特開 2024-163007 プラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024163007

(43)【公開日】2024-11-21

(54)【発明の名称】プラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6844 20180101AFI20241114BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20241114BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241114BHJP

   C07K 17/14 20060101ALI20241114BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241114BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20241114BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20241114BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6844 Z

G01N33/543 541A

G01N33/543 595

G01N33/53 U ZNA

C07K17/14

C12Q1/686 Z

C07K16/18

C07K16/42

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024021037

(22)【出願日】2024-02-15

(31)【優先権主張番号】10-2023-0059804

(32)【優先日】2023-05-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 公開日：２０２３年２月１５日 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０９２５４００５２２０１７５３１

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510314208

【氏名又は名称】スンチュンヒャン ユニバーシティ インダストリー アカデミー コオペレーション ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジョンフン

【テーマコード（参考）】

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ05

4B063QQ20

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS39

4B063QX02

4B063QX10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA63

4H045EA50

(57)【要約】

【課題】プラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法の提供を課題とする。
【解決手段】一態様によるプラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法は、低コストで、迅速かつ簡単に標的核酸の検出が可能であるところ、分子生物学、医療、生物分類など様々な分野に活用することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）捕捉抗体とプラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ：Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を結合させる段階；
（ｂ）検出抗体とストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）－核酸複合体を結合させる段階；
（ｃ）前記捕捉抗体と結合したナノ粒子および前記検出抗体と結合した複合体を混合する段階；および
（ｄ）前記混合したナノ粒子と複合体を分離する段階；
（ｅ）前記複合体、プライマーおよび核酸重合酵素を用いて標的核酸を増幅させる段階；および
（ｆ）標的核酸を検出する段階；を含む標的核酸の検出方法。

【請求項2】

前記（ａ）段階で前記プラズモン免疫磁気ナノ粒子は、磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓｍ）および光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）特性を有するものである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記（ａ）段階で前記捕捉抗体は、前記ナノ粒子の表面に共有結合したものである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記（ｂ）段階で前記検出抗体は、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）したものである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記（ｃ）段階で前記ナノ粒子と前記複合体は、サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）構造で混合したものである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記（ｅ）段階で前記重合酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＰＷＯポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼから成る群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記（ｅ）段階で前記増幅は、光熱循環増幅を通じて行うものである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記（ｆ）段階で前記検出は、比色分析、蛍光分析、ラマン分析およびゲル電気泳動から成る群から選択される１つ以上を用いて行うものである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

酸化鉄ナノクラスター（ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ）、金ナノシェル（ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｈｅｌｌ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む、多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子（Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。

【請求項10】

前記酸化鉄ナノクラスターは、磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓｍ）を有するものである、請求項９に記載のナノ粒子。

【請求項11】

前記金ナノシェルは、光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）特性を有するものである、請求項９に記載のナノ粒子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法に関する。
本発明は、韓国科学技術情報通信部の支援で課題番号２０２２Ｒ１Ｆ１Ａ１０７０１６２（１７１１１７１６３１）により完成された。

【背景技術】

【0002】

ｉＰＣＲ（Ｉｍｍｕｎｏ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、抗原－抗体相互作用の特異性とＰＣＲの増幅能力を用いたタンパク質の超高感度定量化のための免疫分析法である。一般的に、ｉＰＣＲは、ＰＣＲの幾何級数的増幅能力によりＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）に比べて感度を数千～数億倍増加させることができる。しかしながら、ｉＰＣＲに用いられる従来のｑＰＣＲ熱循環器は、精巧であるが、高価であり、時間およびエネルギー消耗ペルチェ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）ベースの熱ブロックモジュールであるから、ポイントオブケア（ＰＯＣ：ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）診断に適用が制限的であるという問題がある。

【0003】

最近では、プラズモンナノ物質（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）の光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）効果を用いた光子ＰＣＲ（ｐｈｏｔｏｎｉｃ ＰＣＲ）が、速くかつ高い光熱変換能力を有するという点から、関心を集めている。しかしながら、光子ＰＣＲには、依然としていくつかの問題があり、広範囲なＰＣＲ適用が制限的である。

【0004】

これより、前述のような問題点を解決するために、本発明者らは、多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ）を用いたプラズモン光熱定量ｉＰＣＲ（ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ）を開発した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

一態様は、（ａ）捕捉抗体とプラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ：Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を結合させる段階；
（ｂ）検出抗体とストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）－核酸複合体を結合させる段階；
（ｃ）前記捕捉抗体と結合したナノ粒子および前記検出抗体と結合した複合体を混合する段階；および
（ｄ）前記混合したナノ粒子と複合体を分離する段階；
（ｅ）前記複合体、プライマーおよび核酸重合酵素を用いて標的核酸を増幅させる段階；および
（ｆ）標的核酸を検出する段階；を含む標的核酸の検出方法を提供することにある。

