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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024016469
(43)【公開日】2024-02-07
(54)【発明の名称】ＡＴＰ産生促進剤、およびミトコンドリア活性化剤
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20240131BHJP
A61K 36/76 20060101ALI20240131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240131BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20240131BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240131BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240131BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A61K36/76
A61P43/00 107
A61K8/9789
A61Q19/00
A61Q19/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022118619
(22)【出願日】2022-07-26
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】矢崎 友章
【テーマコード（参考）】
4B018
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018MD61
4B018ME10
4B018ME14
4B018MF01
4C083AA111
4C083EE12
4C088AB12
4C088AC05
4C088AC06
4C088BA08
4C088CA03
4C088NA14
4C088ZB22
4C088ZC52
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するＡＴＰ産生促進剤。
【請求項2】
西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＴＰ産生促進剤、およびミトコンドリア活性化剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ミトコンドリアは、細胞小器官の一つであり、電子伝達系において酸素を消費してＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を産生している。ＡＴＰは、生物が活動するためのエネルギーの貯蔵、放出を担う化合物であり、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。また、機能の低下した細胞や老化した細胞は、ＡＴＰ量が減少することが知られており、ＡＴＰの産生促進、また、ＡＴＰを産生するミトコンドリアの活性化は、細胞の機能向上、老化の防止・改善等のために重要である。
特許文献１には、酵母エキスを有効分とする筋肉細胞のＡＴＰ産生促進剤、特許文献２には、エルゴチオネインを有効成分とするＡＴＰ産生促進剤、特許文献３にはスフィンゴミエリンを有効成分とするミトコンドリア機能向上剤が提案されている。
特許文献１には、酵母エキスを有効分とする筋肉細胞のＡＴＰ産生促進剤、特許文献２には、エルゴチオネインを有効成分とするＡＴＰ産生促進剤、特許文献３にはスフィンゴミエリンを有効成分とするミトコンドリア機能向上剤が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００１－１０９４７号公報
【特許文献2】特開２００３－２３１６２６号公報
【特許文献3】特開２０１１－１５７３２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、新規なＡＴＰ産生促進剤、およびミトコンドリア活性化剤を提供することを課題とする。（以下、本発明のＡＴＰ産生促進剤とミトコンドリア活性化剤とをまとめて、本発明の剤ともいう。）
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の課題を解決するための手段は、次のとおりである。
１．西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するＡＴＰ産生促進剤。
２．西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤。
１．西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するＡＴＰ産生促進剤。
２．西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤。
【発明の効果】
【0006】
本発明の剤により、ＡＴＰの産生を促進することができ、また、ミトコンドリアを活性化することができた。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】実施例におけるＡＴＰ産生量測定の結果を示すグラフ。
