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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024165150
(43)【公開日】2024-11-28
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20241121BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20241121BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241121BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241121BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241121BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/10
A61K39/395 N
A61P31/14
A61P43/00 121
A61K39/395 S
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023081056
(22)【出願日】2023-05-16
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(71)【出願人】
【識別番号】598041566
【氏名又は名称】学校法人北里研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】河野 響
(72)【発明者】
【氏名】西口 大貴
(72)【発明者】
【氏名】正木 秀和
(72)【発明者】
【氏名】戸高 玲子
(72)【発明者】
【氏名】芳賀 慧
(72)【発明者】
【氏名】片山 和彦
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085CC23
4C085DD62
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異株に対して幅広く結合活性及び中和活性を示すシングルドメイン抗体及びその利用法を提供する。
【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
【選択図】なし
【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
【請求項2】
前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
単一ドメイン抗体、少なくとも1つの当該単一ドメイン抗体を含む単一ドメイン抗体多量体、又は少なくとも１つの当該単一ドメイン抗体と他の分子を連結させた抗体のいずれかである、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項5】
前記単一ドメイン抗体がヒト化された特徴を有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体をコードする核酸。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
【請求項8】
前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体と前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体を組み合わせてなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶやＭＥＲＳ－ＣｏＶと同様ベータコロナウイルス属に属し、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一般的なコロナウイルスと同様に、４つの構造タンパク質、１６の非構造タンパク質（ｎｓｐ１－１６）、及びいくつかの付属タンパク質をコードする大きなポジティブセンスＲＮＡゲノムを有している。構造タンパク質は、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシド、膜タンパク質、エンベロープタンパク質から成り、スパイクタンパク質は、受容体結合を担うＮ末端のＳ１サブユニットと膜融合を担うＣ末端のＳ２サブユニットから構成される。Ｓ１サブユニットはさらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）に分割されている。Ｓ２サブユニットは、さらに、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）及びヘプタドリピート２（ＨＲ２）に分割されていることが知られている（非特許文献１参照）。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのスパイクタンパク質を介して宿主細胞受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と結合して細胞内に侵入する。受容体との結合は、スパイク蛋白質の構造変化を引き金とし、活性化状態へと変化させる。活性化されたスパイクは、Ｓ１／Ｓ２部位でプロテアーゼ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではＴＭＰＲＳＳ２）によって切断され、Ｓ１サブユニットが放出され、Ｓ２サブユニット上のＦＰが露出する。ＦＰは標的細胞膜に挿入され、ＨＲ１とＨＲ２がリフォールドして融合後のコンフォメーションを形成し、標的細胞とのウイルス膜融合を促進することが知られている（非特許文献２参照）。
【0005】
低温電子顕微鏡や結晶解析によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２三量体スパイクのプレフュージョンコンフォメーションやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤと完全長ヒトＡＣＥ２の構造解析が進んでおり、ＡＣＥ２への結合様式の解明やヒトＡＣＥ２とのより強い接触を形成するＲＢＤ上の重要な変異点の知見、更には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを標的とする交差反応性抗体の同定に向けたエピトープの洞察が提供されている。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質の糖鎖解析から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ同様に多くのグリコシル化部位を有しており、その中でもＳＡＲＳ－ＣｏＶには無い、ユニークなグリコシル化部位も報告されており、この様な特異な糖鎖がエピトープのマスキングを介した免疫回避を促進する可能性があることも報告されている（非特許文献３参照）。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、宿主細胞にウイルスが侵入する際に不可欠な役割を果たしており、中和抗体の主要な標的となる。コロナウイルスＳ１サブユニットの機能性と高い免疫原性のため、これまでにコロナウイルスに対して特徴づけられたほとんどの中和抗体は、Ｓ１サブユニット、特にＲＢＤを標的としていることが報告されている。また、以前のＳＡＲＳ及びＭＥＲＳの感染の流行中にもいくつかの中和抗体が開発され、コロナウイルス感染症の治療での使用の可能性が証明されている。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤに特異的な多くの既知の中和抗体（Ｓ２３０、ｍ３９６、８０Ｒなど）は、１μＭまでの濃度でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合せず、一方で、単一のＢ細胞の選別によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者から単離されたモノクローナル抗体はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤと交差反応を示さないことが報告されている。この様に、多くの既存の中和抗体は交差反応性に乏しいが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に中和活性を示す４７Ｄ１１やＳ３０９といったＩｇＧ抗体やシングルドメイン抗体としてＶＨＨ－７２－Ｆｃ等が存在することも報告されている（非特許文献３参照）。現在までに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を標的とした中和抗体薬が世界各国で承認されている。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤに特異的な多くの既知の中和抗体（Ｓ２３０、ｍ３９６、８０Ｒなど）は、１μＭまでの濃度でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合せず、一方で、単一のＢ細胞の選別によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者から単離されたモノクローナル抗体はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤと交差反応を示さないことが報告されている。この様に、多くの既存の中和抗体は交差反応性に乏しいが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に中和活性を示す４７Ｄ１１やＳ３０９といったＩｇＧ抗体やシングルドメイン抗体としてＶＨＨ－７２－Ｆｃ等が存在することも報告されている（非特許文献３参照）。現在までに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を標的とした中和抗体薬が世界各国で承認されている。
【0007】
ＣＯＶＩＤ－１９はその発生から３年以上経った２０２３年２月現在においても完全な収束には至らず、その原因の１つはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の出現によるものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株では、スパイクタンパク質のアミノ酸配列に様々な変異（アミノ酸の置換、欠損又は挿入）が生じており、従来のウイルス株と比較しての感染力や抗原性の変化が確認されている。国立感染症研究ではこうしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異のリスクを分析し、その評価に応じて、変異株を「懸念される変異株（ＶＯＣ）」と「注目すべき変異株（ＶＯＩ）」と定めている。これまでに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が世界各地で出現しており、現在ではＶＯＣの１つであるオミクロン株が世界的な流行株として広まっている。さらに、承認されている中和抗体薬の中にはＶＯＣの１つであるオミクロン株に対する中和活性が低下することが報告されている（非特許文献４参照）。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の流行を抑制するためには、既存の変異株だけでなく将来的に出現する新規変異株に対しても有効な中和抗体の開発が重要である。
【0008】
免疫応答における抗体は、生体が感染によって抗原と接触した後、比較的感染初期に患者の血中で増加するイムノグロブリンＭ（以下、「ＩｇＭ」と略すことがある）と、その後に増加するＩｇＧ等があることが知られている。ここで、一般的なＩｇは軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物は、軽鎖を含まない重鎖抗体を産生することが知られている。また、重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメインは、天然のシングルドメインであり、それ自身でも抗体として機能する。このため、「単一ドメイン抗体」（以下、「ＶＨＨ」と略すことがある。）と呼ばれている。
ウイルスの立体構造エピトープが、例えば、酵素ポケットのような穴状の構造や、ドメイン間の割目の構造部分を含む場合、従来のＩｇＧではその大きさからこうしたエピトープに結合することができなかった。これに対し、上記のＶＨＨは、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、上記のような構造のエピトープにも結合することができ、多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る分子の幅が広くなる。
ウイルスの立体構造エピトープが、例えば、酵素ポケットのような穴状の構造や、ドメイン間の割目の構造部分を含む場合、従来のＩｇＧではその大きさからこうしたエピトープに結合することができなかった。これに対し、上記のＶＨＨは、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、上記のような構造のエピトープにも結合することができ、多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る分子の幅が広くなる。
【0009】
さらに、ＶＨＨは耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、微生物等で生産することができる。このため、量産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨは１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2. Nat Struct Mol Biol. 2021;28:326.
【非特許文献2】Development of multi-specific humanized llama antibodies blocking SARS-CoV-2/ACE2 interaction with high affinity and avidity. Emerging Microbes & Infections 2020;9;1034-1036
【非特許文献3】Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell 2020;181:1004-1015.
