特開 2024-163432 Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024163432

(43)【公開日】2024-11-22

(54)【発明の名称】Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20241115BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20241115BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6888 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023079021

(22)【出願日】2023-05-12

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業、「新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する症候・病態に対する研究」、「新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）罹患後症状の定性・定量的診断手法の開発」、委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】510192802

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立国際医療研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】杉山 真也

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QR08

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS28

4B063QS34

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する技術を提供する。
【解決手段】Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法であって、Ｂ型肝炎患者がホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、Ｂ型肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有するか、Ｂ型肝炎患者がヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、Ｂ型肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有することが、前記Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高いことを示す、方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法であって、
以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかであることが、前記Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高いことを示す、方法。
（ｉ）前記Ｂ型慢性肝炎患者がホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有する
（ｉｉ）前記Ｂ型慢性肝炎患者がヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有する

【請求項2】

ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を検出するための試薬、及び、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質のＫ１３０Ｍ若しくはＨ９４Ｙのアミノ酸変異を検出するための試薬を含む、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

世界人口の１／３にあたる人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染しているといわれている。Ｂ型肝炎は、一過性に終息する一過性感染と慢性肝炎に大別される。急性肝炎は感染後１～６か月後の潜伏期間を経て症状が出現し、数週間で回復過程に入る。しかし急性肝炎を発症した患者のうち１～２％の人は劇症肝炎を発症する危険性があり、劇症肝炎を発症した人の７０～８０％は死亡する。

【0003】

一方、感染したＨＢＶが体内から排除されず６か月以上にわたって肝臓の中に住み着くことでキャリアとなる。母子感染した場合又は小児期に感染した場合は、その大半が慢性肝炎となり、年率で約０．３％が肝硬変、肝癌を発症する。成人が感染した場合、キャリアの約９割は、無症候期、一過性の肝炎期、肝炎沈静期を経て、その後は無症候キャリアのまま経過する。しかし、成人感染者の約１割は慢性肝炎に移行し、さらに、その約１％が肝硬変や肝癌へと移行する。Ｂ型慢性肝炎ウイルス患者は東南アジアや東太平洋地域に多く分布し、日本にはおよそ１５０万人のＢ型肝炎感染者がいるといわれている。

【0004】

このように、ＨＢＶ感染後の経過は多岐にわたる。近年、宿主側の遺伝要因の探索が進み、日本人を含むアジア人サンプルを用いたゲノムワイド関連解析（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ：ＧＷＡＳ）により、Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）に関連する新たな遺伝要因が報告されている。

【0005】

例えば、特許文献１には、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０９：０１であり、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０４：０２、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１であり、Ｂ型肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１であることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１５／０３０１４２号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、Ｂ型肝炎の病態進展に感受性のあるアリルとされるＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１を有するＢ型慢性肝炎患者の中にも、Ｂ型肝癌（ＨＣＣ）を発症する患者と発症しない患者が存在する。そして、Ｂ型肝癌発症群と健常対照群についての９５％信頼区間におけるオッズ比は１．５程度であり、実用的な精度でＢ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価できるとはいえない。

【0008】

また、Ｂ型肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルとされるＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１を有するＢ型慢性肝炎患者の中にも、Ｂ型肝癌を発症する患者と発症しない患者が存在する。そして、Ｂ型肝癌発症群と健常対照群についての９５％信頼区間におけるオッズ比は０．５程度であり、実用的な精度でＢ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価できるとはいえない。

【0009】

このため、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価することのできる、より実用性の高い方法が求められている。そこで、本発明は、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法であって、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかであることが、前記Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高いことを示す、方法。
（ｉ）前記Ｂ型慢性肝炎患者がホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有する
（ｉｉ）前記Ｂ型慢性肝炎患者がヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有する
［２］ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を検出するための試薬、及び、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質のＫ１３０Ｍ若しくはＨ９４Ｙのアミノ酸変異を検出するための試薬を含む、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価するためのキット。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する技術を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

［Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法］
一実施形態において、本発明は、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法であって、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかであることが、前記Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高いことを示す、方法を提供する。
（ｉ）前記Ｂ型慢性肝炎患者がホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有する。
（ｉｉ）前記Ｂ型慢性肝炎患者がヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有する。

