは、以下の１以上を含む：１以上の無菌精子保存容器、トランスファーピペット、精液希釈剤溶液、前記保存容器を保存するための絶縁ポーチ、温度を約８℃～約２０℃に制御するためのコールドパック（例えば、ＫＯＯＬＩＴ（登録商標）冷媒）、サンプル／絶縁ポーチ及びコールドパックを保存する断熱容器、及び使用説明書。いくつかの実施形態では、キットは、精子サンプルと混合するためのバッファー溶液を更に含む。いくつかの実施形態では、そのようなバッファーは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、重炭酸塩、ＴＲＩＳ、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0071】

いくつかの実施形態では、前記方法は、トランスファーピペットを用いて精子サンプルの一部又は全部を１５ｍＬコニカルチューブに移し、精子サンプルを回収カップに回収することと、精子サンプルを精液希釈剤で１：１（ｖ／ｖ）の比で希釈することと、コニカルチューブとその内容物を絶縁バブルフォイルポーチに包装することと、フォイルポーチに包装されたサンプルチューブを発泡スチロールボックスに入れることと、４℃に冷却したコールドパックを、バブルフォイルポーチに包装されたサンプルチューブパック上に置くことと、発泡スチロールボックスを封止することと、発泡スチロールボックスを輸送用容器に入れることとを含む（図２を参照）。

【0072】

いくつかの実施形態では、前記方法は、１５ｍＬコニカルチューブ中の精子サンプルを、予熱した冷蔵培地－ＴＹＢ培地（ＴＹＢ希釈剤；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；９０１２９－２０×５ｍＬ）にて１：１（ｖ／ｖ）で希釈することと、チューブをフォイルバブルポーチメーラー（Ｔｈｅｒａｐａｋ；５６３６２Ｇ）に入れることと、４℃に維持したコールドパック（Ｔｈｅｒａｐａｋ；５６２２００）をメーラー上に置くことと、メーラー／コールドパックを発泡ポリスチレンクーラー（壁厚３／４”の６^３／８”×４^７／８”×２^１／４”内径）に入れることと、クーラーを段ボール箱に入れることとを含む（図２）。

【0073】

いくつかの実施形態では、前記方法は、トランスファーピペットを用いて精子サンプルの一部又は全部を１５ｍＬコニカルチューブに移し、精子サンプルを回収カップに回収することと、精子サンプルを精液希釈剤で１：１（ｖ／ｖ）の比で希釈することと、コニカルチューブとその内容物を絶縁バブルフォイルポーチに包装することと、フォイルポーチに包装されたサンプルチューブを発泡スチロールボックスに入れることと、－２０℃に冷却したコールドパックを、バブルフォイルポーチに包装されたサンプルチューブパック上に置くことと、発泡スチロールボックスを封止することと、発泡スチロールボックスを輸送用容器に入れることとを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、回収した精子サンプルは、精液希釈剤の添加後に、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイ用に処理される。いくつかの実施形態では、回収した精子サンプルは、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイ用に、回収直後に（精液希釈剤を添加せずに）処理される。いくつかの実施形態では、精子サンプルの処理は、精液希釈剤を除去すること、精子サンプルを洗浄すること、精子サンプルの１以上の部分を培地中に再懸濁すること、及び受精能獲得剤を精子サンプルの１以上の部分に添加し、受精能獲得を誘発することからなる群から選択される１以上の工程を含む。いくつかの実施形態では、処理は、回収した精子サンプルの一部に、受精能獲得バッファー又は非受精能獲得バッファーを添加することを含む（図１）。

【0075】

いくつかの実施形態では、希釈剤及び精漿は、遠心分離及び後続のペレット化された精子サンプルの培地による洗浄、例えば、ｍＨＴＦ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；レファレンス９０１２６）による洗浄によって精子から分離される。いくつかの実施形態では、遠心分離速度は、約５０ｇ～約２０，０００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心分離速度は、約１００ｇ～約２０００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心分離速度は、約３００ｇ～約６００ｇの範囲である。

【0076】

いくつかの実施形態では、封止された試料容器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４－３７５－４６２）中の自宅で回収した射精液を、空気インキュベーター内で３７℃で液状とする。希釈剤及び／又は精漿を除去するために、サンプル１ｍＬをＥｎｈａｎｃｅ Ｓ－Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、レファレンス：１５２３２ ＥＳＰ－１００－９０％）１ｍＬに重層した。実施形態では、サンプルを３００ｇで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを回収し、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｂａｌ Ｆｌｕｉｄ培地（ｍＨＴＦ）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；レファレンス９０１２６）約４ｍＬに再懸濁し、６００ｇで１０分間ペレット化する。

【0077】

いくつかの実施形態では、精液希釈剤は、Ｅｎｈａｎｃｅ Ｓ－Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ；Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン；カタログ番号１５２３２ ＥＳＰ－１００－９０％）による精子の遠心分離によって分離され、精子は、培地、例えば、改変Ｈｕｍａｎ Ｔｕｂａｌ Ｆｌｕｉｄ培地（ｍＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンタアナ、ＣＡ；カタログ番号９０１２６）で洗浄される。精子サンプルチューブを６００ｇで１０分間遠心分離する。いくつかの実施形態では、精子細胞を、精子受精能獲得剤（例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ；セントルイス、ＭＯ；カタログ番号Ｃ０９２６））を含有する、ｍＨＴＦなどの培地（Ｃａｐ）及び任意に、精子受精能獲得剤を含有しない、ｍＨＴＦなどの培地（ＮｏｎＣａｐ）に再懸濁させる（図１）。