【非特許文献4】Efficacy of Antibodies and Antiviral Drugs against Omicron BA.2.12.1, BA.4, and BA.5 Subvariants. N Engl J Med. 2022;387:468-470.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異株に対して幅広く結合活性及び中和活性を示すシングルドメイン抗体及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する単一ドメイン抗体を得るべく検討した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質であるスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン内のエピトープに結合し、当該ウイルス及びその変異株に対して幅広く中和活性を示すモノクローナル抗体を得ることに成功した。
【0013】
すなわち、本発明は以下の１）～４）に係るものである。
１）下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）１）の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
４）前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体と前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体を組み合わせてなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
１）下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）１）の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
４）前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体と前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体を組み合わせてなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異株に対して幅広く反応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を提供することができる。本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその変異株に対して優れた結合活性及び中和活性を有することから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、すなわち急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】バイオレイヤー干渉法によるコリネ菌培養上清中ＶＨＨの結合活性測定。
【図2】枯草菌により生産されたＶＨＨの精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。
【図3】表面プラズモン共鳴法によるＨｉｓタグ付きＶＭ７９３の結合活性測定。
【図4】表面プラズモン共鳴法によるＨｉｓタグ付きＶＭ８００の結合活性測定。
【図5】表面プラズモン共鳴法によるＶＭ７９３の結合活性測定。
【図6】表面プラズモン共鳴法によるＶＭ８００の結合活性測定。
【図7】ＶＭ７９３及びＶＭ８００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性測定。
【図8】ＶＭ７９３・ＶＭ８００カクテルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性測定。
【図9】水素/重水素交換質量分析によるＶＭ７９３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤに対する結合部位解析。
【図10】水素/重水素交換質量分析によるＶＭ８００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤに対する結合部位解析。
【図11】ＶＭ７９３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対する結合部位。四角で囲われたアミノ酸領域が結合部位を含むアミノ酸領域である。
【図12】ＶＭ８００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対する結合部位。四角で囲われたアミノ酸領域が結合部位を含むアミノ酸領域である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質の一つであるスパイクタンパク質は、受容体結合を担うＮ末端のＳ１サブユニットと膜融合を担うＣ末端のＳ２サブユニットから構成される。Ｓ１サブユニットはさらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）に分割されている（前記非特許文献１）。
【0017】
本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体（以下、「本発明の抗体」と称する）は、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に存在するエピトープに結合する抗体であり、当該エピトープは下記（ａ）又は（ｂ）で示される領域に含まれる。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ、及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ、及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域
【0018】
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株（Ｄｅｌｔａ株）のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のアミノ酸配列を指す。
また、「エピトープ」とは、抗体への特異的結合が可能な抗原決定基を意味する。
上記（ａ）で示される、「配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当する領域」、「配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当する領域アミノ酸領」、上記（ｂ）で示される、「配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当する領域」、「１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域」における「これに相当する領域」とは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄｅｌｔａ株のＲＢＤのアミノ酸配列をもとに、遺伝子情報処理ソフトウェアＧＥＮＡＴＹＸを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのＲＢＤ変異株とのアライメントをとった場合に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該領域（３３番目～４３番目、１２４番目～１３７番目、５１番目～５６番目、１７８番目～１９４番目）に対応する領域を意味する（図１１及び図１２参照）。相同する領域は、三次元構造中で同じ領域に存在すると考えられ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤについて同様のエピトープを有するものと推定できる。
また、「エピトープ」とは、抗体への特異的結合が可能な抗原決定基を意味する。
上記（ａ）で示される、「配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当する領域」、「配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当する領域アミノ酸領」、上記（ｂ）で示される、「配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当する領域」、「１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域」における「これに相当する領域」とは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｄｅｌｔａ株のＲＢＤのアミノ酸配列をもとに、遺伝子情報処理ソフトウェアＧＥＮＡＴＹＸを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのＲＢＤ変異株とのアライメントをとった場合に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該領域（３３番目～４３番目、１２４番目～１３７番目、５１番目～５６番目、１７８番目～１９４番目）に対応する領域を意味する（図１１及び図１２参照）。相同する領域は、三次元構造中で同じ領域に存在すると考えられ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤについて同様のエピトープを有するものと推定できる。
【0019】
なお、当該エピトープに対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、表面プラズモン共鳴法により、平衡乖離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えばＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、バイオレイヤー干渉法等を用いた方法によっても評価できる。
【0020】
上記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体としては、具体的には、ＧＳＩＦＳＩＹＤＭＧ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＳＷＳＧＳＡＴＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＲＡＳＹＱＤＤＬＧＨＮＶＲＤＹ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が挙げられる。
また、上記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体としては、具体的には、ＧＲＴＦＳＴＹＡＶＧ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＤＩＴＳＧＧＳＴＮ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＹＫＧＶＷＧＲＳＶＤＹ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が挙げられる。
また、上記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体としては、具体的には、ＧＲＴＦＳＴＹＡＶＧ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＤＩＴＳＧＧＳＴＮ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＹＫＧＶＷＧＲＳＶＤＹ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が挙げられる。
【0021】
ここで、ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。上記抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。
【0022】
上記配列番号２～７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲに変異が導入されていても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能を有している限り、本発明の抗体のＣＤＲに包含される。
【0023】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【0024】
配列番号８～１１、１３～１４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
【0025】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列の同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0026】
本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号4で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１２）を有する抗体は、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（ＶＭ７９３）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
また、本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１５）を有する抗体は、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（ＶＭ８００）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
また、本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１５）を有する抗体は、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（ＶＭ８００）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
【0027】
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、単一ドメイン抗体（ナノボディーとも呼ばれる）や、少なくとも1つの当該単一ドメイン抗体が複数結合した多量体（例えば二量体）であり得る。多量体には、本発明の構造ドメインが複数連結した多量体の他、当該構造ドメインの１又は複数と、他の分子（当該構造ドメインとは抗原特異性の異なる他の構造ドメインの１又は複数）が連結した多量体が含まれる。
単一ドメイン抗体は、単一の可変領域（抗原結合ドメイン）で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど）で同定された重鎖抗体であるＶＨＨ、軟骨魚類（例えばサメ）由来の重鎖抗体であるＶＮＡＲ等が単一ドメイン抗体の一種として知られており、本発明においてはＶＨＨが好ましい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