【0013】

Ｂ型慢性肝炎とは、ＨＢＶが持続感染している状態をいい、発症要因としては、ＨＢＶ持続感染者からの母児感染（垂直感染）、乳幼児期の医療行為等が原因でＨＢＶ持続感染者の血液や体液が体内に侵入した場合、体の免疫力が低下するような免疫抑制剤や抗癌剤の使用中にＨＢＶに感染した結果ＨＢＶを体内から排除できずに持続感染を起こす場合、健常者がジェノタイプＡ型という欧米型やアジア・アフリカ型等の外来種ＨＢＶに感染した場合等が挙げられる。

【0014】

成人期に感染した場合、ＨＢＶ感染者の約９割が無症候キャリアとなるが、約１割はＢ型慢性肝炎に移行する。更にその中の一部が肝硬変や肝癌へ移行する。「肝硬変」とは、ＨＢＶ感染により損傷した肝臓が修復されるときにできる線維が肝臓に拡がった状態をいい、肝臓が硬くなったために腹水や食道静脈瘤が生じたり、肝臓機能が低下するために肝性脳症や黄疸が生じたりする原因となる。Ｂ型肝癌とは、ＨＢＶの感染が原因で生じる肝細胞癌をいう。

【0015】

本実施形態の方法では、Ｂ型慢性肝炎患者のＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルの遺伝子型、及び、慢性Ｂ型肝炎患者に感染しているＨＢＶの変異に基づいて、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する。

【0016】

ＨＬＡはヒトの主要組織適合性複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）であり、移植片や細菌、ウイルス等の外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質である。ＨＬＡには多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報についてはＨＬＡ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html）等に記載がある。なお、本明細書のアリルの表記は、ＨＬＡ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる表記方法に基づく。

【0017】

ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１のｃＤＮＡの塩基配列の欧州分子生物学研究所データベース（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）のアクセッション番号は、ＡＹ６５６６７９等である。また、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１のアミノ酸配列のＥＭＢＬ－ＥＢＩアクセッション番号は、ＡＡＶ７１０２６等である。

【0018】

ＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルの遺伝子型の決定方法は特に限定されず、当業者にとって公知の方法から適宜選択して使用することができる。例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ法（ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法）、ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＡＳＯ）法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、直接シークエンス法、ＲＦＬＰ法、インベーダー法、ＴＧＧＥ法、ＤＧＧＥ法、ＭｕｔＹ酵素法、マイクロアレイ、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＰＴＴ）法、Ｓｎｉｐｐｅｒ法、ルミネックス法、ＨＬＡ Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ法、マイクロＳＳＰ法等が挙げられる。中でも、ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法、直接シークエンス法、ルミネックス法、ＨＬＡ Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ法、マイクロＳＳＰ法が好ましい。

【0019】

直接シーケンス法は、従来型の直接シーケンス法であってもよく、次世代シーケンサーを使用した直接シーケンス法であってもよい。ＨＬＡ Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ法とは、個人のＨＬＡ遺伝子型をコンピュータにより高い精度で推定する遺伝統計解析の手法である。マイクロＳＳＰ法とは、複数のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ゲル電気泳動により特徴的な多型部分が増幅されたか否かを確認し、当該増幅のパターンに基づいてアリルを判定する手法である。

【0020】

アリルの遺伝子型の決定（タイピング）は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。Ｂ型肝癌を発症するリスクを評価する対象のＢ型慢性肝炎患者から採取した生物学的試料をもとに、一般的な方法でゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、ＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルの塩基配列を解析することにより、ＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルの遺伝子型を決定することができる。

【0021】

本実施形態の方法が対象とするＢ型慢性肝炎患者は日本人であってもよい。また、生物学的試料としては、例えば、末梢血単核球細胞、組織、毛髪、便、尿、唾液、細胞、鼻腔粘膜からこすりとった細胞、口腔粘膜からこすりとった細胞等を用いることができるが、これらに限定されない。

