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特開2024-163554同種抗体検出方法、検査方法、検出試薬、検出試薬の製造方法、同種抗体検出キット、及び白血病用医薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024163554
(43)【公開日】2024-11-22
(54)【発明の名称】同種抗体検出方法、検査方法、検出試薬、検出試薬の製造方法、同種抗体検出キット、及び白血病用医薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241115BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20241115BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241115BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N ZNA
C07K14/47
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023079282
(22)【出願日】2023-05-12
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505246789
【氏名又は名称】学校法人自治医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100097113
【弁理士】
【氏名又は名称】堀 城之
(74)【代理人】
【識別番号】100162363
【弁理士】
【氏名又は名称】前島 幸彦
(74)【代理人】
【識別番号】100194283
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 大勇
(72)【発明者】
【氏名】森田 薫
(72)【発明者】
【氏名】神田 善伸
(72)【発明者】
【氏名】海野 健斗
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA86
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植を行った患者の
移植を提供する。
【解決手段】
同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を含む試料と、検出試薬とを加え、複合体に結合する試料中の同種抗体を検出する。同種抗原タンパク質は、ＤＢＹタンパク質であってもよい。また、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、及びＨＬＡ－ＤＲ１６からなる群から選択された少なくとも一つであってもよい。
【選択図】図１
移植を提供する。
【解決手段】
同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を含む試料と、検出試薬とを加え、複合体に結合する試料中の同種抗体を検出する。同種抗原タンパク質は、ＤＢＹタンパク質であってもよい。また、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、及びＨＬＡ－ＤＲ１６からなる群から選択された少なくとも一つであってもよい。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を含む試料と、検出試薬とを接触させ、
前記複合体に結合する前記試料中の同種抗体を検出する
ことを特徴とする同種抗体検出方法。
前記複合体に結合する前記試料中の同種抗体を検出する
ことを特徴とする同種抗体検出方法。
【請求項2】
前記同種抗原タンパク質は、ＤＢＹタンパク質である
ことを特徴とする請求項１に記載の同種抗体検出方法。
ことを特徴とする請求項１に記載の同種抗体検出方法。
【請求項3】
前記ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、及びＨＬＡ－ＤＲ１６からなる群から選択された少なくとも一つである
ことを特徴とする請求項２に記載の同種抗体検出方法。
ことを特徴とする請求項２に記載の同種抗体検出方法。
【請求項4】
前記試料は、被験者から単離された血漿又は血清である
ことを特徴とする請求項１に記載の同種抗体検出方法。
ことを特徴とする請求項１に記載の同種抗体検出方法。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法によって、前記試料中の同種抗体を検出する検出工程と、
前記検出工程における同種抗体の検出結果から、慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査する検査工程とを含み、
慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査する
ことを特徴とする検査方法。
前記検出工程における同種抗体の検出結果から、慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査する検査工程とを含み、
慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査する
ことを特徴とする検査方法。
【請求項6】
前記検出工程が、前記同種抗体の抗体価を測定する測定工程である
ことを特徴とする請求項５記載の検査方法。
ことを特徴とする請求項５記載の検査方法。
【請求項7】
前記測定工程において、前記同種抗体の抗体価を測定する方法がフローサイトメトリーである
ことを特徴とする請求項６に記載の検査方法。
ことを特徴とする請求項６に記載の検査方法。
【請求項8】
前記検査工程において、前記測定工程で測定した前記同種抗体の抗体価の測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも高い場合に、前記被験者は慢性移植片対宿主病の発症可能性があるとし、
前記基準値が、男性ドナーから男性レシピエント、又は女性ドナーから女性レシピエント、又は男性ドナーから女性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者を被験者とした前記測定値である
ことを特徴とする請求項６に記載の検査方法。
前記基準値が、男性ドナーから男性レシピエント、又は女性ドナーから女性レシピエント、又は男性ドナーから女性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者を被験者とした前記測定値である
ことを特徴とする請求項６に記載の検査方法。
【請求項9】
前記被験者が、女性ドナーから男性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者である
ことを特徴とする請求項８に記載の検査方法。
ことを特徴とする請求項８に記載の検査方法。
【請求項10】
女性ドナーから男性レシピエントへの移植において、
前記ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする請求項９に記載の検査方法。
前記ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする請求項９に記載の検査方法。
【請求項11】
男性ドナーから女性レシピエントへの移植において、
前記ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする請求項８に記載の検査方法。
前記ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする請求項８に記載の検査方法。
【請求項12】
女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする検査方法。
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする検査方法。
【請求項13】
男性ドナーから女性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする検査方法。
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断する
ことを特徴とする検査方法。
【請求項14】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の同種抗体検出方法において前記同種抗体を検出する際に添加される
ことを特徴とする検出試薬。
ことを特徴とする検出試薬。
【請求項15】
請求項１０に記載の検出試薬を製造する
ことを特徴とする検出試薬の製造方法。
ことを特徴とする検出試薬の製造方法。
【請求項16】
請求項１０に記載の検出試薬を含む
ことを特徴とする同種抗体検出キット。
ことを特徴とする同種抗体検出キット。
【請求項17】
同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を標的とする
ことを特徴とする白血病用医薬。
ことを特徴とする白血病用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に移植片対宿主病の同種抗体検出方法、検査方法、検出試薬、検出試薬の製造方法、同種抗体検出キット、及び白血病用医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
血液、造血器疾患において、造血細胞移植（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、以下「ＨＣＴ」ともいう。）、特に同種造血幹細胞移植は最も強力な治療法である。しかしながら、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ。以下、「ＧＶＨＤ」という。）という重篤な合併症を起こすリスクがある。移植片対宿主病はドナー由来の免疫細胞がレシピエントを異物と見なすことによって生じる病態で、移植後１００日（約３ヶ月）以降を境にして急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ ＧＶＨＤ。以下、「ｃＧＶＨＤ」という。）に大別される。慢性移植片対宿主病は３０～７０％に発症するが、移植方法の多様化に伴い、発症率の増加が懸念されている。
【0003】
ここで、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ － ＤＲ ｉｓｏｔｙｐｅ（以下、「ＨＬＡ－ＤＲ」という。）は、ヒト主要組織適合抗原複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ。 以下、「ＭＨＣ」という。）のＣｌａｓｓ ＩＩに分類される抗原である。ＨＬＡ－ＤＲは、α、βの２つからなる糖タンパクの二量体で、長さが９～３０アミノ酸程度のペプチドと複合体を形成する。ＨＬＡ－ＤＲは、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ。以下、「ＴＣＲ」という。）のリガンドを構成し、臓器移植の適合性に関連する重要な抗原となる。
また、ＨＬＡ－ＤＲは、ヒトゲノム上では、６番染色体領域６ｐ２１．３１上に存在し、その型には高度の多型性が知られている。
また、ＨＬＡ－ＤＲは、ヒトゲノム上では、６番染色体領域６ｐ２１．３１上に存在し、その型には高度の多型性が知られている。
【0004】
従来技術として、特許文献１を参照すると、同種造血幹細胞移植において、ドナーとレシピエントとのＨＬＡが一部ミスマッチの場合においても移植後の予後を予測する方法が記載されている。
特許文献１に記載の方法では、同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントが悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群、ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ。以下、「ＭＤＳ」という。）を除く患者の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する。
特許文献１に記載の方法では、同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントが悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群、ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ。以下、「ＭＤＳ」という。）を除く患者の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する。
【0005】
一方、ｃＧＶＨＤにおける顕著なリスク因子は女性ドナーから男性レシピエントへの移植であり、それに関連してＹ染色体由来の抗原に対する同種抗体の出現が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１８／０７９４９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、従来技術では、ｃＧＶＨＤ患者の生体内での病態形成に関する実際の同種抗体の検出方法は確立されていなかった。
【0008】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の同種抗体検出方法は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子が結合した複合体を含む試料と、検出試薬とを接触させ、前記複合体に結合する前記試料中の同種抗体を検出することを特徴とする。
本発明の同種抗体検出方法は、前記同種抗原タンパク質は、ＤＢＹタンパク質であることを特徴とする。
本発明の同種抗体検出方法は、前記ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、及びＨＬＡ－ＤＲ１６からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
本発明の同種抗体検出方法は、前記試料は、被験者から単離された血漿又は血清であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記いずれか一項に記載の検出方法によって、前記試料中の同種抗体を検出する検出工程と、前記検出工程における同種抗体の検出結果から、慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査する検査工程とを含み、慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査することを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記検出工程が、前記同種抗体の抗体価を測定する測定工程であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記測定工程において、前記同種抗体の抗体価を測定する方法がフローサイトメトリーであることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記検査工程において、前記測定工程で測定した前記同種抗体の抗体価の測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも高い場合に、前記被験者は慢性移植片対宿主病の発症可能性があるとし、前記基準値が、男性ドナーから男性レシピエント、又は女性ドナーから女性レシピエント、又は男性ドナーから女性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者を被験者とした前記測定値であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記被験者が、女性ドナーから男性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、女性ドナーから男性レシピエントへの移植において、前記ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検査方法は、男性ドナーから女性レシピエントへの移植において、前記ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検査方法は、女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検査方法は、男性ドナーから女性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検出試薬の製造方法は、前記同種抗体検出方法において前記同種抗体を検出する際に添加されることを特徴とする。
本発明の検出試薬の製造方法は、前記検出試薬を製造することを特徴とする。
本発明の同種抗体検出キットは、前記検出試薬を含むことを特徴とする。
本発明の白血病用医薬は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子が結合した複合体を標的とすることを特徴とする。
本発明の同種抗体検出方法は、前記同種抗原タンパク質は、ＤＢＹタンパク質であることを特徴とする。
本発明の同種抗体検出方法は、前記ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、及びＨＬＡ－ＤＲ１６からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
本発明の同種抗体検出方法は、前記試料は、被験者から単離された血漿又は血清であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記いずれか一項に記載の検出方法によって、前記試料中の同種抗体を検出する検出工程と、前記検出工程における同種抗体の検出結果から、慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査する検査工程とを含み、慢性移植片対宿主病の発症可能性を検査することを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記検出工程が、前記同種抗体の抗体価を測定する測定工程であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記測定工程において、前記同種抗体の抗体価を測定する方法がフローサイトメトリーであることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記検査工程において、前記測定工程で測定した前記同種抗体の抗体価の測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも高い場合に、前記被験者は慢性移植片対宿主病の発症可能性があるとし、前記基準値が、男性ドナーから男性レシピエント、又は女性ドナーから女性レシピエント、又は男性ドナーから女性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者を被験者とした前記測定値であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、前記被験者が、女性ドナーから男性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者であることを特徴とする。
本発明の検査方法は、女性ドナーから男性レシピエントへの移植において、前記ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検査方法は、男性ドナーから女性レシピエントへの移植において、前記ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検査方法は、女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検査方法は、男性ドナーから女性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があると慢性移植片対宿主病が発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があると慢性移植片対宿主病が発症しにくくなると判断することを特徴とする。
本発明の検出試薬の製造方法は、前記同種抗体検出方法において前記同種抗体を検出する際に添加されることを特徴とする。
本発明の検出試薬の製造方法は、前記検出試薬を製造することを特徴とする。
本発明の同種抗体検出キットは、前記検出試薬を含むことを特徴とする。
本発明の白血病用医薬は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡｃｌａｓｓＩＩ分子が結合した複合体を標的とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、同種抗原タンパク質とＨＬＡクラスＩＩ分子とが結合してできる複合体を含む検出試薬と、試料とを接触させて同種抗体を検出することで、女性ドナーから男性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者のｃＧＶＨＤ発症を、その発症前に予測することができる同種抗体検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の実施例に係るＦ－ｔｏ－ＭコホートのｃＧＶＨＤの各アレルの累積発症率を示すグラフである。
【図2】本発明の実施例に係るＦ－ｔｏ－ＭコホートのａＧＶＨＤの各アレルの累積発症率を示すグラフである。
【図3】本発明の実施例に係るドナーの性別に応じた男性レシピエントにおける全体のｃＧＶＨＤの累積発生率を示すグラフである。
【図4】本発明の実施例に係るＭ－ｔｏ－ＭコホートのｃＧＶＨＤの各アレルの累積発症率を示すグラフである。
【図5】本発明の実施例に係るＨ－Ｙ抗原の細胞表面及び細胞内発現のＦＡＣＳの結果を示すグラフである。
【図6】本発明の実施例に係るＨＬＡ－ＤＲ発現の細胞表面及び細胞内発現のＦＡＣＳの結果を示すグラフである。
【図7】本発明の実施例に係る完全長ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲのタンパク質間相互作用の共免疫沈降法の結果を示す写真である。
【図8】本発明の実施例に係る抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体と抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体によるＩＦによる染色の写真である。
【図9】本発明の実施例に係るＭｙｃタグ付きＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲ間とのタンパク質－タンパク質相互作用を可視化するためのＰＬＡの写真である。
【図10】本発明の実施例に係るＩｉの有無による細胞表面ＤＢＹ発現のＦＡＣＳの結果を示すグラフである。
【図11】本発明の実施例に係る抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の検出の結果を示すグラフである。
【図12】本発明の実施例に係る抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体のカットオフを示すグラフである。
【図13】本発明の実施例に係る抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の有無によるｃＧＶＨＤの累積発生率を示すグラフである。
【図14】本発明の実施例に係る抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の力価と抗ＤＢＹ抗体との力価の関係を示すグラフである。
【図15】本発明の実施例に係るＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の解析におけるＨＬＡ－ＤＲのＭＦＩを示すグラフである。
【図16】本発明の実施例に係るＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の解析におけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体のＭＦＩを示すグラフである。
【図17】本発明の実施例に係るＨＬＡ－ＤＲＢ１アリルのＤＢＹエピトープに対する結合親和性をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで算出した表である。
【図18】本発明の実施例に係るＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の解析における抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体に対するＭＦＩを示すグラフである。
【図19】本発明の実施例に係るＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体形成と、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に結合するｃＧＶＨＤ患者からの同種抗体の親和性の相関係数を示すグラフである。
【図20】本発明の実施例に係るＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後のｃＧＶＨＤ患者の皮膚生検試料のＨＥ染色の写真である。
【図21】本発明の実施例に係るＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後のｃＧＶＨＤ患者の皮膚生検試料のＩＨＣの写真である。
【図22】本発明の実施例に係るｃＧＶＨＤにおけるＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲのタンパク質間相互作用を可視化するためのＰＬＡの写真である。
【図24】本発明の実施例に係るｃＧＶＨＤバイオマーカーであるＢＡＦＦのＩＨＣ染色の写真である。
【図25】本発明の実施例に係るｃＧＶＨＤバイオマーカーであるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のＩＨＣ染色の写真である。
【図26】本発明の実施例に係るＣＤ３１及びαＳＭＡのＩＦの写真である。
【図27】本発明の実施例に係るＣ４ｄのＩＦの写真である。
【図28】本発明の実施例に係る抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体を用いたＣＤＣの解析結果を示すグラフである。
【図29】本発明の実施例に係る白血病細胞株のＦＡＣＳを用いたＨＬＡ－ＤＲの発現解析の結果を示すグラフである。
【図30】本発明の実施例に係る白血病細胞株の定量的ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。
【図31】本発明の実施例に係る白血病細胞株におけるＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在を可視化するためのＰＬＡの写真である。
【図32】本発明の実施例に係る白血病患者の芽球におけるＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在を可視化するためのＰＬＡの写真である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
＜実施の形態＞
慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）は、一度進行すると難治性になることが多く、早期発見、早期治療が極めて重要である。
ｃＧＶＨＤにおける強力なリスク因子は女性ドナーから男性レシピエント（Ｆｅｍａｌｅ ｔｏ Ｍａｌｅ。以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｍ」と省略する。）への同種移植である（以下、Ｆ－ｔｏ－Ｍの同種移植を「Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ」という。）。この同種移植は、Ｙ染色体コード化エピトープ（以下、「Ｈ－Ｙ抗原」という。）に対する同種抗体の出現を特徴とするＢ細胞の調節障害と広く関連している。
しかしながら、従来、ｃＧＶＨＤ患者の生体内で、実際に病態形成に関わる同種抗体の同定はされていなかった。
慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）は、一度進行すると難治性になることが多く、早期発見、早期治療が極めて重要である。
ｃＧＶＨＤにおける強力なリスク因子は女性ドナーから男性レシピエント（Ｆｅｍａｌｅ ｔｏ Ｍａｌｅ。以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｍ」と省略する。）への同種移植である（以下、Ｆ－ｔｏ－Ｍの同種移植を「Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ」という。）。この同種移植は、Ｙ染色体コード化エピトープ（以下、「Ｈ－Ｙ抗原」という。）に対する同種抗体の出現を特徴とするＢ細胞の調節障害と広く関連している。
しかしながら、従来、ｃＧＶＨＤ患者の生体内で、実際に病態形成に関わる同種抗体の同定はされていなかった。
【0013】
Ｙ染色体にコードされるＨ－Ｙ抗原への抗体（同種抗体）は、ｃＧＶＨＤと移植片対白血病（Ｇｒａｆｔ Ｖｅｒｓｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＧＶＬ）効果の両方に重要な役割を果たすことが知られており、疾患寛解の維持と有意に関連している。
しかしながら、Ｈ－Ｙ抗原は、転写や翻訳に関わる細胞内機能性タンパク質であり、膜貫通領域を持たず、細胞から放出されることはない。すなわち、Ｈ－Ｙ抗原は全て細胞内タンパクであり、それだけでは細胞外に出ないため、抗体の標的になり得ない。さらに、Ｈ－Ｙ抗原は主に男性の生殖器や心臓等の臓器にタンパク質レベルで発現しており、これらは一般的にｃＧＶＨＤの影響を受けない。
このため、従来は、Ｈ－Ｙ抗原が罹患臓器の表面に出現する正確なメカニズムは不明であった。
しかしながら、Ｈ－Ｙ抗原は、転写や翻訳に関わる細胞内機能性タンパク質であり、膜貫通領域を持たず、細胞から放出されることはない。すなわち、Ｈ－Ｙ抗原は全て細胞内タンパクであり、それだけでは細胞外に出ないため、抗体の標的になり得ない。さらに、Ｈ－Ｙ抗原は主に男性の生殖器や心臓等の臓器にタンパク質レベルで発現しており、これらは一般的にｃＧＶＨＤの影響を受けない。
このため、従来は、Ｈ－Ｙ抗原が罹患臓器の表面に出現する正確なメカニズムは不明であった。
【0014】
そこで、本発明者らは、Ｈ－Ｙ抗原の一つであるＤＢＹタンパク質とレシピエントのＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合タンパク（以下、「複合体」という。）が、権患臓器の血管内皮細胞上に発現することを突き止め、更にその複合体に対する抗体の出現が病態形成に直接的に寄与することを明らかにした。
【0015】
より詳しく説明すると、ｃＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤ（ａｃｕｔｅ Ｇｒａｆｔ Ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ、以下、「ａＧＶＨＤ」という。）とは対照的に、強皮症等の自己免疫疾患に類似したいくつかの臨床的特徴を有している。
自己免疫疾患は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子と密接に関連している。近年、主要な自己免疫疾患において、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化した自己抗原が、強力な自己抗体標的として働くという新しいメカニズムが報告されている。このメカニズムによれば、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は細胞内でミスフォールドしたタンパク質と複合体を形成し、ペプチドに断片化することなく細胞表面へと輸送することができる。疾病リスクのあるアレルのＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と結合した分子（複合体）は、効率よく自己抗体によって認識され、標的化される。自己抗原とＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子との複合体を発現する細胞を移植すると、マウスで自己抗体の産生が誘導される。これらの知見によれば、自己免疫疾患における自己抗体産生の根底には、感受性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルの重要な役割がある。
自己免疫疾患は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子と密接に関連している。近年、主要な自己免疫疾患において、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化した自己抗原が、強力な自己抗体標的として働くという新しいメカニズムが報告されている。このメカニズムによれば、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は細胞内でミスフォールドしたタンパク質と複合体を形成し、ペプチドに断片化することなく細胞表面へと輸送することができる。疾病リスクのあるアレルのＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と結合した分子（複合体）は、効率よく自己抗体によって認識され、標的化される。自己抗原とＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子との複合体を発現する細胞を移植すると、マウスで自己抗体の産生が誘導される。これらの知見によれば、自己免疫疾患における自己抗体産生の根底には、感受性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルの重要な役割がある。
【0016】
本発明者らは、血管内皮上のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹタンパク質が、抗体を介したｃＧＶＨＤの初期段階における重要な標的であり、ｃＧＶＨＤがＧＶＬ効果を誘発する理由の説明となる可能性があることを明らかにした。具体的には、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が、ｃＧＶＨＤ患者において全長のＨ－Ｙ抗原を細胞表面に提示し、自己抗体の標的となっていることをつきとめた。
その過程で、ＤＢＹタンパク質とＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子で構成される複合体が発現する細胞株を作成し、同種移植後３ヶ月の患者血漿に接触させることで、複合体に対する同種抗体価を測定する、同種抗体検出方法を開発した。
その過程で、ＤＢＹタンパク質とＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子で構成される複合体が発現する細胞株を作成し、同種移植後３ヶ月の患者血漿に接触させることで、複合体に対する同種抗体価を測定する、同種抗体検出方法を開発した。
【0017】
この同種抗体検出方法で測定した抗体価がカットオフ値より高くなる場合、その後のｃＧＶＨＤの発症率が有意に上昇する結果が得られ、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本実施形態に係る同種抗体検出方法により、女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植においてｃＧＶＨＤの発症可能性を予測することが可能となる。このため、本実施形態に係る同種抗体検出方法を用いたｃＧＶＨＤの検査方法を実現できる。
すなわち、本実施形態に係る同種抗体検出方法により、女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植においてｃＧＶＨＤの発症可能性を予測することが可能となる。このため、本実施形態に係る同種抗体検出方法を用いたｃＧＶＨＤの検査方法を実現できる。
【0018】
また、本発明者らは、後述する実施例で示すように、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子がＤＢＹを輸送して同種抗体に提示する能力は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルのｃＧＶＨＤに対する感受性と密接に関連していることを明らかとした。つまり、同種抗体に提示する能力の高い特定のＨＬＡ－ＤＲアレルでは、ＤＢＹはｃＧＶＨＤの皮膚血管内皮でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と特異的に共局在化し、補体依存性の細胞傷害性を誘発する。
このため、本実施形態に係る検査方法は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルによるｃＧＶＨＤの発症しやすさ又はしにくさを判断することも可能とした。
さらに、本発明者らは、男性由来の一部の白血病細胞株で複合体が発現していることを明らかとして、この複合体を標的とする抗体等を医薬として使用可能であることを示した。
以下、本実施形態に係る同種抗体検出方法、検査方法、検出試薬、検出試薬の製造方法、同種抗体検出キット、及び白血病用医薬（医療用組成物）について詳細に説明する。
このため、本実施形態に係る検査方法は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルによるｃＧＶＨＤの発症しやすさ又はしにくさを判断することも可能とした。
さらに、本発明者らは、男性由来の一部の白血病細胞株で複合体が発現していることを明らかとして、この複合体を標的とする抗体等を医薬として使用可能であることを示した。
以下、本実施形態に係る同種抗体検出方法、検査方法、検出試薬、検出試薬の製造方法、同種抗体検出キット、及び白血病用医薬（医療用組成物）について詳細に説明する。
【0019】
〔同種抗体検出方法〕
本実施形態に係る同種抗体検出方法は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を含む試料と、検出試薬とを接触させ、複合体に結合する試料中の同種抗体を検出することを特徴とする。
本実施形態に係る同種抗体検出方法は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を含む試料と、検出試薬とを接触させ、複合体に結合する試料中の同種抗体を検出することを特徴とする。
【0020】
本実施形態においては、同種抗体検出するための被験者が、女性ドナーから男性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者であってもよく、この被験者の試料を用いてもよい。
【0021】
本実施形態に係る同種抗原タンパク質は、主にＨ－Ｙ抗原であってもよい。このＨ－Ｙ抗原は、例えば、ＤＢＹ、ＥＩＦ１ＡＹ、ＲＰＳ４Ｙ、ＵＴＹ、及びＺＦＹのタンパク質であってもよい。これらは、Ｙ染色体の男性特異的領域にコードされるマイナー組織適合抗原の一群である。
【0022】
より具体的には、本実施形態に係るＨ－Ｙ抗原は、特に、ＤＢＹタンパク質であってもよい。ＤＢＹタンパク質は、ヒトではＹ染色体上に存在するＤＤＸ３Ｙ遺伝子によってコードされるＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼであり、ＤＤＸ３Ｙとも称される。ＤＢＹタンパク質は、保存されたモチーフであるＡｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ（ＤＥＡＤ）を特徴とするＤＥＡＤボックスタンパク質である。
ＤＢＹタンパク質は、上述したように、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と全長で結合することで細胞膜上に運ばれ、抗体の標的になり得る。
ＤＢＹタンパク質は、上述したように、ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と全長で結合することで細胞膜上に運ばれ、抗体の標的になり得る。
【0023】
一方、本実施形態に係る同種抗体検出方法において、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、通常は、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞棟の抗原提示細胞に発現する細胞膜貫通タンパク質であり、主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）分子である。ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、α鎖とβ鎖が会合した構造を取り、細胞内の各種タンパク質の断片であるペプチドを細胞表面に提示する働きをもつ。
【0024】
本実施形態に係るＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、ＨＬＡ－ＤＲ１６からなる群から選択された少なくとも一つであってもよい。
【0025】
〔検査方法〕
本実施形態に係る検査方法は、上述の検出方法によって、試料中の同種抗体を検出する検出工程と、検出工程における同種抗体の検出結果から、ｃＧＶＨＤの発症可能性を検査する検査工程とを含み、ｃＧＶＨＤの発症可能性を検査することを特徴とする。
本実施形態に係る検査方法は、上述の検出方法によって、試料中の同種抗体を検出する検出工程と、検出工程における同種抗体の検出結果から、ｃＧＶＨＤの発症可能性を検査する検査工程とを含み、ｃＧＶＨＤの発症可能性を検査することを特徴とする。
【0026】
このうち、この検出工程が、同種抗体の抗体価を測定する測定工程であってもよい。この抗体価の測定は、補体結合反応（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ。以下、「ＣＦ」ともいう。）、蛍光抗体法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｔｈｏｄ。以下、「ＦＡ」ともいう。）、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ。以下、「ＥＬＩＳＡ」ともいう。）、化学発光免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ。以下、「ＣＬＥＩＡ」ともいう。）、蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ。以下、単にフローサイトメトリー又は「ＦＡＣＳ」という。）等の抗体を検出する各種手法を用いることが可能である。
【0027】
より具体的に、本実施形態に係る測定工程においては、特に、同種抗体の抗体価を測定する方法がフローサイトメトリーであることが好適である。
また、検査される被験者の試料は、被験者から単離された血漿又は血清であってもよい。
また、検査される被験者の試料は、被験者から単離された血漿又は血清であってもよい。
【0028】
すなわち、ＦＡＣＳを用いて、ＤＢＹタンパク質等のＨ－Ｙ抗原及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体に結合する同種抗体の抗体価を行うことが可能である。具体的には、例えば、上述のＤＢＹタンパク質及びＨＬＡ ＣｌａｓｓＩＩ分子が結合した複合体を細胞表面に発現させている細胞株等を用いて、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後、特定期間、例えば、１００日（３ヶ月）後程度が経過した患者の血清又は血漿における血清又は血漿中のＩｇＧ抗体（同種抗体）を測定する。
これにより、ｃＧＶＨＤ病態形成の原因となる同種抗体の抗体価の測定を行うことが可能となる。
これにより、ｃＧＶＨＤ病態形成の原因となる同種抗体の抗体価の測定を行うことが可能となる。
【0029】
この測定工程で用いる細胞株は、形質が理解され、当業者に用いられる株であれば、特に限定されない。具体的に、後述する実施例では、ヒト胎児腎細胞２９３（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ２９３。以下、「２９３Ｔ」細胞という。）を用いる一例について説明している。
または、細胞株として、例えば、男性白血病由来の白血病細胞株を用いることも可能である。具体的には、後述する実施例で示すＫＯ５２やＴＨＰ－１のような、ＤＢＹが白血病細胞でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と共局在化して検出されるような細胞株を用いてもよい。
または、細胞株として、例えば、男性白血病由来の白血病細胞株を用いることも可能である。具体的には、後述する実施例で示すＫＯ５２やＴＨＰ－１のような、ＤＢＹが白血病細胞でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と共局在化して検出されるような細胞株を用いてもよい。
【0030】
さらに具体的には、本実施形態に係る検査方法では、検査工程において、測定工程で測定した同種抗体の抗体価の測定値と基準値とを比較し、測定値が基準値よりも高い場合に、被験者はｃＧＶＨＤの発症可能性があるとしてもよい。
この基準値は、男性ドナーから男性レシピエント（以下、「Ｍ－ｔｏ－Ｍ」と省略する。）へのＨＣＴ、又は女性ドナーから女性レシピエント（以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｆ」と省略する。）への同種移植、又は男性ドナーから女性レシピエント（以下、「Ｍ－ｔｏ－Ｆ」）と省略する。）への同種移植を行った患者を被験者とした測定値であってもよい。この同種移植は、同種造血幹細胞移植であってもよい。
この基準値は、男性ドナーから男性レシピエント（以下、「Ｍ－ｔｏ－Ｍ」と省略する。）へのＨＣＴ、又は女性ドナーから女性レシピエント（以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｆ」と省略する。）への同種移植、又は男性ドナーから女性レシピエント（以下、「Ｍ－ｔｏ－Ｆ」）と省略する。）への同種移植を行った患者を被験者とした測定値であってもよい。この同種移植は、同種造血幹細胞移植であってもよい。
【0031】
より具体的には、この基準値は、測定された発現量から統計的な有意差を検定可能な抗体価に基づく値であってもよい。たとえば、基準値は、健常者に由来する試料の発現量と比較し、例えば、５％有意（ｐ＜０．０５）であるように統計検定される値であってもよい。この検定は、例えば、Ｔ検定、Ｆ検定、カイ二乗検定等の手法をデータ量やデータの性質等に対応して、適宜用いることが可能である。
【0032】
これに加えて、本実施形態に係る検査方法では、ＨＬＡ－ＤＲアレルの型により、ｃＧＶＨＤの発症しやすさと発症しにくさの判断を行ってもよい。これは、後述する実施例で示すように、特定のアレルに関するＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子がｃＧＶＨＤ発症組織の血管内皮表面に全長ＤＢＹ抗原を輸送し、自己抗体を誘導してＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後のｃＧＶＨＤの重要なリスク因子となるためである。
【0033】
具体的には、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴは、それ自体がｃＧＶＨＤの発症リスクと広く知られている。
このため、本実施形態に係る検査方法では、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では発症しにくくなると判断してもよい。
すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、特にドナー、レシピエントともにＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２を有する場合は、そのドナーは避けた方がよいと判断可能となる。一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１２：０１を有するドナー、レシピエントの場合は、ｃＧＶＨＤの発症リスクが低いので、移植を行ってもｃＧＶＨＤの発症リスクは低いため、安全に移植を行えると予想できる。
このため、本実施形態に係る検査方法では、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では発症しにくくなると判断してもよい。
すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、特にドナー、レシピエントともにＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２を有する場合は、そのドナーは避けた方がよいと判断可能となる。一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１２：０１を有するドナー、レシピエントの場合は、ｃＧＶＨＤの発症リスクが低いので、移植を行ってもｃＧＶＨＤの発症リスクは低いため、安全に移植を行えると予想できる。
【0034】
または、本実施形態に係る検査方法では、Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があるとｃＧＶＨＤが発症しにくくなると判断してもよい。
すなわち、Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいて、ドナー、レシピエントともにＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１を有する場合、そのドナーからの移植はｃＧＶＨＤの発症率が高いので避けた方がよいと判断可能となる。一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３を有する場合は、ｃＧＶＨＤの発症率が低いので、安全に移植を行えると予測できる。
すなわち、Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいて、ドナー、レシピエントともにＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１を有する場合、そのドナーからの移植はｃＧＶＨＤの発症率が高いので避けた方がよいと判断可能となる。一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３を有する場合は、ｃＧＶＨＤの発症率が低いので、安全に移植を行えると予測できる。
【0035】
このように、ＨＬＡが適合した血縁者ドナーは同種移植のドナーの第一候補となるものの、異性間の場合は、ｃＧＶＨＤの発症率についての予想により、より適切なドナー選択ができる。
【0036】
これらの男性レシピエント又は女性レシピエントである被験者のＨＬＡ－ＤＲアレルの型は、上述の検査とは別途、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、制限酵素のラダーパターン、ゲノムのシーケンシング、次世代シーケンサーによるシーケンシング等により確定されてもよい。
【0037】
〔検出試薬、検出試薬の製造方法〕
本実施形態に係る検出試薬は、上述の同種抗体検出方法において同種抗体を検出する際に添加されることを特徴とする。
このような抗体測定用の試薬としては、例えば、ＣＦ、ＦＡ、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、又はフローサイトメトリーに必用な試薬を含んでいてもよい。加えて、上述の同種抗体を検出するための抗体、その他、上述のＨＬＡ－ＤＲの型を測定するための試薬を含んでいてもよい。
さらに、各抗体検出用の各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液等も含まれてもよい。これに加えて、上述の方式により抗体を検出するための資材や器材等を含んでもよい。
本実施形態に係る検出試薬は、上述の同種抗体検出方法において同種抗体を検出する際に添加されることを特徴とする。
このような抗体測定用の試薬としては、例えば、ＣＦ、ＦＡ、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、又はフローサイトメトリーに必用な試薬を含んでいてもよい。加えて、上述の同種抗体を検出するための抗体、その他、上述のＨＬＡ－ＤＲの型を測定するための試薬を含んでいてもよい。
さらに、各抗体検出用の各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液等も含まれてもよい。これに加えて、上述の方式により抗体を検出するための資材や器材等を含んでもよい。
【0038】
本実施形態に係る検出試薬の製造方法は、上述の検出試薬を製造することを特徴とする。具体的には、上述の各試薬を、検出試薬として必用な濃度や量で含まれるように調合する工程、資材や器材等を用意する工程等が含まれてもよい。これらの製造の工程においては、当業者が適宜、必用な各種化学物質、測定機器、及び計測機器等を用いて調整、パッケージング等して製造することが可能である。
【0039】
〔同種抗体検出キット〕
本発明の実施の形態に係る同種抗体検出キットは、上述の検出試薬を含むことを特徴とする。
この検出試薬に加えて、本実施形態に係る同種抗体検出キットは、更に、上述の細胞株の細胞や、検出キットのマニュアルやインストラクション等も含んでいてもよい。
さらに、本実施形態のｃＧＶＨＤの検査用キットは、検査結果を得るための装置、解析するためのコンピュータ等を含んでいてもよい。このコンピュータ等は、スタンドアロンで構成されても、ネットワーク上のサーバーを用いて構成されてもよい。コンピュータ等は、検査結果を判断し、データ処理し、可視化するためのプログラム、当該コンピュータを備えた装置及びシステム等がインストールされて含んでいてもよい。このような装置及びシステム等は、当業者に一般的な技術、方式等を用いて開発可能である。
このような装置及びシステム等により、ハイスループットでの検査が可能となり、患者の診断が容易となる。
本発明の実施の形態に係る同種抗体検出キットは、上述の検出試薬を含むことを特徴とする。
この検出試薬に加えて、本実施形態に係る同種抗体検出キットは、更に、上述の細胞株の細胞や、検出キットのマニュアルやインストラクション等も含んでいてもよい。
さらに、本実施形態のｃＧＶＨＤの検査用キットは、検査結果を得るための装置、解析するためのコンピュータ等を含んでいてもよい。このコンピュータ等は、スタンドアロンで構成されても、ネットワーク上のサーバーを用いて構成されてもよい。コンピュータ等は、検査結果を判断し、データ処理し、可視化するためのプログラム、当該コンピュータを備えた装置及びシステム等がインストールされて含んでいてもよい。このような装置及びシステム等は、当業者に一般的な技術、方式等を用いて開発可能である。
このような装置及びシステム等により、ハイスループットでの検査が可能となり、患者の診断が容易となる。
【0040】
〔ｃＧＶＨＤ用医薬〕
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬（医療用組成物）は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を標的とする組成物を含むことを特徴とする。
具体的には、後述の実施例で示すように、ＤＢＹタンパク質とＨＬＡ ＣｌａｓｓＩＩ分子とが結合した複合体は、ａＧＶＨＤ及び急性白血病の腫瘍細胞上にも発現している。このため、この複合体に対する抗体は、今後白血病に対する治療用の標的として用いることが可能である。この抗体は、例えば、ｃＧＶＨＤに対する同種抗原がＧＶＬ効果を誘導するような抗体について、当業者の手法にてクローニングを行って取得してもよい。
さらに、この複合体に対する抗体そのものだけではなく、トランケートされた抗体、抗体様の化学物質、ＰＮＡ、核酸、抗体の認識部位に対応する化合物、抗体に細胞毒性や抗癌作用のある薬物を結合させたもの、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いたもの等（以下、単に「抗体等」という。）を用いてもよい。
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬（医療用組成物）は、同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を標的とする組成物を含むことを特徴とする。
