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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024165048
(43)【公開日】2024-11-28
(54)【発明の名称】遺伝子発現抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/185 20060101AFI20241121BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241121BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241121BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241121BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20241121BHJP
A61Q 17/04 20060101ALI20241121BHJP
A61K 8/92 20060101ALI20241121BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241121BHJP
【ＦＩ】
A61K36/185
A61P29/00
A61P43/00 111
A61Q19/00
A61K8/9789
A61Q17/04
A61K8/92
C12N15/09 Z ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023080868
(22)【出願日】2023-05-16
(71)【出願人】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(71)【出願人】
【識別番号】507307260
【氏名又は名称】宇航人ジャパン株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】309033932
【氏名又は名称】株式会社フィネス
(74)【代理人】
【識別番号】100197642
【弁理士】
【氏名又は名称】南瀬 透
(74)【代理人】
【識別番号】100099508
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 久
(74)【代理人】
【識別番号】100182567
【弁理士】
【氏名又は名称】遠坂 啓太
(74)【代理人】
【識別番号】100219483
【弁理士】
【氏名又は名称】宇野 智也
(72)【発明者】
【氏名】清水 邦義
(72)【発明者】
【氏名】楊 建標
(72)【発明者】
【氏名】祖父江 守恒
【テーマコード（参考）】
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C083AA121
4C083AA122
4C083CC04
4C083CC05
4C083CC06
4C083CC07
4C083CC13
4C083CC19
4C083CC23
4C083CC31
4C083CC39
4C083DD27
4C083DD30
4C083DD31
4C083EE11
4C083EE17
4C083FF01
4C088AB12
4C088AC04
4C088CA10
4C088ZB11
4C088ZC41
(57)【要約】
【課題】５－ＬＯＸ遺伝子および／またはＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する、新規の遺伝子発現抑制剤を提供する。
【解決手段】サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
【選択図】 図１
【解決手段】サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
【請求項2】
ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する、請求項１に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項3】
サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
【請求項4】
前記サジー種子オイルが、サジー種子の超臨界二酸化炭素抽出物および／または亜臨界二酸化炭素抽出物である、請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、５－ＬＯＸ遺伝子および／またはＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
生体の防御反応の一つである炎症反応は、様々な化学物質によって制御されている。炎症が起こると、細胞膜のリン脂質に結合しているアラキドン酸という物質から、酵素を介してロイコトリエン、プロスタグランジンという生理活性物質が作られ、それらの作用で痛みや発熱などの炎症反応が起こる。
【0003】
５－ＬＯＸ（５－リポキシゲナーゼ）遺伝子は、炎症により誘導されるロイコトリエンの合成に関与する遺伝子である。ＣＯＸ２（シクロオキシゲナーゼ２）遺伝子は、炎症により誘導されるプロスタグランジンの合成に関与する遺伝子である。炎症反応は生体防御に不可欠な反応である一方で、過剰な炎症反応は生体に有害となることがある。過剰な炎症反応の抑制のためにこれらの遺伝子の発現を抑制する物質が研究されている。例えば、ＣＯＸ２遺伝子の発現抑制に関するものとして、特許文献１などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】ＷＯ０１／０３０３４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、５－ＬＯＸ遺伝子および／またはＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する、新規の遺伝子発現抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞ サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
＜２＞ ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する、前記＜１＞に記載の遺伝子発現抑制剤。
＜３＞ サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
＜４＞ 前記サジー種子オイルが、サジー種子の超臨界二酸化炭素抽出物および／または亜臨界二酸化炭素抽出物である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