単一ドメイン抗体は、単一の可変領域（抗原結合ドメイン）で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体）、可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカなど）で同定された重鎖抗体であるＶＨＨ、軟骨魚類（例えばサメ）由来の重鎖抗体であるＶＮＡＲ等が単一ドメイン抗体の一種として知られており、本発明においてはＶＨＨが好ましい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
【0028】
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸を適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
【0029】
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0030】
発現させた本発明の抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0031】
本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
【0032】
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
【0033】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
【0034】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１サブユニットの受容体結合ドメインに結合し、ウイルスの細胞への感染を阻害する、すなわち中和活性を有する。したがって、本発明の抗体は、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することが可能である。本発明の抗体を当該医薬として用いる場合は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する抗体、好ましくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる構造ドメインを有する抗体（ＶＭ７９３）を用いるのが好ましく、これと配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する抗体、好ましくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる構造ドメインを有する抗体（ＶＭ８００）を組み合わせて、抗体カクテルとして用いるのがより好ましい。
哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等があげられるが、ヒトが好ましい。
哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等があげられるが、ヒトが好ましい。
【0035】
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
【0036】
斯かる医薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療が必要な対象、例えば患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療が必要な対象、例えば患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
【0037】
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
＜２＞前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、＜１＞に記載の抗体。
＜３＞前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、＜１＞に記載の抗体。
＜４＞単一ドメイン抗体、少なくとも1つの当該単一ドメイン抗体を含む単一ドメイン抗体多量体、又は少なくとも１つの当該単一ドメイン抗体と他の分子を連結させた抗体のいずれかである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の抗体。
＜５＞前記単一ドメイン抗体がヒト化された特徴を有する、＜４＞に記載の抗体。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかの抗体をコードする核酸。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかの抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
＜８＞前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体と前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体を組み合わせてなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
＜１＞下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
＜２＞前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、＜１＞に記載の抗体。
＜３＞前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、＜１＞に記載の抗体。
＜４＞単一ドメイン抗体、少なくとも1つの当該単一ドメイン抗体を含む単一ドメイン抗体多量体、又は少なくとも１つの当該単一ドメイン抗体と他の分子を連結させた抗体のいずれかである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の抗体。
＜５＞前記単一ドメイン抗体がヒト化された特徴を有する、＜４＞に記載の抗体。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかの抗体をコードする核酸。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかの抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
＜８＞前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体と前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体を組み合わせてなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
【0038】
＜９＞単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、＜４＞又は＜５＞記載の抗体。
＜１０＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜２＞又は＜３＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜１０＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号4で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１２）を有する、＜１１＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１５）を有する、＜１１＞の抗体。
＜１０＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜２＞又は＜３＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜１０＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号１１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号4で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１２）を有する、＜１１＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号１５）を有する、＜１１＞の抗体。
【実施例0039】
（実施例１）ＶＨＨのスクリーニング
１－１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇｔｍ、Ｓｕｐｅｒ ｓｔａｂｌｅ ｔｒｉｍｅｒ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ） Ｆｃ ｔａｇ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇｔｍ（Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
１－１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇｔｍ、Ｓｕｐｅｒ ｓｔａｂｌｅ ｔｒｉｍｅｒ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ） Ｆｃ ｔａｇ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇｔｍ（Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【0040】
１－２．人工ヒト化ＶＨＨ提示ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙの合成
１－２－（１）ｍＲＮＡ－リンカー連結体の合成
ヒト化人工ＶＨＨサブライブラリ（ＰｈａｒｍａｌｏｇｉｃａｌＴＭ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を鋳型として、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃、３０分間転写反応を行った。転写反応後、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて３７℃、１５分間反応させ、ＲＮＡｃｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１（Ｄｅｎｏｖｉｘ）を用いて測定後、終濃度が２００ｍＭ ＮａＣｌ、 ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μＭ ｍＲＮＡ、１μＭ ｃｎｖＫ ｌｉｎｋｅｒになるように試薬を混合した。本混合液を（ｓ１）９０℃、１分、（ｓ２）７０℃、１分、（ｓ３）４℃ のプログラムで熱処理した後、ＵＶＰ ｃｌｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ｃｌ－３０００を用いて総エネルギー量が４０６ｍＪ／ｃｍ２となるまで２５４ｎｍのＵＶを照射し、ｍＲＮＡ－リンカー連結体を得た。
１－２－（１）ｍＲＮＡ－リンカー連結体の合成
ヒト化人工ＶＨＨサブライブラリ（ＰｈａｒｍａｌｏｇｉｃａｌＴＭ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を鋳型として、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃、３０分間転写反応を行った。転写反応後、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて３７℃、１５分間反応させ、ＲＮＡｃｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１（Ｄｅｎｏｖｉｘ）を用いて測定後、終濃度が２００ｍＭ ＮａＣｌ、 ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μＭ ｍＲＮＡ、１μＭ ｃｎｖＫ ｌｉｎｋｅｒになるように試薬を混合した。本混合液を（ｓ１）９０℃、１分、（ｓ２）７０℃、１分、（ｓ３）４℃ のプログラムで熱処理した後、ＵＶＰ ｃｌｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ｃｌ－３０００を用いて総エネルギー量が４０６ｍＪ／ｃｍ２となるまで２５４ｎｍのＵＶを照射し、ｍＲＮＡ－リンカー連結体を得た。
【0041】
１－２－（２）ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙディスプレイ分子の合成
上記方法で得られた各サブライブラリのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した後、６００μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体から１．６ｍＬの無細胞翻訳液（Ｐｕｒｅｆｒｅｘ １．０）（Ｇｅｎｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）を調製し、３７度、３０分間インキュベートした。次いで、１ＭのＭｇＣｌ２及び３ＭのＫＣｌをそれぞれ最終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）を最終濃度７０ｍＭになるように加えて、４℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液（全量３．２ｍＬ）を得た。得られたｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液を１．９２ ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｙＯｎｅ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、添付のプロトコルに従って精製した。ｍＲＮＡディスプレイ固定化ビーズに対して、３２０μＬの５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｉｐｐｏｎ ＧＥＮＥ）、６４μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３２μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００Ｕ／ｍＬ、Ｎｉｐｐｏｎ ＧＥＮＥ）、及び１１８４μＬの超純水から成る逆転写反応溶液を加え、４２℃にて１時間反応した。
上記反応物を、ＲＮａｓｅＴ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む５００μＬの溶出バッファーでビーズから溶出させ、その後、４００μＬのＨｉｓ－Ｍａｇセファロース（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを精製し、５０μＬのＨｉｓ－Ｍａｇ溶出液で溶出し、人工ヒト化ＶＨＨ提示ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ分子（ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド連結体）を得た。