具体的には、後述の実施例で示すように、ＤＢＹタンパク質とＨＬＡ ＣｌａｓｓＩＩ分子とが結合した複合体は、ａＧＶＨＤ及び急性白血病の腫瘍細胞上にも発現している。このため、この複合体に対する抗体は、今後白血病に対する治療用の標的として用いることが可能である。この抗体は、例えば、ｃＧＶＨＤに対する同種抗原がＧＶＬ効果を誘導するような抗体について、当業者の手法にてクローニングを行って取得してもよい。
さらに、この複合体に対する抗体そのものだけではなく、トランケートされた抗体、抗体様の化学物質、ＰＮＡ、核酸、抗体の認識部位に対応する化合物、抗体に細胞毒性や抗癌作用のある薬物を結合させたもの、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いたもの等（以下、単に「抗体等」という。）を用いてもよい。
【0041】
また、近年、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ発現のダウンレギュレーションが、白血病細胞の免疫逃避や同種移植後の再発を促進することが明らかにされている。また、移植Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴでの白血病の再発と、Ｈ－Ｙ抗原とは関連している。すなわち、白血病の再発は、本実施形態に係るＤＢＹタンパク質とＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の複合体に対する抗体による白血病の認識阻害と関連している可能性がある。
このため、本実施形態に係るＨ－Ｙ抗原、特にＤＢＹ等と複合体を提示する能力を高めたＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子を発現させるような核酸等を白血病細胞に導入するように構成された遺伝子治療様の医薬も提供可能である。すなわち、例えば、Ｈ－Ｙ抗原及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の複合体を提示させられるような核酸等を白血病細胞に導入して治療用の医薬としてもよい。この核酸等は、例えば、後述する実施例で示したＤＢＹ及び／又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２と同様の配列を含んでいてもよい。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２は、より複合体を提示させやすいアイソフォーム１であってもよい。
このため、本実施形態に係るＨ－Ｙ抗原、特にＤＢＹ等と複合体を提示する能力を高めたＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子を発現させるような核酸等を白血病細胞に導入するように構成された遺伝子治療様の医薬も提供可能である。すなわち、例えば、Ｈ－Ｙ抗原及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の複合体を提示させられるような核酸等を白血病細胞に導入して治療用の医薬としてもよい。この核酸等は、例えば、後述する実施例で示したＤＢＹ及び／又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２と同様の配列を含んでいてもよい。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２は、より複合体を提示させやすいアイソフォーム１であってもよい。
【0042】
さらに、この核酸等については、例えば、各種ウィルスベクター、プラスミドベクターを用いてもよく、これらを含ませる担体、リポソーム、ＤＤＳ等を用いてもよい。さらに、ゲノム編集等の当業者に使用可能な手法を用いて、白血病細胞における複合体の細胞外への提示を増やすような構成も可能である。
加えて、及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体の形成や細胞外提示に関する発現調整の対象とする遺伝子やパスウェイに対する作用を介した医薬を調製し、ｃＧＶＨＤ用医薬として構成してもよい。
加えて、及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体の形成や細胞外提示に関する発現調整の対象とする遺伝子やパスウェイに対する作用を介した医薬を調製し、ｃＧＶＨＤ用医薬として構成してもよい。
【0043】
これらを用いたｃＧＶＨＤ用医薬により、骨髄移植をせず又は骨髄移植と併用して白血病の治療を行うことが可能となる。
【0044】
このｃＧＶＨＤ用医薬としては、任意の製剤上許容しうる担体を含んでいてもよい。この担体は、例えば、リポソーム担体、コロイド金粒子、ポリペプチド、リポ多糖類、多糖類、脂質膜等であってもよい。これらの中で、機能活性調整剤の発現調整効果を向上させる担体を用いることが好適である。
【0045】
さらに、製薬上許容される担体としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等を含んでいてもよい。さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０等と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。
【0046】
また、本実施形態のｃＧＶＨＤ用医薬は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。このキャリアは、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。また、キャリアは、乳濁液として提供されてもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物のいずれか又は任意の組み合わせを含有させてもよい。
【0047】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、非経口的又は経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、腎臓等への直接投与が可能である。
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
【0048】
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬を上述の治療に用いる際に、投与間隔及び投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
【0049】
加えて、本発明の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。
【0050】
〔治療法〕
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬は、動物のｃＧＶＨＤと同様の疾患の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類等であってもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
すなわち、本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。
さらに、実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬を、ｃＧＶＨＤ以外の自己免疫疾患に用いることが可能であってもよい。
本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬は、動物のｃＧＶＨＤと同様の疾患の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類等であってもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
すなわち、本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。
さらに、実施の形態に係るｃＧＶＨＤ用医薬を、ｃＧＶＨＤ以外の自己免疫疾患に用いることが可能であってもよい。
【0051】
〔ｃＧＶＨＤのリスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルの同定方法〕
ここで、本実施形態に係る検査方法において、ｃＧＶＨＤのリスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルは、以下のような工程で解析することで、選択することが可能である。
すなわち、ＨＬＡ適合の血縁者ドナーの異性間移植で、ｃＧＶＨＤの発症しやすさを予測するＨＬＡ－ＤＲアレルを同定可能となる。
ここで、本実施形態に係る検査方法において、ｃＧＶＨＤのリスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルは、以下のような工程で解析することで、選択することが可能である。
すなわち、ＨＬＡ適合の血縁者ドナーの異性間移植で、ｃＧＶＨＤの発症しやすさを予測するＨＬＡ－ＤＲアレルを同定可能となる。
【0052】
（ステップＳ１）
ＨＬＡの型についてのデータベースにアクセスする。このデータベースは、例えば、後述する実施例で示すような日本造血幹細胞移植学会等で提供されたものであってもよい。具体的には、ドナー、レシピエントの性別で層別化した全国的な登録データを用いることが好適である。
ＨＬＡの型についてのデータベースにアクセスする。このデータベースは、例えば、後述する実施例で示すような日本造血幹細胞移植学会等で提供されたものであってもよい。具体的には、ドナー、レシピエントの性別で層別化した全国的な登録データを用いることが好適である。
【0053】
（ステップＳ２）
データベースから取得した登録データを選択する。この選択は、ＨＬＡアレルの不一致によるｃＧＶＨＤへの影響を避けるため、ＨＬＡ適合血縁者ドナー間の移植に限定する。これは、非血縁者ドナー移植においては、我が国の保険診療では、ＨＬＡの主な４項目であるＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤＲの４項目しか測定できないためである。つまり、これらの４項目が一致していても、測定されないＨＬＡ－ＤＰ，ＤＱ等で、不一致になる可能性がある。
データベースから取得した登録データを選択する。この選択は、ＨＬＡアレルの不一致によるｃＧＶＨＤへの影響を避けるため、ＨＬＡ適合血縁者ドナー間の移植に限定する。これは、非血縁者ドナー移植においては、我が国の保険診療では、ＨＬＡの主な４項目であるＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤＲの４項目しか測定できないためである。つまり、これらの４項目が一致していても、測定されないＨＬＡ－ＤＰ，ＤＱ等で、不一致になる可能性がある。
【0054】
（ステップＳ３）
選択された登録データを、ドナーとレシピエントの性別で層別化、更に選択する。
選択された登録データを、ドナーとレシピエントの性別で層別化、更に選択する。
【0055】
（ステップＳ４）
階層化され選択されたＨＬＡ－ＤＲアレルとｃＧＶＨＤとの関係について多変量解析する。これにより、ＨＬＡ血縁者からの移植後のｃＧＶＨＤ感受性に寄与する特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルを同定する。
階層化され選択されたＨＬＡ－ＤＲアレルとｃＧＶＨＤとの関係について多変量解析する。これにより、ＨＬＡ血縁者からの移植後のｃＧＶＨＤ感受性に寄与する特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルを同定する。
【0056】
上述のステップＳ１～Ｓ４のような解析を行うことで、ＨＬＡ－ＤＲアレルの型として、ＨＬＡアレル毎のｃＧＶＨＤの発症のしやすさ又はしにくさを判断することができる。
すなわち、ｃＧＶＨＤのリスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルを同定し、上述の検査方法に用いることが可能である。
すなわち、ｃＧＶＨＤのリスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルを同定し、上述の検査方法に用いることが可能である。
【0057】
〔発明の効果〕
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
ｃＧＶＨＤは、多形性の自己免疫疾患及び同種免疫疾患であり、同種造血幹細胞移植後の晩期疾病及び再発不能死亡率（Ｎｏｎ Ｒｅｌａｐｓｅ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ。以下、「ＮＲＭ」という。）の主要原因となっていた。ｃＧＶＨＤは、一旦進行すると難治性になることが多く、早期発見、早期治療が極めて重要であった。
しかしながら、従来、ｃＧＶＨＤ罹患した組織の標的細胞や抗原はまだ解明されていなかった。さらに、ヒトで観察される臨床的、病理学的特徴をすべて適切に再現したｃＧＶＨＤマウスモデル等も存在しなかった。このため、従来、ｃＧＶＨＤの発症を予測することは困難であり、従来の診断では手遅れとなることが多々あった。
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
ｃＧＶＨＤは、多形性の自己免疫疾患及び同種免疫疾患であり、同種造血幹細胞移植後の晩期疾病及び再発不能死亡率（Ｎｏｎ Ｒｅｌａｐｓｅ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ。以下、「ＮＲＭ」という。）の主要原因となっていた。ｃＧＶＨＤは、一旦進行すると難治性になることが多く、早期発見、早期治療が極めて重要であった。
しかしながら、従来、ｃＧＶＨＤ罹患した組織の標的細胞や抗原はまだ解明されていなかった。さらに、ヒトで観察される臨床的、病理学的特徴をすべて適切に再現したｃＧＶＨＤマウスモデル等も存在しなかった。このため、従来、ｃＧＶＨＤの発症を予測することは困難であり、従来の診断では手遅れとなることが多々あった。
【0058】
これに対して、本実施形態に係る同種抗体検出方法により、ｃＧＶＨＤの発症前に、その発症を予測することができる。すなわち、女性ドナーから男性レシピエントへ同種造血幹細胞移植を行った患者のｃＧＶＨＤ発症を、その発症前に予測することができる。よって、ｃＧＶＨＤの早期発見、早期治療に資することができる。
【0059】
さらに、ｃＧＶＨＤは、自己免疫疾患に類似した臨床的特徴を持つ多臓器症候群である。したがって、後述する実施例で示すように、免疫細胞のターゲットに着目して、ｃＧＶＨＤと自己免疫疾患の病態生理における疾患リスクとなるＨＬＡアレルの存在等を理解することで、ｃＧＶＨＤの複雑な病態を理解し、有効な新規治療法の開発に資することができる。
【0060】
また、従来から、ｃＧＶＨＤにおける顕著なリスク因子は女性ドナーから男性レシピエントへの移植であり、それに関連してＹ染色体にコードされるＨ－Ｙ抗原に対する同種抗体の出現が知られていた。
しかしながら、Ｈ－Ｙ抗原は一般に男性の生殖器官で細胞内に局在するため、臓器レベルでどのように出現するかは不明であった。このため、ｃＧＶＨＤ患者の生体内での、病態形成に係る実際の同種抗体は解明されていなかった。また、その検出方法も確立されていなかった。
しかしながら、Ｈ－Ｙ抗原は一般に男性の生殖器官で細胞内に局在するため、臓器レベルでどのように出現するかは不明であった。このため、ｃＧＶＨＤ患者の生体内での、病態形成に係る実際の同種抗体は解明されていなかった。また、その検出方法も確立されていなかった。
【0061】
これに対して、本実施形態においては、後述する実施例で示すように、Ｙ染色体にコードされているＤＢＹタンパク質とレシピエントのＨＬＡ ｃｌａｓｓ II分子とが結合した複合体に対する抗体がｃＧＶＨＤ病態形成に直接関与していることを明らかにした。
【0062】
このため、女性ドナーから男性レシピエントへの同種造血幹細胞移植において、本実施形態に係る同種抗体検出方法により測定した抗体価が基準値より高い場合に、その後のｃＧＶＨＤ発症の可能性が高いと予測することが可能となる。
これにより、同種造血幹細胞移植の治療方針の決定に対して重要な情報を提供することができる。すなわち、この測定値により、高い信頼性をもってｃＧＶＨＤ発症及びＮＲＭの発生の予測を医師が判定するためのデータを提供することができる。
これにより、同種造血幹細胞移植の治療方針の決定に対して重要な情報を提供することができる。すなわち、この測定値により、高い信頼性をもってｃＧＶＨＤ発症及びＮＲＭの発生の予測を医師が判定するためのデータを提供することができる。
【0063】
また、従来、ｃＧＶＨＤの発症に特定のＨＬＡ－ＤＲアレルが関与していることは報告されていなかった。その理由は、ドナーとレシピエント間での性別の違いで層別化して解析されたことがないためであった。
【0064】
これに対して、本実施形態に係る検査方法により、レシピエントの特定のＨＬＡ－ＤＲアレルを検査して、ｃＧＶＨＤを発症しやすいか発症しにくいかを判断することが可能となる。すなわち、特に、ＨＬＡが適合した血縁であるが、性別が異なるドナーからの同種造血幹細胞移植において、特定のＨＬＡ－ＤＲアレルがｃＧＶＨＤのリスク因子となることを判断可能となる。
このため、本実施形態の検査方法は、早期診断のために予備的な診断するための検査方法としても用いることも可能となる。いいかえると、本実施形態の検査方法により、ｃＧＶＨＤの発症のしやすさを早期に、正確に判断することができる。結果として、的確なドナーの選択、早期治療等を可能とし、治療効果を向上させることができる。
このため、本実施形態の検査方法は、早期診断のために予備的な診断するための検査方法としても用いることも可能となる。いいかえると、本実施形態の検査方法により、ｃＧＶＨＤの発症のしやすさを早期に、正確に判断することができる。結果として、的確なドナーの選択、早期治療等を可能とし、治療効果を向上させることができる。
【0065】
また、本実施形態に係る同種抗原タンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を標的とする抗体等を、白血病用医薬として用いることが可能となる。
【0066】
なお、上述の実施形態においては、試料中の同種抗体を検出する検出工程を行ってから、ＨＬＡ－ＤＲアレルの型を測定し、ｃＧＶＨＤが発症しにくいか発症しやすいかを判断する検査方法として構成する例について記載した。
しかしながら、本発明の他の実施形態に係る検査方法として、同種抗体の検出工程を含まずに、ｃＧＶＨＤが発症しにくいか発症しやすいかを判断することも可能である。すなわち、検査方法として、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では発症しにくくなると判断してもよい。
一方、Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があるとｃＧＶＨＤが発症しにくくなると判断してもよい。
しかしながら、本発明の他の実施形態に係る検査方法として、同種抗体の検出工程を含まずに、ｃＧＶＨＤが発症しにくいか発症しやすいかを判断することも可能である。すなわち、検査方法として、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのアレルとして、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１では発症しにくくなると判断してもよい。
一方、Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があるとｃＧＶＨＤが発症しにくくなると判断してもよい。
【0067】
また、本発明の実施の形態に係る医薬は、他の組成物等と併用することも可能である。本発明の組成物を、他の組成物と同時に投与、散布、塗布等をしてもよい。
また、上述の実施の形態においては、被験者から取得した試料は、被験者から単離された血漿又は血清である例について記載したものの、生検で得られた皮膚サンプルや血管サンプル等であってもよい。
また、上述の実施の形態においては、被験者から取得した試料は、被験者から単離された血漿又は血清である例について記載したものの、生検で得られた皮膚サンプルや血管サンプル等であってもよい。
【0068】
加えて、本実施形態に係る医療用組成物を、医薬以外の用途に用いることも可能である。さらに、動物でのｃＧＶＨＤにおける作用機序の実験やモデル等に用いることも可能である。
【実施例0069】
以下で、本発明の実施の形態に係るｃＧＶＨＤ特異的バイオマーカーについて、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
【0070】
〔材料と方法〕
（臨床データ）
造血幹細胞移植レシピエントの臨床データは、日本の全国データベース（移植登録統一管理プログラム、以下、「ＴＲＵＭＰ」という。）から入手し、日本移植・細胞治療学会（以下、「ＪＳＴＣＴ」という。）及び日本造血細胞移植データセンター（以下、「ＪＤＣＨＣＴ」という。）から提供された。２００１年から２０１９年の間にＨＬＡ同一血縁者ドナーから初回移植を受け、好中球生着を達成し、１００日以上生存した成人患者（年齢１８歳以上）を取得、選択対象とした。ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＲアレルのデータは、すべてのドナーとレシピエントについて取得可能であった。血液疾患がない患者、又はＨＬＡとｃＧＶＨＤに関する情報が十分でない患者は除外した。ｃＧＶＨＤ発症に対するドナー由来の抗体の影響に注目するため、移植前及び移植後も寛解に至らなかった患者も除外した。骨髄破壊条件（以下、「ＭＡＣ」という。）レジメンは、総照射量８Ｇｙ超、経口ブスルファン量９ｍｇ／ｋｇ以上、静脈内ブスルファン量７．２ｍｇ／ｋｇ以上、又はメルファラン量１４０ｍｇ／ｍ2以上と定義した。２４グレードＩＩ～ＩＶのａＧＶＨＤとｃＧＶＨＤは、主治医が診断した。
この研究は、ＴＲＵＭＰのデータ管理委員会及び自治医科大学の審査委員会によって承認された。
（臨床データ）
造血幹細胞移植レシピエントの臨床データは、日本の全国データベース（移植登録統一管理プログラム、以下、「ＴＲＵＭＰ」という。）から入手し、日本移植・細胞治療学会（以下、「ＪＳＴＣＴ」という。）及び日本造血細胞移植データセンター（以下、「ＪＤＣＨＣＴ」という。）から提供された。２００１年から２０１９年の間にＨＬＡ同一血縁者ドナーから初回移植を受け、好中球生着を達成し、１００日以上生存した成人患者（年齢１８歳以上）を取得、選択対象とした。ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＲアレルのデータは、すべてのドナーとレシピエントについて取得可能であった。血液疾患がない患者、又はＨＬＡとｃＧＶＨＤに関する情報が十分でない患者は除外した。ｃＧＶＨＤ発症に対するドナー由来の抗体の影響に注目するため、移植前及び移植後も寛解に至らなかった患者も除外した。骨髄破壊条件（以下、「ＭＡＣ」という。）レジメンは、総照射量８Ｇｙ超、経口ブスルファン量９ｍｇ／ｋｇ以上、静脈内ブスルファン量７．２ｍｇ／ｋｇ以上、又はメルファラン量１４０ｍｇ／ｍ2以上と定義した。２４グレードＩＩ～ＩＶのａＧＶＨＤとｃＧＶＨＤは、主治医が診断した。
この研究は、ＴＲＵＭＰのデータ管理委員会及び自治医科大学の審査委員会によって承認された。
【0071】
（ヒトの試料）
ヒトの試料として、血漿（ｎ＝１４３）、皮膚生検標本（ｎ＝７）、及び白血病細胞（ｎ＝１４）は、自治医科大学附属病院から入手し、自治医科大学附属病院埼玉医療センターで取得された。研究は、ヘルシンキ宣言に記載された倫理原則に則り、自治医科大学疫学研究生命倫理委員会にて承認された。分析に含まれるすべての個人からインフォームドコンセントを得た。
ヒトの試料として、血漿（ｎ＝１４３）、皮膚生検標本（ｎ＝７）、及び白血病細胞（ｎ＝１４）は、自治医科大学附属病院から入手し、自治医科大学附属病院埼玉医療センターで取得された。研究は、ヘルシンキ宣言に記載された倫理原則に則り、自治医科大学疫学研究生命倫理委員会にて承認された。分析に含まれるすべての個人からインフォームドコンセントを得た。
【0072】
（細胞株）
２９３Ｔ細胞（ＲＣＢ２２０２）、Ｒａｊｉ細胞（ＲＣＢ１６４７）、ＴＨＰ－１細胞（ＲＣＢ１１８９）を理化学研究所から購入した。ＨＥＬ（ＪＣＲＢ００６２）、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１（ＪＣＲＢ１４１１）、ＫＨＭ－２Ｂ（ＪＣＲＢ１３９４）、ＫＯ５２細胞（ＪＣＲＢ０１２３）は、日本研究生物資源細胞バンクから入手した。２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＧｌｕｔａＭＡＸ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ社製）において培養した。ＨＥＬ、ＫＨＭ－２Ｂ、Ｒａｊｉ、及びＴＨＰ－１細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ＫａｓｕｍｉＡ－５４１細胞は、２０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。ＫＯ５２細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むα－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）中で培養した。すべての細胞株は、５％ＣＯ2インキュベーターで３７℃にて培養された。
２９３Ｔ細胞（ＲＣＢ２２０２）、Ｒａｊｉ細胞（ＲＣＢ１６４７）、ＴＨＰ－１細胞（ＲＣＢ１１８９）を理化学研究所から購入した。ＨＥＬ（ＪＣＲＢ００６２）、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１（ＪＣＲＢ１４１１）、ＫＨＭ－２Ｂ（ＪＣＲＢ１３９４）、ＫＯ５２細胞（ＪＣＲＢ０１２３）は、日本研究生物資源細胞バンクから入手した。２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＧｌｕｔａＭＡＸ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ社製）において培養した。ＨＥＬ、ＫＨＭ－２Ｂ、Ｒａｊｉ、及びＴＨＰ－１細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ＫａｓｕｍｉＡ－５４１細胞は、２０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。ＫＯ５２細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むα－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）中で培養した。すべての細胞株は、５％ＣＯ2インキュベーターで３７℃にて培養された。
【0073】
（Ｈ－Ｙ抗原及びＨＬＡ－ＤＲアレルのトランスフェクション）
２９３Ｔ細胞を２４ウェル細胞培養プレート（コーニング社製）にて２４時間培養した。細胞が７０～８０％のコンフルーエントに達した後、製造元の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてプラスミドＤＮＡ（全長Ｈ－Ｙ抗原、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１アリル、ＧＦＰ）でトランスフェクションした。
トランスフェクション後２日目に細胞を回収し、フローサイトメトリー、イムノブロット、免疫蛍光染色（以下、「ＩＦ」という。）、ｉｎ ｓｉｔｕ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（以下、「ＰＬＡ」という。）により解析した。
２９３Ｔ細胞を２４ウェル細胞培養プレート（コーニング社製）にて２４時間培養した。細胞が７０～８０％のコンフルーエントに達した後、製造元の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてプラスミドＤＮＡ（全長Ｈ－Ｙ抗原、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１アリル、ＧＦＰ）でトランスフェクションした。
トランスフェクション後２日目に細胞を回収し、フローサイトメトリー、イムノブロット、免疫蛍光染色（以下、「ＩＦ」という。）、ｉｎ ｓｉｔｕ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（以下、「ＰＬＡ」という。）により解析した。
【0074】
（プラスミド）