【0006】

他の態様は、酸化鉄ナノクラスター（ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ）、金ナノシェル（ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｈｅｌｌ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む、多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子（Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様は、（ａ）捕捉抗体とプラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ：Ｐｌａｓｍｏｎ
ｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を結合させる段階；
（ｂ）検出抗体とストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）－核酸複合体を結合させる段階；
（ｃ）前記捕捉抗体と結合したナノ粒子および前記検出抗体と結合した複合体を混合する段階；および
（ｄ）前記混合したナノ粒子と複合体を分離する段階；
（ｅ）前記複合体、プライマーおよび核酸重合酵素を用いて標的核酸を増幅させる段階；および
（ｆ）標的核酸を検出する段階；を含む標的核酸の検出方法を提供する。

【0008】

前記用語「ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）」は、ストレプトミセス・アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）で精製された５２ｋＤａタンパク質を意味する。

【0009】

前記用語「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、ＤＮＡ合成時に鋳型に相補的なもう１つの重合体ストランドが作られる開始点となる短い遺伝子配列を意味する。

【0010】

一実施形態において、前記（ａ）段階で前記プラズモン免疫磁気ナノ粒子は、磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓｍ）および光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）特性を有するものでありうる。

【0011】

前記用語「磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓｍ）」は、磁石が周囲物体に何らかの影響を及ぼすことを意味する。

【0012】

前記用語「光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）特性」は、光エネルギーを用いて所望の部位に特異的に刺激できる性質を意味する。

【0013】

前記用語「プラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ：Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」は、磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓｍ）および光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）特性を有し、酸化鉄ナノクラスター（ｉｒｏｎ
ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ）、金ナノシェル（ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ）および抗体で構成されたナノ粒子を意味する。

【0014】

一実施形態において、前記（ａ）段階で前記捕捉抗体は、前記ナノ粒子の表面に共有結合したものでありうる。

【0015】

前記用語「捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つ以上の標的タンパク質（抗原）に特異的に結合できる抗体を意味する。

【0016】

前記用語「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）」は、化学結合中に電子を原子が共有したときに生成される結合を意味する。

【0017】

一実施形態において、前記（ｂ）段階で前記検出抗体は、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）したものでありうる。

【0018】

前記用語「検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、前記捕捉抗体により捕捉された標的タンパク質（抗原）に結合できる抗体を意味する。

【0019】

一実施形態において、前記検出抗体がビオチン化することによって検出効率が増加する
ものでありうる。

【0020】

一実施形態において、前記（ｃ）段階で前記ナノ粒子と前記複合体は、サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）構造で混合したものでありうる。

【0021】

一実施形態において、前記（ｄ）段階で前記ナノ粒子と複合体は、磁気分離したものでありうる。

【0022】

一実施形態において、前記（ｅ）段階で前記重合酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＰＷＯポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼから成る群から選択される１つ以上でありうる。

【0023】

一実施形態において、前記（ｅ）段階で前記増幅は、光熱循環増幅を通じて行うものでありうる。

【0024】

一実施形態において、前記（ｆ）段階で前記検出は、比色分析、蛍光分析、ラマン分析およびゲル電気泳動から成る群から選択される１つ以上を用いて行うものでありうる。

【0025】

前記用語「比色分析」は、色試薬などを用いて光の特定波長の吸光度を測定し、化学化合物、溶液の濃度をテストしたり定量することを意味する。

【0026】

前記用語「蛍光分析」は、物質の蛍光性を用いた化学分析法であり、非蛍光物質である試料を化学反応によって蛍光物質に変化させて当該蛍光を分析することを意味する。

【0027】

前記用語「ラマン分析」は、光を用いて分子運動を生成（励起）し、このような相互作用を解析してサンプルを化学的に分析することを意味する。

【0028】

前記用語「ゲル電気泳動」は、ゲルマトリックス（ｇｅｌ ｍａｔｒｉｘ）に電流を流してＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などを分離することを意味する。

【0029】

他の態様は、酸化鉄ナノクラスター（ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ）、金ナノシェル（ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｈｅｌｌ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む、多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子（Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を提供する。

【0030】

前記「酸化鉄ナノクラスター」、「金ナノシェル」、「抗体」、「プラズモン免疫磁気ナノ粒子」などは、前述した範囲内でありうる。

【0031】

一実施形態において、前記酸化鉄ナノクラスターは、磁性（ｍａｇｎｅｔｉｓ ｍ）を有するものでありうる。

【0032】

一実施形態において、前記金ナノシェルは、光熱（ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ）特性を有するものでありうる。

【発明の効果】

【0033】

一態様によるプラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法は、低コストで、迅速かつ簡単に標的物質の検出が可能であるところ、分子生物学、医療、生物分類など様々な分野に活用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、ＩＬ－６検出のためのプラズモン免疫磁気ナノ粒子（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を用いたプラズモン光熱定量的免疫－ＰＣＲ（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ）のワークフロー（ｗｏｒｋｆｌｏｗ）概略図である。

【図2a】図２ａ～図２ｆは、ＰＩＭＮの特性を確認した結果を示す図である。具体的には、図２ａは、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＰＭＮ（Ａｕ：赤色、Ｆｅ：緑色）の高角環状暗視野（Ｈｉｇｈ－ａｎｇｌｅ ａｎｎｕｌａｒ ｄａｒｋ－ｆｉｅｌｄ）および元素マッピングイメージ（ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｍａｇｅｓ）および磁性ナノクラスターコアを確認した結果を示す図である。

