特開 2024-163697 アミロイド線維検出プローブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024163697

(43)【公開日】2024-11-22

(54)【発明の名称】アミロイド線維検出プローブ

(51)【国際特許分類】

   C07F 5/02 20060101AFI20241115BHJP

   A61K 31/69 20060101ALI20241115BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241115BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20241115BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241115BHJP

   A61P 25/28 20060101ALN20241115BHJP

   A61P 25/16 20060101ALN20241115BHJP

【ＦＩ】

C07F5/02 C CSP

A61K31/69

A61P43/00

G01N33/533

G01N33/53 D

A61P25/28

A61P25/16

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023079529

(22)【出願日】2023-05-12

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】白木 琢磨

(72)【発明者】

【氏名】櫻井 一正

【テーマコード（参考）】

4C086

4H048

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA43

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA16

4H048AA01

4H048AA03

4H048AB20

4H048VA12

4H048VA20

4H048VA22

4H048VA30

4H048VA77

4H048VB10

(57)【要約】      （修正有）

【課題】体内で生成したアミロイド線維をｉｎ ｖｉｖｏで体外から観測する有用な技術を提供する。
【解決手段】特定のクルクミン誘導体、例えば下式で示された誘導体を含むアミロイドβアミロイド繊維に結合するアミロイド線維検出プローブ。

【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（２）式から（８）式、（１０）式から（１４）式で表される構造を有するクルクミン誘導体。

【化101】

【化102】

【化103】

【化104】

【化105】

【化106】

【化107】

【化108】

【化109】

【化110】

【化111】

【化112】

【請求項2】

（４）式、（５）式、（６）式、（１０）式、および（１４）式で示されたクルクミン誘導体を少なくとも１種含むアミロイドβアミロイド繊維に結合するアミロイド線維検出プローブ。

【化114】

【化115】

【化116】

【化117】

【化118】

【請求項3】

前記アミロイド線維検出プローブ中の少なくとも１つの炭素が同位体修飾されている請求項１に記載されたアミロイド線維検出プローブ。

【請求項4】

（３）式、（４）式、（７）式および（８）式で示されたクルクミン誘導体を少なくとも１種含むαシヌクレインアミロイド繊維に結合するアミロイド線維検出プローブ。

【化119】

【化120】

【化121】

【化122】

【請求項5】

前記アミロイド線維検出プローブ中の少なくとも１つの炭素が同位体修飾されている請求項３に記載されたアミロイド線維検出プローブ。

【請求項6】

請求項１乃至４の何れか一の請求項に記載されたアミロイド線維検出プローブを含む中性子線治療用組成物。

【請求項7】

アミロイド線維に選択的に結合し、構造中にホウ素を有する化合物を含有する中性子線治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は体内のアミロイド線維を体外から検出および観測するためのプローブ化合物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

様々な種類のタンパク質に由来する不溶性アミロイド線維を原因とする疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病等３０種以上が報告されている。しかし、これらの病気の詳細な病理学的メカニズムはまだ判っていない。

【0003】

治療の１つ方法として、抗体を用いた方法が考えられている。例えば、ベータ－アミロイド（Ａβ）ペプチドの凝集形態に対して選択的に結合するヒトモノクロナール抗体としてアデュカヌマブ（ＢＩＩＢ０３７）が知られており、このようなモノクロナール抗体の投与方法を特定することでアミロイド班（アミロイド線維）を減少させることができるという報告もある（特許文献１）。

【0004】

一方、アミロイド線維の検出方法としては、チオフラビン蛍光法、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄを用いた染色、ＦＳＢを用いた染色、及びアミロイド線維を認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡといった方法が示されている（特許文献２）。

【0005】

また、ｉｎ ｖｉｖｏでアミロイド線維の沈着を検出する方法としては、（９９）式で示される化合物中の炭素原子に放射標識した化合物を、ガンマ線画像法、磁気共鳴画像法または磁気共鳴分光法によって検出する方法が提案されている（特許文献３）。