ｐＳＩ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＶｅｃｔｏｒはＰｒｏｍｅｇａ社から、ｐＣＡＧ－ＧＦＰはＡｄｄｇｅｎｅ社から購入した。ＤＢＹ（アイソフォーム１）、ＥＩＦＡ１Ｙ、ＲＰＳ４Ｙ１、ＵＴＹ、及びＺＦＹの全長ｃＤＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ社から入手した。フローサイトメトリーに適した市販の抗Ｈ－Ｙ抗体がないため、これらのｃＤＮＡをＰＣＲでクローニングし、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｃ末端にＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＤを付加した。これらのｃＤＮＡをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いてｐＳＩベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの部位にライゲーションした。そして、ｐＳＩ－ＦＬＡＧＤＢＹ－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＥＩＦＡ１Ｙ－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＲＰＳ４Ｙ１－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＵＴＹ－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＺＦＹ－Ｍｙｃを作成した。ＤＢＹアイソフォーム２及び３は、Ｉｎ－ＦＬＡＧ－ＤＢＹ（アイソフォーム１）－ＭｙｃからＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて作成した。ＨＬＡ－ＤＲＡ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１、ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎの遺伝子構築物はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から購入した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）を用いて確認された。ＴＲＵＭＰのＦ－ｔｏ－Ｍコホートにおいて、５人以上の患者から得られたＨＬＡＤＲＢ１対立遺伝子は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ及びＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社製）を用いてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１から作成された。これらの各ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎの増幅断片をｐＳＩ ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。これらの発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン（シグマアルドリッチ社製）を添加したＬＢブロス（シグマアルドリッチ社製）で３７℃にて培養を行った。これらのプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者の指示に従って調製した。
ｐＳＩ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＶｅｃｔｏｒはＰｒｏｍｅｇａ社から、ｐＣＡＧ－ＧＦＰはＡｄｄｇｅｎｅ社から購入した。ＤＢＹ（アイソフォーム１）、ＥＩＦＡ１Ｙ、ＲＰＳ４Ｙ１、ＵＴＹ、及びＺＦＹの全長ｃＤＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ社から入手した。フローサイトメトリーに適した市販の抗Ｈ－Ｙ抗体がないため、これらのｃＤＮＡをＰＣＲでクローニングし、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｃ末端にＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＤを付加した。これらのｃＤＮＡをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いてｐＳＩベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの部位にライゲーションした。そして、ｐＳＩ－ＦＬＡＧＤＢＹ－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＥＩＦＡ１Ｙ－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＲＰＳ４Ｙ１－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＵＴＹ－Ｍｙｃ、ｐＳＩ－ＦＬＡＧ－ＺＦＹ－Ｍｙｃを作成した。ＤＢＹアイソフォーム２及び３は、Ｉｎ－ＦＬＡＧ－ＤＢＹ（アイソフォーム１）－ＭｙｃからＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて作成した。ＨＬＡ－ＤＲＡ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１、ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎの遺伝子構築物はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から購入した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）を用いて確認された。ＴＲＵＭＰのＦ－ｔｏ－Ｍコホートにおいて、５人以上の患者から得られたＨＬＡＤＲＢ１対立遺伝子は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ及びＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社製）を用いてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１から作成された。これらの各ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎの増幅断片をｐＳＩ ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。これらの発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン（シグマアルドリッチ社製）を添加したＬＢブロス（シグマアルドリッチ社製）で３７℃にて培養を行った。これらのプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製）を用いて、製造者の指示に従って調製した。
【0075】
（フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ）
トランスフェクトした細胞をＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とインキュベートし、非特異的抗体結合をブロックした。ブロッキング後、ＦＶＤ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて死細胞を標識した。その後、トランスフェクションした細胞を特異的抗体と３０分間インキュベートした。細胞内染色には、製造元のプロトコールに従って転写因子バッファーセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。染色された細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標） Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｏｍｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ社製）を用いて分析した。
フローサイトメトリー解析に使用した抗体は以下の通りである：ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体（Ｌ２４３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ抗体（ＭＯＰＣ－１７３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＱ抗体（ＳＫ１０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＥ抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体（Ｌ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
トランスフェクトした細胞をＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とインキュベートし、非特異的抗体結合をブロックした。ブロッキング後、ＦＶＤ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて死細胞を標識した。その後、トランスフェクションした細胞を特異的抗体と３０分間インキュベートした。細胞内染色には、製造元のプロトコールに従って転写因子バッファーセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。染色された細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標） Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｏｍｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ社製）を用いて分析した。
フローサイトメトリー解析に使用した抗体は以下の通りである：ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ抗体（Ｌ２４３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ抗体（ＭＯＰＣ－１７３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＱ抗体（ＳＫ１０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＥ抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ抗体（Ｌ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
【0076】
（共免疫沈降法とウェスタンブロット解析）
共免疫沈降法（Ｃｏ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ。以下、「Ｃｏ－ＩＰ」ともいう。）は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｃｏ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎキット（ＶＥＲＩＴＡＳ社製）を使用し、製造者の説明書（マニュアル）に従って実験を行った。簡単に説明すると、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙを抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）または抗ＤＹＫＤＤＫ－Ｔａｇ抗体（Ｌ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と３７℃で２４時間カップリングした。トランスフェクトした細胞を、１００ｍＭ ＮａＣｌと０．２％フェニルメチルスルホニルフルオリドプロテアーゼ阻害剤を含む付属の抽出バッファーで氷上１５分間溶解させた。抗体結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙを４℃で３０分間、溶解液と混合した。インキュベーション後、ビーズに結合したタンパク質を付属の溶出バッファーで溶出した。溶出後、試料タンパク質を５％β－メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と混合し、９８℃で５分間煮沸することにより変性させた。混合物を４％～２０％のＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にロードし、ｉＢｌｏｔ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて転写した。メンブレンは、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンを一次抗体と室温（２５℃、ＲＴ）で１時間、次いで二次抗体とＲＴで１時間インキュベートした。ウェスタンブロット解析には、以下の抗体を使用した： 抗ＤＹＫＤＤＫ－ｔａｇ抗体（２３６８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体（ａｂ９１０６、Ａｂｃａｍ社製）、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、抗ラビットＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、免疫反応性バンドを検出した。
共免疫沈降法（Ｃｏ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ。以下、「Ｃｏ－ＩＰ」ともいう。）は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｃｏ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎキット（ＶＥＲＩＴＡＳ社製）を使用し、製造者の説明書（マニュアル）に従って実験を行った。簡単に説明すると、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙを抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）または抗ＤＹＫＤＤＫ－Ｔａｇ抗体（Ｌ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と３７℃で２４時間カップリングした。トランスフェクトした細胞を、１００ｍＭ ＮａＣｌと０．２％フェニルメチルスルホニルフルオリドプロテアーゼ阻害剤を含む付属の抽出バッファーで氷上１５分間溶解させた。抗体結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙを４℃で３０分間、溶解液と混合した。インキュベーション後、ビーズに結合したタンパク質を付属の溶出バッファーで溶出した。溶出後、試料タンパク質を５％β－メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と混合し、９８℃で５分間煮沸することにより変性させた。混合物を４％～２０％のＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にロードし、ｉＢｌｏｔ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて転写した。メンブレンは、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンを一次抗体と室温（２５℃、ＲＴ）で１時間、次いで二次抗体とＲＴで１時間インキュベートした。ウェスタンブロット解析には、以下の抗体を使用した： 抗ＤＹＫＤＤＫ－ｔａｇ抗体（２３６８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体（ａｂ９１０６、Ａｂｃａｍ社製）、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、抗ラビットＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、免疫反応性バンドを検出した。
【0077】
（ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する抗体の解析）
全長ＤＢＹ、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子、及びＧＦＰ、又はＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子、及びＧＦＰを２９３Ｔ細胞へトランスフェクトさせた。トランスフェクトした細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＨａｎｋｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で２回洗浄した。死細胞染色及びＦＣブロッキング後、トランスフェクトした細胞を、１：５０に希釈した患者血漿とともに氷上で１時間インキュベートし、続いて１：５０に希釈したＡＰＣ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）で３０分、ＲＴで標識した。その後、染色した細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体価は、ＤＢＹ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２でトランスフェクトしたＧＦＰ陽性細胞へのＩｇＧ結合のＭＦＩからＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２のみでトランスフェクトしたＧＦＰ陽性細胞へのＩｇＧ結合のＭＦＩを差し引くことにより算出した。
全長ＤＢＹ、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子、及びＧＦＰ、又はＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子、及びＧＦＰを２９３Ｔ細胞へトランスフェクトさせた。トランスフェクトした細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＨａｎｋｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で２回洗浄した。死細胞染色及びＦＣブロッキング後、トランスフェクトした細胞を、１：５０に希釈した患者血漿とともに氷上で１時間インキュベートし、続いて１：５０に希釈したＡＰＣ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）で３０分、ＲＴで標識した。その後、染色した細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体価は、ＤＢＹ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２でトランスフェクトしたＧＦＰ陽性細胞へのＩｇＧ結合のＭＦＩからＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２のみでトランスフェクトしたＧＦＰ陽性細胞へのＩｇＧ結合のＭＦＩを差し引くことにより算出した。
【0078】
（血漿中のＤＢＹ抗体検出のためのＥｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（酵素結合免疫吸着測定法））
９６ウェル平底プレート（住友ベークライト社製）に、５０ｍＭ炭酸－重炭酸緩衝液中５０ｎｇ／μＬのＤＢＹタンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）を５０μＬコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と０．０２％Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂乳２００μＬで３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄後、プレートをＰＢＳ－０．０２％ Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂乳１００μＬで１：５０に希釈した患者の血漿と３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳと０．０２％ Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂乳で１：１０００に希釈したペルオキシダーゼゴート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）と３７℃で３０分インキュベートした。最後に、１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標） ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＬＧＣ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）をプレートに加え、１００μＬのＴＭＢ Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＧＣ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して反応を停止させた。その後、Ｓｐａｒｋ（ＴＥＣＡＮ社製）により、６２０ｎｍの基準波長を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。血漿ＩｇＧのＤＢＹへの特異的結合は、５０ｍＭ炭酸水素緩衝液でコーティングしたＤＢＹのＯＤ値からコントロールのＯＤ値を差し引くことにより求めた。
９６ウェル平底プレート（住友ベークライト社製）に、５０ｍＭ炭酸－重炭酸緩衝液中５０ｎｇ／μＬのＤＢＹタンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）を５０μＬコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と０．０２％Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂乳２００μＬで３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄後、プレートをＰＢＳ－０．０２％ Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂乳１００μＬで１：５０に希釈した患者の血漿と３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳと０．０２％ Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂乳で１：１０００に希釈したペルオキシダーゼゴート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）と３７℃で３０分インキュベートした。最後に、１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標） ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＬＧＣ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）をプレートに加え、１００μＬのＴＭＢ Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＧＣ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用して反応を停止させた。その後、Ｓｐａｒｋ（ＴＥＣＡＮ社製）により、６２０ｎｍの基準波長を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。血漿ＩｇＧのＤＢＹへの特異的結合は、５０ｍＭ炭酸水素緩衝液でコーティングしたＤＢＹのＯＤ値からコントロールのＯＤ値を差し引くことにより求めた。
【0079】
（ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の発現量及びＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体への抗体結合量に対する異なるＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子の影響）
全長Ｈ－Ｙ、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子、及びＧＦＰを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。フローサイトメトリーにより、細胞表面におけるＨ－Ｙ抗原の発現量を比較した。次に、同種移植後、３ヶ月で採取した男性ｃＧＶＨＤ患者の血漿を用いて、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子におけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体への自己抗体結合を解析した。最後に、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の量とＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に結合する抗体との関連を、ピアソン積率相関係数を用いて評価した。
全長Ｈ－Ｙ、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子、及びＧＦＰを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。フローサイトメトリーにより、細胞表面におけるＨ－Ｙ抗原の発現量を比較した。次に、同種移植後、３ヶ月で採取した男性ｃＧＶＨＤ患者の血漿を用いて、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子におけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体への自己抗体結合を解析した。最後に、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の量とＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に結合する抗体との関連を、ピアソン積率相関係数を用いて評価した。
【0080】
（ＣＤＣアッセイ）
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を回収し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで２回洗浄した。洗浄後、１００μＬのＤＭＥＭ中の１×１０6の細胞を、スピンカラムベースの抗体精製キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）（コスモバイオ社製）を用いて、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体を含む男性ｃＧＶＨＤ患者の血漿から精製したＩｇＧとインキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、１：６に希釈した標準ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と３７℃で１時間インキュベートした。最後に、死細胞をＦＶＤ７８０で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を回収し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで２回洗浄した。洗浄後、１００μＬのＤＭＥＭ中の１×１０6の細胞を、スピンカラムベースの抗体精製キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）（コスモバイオ社製）を用いて、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体を含む男性ｃＧＶＨＤ患者の血漿から精製したＩｇＧとインキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、１：６に希釈した標準ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と３７℃で１時間インキュベートした。最後に、死細胞をＦＶＤ７８０で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【0081】