【0078】

いくつかの実施形態では、精子細胞を、Ｅｈａｎｃｅ Ｓ－Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｓｙ Ｍｅｄｉａ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、ＣＯ、レファレンス：１５２３２ ＥＳＰ－１００－９０％）で３００ｇにて１０分間遠心分離することによって精液希釈剤から分離した。一実施形態では、精子細胞を回収し、約４ｍＬのヒト卵管液（ＨＴＦ）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンタアナ、ＣＡ、レファレンス９０１２５）又は改変ヒト卵管液（ｍＨＴＦ）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、レファレンス９０１２６）で再懸濁し、６００ｇで１０分間再度遠心分離する。得られた精子細胞ペレットを、ＨＴＦ又はｍＨＴＦに再懸濁し、受精能獲得剤と共に（Ｃａｐ）及び任意に、受精能獲得剤なしで（Ｎｏｎ－Ｃａｐ）インキュベートした２つの別々のアリコートに分ける。精子濃度を、１本のチューブ当たり１，０００万個の精子細胞／ｍｌに調整し、３７℃で３時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、精子細胞を、重炭酸塩バッファーを含有するＨＴＦ中で、５％ＣＯ２を有するインキュベーター内で３７℃でインキュベートする。いくつかの実施形態では、精子細胞は、ＨＥＰＥＳバッファーを含有するｍＨＴＦ中で、空気インキュベーター内にて３７℃でインキュベートする。

【0079】

いくつかの実施形態では、受精能獲得剤と共に又は任意に受精能獲得剤なしでインキュベーションした後、精子サンプルは、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭを決定する前に、少なくとも１８時間固定され、包装され、及び輸送また保存される。本発明の別の実施形態では、受精能獲得剤とのインキュベーションは、少なくとも１８時間の輸送及び／又は保存後に行われる。

【0080】

いくつかの実施形態では、単離された精子細胞は、その上部に層を形成し、密度勾配によって遠心分離すること；その上部に層を形成し、密度勾配によって遠心分離した後、精子に富む画分を回収し、続いて再懸濁及び洗浄すること；その上部に層を形成し、密度勾配によって遠心分離した後、精子に富む画分を回収し、その上部に、運動性の精子がスイムアップする密度のより低い培地を重ねること；密度のより低い培地をサンプルの上に重ね、運動性の精子がその中にスイムアップすることを可能にすることからなる群から選択される１以上の選択プロセスに付される。

【0081】

いくつかの実施形態では、精子細胞を数え、所定の数の精子を容器（例えば、チューブ）に入れ、非受精能獲得培地又は受精能獲得剤含有培地で希釈して、精子の所望の最終濃度を達成する。いくつかの実施形態では、精子の所望の最終濃度は、１０００万個／ｍＬである（最終濃度範囲は、２５０×１０^３個の精子／ｍＬ～２５０×１０^６個の精子／ｍＬの範囲でで変化し得る）。

【0082】

いくつかの実施形態では、本発明において有用な培地（例えば、精子を再懸濁するための培地、精子サンプルを洗浄するための培地、及び／又は非受精能獲得及び受精能獲得条件下で精子をインキュベートするための培地）は、生理学的バッファー溶液である。いくつかの実施形態では、培地は、ヒト卵管液（ＨＴＦ）；改変されたヒト卵管液（ｍＨＴＦ）；Ｗｈｉｔｔｅｎの培地；改変されたＷｈｉｔｔｅｎの培地；ＫＳＯＭ；リン酸緩衝生理食塩水；ＨＥＰＥＳ－緩衝生理食塩水；トリス緩衝生理食塩水；ＨａｍのＦ－１０；Ｔｙｒｏｄｅの培地；改変されたＴｙｒｏｄｅの培地；ＴＥＳ－トリス（ＴＥＳＴ）－卵黄バッファー；又はＢｉｇｇｅｒｓ、Ｗｈｉｔｔｅｎ、及びＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ（ＢＷＷ）培地からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、１以上の記載された又は混合されたタンパク質源を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質源は、胎児臍帯血清限外濾過液、プラズマネート、卵黄、スキムミルク、アルブミン、リポタンパク質、及び脂肪酸結合タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地へのタンパク質の添加は、生存率を向上させる及び／又は受精能獲得の誘発を助長する。

【0083】

いくつかの実施形態では、精子サンプルは、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ分析を行うために少なくとも１つの受精能獲得剤に接触される。いくつかの実施形態では、受精能獲得のための刺激は、重炭酸塩（典型的には、５～５０ｍＭの範囲で２０～２５ｍＭ）、カルシウム（典型的には、０．１～１０ｍＭの範囲で１～２ｍＭ）、及び／又はシクロデキストリン（典型的には、０．１～２０ｍＭの範囲で１～３ｍＭ）のうちの１以上である。いくつかの実施形態では、シクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、メチル－β－シクロデキストリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0084】

いくつかの実施形態では、受精能獲得剤又は刺激は、重炭酸イオン、カルシウムイオン、ステロール流出のメディエーター、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ステロール流出のメディエーターは、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、メチル－β－シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎児臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、リポソーム、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対照サンプルの受精能獲得又は任意に非受精能獲得条件への曝露を、試験サンプルと並行して行うことができる。