＜１＞ サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
＜２＞ ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する、前記＜１＞に記載の遺伝子発現抑制剤。
＜３＞ サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
＜４＞ 前記サジー種子オイルが、サジー種子の超臨界二酸化炭素抽出物および／または亜臨界二酸化炭素抽出物である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、５－ＬＯＸ遺伝子および／またはＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する、新規の遺伝子発現抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】５－ＬＯＸ遺伝子およびＣＯＸ２遺伝子の発現評価試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「～」という表現を用いる場合、その前後の数値又は物性値を含む表現として用いるものとする。
【0010】
＜遺伝子発現抑制剤＞
本発明は、サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤に関するものである。また、本発明は、サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤に関するものである。すなわち、本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子および／またはＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制することができる。
本発明は、サジー種子オイルを有効成分として含有する、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤に関するものである。また、本発明は、サジー種子オイルを有効成分として含有する、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤に関するものである。すなわち、本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子および／またはＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制することができる。
【0011】
（サジー種子オイル）
サジー種子オイルは、サジーの種子から抽出された油分（疎水性成分）である。サジー（沙棘、学名：Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ Ｌ．、英語名：Ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ）は、ユーラシア大陸原産のグミ科ヒッポファエ属の植物である。サジーの種子は、果実そのものや果実を加工した後の残渣などから取り出して用いることができる。例えば、サジー果実を圧搾や裏ごしして液やピューレなどの果汁等に加工するときに除去される残渣から種子を選別しオイルの抽出に用いることができる。残渣等から選別した種子は、適宜、水で洗浄し乾燥させてからオイルの抽出に用いることができる。
サジー種子オイルは、サジーの種子から抽出された油分（疎水性成分）である。サジー（沙棘、学名：Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ Ｌ．、英語名：Ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ）は、ユーラシア大陸原産のグミ科ヒッポファエ属の植物である。サジーの種子は、果実そのものや果実を加工した後の残渣などから取り出して用いることができる。例えば、サジー果実を圧搾や裏ごしして液やピューレなどの果汁等に加工するときに除去される残渣から種子を選別しオイルの抽出に用いることができる。残渣等から選別した種子は、適宜、水で洗浄し乾燥させてからオイルの抽出に用いることができる。
【0012】
オイルの抽出方法は特に限定されず、公知の方法を利用することができ、サジーの種子を、適宜、破砕や粉砕した後、超臨界二酸化炭素抽出法や、亜臨界二酸化炭素抽出法、水蒸気蒸留法、有機溶媒抽出法、圧搾抽出法などの抽出方法により抽出し得られた抽出物をサジー種子オイルとして利用することができる。
【0013】
中でも、低温で抽出でき、熱に弱い成分も壊さずに抽出することができる超臨界二酸化炭素抽出法や亜臨界二酸化炭素抽出法を利用することが好ましく、サジー種子オイルは、サジー種子の超臨界二酸化炭素抽出物および／または亜臨界二酸化炭素抽出物であることが好ましい。具体的には、サジー種子オイルは、超臨界状態または亜臨界状態の二酸化炭素を抽出溶媒として用い、サジー種子から油分を抽出し、二酸化炭素を除去する工程を有する方法により得ることが好ましい。抽出条件は、二酸化炭素が超臨界状態または亜臨界状態となる温度、圧力であればよく、例えば、温度２０～８０℃、圧力１０～６０ＭＰａや、温度３０～８０℃、圧力１０～５０ＭＰａ、温度３１～６０℃、圧力１５～４０ＭＰａ、温度３１～４０℃、圧力２０～３０ＭＰａである。
【0014】
（５－ＬＯＸ遺伝子の発現抑制）
本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制することができ、５－ＬＯＸ遺伝子発現抑制剤として用いることができる。５－ＬＯＸは、５-リポキシゲナーゼや、アラキドン酸５－リポキシゲナーゼ、ＡＬＯＸ５などといわれることもあり、ロイコトリエンの合成に関与する酵素である。刺激によって細胞が損傷すると、細胞膜リン脂質よりアラキドン酸が遊離する。５－ＬＯＸがアラキドン酸に働くとロイコトリエンが生成される。ロイコトリエンは炎症に関与することが知られており、炎症細胞の遊走、活性化に働くことや気道平滑筋の収縮、血管拡張作用などが知られている。５－ＬＯＸ遺伝子は、５－ＬＯＸをコードする遺伝子であり、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に記載のＯｆｆｉｃｉａｌ ｓｙｍｂｏｌはＡＬＯＸ５である。本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子からｍＲＮＡへの転写や、ｍＲＮＡから遺伝子にコードされた５－ＬＯＸへの翻訳を抑制または阻害して、転写産物や５－ＬＯＸを減少させることができる。