【0022】

慢性Ｂ型肝炎患者に感染しているＨＢＶの変異は、患者由来のＨＢＶの塩基配列又はそれに基づくアミノ酸配列を解析し、基準となる配列と比較することにより検出することができる。ＨＢＶの変異はＤＮＡレベルで検出してもよいし、アミノ酸配列レベルで検出してもよい。患者由来のＨＢＶは、例えば、患者由来の血液試料から採取することができる。本実施形態の方法が対象とするＨＢＶの遺伝子型は、ＨＢＶ／Ｃであってもよい。

【0023】

本実施形態においては、ＨＢＶのＨＢｘ遺伝子の塩基配列をシーケンスし、ＨＢｘ抗原タンパク質のＫ１３０Ｍのアミノ酸変異、ＨＢｘ抗原タンパク質のＨ９４Ｙのアミノ酸変異を検出してもよい。あるいは、これらのアミノ酸変異に対応する遺伝子変異を検出することができるプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ、インベーダー法等により、各変異を検出してもよい。あるいは、各アミノ酸変異を検出することができるモノクローナル抗体を使用して、タンパク質レベルで各アミノ酸変異を検出してもよい。

【0024】

ＨＢｘ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＬＣ５３５９２４（ｇｅｎｅ＝”Ｘ”）等である。また、ＨＢｘ抗原タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＢＣＤ４１１１１等である。

【0025】

実施例において後述するように、発明者らは、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかである場合に、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高いことを明らかにした。
（ｉ）慢性Ｂ型肝炎患者がホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、慢性Ｂ型肝炎患者に感染しているＨＢＶのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有する。
（ｉｉ）慢性Ｂ型肝炎患者がヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、慢性Ｂ型肝炎患者に感染しているＨＢＶのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有する。

【0026】

本明細書において、Ｂ型肝癌を発症するリスクが高いとは、Ｂ型肝癌患者群と慢性Ｂ型肝炎患者群についての９５％信頼区間におけるオッズ比が、２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上であることを意味する。

【0027】

ここでオッズ比とは、上記（ｉ）の場合には、ホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、感染しているＨＢＶのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有する患者についての、Ｂ型肝癌発症群（Ｂ型肝癌患者）のオッズと、Ｂ型肝癌非発症群（Ｂ型慢性肝炎患者）のオッズとの比である。

【0028】

また、上記（ｉｉ）の場合には、ヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、感染しているＨＢＶのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有する患者についての、Ｂ型肝癌発症群のオッズと、Ｂ型肝癌非発症群のオッズとの比である。

【0029】

本実施形態の方法によれば、従来よりも実用的な精度でＢ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価することができる。

【0030】

［Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価するためのキット］
一実施形態において、本発明は、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を検出するための試薬、及び、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質のＫ１３０Ｍ若しくはＨ９４Ｙのアミノ酸変異を検出するための試薬を含む、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価するためのキットを提供する。

【0031】

本実施形態のキットにより、上述した、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する方法を好適に実施することができる。

【0032】

ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を検出するための試薬としては、このアリルを検出できるものであれば特に限定されず、例えば、このアリルに特異的なプライマーセット、プローブ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液等が挙げられる。また、プライマー又はプローブは、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン等により標識されていてもよい。

【0033】

また、ＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判定する観点から、本実施形態のキットは、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１アリル以外の遺伝子型のＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルを決定するためのプライマーセットやプローブを更に含んでいてもよい。

【0034】

Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質のＫ１３０Ｍ若しくはＨ９４Ｙのアミノ酸変異を検出するための試薬は、ＨＢｘ遺伝子のうち、少なくとも上記変異部分をコードする遺伝子領域を含む領域の塩基配列を決定するための試薬であってもよい。

【0035】

例えば、ＨＢｘ抗原タンパク質の第１３０番目又は第９４番目のアミノ酸をコードする遺伝子領域を増幅するためのプライマーセット、塩基配列を決定するための試薬等が挙げられる。