【0085】

いくつかの実施形態では、受精能獲得剤又は刺激とのインキュベーション温度は、約３０℃～約４０℃、約３０℃～約３９℃、約３０℃～約３８℃、約３０℃～約３７℃、約３０℃～約３６℃、約３０℃～約３５℃、約３０℃～約３４℃、約３０℃～約３３℃、約３０℃～約３２℃、又は約３０℃～約３１℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーション温度は、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃である。いくつかの実施形態では、受精能獲得剤とのインキュベーション時間は、約３０分間～約１８時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約１時間～約４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約３０分間、即ち、０．５時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約１時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約２時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約３時間である。いくつかの実施形態では、ベースラインサンプル又は測定値は、インキュベーション期間の開始時に取得される。

【0086】

いくつかの実施形態では、精子細胞は、受精能獲得剤の有無にかかわらず、インキュベーション後のＧ_Ｍ１パターンの可視化のために固定される。固定は、一部のＧ_Ｍ１パターンを評価するためには必要がないが、固定により精子細胞が保存されるので、精子細胞を可視化する機会が拡がり、精子細胞が動かないようにすることができる。精子の組織学的研究のための様々な固定剤は、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態では、適切な固定剤としては、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン固定剤、及びカコジル酸ナトリウム、塩化カルシウム、ピクリン酸、タンニン酸などを含む固定剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又はそれらの組合せが使用される。

【0087】

いくつかの実施形態では、固定化剤の量は、約０．００４％（重量／体積）パラホルムアルデヒド～約４％（重量／体積）パラホルムアルデヒド、約０．０１％～約１％（重量／体積）パラホルムアルデヒド、約０．００５％（重量／体積）パラホルムアルデヒド～約１％（重量／体積）パラホルムアルデヒド、約４％のパラホルムアルデヒド（重量／体積）、約０．１％グルタルアルデヒド（重量／体積）、及びリン酸緩衝生理食塩水中の約５ｍＭのＣａＣｌ_２からなる群から選択される。

【0088】

予備試験では、重炭酸塩（ＨＣＯ_３ ^－）又はＨＥＰＥＳ緩衝培地のいずれを使用した場合でも、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイにおける生存率又は精子回収率に違いは見られなかった。受精能獲得刺激は、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、カタログ番号Ｃ０９２６）からなった。パイロット試験では、この刺激は、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭで測定されるヒトの精子の受精能獲得促進に関し、３時間のインキュベーションで、アルブミンの６時間と同程度有効であることが示された。インキュベーション後、サンプルをパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、カタログ番号１５７１２）で固定した。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイは、本発明に記載されるように精子サンプルに対して行われる。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイは、Ａｎｄｒｏｖｉａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発された独自のアッセイであり、米国特許出願第１５／５１２，３５７号明細書、同第１５／３８７，９６５号明細書、同第１５／４３５，８７５号明細書に記載されている。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイは、Ｇ_Ｍ１ガングリオシドに特異的な親和性を有する親和性結合分子を使用して、生きている精子細胞又は固定された精子細胞のＧ_Ｍ１分布パターンの違いを測定する。いくつかの実施形態では、親和性分子は、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）に直接連結される。いくつかの実施形態では、親和性分子は、検出可能な標識を有する第２の親和性分子によって検出される。いくつかの実施形態では、標識された（例えば、蛍光標識された）コレラ毒素ｂサブユニットを用いて、Ｇ_Ｍ１分布パターンを得る。いくつかの実施形態では、使用されるコレラ毒素ｂサブユニットフルオロフォア標識の量は、約０．０１～約１０．０μｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、使用されるコレラ毒素ｂサブユニットフルオロフォア標識の量は、約０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．４、２．６、２．７、２．７、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、又は１０．０μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、前記量は、約２μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、コレラ毒素ｂサブユニットに対する標識化抗体を使用して、Ｇ_Ｍ１分布パターンを可視化する。いくつかの実施形態では、Ｇ_Ｍ１に直接結合する一次抗体又はコレラ毒素のｂサブユニットに結合する一次抗体のいずれかに結合する標識化二次抗体が使用される。いくつかの実施形態では、本発明において有用な他の検出可能な標識は、放射性核種、酵素、蛍光剤、又は発色団から選択される。いくつかの実施形態では、本発明に係る精子サンプル中のＧ_Ｍ１分布の標識（又は染色）及び可視化は、当技術分野において知られた標準的な技法によって行われ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の使用、Ｇ_Ｍ１分子の関連するエピトープのペプチド模倣物の生成、又は低分子との結合の模倣が挙げられるが、これらに限定されない。

【0089】

米国特許出願第１５／５１２，３５７号明細書、同第１５／３８７，９６５号明細書、同第１５／４３５，８７５号明細書に十分に述べられているように、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭは、受精能獲得精子サンプルと受精能非獲得精子サンプルのＧ_Ｍ１分布パターンを比較し、受精能獲得の刺激に応答する精子の割合を反映するそれらのパターンの違いに基づいてＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭを割り当てることによって決定される。ヒトの精子については、いくつかの異なるＧ_Ｍ１パターンが報告された。これらのパターンは、ＩＮＴＥＲ（中間体）、ＡＰＭ（先体原形質膜）、ＡＡ（アピカル先体）、ＰＡＰＭ（ポスト先体原形質膜）、ＡＡ／ＰＡ（アピカル先体／ポスト先体）、ＥＳ（エクアトリアルセグメント）、ＤＩＦＦ（ディフューズ）、及びＬｉｎｅｄ Ｃｅｌｌとして示される。受精能閾値は、ＡＡ及び／又はＡＰＭのレベルの値であり、これらの値で、ＡＡ及び／又はＡＰＭのレベルを上昇させるための母集団の受精能の上昇が実質的に止まる。個体は、個体のＡＡ及び／又はＡＰＭレベルに基づいて、「不妊」、「準不妊」、又は「非不妊」として表示することができる（米国特許出願第１５／５１２，３５７号明細書の実施例１を参照）。実施形態では、受精能を獲得したことの指標となるパターン（例えば、ＡＡ＋ＡＰＭ）を有する細胞の割合を評価した。