【図2b】図２ｂ～図２ｄは、それぞれ互いに異なる表面修飾段階でＰＭＮの流体力学的直径分布（ｂ）、ゼータ電位（ｃ）およびＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ｄ）を確認した結果を示す図である。

【図2c】図２ｂのつづき。

【図2d】図２ｃのつづき。

【図2e】図２ｅは、ＰＩＭＮの様々な光学密度を有する７２℃～９５℃間の１つの光熱循環の温度プロファイルを確認した結果を示す図である。

【図2f】図２ｆは、計算された加熱および冷却速度を確認した結果を示す図である。

【図3a】図３ａ～図３ｄは、酸化鉄（ａ）、（ｂ）Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ａｕ種子、（ｃ）Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ａｕおよび（ｄ）Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ａｕ－ＭＰＡを走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したイメージを示す図である（スケールバー：５００ｎｍ）。

【図3b】図３ａのつづき。

【図3c】図３ｂのつづき。

【図3d】図３ｃのつづき。

【図4】図４は、Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＡｕのＥＤＸパターン（Ａ）とＦｅ_３Ｏ_４およびＦｅ_３Ｏ_４＠ＡｕのＸＲＤパターン（Ｂ）を示す図である。

【図5】図５は、ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲのためのホームビルド（ｈｏｍｅ－ｂｕｉｌｄ）装置を示す図である。

【図6】図６は、ＰＩＭＭがない溶液の温度プロファイルを確認した結果を示す図である。

【図7】図７は、３５回の光熱循環前後の熱安定性を確認した結果を示す図である。

【図8】図８は、標的ＩＬ－６（１，０００ｐｇ／ｍｌ）、互いに異なる量のＳＧ染料（Ａ）、３％アガロースゲル電気泳動分析（Ｂ）および蛍光スペクトル（ＳＧ７ｘ）を用いたリアルタイムＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの増幅曲線を確認した結果を示す図である。

【図9】図９は、ＩＬ－６（１，０００ｐｇ／ｍｌ）および互いに異なる濃度のＰＩＭＮから得たリアルタイムＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの増幅曲線を確認した結果を示す図である。

【図10a】図１０ａ～図１０ｇは、ＰＩＭＮを用いたＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ特性を確認した結果を示す図である。具体的には、図１０ａは、リアルタイムおよび終点蛍光二重読み出し（ｅｎｄ－ｐｏｉｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｕａｌ－ｒｅａｄｏｕｔ）を用いたＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの概略図である。

【図10b】図１０ｂは、代表的な光熱増幅温度プロファイルを確認した結果を示す図である。

【図10c】図１０ｃは、互いに異なる濃度のＩＬ－６（１０００、１００、５０、１０、５、１ｐｇ・ｍＬ^－１）でＰＰＴ－ｑｉＰＣＲのリアルタイム増幅曲線を確認した結果を示す図である。

【図10d】図１０ｄは、リアルタイム増幅曲線のＣｑ値を確認した結果を示す図である。

【図10e】図１０ｅは、図１０ｃと同じサンプルでＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの終点蛍光曲線を確認した結果を示す図である（赤色と黒色プロットは、それぞれ磁気分離前後の終点蛍光信号）。

【図10f】図１０ｆは、ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの蛍光およびゲル電気泳動イメージである（レーン１－９：０、０．２５、０．０５、０．５、１、１０、１００、５００、１０００ｐｇ・ｍＬ^－１）。

【図10g】図１０ｇは、ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ［ＰＢＳ緩衝液、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、ヘモグロビン（Ｈｂ）］の選択性試験を行った結果を示す図である。

【図11】図１１は、濃度の異なるターゲットとナノ粒子の固定濃度による蛍光消光効果を示す図である。

【図12a】図１２ａ～図１２ｃは、ＩＬ－６検出のための比色ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲを行った結果を示す図である。具体的には、図１２ａは、終点比色ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲのワークフロー概略図である。

【図12b】図１２ｂは、終点比色ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲを行った結果のイメージである。

【図12c】図１２ｃは、６５０ｎｍで終点比色ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ溶液の吸光度プロットを確認した結果を示す図である。

【図13】図１３は、ＭＥＳ緩衝液の添加によるｉＰＣＲ緩衝液のｐＨ変化（Ａ）とＴＭＢ濃度による３５回熱循環後に測定された吸光度を比較（Ｂ）した結果を示す図である。

【図14】図１４は、照射時間（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）の最適化を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例0036】