上記方法で得られた各サブライブラリのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した後、６００μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体から１．６ｍＬの無細胞翻訳液（Ｐｕｒｅｆｒｅｘ １．０）（Ｇｅｎｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）を調製し、３７度、３０分間インキュベートした。次いで、１ＭのＭｇＣｌ２及び３ＭのＫＣｌをそれぞれ最終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）を最終濃度７０ｍＭになるように加えて、４℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液（全量３．２ｍＬ）を得た。得られたｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液を１．９２ ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｙＯｎｅ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、添付のプロトコルに従って精製した。ｍＲＮＡディスプレイ固定化ビーズに対して、３２０μＬの５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｉｐｐｏｎ ＧＥＮＥ）、６４μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３２μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００Ｕ／ｍＬ、Ｎｉｐｐｏｎ ＧＥＮＥ）、及び１１８４μＬの超純水から成る逆転写反応溶液を加え、４２℃にて１時間反応した。
上記反応物を、ＲＮａｓｅＴ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む５００μＬの溶出バッファーでビーズから溶出させ、その後、４００μＬのＨｉｓ－Ｍａｇセファロース（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを精製し、５０μＬのＨｉｓ－Ｍａｇ溶出液で溶出し、人工ヒト化ＶＨＨ提示ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ分子（ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド連結体）を得た。
【0042】
１－３．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ抗体のスクリーニング
１－３－（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対するセレクション
２００μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ, Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇｔｍ, Ｓｕｐｅｒ ｓｔａｂｌｅ ｔｒｉｍｅｒ（以下、ＳＡＲ―Ｓ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｔｒｉｍｅｒとよぶ）３５μＬを１５μＬのＰＢＳで希釈し、1μＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ ｔｒｉｍｅｒ溶液とした。本溶液５０μＬに、ｍＲＮＡ－リンカー連結体６００ｐｍｏｌスケールから上記の方法より調製した人工ヒト化ＶＨＨ提示ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液４７μＬ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５μＬ、５ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ溶液 ２．５μＬを順次加え、４℃で３０分間インキュベートした。次に、このｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ混合液を１２０μＬの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１）（ベリタス）に加え、４℃で３０分間転倒混和し、上清を除去後、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、溶出操作後、溶出液からＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを回収した。
１－３－（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対するセレクション
２００μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ, Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇｔｍ, Ｓｕｐｅｒ ｓｔａｂｌｅ ｔｒｉｍｅｒ（以下、ＳＡＲ―Ｓ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｔｒｉｍｅｒとよぶ）３５μＬを１５μＬのＰＢＳで希釈し、1μＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ ｔｒｉｍｅｒ溶液とした。本溶液５０μＬに、ｍＲＮＡ－リンカー連結体６００ｐｍｏｌスケールから上記の方法より調製した人工ヒト化ＶＨＨ提示ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液４７μＬ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５μＬ、５ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ溶液 ２．５μＬを順次加え、４℃で３０分間インキュベートした。次に、このｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ混合液を１２０μＬの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１）（ベリタス）に加え、４℃で３０分間転倒混和し、上清を除去後、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、溶出操作後、溶出液からＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを回収した。
【0043】
１－３－（２）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質結合ＤＮＡライブラリの調製
上記で得られたｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ回収サンプルをＰＣＲに供した。ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙＡ（配列番号１６）と ＰＬ＿Ｔ７ｐｒｏ（配列番号１７）をプライマーとし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ）によりアニーリング温度６０℃、伸長反応３５秒の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質結合ＤＮＡライブラリとした。
上記で得られたｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ回収サンプルをＰＣＲに供した。ｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙＡ（配列番号１６）と ＰＬ＿Ｔ７ｐｒｏ（配列番号１７）をプライマーとし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ）によりアニーリング温度６０℃、伸長反応３５秒の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質結合ＤＮＡライブラリとした。
【0044】
１－３－（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ｄｅｌｔａ変異株（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）のビオチン化
５．９μＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）Ｆｃ ｔａｇ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液１００μＬに、それぞれ１ｍＭビオチン化試薬（ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＰＥＧ１２－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１１．８μＬ加え、室温で１時間反応させた。ＺｅｂａＴＭ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、0.5 mL（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を説明書に従いＰＢＳに置換し、反応液を加え１５００ｘｇ、２分間遠心することで反応液のＢｕｆｆｅｒをＰＢＳに置換して、未反応のビオチン化試薬を除去し、各Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ｄｅｌｔａ変異株を得た。
５．９μＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）Ｆｃ ｔａｇ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液１００μＬに、それぞれ１ｍＭビオチン化試薬（ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＰＥＧ１２－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１１．８μＬ加え、室温で１時間反応させた。ＺｅｂａＴＭ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、0.5 mL（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を説明書に従いＰＢＳに置換し、反応液を加え１５００ｘｇ、２分間遠心することで反応液のＢｕｆｆｅｒをＰＢＳに置換して、未反応のビオチン化試薬を除去し、各Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ｄｅｌｔａ変異株を得た。
【0045】
１－３－（４）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株ＶＨＨ抗体スクリーニング（ラウンド１）
上記１－３－（２）で得られた抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質結合ＤＮＡライブラリを鋳型として、上記１－２－（１）と同様の方法にてｍＲＮＡ－リンカー連結体を得た後、Ｄｅｌｔａ変異株、Ｏｍｉｃｒｏｎ変異株に対して、それぞれ２０μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体から上記１－２－（２）と同様の方法にてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液を調製した。ＰＢＳで希釈した各ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液４７μＬに、５００ｎＭのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株溶液５０μＬ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ０．５μＬ、５ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ溶液 ２．５μＬを順次加え、４℃で１時間インキュベートした。次に、このｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ混合液を４０μＬの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１）（ベリタス）に加え、４℃で３０分間転倒混和し、上清を除去後、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、溶出操作後、溶出液からＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを回収した。本回収サンプルを上記３－２と同様の方法にてＰＣＲに供した。
上記１－３－（２）で得られた抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質結合ＤＮＡライブラリを鋳型として、上記１－２－（１）と同様の方法にてｍＲＮＡ－リンカー連結体を得た後、Ｄｅｌｔａ変異株、Ｏｍｉｃｒｏｎ変異株に対して、それぞれ２０μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体から上記１－２－（２）と同様の方法にてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液を調製した。ＰＢＳで希釈した各ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液４７μＬに、５００ｎＭのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株溶液５０μＬ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ０．５μＬ、５ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ溶液 ２．５μＬを順次加え、４℃で１時間インキュベートした。次に、このｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ混合液を４０μＬの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１）（ベリタス）に加え、４℃で３０分間転倒混和し、上清を除去後、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、溶出操作後、溶出液からＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを回収した。本回収サンプルを上記３－２と同様の方法にてＰＣＲに供した。
【0046】
１－３－（５）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株ＶＨＨ抗体スクリーニング（ラウンド２及び３）