【0036】

あるいは、ＨＢｘ抗原タンパク質のＫ１３０Ｍ若しくはＨ９４Ｙのアミノ酸変異に対応するＨＢｘ遺伝子上の変異を検出可能なプライマーセット又はプローブ等であってもよい。

【0037】

あるいは、ＨＢｘ抗原タンパク質上の各アミノ酸変異をタンパク質レベルで検出することができるモノクローナル抗体等であってもよい。

【0038】

［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、Ｂ型肝癌を治療する方法であって、（ｉ）Ｂ型慢性肝炎患者がホモ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＫ１３０Ｍのアミノ酸変異を有するか、（ｉｉ）Ｂ型慢性肝炎患者がヘテロ接合型でＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を有し、且つ、前記Ｂ型慢性肝炎患者に感染しているＢ型肝炎ウイルスのＨＢｘ抗原タンパク質がＨ９４Ｙのアミノ酸変異を有することが、前記Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高いことを示し、前記Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクが高い場合に、前記Ｂ型慢性肝炎患者のＢ型肝癌の発症についての検査頻度を上昇させ、Ｂ型肝癌の発症を早期発見する工程と、発見した早期Ｂ型肝癌を、内科的処置、外科的処置又は抗癌剤治療により治療する工程と、を含む方法を提供する。また、リスクが低い場合は、検査頻度を低下させることで医療経済上のメリットだけでなく、患者の受診に関わる負担の軽減につながる。

【0039】

本実施形態において、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルスの変異等については、上述したものと同様である。

【0040】

現在のところ、肝癌のハイリスク者を予測することはできない。小児期の感染パターンであれば、その慢性肝炎患者の約０．３％、成人期の感染であれば、その慢性肝炎患者の約１％が年間に肝癌となるとされる。肝癌となる患者規模は、感染者全体では少ないものであるが、現在のところ、肝癌のハイリスク者を予測することはできないため、全員を一定の間隔で外来にて経過観察や定期的な肝臓の状態を確認する非侵襲的な検査（超音波、ＭＲＩ等の画像検査）を行っている。

【0041】

本実施形態の方法において、検査頻度を上昇させるとは、例えば、通常のＢ型肝癌の発症についての検査頻度が約２～３年に１回であるところ、約半年に１回以上の頻度で検査を行うことであってもよい。一方、検査頻度を低下させるとは、検査頻度を約５年に１回等に減らすことであってよい。

【0042】

検査頻度を上昇させる対象を、Ｂ型肝癌を発症するリスクが高い患者に限定することは医療経済上好ましい。また、Ｂ型肝癌を発症するリスクが低いことが示されたＢ型慢性肝炎患者にとっては、Ｂ型肝癌の発症に関する精神的不安やストレスを緩和することができる。

【0043】

本実施形態の方法により、Ｂ型肝癌の発症を早期に発見することが可能になり、より低侵襲なＢ型肝癌の治療方法を選択することが可能となる。上記の内科的処置としては、例えば、ラジオ波焼灼療法等の比較的低侵襲な治療が挙げられる。

【実施例0044】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0045】

［実験例１］
（ＨＬＡアリルの検出）
日本人のＢ型肝癌患者及び健常者（Ｂ型肝炎の感染なし）由来の末梢血単核球細胞からゲノムＤＮＡを調製し、ＨＬＡ－ＤＰＢ１アリルの遺伝子型を決定した。

【0046】

ゲノムＤＮＡの調製には、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン）を使用した。まず、マイクロチューブにＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ２０μＬ及び各試料２００μＬを添加した。さらにＢｕｆｆｅｒ ＡＬを加えて１５秒間混和した後、５６℃で１０分間インキュベートして試料を溶解した。その後、マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。続いて、試料にエタノール（１００％）２００μＬを添加し、１５秒間ボルテックスした後、１．５ｍＬマイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。当該溶液をＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎにアプライし、６，０００×ｇで１分間遠心分離した。続いて、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを開き、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１を添加して６，０００×ｇで１分間遠心分離した。続いて、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを開き、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２を添加して、２０，０００×ｇで３分間遠心分離した。続いて、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを開き、２００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＥ又は精製水を添加した。室温で１分間インキュベートした後、６，０００×ｇで１分間遠心分離して、各検体由来のゲノムＤＮＡを回収した。