１．実験材料および実験方法

【0037】

（１）実験材料
塩化第二鉄を６水和物（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、３－アミノプロピルトリメトキシシラン（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）（ＡＰＴＭＳ）、テトラキス（ヒドロキシメチル）ホスホニウムクロライド（ＴＨＰＣ：ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、水素テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｕｒａｔｅ ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ）（ＨＡｕＣｌ_４・３Ｈ_２Ｏ）、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸三ナトリウム二水和物（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、炭酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（Ｋ_２ＣＯ_３）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＨＣＨＯ）は、ＴＣＩ Ｃｏｍｐａｎｙから得、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（３，３’、５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）および３－メルカプトプロピオン酸（３－Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＭＰＡ）は、Ｅｎｅｒｇｙ ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。精製された抗ヒトＩＬ－６抗体（クローンＭＱ２－１３Ａ５、ラットモノクロナール）、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）抗ヒトＩＬ－６抗体（クローンＭＱ２－３９Ｃ３、ラットモノクロナール）、組換えヒトＩＬ－６および精製されたストレプトアビジン（
ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。正方向プライマー（５’－ＣＡＴＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＡＡＴ－３’：配列番号１）、逆方向プライマー（５’－ＴＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴ－３’：配列番号２）および５’末端にビオチンラベル付き１１２－塩基対（ｂｐ）Ｘ－ＤＮＡ標的は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｄｒｅａｍ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（０．０５Ｕ・μＬ^－１）、反応緩衝液（ＭｇＣｌ_２、４ｍＭ）、ｄＮＴＰ混合物（それぞれ０．４ｍＭ）およびＭＥＳ緩衝液（８μＬ、ＢｕｐＨ^ＴＭ ＭＥＳ緩衝食塩水パック、２８３９０、０．１Ｍ ＭＥＳ、０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ４．７）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（４９７ｎｍで励起状態および５３０ｎｍで放出）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）紫色低分子量ＤＮＡラダー（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ）、Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）紫色１ｋｂ ＤＮＡは、ラダーおよびゲルローディング染料（紫色、６ｘ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から購入した。ＰＭＮおよびその他の中間体の形態およびサイズ分布は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｔｅｃｎａｉ １２，Ｐｈｉｌｉｐｓ）およびＦｉｅｌｄ放出ＴＥＭ（ＦＥ－ＴＥＭ，ＪＥＭ－Ｆ２００，ＪＥＯＬ）ＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルは、Ｃａｒｙ
６０ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）でモニタリングした。

【0038】

（２）磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）およびプラズモン磁性ナノ粒子（ＰＭＮ：ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の合成

【0039】

まず、０．３４ｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、０．６ｇの酢酸ナトリウムおよび０．１１ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物をエチレングリコール（１０ｍＬ）に溶解させ、混合物を攪拌し、２時間超音波処理した後、テフロン（登録商標）ライニングステンレススチールオートクレーブ（Ｔｅｆｌｏｎ－ｌｉｎｅｄ ｓｔａｉｎｌｅｓｓ－ｓｔｅｅｌ ａｕｔｏｃｌａｖｅ）で密封した。オートクレーブは、２００℃で加熱し、１２時間維持し、磁性生成物を磁力分離で収集し、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）／脱イオン水（ＤＩＷ：ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）で３回洗浄し、使用前に６０℃で乾燥させた。ＰＭＮの場合、以前に［Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ａｐｐｌ Ｍａｔｅｒ Ｔｏｄａｙ，２３（２０２１）］説明したのと同じ合成方法を用いた。

【0040】

（３）ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ光学装置

【0041】

赤外線ＬＥＤ（８５０ｎｍピーク波長、金属コアＰＣＢに装着、８．５Ｗ正格電力、７００ｍＡ順方向電流で３．８Ｗ放射フラックス、１２．４Ｖ順方向電圧、ＬＺ４－４０Ｒ６０８、ＬＥＤエンジン、ＣＡ，ＵＳＡ）、青色ＬＥＤ（４６０ｎｍピーク波長、金属コアＰＣＢに装着、１０Ｗ電力等級、７００ｍＡ順方向電流および１４Ｖ順方向電圧で３．９Ｗ放射フラックス、ＬＺ４―４０Ｂ２０８、ＬＥＤ Ｅｎｇｉｎｅ、ＣＡ，ＵＳＡ）、ＩＲ温度計（ＯＰＴＣＳＴＣＬＴ１５）、青色ＬＥＤ（５ｍｍ、４８０ｎｍピーク波長、３．２Ｖ順方向電圧、２０ｍＡ順方向電流、４．１ｃｄ、Ｃ５０３Ｂ－ＢＣＮ－Ｖ０Ｚ０４６１、ＣＲＥＥ，Ｉｎｃ．，ＮＣ，ＵＳＡ）、ＦＩＴＣ放出フィルター（中心波長＝４７５ｎｍ、バンド幅＝３５ｎｍ、ＭＦ４７５－３５、Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）、分光光度計（ＣＣＳ２００、Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ）、ＵＳＡ）および光ファイバー（Ｍ００６５－５１－００３４、Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ
Ｊ，ＵＳＡ）を用いてＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ光学装置を構築した。ＬａｂＶＩＥＷプログラムは、電源供給装置、ＬＥＤを用いた熱循環、冷却ファン、蛍光測定および温度測定を制御した。