【図2】実施例における細胞増殖量測定の結果を示すグラフ。
【図3】実施例におけるＡＴＰ産生量／細胞増殖量の結果を示すグラフ。
【図4】実施例におけるミトコンドリア活性測定の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明は、西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するＡＴＰ産生促進剤とミトコンドリア活性化剤とに関する。
【0009】
・西洋ヤナギ抽出物
西洋ヤナギ（Ｓａｌｉｘ ｓｐ．）は、ヤナギ科ヤナギ属の植物である。西洋ヤナギは、鎮痛作用、解熱作用等を有するとして古代より利用されている薬用植物である。
西洋ヤナギの抽出部位は、特に制限されず、例えば、樹皮、葉、枝、幹、根等が挙げられ、好ましくは樹皮である。
西洋ヤナギ（Ｓａｌｉｘ ｓｐ．）は、ヤナギ科ヤナギ属の植物である。西洋ヤナギは、鎮痛作用、解熱作用等を有するとして古代より利用されている薬用植物である。
西洋ヤナギの抽出部位は、特に制限されず、例えば、樹皮、葉、枝、幹、根等が挙げられ、好ましくは樹皮である。
【0010】
西洋ヤナギ抽出物を得るための抽出溶媒は、特に制限されず、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、テトラヒドロフランやジエチルエーテルなどのエーテル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチルや蟻酸エチルなどのエステル類、ヘキサン、水等を使用することができ、各種の抽出溶媒を混合して用いることもできる。例えば、水とエタノールを含む含水エタノールによる抽出溶媒を用いることができる。
抽出方法は、特に制限されないが、二相溶媒分配法や分配高速クロマトグラフィー法を用いる方法が好ましい。抽出温度は、通常、０～１００℃の範囲内であり、５～５０℃であることが好ましい。抽出溶媒量は、被抽出物に対して１～１００（ｗ／ｗ）倍、好ましくは５～１０（ｗ／ｗ）倍である。また、抽出時にタンパク分解酵素を加えて加水分解を行ってもよい。
抽出方法は、特に制限されないが、二相溶媒分配法や分配高速クロマトグラフィー法を用いる方法が好ましい。抽出温度は、通常、０～１００℃の範囲内であり、５～５０℃であることが好ましい。抽出溶媒量は、被抽出物に対して１～１００（ｗ／ｗ）倍、好ましくは５～１０（ｗ／ｗ）倍である。また、抽出時にタンパク分解酵素を加えて加水分解を行ってもよい。
【0011】
抽出物は、公知の方法により、精製することができる。例えば、不溶物を濾過、遠心分離、デカンテ－ション等により除去した後、必要に応じて脱色、脱臭の目的で活性炭、活性白土、シリカゲル、活性アルミナ合成樹脂等の吸着剤や、溶剤分画、逆浸透膜、イオン交換体等によって分画、精製、濃縮することができる。
得られた抽出物は、抽出エキスのまま、あるいは、抽出エキスを減圧濃縮、スプレ－ドライまたは凍結乾燥等の方法で粉末化したものを使用することができる。
例えば、インデナジャパン株式会社から、西洋ヤナギの樹皮を含水エタノールで抽出したエキス乾燥品（セイヨウヤナギカンソウエキス１５％）が市販されていて、これを使用することができる。
得られた抽出物は、抽出エキスのまま、あるいは、抽出エキスを減圧濃縮、スプレ－ドライまたは凍結乾燥等の方法で粉末化したものを使用することができる。
例えば、インデナジャパン株式会社から、西洋ヤナギの樹皮を含水エタノールで抽出したエキス乾燥品（セイヨウヤナギカンソウエキス１５％）が市販されていて、これを使用することができる。
【0012】
本発明の剤は、西洋ヤナギ抽出物を有効成分として含有するものであり、西洋ヤナギ抽出物そのもの、または他の化合物と混合した組成物として、食品、飲料、サプリメント等の健康食品、医薬品、化粧品等として使用することができる。
食品としては、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等とすることができる。飲料としては、例えば、清涼飲料、果実飲料、乳清飲料、アルコール飲料等に配合することができる。本発明の剤を飲食品や化粧料等に配合する場合、その配合量は、剤形、使用目的を考慮して適宜調整できるが、その配合率は、抽出物として、好ましくは０．０００１質量％以上５０質量％以下であり、より好ましくは０．００１質量％以上１０質量％以下である。
食品としては、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等とすることができる。飲料としては、例えば、清涼飲料、果実飲料、乳清飲料、アルコール飲料等に配合することができる。本発明の剤を飲食品や化粧料等に配合する場合、その配合量は、剤形、使用目的を考慮して適宜調整できるが、その配合率は、抽出物として、好ましくは０．０００１質量％以上５０質量％以下であり、より好ましくは０．００１質量％以上１０質量％以下である。
【0013】
サプリメントや医薬品とする場合、形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。この際、担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等を用いることができる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することもできる。
