特開 2024-161970 アゾール系抗真菌薬剤耐性Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅの分子生物学的検出法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024161970

(43)【公開日】2024-11-21

(54)【発明の名称】アゾール系抗真菌薬剤耐性Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅの分子生物学的検出法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20241114BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20241114BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALI20241114BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20241114BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/6851 Z ZNA

C12Q1/6895 Z

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023077076

(22)【出願日】2023-05-09

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ２０２２年５月１２日、ＡＳＭ Ｊｏｕｒｎａｌｓ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０２２ Ｊｕｎ ２１；６６（６）：ｅ０００５９２２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ａａｃ．０００５９－２２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ

(71)【出願人】

【識別番号】399086263

【氏名又は名称】学校法人帝京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】加納 塁

(72)【発明者】

【氏名】山田 剛

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ07

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR76

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】白癬菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ（Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）における、より安価で迅速な感受性株と耐性株とを鑑別する方法を提供する。
【解決手段】前記鑑別方法は、白癬菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ（Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）からゲノムＤＮＡサンプルを調製する工程；前記Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の翻訳領域の５’末端より上流のアンチセンス鎖と相補的な塩基配列を含むフォワードプライマーと、前記ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の翻訳領域の３’末端より下流のセンス鎖と相補的な塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを用いて、前記核酸サンプルの核酸増幅反応を行い、得られた核酸増幅産物のサイズを分析することにより、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数を予想し、アゾール系抗真菌剤耐性を判定する工程；を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

白癬菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ（Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）からゲノムＤＮＡサンプルを調製する工程；
前記Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の翻訳領域の５’末端より上流のアンチセンス鎖と相補的な塩基配列を含むフォワードプライマーと、前記ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の翻訳領域の３’末端より下流のセンス鎖と相補的な塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを用いて、前記核酸サンプルの核酸増幅反応を行い、得られた核酸増幅産物のサイズを分析することにより、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数を予想し、アゾール系抗真菌剤耐性を判定する工程；
を含む、
Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるアゾール系抗真菌剤耐性株の鑑別方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アゾール系抗真菌薬剤耐性Trichophyton indotineaeの分子生物学的検出法に関する。

【背景技術】

【0002】

２０１８年、インドにおいて、アリルアミン系抗真菌薬であるテルビナフィン（ＴＢＦ）に耐性（低感受性）を示す体部白癬の流行が多数報告され、その原因菌はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅとされた。
２０２０年、前記ＴＢＦ耐性Ｔ．ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅは、加納らによって、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅとして新種提案された（非特許文献１）。

【0003】

２０２２年、本発明者らは、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるアゾール系抗真菌薬（イトラコナゾール、ボリコナゾール）耐性がＣＹＰ５１Ｂ遺伝子（ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂ）のコピー数の増加による同遺伝子の過剰発現に基づくものであることを報告した（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Kano, R. et al., Trichophyton indotineae sp. nov.: A New Highly Terbinafine-Resistant Anthropophilic Dermatophyte Species. Mycopathologia 185, 947-958 (2020).

【非特許文献2】Yamada, T. et al., Gene Amplification of CYP51B: a New Mechanism of Resistance to Azole Compounds in Trichophyton indotineae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy June 2022 Volume 66 Issue 6.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

前記非特許文献２では、次世代シーケンサーによるＴ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅの全ゲノム配列決定により、ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数を決定しており、より安価で迅速な感受性株と耐性株とを鑑別する方法が求められていた。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記課題は、以下の本発明により解決することができる：
［１］白癬菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ（Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）からゲノムＤＮＡサンプルを調製する工程；
前記Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の翻訳領域の５’末端より上流のアンチセンス鎖と相補的な塩基配列を含むフォワードプライマーと、前記ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の翻訳領域の３’末端より下流のセンス鎖と相補的な塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを用いて、前記核酸サンプルの核酸増幅反応を行い、得られた核酸増幅産物のサイズを分析することにより、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数を予想し、アゾール系抗真菌剤耐性を判定する工程；
を含む、
Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるアゾール系抗真菌剤耐性株の鑑別方法。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、より安価で迅速に、白癬菌（Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）におけるアゾール系抗真菌薬に対する感受性株と耐性株との鑑別を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのアゾール系抗真菌薬感受性株（ＴＩＭＭ２０１１４）と同薬耐性株（ＴＩＭＭ２０１１６、ＴＩＭＭ２０１１８）におけるゲノム上のＣＹＰ５１Ｂ遺伝子（ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂ）の数と配置を模式的に示す説明図である。