【0047】

調製したゲノムＤＮＡ試料を用いてＰＣＲ－ＳＳＯＰ法を利用したＬＡＢＴｙｐｅ ＳＳＯ ＤＰＡ１／ＤＰＢ１ ｋｉｔ（ワンラムダ）、又は、ＷＡＫＦｌｏｗ（登録商標）ＨＬＡ－ＤＰＢ１ ｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（湧永製薬）を用いて、４桁のＨＬＡタイピングを実施した。実験は説明書にしたがって行い、ｘＭＡＰ（登録商標）テクノロジーを利用したマルチプレックス測定システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を使用して測定した。具体的には、上記ゲノムＤＮＡ試料２μＬに増幅試薬２４．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ液０．５μＬを加えて以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
変性温度：９３℃（３０秒）
アニーリング温度：６０℃（３０秒）
伸長温度：７２℃（３０秒）
サイクル数：４０回
上記サイクル前に９３℃（３分）、上記サイクル後に７２℃（５分）の反応を行い、終了後は４℃で保存した。

【0048】

ＰＣＲ終了後の増幅ＤＮＡ５μＬを、変性液５μＬを分注した９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに加えてボルテックスし、室温で５分間放置した。ハイブリダイゼーション溶液２０μＬ、ビーズミックス３μＬ及びＳＡＰＥ２μＬを混合したハイブリミックス試薬２５μＬに上記の変性増幅ＤＮＡを加えてハイブリミックス溶液を調製し、ボルテックスで撹拌した。５５℃に設定したサーマルサイクラーに上記ハイブリミックス溶液をセットして、３０分間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄液７５μＬを各ウェルに加え、１，０００×ｇで１分間遠心分離を行った。その後、上清を除去して、洗浄液７５μＬを各ウェルに加えた。Ｌｕｍｉｎｅｘ ＸＹＰのブロック温度を３７℃に設定して、ビーズミックスのＬｏｔ番号に対応したテンプレートファイルを用いて測定した。測定結果のＣＳＶファイルをＷＡＫＦｌｏｗ（登録商標）Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅで開き、各蛍光ビーズの陽性・陰性を判定表に記載しているカットオフ値をもとに自動判定した。自動判定では、蛍光強度がカットオフ値以上を示すビーズを陽性、カットオフ値以下を示すビーズを陰性とし、各ビーズの陽性・陰性のパターンからＨＬＡの遺伝子型を決定した。結果を表１に示す。

【0049】

【表1】

【0050】

その結果、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０９：０１アリルは、Ｂ型肝癌の発症に感受性があることが示された。また、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０４：０２アリルは、Ｂ型肝癌の発症に抵抗性があることが示された。

【0051】

しかしながら、Ｂ型肝癌の発症に感受性であるアリルを有する患者の中にも、Ｂ型肝癌を発症する患者と発症しない患者が存在し、Ｂ型肝癌を発症するリスクを評価するには実用的とはいえない。また、Ｂ型肝癌の発症に抵抗性であるアリルを有する患者の中にも、Ｂ型肝癌を発症する患者と発症しない患者が存在し、Ｂ型肝癌を発症するリスクを評価するには実用的とはいえない。

【0052】

［実験例２］
（Ｂ型肝炎ウイルス集団の変異の頻度の検出１）
ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１アリルをホモ接合型で有するＢ型肝癌患者及びＢ型慢性肝炎患者の血液試料に含まれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の遺伝子配列を解析し、比較した。

【0053】

年齢及び感染しているＨＢＶの遺伝子型が一致する患者を解析対象とした。ＨＢＶ／Ｃは、日本人やアジア人が多く感染しているＢ型肝炎ウイルスの型である。この際、肝癌の発症に関連が認められるとされる、年齢、性別、ＨＢＶ遺伝子型は、ケース（肝癌あり）、コントロール（肝癌なし）間で差がないように調整した。具体的には、Ｂ型肝癌患者が平均６３歳であり（９９例）、Ｂ型慢性肝炎患者が平均６１歳であり（１０１例）、全て男性であった。また、感染しているＨＢＶの遺伝子型は、いずれもＨＢＶ／Ｃであった。