本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子の発現を抑制することができ、５－ＬＯＸ遺伝子発現抑制剤として用いることができる。５－ＬＯＸは、５-リポキシゲナーゼや、アラキドン酸５－リポキシゲナーゼ、ＡＬＯＸ５などといわれることもあり、ロイコトリエンの合成に関与する酵素である。刺激によって細胞が損傷すると、細胞膜リン脂質よりアラキドン酸が遊離する。５－ＬＯＸがアラキドン酸に働くとロイコトリエンが生成される。ロイコトリエンは炎症に関与することが知られており、炎症細胞の遊走、活性化に働くことや気道平滑筋の収縮、血管拡張作用などが知られている。５－ＬＯＸ遺伝子は、５－ＬＯＸをコードする遺伝子であり、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に記載のＯｆｆｉｃｉａｌ ｓｙｍｂｏｌはＡＬＯＸ５である。本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子からｍＲＮＡへの転写や、ｍＲＮＡから遺伝子にコードされた５－ＬＯＸへの翻訳を抑制または阻害して、転写産物や５－ＬＯＸを減少させることができる。
【0015】
（ＣＯＸ２遺伝子の発現抑制）
本発明の遺伝子発現抑制剤は、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制することができ、ＣＯＸ２遺伝子発現抑制剤として用いることができる。ＣＯＸ２は、シクロオキシゲナーゼ２や、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２、ＣＯＸ－２、ＰＴＧＳ２といわれることもあり、プロスタグランジンの合成に関与する酵素である。アラキドン酸にＣＯＸ２が働くとプロスタグランジンが生成される。プロスタグランジンは発熱作用や炎症促進作用、痛みを増強する作用などがあることが知られている。ＣＯＸ２遺伝子は、ＣＯＸ２をコードする遺伝子であり、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に記載のＯｆｆｉｃｉａｌ ｓｙｍｂｏｌはＰＴＧＳ２である。本発明の遺伝子発現抑制剤は、ＣＯＸ２遺伝子からｍＲＮＡへの転写や、ｍＲＮＡから遺伝子にコードされたＣＯＸ２への翻訳を抑制または阻害して、転写産物やＣＯＸ２を減少させることができる。
本発明の遺伝子発現抑制剤は、ＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制することができ、ＣＯＸ２遺伝子発現抑制剤として用いることができる。ＣＯＸ２は、シクロオキシゲナーゼ２や、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２、ＣＯＸ－２、ＰＴＧＳ２といわれることもあり、プロスタグランジンの合成に関与する酵素である。アラキドン酸にＣＯＸ２が働くとプロスタグランジンが生成される。プロスタグランジンは発熱作用や炎症促進作用、痛みを増強する作用などがあることが知られている。ＣＯＸ２遺伝子は、ＣＯＸ２をコードする遺伝子であり、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に記載のＯｆｆｉｃｉａｌ ｓｙｍｂｏｌはＰＴＧＳ２である。本発明の遺伝子発現抑制剤は、ＣＯＸ２遺伝子からｍＲＮＡへの転写や、ｍＲＮＡから遺伝子にコードされたＣＯＸ２への翻訳を抑制または阻害して、転写産物やＣＯＸ２を減少させることができる。
【0016】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、５－ＬＯＸ遺伝子およびＣＯＸ２遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。ロイコトリエンとプロスタグランジンはともに炎症を引き起こす物質である。５－ＬＯＸ遺伝子およびＣＯＸ２遺伝子の両方の発現を抑制することで、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンの産生を抑制し、より強力な抗炎症作用が期待できるため好ましい。
【0017】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、水溶液や乳化液、分散液、エマルジョンなどの液状；ゲル状や軟膏状、ペースト状、クリーム状などの半固形状；固形状など種々の形態で使用することができる。例えば、化粧水、化粧液、クリーム、乳液、日やけ止め、洗浄料、パック、化粧用油、ボディリンス、マッサージ料、頭皮料、洗髪料、ヘアリンス、リップケア化粧料等の任意の外用剤の形態とすることができる。外用剤の場合、１日１回～数回程度、各外用剤の形態で一般的な量を使用することができる。
【0018】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、その形態などに応じて、サジー種子オイルのみで構成しても、サジー種子オイルに加えて、医薬品や、医薬部外品、化粧品等の技術分野で基材や添加剤などの他の成分を含んでもよい。本発明の遺伝子発現抑制剤中のサジー種子オイルの含有量は、本発明の効果を達成できる範囲であれば特に限定されないが、０．３ｖ／ｖ％以上や、０．３５ｖ／ｖ％以上、０．４ｖ／ｖ％以上、０．４５ｖ／ｖ％以上が好ましい。本発明の遺伝子発現抑制剤中のサジー種子オイルの含有量の上限は特に限定はなく、形態等に応じて、９０ｖ／ｖ％以下や５０ｖ／ｖ％以下、１０ｖ／ｖ％以下、５ｖ／ｖ％以下などとすることができる。
【実施例0019】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【0020】
１．試験試料（サジー種子オイル）
Ｈ．ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓの果実（内モンゴル産）を用いたサジー果汁加工後の残渣（種子、果皮の一部を含む）から種子を選別し、飲用水で洗浄した。その後、乾燥させたものを粉砕し、超臨界二酸化炭素抽出（圧力２４～２６ＭＰａ、温度３１．２５℃、時間３．５時間）により油分を溶解・分離し、褐色透明の抽出液を得た。充填は無菌条件で包装・密封を行った。
Ｈ．ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓの果実（内モンゴル産）を用いたサジー果汁加工後の残渣（種子、果皮の一部を含む）から種子を選別し、飲用水で洗浄した。その後、乾燥させたものを粉砕し、超臨界二酸化炭素抽出（圧力２４～２６ＭＰａ、温度３１．２５℃、時間３．５時間）により油分を溶解・分離し、褐色透明の抽出液を得た。充填は無菌条件で包装・密封を行った。
【0021】
２．試験方法
（１）評価サンプル
・サジー種子オイル
終濃度：０．２ｖ／ｖ％、０．４ｖ／ｖ％、０．５ｖ／ｖ％
・コントロール
エタノール、終濃度：０．５ｖ／ｖ％
（１）評価サンプル
・サジー種子オイル