【図2】配列番号１のセンスプライマーと、配列番号２のアンチセンスプライマーとの組合せを使用し、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのアゾール系抗真菌薬耐性株と同感受性株から抽出したゲノムＤＮＡサンプルを鋳型としてＬＡ－ＰＣＲ（Long and accurate PCR）反応を行い、ＰＣＲ増幅産物（ＤＮＡ断片）のアガロースゲル電気泳動の結果を示す電気泳動像である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

図１及び表１に示すように、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのアゾール系抗真菌薬感受性株（以下、単に感受性株と称することがある）では、ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂのコピー数が１であるのに対して、アゾール系抗真菌薬耐性株（以下、単に耐性株と称することがある）では、ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂのコピー数が複数（例えば、３～７）であり、前記耐性株では重複するＴｉｎＣＹＰ５１Ｂがゲノム上で同じ方向に一列に繰り返す構造（タンデムリピート構造）をとっている。耐性株では、ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂのコピー数が増加しているため、同遺伝子が過剰発現しており、アゾール系抗真菌薬への耐性をもたらしている。

【0010】

本発明の鑑別方法では、プライマーセットとして、ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂの翻訳領域の５’末端より上流のアンチセンス鎖と相補的な塩基配列を含むフォワードプライマーと、前記ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂの翻訳領域の３’末端より下流のセンス鎖と相補的な塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを使用する。

【0011】

前記フォワードプライマーとしては、配列番号４における、好ましくは２０－４０、より好ましくは２５－３５の領域を標的として設計することができる。
前記リバースプライマーとしては、配列番号４における、好ましくは２０－４０、より好ましくは２５－３５の領域を標的として設計することができる。

【0012】

本発明の鑑別方法における各工程、例えば、Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅの培養、ゲノムＤＮＡサンプルの調製、核酸増幅反応、核酸増幅産物の確認は、それぞれ、常法に従って、あるいは、後述の実施例の記載に従って、実施することができる。

【実施例0013】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

【0014】

《実施例１》
本実施例では、アゾール系抗真菌剤（イトラコナゾール、ボリコナゾール）に感受性または耐性を示す白癬菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ（Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）４株から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子（ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂ）を増幅するＬＡ－ＰＣＲ（Long and accurate PCR）を行い、得られた核酸増幅産物のサイズとＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数との相関性を検討した。

【0015】

Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅとしては、感受性株としてＴＩＭＭ２０１１４株、耐性株としてＮＵＢＳ１９００６^Ｔ、ＴＩＭＭ２０１１８株、ＴＩＭＭ２０１１９株を使用した（帝京大学医真菌研究センターのカルチャーコレクションより入手）。Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅのゲノムＤＮＡは、サブローブドウ糖寒天培地（１％ペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で３～４日間培養後、菌糸を回収し、液体窒素で凍結した菌糸をマルチビーズショッカー（Multi-Beads shocker；安井機械株式会社，大阪）を用いて菌糸を破壊後、フェノール、クロロホルム処理による徐タンパク処理し、エタノール沈殿にて抽出した。

【0016】

ＰＣＲプライマーとしては、センスプライマー（配列番号１；Ｔｉｃｙｐ５１Ｂ－ＬＡＳ：５’－ＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧ－３’）及びアンチセンスプライマー（配列番号２；Ｔｉｃｙｐ５１Ｂ－ＬＡＲ：５’－ＣＡＡＡＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＣＣＧＴＣＡＡＧＧＴＴＣ－３’）の組合せを用いた。なお、前記アンチセンスプライマーの標的配列を配列番号３（５’－ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＴＧ－３’）に示す。
また、感受性株であるＴＩＭＭ２０１１４株のＴｉｎＣＹＰ５１Ｂ遺伝子（１コピー）及びその周辺領域の塩基配列を配列番号４（全６８３７塩基）に示し、耐性株であるＴＩＭＭ２０１１８株のＴｉｎＣＹＰ５１Ｂ遺伝子（７コピー）及びその周辺領域の塩基配列を配列番号５（全２１２６１塩基）に示す。配列番号４において、ＴｉｎＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の開示コドンＡＴＧは２５３５－２５３７であり、終始コドンＴＧＡは４３２０－４３２２である。
配列番号１の配列は、配列番号４の１３９－１６８、あるいは、配列番号５の１３９－１６８に対応し、配列番号２の配列は、配列番号４の４８７６－４９０５、あるいは、配列番号５の１９３００－１９３２９に対応する。