【0090】

本発明はまた、男性個体の受精能状態を特定するためのＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイでの使用を含む、本明細書に記載の方法で使用するための回収キットを提供する。いくつかの実施形態では、回収キットは、以下の１以上を含む：１以上の無菌精子保存容器、トランスファーピペット、精液希釈剤溶液、前記保存容器を保存するための絶縁ポーチ、温度を約４℃～約２５℃に制御するためのコールドパック、サンプル／絶縁ポーチ及びコールドパックを保存する断熱容器、及び使用説明書。いくつかの実施形態では、キットは、精子サンプルと混合するためのバッファー溶液を更に含む。いくつかの実施形態では、前記バッファーは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、重炭酸塩、ＴＲＩＳ、リン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0091】

いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書と、輸送、保管、及び識別の目的に有用なラベル及び容器／バッグ／ポーチとを含む。いくつかの実施形態では、キットは、フォイルポーチと、精子サンプルを郵送するための吸収性材料を含有するバイオハザードバッグと、吸収剤を含有する再封止可能なバッグと、発泡チューブプレースホルダーとを含む。いくつかの実施形態では、容器は、ガラス、プラスチック、又は他の耐久性を有する材料であることができる。

【0092】

いくつかの実施形態では、キットは、以下の１以上を含む：受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤組成物、Ｇ_Ｍ１染色パターンを決定するための試薬、比較チャート、所定の基準、比較のためのＧ_Ｍ１パターンの表現、又は閾値。

【0093】

いくつかの実施形態では、キットは、細胞単離培地（例えば、Ｅｎｈａｎｃｅ Ｓ－Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ、９０％、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、レファレンス：１５２３２ ＥＳＰ－１００－９０％）を更に含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、キットは、大型オリフィスピペットチップ（例えば、２００μＬの大型オリフィスチップ、ＵＳＡ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０１１－８４００）又は大型オリフィストランスファーピペット（例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｉｐｅｔｓ、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｕｌｂレファレンス番号：２０２－２０Ｓ、ＶＷＲカタログ番号１４６７０－１４７）を更に含むことができる。

【0095】

いくつかの実施形態では、キットは、回収及び／又は保存チューブ、例えば、１．５ｍＬチューブ（例えば、ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４１５９７００）及び／又は１２０ｍＬ検体回収カップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４３７５４６２）を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、回収チューブの１以上が、受精能獲得を刺激するシクロデキストリンを含む。いくつかの実施形態では、シクロデキストリンなどの受精能獲得剤は、キット中に分けて入れられる。

【0096】

いくつかの実施形態では、キットは、精子サンプルから精漿又は精液希釈剤を除去する密度勾配材料及び／又は説明書を更に含む。

【実施例0097】

以下、本明細書に包含される実施形態を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示目的としてのみ提供されており、本明細書に包含される開示は、これらの実施例に何ら限定されると解釈するべきではなく、本明細書に与えられる教示の結果として明らかになるあらゆる変形例を包含すると解釈するべきである。

【0098】

全実施例の材料及び方法
以下の実施例は、回収した精子サンプルが、長期間（例えば、２時間超）維持された回収キットの使用を示す。

【0099】

男性のドナーが精子サンプルを１２０ｍｌの検体容器に採取し、１５分間以上２時間以下液状とした後、大型オリフィストランスファーピペットを用いて１５ｍＬコニカルチューブに移した。精子サンプルを精液希釈溶液にて１：１で希釈し、コールドパックを含む絶縁ボックスに入れて、温度を約４～約２５℃に維持した。低温でのサンプルの維持は、平均して少なくとも１２時間であった。

【0100】

低温で一晩維持した後、精子細胞を精漿及び希釈剤から分離した。これは、１５ｍＬコニカルチューブ内のＥｎｈａｎｃｅ Ｓ－Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（１ｍＬ）の上に１ｍＬの精液／希釈剤を層状に重ねることによって達成した。十分な数のコニカルチューブを用いて、精液／希釈剤の全量から精子を分離した。精液／希釈剤及び細胞単離培地を含むチューブを、３００ｇで１０分間遠心分離した。精漿と希釈剤を全チューブから除去し、下部の約１ｍＬ画分を新たな１５ｍＬチューブに移した後、４ｍＬのｍＨＴＦに再懸濁した。再懸濁した精子を６００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、精子細胞のペレットを～０．２５ｍＬのｍＨＴＦに再懸濁した。次いで、洗浄した精子細胞の濃度と運動性を評価した。次いで、精子細胞を２つのチューブに分け、各チューブの最終体積が３００μＬ、精子の最終濃度が１０，０００，０００個／ｍＬになるようにした。１番目のチューブには、３００μＬのｍＨＴＦ（非受精能獲得条件）を含有させ、２番目のチューブには、３００μＬのｍＨＴＦと最終濃度３ｍＭの２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（受精能獲得条件）を含有させた。精子細胞を、３７℃で３時間インキュベートした。