（ＩＦ）
細胞は４％パラホルムアルデヒドで、氷上で１５分間固定した。その後、非特異的部位をＰＢＳ中の５％ロバ血清で、ＲＴで１時間ブロッキングした。その後、細胞を抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体（ａｂ９１０６、Ａｂｃａｍ社製）とともにＲＴで１時間インキュベートし、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）プレアドソーブ（Ａｂｃａｍ社製）及びヤギ抗ラビットＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）プレアドソーブ（Ａｂｃａｍ社製）で３０分間処理してＲＴとした。核はＤＡＰＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）でカウンター染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて画像を得た。画像はＦｉｊｉ Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（富士フイルム社製）を使って処理した。
細胞は４％パラホルムアルデヒドで、氷上で１５分間固定した。その後、非特異的部位をＰＢＳ中の５％ロバ血清で、ＲＴで１時間ブロッキングした。その後、細胞を抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体（ａｂ９１０６、Ａｂｃａｍ社製）とともにＲＴで１時間インキュベートし、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）プレアドソーブ（Ａｂｃａｍ社製）及びヤギ抗ラビットＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）プレアドソーブ（Ａｂｃａｍ社製）で３０分間処理してＲＴとした。核はＤＡＰＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）でカウンター染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて画像を得た。画像はＦｉｊｉ Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（富士フイルム社製）を使って処理した。
【0082】
（ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ）
ＰＬＡは、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｒｅｄ Ｓｔａｒｔｅｒ ｋｉｔ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、製造者の指示に従い実行した。抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体（ａｂ９１０６、Ａｂｃａｍ社製）はトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＥＲＰ３６９２、Ａｂｃａｍ社製）及び抗ＤＢＹ抗体（Ｂ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）はホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ、ＦＦＰＥ）切片、ヒト白血病細胞株及び患者から採取した白血病細胞に使用された。
ＰＬＡは、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｒｅｄ Ｓｔａｒｔｅｒ ｋｉｔ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、製造者の指示に従い実行した。抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体（ａｂ９１０６、Ａｂｃａｍ社製）はトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＥＲＰ３６９２、Ａｂｃａｍ社製）及び抗ＤＢＹ抗体（Ｂ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）はホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ、ＦＦＰＥ）切片、ヒト白血病細胞株及び患者から採取した白血病細胞に使用された。
【0083】
（病理組織学的評価）
皮膚生検試料のＦＦＰＥ切片は、ｃＧＶＨＤの患者から入手した。健康な皮膚生検試料は、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社及びＯｒｉＧｅｎｅ社から購入した。切片はキシレンを用いて脱パラフィンし、段階的なエタノールシリーズで脱水した。抗原回収は、オートクレーブを用いて、ターゲット回収液（Ｄａｋｏ社製）を用いて１２１℃、２０分間行った。ヘマトキシリン・エオシン染色は、Ｍａｙｅｒ'ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（富士フイルム社製）、Ｅｏｓｉｎ Ｙ（富士フイルム社製）を用いて行った。ＩＨＣについては、抗原回収後の切片を３％過酸化水素で１５分間ＲＴ処理し、ＰＢＳ中の２％ロバ血清で、３０分間ＲＴでブロックし、Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を使用して分析した。その後、切片を一次抗体とＲＴで１時間、対応する二次抗体とＲＴで３０分インキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ標準キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を製造者の説明書に従って使用した。最後に、ペルオキシダーゼ染色ＤＡＢキット（Ｂｒｏｗｎ Ｓｔａｉｎ）（ナカライテスク社製）を用いて、免疫反応性を可視化した。ＩＦについては、抗原回収を行った切片を使用した。切片を一次抗体と３７℃で１時間インキュベートした後、二次抗体とＲＴで３０分インキュベートした。核はＤＡＰＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）でカウンターステインした。一次抗体は、抗ＤＤＸ３抗体（Ｃ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、α－ＳＭＡ抗体（ａｂ５６９４、Ａｂｃａｍ社製）、抗ＣＤ３１抗体（Ｈ－３．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＢＡＦＦ抗体（ＡＦ１２４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、抗ＣＸＣＬ９抗体（Ａ－９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＣＸＣＬ１０抗体（１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ｃ４ｄ抗体（ａｂ８７２４、Ａｂｃａｍ社製）、二次抗体にはビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉｇｏａｔ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ｇｏａｔ ａｎｔｉｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４） ｐｒｅａｄｓｏｒｂｅｄ（Ａｂｃａｍ社製）、及びｇｏａｔ ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８） ｐｒｅａｄｓｏｒｂｅｄ（Ａｂｃａｍ社製）が含まれていた。
皮膚生検試料のＦＦＰＥ切片は、ｃＧＶＨＤの患者から入手した。健康な皮膚生検試料は、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社及びＯｒｉＧｅｎｅ社から購入した。切片はキシレンを用いて脱パラフィンし、段階的なエタノールシリーズで脱水した。抗原回収は、オートクレーブを用いて、ターゲット回収液（Ｄａｋｏ社製）を用いて１２１℃、２０分間行った。ヘマトキシリン・エオシン染色は、Ｍａｙｅｒ'ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（富士フイルム社製）、Ｅｏｓｉｎ Ｙ（富士フイルム社製）を用いて行った。ＩＨＣについては、抗原回収後の切片を３％過酸化水素で１５分間ＲＴ処理し、ＰＢＳ中の２％ロバ血清で、３０分間ＲＴでブロックし、Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を使用して分析した。その後、切片を一次抗体とＲＴで１時間、対応する二次抗体とＲＴで３０分インキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ標準キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を製造者の説明書に従って使用した。最後に、ペルオキシダーゼ染色ＤＡＢキット（Ｂｒｏｗｎ Ｓｔａｉｎ）（ナカライテスク社製）を用いて、免疫反応性を可視化した。ＩＦについては、抗原回収を行った切片を使用した。切片を一次抗体と３７℃で１時間インキュベートした後、二次抗体とＲＴで３０分インキュベートした。核はＤＡＰＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）でカウンターステインした。一次抗体は、抗ＤＤＸ３抗体（Ｃ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＨＬ－４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、α－ＳＭＡ抗体（ａｂ５６９４、Ａｂｃａｍ社製）、抗ＣＤ３１抗体（Ｈ－３．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＢＡＦＦ抗体（ＡＦ１２４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、抗ＣＸＣＬ９抗体（Ａ－９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＣＸＣＬ１０抗体（１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ｃ４ｄ抗体（ａｂ８７２４、Ａｂｃａｍ社製）、二次抗体にはビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉｇｏａｔ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ｇｏａｔ ａｎｔｉｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４） ｐｒｅａｄｓｏｒｂｅｄ（Ａｂｃａｍ社製）、及びｇｏａｔ ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８） ｐｒｅａｄｓｏｒｂｅｄ（Ａｂｃａｍ社製）が含まれていた。
【0084】
（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
製造者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて５×１０4の白血病細胞からトータルＲＮＡを単離した。その後、単離したＲＮＡをｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて逆転写させた。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）反応は、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。インターナルコントロール（比較例）としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）を使用した。
製造者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて５×１０4の白血病細胞からトータルＲＮＡを単離した。その後、単離したＲＮＡをｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて逆転写させた。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）反応は、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。インターナルコントロール（比較例）としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）を使用した。
【0085】
使用したプライマーは、下記と添付する配列表に記載した通りである：
ＤＢＹプライマーＦ： ５′－ＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＴＡ－３′ …… 配列番号（１）
ＤＢＹプライマーＲ： ５′－ＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣ－３′ …… 配列番号（２）
ＧＡＰＤＨプライマーＦ： ５′－ＧＧＡＴＴＴＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧ３′ …… 配列番号（３）
ＧＡＰＤＨプライマーＲ： ５′－ＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＴ－３′ …… 配列番号（４）
ＤＢＹプライマーＦ： ５′－ＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＴＡ－３′ …… 配列番号（１）
ＤＢＹプライマーＲ： ５′－ＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣ－３′ …… 配列番号（２）
ＧＡＰＤＨプライマーＦ： ５′－ＧＧＡＴＴＴＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧ３′ …… 配列番号（３）
ＧＡＰＤＨプライマーＲ： ５′－ＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＴ－３′ …… 配列番号（４）
【0086】
（ライト・ギムザ染色）
ＢＭスミアはライト液とギムザ液（ムトー純薬社製）を用いて染色した。
ＢＭスミアはライト液とギムザ液（ムトー純薬社製）を用いて染色した。
【0087】
（ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ ４．０を用いたペプチド結合親和性の予測）
ＤＢＹと各ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ対立遺伝子との結合親和性を測定するために、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ ４．０を使用した。このシステムは、人工ニューラルネットワークに基づくアライメント法を用いて、ペプチド結合アッセイの結果をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測する。ペプチド長は、初期設定である１５アミノ酸と仮定した。各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に対するＤＢＹの結合親和性についての％ｒａｎｋ値を比較した。ｒａｎｋ値が１．０未満のものを強結合体と定義した。
ＤＢＹと各ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ対立遺伝子との結合親和性を測定するために、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ ４．０を使用した。このシステムは、人工ニューラルネットワークに基づくアライメント法を用いて、ペプチド結合アッセイの結果をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測する。ペプチド長は、初期設定である１５アミノ酸と仮定した。各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に対するＤＢＹの結合親和性についての％ｒａｎｋ値を比較した。ｒａｎｋ値が１．０未満のものを強結合体と定義した。
【0088】
（統計解析）
ａＧＶＨＤ及びｃＧＶＨＤの累積発生率は、移植時からａＧＶＨＤ及びｃＧＶＨＤの発生まで、競合リスクとして再発または死亡を伴わずに測定された。ａＧＶＨＤとｃＧＶＨＤの累積発生率は、Ｇｒａｙの方法で評価した。多変量解析は、Ｆｉｎｅ－Ｇｒａｙ法を用いて実施した。患者年齢（線形）、パフォーマンスステータス、条件レジメン、幹細胞の供給源、ＧＶＨＤ予防、移植年数、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子は多変量解析の対象となった。すべての統計解析は、ＥＺＲ（バージョン１．５５、自治医科大学埼玉医療センター）を用いて行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析は、Ｐｒｉｓｍ ７．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド社聖）を用いて行った。２群の平均値の比較には、Ｐｒｉｓｍ ７．０における対にならない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ ｔｅｓｔを使用した。すべての図において、エラーバーは平均値の標準偏差を表す。すべてのｐ値＜０．０５は統計的有意性を示す。
ａＧＶＨＤ及びｃＧＶＨＤの累積発生率は、移植時からａＧＶＨＤ及びｃＧＶＨＤの発生まで、競合リスクとして再発または死亡を伴わずに測定された。ａＧＶＨＤとｃＧＶＨＤの累積発生率は、Ｇｒａｙの方法で評価した。多変量解析は、Ｆｉｎｅ－Ｇｒａｙ法を用いて実施した。患者年齢（線形）、パフォーマンスステータス、条件レジメン、幹細胞の供給源、ＧＶＨＤ予防、移植年数、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子は多変量解析の対象となった。すべての統計解析は、ＥＺＲ（バージョン１．５５、自治医科大学埼玉医療センター）を用いて行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析は、Ｐｒｉｓｍ ７．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド社聖）を用いて行った。２群の平均値の比較には、Ｐｒｉｓｍ ７．０における対にならない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ ｔｅｓｔを使用した。すべての図において、エラーバーは平均値の標準偏差を表す。すべてのｐ値＜０．０５は統計的有意性を示す。
【0089】
〔結果〕
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルは、ＨＬＡ同一女性血縁者ドナーからの男性レシピエントの同種移植後のｃＧＶＨＤ発症に影響を与える。
本発明者らは、まず、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおけるｃＧＶＨＤの発生に影響するかどうかを、日本の全国データベースを用いて検討した。
このＨＬＡ同一の女性の血縁者ドナーから移植を受けた男性患者（以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｍコホート」という。）の臨床的特徴を下記の表１に示す：
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルは、ＨＬＡ同一女性血縁者ドナーからの男性レシピエントの同種移植後のｃＧＶＨＤ発症に影響を与える。
本発明者らは、まず、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおけるｃＧＶＨＤの発生に影響するかどうかを、日本の全国データベースを用いて検討した。
このＨＬＡ同一の女性の血縁者ドナーから移植を受けた男性患者（以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｍコホート」という。）の臨床的特徴を下記の表１に示す：
【0090】
【表1】
【0091】
表１においては、ｃＧＶＨＤに対するＨＬＡミスマッチの潜在的影響を排除するために、Ｆ－ｔｏ－Ｍコホートを分析した。合計７６８人（ｎ＝７６８）の患者が評価された。患者は、骨髄（ＢＭ）移植２４５人、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）移植５２２人、ＢＭ＋ＰＢＳＣ移植１人であった。患者のうち、６４．６％が白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）と診断され、７７．９％がサイクロスポリンに基づいた（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ－ｂａｓｅｄ）のＧＶＨＤ予防処置が行われ、７１．２％がこれに伴う骨髄破壊的前処置（Ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ：ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ、ＭＡＣレジメン）を受けていた。
【0092】
次に、本発明者らは、ｃＧＶＨＤ累積発症リスクについて、上述のＦ－ｔｏ－Ｍコホート（ｎ＝７６８）について、多変量解析を行った。具体的には、５％以上の頻度で存在するＨＬＡ－ＤＲアレル（ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレル）がｃＧＶＨＤの発症に及ぼす影響を評価した。ｃＧＶＨＤの発症に対する各ＨＬＡ－ＤＲアレルの影響はＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ法により算出された。
この解析の結果を下記の表２に示す：
この解析の結果を下記の表２に示す：
【0093】
【表2】
【0094】
（ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルが、ｃＧＶＨＤ発症に与える影響）
表２に示したように、ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルによりｃＧＶＨＤの発症リスクが異なっていた。多変量解析では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２陽性群は、発症率が増加し、ｃＧＶＨＤのリスク上昇と有意に関連していた。この群のハザード比（ＨＲ）は１．２８、９５％信頼区間（ＣＩ）は１．０３～１．５８、Ｐ＝０．０２５であった。
逆に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１陽性群は、ｃＧＶＨＤのリスク低下と有意な相関があった。この群のＨＲは０．７４、９５％ＣＩは０．５９～０．９３、Ｐ＝０．０１０であった。
また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１陽性群は、統計的有意性の境界線上にあった。この群のＨＲは０．６３、９５％ＣＩは０．３９～１．０１、Ｐ＝０．０５３であった。
表２に示したように、ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルによりｃＧＶＨＤの発症リスクが異なっていた。多変量解析では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２陽性群は、発症率が増加し、ｃＧＶＨＤのリスク上昇と有意に関連していた。この群のハザード比（ＨＲ）は１．２８、９５％信頼区間（ＣＩ）は１．０３～１．５８、Ｐ＝０．０２５であった。
逆に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１陽性群は、ｃＧＶＨＤのリスク低下と有意な相関があった。この群のＨＲは０．７４、９５％ＣＩは０．５９～０．９３、Ｐ＝０．０１０であった。
また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１陽性群は、統計的有意性の境界線上にあった。この群のＨＲは０．６３、９５％ＣＩは０．３９～１．０１、Ｐ＝０．０５３であった。
【0095】
Ｆ－ｔｏ－Ｍコホートのこれらのアレルについて、実際の発症率を算出した。
図１に、このＦ－ｔｏ－ＭコホートのｃＧＶＨＤの累積発症率を示す。各グラフにおいて、横軸は移植後の経過年数、縦軸はｃＧＶＨＤの累積発症率を示す。いずれも、Ｇｒａｙ検定によって比較された。
図１に、このＦ－ｔｏ－ＭコホートのｃＧＶＨＤの累積発症率を示す。各グラフにおいて、横軸は移植後の経過年数、縦軸はｃＧＶＨＤの累積発症率を示す。いずれも、Ｇｒａｙ検定によって比較された。
【0096】
図１（ａ）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２陽性（淡色線）の患者と陰性（濃色線）の患者とを比較した結果を示す。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２陽性群は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２陰性群よりもｃＧＶＨＤの累積発生率が高かった。具体的には、１年経過後で５５．１％（９５％ＣＩ ４７．２％～６２．３％）対４６．６％（９５％ＣＩ ４２．５％～５０．５％）であり、Ｐ＝０．０３５であった。
【0097】
図１（ｂ）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１陽性（淡色線）の患者と陰性（濃色線）の患者とを比較した結果を示す。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１陽性群は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１陰性群と比較して、ｃＧＶＨＤの累積発生率が低かった。具体的には、１年経過後で４０．４％（９５％ＣＩ ３４．０％～４６．７％）対５１．８％（９５％ＣＩ ４７．５％－５６．０％）であり、Ｐ＝０．００９であった。
【0098】
図１（ｃ）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１陽性（淡色線）の患者と陰性（濃色線）の患者とを比較した結果を示す。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１陽性群は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１陰性群と比較して、ｃＧＶＨＤの累積発生率が低いことが示された。具体的には、１年時点で３４．８％（９５％ＣＩ ２１．３％～４８．６％）対４９．３％（９５％ＣＩ ４５．６％～５２．９％）であり、Ｐ＝０．０４５であった。
【0099】
まとめると、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１はＦ－ｔｏ－ＭコホートにおけるｃＧＶＨＤ発症と相関があった。具体的には、Ｆ－ｔｏ－Ｍコホートでは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２がｃＧＶＨＤ発症を増加させた。
一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ｃＧＶＨＤ発症を減少させた。