上記１－３－（４）で得られた各変異株のＰＣＲ産物を鋳型として、上記３－４と同様の方法にてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液を調製した。ＰＢＳで希釈した各ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液４４．５μＬに、２００ｎＭのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株溶液５０μＬ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ０．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ 溶液 ５μＬを順次加え、４℃で１時間インキュベートした。次に、このｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ混合液を２０μＬの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１）（ベリタス）に加え、４℃で３０分間転倒混和し、上清を除去後、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、溶出操作後、溶出液からＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを回収した。回収したｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液から、ＰＣＲ増幅を経て、本操作を更に１回実施し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株（ｄｅｌｔａ＆ｏｍｉｃｒｏｎ）ＶＨＨ抗体ＤＮＡライブラリを得た。
上記１－３－（４）で得られた各変異株のＰＣＲ産物を鋳型として、上記３－４と同様の方法にてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液を調製した。ＰＢＳで希釈した各ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液４４．５μＬに、２００ｎＭのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株溶液５０μＬ、１０％ Ｔｗｅｅｎ ０．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ 溶液 ５μＬを順次加え、４℃で１時間インキュベートした。次に、このｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ混合液を２０μＬの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１）（ベリタス）に加え、４℃で３０分間転倒混和し、上清を除去後、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、溶出操作後、溶出液からＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを回収した。回収したｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ溶液から、ＰＣＲ増幅を経て、本操作を更に１回実施し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株（ｄｅｌｔａ＆ｏｍｉｃｒｏｎ）ＶＨＨ抗体ＤＮＡライブラリを得た。
【0047】
（実施例２）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株（ｄｅｌｔａ＆ｏｍｉｃｒｏｎ）ＶＨＨ抗体ＤＮＡライブラリからの陽性クローンの同定
２－１．ＶＨＨ発現プラスミドライブラリの作成
上記のスクリーニングによって選抜したＶＨＨをコードするＤＮＡライブラリを、ＶＨＨ発現用のプラスミドベクターにクローニングした。まず、スクリーニングによって取得したＤＮＡライブラリに対して、制限酵素処理するための配列をＰＣＲにより付加し、ＰＣＲ産物を得た。反応液は、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ、1μＬのスクリーニング産物、それぞれ１０ｐｍｏｌのＰＬ＿ＶＨＨ＿ＳｆｉＩ－ＮｃｏＩ＿ＦＷ（配列番号１８）及び ＰＬ＿ＶＨＨ＿ＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩ＿ＲＶ（配列番号１９）を超純水で５０μＬに調整した。ＰＣＲプログラムは、アニーリング温度を５５℃、伸長時間を１５秒でＰＣＲ反応を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現プラスミドベクターとを、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて、３７℃にて１時間処理し、その後、制限酵素ＳｆｉＩを用いて、５０℃にて1時間処理した。ＩｎｓｅｒｔＤＮＡとなるＰＣＲ産物由来の反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰで精製し、プラスミドベクター由来の反応産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動に供して切り出し精製を行った。精製したプラスミドベクターＤＮＡを脱リン酸化酵素Ｆａｓｔ ＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃にて1時間脱リン酸化反応させた。その後、Ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡとプラスミドベクターＤＮＡとのモル比が１：１０になるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、１６℃にて一晩でライゲーション反応を行い、選抜ＶＨＨライブラリが導入されたプラスミドライブラリを取得した。
２－１．ＶＨＨ発現プラスミドライブラリの作成
上記のスクリーニングによって選抜したＶＨＨをコードするＤＮＡライブラリを、ＶＨＨ発現用のプラスミドベクターにクローニングした。まず、スクリーニングによって取得したＤＮＡライブラリに対して、制限酵素処理するための配列をＰＣＲにより付加し、ＰＣＲ産物を得た。反応液は、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ、1μＬのスクリーニング産物、それぞれ１０ｐｍｏｌのＰＬ＿ＶＨＨ＿ＳｆｉＩ－ＮｃｏＩ＿ＦＷ（配列番号１８）及び ＰＬ＿ＶＨＨ＿ＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩ＿ＲＶ（配列番号１９）を超純水で５０μＬに調整した。ＰＣＲプログラムは、アニーリング温度を５５℃、伸長時間を１５秒でＰＣＲ反応を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現プラスミドベクターとを、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて、３７℃にて１時間処理し、その後、制限酵素ＳｆｉＩを用いて、５０℃にて1時間処理した。ＩｎｓｅｒｔＤＮＡとなるＰＣＲ産物由来の反応液をＡＭＰｕｒｅＸＰで精製し、プラスミドベクター由来の反応産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動に供して切り出し精製を行った。精製したプラスミドベクターＤＮＡを脱リン酸化酵素Ｆａｓｔ ＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃にて1時間脱リン酸化反応させた。その後、Ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡとプラスミドベクターＤＮＡとのモル比が１：１０になるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、１６℃にて一晩でライゲーション反応を行い、選抜ＶＨＨライブラリが導入されたプラスミドライブラリを取得した。
【0048】
２－２．コリネ菌を用いた選抜済みＶＨＨを含む培養上清の取得
電気穿孔法により各プラスミドライブラリをＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍへ導入し、形質転換体とした。得られた形質転換体をＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃にて一晩培養を行った。その後、前記培養液をＶＨＨ発現用培地ＰＭ１Ｓ培地に継代し、２５℃にて７２時間培養を行って、培養上清中にＶＨＨの分泌発現を行った。培養上清の回収は３０００ｘｇの遠心操作により行い、さらに０．２２μmのフィルター処理により上清から菌体を除去した。
電気穿孔法により各プラスミドライブラリをＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍへ導入し、形質転換体とした。得られた形質転換体をＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃にて一晩培養を行った。その後、前記培養液をＶＨＨ発現用培地ＰＭ１Ｓ培地に継代し、２５℃にて７２時間培養を行って、培養上清中にＶＨＨの分泌発現を行った。培養上清の回収は３０００ｘｇの遠心操作により行い、さらに０．２２μmのフィルター処理により上清から菌体を除去した。
【0049】
２－３．バイオレイヤー干渉法によるｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、上記で産生したＶＨＨクローンをＨｉｓ１Ｋセンサーチップに固相化して各ターゲット分子に対する結合活性を測定した。リガンドとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）、Ｆｃ Ｔａｇ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の濃度を２００ｎＭに調製し、７０μＬの測定液を３８４ウェルプレートに添加して各標的分子の結合を測定した。測定前にＤｉｐ ａｎｄ ＲｅａｄＴＭ Ｈｉｓ１Ｋ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）の先端を２００μＬのＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４）に１０分間浸漬させて、センサーチップを水和させた。ラン測定毎の測定順の条件は以下の通りとした。
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で３０秒間の測定。
２）Ｌｏａｄｉｎｇｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔで５０倍希釈したＶＨＨで６０秒間の測定。
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で３０秒間の測定。
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔで希釈し調製した各ターゲット分子で１００秒間の測定。
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で１００秒間の測定。
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ ２．２）中で５秒間測定、ＰＢＳ－Ｔ中で３０秒間の測定。この工程を３回繰り返す。得られたデータはＯｃｔｅｔソフトウェアバージョン（１．２．１．５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて処理した。解析の結果を図１に示す。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅが０．１ｎｍ以上の値を示したものを陽性クローンとすることにより、ＶＭ７９３及びＶＭ８００を陽性クローンとして選抜した。
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、上記で産生したＶＨＨクローンをＨｉｓ１Ｋセンサーチップに固相化して各ターゲット分子に対する結合活性を測定した。リガンドとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）、Ｆｃ Ｔａｇ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の濃度を２００ｎＭに調製し、７０μＬの測定液を３８４ウェルプレートに添加して各標的分子の結合を測定した。測定前にＤｉｐ ａｎｄ ＲｅａｄＴＭ Ｈｉｓ１Ｋ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）の先端を２００μＬのＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４）に１０分間浸漬させて、センサーチップを水和させた。ラン測定毎の測定順の条件は以下の通りとした。
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で３０秒間の測定。
２）Ｌｏａｄｉｎｇｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔで５０倍希釈したＶＨＨで６０秒間の測定。
３）Ｂａｓｅｌｉｎｅｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で３０秒間の測定。
４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔで希釈し調製した各ターゲット分子で１００秒間の測定。
５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で１００秒間の測定。
６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ ２．２）中で５秒間測定、ＰＢＳ－Ｔ中で３０秒間の測定。この工程を３回繰り返す。得られたデータはＯｃｔｅｔソフトウェアバージョン（１．２．１．５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて処理した。解析の結果を図１に示す。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅが０．１ｎｍ以上の値を示したものを陽性クローンとすることにより、ＶＭ７９３及びＶＭ８００を陽性クローンとして選抜した。
【0050】
２－４．陽性クローンをコードする塩基配列の解析
２－３にて選抜した陽性クローンについて各ＶＨＨ遺伝子の塩基配列を特定した。各陽性クローンである形質転換体を３７℃にて一晩培養を行い、この培養液についてコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物に１０ｕｎｉｔｓのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び０．５ ｕｎｉｔｓのＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｒＳＡＰ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、３７℃で４５分反応させた後、８０℃で１５分反応させて失活させた。各反応液を用いてＤＮＡのシーケンス解析をＥｕｒｏｆｉｎｓ ｇｅｎｏｍｉｃｓに外注した。その結果、ＶＭ７９３及びＶＭ８００をコードする塩基配列はそれぞれ（配列番号２０）及び（配列番号２１）であることがわかった。また、ＶＭ７９３及びＶＭ８００をコードするアミノ酸配列はそれぞれ（配列番号１２）及び（配列番号１５）であることがわかった。当該アミノ酸配列において、ＶＭ７９３では１～２５番がＦＲ１、２６～３５番がＣＤＲ１、３６～４９番がＦＲ２、５０～５９番がＣＤＲ２、６０～９８番がＦＲ３、９９～１１３番がＣＤＲ３、１１４～１２４番がＦＲ４であり、ＶＭ８００では１～２５番がＦＲ１、２６～３５番がＣＤＲ１、３６～４９番がＦＲ２、５０～５８番がＣＤＲ２、５９～９７番がＦＲ３、９８～１０９番がＣＤＲ３、１１０～１２０番がＦＲ４である。