【0017】

ＬＡ－ＰＣＲは、以下の条件で実施し、得られた増幅産物は０．６％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。
抽出した遺伝子（約１００ｎｇ）を鋳型として、市販キット（long range PCR enzyme mix; biotechrabbit GmbH, Berlin, Germany）に添付されている酵素およびバッファーを用いて反応液を作成した。
反応液の組成は以下のとおりである：
２．５μＬ １０ｘｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ
５μＬ ５ｘＰＣＲ ｅｎｈａｎｃｅｒ
１．５μＬ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ
０．７５Ｕ 酵素
０．３μＬ 各プライマー（１００ｎｍｏｌ）セット
合計２５μＬ
反応条件は
９５℃、２分の変性後、
以下のサイクルを３０サイクル繰り返した：
９５℃、３０秒
６８℃、２５分

【0018】

ＬＡ－ＰＣＲによるＣＹＰ５１Ｂ遺伝子増幅産物の泳動像を図２に示す。
また、各Ｔ．ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅにおけるイトラコナゾール（ＩＴＣ）及びボリコナゾール（ＶＲＣ）に対する感受性（ＭＩＣ_８０）、アゾール系抗真菌剤に対する感受性／耐性、ゲノム中のＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数を表１にまとめた。なお、ＭＩＣ_８０とは、抗真菌剤なしで得られた吸光度値と比較して８０％の増殖阻害を示すウェルに存在する抗真菌剤の最低濃度（単位：μｇ／ｍＬ）である。また、ゲノム中のＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数は、次世代シーケンサーにより決定した全ゲノム配列に基づく。

【0019】

【表1】

【0020】

アゾール系抗真菌剤感受性のＴＩＭＭ２０１１４株は、全ゲノム配列から決定したＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数が１コピーであり、ＬＡ－ＰＣＲ増幅産物に含まれる増幅バンドは１本であった（図２のレーン１）。一方、アゾール系抗真菌剤耐性のＮＵＢＳ１９００６^Ｔ株（図２のレーン２）、ＴＩＭＭ２０１１８株（図２のレーン３）、ＴＩＭＭ２０１１９株（図２のレーン４）におけるＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数は、それぞれ、３コピー、７コピー、５コピーであり、増幅バンドとして、ＴＩＭＭ２０１１４株と同じサイズのバンド以外に、それよりも塩基長の長いバンドが認められた。また、ＮＵＢＳ１９００６^Ｔ株（３コピー）とＴＩＭＭ２０１１８株（７コピー）の増幅バンドを比較すると、ＴＩＭＭ２０１１８株においてＮＵＢＳ１９００６^Ｔ株よりも更に長いバンドが認められた。

【0021】

ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数に応じて、アゾール系抗真菌剤への耐性をもたらしているものと考えられる。
本発明によれば、高価な次世代シーケンサーにより全ゲノム配列を決定することなく、ＬＡ－ＰＣＲ増幅産物のバンドサイズにより、ＣＹＰ５１Ｂ遺伝子の重複コピー数を予想することができ、安価でルーチンとして定着しているＬＡ－ＰＣＲ及びその増幅産物の電気泳動像により、アゾール系抗真菌剤に対する耐性があるかないかを判定することができ、すなわち、感受性株と耐性株とを鑑別することができる。

【産業上の利用可能性】

【0022】

本発明は、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｄｏｔｉｎｅａｅ）におけるアゾール系抗真菌剤に対する感受性株と耐性株との鑑別に利用することができる。

【図1】

【図2】

【配列表】

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