【0006】

【化1】

【0007】

［式中、
Ｒ^１は、水素、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＲ、－ＯＣＨ２ＯＲ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシまたはハロであり、ここで、Ｒ^１の原子の１つ以上は、放射標識した原子であってよく；
Ｒは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、ここで、炭素原子の１つ以上は、放射標識した原子であってよく；
Ｒ^２は、水素、非放射性ハロまたは放射性ハロであり；
Ｒ^３は、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルまたはＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり；
Ｒ^４は、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルまたはＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり、ここで、Ｒ^２が水素または非放射性ハロである場合、そのアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、放射性炭素を含んでいるか、あるいは放射性ハロで置換されており；
但し、Ｒ^１が水素または－ＯＨであり、Ｒ^２が水素であり、Ｒ^４が－^１１ＣＨ_３である場合、Ｒ^３はＣ_２～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルまたはＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり；
さらに、Ｒ^１が水素であり、Ｒ^２が水素であり、Ｒ^４が－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ ^１８Ｆである場合、Ｒ_３はＣ_２～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルまたはＣ_２～Ｃ_６アルキニルである］の化合物、またはその化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０２３－１１００２号公報

【特許文献2】特開２０２０－１８８７００号公報

【特許文献3】特表２００６－５２２１０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

体内で生成したアミロイド線維をｉｎ ｖｉｖｏで観測することはアミロイド線維に係る病気に対しては、まず必要な技術である。その点特許文献２の方法は、一定の効果を示すものである。しかし、ガンマ線画像法等は装置自体が巨大となる。より簡便な装置であってもｉｎ ｖｉｖｏでアミロイド線維の観察ができるものがあれば、診断の際に非常に貢献すると考えられる。また、観察と同時に治療の一環を担うことができれば、さらに効果的であるといえる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、新規クルクミン誘導体を提供するものであり、そのクルクミン誘導体を有するアミロイド線維に選択的に結合し、赤外線によって発光することで、アミロイド線維を観察できるプローブを提供するものである。

【0011】

具体的に本発明に係るクルクミン誘導体は、（２）式から（８）式、（１０）式から（１４）式で表される構造を有することを特徴とする。

【0012】

【化2】

【0013】

【化3】

【0014】

【化4】

【0015】

【化5】

【0016】

【化6】

【0017】

【化7】

【0018】

【化8】

【0019】

【化9】

【0020】

【化10】

【0021】

【化11】

【0022】

【化12】

【0023】

【化13】

【0024】

また、本発明に係るアミロイドβアミロイド線維に結合するアミロイド線維検出プローブは、（４）式、（５）式、（６）式、（１０）式、および（１４）式で示されたクルクミン誘導体を少なくとも１種含む。

【0025】

また、本発明に係るαシヌクレインアミロイド線維に結合するアミロイド線維検出プローブは、（３）式、（４）式、（７）式および（８）式で示されたクルクミン誘導体を少なくとも１種含む。

【発明の効果】

【0026】

本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、アミロイド線維に選択的に結合し、赤外線によって発光するので、皮膚を通してもその発光を検出することができる。したがって、赤外線発光装置と赤外線カメラによってアミロイド線維の分布や量を容易に推測することができる。また、近赤外での発光を継続することでアミロイド線維自体を崩壊させる可能性もある。

【0027】

また、本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、比較的容易に構造中に^１３ＣあるいはＦを含ませることができるので、核磁気共鳴装置(MRI装置）により高解像度にアミロイド線維を断層撮影することもできる。

【0028】

また、本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、構造中にホウ素を含有させるので、結合したアミロイド線維に対して中性子線捕捉療法ができ、アミロイド線維を分解できる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】本発明に係るクルクミン類似体の生合成の概念を示す図である。

【図2】クルクミン類似体を生合成する際の前駆物質を示す図である。

【図3】本発明に係るＢＦ２化されたアクルクミン類似体の構造を示す図である。

【図4】本発明に係るＢＦ２化されたアクルクミン類似体の構造を示す図である。

【図5】本発明に係るＢＦ２化されたアクルクミン類似体の構造を示す図である。

【図6】アミロイド線維検出プローブの蛍光発光特性を示す図である。

【図7】アミロイドβアミロイド線維に結合している様子を示す図である。

【図8】ＢＦ２化されたアクルクミン類似体のうちアミロイドβアミロイド線維に結合するものを選別する様子を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真である。