２－３にて選抜した陽性クローンについて各ＶＨＨ遺伝子の塩基配列を特定した。各陽性クローンである形質転換体を３７℃にて一晩培養を行い、この培養液についてコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物に１０ｕｎｉｔｓのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び０．５ ｕｎｉｔｓのＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｒＳＡＰ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、３７℃で４５分反応させた後、８０℃で１５分反応させて失活させた。各反応液を用いてＤＮＡのシーケンス解析をＥｕｒｏｆｉｎｓ ｇｅｎｏｍｉｃｓに外注した。その結果、ＶＭ７９３及びＶＭ８００をコードする塩基配列はそれぞれ（配列番号２０）及び（配列番号２１）であることがわかった。また、ＶＭ７９３及びＶＭ８００をコードするアミノ酸配列はそれぞれ（配列番号１２）及び（配列番号１５）であることがわかった。当該アミノ酸配列において、ＶＭ７９３では１～２５番がＦＲ１、２６～３５番がＣＤＲ１、３６～４９番がＦＲ２、５０～５９番がＣＤＲ２、６０～９８番がＦＲ３、９９～１１３番がＣＤＲ３、１１４～１２４番がＦＲ４であり、ＶＭ８００では１～２５番がＦＲ１、２６～３５番がＣＤＲ１、３６～４９番がＦＲ２、５０～５８番がＣＤＲ２、５９～９７番がＦＲ３、９８～１０９番がＣＤＲ３、１１０～１２０番がＦＲ４である。
【0051】
（実施例３）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌を用いたＶＭ７９３及びＶＭ８００の生産
３－１. ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換え プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号２２）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号２３）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号２４）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号２５）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
３－１. ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換え プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号２２）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号２３）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号２４）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号２５）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
【0052】
３－２．Ｈｉｓタグ付きＶＭ７９３及びＶＭ８００生産用プラスミドの設計
ＶＨ７９３（配列番号１２）及びＶＭ８００（配列番号１５）のＣ末端にＧＳ＋Ｈｉｓタグ(配列番号２６)が付与されたものをＨｉｓタグ付きＶＭ７９３（配列番号２７）及びＨｉｓタグ付きＶＭ８００（配列番号２８）としてアミノ酸配列を設計した。枯草菌による生産のために、Ｈｉｓタグ付きＶＨ７９３塩基配列（配列番号２９）及びＨｉｓタグ付きＶＨ８００塩基配列（配列番号３０）をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって３－１で構築したＶＨＨ発現用プラスミドの配列番号３１と配列番号３２の間に組み込む形で合成した。
ＶＨ７９３（配列番号１２）及びＶＭ８００（配列番号１５）のＣ末端にＧＳ＋Ｈｉｓタグ(配列番号２６)が付与されたものをＨｉｓタグ付きＶＭ７９３（配列番号２７）及びＨｉｓタグ付きＶＭ８００（配列番号２８）としてアミノ酸配列を設計した。枯草菌による生産のために、Ｈｉｓタグ付きＶＨ７９３塩基配列（配列番号２９）及びＨｉｓタグ付きＶＨ８００塩基配列（配列番号３０）をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって３－１で構築したＶＨＨ発現用プラスミドの配列番号３１と配列番号３２の間に組み込む形で合成した。
【0053】
３－３．ＶＭ７９３及びＶＭ８００生産用プラスミドの設計
上記３－２にて作製されたＨｉｓタグ付きＶＭ７９３発現用プラスミド及びＨｉｓタグ付きＶＭ８００発現用プラスミドを鋳型ＤＮＡとして、ＶＭ７９３発現用プラスミド及びＶＭ８００発現用プラスミドをそれぞれ作製した。ＶＭ７９３発現用プラスミドはＨｉｓタグ付きＶＭ７９３発現用プラスミドを鋳型として５’－ＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＣ－３’（配列番号３３）と５’－ＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧ－３’（配列番号３４）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅し、得られたＰＣＲ産物を３－４に示す方法で枯草菌に形質転換することで作製した。ＶＭ８００発現用プラスミドはＨｉｓタグ付きＶＭ８００発現用プラスミドを鋳型として５’－ＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＣ－３’（配列番号３３）と５’－ＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧ－３’（配列番号３４）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅し、得られたＰＣＲ産物を３－４に示す方法で枯草菌に形質転換することで作製した。
上記３－２にて作製されたＨｉｓタグ付きＶＭ７９３発現用プラスミド及びＨｉｓタグ付きＶＭ８００発現用プラスミドを鋳型ＤＮＡとして、ＶＭ７９３発現用プラスミド及びＶＭ８００発現用プラスミドをそれぞれ作製した。ＶＭ７９３発現用プラスミドはＨｉｓタグ付きＶＭ７９３発現用プラスミドを鋳型として５’－ＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＣ－３’（配列番号３３）と５’－ＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧ－３’（配列番号３４）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅し、得られたＰＣＲ産物を３－４に示す方法で枯草菌に形質転換することで作製した。ＶＭ８００発現用プラスミドはＨｉｓタグ付きＶＭ８００発現用プラスミドを鋳型として５’－ＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＴＣ－３’（配列番号３３）と５’－ＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧ－３’（配列番号３４）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅し、得られたＰＣＲ産物を３－４に示す方法で枯草菌に形質転換することで作製した。
【0054】
３－４．組換え枯草菌の作製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特許第４４８５３４１号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒＸ）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦへのプラスミド又はＰＣＲ産物の導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックしたＤｐｒ９ΔｓｉｇＦを植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットを４ｍｇ／ｍＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））に懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットを４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液に３５０μＬのＳＭＭＰを加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特許第４４８５３４１号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒＸ）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦへのプラスミド又はＰＣＲ産物の導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックしたＤｐｒ９ΔｓｉｇＦを植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットを４ｍｇ／ｍＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））に懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットを４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液に３５０μＬのＳＭＭＰを加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
【0055】
３－５．ＶＨＨ産生
３－４で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。Ｈｉｓタグ付きＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を、その他のＶＨＨはＡｍｓｐｈｅｒｅＴＭ Ａ３（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。
３－４で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。Ｈｉｓタグ付きＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を、その他のＶＨＨはＡｍｓｐｈｅｒｅＴＭ Ａ３（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。
【0056】
２μＬの精製した各ＶＨＨの水溶液（共に１ｍｇ／ｍＬ）、５μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２μＬのＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ （１０×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４．１１μＬのＨ２Ｏを混合し、１００℃で加熱した。その後、１０μＬのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、５μＬのＮｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もゲルのウェルにアプライした。ゲルはＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％，Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，１．０ｍｍ，Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ，１２－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。泳動用緩衝液にはＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （２０×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を水で２０倍希釈して調製した緩衝液を用いた。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニセル電気泳動システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を泳動槽として用い、ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（商標）９０Ｗ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続して２００Ｖの電圧で４０分間電気泳動を行った。その後、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色し、目的タンパク質のバンドの有無を確認した。その結果、いずれのＶＨＨも高純度に生産できたことが明らかになった（図２）。
【0057】
（実施例４）表面プラズモン共鳴法によるＶＨＨの結合活性の評価
４－１．Ｈｉｓタグ付きＶＭ７９３の結合活性の評価
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、Ｈｉｓタグ付きＶＭ７９３のＤｅｌｔａ型及びオミクロン型（Ｂ．１．１．５２９型）のＲＢＤへの結合活性を評価した。Ｂｉｏｔｉｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、Ａｖｉタグ付きＤｅｌｔａ型ＲＢＤ［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ （Ｌ４５２Ｒ， Ｔ４７８Ｋ）、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇ（商標） （ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、Ａｖｉタグ付きＢ．１．１．５２９型ＲＢＤ［Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ， Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇ（商標）（Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］をリガンドとしてセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰ）（Ｃｙｔｉｖａ）に固定化した。その後、アナライトとしてＨｉｓタグ付きＶＭ７９３を流し、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓモードで両者の結合活性を測定した。ランニング緩衝液にはＨＢＳ－ＥＰ＋ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いた。詳細な測定順序は以下の通りである。まずはＲＢＤのセンサーチップへの固定化を行った。流速を２μＬ／ｍｉｎに設定し、キットに付属のＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ ｒｅａｇｅｎｔを３００秒間流した。その後、ランニング緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈したＲＢＤを流速２μＬ／ｍｉｎで１８０秒間流して、センサーチップへの固定化を行った。次に、結合活性の測定を行った。流速を３０μＬ／ｍｉｎに設定し、ランニング緩衝液で適当な濃度に希釈したＶＨＨをＣｏｎｔａｃｔ Ｔｉｍｅを１８０秒、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅを６００秒に設定して流すことで、ＲＢＤとＶＨＨの相互作用を測定した。最後に、センサーチップ表面の再生を行った。流速を１０μＬ／ｍｉｎに設定し、３５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を６０秒間添加することでセンサーチップに固定化されたＲＢＤを溶離した。測定終了後にＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行った。
