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特開2024-165590タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、組成物、ポリエチレンテレフタレートの検出方法、及びポリエチレンテレフタレートの分解方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024165590
(43)【公開日】2024-11-28
(54)【発明の名称】タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、組成物、ポリエチレンテレフタレートの検出方法、及びポリエチレンテレフタレートの分解方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20241121BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241121BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241121BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241121BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241121BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20241121BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20241121BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20241121BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N9/14
C07K1/13
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023081904
(22)【出願日】2023-05-17
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、創発的研究支援事業、「プラスチックを探して壊すバイオマイクロドローンの創出」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304023318
【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中村 彰彦
(72)【発明者】
【氏名】橋野 嘉仁
【テーマコード（参考）】
2G043
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043AA04
2G043BA14
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA01
2G043DA02
2G043DA08
2G043DA09
2G043EA01
2G043EA13
2G043FA07
2G043KA02
2G043KA03
2G043KA05
2G043LA01
2G043MA01
2G043NA01
2G043NA05
2G043NA11
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA46
4B065CA55
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA89
4H045EA50
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＰＥＴへの結合性を有するタンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び形質転換体；前記タンパク質を含む組成物；並びにＰＥＴの検出方法及び分解方法を提供する。
【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、ポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、タンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び形質転換体；前記タンパク質を含む組成物；並びにＰＥＴの検出方法及び分解方法。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、ポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、タンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び形質転換体；前記タンパク質を含む組成物；並びにＰＥＴの検出方法及び分解方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、
ポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、タンパク質。
ポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、タンパク質。
【請求項2】
６０℃でポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項3】
さらに標識物質を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項4】
前記標識物質が蛍光色素又は蛍光タンパク質である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項5】
さらに酵素ドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項6】
前記酵素ドメインがポリエチレンテレフタレート分解酵素ドメインである、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項11】
請求項３又は４に記載のタンパク質をポリエチレンテレフタレートへ接触させることと、
前記標識物質を検出することと、
を含む、ポリエチレンテレフタレートの検出方法。
前記標識物質を検出することと、
を含む、ポリエチレンテレフタレートの検出方法。
【請求項12】
請求項６に記載のタンパク質をポリエチレンテレフタレートへ接触させることを含む、ポリエチレンテレフタレートの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、組成物、ポリエチレンテレフタレートの検出方法、及びポリエチレンテレフタレートの分解方法に関する。
【背景技術】
【0002】
プラスチックによる環境汚染の解決や、持続可能な社会の構築が重要視されている。その中で、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は国内で生産されているプラスチックの４％を占めており、飲料ボトルや衣類など身近なところで使用されている。また、エンジニアリングプラスチックとしてガラス繊維などとの複合材料も使用されている。
【0003】
ＰＥＴの持続可能な利用を目的とした様々なＰＥＴ分解技術が報告されている。例えば、特許文献１～４では、ＰＥＴ分解酵素が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２０１９／１６８８１１号
【特許文献2】特開２０１５－１１９６７０号公報
【特許文献3】国際公開第２０１２／０９９０１８号
【特許文献4】特表２０１９－５２７０６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
使用されたプラスチックが環境中に流出することで微細化し、水中を漂っていることが知られている。このような環境中に漂うプラスチックは「マイクロプラスチック」と呼ばれる。環境汚染への対応のため、ＰＥＴを除去したり分解したりする技術が望まれる。ＰＥＴの検出、除去や分解には、ＰＥＴに結合可能な物質を用いることが有用であるが、これまでに、ＰＥＴに結合性を有する物質に関する知見は限られている。
上記事情に鑑み、本開示は、ＰＥＴへの結合性を有するタンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び形質転換体；前記タンパク質を含む組成物；並びにＰＥＴの検出方法及び分解方法を提供することに関する。
上記事情に鑑み、本開示は、ＰＥＴへの結合性を有するタンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び形質転換体；前記タンパク質を含む組成物；並びにＰＥＴの検出方法及び分解方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題を解決するための手段は、以下の態様を含む。