【図9】ＢＦ２化されたアクルクミン類似体のうちシヌクレインアミロイド線維に結合するものを選別する様子を示すＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥの写真である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下に本発明に係るアミロイド線維検出プローブについて図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

【0031】

本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、クルクミンから得られる誘導体であり一般には（１００）式の構造を有している。

【0032】

【化14】

【0033】

配位の番号はクルクミンの基本骨格の番号を示している。１位を中心として左右のベンゼン環に結合する官能基をＲｐ１および官能基Ｒｐ２とした。それぞれの官能基に特に制限はなく、官能基をＲｐ１および官能基Ｒｐ２はそれぞれ複数の官能基であってもよい。また、官能基をＲｐ１および官能基Ｒｐ２が同じであることを妨げない。以後、説明のために１位の位置を中心として右側を右サイト、左側を左サイトと呼ぶ。

【0034】

本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、この構造を有するものの中で、赤外域での蛍光発光を有し、アミロイド線維への結合力を有するものである。これらのアミロイド線維検出プローブは生合成によって作製した。生合成は、大腸菌にクルクミン合成経路に係る酵素遺伝子を導入し、それを誘導体の材料となる前駆物質を含む培地で培養することで合成させる。このようにすると、官能基の異なる誘導体を容易に得ることができる。また、特定の炭素を安定同位体に置き換える。

【0035】

図１に生合成の概略を示す。クルクミンを合成する酵素遺伝子（４ＣＬ、ＤＣＳ、ＣＵＲＳ１）を導入したプラスミドを大腸菌に導入する。導入された大腸菌を「ｍｕｔ－ｅｃｏｉｌ」とした。この大腸菌をクルクミンの前駆物質となる２種の化合物（それぞれ前駆物質Ｐ１、前駆物質Ｐ２とする。）を含む培地中で培養する。この２種の前駆物質は、フェニルプロピオン酸に官能基が結合したもので、図１では、Ｒｐ１およびＲｐ２とした。この官能基に特に制限はない。

【0036】

大腸菌ｍｕｔ－ｅｃｏｌｉは、これらの前駆物質からクルクミン類似体を合成する。この際、前駆物質同士の区別はないので、前駆物質Ｐ１が左右のサイトに使われた物（ｈｏｍｏ－Ｐ１）、前駆物質Ｐ１およびＰ２が左右のサイトに使われた物（ｈｅｔｅｒｏ－Ｐ１＿Ｐ２）、前駆物質Ｐ２が左右のサイトに使われた物（ｈｏｍｏ－Ｐ２）の３種の類似体を得ることができる。

【0037】

例えば、前駆物質Ｐ１および前駆物質Ｐ２を共に（１００）式のヒドロキシメトキシフェニルプロピオン酸にすれば、合成される３種は共にクルクミンとなる。

【0038】

【化15】

【0039】

このようにして得られたクルクミン誘導体は、ケトエノール互変異性によって、（１０１）式のようにケト型とエノール型で互変異する。

【0040】

【化16】

【0041】

そこで、２位と２’位の酸素原子同士をジフルオロボロンで結合させる。これを「ＢＦ２化」と呼ぶ。結果、（１０２）式のようにＢＦ２化されたクルクミンが生成される。

【0042】

【化17】

【0043】

ＢＦ２化されたクルクミンは（１０２）式で示した互変異がなくなり、安定した構造で存在するＢＦ２化されたクルクミンは、蛍光発光の特性を有する。そして、左右のサイトのベンゼン環に結合させる官能基を変えることで赤外帯域での蛍光発光を観測に十分な強度まで高めることができる。

【0044】

さらに、左右のサイトのベンゼン環へ結合させる官能基を調整することで、アミロイド線維へ特異的な結合力を付与することができる。

【0045】

また、培養の際の培地に^１３Ｃグルコースを混入させることで、１位（１００式参照）の炭素を安定同位体に修飾することもできる。^１３Ｃがあれば、ＭＲＩでイメージングすることができ、脳内のアミロイド線維の詳細な撮影が可能である。また、ＢＦ２化されているので、骨格内にＦを有する。したがって、Ｆをつかった核磁気共鳴のイメージングも可能である。