４－１．Ｈｉｓタグ付きＶＭ７９３の結合活性の評価
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、Ｈｉｓタグ付きＶＭ７９３のＤｅｌｔａ型及びオミクロン型（Ｂ．１．１．５２９型）のＲＢＤへの結合活性を評価した。Ｂｉｏｔｉｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、Ａｖｉタグ付きＤｅｌｔａ型ＲＢＤ［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ （Ｌ４５２Ｒ， Ｔ４７８Ｋ）、Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇ（商標） （ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、Ａｖｉタグ付きＢ．１．１．５２９型ＲＢＤ［Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ， Ｈｉｓ、Ａｖｉｔａｇ（商標）（Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］をリガンドとしてセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰ）（Ｃｙｔｉｖａ）に固定化した。その後、アナライトとしてＨｉｓタグ付きＶＭ７９３を流し、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓモードで両者の結合活性を測定した。ランニング緩衝液にはＨＢＳ－ＥＰ＋ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いた。詳細な測定順序は以下の通りである。まずはＲＢＤのセンサーチップへの固定化を行った。流速を２μＬ／ｍｉｎに設定し、キットに付属のＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ ｒｅａｇｅｎｔを３００秒間流した。その後、ランニング緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈したＲＢＤを流速２μＬ／ｍｉｎで１８０秒間流して、センサーチップへの固定化を行った。次に、結合活性の測定を行った。流速を３０μＬ／ｍｉｎに設定し、ランニング緩衝液で適当な濃度に希釈したＶＨＨをＣｏｎｔａｃｔ Ｔｉｍｅを１８０秒、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅを６００秒に設定して流すことで、ＲＢＤとＶＨＨの相互作用を測定した。最後に、センサーチップ表面の再生を行った。流速を１０μＬ／ｍｉｎに設定し、３５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を６０秒間添加することでセンサーチップに固定化されたＲＢＤを溶離した。測定終了後にＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行った。
【0058】
結果を図３及び表１に示す。Ｈｉｓタグ付きＶＭ７９３はＤｅｌｔａ型及びＢ．１．１．５２９型のＲＢＤに対して、良好な結合活性を示すことが明らかになった。
【0059】
【表1】
【0060】
４－２．Ｈｉｓタグ付きＶＭ８００の結合活性の評価
上記の４－１の方法に従い、Ｈｉｓタグ付きＶＭ８００のＤｅｌｔａ型及びオミクロン型（Ｂ．１．１．５２９型）のＲＢＤへの結合活性を評価した。結果を図４及び表２に示すが、いずれのＲＢＤに対しても良好な結合活性を示すことが明らかになった。
上記の４－１の方法に従い、Ｈｉｓタグ付きＶＭ８００のＤｅｌｔａ型及びオミクロン型（Ｂ．１．１．５２９型）のＲＢＤへの結合活性を評価した。結果を図４及び表２に示すが、いずれのＲＢＤに対しても良好な結合活性を示すことが明らかになった。
【0061】
【表2】
【0062】
４－３．ＶＭ７９３の結合活性の評価
上記の４－１の方法に従い、Ｗｕｈａｎ型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ，Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、Ｄｅｌｔａ型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｔ４７８Ｋ），Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、Ｂ．１．１．５２９型［Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ，Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標） Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、ＢＡ．４／５型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ， Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＢＡ．４＆ＢＡ．５／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］，ＢＡ．２．７５型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ，Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＢＡ．２．７５／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］のＲＢＤに対して、ＶＭ７９３の結合活性を評価した。結果を図５及び表３に示すが、ＶＭ７９３はいずれの変異株に対しても非常に良好な結合活性を示した。つまり、ＶＭ７９３が様々な変異株に幅広く結合活性を有することが明らかになった。
上記の４－１の方法に従い、Ｗｕｈａｎ型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ，Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、Ｄｅｌｔａ型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｔ４７８Ｋ），Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、Ｂ．１．１．５２９型［Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ，Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標） Ｂ．１．１．５２９／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］、ＢＡ．４／５型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ， Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＢＡ．４＆ＢＡ．５／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］，ＢＡ．２．７５型［Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ，Ｈｉｓ，Ａｖｉｔａｇ（商標）（ＢＡ．２．７５／Ｏｍｉｃｒｏｎ）（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）］のＲＢＤに対して、ＶＭ７９３の結合活性を評価した。結果を図５及び表３に示すが、ＶＭ７９３はいずれの変異株に対しても非常に良好な結合活性を示した。つまり、ＶＭ７９３が様々な変異株に幅広く結合活性を有することが明らかになった。
【0063】
【表3】
【0064】
４－４．表面プラズモン共鳴法によるＶＭ８００の結合活性の評価
上記の４－１の方法に従い、Ｗｕｈａｎ型、Ｄｅｌｔａ型、Ｂ．１．１．５２９型、ＢＡ．４／５型、ＢＡ．２．７５型のＲＢＤに対して、ＶＭ８００の結合活性を評価した結果を図６及び表４に示す。ＶＭ８００はＷｕｈａｎ型及びＤｅｌｔａ型に対して良好な結合活性を示した。一方で、Ｂ．１．１．５２９型への結合活性はやや低下傾向にあり、ＢＡ．４／５型及びＢＡ．２．７５型への結合は検出されなかった。
上記の４－１の方法に従い、Ｗｕｈａｎ型、Ｄｅｌｔａ型、Ｂ．１．１．５２９型、ＢＡ．４／５型、ＢＡ．２．７５型のＲＢＤに対して、ＶＭ８００の結合活性を評価した結果を図６及び表４に示す。ＶＭ８００はＷｕｈａｎ型及びＤｅｌｔａ型に対して良好な結合活性を示した。一方で、Ｂ．１．１．５２９型への結合活性はやや低下傾向にあり、ＢＡ．４／５型及びＢＡ．２．７５型への結合は検出されなかった。
【0065】
【表4】
【0066】
（実施例５）培養細胞を用いたＶＨＨのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性の評価
５－１．ヒトＡＣＥ２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ２）導入２９３Ｔ細胞の構築
レンチウイルスベクターを用いて、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にヒトＡＣＥ２を導入し、ハイグロマイシン（ナカライ）で選択培養を行い、定常的にヒトＡＣＥ２を発現させた。これにより作製された培養細胞を２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞と呼ぶ。
５－１．ヒトＡＣＥ２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ２）導入２９３Ｔ細胞の構築
レンチウイルスベクターを用いて、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にヒトＡＣＥ２を導入し、ハイグロマイシン（ナカライ）で選択培養を行い、定常的にヒトＡＣＥ２を発現させた。これにより作製された培養細胞を２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞と呼ぶ。
【0067】
ＶＭ７９３及びＶＭ８００を供試した。各ＶＨＨは１００μｇ／ｍＬまたは３３．３μｇ／ｍＬを最高濃度とし、３倍希釈系列を作製した。各濃度のＶＨＨは１ウェルあたり１００μＬになるようにＵ底９６ウェルプレート（ビオラモ）に分注した。供試したウイルス株を表５に示す。各ウイルス株は培養細胞への感染時にＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝５（ＲＮＡコピー）になるように調整した。１００μLの調整した各ウイルス液を１００μＬのＶＨＨ液と混合し、３７℃で２時間反応させた後、４℃で１６時間インキュベートした。
【0068】
【表5】
【0069】
１００％のコンフルエントになるように培養された２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、１ウェルあたり１００ｕＬの２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）含有培地（ダルベッコ変法イーグル培地；ナカライ）に置換した。１００ｕＬのウイルス－ＶＨＨ混合液を２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。
【0070】
４８時間後に２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞の培養上清中のウイルス量（ＲＮＡコピー数）をｑＰＣＲで測定した。定量ＰＣＲにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いた。培養上清３μＬを前処理液３μＬと混合し、そのうちの３μＬをＲＴ―ＰＣＲ反応液（反応液１５μＬ、酵素液２．５μＬ、プライマー・プローブ液２．５μＬ）に加えて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６にて定量ＰＣＲを行った。反応条件は、逆転写反応４２度・５分、プレ変性９５度・１０秒、サイクル反応［変性９５℃・１秒、会合５０℃・３秒、伸長５５℃・１０秒］４５サイクルで検出を行った。
【0071】
培養上清中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数をもとに、ＶＭ７９３及びＶＭ８００の各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する細胞への感染阻害率（図７）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）（表６、表７）を算出した。その結果、ＶＭ７９３はＤｅｌｔａ株、ＢＡ．１．１８株、ＢＡ．２株、ＢＡ．５．２．１株、ＢＱ．１株に対して良好な中和活性を示すことが確認された。また、ＶＭ８００に関してはＤｅｌｔａ株、ＢＡ．１．１８株に対して良好な中和活性を示すことが確認された。
【0072】
【表6】
【0073】
【表7】
【0074】
（実施例６）培養細胞を用いたＶＨＨカクテルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性の評価
実施例５に記載の方法に従って、ＶＭ７９３及びＶＭ８００を混合した際のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を評価した。ウイルス株としてはＶＭ７９３及びＶＭ８００が中和活性を示すことが確認されたＫＵＨ００３株を用いた。ＶＭ７９３及びＶＭ８００の混合は両ＶＨＨ濃度を３３μｇ／ｍＬに調製した後、等量混合し、総ＶＨＨ量を６６μｇ／ｍＬになるように行った。ＶＭ７９３及びＶＭ８００を混合したものをＶＭ７９３・ＶＭ８００カクテルと呼ぶ。
実施例５に記載の方法に従って、ＶＭ７９３及びＶＭ８００を混合した際のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を評価した。ウイルス株としてはＶＭ７９３及びＶＭ８００が中和活性を示すことが確認されたＫＵＨ００３株を用いた。ＶＭ７９３及びＶＭ８００の混合は両ＶＨＨ濃度を３３μｇ／ｍＬに調製した後、等量混合し、総ＶＨＨ量を６６μｇ／ｍＬになるように行った。ＶＭ７９３及びＶＭ８００を混合したものをＶＭ７９３・ＶＭ８００カクテルと呼ぶ。
【0075】