【実施例0014】
（１）細胞培養
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）で３７℃、５％ＣＯ２下で培養したものを使用した。
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）で３７℃、５％ＣＯ２下で培養したものを使用した。
【0015】
（２）ＡＴＰ産生量測定
ＨＥＫ２９３細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＥＭ培地で懸濁し、９６ウエルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、５μＭ ＦＣＣＰ（ａｂｃａｍ）と西洋ヤナギ抽出物（インデナジャパン株式会社、セイヨウヤナギカンソウエキス１５％、１０μｇ／ｍＬ）を添加した。なお、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）は、脱共役剤であり、ＦＣＣＰの存在下では、ミトコンドリアの電子伝達系の反応は進行するが、ＡＴＰは合成されなくなる。
さらに２４時間後、ＡＴＰ産生量をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて測定した。また、西洋ヤナギ抽出物を添加しない以外は同様にしてコントロール、ＡＴＰ産生亢進作用が認められるとして報告のあるインドール化合物のＭａｉｔｏｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ５（ナミキ商事株式会社、５μＭ）を添加してポジティブコントロールとした。コントロールの結果を１．０として規格化したＡＴＰ産生量を図１に示す。
ＨＥＫ２９３細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＥＭ培地で懸濁し、９６ウエルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、５μＭ ＦＣＣＰ（ａｂｃａｍ）と西洋ヤナギ抽出物（インデナジャパン株式会社、セイヨウヤナギカンソウエキス１５％、１０μｇ／ｍＬ）を添加した。なお、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）は、脱共役剤であり、ＦＣＣＰの存在下では、ミトコンドリアの電子伝達系の反応は進行するが、ＡＴＰは合成されなくなる。
さらに２４時間後、ＡＴＰ産生量をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて測定した。また、西洋ヤナギ抽出物を添加しない以外は同様にしてコントロール、ＡＴＰ産生亢進作用が認められるとして報告のあるインドール化合物のＭａｉｔｏｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ５（ナミキ商事株式会社、５μＭ）を添加してポジティブコントロールとした。コントロールの結果を１．０として規格化したＡＴＰ産生量を図１に示す。
【0016】
（３）細胞増殖測定
ＨＥＫ２９３細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＥＭ培地で懸濁し、９６ウエルブラックプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、５μＭ ＦＣＣＰ（ａｂｃａｍ）及び西洋ヤナギ抽出物（インデナジャパン株式会社、セイヨウヤナギカンソウエキス１５％、１０μｇ／ｍＬ）を添加した。
さらに２４時間後、細胞増殖能をＣｙＱＵＡＮＴＴＭ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて測定した。また、西洋ヤナギ抽出物を添加しない以外は同様にしてコントロール、ＡＴＰ産生亢進作用が認められるとして報告のあるインドール化合物のＭａｉｔｏｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ５（ナミキ商事株式会社、５μＭ）を添加してポジティブコントロールとした。コントロールの結果を１．０として規格化した細胞増殖量と、ＡＴＰ産生量／細胞増殖量の結果を、それぞれ図２、３に示す。
ＨＥＫ２９３細胞を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＥＭ培地で懸濁し、９６ウエルブラックプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養２４時間後に、５μＭ ＦＣＣＰ（ａｂｃａｍ）及び西洋ヤナギ抽出物（インデナジャパン株式会社、セイヨウヤナギカンソウエキス１５％、１０μｇ／ｍＬ）を添加した。
さらに２４時間後、細胞増殖能をＣｙＱＵＡＮＴＴＭ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて測定した。また、西洋ヤナギ抽出物を添加しない以外は同様にしてコントロール、ＡＴＰ産生亢進作用が認められるとして報告のあるインドール化合物のＭａｉｔｏｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ５（ナミキ商事株式会社、５μＭ）を添加してポジティブコントロールとした。コントロールの結果を１．０として規格化した細胞増殖量と、ＡＴＰ産生量／細胞増殖量の結果を、それぞれ図２、３に示す。