【0046】

このように、本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、クルクミン誘導体からなり、赤外域での蛍光発光能を有するので、皮膚下数ｃｍの存在を赤外線カメラなどで観察することができる。

【0047】

また、本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、ＢＦ２化したために、骨格内にホウ素を含む。ホウ素クラスターが中性子線捕捉療法に使われるが、ホウ素クラスターをいかにして標的に届けるかが課題となっている。しかし、本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、アミロイド線維に結合する上に、ホウ素を骨格中に有している。したがって、赤外域での蛍光発光によってアミロイド線維の位置を特定すると同時に中性子線照射の標的とすることができ、中性子線捕捉療法用組成物として用いることができる。

【実施例0048】

以下の手順でクルクミン類似体を産生および精製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にクルクミン合成経路の３つの酵素遺伝子４ＣＬ、ＤＣＳ、ＣＵＲＳ１をプラスミドで導入した。

【0049】

ＴＢ培地で３７℃で１晩振盪培養後、培養温度を２７℃に下げイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、終濃度１ｍＭ）を添加し、さらに１晩振盪培養した。１０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解した前駆物質を培地の１／１０００量添加しさらに２４時間培養した。菌体を遠心で回収し、ＰＢＳ（－）で溶解後－３０℃で保存した。培養上清は４℃で保存した。

【0050】

菌体から脂溶性代謝物をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出後、吹付け乾燥した。メタノールで溶解しＴＬＣでクルクミン類似体の存在を確認後シリカカラム（１０ｍＬ）を用いて精製した。溶出フラクションを１ｍＬずつ回収し、すみやかに乾燥した。メタノールで懸濁後、ＴＬＣによりクルクミン類似体の存在するフラクションを同定し回収した。この時点で吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。

【0051】

培養上清に含まれる脂溶性物質をＣ１８ ｓｅｐ－ｐａｋカラムを用いた固相抽出により溶出した後、吹付け乾燥し、メタノールで懸濁した。その後、菌体由来のクルクミン類似体同様シリカカラムで精製した。

【0052】

用いた前駆物質を図２に示す。用いた前駆体物質は８つであり、前駆体物質－８、前駆体物質－１３、前駆体物質－１４、前駆体物質－１５、前駆体物質－１８、前駆体物質－２２、前駆体物質ｆｅｒｕｌａｔｅ、前駆体物質ｃｏｕｍａｌａｔｅである。前駆体物質ｆｅｒｕｌａｔｅおよび前駆体物質ｃｏｕｍａｌａｔｅはそれぞれヒドロキシメトキシフェニルプロピオン酸と、メトキシフェニルプロピオン酸である。これらを用いてクルクミン類似体を産生した。表１に使用した前駆物質（それぞれ第１前駆物質、第２前駆物質とした。）とクルクミン類似体のサンプル名およびサンプル番号を示す。

【0053】

【表1】

【0054】

なお、ｃｕｒｕ８およびｃｕｒｕ９は同一物質で産生日が異なるものである。また、ｃｕｒｕ１４とｃｕｒｕ１５は大腸菌の中（ｐｐｔ）と外（上澄み中：ｓｕｐ）から得たものであって、同一物質であった。

【0055】

＜クルクミン類似体のＢＦ２修飾＞
表１のクルクミン類似体をガラスバイアルに移し、スターラーバーを入れた後に完全に乾燥した後に密閉した。Ｎ２を充満したシリンジをバイアルに刺し、バイアル内の酸素、水蒸気をＮ２で置き換えた。前日よりモレキュラーシーブにより脱水したジクロロメタン（ＤＣＭ）２５０μＬをスターラーで撹拌しながらバイアルに注入しクルクミン類似体を完全に溶解した。ＤＣＭと１：１で混合した三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体を２５０μＬをスターラーで撹拌しながらゆっくりと加え室温で２時間以上放置した。

【0056】

反応後乾燥およびジエチルエーテルによる洗浄を繰り返し、未反応の三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体を取り除いた。完全に乾燥した後、メタノールで懸濁しＰＦＴＥフィルターでろ過後４℃で保存した。この時点で吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。ＢＦ２化したクルクミン類似体を表２に示す。また、それぞれの化合物の構造を図３から図５示す。また、化合物１～化合物１５の構造はそれぞれ（１）式～（１５）式で表されている。なお、化合物１はクルクミンそのものであり、（１０３）式と同じものである。