一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ｃＧＶＨＤ発症を減少させた。
【0100】
図２は、Ｆ－ｔｏ－Ｍコホートの急性ＧＶＨＤ（以下、「ａＧＶＨＤ」という。）累積発症率を示す。各グラフにおいて、横軸は移植後の経過日数、縦軸はｃＧＶＨＤの累積発症率を示す。いずれも、図１と同様に、Ｇｒａｙ検定によって比較された。
【0101】
図２（ａ）によると、ａＧＶＨＤはｃＧＶＨＤの主要なリスク因子であるものの、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２は、グレードＩＩ～ＩＶのａＧＶＨＤの累積発生率において、陽性群と陰性群とで差がなかった。具体的には、１００日時点で３４．５％（９５％ ＣＩ ２７．４％－４１．８％）対３４．７％（９５％ＣＩ ３０．９％～３８．６％）であり、Ｐ＝０．７９５であった。
【0102】
図２（ｂ）によると、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１も、ａＧＶＨＤは、陽性群と陰性群とで差がなかった。具体的には、１００日時点で３２．２％（９５％ＣＩ ２６．２％～３８．３％）対３５．８％（９５％ＣＩ ３１．７％～３９．８％）であり、Ｐ＝０．２７６であった。
【0103】
図２（ｃ）によると、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１も、ａＧＶＨＤは、陽性群と陰性群とで差がなかった。具体的には、１００日時点で３７．０％（９５％ＣＩ ２３．２％～５０．８％）対３４．５％（９５％ＣＩ ３１．１％～３８．０％）であり、Ｐ＝０．５２２であった。
【0104】
まとめると、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ａＧＶＨＤ発症に影響を与えなかった。
これらの結果は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１が、ａＧＶＨＤ非依存的メカニズムを通じてｃＧＶＨＤの発生に関与することを示唆した。
これらの結果は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１が、ａＧＶＨＤ非依存的メカニズムを通じてｃＧＶＨＤの発生に関与することを示唆した。
【0105】
次に、ＨＬＡ同一性の男性血縁者ドナーからの男性レシピエント（以下、「Ｍ－ｔｏ－Ｍコホート」という。）、女性ドナーからの女性レシピエント（以下、「Ｆ－ｔｏ－Ｆコホート」という。）、男性ドナーからの女性レシピエント（以下、「Ｍ－ｔｏ－Ｆコホート」という。）、に関する同様の解析を行った。
【0106】
まず、本実施例に係るＭ－ｔｏ－Ｍコホート（ｎ＝８４８）の臨床的特徴を下記の表３に示す：
【0107】
【表3】
【0108】
下記の表４に、Ｍ－ｔｏ－ＭコホートによるｃＧＶＨＤ累積発症リスクの多変量解析（ｎ＝８４８）の結果を示す。
【0109】
【表4】
【0110】
このように、Ｆ－ｔｏ－Ｍコホートと比較して、Ｍ－ｔｏ－ＭコホートはｃＧＶＨＤの累積発生率が低かった。
【0111】
図３は、ドナーの性別に応じた男性レシピエントにおけるｃＧＶＨＤの累積発生率を示す。濃色は男性ドナー（Ｍ－ｔｏ－Ｍコホート）、淡色は女性ドナー（Ｆ－ｔｏ－Ｍコホート）を示す。横軸は移植後の経過年数、縦軸はｃＧＶＨＤの累積発症率を示す。具体的には、１年経過後で、３５．７％（９５％ ＣＩ ３２．４％－３８．９％）対４８．４％（９５％ ＣＩ ４４．８％－５１．９％）であり、Ｐ ＜０．００１であった。
すなわち、男性レシピエントの場合、ドナーの性別がｃＧＶＨＤのリスク因子となっていることが確かめられた。
すなわち、男性レシピエントの場合、ドナーの性別がｃＧＶＨＤのリスク因子となっていることが確かめられた。
【0112】
図４は、Ｍ－ｔｏ－Ｍコホートにおける、ＨＬＡ－ＤＲアレルのｃＧＶＨＤ累積発症率を示す。
Ｍ－ｔｏ－Ｍコホートでは、リスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルの型はなかった。
Ｍ－ｔｏ－Ｍコホートでは、リスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルの型はなかった。
【0113】
次に、本実施例に係るＦ－ｔｏ－Ｆコホート（ｎ＝６１５）の臨床的特徴を下記の表５に示す：
【0114】
【表5】
【0115】
下記の表６に、Ｆ－ｔｏ－ＦコホートによるｃＧＶＨＤ累積発症リスクの多変量解析（ｎ＝６１５）の結果を示す。
【0116】
【表6】
【0117】
ＨＬＡ－ＤＲアレルは、Ｆ－ｔｏ－ＦコホートにおけるｃＧＶＨＤの発生率に影響を与えなかった。すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｆコホートでも、リスク因子となるＨＬＡ－ＤＲアレルの型はなかった。
【0118】
次に、本実施例に係るＭ－ｔｏ－Ｆコホート（ｎ＝６５８）の臨床的特徴を下記の表７に示す：
【0119】
【表7】
【0120】
下記の表８に、Ｍ－ｔｏ－ＦコホートによるｃＧＶＨＤ累積発症リスクの多変量解析（ｎ＝６５８）の結果を示す。
【0121】
【表8】
【0122】
Ｍ－ｔｏ－Ｆコホートでは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３が、ｃＧＶＨＤのリスクを減少させた。具体的には、ＨＲ ０．６６、９５％ＣＩ ０．４６～０．９６、Ｐ＝０．０３１であった。
また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１が、ｃＧＶＨＤのリスクを増加させた。具体的には、ＨＲ １．７４、９５％ ＣＩ １．０２～２．９８、Ｐ＝０．０４４であった。
また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１が、ｃＧＶＨＤのリスクを増加させた。具体的には、ＨＲ １．７４、９５％ ＣＩ １．０２～２．９８、Ｐ＝０．０４４であった。
【0123】
これらの知見を総合すると、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにおいては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ｃＧＶＨＤ発症と特異的な関連があり、発症しやすくなることが示された。
さらに、ＨＬＡ－ＤＲアレルとｃＧＶＨＤの関連は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴに限定されるものではなかった。Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があるとｃＧＶＨＤが発症しにくくなることが示された。
すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ及びＭ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにて、特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩがｃＧＶＨＤ発症に関連していた。
さらに、ＨＬＡ－ＤＲアレルとｃＧＶＨＤの関連は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴに限定されるものではなかった。Ｍ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにおいては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１があるとｃＧＶＨＤが発症しやすくなり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３があるとｃＧＶＨＤが発症しにくくなることが示された。
すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ及びＭ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴにて、特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩがｃＧＶＨＤ発症に関連していた。
【0124】
（細胞内の全長ＤＢＹタンパク質は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体を形成して細胞表面に提示される）
次に、ｃＧＶＨＤに特異的な関連があるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２分子が、全長Ｈ－Ｙ抗原の細胞表面への輸送に必須の役割を果たすかどうかを検討した。
具体的には、Ｈ－Ｙ抗原は細胞内タンパク質であり、Ｈ－Ｙ抗原が細胞表面に表出してｃＧＶＨＤ発症に関与するか不明であったため、これを明らかにした。
次に、ｃＧＶＨＤに特異的な関連があるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２分子が、全長Ｈ－Ｙ抗原の細胞表面への輸送に必須の役割を果たすかどうかを検討した。
具体的には、Ｈ－Ｙ抗原は細胞内タンパク質であり、Ｈ－Ｙ抗原が細胞表面に表出してｃＧＶＨＤ発症に関与するか不明であったため、これを明らかにした。
【0125】
図５は、ＦＡＣＳの結果を示す。具体的には、Ｈ－Ｙ抗原（ＤＢＹ、ＥＩＦ１ＡＹ、ＲＰＳ４Ｙ、ＵＴＹ、及びＺＦＹ）の細胞表面及び細胞内発現をフローサイトメトリーで測定した。Ｍｏｃｋ（網掛けヒストグラム）、Ｈ－Ｙ抗原（濃色線）、又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２を有するＨ－Ｙ抗原（淡色線）を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。すべてのＨ－Ｙ抗原は、Ｎ末端にＦＬＡＧ－ｔａｇを融合させ、抗ＦＬＡＧ－ｔａｇ抗体を用いて検出した。細胞表面（上段の５つのヒストグラム）及び細胞内（下段の５つのヒストグラム）の解析結果を示す。
【0126】
図６は、ＨＬＡ－ＤＲ発現のフローサイトメトリーの測定結果を示す。Ｍｏｃｋ（灰色ヒストグラム）、ＤＢＹ（濃色線）、又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２を有するＤＢＹ（淡色線）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、トランスフェクト細胞を抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体で染色した解析結果を示す。
【0127】
結果として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（α鎖：ＤＲＡ１＊０１：０１）を導入した２９３Ｔ細胞に、Ｎ末端にＦＬＡＧ－ｔａｇを付けた各Ｈ－Ｙ抗原をトランスフェクションしたところ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２は、Ｈ－Ｙ抗原の細胞表面への輸送に必須な役割を果たした。
具体的には、Ｈ－Ｙ抗原を単独でトランスフェクトした場合、いずれの抗原も細胞表面に検出されなかった。一方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２との共導入では、すべてのＨ－Ｙ抗原が細胞表面に存在するようになり、ＤＢＹが最も強く発現した。
具体的には、Ｈ－Ｙ抗原を単独でトランスフェクトした場合、いずれの抗原も細胞表面に検出されなかった。一方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２との共導入では、すべてのＨ－Ｙ抗原が細胞表面に存在するようになり、ＤＢＹが最も強く発現した。
【0128】
このように、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩを遺伝子を導入することで、細胞表面にＨ－Ｙ抗原が表出された。このＨ－Ｙ抗原の中ではＤＢＹが最も表出された。
血漿中のＤＢＹ抗体はｃＧＶＨＤの発症と重症度の最も強力な予測因子であることが証拠によって示されている。したがって、ＤＢＹは、特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがｃＧＶＨＤの発症と関連している理由を説明する最も高い可能性を持っている。
また、ＤＢＹには、３つの交互スプライシングアイソフォームが存在するため、これをそれぞれ測定したところ、同様の結果となった。これらのうち、本発明者らは、その後の実験で、ＤＢＹアイソフォーム１を用いた。
血漿中のＤＢＹ抗体はｃＧＶＨＤの発症と重症度の最も強力な予測因子であることが証拠によって示されている。したがって、ＤＢＹは、特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがｃＧＶＨＤの発症と関連している理由を説明する最も高い可能性を持っている。
また、ＤＢＹには、３つの交互スプライシングアイソフォームが存在するため、これをそれぞれ測定したところ、同様の結果となった。これらのうち、本発明者らは、その後の実験で、ＤＢＹアイソフォーム１を用いた。
【0129】
図７に、完全長ＤＢＹがＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体を形成するかどうかを共免疫沈降法を用いて解析した結果を示す。完全長ＤＢＹを検出するために、ＤＢＹはＮ末端にＦＬＡＧ－ｔａｇを、Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを融合させた。ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの両方をトランスフェクトした細胞から抗ＦＬＡＧ－ｔａｇ抗体と抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体の両方を用いてＨＬＡ－ＤＲとＩＰすることにより、７３ｋＤａの完全長のＤＢＹタンパク質の検出が可能になった。具体的には、ＦＬＡＧ－ＤＢＹ－ＭｙｃとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＦＬＡＧ－ＤＢＹ－Ｍｙｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、又はＭｏｃｋとを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクトした細胞を溶解し、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（左側）及び抗ＦＬＡＧ－ｔａｇ抗体（右側）を用いて共免疫沈降法を行った。得られた免疫沈降物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ、ＩＰ）は、指定の抗体でブロットした。
【0130】
結果として、ＤＢＹは全長でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩと複合体を形成した。すなわち、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、ＤＢＹタンパク質をペプチドに断片化することなく細胞表面に輸送された。
【0131】
ここで、トランスフェクトした細胞におけるＨＬＡ－ＤＲとＭｙｃ－ｔａｇ ＤＢＹの発現を確認した。
図８は、完全長ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩの共局在をさらに確認するために、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体と抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体を用いてＩＦによる染色を行った例を示す。各写真の原倍率は２００倍、スケールバーは５μｍである。
具体的には、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２とをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＩＦを行った。ＤＢＹはＣ末端にＭｙｃ－ｔａｇを融合させ、抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体を用いて検出した（左上）。ＨＬＡ－ＤＲとＭｙｃ－ｔａｇとの二重免疫染色を行った（左下）。核は、ＤＮＡと結合する蛍光色素である４'，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（以下、「ＤＡＰＩ」という。）で染色した（右上）。これらの写真を合成した（Ｍｅｒｇｅ）ものを、右下に示す。
図８は、完全長ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩの共局在をさらに確認するために、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体と抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体を用いてＩＦによる染色を行った例を示す。各写真の原倍率は２００倍、スケールバーは５μｍである。
具体的には、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２とをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＩＦを行った。ＤＢＹはＣ末端にＭｙｃ－ｔａｇを融合させ、抗Ｍｙｃ－ｔａｇ抗体を用いて検出した（左上）。ＨＬＡ－ＤＲとＭｙｃ－ｔａｇとの二重免疫染色を行った（左下）。核は、ＤＮＡと結合する蛍光色素である４'，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（以下、「ＤＡＰＩ」という。）で染色した（右上）。これらの写真を合成した（Ｍｅｒｇｅ）ものを、右下に示す。
【0132】
次に、ＰＬＡを行ってタンパク質間相互作用を観察した。
図９は、Ｍｙｃタグ付きＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲ間のタンパク質－タンパク質相互作用を可視化するためのＰＬＡの例を示す。各写真の原倍率は４００倍、スケールバーは２０μｍである。
図９は、Ｍｙｃタグ付きＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲ間のタンパク質－タンパク質相互作用を可視化するためのＰＬＡの例を示す。各写真の原倍率は４００倍、スケールバーは２０μｍである。
【0133】
Ｍｙｃタグ付きＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在化によりＰＬＡシグナル（淡色）が誘発された。モック（左側）又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（右側）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、解析した。核はＤＡＰＩで染色した。
ＰＬＡシグナルは、２つの抗原が４０ｎｍより近い場合に検出される。結果として、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲをトランスフェクトした細胞でＰＬＡシグナルが検出された。
ＰＬＡシグナルは、２つの抗原が４０ｎｍより近い場合に検出される。結果として、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲをトランスフェクトした細胞でＰＬＡシグナルが検出された。
【0134】
不変性鎖（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ、以下、「Ｉｉ」という。）は、新しく合成されたＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子のシャペロンとして、ペプチドやミスフォールドしたタンパク質が小胞体にロードされるのを防ぎ、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子をエンドソームに導く役割を担っている。
【0135】
図１０は、Ｉｉの有無による細胞表面ＤＢＹ発現のフローサイトメトリーの結果を示す。Ｍｏｃｋは（灰色ヒストグラム）、ＤＢＹ及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩを有するＩｉ（濃色線）またはＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩを有するＤＢＹ（淡色線）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（左側）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１（中側）、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１（右側）の解析結果を示す。ＭｏｃｋはｐＳＩベクターのみである。すべてのデータは３つの独立した実験の代表値である。
【0136】
結果として、Ｉｉの存在下でも、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２はＤＢＹを効率よく細胞表面に輸送していた。同様の結果は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞にＤＢＹペプチドを提示することが報告されているＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１とＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１でも見られた（図示せず）。
【0137】
これらの知見を総合すると、Ｈ－Ｙ抗原はＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２）と複合体を形成して細胞表面に表出していた。このＨ－Ｙ抗原の中では、ＤＢＹがＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２と最も複合体を形成していた。
すなわち、完全長のＨ－Ｙ抗原、特にＤＢＹはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２と複合体を形成することによって細胞表面に出現し、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子に対するＤＢＹの親和性はＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子に対するＩｉの親和性よりも強くなっていることが示された。
以下、このＤＢＹタンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を、「ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体」と省略して記載する。
すなわち、完全長のＨ－Ｙ抗原、特にＤＢＹはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２と複合体を形成することによって細胞表面に出現し、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子に対するＤＢＹの親和性はＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子に対するＩｉの親和性よりも強くなっていることが示された。
以下、このＤＢＹタンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を、「ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体」と省略して記載する。
【0138】
（抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体は、ｃＧＶＨＤ発症に関与するか）
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合したＤＢＹに対する自己抗体の存在は、ｃＧＶＨＤのリスクを増加させると考えられる。すなわち、抗ＤＢＹ抗体の出現はｃＧＶＨＤ発症に関連する。
しかしながら、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体がｃＧＶＨＤの標的抗原となるかは不明であった。このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体を認識する抗体が、ｃＧＶＨＤ発症の病因となりうるか解明した。
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合したＤＢＹに対する自己抗体の存在は、ｃＧＶＨＤのリスクを増加させると考えられる。すなわち、抗ＤＢＹ抗体の出現はｃＧＶＨＤ発症に関連する。
しかしながら、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体がｃＧＶＨＤの標的抗原となるかは不明であった。このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体を認識する抗体が、ｃＧＶＨＤ発症の病因となりうるか解明した。
【0139】
ここでは、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後にｃＧＶＨＤを起こした患者が、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹに対するＩｇＧ抗体を持っているかどうかを検証した。移植患者は輸血によって抗ＨＬＡ抗体を獲得する危険性があることから、血漿中のＤＢＹに対するＩｇＧを比較した。具体的には、２９３Ｔ細胞表面に発現したＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２複合体及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２単独に対する血漿中ＩｇＧを比較した。
【0140】
図１１は、ＦＡＣＳを用いた、Ｆ－ｔｏ－Ｍ移植の患者血漿中（ｎ＝７３）の抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の検出の結果である。すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後の患者におけるＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合したＤＢＹに結合する血漿抗体のフローサイトメトリーの結果を示す。ここでは、希釈した血漿を、Ｍｏｃｋ（網掛けヒストグラム）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（濃色線）、又はＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（淡色線）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞とともにインキュベートした。トランスフェクトされた細胞へのＩｇＧ抗体の結合が、抗ヒトＩｇＧ抗体による染色で評価された。上段６つのヒストグラムに示す患者（Ｐａｔｉｅｎｔ）１～６はｃＧＶＨＤを発症しなかった。一方、下段６つのヒストグラムに示す患者（Ｐａｔｉｅｎｔ）７～１２は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後に、ｃＧＶＨＤを発症していた。
【0141】
結果として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２単独に対するＩｇＧ抗体は、ｃＧＶＨＤの発症の有無にかかわらず、一部の患者で観察された。一方で、一部のｃＧＶＨＤ症例では、ＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２複合体に対するＩｇＧ抗体が検出された。
【0142】
この上で、ｃＧＶＨＤを発症した患者では、ＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２複合体に対する血漿中ＩｇＧ抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２単独に対する抗体より高かった。
このため、ｃＧＶＨＤにおけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する特異抗体の存在が示唆された．
このため、ｃＧＶＨＤにおけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する特異抗体の存在が示唆された．
【0143】
次に、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する抗体の出現がｃＧＶＨＤのリスクを増加させるかどうかを検討した。具体的には、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２の両方を導入したＧＦＰ陽性細胞へのＩｇＧ結合のＭＦＩから、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２のみを導入したＧＦＰ陽性細胞へのＩｇＧ結合のＭＦＩを差し引くことによって、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の抗体価を算出した。
【0144】
図１２は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを受けた７３名の患者を含む、自治医科大学病院で採取した１４３名の血漿試料を移植後３ヶ月で解析し、Ｆ－ｔｏ－Ｍ移植症例以外の９５％値をカットオフ値として設定した力価（抗体価）の比較結果である。具体的には、ＨＣＴ後３ヵ月における、Ｆ－ｔｏ－Ｍと、他のＨＣＴ（Ｍ－ｔｏ－Ｍ、Ｍ－ｔｏ－Ｆ、Ｆ－ｔｏ－Ｆ）との間の抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の抗体価の比較を行った。カットオフ値は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを除く患者におけるＭＦＩの９５％値で決定した。破線はＭＦＩのカットオフ値を示す。Ｍ－ｔｏ－Ｍ、Ｍ－ｔｏ－Ｆ、Ｆ－ｔｏ－Ｆ ＨＣＴを受けた患者は左側、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを受けた患者は右側に示した。
【0145】
結果として、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体のカットオフ値をＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを除く患者におけるＭＦＩの９５％に設定したところ、３２人（４３．８％）がＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後に陽性と同定された。
【0146】
図１３は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後の抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の有無によるｃＧＶＨＤの累積発生率を示す。抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体陽性群（淡色線）又は陰性群（濃色線）の比較には、Ｇｒａｙ検定を用いた。
注目すべきことに、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体が陽性だった患者のｃＧＶＨＤの累積発生率は、抗体が陰性だった患者のそれよりも高かった。具体的には、１年後の６８．８％（９５％ＣＩ ４８．８～８２．２％）、対３１．７％（９５％ＣＩ １７．５～４６．９％）となり、Ｐ＝０．００２となった。
注目すべきことに、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体が陽性だった患者のｃＧＶＨＤの累積発生率は、抗体が陰性だった患者のそれよりも高かった。具体的には、１年後の６８．８％（９５％ＣＩ ４８．８～８２．２％）、対３１．７％（９５％ＣＩ １７．５～４６．９％）となり、Ｐ＝０．００２となった。
【0147】
すなわち、複合体への抗体を有する症例ではｃＧＶＨＤ発症率が高くなっていた。
このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の存在は、Ｆ－ｔｏ－ＭＨＣＴにおけるｃＧＶＨＤ発症のリスク因子となり得ることが示された。
このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の存在は、Ｆ－ｔｏ－ＭＨＣＴにおけるｃＧＶＨＤ発症のリスク因子となり得ることが示された。
【0148】
次に、同じコホート内の抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の陽性率を抗ＤＢＹ抗体の陽性率と比較した。
図１４は、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の抗体価と抗ＤＢＹ抗体の抗体価の関係を示す。すなわち、ＤＢＹのみを認識する抗体を間接法ＥＬＩＳＡで検出した結果である。カットオフ値は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを除き、ＭＦＩと光学密度（ＯＤ）値の９５％値で決定した。破線はＭＦＩとＯＤ値のカットオフ値を示す。丸印は個体を示す。ＭｏｃｋはｐＳＩベクターである。
図１４は、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体の抗体価と抗ＤＢＹ抗体の抗体価の関係を示す。すなわち、ＤＢＹのみを認識する抗体を間接法ＥＬＩＳＡで検出した結果である。カットオフ値は、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを除き、ＭＦＩと光学密度（ＯＤ）値の９５％値で決定した。破線はＭＦＩとＯＤ値のカットオフ値を示す。丸印は個体を示す。ＭｏｃｋはｐＳＩベクターである。
【0149】
結果として、７３人中１８人（２４．７％）が抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体及び抗ＤＢＹ抗体の両方を保有していた。しかし、１４人（１９．１％）は抗ＤＢＹ／ＨＬＡ複合体抗体のみを保有し、その殆どが、後にｃＧＶＨＤを発症していた。
このことから、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ 複合体は、プレート結合型ＤＢＹと共通のエピトープに加え、独自の同種抗原エピトープを持っていることが示唆された。すなわち、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する抗体は、単純なＤＢＹを認識する抗体だけではなかった。
このことから、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ 複合体は、プレート結合型ＤＢＹと共通のエピトープに加え、独自の同種抗原エピトープを持っていることが示唆された。すなわち、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する抗体は、単純なＤＢＹを認識する抗体だけではなかった。
【0150】
まとめると、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の出現は、ｃＧＶＨＤ発症のリスク要因となる。
すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ移植後、約４０％の症例で、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体が出現した。
また、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体を有する症例はｃＧＶＨＤの発症率が高かった。
このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、ｃＧＶＨＤの標的抗原と示唆された。
すなわち、Ｆ－ｔｏ－Ｍ移植後、約４０％の症例で、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体が出現した。
また、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体を有する症例はｃＧＶＨＤの発症率が高かった。
このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、ｃＧＶＨＤの標的抗原と示唆された。
【0151】
（Ｈ－Ｙ抗原及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体を形成しやすいＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩは、ｃＧＶＨＤのリスクとなる）
上述のように、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する抗体はｃＧＶＨＤ発症に関与していた。
しかしながら、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成量が、ｃＧＶＨＤ発症に与える影響は不明である。このため、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルの型の違いがＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する同種抗体の認識に影響するかどうかを検討した。すなわち、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成がＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレル依存性であるか解明することにした。
上述のように、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する抗体はｃＧＶＨＤ発症に関与していた。
しかしながら、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成量が、ｃＧＶＨＤ発症に与える影響は不明である。このため、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルの型の違いがＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する同種抗体の認識に影響するかどうかを検討した。すなわち、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成がＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレル依存性であるか解明することにした。
【0152】
まず、Ｆ－ｔｏ－Ｍコホートの５人以上の患者から２２のＨＬＡ－ＤＲＢ１アレル（α鎖：ＤＲＡ１＊０１：０１）を選び、それぞれを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＤＢＹを導入した。
【0153】
図１５及び図１６は、各ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルにおける、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の解析の結果を示す。具体的には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがＨＬＡ－ＤＲ及びＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の発現量（複合体の形成量）を示す。異なるＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルとＤＢＹを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリーで解析した。棒グラフは、図１５が各ＨＬＡ－ＤＲであり、図１６がＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体化したＤＢＹの蛍光値（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を示す。ＭＦＩは、３つの独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。
【0154】
ＭＦＩで示されるＨＬＡ－ＤＲアレルの細胞表面の発現量は、互いに差がなかった。しかしながら、ＤＢＹの細胞表面での発現量はＨＬＡ－ＤＲアレルによって著しく異なり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２は、ＤＢＹの発現を最も多く誘導した。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルの違いは、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体形成とｃＧＶＨＤ患者の同種抗体のＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する反応性に影響を与えていた。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルの違いは、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体形成とｃＧＶＨＤ患者の同種抗体のＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する反応性に影響を与えていた。
【0155】
加えて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１アリルのＤＢＹエピトープに対する結合親和性を、１％以下の％ｒａｎｋで強結合エピトープを定義するＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ ４．０を用いて分析した。
【0156】
この結果を、図１７に示す。各アリルについて、示されるエピトープに関する％ｒａｎｋを示す。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２とＤＢＹペプチドとの結合力が最も高いと予測できた。
【0157】
また、ｃＧＶＨＤ患者からの血漿中の同種抗体のＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体への親和性を測定した。
【0158】
図１８は、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体に対するＭＦＩを示す。ＭＦＩは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示された。
【0159】
図１９は、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体形成と、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に結合するｃＧＶＨＤ患者からの血漿中の同種抗体の親和性との間の関係を示す。具体的には、２群のＭＦＩ間でピアソンの相関係数を算出した。Ｒは相関係数を表す。丸印は個々のＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルである。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２を、それぞれ淡色で示す。
【0160】
結果として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２が最も強い結合エピトープを持つことがわかった。さらに、ｃＧＶＨＤ患者の同種抗体のＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する反応性も、ＨＬＡ－ＤＲアレルによって影響を受け、この反応性はＤＢＹの表面発現レベルと相関していた。この相関係数は、ｒ＝０．７０２（９５％ ＣＩ、０．３９８～０．８６７）であり、Ｐ＜０．００１であった。
【0161】
注目すべきは、ＤＲＢ１＊１５：０２は、複合体形成量、結合親和性とも大きかったことであった。すなわち、ｃＧＶＨＤ患者からの同種抗体は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２と複合化したＤＢＹに対して最も強い結合親和性を持ち、ｃＧＶＨＤのリスクを増加させていた。
【0162】
一方、ＤＲＢ１＊０９：０１及びＤＲＢ１＊１２：０１は、複合体形成量、結合親和性が最も低かった。すなわち、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ＤＢＹの発現を最も低く誘導し、同種抗体によって最も認識されにくいことから、ｃＧＶＨＤのリスクを下げると考えられることが分かった。
【0163】
他のＨ－Ｙ抗原も様々なＨＬＡ－ＤＲアレルと複合体を形成するものの、それらの表面発現レベルはＤＢＹよりも低く、Ｈ－Ｙ抗原の最高発現も最低発現もＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１とは関連がなかった。
【0164】
これらの結果は、細胞表面におけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成が、ＨＬＡ－ＤＲアレルによってもたらされるｃＧＶＨＤへの感受性の根底にあり、ｃＧＶＨＤの発症に直接影響することを示していた。
このように、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成は慢性ＧＶＨＤの発症機序に重要であった。
このように、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成は慢性ＧＶＨＤの発症機序に重要であった。
【0165】
まとめると、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレル依存性であり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２において、最も複合体が形成された。さらに、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２は、ｃＧＶＨＤ発症のリスク因子となるアレルであった。
一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体形成量が少なく、慢性ＧＶＨＤの発症率も低かった。
一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１は、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体形成量が少なく、慢性ＧＶＨＤの発症率も低かった。
【0166】
（ｃＧＶＨＤにおいてＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体はどこに出現するか）
上述のように、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は慢性ＧＶＨＤ発症に関与していた。ＤＢＹは広く転写されているが、その翻訳は通常、精巣に限定されており、精巣はｃＧＶＨＤの主要な標的臓器の一つではない。
このため、ｃＧＶＨＤの病態におけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の重要な役割を考慮して、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が患部臓器で発現しているかどうかを検証した。すなわち、標的組織のどの部位で、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が発現し、標的となっているかを調べた。
上述のように、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は慢性ＧＶＨＤ発症に関与していた。ＤＢＹは広く転写されているが、その翻訳は通常、精巣に限定されており、精巣はｃＧＶＨＤの主要な標的臓器の一つではない。
このため、ｃＧＶＨＤの病態におけるＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の重要な役割を考慮して、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が患部臓器で発現しているかどうかを検証した。すなわち、標的組織のどの部位で、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が発現し、標的となっているかを調べた。
【0167】
まず、免疫染色を用いて、ＤＢＹ、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩがどこに発現しているか解析した。ここでは、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後のｃＧＶＨＤ患者（ｎ＝４）から、ｃＧＶＨＤの扁平苔癬様の組織学的特徴を有する皮膚生検試料を得た。
【0168】
図２０は、この皮膚生検試料の代表的なヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す。写真内のスケールバーは２００μｍ、倍率４０倍である。
過角化、表皮肥厚、表皮下への炎症細胞の浸潤、及び表皮と真皮の間の炎症がみられた。
過角化、表皮肥厚、表皮下への炎症細胞の浸潤、及び表皮と真皮の間の炎症がみられた。
【0169】
次に、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ。免疫染色）を行った。
【0170】
図２１は、女性ｃＧＶＨＤ患者（Ｆｅｍａｌｅ、ｎ＝３。以下、単に「女性患者」ともいう。）及びＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴを受けたｃＧＶＨＤ男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ、ｎ＝４。以下、単に「男性患者」ともいう。）のＤＢＹ及びＨＬＡ－ＤＲの代表的なＩＨＣの結果を示す。スケールバーは５０μｍ、倍率は２００倍である。
【0171】
結果として、ＤＢＹは、主に男性患者の真皮の血管内皮細胞に発現していた。また、ＨＬＡ－ＤＲは性別に関係なく血管内皮細胞に発現していた。
このように、ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子との複合体は、ｃＧＶＨＤの患者組織（皮膚）において皮膚血管内皮細胞に発現していた。
このように、ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子との複合体は、ｃＧＶＨＤの患者組織（皮膚）において皮膚血管内皮細胞に発現していた。
【0172】
興味深いことに、女性患者（Ｆｅｍａｌｅ）の皮膚では、血管内皮細胞にもＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）が発現していた。上述のＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ ４．０による解析では、抗ＤＢＹ抗体のエピトープには、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子に結合するペプチドが含まれていない。このため、この抗体はＨＬＡ結合部位の外側の領域を認識していることが示唆された。
【0173】
次に、ＰＬＡを用いてＤＢＹがＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と共局在しているかどうかを調べた。
【0174】
図２２は、ｃＧＶＨＤにおけるＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲのタンパク質間相互作用を可視化するためのＰＬＡの結果を示す。女性患者（Ｆｅｍａｌｅ）及び男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）の顕微鏡写真（Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ）及びＰＬＡシグナルの写真を示す。核はＤＡＰＩで染色された。スケールバーは２０μｍ、倍率は４００倍である。
結果として、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在化により、男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）において、写真内で楕円の点状に示されるように、ＰＬＡシグナルが血管内皮細胞で誘発された。
結果として、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在化により、男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）において、写真内で楕円の点状に示されるように、ＰＬＡシグナルが血管内皮細胞で誘発された。
【0175】
図２３は、このＰＬＡシグナルを棒グラフ化したものである。具体的には、女性患者（Ｆｅｍａｌｅ、ｎ＝９）及び男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ、ｎ＝１２）の皮膚からの血管あたりのＰＬＡシグナルを示す。データは平均値±ＳＤで示した。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて計算された。「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。
【0176】
結果として、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後の男性患者の血管内皮細胞において、ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の間にＰＬＡシグナルが観察された（Ｐ＝０．０３２）。
これらの結果は、男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）では、ＤＢＹが血管内皮細胞上で異所的に発現し、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体を形成していることを示している。すなわち、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）で血管内皮に発現していた。
これらの結果は、男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）では、ＤＢＹが血管内皮細胞上で異所的に発現し、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体を形成していることを示している。すなわち、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、男性患者（Ｆ－ｔｏ－Ｍ）で血管内皮に発現していた。
【0177】
次に、ｃＧＶＨＤの標的としての血管内皮細胞の重要性をさらに検証するために、ｃＧＶＨＤバイオマーカーのＩＨＣ染色を行った。
このｃＧＶＨＤバイオマーカーとしては、まず、血清Ｂ細胞活性化因子（Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ、以下「ＢＡＦＦ」という。）を用いた。ＢＡＦＦは強力なＢ細胞増殖因子であり、ｃＧＶＨＤ患者では上昇し、疾患の重症度と相関することが分かっている。さらに、ｃＧＶＨＤマウスモデルでは、線維芽細胞網状細胞がＢＡＦＦの主要な産生因子であることが示されている。また、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０は、ＣｘＣケモカインファミリーの一員のサイトカインであり、各種細胞から分泌される。
このｃＧＶＨＤバイオマーカーとしては、まず、血清Ｂ細胞活性化因子（Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ、以下「ＢＡＦＦ」という。）を用いた。ＢＡＦＦは強力なＢ細胞増殖因子であり、ｃＧＶＨＤ患者では上昇し、疾患の重症度と相関することが分かっている。さらに、ｃＧＶＨＤマウスモデルでは、線維芽細胞網状細胞がＢＡＦＦの主要な産生因子であることが示されている。また、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０は、ＣｘＣケモカインファミリーの一員のサイトカインであり、各種細胞から分泌される。