【0017】
（４）単離ミトコンドリア
培養したＨＥＫ２９３細胞をセルスクレーパーにより回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたホモジナイズ溶液（３００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ ＢＳＡ）にて細胞抽出液を調製した。調製した細胞抽出液を１０００×ｇ、５分、４℃で遠心して上清を回収した。この操作を２回繰り返した。さらに回収した上清を１２０００×ｇ、１０分、４℃で遠心し沈殿をミトコンドリア画分として回収した。
回収したミトコンドリア画分をホモジナイズ溶液で調製し、ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質定量を行い調製した後、ミトコンドリア活性に使用するまで－８０℃で保存した。
培養したＨＥＫ２９３細胞をセルスクレーパーにより回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたホモジナイズ溶液（３００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ ＢＳＡ）にて細胞抽出液を調製した。調製した細胞抽出液を１０００×ｇ、５分、４℃で遠心して上清を回収した。この操作を２回繰り返した。さらに回収した上清を１２０００×ｇ、１０分、４℃で遠心し沈殿をミトコンドリア画分として回収した。
回収したミトコンドリア画分をホモジナイズ溶液で調製し、ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質定量を行い調製した後、ミトコンドリア活性に使用するまで－８０℃で保存した。
【0018】
（５）ミトコンドリア活性測定
単離ミトコンドリアをＡＴＰ測定溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）にて１０μｇ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌ 白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１０μＬ添加した。
その後、１１１ｎＭ ＡＤＰ及び西洋ヤナギ抽出物（インデナジャパン株式会社、セイヨウヤナギカンソウエキス１５％、含水エタノール抽出、１０μｇ／ｍＬ）を添加して５分後、ミトコンドリア活性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて測定した。西洋ヤナギ抽出物を添加しない以外は同様にしてコントロールとした。結果を図４に示す。
単離ミトコンドリアをＡＴＰ測定溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）にて１０μｇ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌ 白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１０μＬ添加した。
その後、１１１ｎＭ ＡＤＰ及び西洋ヤナギ抽出物（インデナジャパン株式会社、セイヨウヤナギカンソウエキス１５％、含水エタノール抽出、１０μｇ／ｍＬ）を添加して５分後、ミトコンドリア活性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて測定した。西洋ヤナギ抽出物を添加しない以外は同様にしてコントロールとした。結果を図４に示す。
【0019】
（結果）
図１に示すように、西洋ヤナギ抽出物添加によりＡＴＰ産生量が増加した。
ＡＴＰは、細胞内のミトコンドリアで産生されるため、細胞が増殖してミトコンドリアが増えるとＡＴＰ産生量も増加する。そのため、細胞増殖能も調査したところ、図２、３に示すように、西洋ヤナギ抽出物を添加しても細胞の増殖に影響を及ぼさず、西洋ヤナギ抽出物添加によりＡＴＰ産生促進作用が得られることが確認された。
さらに、図４に示すように、単離したミトコンドリアに対しても西洋ヤナギ抽出物を添加することにより、ＡＴＰ産生量が増加した。このことから西洋ヤナギ抽出物はミトコンドリアにおけるＡＴＰ合成能を増強し、ミトコンドリア活性促進作用を持つことが確認された。
以上のように、西洋ヤナギ抽出物はＡＴＰ産生促進作用を有し、さらにミトコンドリア活性を促進できることが確認された。
図１に示すように、西洋ヤナギ抽出物添加によりＡＴＰ産生量が増加した。
ＡＴＰは、細胞内のミトコンドリアで産生されるため、細胞が増殖してミトコンドリアが増えるとＡＴＰ産生量も増加する。そのため、細胞増殖能も調査したところ、図２、３に示すように、西洋ヤナギ抽出物を添加しても細胞の増殖に影響を及ぼさず、西洋ヤナギ抽出物添加によりＡＴＰ産生促進作用が得られることが確認された。
さらに、図４に示すように、単離したミトコンドリアに対しても西洋ヤナギ抽出物を添加することにより、ＡＴＰ産生量が増加した。このことから西洋ヤナギ抽出物はミトコンドリアにおけるＡＴＰ合成能を増強し、ミトコンドリア活性促進作用を持つことが確認された。
以上のように、西洋ヤナギ抽出物はＡＴＰ産生促進作用を有し、さらにミトコンドリア活性を促進できることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