【0101】

インキュベーション期間の終了後に、各チューブの内容物を穏やかに混合し、３３μＬの１％（重量／体積）パラホルムアルデヒドを添加して、０．１％の最終濃度を達成した。いくつかの実施形態では、０．１％（重量／体積）のパラホルムアルデヒドを添加して、０．０１％の最終濃度を達成した。これらのチューブを穏やかに混合し、室温で一晩維持した。翌日、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートさせた０．５ｍｇ／ｍＬのコレラ毒素ｂサブユニットを１μＬ添加した。２本のチューブの内容物を再度穏やかに混合し、室温で更に１０分間静置した。各チューブから５μＬを取り出し、スライドガラス上に置き、蛍光顕微鏡による評価を行った。

【0102】

輸送、処理、インキュベーション、及び一晩の固定の後、各サンプルを、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートコレラ毒素ベータサブユニット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、カタログ番号Ｃ３４７７５）で標識した。１０分間後、５μＬの標識化された精子を顕微鏡スライド上に載せ、カバースリップ（２２×２２ｍｍ ｎｏ．１）で覆い、イメージングステーションに移動させた。

【0103】

イメージングは、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＮＩ－Ｅ顕微鏡で行った。この顕微鏡は、ＣＦＩ６０ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ Ｌａｍｂｄａ ２０× Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ；Ｃ－ＦＬ ＡＴ ＧＦＰ／ ＦＩＴＣ Ｌｏｎｇ－Ｐａｓｓ Ｆｉｌｔｅｒ Ｓｅｔｓ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０ ｃａｍｅｒａｓ；Ｈ１０１Ｆ－ＰｒｏＳｃａｎ ＩＩＩ Ｏｐｅｎ Ｆｒａｍｅ Ｕｐｒｉｇｈｔ Ｍｏｔｏｒｉｚｅｄ Ｈ１０１Ｆ Ｆｌａｔ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｔａｇｅｓ；及び６４－ｂｉｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎｓ ｒｕｎｎｉｎｇ ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｎｉｋｏｎ； Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を備えていた。

【0104】

受精能獲得を経験したサンプル中の精子の割合を決定し、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ（受精能獲得に関連するパターンを有する精子の数／（受精能獲得に関連するパターンを有する精子の数＋他のパターンを有する精子の数））として報告した。読み取りはいずれも、信頼性のある方法（Ｍｏｏｄｙ， Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ． ２０１７）にしたがって、且つＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ（ＣＬＩＡ）－Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＣＡＰ）－及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＬＥＰ）が承認した品質管理と保証の最善のプラクティスに沿って行った。簡単に言えば、十分な精子がサンプル中に含有されている場合には、各条件について少なくとも１５０の合計パターンを決定した。利用可能な細胞が不十分な場合、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭを計算するには最低１００パターンが必要である。それ以外の場合には、サンプルを排除した。

【0105】

実施例１．２４時間の保存／輸送中の精子細胞の生存率に対する精液希釈剤及び温度の影響
通常の手順にしたがい、精液サンプルを回収し、分けた。半分を対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として用い、残りの半分を試験（Ｔｅｓｔ）として用いた。Ｃｏｎｔｒｏｌサンプルを処理し、２つの処理群を作成した。一方は、受精能獲得刺激あり（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ）、他方は、受精能獲得刺激なし（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ）である。サンプルをインキュベートし、固定し、一晩維持してから、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定及びＣｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定）について評価した。Ｔｅｓｔサンプルを、冷蔵培地（ＴＹＢ希釈剤）にて１：１で希釈し、一方の実験では、コールドパックと共に一晩維持し（Ｔｅｓｔ－ＣＰ）、他方の実験では、冷蔵庫に維持した（Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ）。ＴＹＢ希釈剤中で低温にて一晩維持した後、試験サンプルを処理し、受精能獲得刺激含有処理群（Ｔｅｓｔ－「ＣＰ又はＲｅｆ」－ＣＡＰ）を作成した。サンプルをインキュベートし、固定し、再度一晩維持した後、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定した（Ｔｅｓｔ－「ＣＰ又はＲｅｆ」－ＣＡＰ－２４時間－固定）（図１）。

【0106】

以下の表１のサンプル１～８の精液サンプルを、マスターベーションによって回収し、最大２時間液状とした（Ｍｏｏｄｙ，Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０１７）。液状化後、サンプルを分けた（図１）。半分は対照として用い、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）用に通常処理した。残りの半分は試験処理（Ｔｅｓｔ）として用い、予熱した冷蔵培地（ＴＹＢ希釈剤；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；９０１２９－２０Ｘ５ｍＬ［１７６ｍＭの２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸［ＴＥＳ］、８０ｍＭの２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール［Ｔｒｉｓ］、９ｍＭのデキストロース、１０μＬのゲンタマイシン硫酸塩、２０％ｖ／ｖの熱不活化卵黄］）にて１：１で希釈した。患者の自宅から、処理目的で実験室にサンプルを輸送する間に経験される時間と潜在的な環境をシミュレートするために、２種の異なる一晩維持プロトコルを試験サンプルについて評価した。まず、一部の試験サンプルを、４℃に冷却したコールドパックを備えた発泡スチロールボックス内に維持した（Ｔｅｓｔ－ＣＰ；図２；ｎ＝５）。サンプルと希釈剤とを含有する１５ｍＬコニカルチューブを絶縁フォイルポーチに入れた（図２Ａ）。コールドパックを４℃でポーチで包み、輪ゴムで固定した（図２Ｂ）。サンプル、ポーチ、及びコールドパックを発泡スチロールボックスに入れた（図２Ｃ）。次いで、サンプル、ポーチ、コールドパック、発泡スチロールボックスを段ボール箱に入れ、一晩維持した（図２Ｄ）。温度プローブをポーチに挿入して、５分間ごとに温度を読み取った（図２Ｅ）。代表的な温度プロファイルを図３に示す。次に、一部の試験サンプルを４℃で冷蔵庫内に維持した（Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ；図４；ｎ＝３）。約２０ｍＬの水を５０ｍＬチューブに添加した（図４Ａ）。希釈したサンプルを含む１５ｍＬコニカルチューブを水に入れた（図４Ｂ）。コニカルチューブを回収カップに入れ、４℃で維持された冷蔵庫に入れた（図４Ｃ）。温度プローブを水浴に挿入して、５分間ごとに温度を読み取った（図４Ｄ）。代表的な温度プロファイルを図５に示す。