【0054】

抗原性が高い、ＨＢｓ抗原をコードするＨＢｓ遺伝子領域、ＨＢｘ抗原をコードするＨＢｘ遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅した。続いて、高速シーケンサーにより、増幅したＰＣＲ産物のディープシークエンス解析を行った。高速シーケンサーとしては、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ（ロシュ）又はＭｉｓｅｑ（イルミナ）を使用した。

【0055】

取得した塩基配列に基づいて、ＨＢＶの変異のバリエーションをリスト化し、アミノ酸の変異のパターンを取得した。ＨＢＶ／Ｃの一般的なアミノ酸配列を基準とした。その結果、ＨＢｘ抗原の第１３０番目のアミノ酸配列におけるＫ１３０Ｍのアミノ酸変異が、Ｂ型肝癌の発症と関連性が高いことが明らかとなった。

【0056】

下記表２に、Ｂ型肝癌患者及びＢ型慢性肝炎患者に感染していたＨＢＶのＨＢｘ抗原の第１３０番目のアミノ酸配列及びその存在割合を示す。

【0057】

【表2】

【0058】

下記表３に、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１アリルをホモ接合型で有する患者に感染していたＨＢＶが、ＨＢｘ抗原のＫ１３０Ｍアミノ酸変異を有する場合の、当該患者のＢ型肝癌の発症のしやすさについての統計学的な指標を算出した結果を示す。

【0059】

【表3】

【0060】

その結果、高いオッズ比が示され、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する指標として、実用的であることが示された。

【0061】

［実験例３］
（Ｂ型肝炎ウイルス集団の変異の頻度の検出２）
ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１アリルをヘテロ接合型で有するＢ型肝癌患者及びＢ型慢性肝炎患者の血液試料に含まれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の遺伝子配列を解析し、比較した。

【0062】

年齢及び感染しているＨＢＶの遺伝子型が一致する患者を解析対象とした。この際、肝癌の発症に関連が認められるとされる、年齢、性別、ＨＢＶ遺伝子型は、ケース（肝癌あり）、コントロール（肝癌なし）間で差がないように調整した。具体的には、Ｂ型肝癌患者が平均６２歳であり（２６例）、Ｂ型慢性肝炎患者が平均６３歳であり（５２例）、全て男性であった。また、感染しているＨＢＶの遺伝子型は、いずれもＨＢＶ／Ｃであった。

【0063】

抗原性が高い、ＨＢｓ抗原をコードするＨＢｓ遺伝子領域、ＨＢｘ抗原をコードするＨＢｘ遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅した。続いて、高速シーケンサーにより、増幅したＰＣＲ産物のディープシークエンス解析を行った。高速シーケンサーとしては、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ（ロシュ）又はＭｉｓｅｑ（イルミナ）を使用した。

【0064】

取得した塩基配列に基づいて、ＨＢＶの変異のバリエーションをリスト化し、アミノ酸の変異のパターンを取得した。ＨＢＶ／Ｃの一般的なアミノ酸配列を基準とした。その結果、ＨＢｘ抗原の第９４番目のアミノ酸配列におけるＨ９４Ｙのアミノ酸変異が、Ｂ型肝癌の発症と関連性が高いことが明らかとなった。

【0065】

下記表４に、Ｂ型肝癌患者及びＢ型慢性肝炎患者に感染していたＨＢＶのＨＢｘ抗原の第９４番目のアミノ酸配列及びその存在割合を示す。

【0066】

【表4】

【0067】

下記表５に、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１アリルをヘテロ接合型で有する患者に感染していたＨＢＶが、ＨＢｘ抗原のＨ９４Ｙアミノ酸変異を有する場合の、当該患者のＢ型肝癌の発症のしやすさについての統計学的な指標を算出した結果を示す。

【0068】

【表5】

【0069】

その結果、高いオッズ比が示され、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する指標として、実用的であることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0070】

本発明によれば、Ｂ型慢性肝炎患者がＢ型肝癌を発症するリスクを評価する技術を提供することができる。