【0178】
図２４は、健常人ドナー（Ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ、ｎ＝２）及びｃＧＶＨＤ患者（ｃＧＶＨＤ Ｐａｔｉｅｎｔ、ｎ＝７）の皮膚生検試料におけるＢＡＦＦの代表的なＩＨＣ染色の結果である。スケールバーは５０μｍ、倍率は２００倍である。
いずれも、ドナー、レシピエントの性別に関係なく、ｃＧＶＨＤ患者の皮膚血管内皮細胞のＩＨＣにて、ＢＡＦＦの免疫反応性が観察された。
いずれも、ドナー、レシピエントの性別に関係なく、ｃＧＶＨＤ患者の皮膚血管内皮細胞のＩＨＣにて、ＢＡＦＦの免疫反応性が観察された。
【0179】
次に、別のｃＧＶＨＤバイオマーカーとして、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０を用いた。ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣＲ３用のＴ－ヘルパータイプ１関連炎症性ケモカインで、ｃＧＶＨＤ診断及び重症度と相関している。
【0180】
図２５は、図２４と同じ患者の皮膚生検試料におけるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の代表的なＩＨＣ染色の結果である。スケールバーは５０μｍ、倍率は２００倍である。
ｃＧＶＨＤ皮膚試料から、血管内皮細胞上のＣＸＣＬ９とＣＸＣＬ１０の染色を検出した。
すなわち、ドナー、レシピエントの性別に関係なく、ｃＧＶＨＤ患者の皮膚血管内皮細胞のＩＨＣにて、ｃＧＶＨＤのマーカーの免疫反応性が観察された。
ｃＧＶＨＤ皮膚試料から、血管内皮細胞上のＣＸＣＬ９とＣＸＣＬ１０の染色を検出した。
すなわち、ドナー、レシピエントの性別に関係なく、ｃＧＶＨＤ患者の皮膚血管内皮細胞のＩＨＣにて、ｃＧＶＨＤのマーカーの免疫反応性が観察された。
【0181】
図２６は、健常人ドナー（Ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ、ｎ＝２）及びｃＧＶＨＤ患者（ｃＧＶＨＤ Ｐａｔｉｅｎｔ、ｎ＝７）の皮膚生検試料における血管内皮マーカーであるＣＤ３１及び筋線維芽細胞マーカーであるα－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（以下、「αＳＭＡ」という。）のＩＦの代表的な結果を示す。スケールバーは５０μｍ、倍率は２００倍である。
健康な皮膚試料と比較して、ｃＧＶＨＤ試料は、真皮血管内皮の周囲で筋線維芽細胞マーカーであるαＳＭＡの発現が増加しており、血管周囲の筋線維芽細胞の活性化と組織の線維化の発生を示していた。
これらの知見は、ｃＧＶＨＤの標的としての血管内皮細胞の可能性を強調するものであった。
健康な皮膚試料と比較して、ｃＧＶＨＤ試料は、真皮血管内皮の周囲で筋線維芽細胞マーカーであるαＳＭＡの発現が増加しており、血管周囲の筋線維芽細胞の活性化と組織の線維化の発生を示していた。
これらの知見は、ｃＧＶＨＤの標的としての血管内皮細胞の可能性を強調するものであった。
【0182】
次に、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する同種抗体が、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体を発現している細胞に対して細胞毒性を示すかどうかを分析した。
図２７は、ｃＧＶＨＤ患者（ｃＧＶＨＤ Ｐａｔｉｅｎｔ、ｎ＝７）の皮膚生検試料において、古典的補体経路マーカーであるＣ４ｄのＩＦの代表的な結果を示す。核はＤＡＰＩで染色した。スケールバーは５０μｍ、倍率は２００倍である。
結果として、古典的な補体経路のマーカーであるＣ４ｄが、ｃＧＶＨＤ皮膚試料の血管内皮細胞に局在していた。
図２７は、ｃＧＶＨＤ患者（ｃＧＶＨＤ Ｐａｔｉｅｎｔ、ｎ＝７）の皮膚生検試料において、古典的補体経路マーカーであるＣ４ｄのＩＦの代表的な結果を示す。核はＤＡＰＩで染色した。スケールバーは５０μｍ、倍率は２００倍である。
結果として、古典的な補体経路のマーカーであるＣ４ｄが、ｃＧＶＨＤ皮膚試料の血管内皮細胞に局在していた。
【0183】
次に、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体に対する自己抗体が補体制御細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ。以下、「ＣＤＣ」という。）を促進するか否かを分析した。
【0184】
図２８は、抗ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体抗体を用いたＣＤＣの解析結果を示す。抗ＤＢＹ／ＨＬＡクラスＩＩ複合体抗体を含むｃＧＶＨＤ血漿からの精製全ＩｇＧを、Ｍｏｃｋ、ＤＢＹ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、及び、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２の順に補体でインキュベートした後、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞と混合した。死細胞はフローサイトメトリーで評価した。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤで示した。ＭｏｃｋはｐＳＩベクターのみである。
結果として、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の発現量に応じて、補体依存性細胞傷害が発生した。具体的には、ＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２複合体を発現する細胞では死細胞が増加したが、ＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１複合体やＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１複合体では死細胞が増加しなかった。ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子のみを発現している細胞は死滅しなかった。
結果として、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の発現量に応じて、補体依存性細胞傷害が発生した。具体的には、ＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２複合体を発現する細胞では死細胞が増加したが、ＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１複合体やＤＢＹ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１複合体では死細胞が増加しなかった。ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子のみを発現している細胞は死滅しなかった。
【0185】
これらをまとめると、ｃＧＶＨＤの皮膚病変では、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は血管内皮に発現していた。実際に、血管内皮では、ｃＧＶＨＤ関連マーカーが発現していた。さらに、血管内皮では、ＢＡＦＦが発現し、Ｂ細胞の活性化に関連していると考えられた。
このため、血管内皮で、補体依存性細胞傷害が生じ、ｃＧＶＨＤの標的組織は血管内皮と示唆された。
このため、血管内皮で、補体依存性細胞傷害が生じ、ｃＧＶＨＤの標的組織は血管内皮と示唆された。
【0186】
（ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、ｃＧＶＨＤとＧＶＬ効果の共通抗原となる）
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹは、一部の白血病細胞にも発現している。抗Ｈ－Ｙ抗体の出現は造血器腫瘍の再発リスクを低下させ、移植片対白血病効果（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＧＶＬ）に関連する。
このため、白血病細胞においてＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が発現し、ＧＶＬの共通抗原となりうるか解析した。ここでは、本発明者らはＰＬＡを用いて白血病細胞がＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体化したＤＢＹを発現しているかどうかを調べた。
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹは、一部の白血病細胞にも発現している。抗Ｈ－Ｙ抗体の出現は造血器腫瘍の再発リスクを低下させ、移植片対白血病効果（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＧＶＬ）に関連する。
このため、白血病細胞においてＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が発現し、ＧＶＬの共通抗原となりうるか解析した。ここでは、本発明者らはＰＬＡを用いて白血病細胞がＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合体化したＤＢＹを発現しているかどうかを調べた。
【0187】
図２９は、白血病細胞株であるＨＥＬ、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１、ＫＨＭ－２Ｂ、ＫＯ５２、Ｒａｊｉ、及びＴＨＰ－１細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現をフローサイトメトリーで測定した結果である。各細胞は、アイソタイプコントロール（網掛けヒストグラム）及び抗ＨＬＡ－ＤＲ（淡色線）抗体で染色された。
【0188】
図３０は、白血病細胞株であるＨＥＬ、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１、ＫＨＭ－２Ｂ、ＫＯ５２、Ｒａｊｉ、及びＴＨＰ－１細胞におけるＤＢＹのｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析の結果である。棒グラフは、コントロールのＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現に対するＤＢＹのｍＲＮＡ発現を示す。ＤＢＹのｍＲＮＡ発現、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示された。
結果として、ＨＬＡ－ＤＲを発現する男性由来の白血病細胞株のうち、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１、ＫＨＭ－２Ｂ、ＫＯ５２、Ｒａｊｉ、ＴＨＰ－１細胞で同様のＤＢＹの発現レベルが検出された。
結果として、ＨＬＡ－ＤＲを発現する男性由来の白血病細胞株のうち、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１、ＫＨＭ－２Ｂ、ＫＯ５２、Ｒａｊｉ、ＴＨＰ－１細胞で同様のＤＢＹの発現レベルが検出された。
【0189】
次に、ＰＬＡを用いたＤＢＹ及びＨＬＡ－ＤＲの共局在解析を行った。
図３１は、ＰＬＡにより、白血病細胞株におけるＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在を可視化した結果である。白血病細胞株であるＫＯ５２（左側）及びＴＨＰ－１（右側）の結果を示す。スケールバーは２０μｍ、倍率は４００倍である。
結果として、小さなツブツブに見えるＰＬＡシグナルが、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在化により誘発されていた。すなわち、男性の白血病細胞株であるＫＯ５２、ＴＨＰ－１において、ＤＢＹは白血病細胞でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と共局在化した。なお、ＨＥＬ、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１、ＫＨＭ－２Ｂ、又はＲａｊｉ細胞は、ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子との間のＰＬＡシグナルを示さなかった。
図３１は、ＰＬＡにより、白血病細胞株におけるＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在を可視化した結果である。白血病細胞株であるＫＯ５２（左側）及びＴＨＰ－１（右側）の結果を示す。スケールバーは２０μｍ、倍率は４００倍である。
結果として、小さなツブツブに見えるＰＬＡシグナルが、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在化により誘発されていた。すなわち、男性の白血病細胞株であるＫＯ５２、ＴＨＰ－１において、ＤＢＹは白血病細胞でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と共局在化した。なお、ＨＥＬ、ＫａｓｕｍｉＡ－５４１、ＫＨＭ－２Ｂ、又はＲａｊｉ細胞は、ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子との間のＰＬＡシグナルを示さなかった。
【0190】
次に、本発明者の所属する自治医科大学病院で、２０２１年５月から２０２２年４月の間に診断された実際の男性白血病患者１４名の凍結保存ＢＭ試料について、ＰＬＡを用いたＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在解析を行った。これらの患者の背景を、下記の表９に示す。
【0191】
【表9】
【0192】
この表９において、「Ｂｌａｓｔｓ（％）」は、骨髄中の芽球の割合を示す。また、「ＨＬＡ－ＤＲ」は、発現をフローサイトメトリーで解析した。
「ＰＬＡ ｓｉｇｎａｌｓ」は、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在を可視化するためにＰＬＡを使用した結果である。後述するように、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在でＰＬＡシグナルが生じた。
いずれの患者も、白血病細胞におけるＹ染色体の消失を認めなかった。
「ＰＬＡ ｓｉｇｎａｌｓ」は、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在を可視化するためにＰＬＡを使用した結果である。後述するように、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲの共局在でＰＬＡシグナルが生じた。
いずれの患者も、白血病細胞におけるＹ染色体の消失を認めなかった。
【0193】
次に、白血病細胞でＨＬＡ－ＤＲの表面発現を示した１２人中７人の患者からＰＬＡシグナルを観察した。
図３２は、診断時の白血病患者のＢＭから凍結保存した単核球をＰＬＡに使用した。患者１（Ｐａｔｉｅｎｔ １）と患者２（Ｐａｔｉｅｎｔ ２）は、ＨＬＡ－ＤＲ陽性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された。上２枚の顕微鏡写真は、Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ染色であり、下２枚の蛍光顕微鏡写真はＰＬＡの結果である。核はＤＡＰＩで染色された。スケールバーは２０μｍであり、倍率は４００倍である。
このように、実際の白血病細胞の７例では、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲとが共局在していた。
図３２は、診断時の白血病患者のＢＭから凍結保存した単核球をＰＬＡに使用した。患者１（Ｐａｔｉｅｎｔ １）と患者２（Ｐａｔｉｅｎｔ ２）は、ＨＬＡ－ＤＲ陽性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された。上２枚の顕微鏡写真は、Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ染色であり、下２枚の蛍光顕微鏡写真はＰＬＡの結果である。核はＤＡＰＩで染色された。スケールバーは２０μｍであり、倍率は４００倍である。
このように、実際の白血病細胞の７例では、ＤＢＹとＨＬＡ－ＤＲとが共局在していた。
【0194】
これらの結果を総合すると、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹは、ｃＧＶＨＤとＧＶＬ効果の共通の標的である可能性があることが分かった。
すなわち、一部の男性の白血病細胞株であるＫＯ５２、ＴＨＰ－１では、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が形成された。
また、実際の男性白血病検体では、約半数の症例でＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が形成された。
このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、ＧＶＨＤとＧＶＬの共通抗原となる可能性があるといえる。
すなわち、一部の男性の白血病細胞株であるＫＯ５２、ＴＨＰ－１では、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が形成された。
また、実際の男性白血病検体では、約半数の症例でＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が形成された。
このため、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、ＧＶＨＤとＧＶＬの共通抗原となる可能性があるといえる。
【0195】
〔結論〕
データベースの解析より、Ｆ－ｔｏ－Ｍ移植では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２がｃＧＶＨＤのリスク因子として同定された。
ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩは全長で複合体を形成した。また、複合体を認識する抗体を有する症例は、ｃＧＶＨＤの発症率が高く、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は慢性ＧＶＨＤの標的抗原と考えられた。
ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成はＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ依存性であり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２で最も形成量が多く複合体形成がｃＧＶＨＤ発症に直結していた。
実際の皮膚病変では、複合体は血管内皮に発現し、ｃＧＶＨＤの標的部位は血管内皮であった。血管内皮では、補体依存性細胞傷害が生じていると示唆された。
ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、白血病細胞に発現しており、ｃＧＶＨＤとＧＶＬ効果の共通抗原となりうる可能性が考えられた。
データベースの解析より、Ｆ－ｔｏ－Ｍ移植では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２がｃＧＶＨＤのリスク因子として同定された。
ＤＢＹとＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩは全長で複合体を形成した。また、複合体を認識する抗体を有する症例は、ｃＧＶＨＤの発症率が高く、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は慢性ＧＶＨＤの標的抗原と考えられた。
ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成はＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ依存性であり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２で最も形成量が多く複合体形成がｃＧＶＨＤ発症に直結していた。
実際の皮膚病変では、複合体は血管内皮に発現し、ｃＧＶＨＤの標的部位は血管内皮であった。血管内皮では、補体依存性細胞傷害が生じていると示唆された。
ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体は、白血病細胞に発現しており、ｃＧＶＨＤとＧＶＬ効果の共通抗原となりうる可能性が考えられた。
【0196】
具体的には、本実施例では、ドナー・レシピエントの性別で層別化した患者群を分析し、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２がＦ－ｔｏ－ＭコホートにおけるｃＧＶＨＤのリスクに大きく影響することを見いだした。また、Ｍ－ｔｏ－Ｆコホートでは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１がｃＧＶＨＤと関連していることを示し、自己又は同種抗原／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体の形成がＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴに限定されないことが示唆された。この知見を裏付けるように、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩの発現は、女性のｃＧＶＨＤ患者の血管内皮細胞でも観察された。
【0197】
実際に、上述したように、ＨＬＡ－ＤＲアレルの中で、ＤＢＹと複合体を最も形成しやすいものはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２で、最も形成しにくいものはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１であることが明らかとなった。しかしながら、他のＨ－Ｙ抗原とＨＬＡアレルの関係ではこの傾向は当てはまらなかった。
これらのＨＬＡ－ＤＲアレルはいずれもｃＧＶＨＤの発症に関与することが、上述の全国規模のデータベースを基にした解析で明らかとなり、この結果はＨ－Ｙ抗原の中でＤＢＹがｃＧＶＨＤの病態機序に最も強く関与していることを示していた。
これらのＨＬＡ－ＤＲアレルはいずれもｃＧＶＨＤの発症に関与することが、上述の全国規模のデータベースを基にした解析で明らかとなり、この結果はＨ－Ｙ抗原の中でＤＢＹがｃＧＶＨＤの病態機序に最も強く関与していることを示していた。
【0198】
Ｂ細胞異常と同種抗体産生は、ｃＧＶＨＤの病態における重要な特徴である。しかし、従来、細胞内に局在する同種抗原が、どのようにして、どこで、細胞表面に異所的に出現し、抗体を介した反応を引き起こすかは、十分に理解されていなかった。
これに対して、本実施例では、女性ドナーから男性レシピエントへの移植後にｃＧＶＨＤを発症した患者の皮膚病理を解析したところ、血管内皮上にＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が出現した。この結果もＤＢＹがｃＧＶＨＤの病態機序に重要であることを示している。すなわち、特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがｃＧＶＨＤ発症組織の血管内皮表面に全長ＤＢＹ抗原を輸送し、自己抗体を誘導してＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後のｃＧＶＨＤの重要なリスク因子となることが明らかとなった。
また、一部の白血病細胞ではＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が発現しており、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体がｃＧＶＨＤとＧＶＬ効果の共通の標的として機能している可能性が示された。
これに対して、本実施例では、女性ドナーから男性レシピエントへの移植後にｃＧＶＨＤを発症した患者の皮膚病理を解析したところ、血管内皮上にＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が出現した。この結果もＤＢＹがｃＧＶＨＤの病態機序に重要であることを示している。すなわち、特定のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩアレルがｃＧＶＨＤ発症組織の血管内皮表面に全長ＤＢＹ抗原を輸送し、自己抗体を誘導してＦ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴ後のｃＧＶＨＤの重要なリスク因子となることが明らかとなった。
また、一部の白血病細胞ではＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体が発現しており、ＤＢＹ／ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体がｃＧＶＨＤとＧＶＬ効果の共通の標的として機能している可能性が示された。
【0199】
また、従来、ｃＧＶＨＤが内皮細胞傷害を引き起こす最初のトリガーは未解明であった。
これに対して、本実施例においては、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹが血管内皮細胞表面に出現し、自己抗体の標的として働くことを明らかにした。さらに、ｃＧＶＨＤ患者の同種抗体は、ｃＧＶＨＤリスクＨＬＡアレルと複合化したＤＢＹを発現する細胞に対してＣＤＣを示すことがわかった。補体の関与は、血清Ｃ３及びＣ４レベルの高さが活動性ｃＧＶＨＤと関連することを示した以前の研究によって裏付けられている。ＤＢＹタンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体に対する同種抗体がｃＧＶＨＤ発症前に検出されたことから、血管内皮がｃＧＶＨＤの発症における最初の標的である可能性がある。ＣＤＣは微小血管の減少を誘発する可能性がある。その結果、低酸素が線維化を引き起こすと考えられる。
さらに、ｃＧＶＨＤの血管内皮細胞は、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０を発現していた。このため、血管内皮細胞が抗原提示細胞として働き、同種反応性Ｂ細胞を引きつけ活性化し、ＩＬ－６を産生させ、それによって線維化を引き起こす可能性がある。
これに対して、本実施例においては、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子と複合化したＤＢＹが血管内皮細胞表面に出現し、自己抗体の標的として働くことを明らかにした。さらに、ｃＧＶＨＤ患者の同種抗体は、ｃＧＶＨＤリスクＨＬＡアレルと複合化したＤＢＹを発現する細胞に対してＣＤＣを示すことがわかった。補体の関与は、血清Ｃ３及びＣ４レベルの高さが活動性ｃＧＶＨＤと関連することを示した以前の研究によって裏付けられている。ＤＢＹタンパク質及びＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が結合した複合体に対する同種抗体がｃＧＶＨＤ発症前に検出されたことから、血管内皮がｃＧＶＨＤの発症における最初の標的である可能性がある。ＣＤＣは微小血管の減少を誘発する可能性がある。その結果、低酸素が線維化を引き起こすと考えられる。
さらに、ｃＧＶＨＤの血管内皮細胞は、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０を発現していた。このため、血管内皮細胞が抗原提示細胞として働き、同種反応性Ｂ細胞を引きつけ活性化し、ＩＬ－６を産生させ、それによって線維化を引き起こす可能性がある。
【0200】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【0201】
本発明によれば、Ｆ－ｔｏ－Ｍ ＨＣＴにて、ｃＧＶＨＤ特異的な同種抗体を検出することで、ｃＧＶＨＤの早期診断の提供が期待でき、産業上利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】