【0107】

Ｃｏｎｔｒｏｌの液状化後及び試験サンプルの一晩維持後に、Ｅｎｈａｎｃｅ Ｓ－Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ；Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン；カタログ番号１５２３２ ＥＳＰ－１００－９０％）による遠心分離により、精子を精漿又はＴＹＢ希釈剤から除去し、改変Ｈｕｍａｎ Ｔｕｂａｌ Ｆｌｕｉｄ培地（ｍＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンタアナ、ＣＡ；カタログ番号９０１２６、９７．８ｍＭのＮａＣｌ、４．６９ｍＭのＫＣｌ、０．２０ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．３７ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、２．０４ｍＭのＣａＣｌ_２、４ｍＭのＮａＨＣＯ_３、２１ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］、２．７８ｍＭのＣ_６Ｈ_１２Ｏ_６、０．３３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２１．４のｍＭの乳酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５ｍｇ／Ｌのフェノールレッド）で洗浄した。受精能獲得を促進するために、精子を、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ；セントルイス、ＭＯ；カタログ番号Ｃ０９２６）不含（ＮｏｎＣＡＰ）又は含有（ＣＡＰ）ｍＨＴＦに再懸濁した（Ｍｏｏｄｙ，Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０１７）。３時間のインキュベーション後、サンプルを固定した。対照サンプルでは、ＮｏｎＣＡＰ及びＣＡＰのＣａｐ－Ｓｃｏｒｅを、固定から約２４時間後に決定した（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定及びＣｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定）。試験サンプルでは、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅは、室温で更に一晩維持した後に決定した（Ｔｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定又はＴｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。精子をＴＹＢに曝露すると受精能獲得が制限される可能性があるので（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０１８）、サンプルが最大の受精能獲得レベルに達するには、更に一晩固定する必要があると想定される。

【0108】

図６に示すように、精液サンプルを回収し、分けた。半分を対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として用い、半分を試験（Ｔｅｓｔ）として用いた。対照サンプルを液状とし、次いで、受精能獲得刺激なし（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ）及び受精能獲得刺激あり（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ）のサンプルを作成した。インキュベーション後、対照サンプルを固定して一晩維持した後、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定及びＣｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定）について評価した。この一連の実験では、まず、試験サンプルを冷蔵培地中で希釈し、次いで、コールドパックと共に一晩維持した（Ｔｅｓｔ－ＣＰ）。次いで、これらのサンプルを処理し、インキュベートし、一晩固定し、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定した（Ｔｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。射精液（ｎ＝５）を分けたので、事前に予定した比較（ｐｒｅ－ｐｌａｎｎｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）には対応のあるｔ検定を使用した。予想通り、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定は、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定よりも大きかった（ｐ＜０．００１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定とＴｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定との間に差は見られなかった（ｐ＝０．８６５）。

【0109】

図７に示すように、精液サンプルを回収し、分けた。半分は対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として用い、半分は試験（Ｔｅｓｔ）として用いた。対照サンプルを液状とし、次いで、受精能獲得刺激なし（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ）及び受精能獲得刺激あり（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ）のサンプルを作成した。インキュベーション後、対照サンプルを固定して一晩維持した後、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定及びＣｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定）について評価した。まず、試験サンプルを冷蔵培地中で希釈し、次いで、冷蔵庫内で一晩維持した（Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ）。次いで、これらのサンプルを処理し、インキュベートし、一晩固定し、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定した（Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。射精液（ｎ＝３）を分けたので、事前に予定した比較には対応のあるｔ検定を使用した。予想通り、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定は、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定よりも大きかった（ｐ＜０．０２１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定とＴｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＡＰ－２４時間－固定との間に差は見られなかった（ｐ＝０．４８２）。

【0110】

キャップスコアは、コールドパック実験（図６）と冷蔵庫実験（図７）の両方におけるＣｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定と比較したとき、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定サンプルの方が大きかった（ｐ＜０．０５）。これは、標準的なアプローチを使用した両実験における良好な受精能獲得応答を示している。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定とＴｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定との間で同様のＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ値が観測され（図６）、このことは、射精液をＴＹＢ希釈剤中で一晩維持し、翌日に処理できることを示している。同様に、冷蔵庫の実験では、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定のＣａｐ－Ｓｃｏｒｅは、Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＡＰ－２４時間－固定サンプルと違いがなかった（図７）。この観察結果は、射精液を冷蔵培地で一晩維持し、翌日に、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅのための処理ができることを更に示している。