【0042】

（４）ＰＭＮの表面カルボキシル化（ＰＭＮ－ＭＰＡ）

【0043】

磁性ナノ粒子およびＰＭＮの合成は、以前の研究（Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ａｐｐｌ Ｍａｔｅｒ Ｔｏｄａｙ，２３（２０２１））と同様に進めた。ＰＭＮ（０．２５ｍＬ、１ｍｇ・ｍＬ^－１ ｉｎ ＤＩＷ）および３－メルカプトプロピオン酸（０．５μＬ、ＭＰＡ）を混合した後、混合物を３０分間超音波処理し、１，５００ｇで８分間遠心分離した後、ＤＩＷで洗浄し、最終的にＤＩＷ（１ｍｇ・ｍＬ^－１）に再分散した。

【0044】

（５）プラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ：Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の製造

【0045】

捕捉抗体は、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）カップリングを通じてＰＭＮに接合させた。具体的には、ＰＭＮ－ＭＰＡ（２０μＬ、１ｍｇ・ｍＬ^－１ ｉｎ ＤＩＷ）、Ｎ－（３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－Ｎ’－ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（２５μＬ、１０ｍｇ・ｍＬ^－１ ｉｎ ｐＨ ５．５ＭＥＳ緩衝液）および抗ヒトＩＬ－６ Ａｂ（１０μＬ、０．５ｍｇ・ｍＬ^－１ ｉｎ ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液）を１時間混合した。ナノ粒子の残りの活性部位は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、２．０ｗｔ％）を用いて遮断し、過量の捕捉抗体およびＢＳＡを除去するために、ＰＢＳ（０．０５ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で生成物を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、４℃で保管した。

【0046】

（６）ＰＣＲチューブの免疫分析法

【0047】

機能化されたナノ粒子ベースの免疫測定法は、次のように行った：２５μＬ ＩＬ－６試料を様々な濃度（１０００、５００、１００、１０、１、０．１、０．０５、０．０２５、０ｐｇ・ｍＬ^－１）でＰＩＭＮ（１２．５μＬ、０．２ｍｇ・ｍＬ^－１、６ＯＤ）およびビオチン抗ヒトＩＬ－６検出抗体（１２．５μＬ、０．００５ｍｇ・ｍＬ^－１）と混合した。振とう器で１時間培養した後、磁力分離を用いてＰＢＳ（０．０５ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。あらかじめ接合されたストレプトアビジン－ｄｓＤＮＡ複合体は、ストレプトアビジン（２．５μＬ、１０μｇ・ｍＬ^－１）とビオチン－ｄｓＤＮＡ（９．４μＬ、０．１μＭ）を室温で３０分間混合（１：２の割合）して獲得した。その後、あらかじめ接合されたストレプトアビジン－ｄｓＤＮＡ複合体をさらに３０分間混合した。ｄｓＤＮＡテンプレートで形成されたサンドイッチ免疫複合体をＰＢＳ（０．０５ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で数回洗浄し、バックグラウンドノイズを減らし、非特異的相互作用を防止した。その後、さらなるＰＣＲ反応のために、複合体溶液を５μＬ ＰＢＳに再分散させた。

【0048】

（７）ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ用ＰＣＲ混合物の準備

【0049】

ＰＣＲ増幅のための１０μＬ反応混合物は、次の通りである：ＰＣＲバッファー（１μＬ、１０×）、正方向プライマー（０．５μＬ、１０μＭ）、逆方向プライマー（０．５μＬ、１０μＭ）、ｄＮＴＰｓ（０．２μＬ、１０μＭ）、ＤＮＡ重合酵素（０．３μＬ、５ Ｕ・μＬ^－１）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（０．５μＬ、１４０ｘ ｉｎ ＤＭＳＯ）、ＰＩＭＮ－サンドイッチ（５μＬ、１５ＯＤ）、ヌクレアーゼのない水（２μＬ
）およびミネラルオイル（１０μＬ、混合物）。ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲは、９５℃（５秒）での初期変性、９５℃（１秒）と７２℃（８秒）の間の３５回光熱循環の二段階で行い、７２℃で１秒間アニーリング／延長する間にリアルタイムで５３０ｎｍで蛍光放出信号を測定し、反応をモニタリングした。増幅後、生成物溶液をＴＢＥ緩衝液（５μＬ、０．５ｘ）およびローディング緩衝液（３μＬ、６ｘ）と混合し、アガロースゲル（３％）電気泳動分析を行った。

【0050】

（８）比色分析（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）

【0051】

ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ後、ＭＥＳ緩衝液（９μＬ、０．１Ｍ、ｐＨ４．７）およびＴＭＢ（１μＬ、最終濃度３ｍＭ）を増幅されたＰＣＲ反応混合物１０μＬに添加した。Ｂｌｕｅ－Ｌｅｄを用いて生成された混合物を１０分間照射した。

【0052】

２．実験結果

【0053】

（１）多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子（Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）およびプラズモン光熱循環（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ）