培養上清中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数をもとに、ＶＭ７９３、ＶＭ８００、ＶＭ７９３・ＶＭ８００カクテルの各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する細胞への感染阻害率（図８）及びＩＣ５０（表８）を算出した。その結果、ＶＭ７９３、ＶＭ８００を混合することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞への感染阻害率が相乗的に向上することが確認された。
【0076】
【表8】
【0077】
（実施例７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対するＶＨＨの結合部位解析
ＶＭ７９３、ＶＭ８００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株（ｄｅｌｔａ株）における結合部位を決定するために、自動 ＨＤＸ２システム (ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ) を使用して水素/重水素交換質量分析 (ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。抗原として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｔ４７８Ｋ），Ｈｉｓ Ｔａｇ（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。当該抗原のアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列のC末端にリンカーを介したＨｉｓタグ（配列番号３５）が付与された配列番号３６である。自動ＨＤＸ２システムは、超高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒ、ｎａｎｏ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ）質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｙｎａｐｔ ＸＳ）、ＬＥＡＰ ＰＡＬ（Ｔｒａｊａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＮＣ）から構成した。各評価サンプルのタンパク質の最終濃度は２５μＭに設定した。リファレンス及び重水素サンプルは、３μLの各評価サンプルを５７μＬの軽水バッファー（１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０）及び重水バッファー（１０ｍＭ リン酸カリウム, ｐＤ ７．０）でそれぞれ希釈することで調製した。重水素交換温度及び時間は、２０℃で、０．５分、１分、１０分、６０分、２４０分の５種類のタイムポイントを使用した。希釈後、タンパク質サンプルを５０μLの氷冷クエンチバッファー（１００ｍＭ リン酸カリウム、４Ｍ 塩酸グアニジン、２００ｍＭ ＴＣＥＰ, ｐＨ２．３、０℃）でクエンチした。９０ μＬのクエンチサンプルをＨＤＸモジュールに注入し、７０μＬ/ｍｉｎの流速で３分間オンラインペプシンカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｅｎｚｙｍａｔｅ ＢＥＨ ｐｅｐｓｉｎ）にてタンパク質消化を行った後、ペプチド断片をトラップカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｖａｎｇｕａｒｄ １．７μｍ）にてトラップした。その後、ペプチドを０．１％ギ酸含有超純水/アセトニトリル系による１７分間のグラジエント条件（アセトニトリルとして５～９５％）にて分析カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８：１．７μｍ）を使用して精製し、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ ＸＳにエレクトロスプレー後、質量/電荷 (ｍ／ｚ) の取得ウィンドウを５０－２０００に設定してペプチド断片の質量を検出した。ロックマス補正は、５００ｆ／ｍｏｌ のＧｌｕＦｉｂ（７８５．８４２６ m/z, Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の間欠注入にて実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ―２ ＲＢＤ ｄｅｌｔａ株のＭＳＥ解析からペプチドを同定し、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してデータを解析した。その後、ＰＬＧＳで同定されたペプチドをＤｙｎａｍＸ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ）で使用した。各ペプチドの重水素取り込みは、重水素化サンプルと未重水素化サンプルの質量エンベロープのセントロイドを比較することによって計算した。ＨＤＸデータは、すべてのＨＤＸ時点において、ＲＢＤとＶＨＨの遊離状態と複合状態の２つの状態間の同一ペプチドの重水素取り込み量の差を計算し、合計することで解析した。両タンパク質状態の同一ペプチドで比較したため、ＨＤＸデータ解析では逆交換補正係数は適用しなかった。
ＶＭ７９３、ＶＭ８００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株（ｄｅｌｔａ株）における結合部位を決定するために、自動 ＨＤＸ２システム (ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ) を使用して水素/重水素交換質量分析 (ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。抗原として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｔ４７８Ｋ），Ｈｉｓ Ｔａｇ（ＭＡＬＳ ｖｅｒｉｆｉｅｄ）（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。当該抗原のアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列のC末端にリンカーを介したＨｉｓタグ（配列番号３５）が付与された配列番号３６である。自動ＨＤＸ２システムは、超高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒ、ｎａｎｏ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ）質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｙｎａｐｔ ＸＳ）、ＬＥＡＰ ＰＡＬ（Ｔｒａｊａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＮＣ）から構成した。各評価サンプルのタンパク質の最終濃度は２５μＭに設定した。リファレンス及び重水素サンプルは、３μLの各評価サンプルを５７μＬの軽水バッファー（１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０）及び重水バッファー（１０ｍＭ リン酸カリウム, ｐＤ ７．０）でそれぞれ希釈することで調製した。重水素交換温度及び時間は、２０℃で、０．５分、１分、１０分、６０分、２４０分の５種類のタイムポイントを使用した。希釈後、タンパク質サンプルを５０μLの氷冷クエンチバッファー（１００ｍＭ リン酸カリウム、４Ｍ 塩酸グアニジン、２００ｍＭ ＴＣＥＰ, ｐＨ２．３、０℃）でクエンチした。９０ μＬのクエンチサンプルをＨＤＸモジュールに注入し、７０μＬ/ｍｉｎの流速で３分間オンラインペプシンカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｅｎｚｙｍａｔｅ ＢＥＨ ｐｅｐｓｉｎ）にてタンパク質消化を行った後、ペプチド断片をトラップカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｖａｎｇｕａｒｄ １．７μｍ）にてトラップした。その後、ペプチドを０．１％ギ酸含有超純水/アセトニトリル系による１７分間のグラジエント条件（アセトニトリルとして５～９５％）にて分析カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８：１．７μｍ）を使用して精製し、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ ＸＳにエレクトロスプレー後、質量/電荷 (ｍ／ｚ) の取得ウィンドウを５０－２０００に設定してペプチド断片の質量を検出した。ロックマス補正は、５００ｆ／ｍｏｌ のＧｌｕＦｉｂ（７８５．８４２６ m/z, Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の間欠注入にて実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ―２ ＲＢＤ ｄｅｌｔａ株のＭＳＥ解析からペプチドを同定し、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してデータを解析した。その後、ＰＬＧＳで同定されたペプチドをＤｙｎａｍＸ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ）で使用した。各ペプチドの重水素取り込みは、重水素化サンプルと未重水素化サンプルの質量エンベロープのセントロイドを比較することによって計算した。ＨＤＸデータは、すべてのＨＤＸ時点において、ＲＢＤとＶＨＨの遊離状態と複合状態の２つの状態間の同一ペプチドの重水素取り込み量の差を計算し、合計することで解析した。両タンパク質状態の同一ペプチドで比較したため、ＨＤＸデータ解析では逆交換補正係数は適用しなかった。
【0078】
その結果、ＶＭ７９３とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株の重水素取り込みは、遊離及び抗原－抗体結合状態で一般的に観察される１２４のペプチドについて観測された。このうち重水素交換度の算出に至ったペプチドは４８本であり、ＲＢＤのペプチド配列の ９５．４％をカバーした。ＶＭ７９３の結合による重水素取り込みの有意な減少は、配列番号１で示されるＲＢＤのアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでのアミノ酸領域と、１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域にて観察された（図９）。そのため、ＲＢＤにおける当該領域がＶＭ７９３の結合部位を含むアミノ酸配列であることがわかった。即ち、ＶＭ７９３はＲＢＤに対して既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体とは異なる結合部位を示すことがわかった。
ＶＭ８００とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株の重水素取り込みは、遊離及び抗原-抗体結合状態で一般的に観察される２１７のペプチドについて観測された。このうち、重水素交換度の算出に至ったペプチドは４５本であり、ＲＢＤペプチドの ８１．４％をカバーした。ＶＭ８００の結合による重水素取り込みの有意な減少は、配列番号１で示されるＲＢＤのアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域と、１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域にて観察された（図１０）。そのため、ＲＢＤにおける当該領域がＶＭ８００の結合部位を含むアミノ酸配列の領域であることがわかった。
ＶＭ８００とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ変異株の重水素取り込みは、遊離及び抗原-抗体結合状態で一般的に観察される２１７のペプチドについて観測された。このうち、重水素交換度の算出に至ったペプチドは４５本であり、ＲＢＤペプチドの ８１．４％をカバーした。ＶＭ８００の結合による重水素取り込みの有意な減少は、配列番号１で示されるＲＢＤのアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域と、１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域にて観察された（図１０）。そのため、ＲＢＤにおける当該領域がＶＭ８００の結合部位を含むアミノ酸配列の領域であることがわかった。
【0079】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤのアミノ酸配列（ＱＨＲ６３２５０．２）をもとに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株（Ｄｅｌｔａ株、ＢＡ１株、ＢＡ２．７５株、ＢＡ４／５株）において代表的な変異を反映させたアミノ酸配列を作製し、ＣｌｕｓｔａｌＷによるアライメントを行った。当該アライメント結果に対して、ＶＭ７９３の結合領域（図１１）を示す。Ｗｕｈａｎ株、Ｄｅｌｔａ株、ＢＡ１株、ＢＡ２．７５株、ＢＡ４／５株のＲＢＤに対して良好な結合活性を示すＶＭ７９３は、ＲＢＤ上における独立した２ヵ所のアミノ酸領域（配列番号１の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでのアミノ酸領域と、１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでのアミノ酸領域）に結合部位を有する。このうち、配列番号１の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでのアミノ酸領域にはアミノ酸配列の変異が認められず、このことがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な変異株に結合活性を維持している理由であることが考えられた。また、配列番号１の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでのアミノ酸領域では、変異株毎に特徴的なアミノ酸配列の変異が認められるが、結合活性（表３）及び中和活性（表６）の結果より、当該領域において認められるアミノ酸変異はＶＭ７９３の結合様式に大きな影響を与えておらず、ＶＭ７９３が当該アミノ酸領域に結合部位をもつことが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な変異株に結合活性及び中和活性を維持している理由であることが考えられた。
【0080】
当該アライメント結果に対して、ＶＭ８００の結合領域（図１２）を示す。Ｗｕｈａｎ株、Ｄｅｌｔａ株に対して良好な結合活性を示すＶＭ８００は、ＲＢＤ上における独立した２ヵ所のアミノ酸領域（配列番号１の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域と、１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンアミノ酸領域）に結合部位を有する。即ち、ＶＭ８００はＲＢＤに対してＶＭ７９３とは異なる結合部位を示すことがわかり、このことがＶＭ７９３・ＶＭ８００カクテルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性がＶＭ７９３またはＶＭ８００を単独で用いた場合よりも相乗的に向上する理由であると考えられた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】