【0111】

４℃に冷却されたコールドパック実験で生成された温度プロファイル（図３）と４℃の冷蔵庫実験で生成された温度プロファイル（図５）は、互いに異なるように見える。コールドパックを用いるセットアップでは、温度は、約０．７５時間で約１１℃に低下した後、約４．５時間で室温（約２０℃）に戻った。したがって、サンプルは、室温で約１９時間維持された。これとは異なり、冷蔵庫を用いるセットアップでは、温度は、約２．５時間で約４℃に低下し、翌日にサンプルが処理されるまでその温度が維持された。これらの結果は、ＴＹＢ希釈剤中の精子を広い温度範囲で一晩維持した後に処理して、標準的な処理を用いて生成されたものに匹敵するＣａｐ－Ｓｃｏｒｅが得られることを示唆した。

【0112】

より緩やかな温度プロファイルを生成できるかどうか、サンプルが前記した極端な環境のいずれかに達するのを防ぐことができるかどうかを判断するために、模擬サンプルを－２０℃に冷却したアイスパック入りのボックスに入れた（図８）。サンプルと希釈剤とを含有する１５ｍＬコニカルチューブを絶縁フォイルポーチに入れた（図８Ａ）。フォイルポーチをサンプルに巻き付け、輪ゴムでポーチを固定した後、発泡スチロールボックスに入れた（図８Ｂ）。－２０℃に平衡化されたアイスパックを、固定されたポーチとサンプルの上に置いた（図８Ｃ）。サンプル、ポーチ、アイスパック、及び発泡スチロールボックスを段ボール箱に入れ、一晩維持した（図８Ｄ）。温度プローブをポーチに挿入して、５分間ごとに温度を読み取った（図８Ｅ）。代表的なプロファイルを図９に示す。実際に、アイスパックのセットアップを使用した場合、サンプルは約１時間で約１２℃に達し、約１９．５時間が経過するまで室温に戻らなかった。

【0113】

まとめると、これらのデータは、自宅でのＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ回収キットの開発を支持している。このキットにより、患者は、自宅で射精液を簡便に採取でき、処理のために集約型実験室に一晩で送ることができる。

【0114】

Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイを、保存中に様々な温度処理に付された希釈ヒト精子サンプルで行い、精子細胞の受精能獲得能力に対する希釈剤溶液及び温度制御の影響を決定した。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭアッセイの結果を表１にまとめる。
表１．精子受精能獲得スコアに対する希釈剤及び温度の影響

【表1】

１ Ｔｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定 時間＝２４時間；精子サンプルをＴＹＢで希釈し、４℃に冷却されたコールドパックで冷却された発泡スチロールボックス中に保存した。
２ Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＡＰ－２４時間－固定：時間＝２４時間；精子サンプルをＴＹＢで希釈し、４℃で冷蔵庫内で保存した。

【0115】

コールドパックで一晩維持した希釈精液サンプル（Ｔｅｓｔ－ＣＰ）に関し、対照サンプルを液状とした後に処理して、受精能獲得刺激不含サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ）及び受精能獲得刺激含有サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ）を作成した。インキュベーション後、対照サンプルを固定して一晩維持した後、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅについて評価した（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定及びＣｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。この一連の実験では、まず、試験サンプルを冷蔵培地中で希釈し、次いで、コールドパックと共に一晩維持した（Ｔｅｓｔ－ＣＰ）。次いで、これらのサンプルを処理し、インキュベートし、一晩固定し、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定した（Ｔｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。射精液（ｎ＝５）を分けたので、事前に予定した比較には対応のあるｔ検定を使用した。予想通り、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定は、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定よりも大きかった（ｐ＜０．００１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定とＴｅｓｔ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定との間に差は見られなかった（ｐ＝０．８６５）（図６）。

【0116】

冷蔵庫で保存した精液サンプルに関し、対照サンプルを液状とした後に処理して、受精能獲得刺激不含サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ）及び受精能獲得刺激含有サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ）を作成した。インキュベーション後、対照サンプルを固定して一晩維持した後、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭについて評価した（Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定及びＣｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。まず、試験サンプルを冷蔵培地中で希釈し、次いで、冷蔵庫内で一晩維持した（Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ）。次いで、これらのサンプルを処理し、インキュベートし、一晩固定し、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭを決定した（Ｔｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＡＰ－２４時間－固定）。射精液（ｎ＝３）を分けたので、事前に予定した比較には対応のあるｔ検定を使用した。予想通り、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定は、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮｏｎＣＡＰ－２４時間－固定よりも大きかった（ｐ＜０．０２１）。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰ－２４時間－固定とＴｅｓｔ－Ｒｅｆ－ＣＰ－ＣＡＰ－２４時間－固定との間に差は見られなかった（ｐ＝０．４８２）（図７）。

【0117】

表１の結果から、対照サンプルと、低温で一晩維持したサンプルとの間に有効な差がないことが示された。ＴＹＢ希釈剤（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９０１２９）に対する、冷却温度での長期間に亘る精子細胞の受精能獲得能力の耐性により、臨床Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ試験ラボにて、開業医の監視下で精子サンプルを回収する必要性が低減した。換言すれば、８℃～２５℃の温度での希釈剤に対する精子細胞の受精能獲得能力の耐性により、患者は自宅で精子サンプルを回収し、希釈した精子サンプルを一晩で臨床Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ試験ラボに送ることができる。精子サンプルの在宅回収の利便性は、正確性及び効率を損なうことなく、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅアッセイの利用性を大幅に向上させる。