【0054】

１）多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子

【0055】

多機能プラズモン免疫磁気ナノ粒子（ＰＩＭＮ：ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、磁気特性のためのＦｅ_３Ｏ_４ナノクラスター（ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ）、プラズモン光熱変換（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）のための金ナノシェル（ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ）および免疫反応のための抗体で構成される（図１）。マグネタイト（ｍａｇｎｅｔｉｔｅ）Ｆｅ_３Ｏ_４ナノクラスターは、溶媒熱反応を通じて準備した（図２ａおよび図３ａ）。その後、金シェル層の成長のために、コロイド金シードをＦｅ_３Ｏ_４ナノクラスターに付着した（図３ｂ）。付着した金シード（Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ａｕ ｓｅｅｄｓ）は、連続的な金シェルを形成する核形成サイトの役割をし、得られたプラズモン磁性Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ａｕナノ粒子は、ＰＭＮで表示した（図２ａおよび図３ｃ）。その後、電子顕微鏡イメージを通じて磁気コアが金シェルで完全に覆われていることを確認した（図２ａ）。Ｘ線粉末回折（ＸＲＤ：Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）パターンを通じて磁気コアと金シェルの結晶性を確認し、磁気コアとＰＭＮ間の他のパターンは、ＰＭＮのコア－シェル構造をさらに支援することを確認した（図４）。また、電子顕微鏡および動的光散乱を用いた粒子分析を通じてＰＭＮが１０８．７±１０．４ｎｍの均一なサイズを有する単分散であることを確認した（図２ｂおよび図３ｃ）。ナノ粒子の表面に捕捉抗体を固定させるために、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）およびカルボニル（ｃａｒｂｏｘｙｌ）グループを含む二作用性３－メルカプトプロピオン酸（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ３－Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＭＰＡ）をＰＭＮと抗体間のリンカーに導入させた。ＰＭＮは、まず、半共有金－硫黄（Ａｕ－Ｓ）結合を通じてＭＰＡで修飾された後、抗体がカルボジイミドカップリング（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）によりナノ粒子の表面に共有結合されることを確認した。修飾プロセスは、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル、ゼータ電位およびＤＬＳ分析を通じてモニタリングした（図２ｂ～図２ｄ）。表面電位は、ＰＭＮでＭＰＡを修飾した後、負数（－３９．９ｍＶ）となり、負電荷を帯びた数多くのカルボキシルグループの修飾を示すことを確認した。捕捉抗体の修飾後、正の方向にζ－電位の相当な移動を確認し、ＰＭＮで抗体が接合することを確認した。ＰＭＮの流体力学的半径およびＬＳＰＲピーク拡張の増加を通じてＰＭＮで抗体が成功裏に修飾されることを確認し、ＩＲ波長でＰＭＮの強い吸収は、ＩＲ光源を光熱変換に使用できるようにし（図２ｄ）、長期間の光の露出
による蛍光染料（ＳＹＢＲ（Ｃ）緑色、ＳＧ）の光退色を防止することを確認した。

【0056】

２）プラズモン光熱循環

【0057】

ｉＰＣＲの核心である熱循環過程は、プラズモンナノ粒子の光熱効果を用いて時間を短縮させることができる。家で作ったＩＲ－ＬＥＤ装置は、ＰＩＭＮの光熱変換を研究するために製造した（図５）。ＩＭＮを含む溶液温度を測定し、非接触ＩＲ温度計で記録した。図２ｅに示されたように、ＰＩＭＮの様々な光学密度（ＯＤ）で７２℃と９５℃の間の１つの光熱周期の代表的な温度プロファイルを確認した。また、ＰＩＭＮ ＯＤが５から１５に増加するにつれて、加熱ランプ速度の線形上昇を確認した。一周期の最も短い光熱循環時間は、加熱速度が９．３２±０．１３℃／ｓであり、冷却速度が６．４５±０．１０℃／ｓである１５ＯＤサンプルの場合、６秒であることを確認した（図２ｆ）。金ナノ粒子によって吸収された光エネルギーが熱発生の他に主なエネルギー損失チャネルがないという点を勘案するとき、加熱速度の線形増加を期待することができる。温度正確度は、９５℃および７２℃で７２．０３±０．３５℃および９４．８８±０．２１℃であり、１５．０ＯＤ以上では、加熱速度が大きく向上しないことを確認した。前述のような結果は、ナノ粒子濃度が増加するにつれて、粒子間カップリングによる光透過深さまたはプラズモン共鳴の変化によることを確認した。また、ＩＲ－ＬＥＤ照射下でナノ粒子なしでは温度変化がないことを確認し（図６）、ＰＩＭＮは、熱循環後、優れた熱安定性を示すことを確認した（図７）。

【0058】

（２）リアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）および終点蛍光二重読み出し（ｅｎｄ－ｐｏｉｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｕａｌ－ｒｅａｄｏｕｔ）を用いた定量的免疫分析