【0057】

【表2】

【0058】

＜発光特性＞
ＢＦ２化されたクルクミン類似体はＢＦ２化される前と比較して発光特性が変化する。特に赤外領域での発光が高くなる。図６には、化合物１（クルクミン）とｃｕｒｕ１（ＢＦ２化されるまえのクルクミン自体）の場合の発光特性を示す。図６（ａ）はｃｕｒｕ１、図６（ｂ）は化合物１である。

【0059】

それぞれのグラフを参照して、横軸は励起光波長（ｎｍ）であり、縦軸は発光強度（無単位）である。また、励起光波長毎に発光した蛍光の波長を棒グラフの上に縦の数字で示した。

【0060】

波長６３５ｎｍで励起した場合、ＢＦ２化していないｃｕｒｕ１はほとんど蛍光発光していないが、ＢＦ２化したクルクミン類似体である化合物１では、７００ｎｍという赤外領域で蛍光発光が確認された。これは他の化合物２乃至１５においても同様に、赤外領域で蛍光発光を確認できた。

【0061】

＜アミロイド線維への結合＞
アミロイドβの産生機構は以下のように考えられている。アミロイドβはアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）からプロテアーゼによって切断されることにより産生される。ＡＰＰがαセクレターゼで切断されるとアミロイドβはつくられない。一方、βセクレターゼ（図左側→）で切断されるとその後γセクレターゼで切断され、アミロイドβが産生される。γセクレターゼの構成要素がプレセニリン（ＰＳ２）で、γセクレターゼ活性を調節している。

【0062】

今回家族性アルツハイマー病患者で見つかったＡＰＰの変異体とＰＳ２の変異体を細胞に共発現し、アミロイドβの産生を確認した。なお、ＡＰＰを発現しないとアミロイドβは産生されなかったことを確認している。

【0063】

図７には、その例を示す。図７（ａ）は、ＡＰＰの変異体とＰＳ２の変異体を共発現させた細胞の抽出物を電気泳動し、抗アミロイドβ抗体（図中では「ａｎｔｉ－Ａβ」と記した。）で標識したものである。アミロイドβオリゴマーがおよそ４０ｋＤａあたりに確認された。

【0064】

細胞の抽出物に化合物１０（ｈｅｔｅｒｏ－１３－１４－ＢＦ２）を接触させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥした結果が図７（ｂ）である。縦軸は質量（ｋＤａ）であり、横軸はサンプル種を示す。ＡＰＰ／ＰＳ２抽出物１０μＬに対して、化合物１０をそれぞれ０，２、４、６、８μＭの濃度で接触させたところ、電気泳動と同じ質量箇所に濃度依存的に発光が確認された。以上の事から、化合物１０はアミロイドβに結合していることが確認できた。

【0065】

図８は、その他の化合物で同様の実験を行った結果を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、化合物４、化合物５、化合物６、化合物１０、化合物１４、化合物１５（なお、化合物１４と化合物１５は同一物質）は、アミロイドβに対して結合能を有することが認められた。

【0066】

図９はパーキンソン病の原因と考えられているαシヌクレインアミロイド線維に対する各化合物の結合を見たＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥの結果である。これを見ると化合物３、化合物４、化合物７、化合物８、化合物９（なお、化合物８と化合物９は同一物質）がαシヌクレインアミロイド線維に対して結合しているのがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0067】

本発明に係るアミロイド線維検出プローブは、アミロイド線維に特異的に結合し、体内で赤外光を発光するため、体外からそれを非侵襲で観測できるるので、アミロイド線維の検出に大いに有効である。また、本発明に係るアミロイド線維検出プローブは構造中に構造中に^１３Ｃ，Ｆで修飾することが出来、核磁気共鳴イメージング等での検出も可能である。さらに構造中にホウ素を有するので、中性子線捕捉療法用組成物としても利用することができ、中性子線でアミロイド線維を破壊できる可能性がある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】