【0118】

実施例２．Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ ^ＴＭ によって決定された、ヒトの精子の受精能獲得能力に対するＴＥＳＴ卵黄バッファー（ＴＹＢ）と冷却の影響
この試験は、精子の受精能獲得の時間を延ばす能力に対するＴＥＳＴ（ＴＥＳ及びＴｒｉｓ）卵黄バッファー及び冷却の影響を評価することである。

【0119】

以下の表２の精液サンプル１～３を回収し、液状として、前記実施例１に記載の手順にしたがって対照サンプルと試験サンプルに分けた（図１、Ｍｏｏｄｙ，Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０１７）。半分は対照として用い、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）用に通常処理し、残りの半分は試験サンプル（Ｔｅｓｔ）として用いた。試験サンプルをＴＹＢ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；９０１２９－２０Ｘ５ｍＬ［１７６ｍＭの２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸［ＴＥＳ］、８０ｍＭの２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール［Ｔｒｉｓ］、９ｍＭのデキストロース、１０μＬのゲンタマイシン硫酸塩、２０％ｖ／ｖの熱不活化卵黄］）中で希釈した。希釈精液試験サンプルは、精液：ＴＹＢが１：１（ｎ＝５）、１：６（ｎ＝７）、又は８：５（ｎ＝５）の体積比で希釈した。ＴＹＢ希釈試験精液サンプル１～３は、－２０°Ｃに冷却されたコールドパックを備えた封止絶縁発泡スチロールボックスに、一晩（即ち、約１８時間～約２４時間）保存した。

【0120】

まず、一晩保存後、冷却サンプルを加温し室温に戻す。次に、サンプルを洗浄し、非受精能獲得（ＮＣ）条件又は受精能獲得（ＣＡＰ）条件に３時間曝露した後、一晩固定しＣａｐ－Ｓｃｏｒｅを決定した。表２の試験サンプル１～３のＣａｐ－Ｓｃｏｒｅは、前記実施例１に記載のアッセイ手順にしたがって決定し、対応のあるｔ検定を使用して、試験サンプルを対照と比較した。

【0121】

いずれの実験においても、Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅは、ｃｏｎｔｒｏｌ－ＮＣと比較したときに、ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰの方が大きかった（ｐ＜０．０５）。いずれの希釈率においても、ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰとｔｅｓｔ－ＣＡＰとの間に有意差は見られなかった（比率１：１：３９．７±４％対４０．０±２％；ｐ＝０．８７；比率１：６：３２．０±４％対３４．０±３％；ｐ＝０．３３；比率８：５：３６．０±２％対３４．２±１％；ｐ＝０．５）。Ｃａｐ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭ試験の結果を以下の表２にまとめる。
表２．精子受精能獲得スコアに対するＴＹＢ及び冷却の影響

【表2】

【0122】

表２の結果によれば、いずれの実験においても、対照で良好な受精能獲得応答が観察された。このことは、ＣＡＰ条件による適切な刺激を示唆している。精液：ＴＹＢの体積比は、一般的な射精量を模倣するように選択され、一定量の希釈剤を、精子の受精能獲得能力を維持する在宅精液回収キットに利用できる可能性がある。様々な異なる射精量に一定量のＴＹＢの添加することは、ユーザー種（ｕｓｅｒ ｉｎｐｕｔ）を制限する。ｃｏｎｔｒｏｌ－ＣＡＰとｔｅｓｔ－ＣＡＰとの間の類似したＣａｐ－Ｓｃｏｒｅ値は、比率によらず、翌日の機能への影響を最小限に抑えつつ、射精液を、様々な濃度のＴＹＢ中で一晩維持できることを示している。

【0123】

この試験から、ＴＹＢが精子の受精能を延ばし得ることが示された。ＴＹＢは、本明細書に記載されるように、在宅回収キットの効果的な精液希釈剤として使用することができる。

【0124】

全体として、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、全ての実験（１：１コールドパック、１：１冷蔵庫、１：６アイスパック、８：５アイスパック、１：１輸送用インキュベーター、及び１：１輸送用冷凍庫）間で、ＣＡＰ－Ｓｃｏｒｅ^ＴＭと濃度値を比較した。対照処理群又は試験処理群について、実験の全般的効果（ｏｖｅｒａｌｌ ｅｆｆｅｃｔ）は観察されなかった。サンプルを、試験温度範囲に維持されることを確実にするために、２つの温度モニターを在宅回収キット内に設けて、－５℃に達するサンプル（Ｔｅｌａｔｅｍｐ－Ｃｏｌｄ Ｓｎａｐ ＣＴ －５℃；１：１輸送用冷凍庫データを参照）と、１時間超で２０℃を超えるサンプル（Ｔｅｌａｔｅｍｐ－Ｗａｒｍ Ｍａｒｋ ３ＴＭ＋２０℃；１：１コールドパックデータを参照）とを特定する。

【0125】

自宅でのサンプル回収により、リソースが限られたクリニックでサンプルを処理する負担を軽減することができる。また、クリニックでのサンプル調製又はクリニックに持ち込む際のプライバシーが主な障壁となっている男性の精密検査の実施を促進することもできる。それはまた、精子機能試験の地理的利用性を、クリニックから遠く離れて住んでいる人々に広げ、仕事から離れる時間及び労力に関連する経済的負担を減らすことができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0126】

【非特許文献1】Ｂａｂｉｇｕｍｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１８， ３５（１）： ９９－１０６

【非特許文献2】Ｃａｒｄｏｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０１７， ８４（５）： ４２３－４３５； Ｓｃｈｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１８， ８５（８－９）： ６５４－６６４

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】