【0059】

増幅された核酸をリアルタイムで定量化できるリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）のモニタリング機能は、分子診断においてゴールドスタンダードとして使用され、蛍光ベースのポイントオブケア診断用バイオセンサー（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）、マルチプレックスＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）および免疫ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ）においてベンチマーク（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）技術である。金ナノ粒子は、効率的な蛍光漂白剤と知られているので、蛍光信号を増加させるために、ＰＩＭＮとＳＧ染料の濃度を最適化した。ラムダＤＮＡ（Ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ）は、ＰＩＭＮを用いたＰＰＴ－ｑｉＰＣＲで増幅し、増幅曲線とゲル電気泳動分析結果からＰＩＭＮとＳＧ染料濃度間の最適条件を決定した。その結果、固定されたＰＩＭＮ濃度（７．５ＯＤ）で蛍光信号は、ＳＧ染料濃度（ｘ１～ｘ７）に比例することを確認したが、染料濃度をｘ１０ ＳＧ染料に増加させる場合、増幅反応が抑制されることを確認した（図８）。したがって、ＳＧ染料濃度をｘ７に固定した。しかしながら、ＰＩＭＮ濃度が１５．０ＯＤであるとき、最も速い発熱速度を示したが、この濃度では、蛍光消光程度が７．５ＯＤより高かったため（図９、図１０ｃ）、その後には、ナノ粒子の濃度を７．５ＯＤに固定した。

【0060】

その後、ＰＩＭＮを用いた迅速かつ敏感なリアルタイムＰＰＴ－ｑｉＰＣＲは、最適化された条件（図１０ａ）でヒトＩＬ－６の様々な濃度で用いた。ＰＩＭＮに標識された抗ヒトＩＬ－６モノクロナール捕捉抗体およびビオチニル化された抗ヒトＩＬ－６モノクロナール検出抗体を用いてサンドイッチ型免疫分析法を通じてヒトＩＬ－６を検出した。ヒトＩＬ－６の連続希釈物を捕捉抗体および検出抗体とともに培養し、サンドイッチ構造を構築し、洗浄した後、ビオチニル化された検出抗体をあらかじめ接合されたストレプトアビジン－ＤＮＡ鋳型と組み立てて、後期ＰＣＲ反応（ｌａｔｅｒ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で信号プローブとして使用した。また、３回洗浄した後、プライマーと重合酵素を含むＰＣＲ反応混合物をＰＣＲチューブに添加し、ＩＲ－ＬＥＤ装置を用いて超高速リア
ルタイムＰＰＴ－ｑｉＰＣＲを行った。初期変性温度（９５℃で５秒）および変性（１秒、９５℃）とアニーリング／延長（８秒、７２℃）の間の二段階の３５回光熱循環を非接触ＩＲ温度計で制御した。その後、プローブＤＮＡの増幅を示す各サイクルの蛍光信号を青色ＬＥＤと分光光度計を用いてリアルタイムでモニタリングした。増幅反応は、温度プロファイルによって１０分未満に完了することを確認した（図１０ｂ）。加熱ブロックでＰＣＲチューブを介して反応溶液に熱を伝達する商業用熱循環器に比べて、ナノ粒子が均一に分散した本発明のシステムは、熱が反応混合物全体に直接均一に分布することができるので、格別に速い熱循環が可能であることを確認した。ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ対ＩＬ－６濃度のリアルタイム増幅信号をプロットするグラフは、一般的なｑＰＣＲ増幅曲線を示し、定量化周期（Ｃｑ：ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ）番号を決定するのに使用した（図１０ｃ）。Ｃｑ値は、５～１０００ｐｇ・ｍＬ^－１のＩＬ－６濃度と一貫した線形関係を示すことを確認し（図３Ｄ－＞１０ｄ）、リアルタイムＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの達成された感度および動的範囲は、商用ＥＬＩＳＡキットと比較し、下記表１に示した（表１）。

【0061】

【表1】

【0062】

上記のように、リアルタイム定量検出を確認した後、さらに高い感度を達成するために、ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲシステムに現場終点蛍光測定を適用した。簡単な磁気分離で溶液からＰＩＭＮを除去することができるので、蛍光消光を大きく減らすことができる。ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ反応後、ＰＩＭＮは、磁石で反応チューブの底で獲得し、５３０ｎｍでアムプリコンの現場終点蛍光信号を測定し、ＩＬ－６濃度に対してプロットした（図１０ｅ）。磁気分離を含む現場終点蛍光信号の測定は、１５秒内に完了することを確認した（図１０ｂおよび図１０ｅ）。また、前記結果から分かるように、蛍光消光の除去によって現場終点ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲは、検出範囲（０．０５～１０００ｐｇ・ｍＬ^－１）を広げ、感度を向上させた。また、定量化プロットも、正しい線形性を示すことを確認した。図１０ｆに示した磁気分離前後の蛍光イメージと図１１に示したナノ粒子濃度依存的蛍光信号を通じて蛍光消光の減少がナノ粒子の除去によるものであることを確認した。［ＦＬ］＝３２２０８＋４２６９ｌｏｇ［Ｃ］（Ｒ^２＝０．９８９）の相関式（ＦＬ：５３０ｎｍでのＳＧの蛍光信号、Ｃ：ＩＬ－６の濃度）から計算された分析ＬＯＤは、２１．３ｆｇ・ｍＬ^－１（３σ_{Ｂｌａｎｋ}）であることを確認した。また、前記表１に示されたように、商業用ＥＬＩＳＡ分析キットのＬＯＤと比較するとき、ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲは、約１００倍さらに低い感度を示すことを確認した。ＰＩＭＮを用いた免疫磁気過程は、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）を用いた商用ＥＬＩＳＡキットに比べて、抗原捕捉後、洗浄が可能で、分析溶液の柔軟なサンプリングと洗浄時間の短縮、非特異的結合および背景信号の減少を可能にすることを確認した。また、非特異的標的タンパク質に対するＰＰＴ－ｑｉＰＣＲの選択性を調査した結果、図１０ｇに示されたように、ブランクおよび非特異的標的と区別される蛍光信号がなく、優れた選択性を示すこと
を確認した。