終濃度：０．２ｖ／ｖ％、０．４ｖ／ｖ％、０．５ｖ／ｖ％
・コントロール
エタノール、終濃度：０．５ｖ／ｖ％
【0022】
（２）実験方法
・細胞培養
ＨａＣａＴ細胞は、１ｖ／ｖ％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）をφ１０ｃｍシャーレに加え、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）で培養を行った。コンフルエントになるまで培養したＨａＣａＴ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い、培地に再懸濁後、２４穴プレートに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種しＣＯ2インキュベーターで培養した。
・細胞培養
ＨａＣａＴ細胞は、１ｖ／ｖ％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）をφ１０ｃｍシャーレに加え、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）で培養を行った。コンフルエントになるまで培養したＨａＣａＴ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い、培地に再懸濁後、２４穴プレートに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種しＣＯ2インキュベーターで培養した。
【0023】
・培養細胞へのサンプル添加
ＨａＣａＴ細胞播種から２４時間後、サンプルを含む無血清のダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）を各ウェル１ｍＬずつ加え、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）にて２４時間培養した。２４時間培養後、ＬＰＳ（１００μｇ／ｍＬ）処理を実施した。
ＨａＣａＴ細胞播種から２４時間後、サンプルを含む無血清のダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）を各ウェル１ｍＬずつ加え、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）にて２４時間培養した。２４時間培養後、ＬＰＳ（１００μｇ／ｍＬ）処理を実施した。
【0024】
・リアルタイムＰＣＲによるＣＯＸ２遺伝子および５－ＬＯＸ遺伝子の発現量の比較
ＬＰＳ処理２４時間後のＨａＣａＴ細胞を回収し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）にて、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型としてＡｒｉａＭＸ リアルタイムＰＣＲ装置（アジレント・テクノロジー）でリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応には、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＣＯＸ２遺伝子用プライマーとして配列番号１（５’－ＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＧＡＧＣＡ－３’）で表されるフォワードプライマーおよび配列番号２（５’－ＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＧ－３’）で表されるリバースプライマーを、５－ＬＯＸ遺伝子用プライマーとして配列番号３（５’－ＴＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＣ－３’）で表されるフォワードプライマーおよび配列番号４（５’－ＣＣＡＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＴ－３’）で表されるリバースプライマーを、内部標準β－アクチン用プライマーとして配列番号５（５’－ＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧ－３’）で表されるフォワードプライマーおよび配列番号６（５’－ＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＴ－３’）で表されるリバースプライマーを使用した。リアルタイムＰＣＲ反応条件として、９５℃、３分の初期変性後、９５℃、３秒での変性、６０℃、３０秒のアニーリング／伸長という２ステップのＰＣＲ反応を４０サイクル行った。
ＬＰＳ処理２４時間後のＨａＣａＴ細胞を回収し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）にて、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型としてＡｒｉａＭＸ リアルタイムＰＣＲ装置（アジレント・テクノロジー）でリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ反応には、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＣＯＸ２遺伝子用プライマーとして配列番号１（５’－ＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＧＡＧＣＡ－３’）で表されるフォワードプライマーおよび配列番号２（５’－ＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＧ－３’）で表されるリバースプライマーを、５－ＬＯＸ遺伝子用プライマーとして配列番号３（５’－ＴＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＣ－３’）で表されるフォワードプライマーおよび配列番号４（５’－ＣＣＡＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＴ－３’）で表されるリバースプライマーを、内部標準β－アクチン用プライマーとして配列番号５（５’－ＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧ－３’）で表されるフォワードプライマーおよび配列番号６（５’－ＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＴ－３’）で表されるリバースプライマーを使用した。リアルタイムＰＣＲ反応条件として、９５℃、３分の初期変性後、９５℃、３秒での変性、６０℃、３０秒のアニーリング／伸長という２ステップのＰＣＲ反応を４０サイクル行った。
【0025】
【図1】
【配列表】