【0063】

（３）比色（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）検出

【0064】

比色バイオセンサー（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）は、作動が容易であり、信号感知のための高価な複雑な装備を除去できるので、ＰＯＣ診断および資源が制限された国家に最も適合したプラットフォームの１つである。ＰＣＲの幾何級数的増幅力を維持しつつ、ＥＬＩＳＡで一般的に使用される発色基質を用いた比色検出にシステムを拡張した（図１２ａ）。ＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ方法が視覚的に識別可能な比色検出方法に適用可能であることを立証するために、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ
ｓｐｅｃｉｅｓ）を生成するＤＮＡ－ＳＧ複合体の光触媒特性を活用した。特に、ＴＭＢの酸化は、青色ＬＥＤの下方から放出されるとき、ＤＮＡ－ＳＧ複合体で生成された一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ）により誘導され得、生成された一重項酸素は、ＴＭＢの酸化を触媒して色相変化を起こし、一重項酸素の量は、増幅された標的ＤＮＡの量に直結している。

【0065】

まず、活性酸素種を生成するＤＮＡ－ＳＧのｐＨ、ＴＭＢ濃度および光照射時間による光触媒活性をＳＧ濃度を×７に固定して照射した。ＴＭＢ酸化を示す６５０ｎｍでの吸光度強度をモニタリングし、溶液のｐＨを調節するためにＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ後にＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）を添加した。その結果、ＤＮＡ－ＳＧを用いたＴＭＢ酸化の最適ｐＨは、５．０であることを確認し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と比較し（図１３Ａ）、標的ＤＮＡの有無による吸光度の変化は、３ｍＭ ＴＭＢ濃度で最も大きいことを確認した（図１３Ｂ）。光照射時間が１０分以上の場合には、吸光度が大きく増加しなかったため（図１４）、１０分の露出時間でｐＨおよびＴＭＢ濃度をそれぞれ５．０および３ｍＭにしてさらなる実験を行った。免疫磁気分析およびＩＬ－６の連続希釈を用いたＰＰＴ－ｑｉＰＣＲ後、ＭＥＳバッファーのＴＭＢ溶液をＰＣＲチューブに添加し、比色検出を確認した。その後、１０分間青色ＬＥＤを照射した後、ＤＮＡ－ＳＧは、ＴＭＢ酸化を誘導し、ＰＭＮを１５秒間磁気分離して、色相の変化を確認した。ＤＮＡ－ＳＧの光触媒活性程度は、増幅されたアムプリコンの量と直接的な関連があるので、増幅されたＰＣＲ産物の量による色相の変化および彩度を用いて標的を定量することができることを確認した。図１２ｂに示されたように、無色から青色への転換は、対象の存在または不在に対する信頼できる指標の役割をするのに対し、青色の強度は、対象集中の証拠の役割をした。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を用いて色相読み取り値をより正確に定量化した（図１２ｃ）。６５０ｎｍでの吸光度とＩＬ－６濃度の間の関係をプロットし、曲線は、［Ａｂｓ］＝１．４６＋０．６７ｌｏｇ［Ｃ］（Ｒ^２＝０．９９）方程式と強い線形相関関係を示すことを確認した（Ａｂｓ：ＴＭＢの吸光度酸化、Ｃ：ＩＬ－６の濃度）。比色方法は、蛍光終点分析と同様に、０．０５ｐｇ・ｍＬ^－１から１ｎｇ・ｍＬ^－１までの広い検出範囲と３９．５ｆｇ・ｍＬ^－１のＬＯＤを立証した。したがって、０．０５ｐｇ・ｍＬ^－１程度の低い標的も、目視で検出することができることを確認した。増幅されたＰＰＴ－ｑｉＰＣＲは、アガロースゲル電気泳動（図１０ｆ）によりさらに特性化され、ＩＬ－６濃度が増加するにつれてバンド強度の明確な変化を確認した。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【図10d】

【図10e】

【図10f】

【図10g】

【図11】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【図13】

【図14】

【配列表】

2024163007000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-05-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0001】

本発明は、プラズモン免疫磁気ナノ粒子を用いた標的核酸の検出方法に関する。
本発明は、韓国科学技術情報通信部（課題番号：ＮＲＦ－２０２２Ｒ１Ｆ１Ａ１０７０１６２（１７１１１７１６３１、１７１１１８６７８５）及び課題番号：２０２３－ＤＤ－ＵＰ－０００７）及び韓国教育部（課題番号：ＮＲＦ－２０２１Ｒ１Ａ６Ａ１Ａ０３０３９５０３（１３４５３６２９１１））により支援を受けて完成された。