＜１＞ 配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、
ポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、タンパク質。
＜２＞ ６０℃でポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞ さらに標識物質を含む、＜１＞又は＜２＞に記載のタンパク質。
＜４＞ 前記標識物質が蛍光色素又は蛍光タンパク質である、＜３＞に記載のタンパク質。
＜５＞ さらに酵素ドメインを含む、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜６＞ 前記酵素ドメインがポリエチレンテレフタレート分解酵素ドメインである、＜５＞に記載のタンパク質。
＜７＞ ＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜８＞ ＜７＞に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
＜９＞ ＜８＞に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
＜１０＞ ＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のタンパク質を含む組成物。
＜１１＞ ＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質をポリエチレンテレフタレートへ接触させることと、前記標識物質を検出することと、を含む、ポリエチレンテレフタレートの検出方法。
＜１２＞ ＜６＞に記載のタンパク質をポリエチレンテレフタレートへ接触させることを含む、ポリエチレンテレフタレートの分解方法。
＜１＞ 配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、
ポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、タンパク質。
＜２＞ ６０℃でポリエチレンテレフタレートへの結合能を有する、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞ さらに標識物質を含む、＜１＞又は＜２＞に記載のタンパク質。
＜４＞ 前記標識物質が蛍光色素又は蛍光タンパク質である、＜３＞に記載のタンパク質。
＜５＞ さらに酵素ドメインを含む、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜６＞ 前記酵素ドメインがポリエチレンテレフタレート分解酵素ドメインである、＜５＞に記載のタンパク質。
＜７＞ ＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜８＞ ＜７＞に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
＜９＞ ＜８＞に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
＜１０＞ ＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のタンパク質を含む組成物。
＜１１＞ ＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質をポリエチレンテレフタレートへ接触させることと、前記標識物質を検出することと、を含む、ポリエチレンテレフタレートの検出方法。
＜１２＞ ＜６＞に記載のタンパク質をポリエチレンテレフタレートへ接触させることを含む、ポリエチレンテレフタレートの分解方法。
【発明の効果】
【0007】
本開示によれば、ＰＥＴへの結合性を有するタンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び形質転換体；前記タンパク質を含む組成物；並びにＰＥＴの検出方法及び分解方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅの遺伝子マップを示す。
【図2】バイオパニングの流れの概要を示す。
【図3】バイオパニングにおける２ラウンド目及び３ラウンド目での洗浄液（Ｗａｓｈ）と溶出液を植菌したカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ寒天培地に生じたコロニー数を示す。
【図4】ＰｆＣｈＢＤ２（ＰＤＢ ＩＤ：２ＣＷＲ）とＡｌｐｈａＦｏｌｄ２で予測されたＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｔ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｌ－Ｄ２８１Ｒ、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｐ－Ｅ２７９Ｌ－Ｄ２８１Ｗ、及びＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体の三次元構造を示す。斜線ハッチング部は変異を加えたＫ２７０、Ｎ２７２、Ｅ２７９、Ｄ２８１の位置を示す。ａ：全体の構造を示す。ｂ：変異箇所を拡大したものを示す。
【図5】ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓの遺伝子マップを示す。
【図6】ＰｆＣｈＢＤ２の野生型（ＷＴ）とＫ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体におけるＰＥＴへの結合量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本開示の実施形態を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示の実施形態は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示の実施形態を制限するものではない。
【0010】
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示において要素が単数形で表記されている場合であっても、特に明示されているときを除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の存在を排除しない。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示において要素が単数形で表記されている場合であっても、特に明示されているときを除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の存在を排除しない。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
【0011】
本開示において、アミノ酸配列の「同一性」とは、比較する２つのアミノ酸配列を、アミノ酸残基の一致数が最大となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入してアラインメントしたときの、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合をいう。アラインメントは、ＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータで評価することができる。
【0012】
本開示において、基準とするアミノ酸配列と「Ｘ％以上の配列同一性を有する」とは、比較対象のアミノ酸配列の全長又は一部分が、基準とするアミノ酸配列の全長に対してＸ％以上の配列同一性を有することを意味する。
【0013】
本開示において、アミノ酸残基は以下の括弧内の一文字表記で示すことがある。
アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）。
アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）。
【0014】
本開示において、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸変異は、変異前のアミノ酸の一文字表記、Ｎ末端からのアミノ酸位置番号、変異後のアミノ酸の一文字表記、の順に並べて表記することがある。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈの変異を有する」とは、配列番号１のＮ末端から数えて１３番目のリシンがヒスチジンに置換されていることを意味する。
【0015】
本開示において、「Ｘのアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、当該タンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部がＸのアミノ酸配列であることを意味する。すなわち、当該タンパク質は、Ｘのアミノ酸配列のみからなってもよく、Ｘのアミノ酸配列に加えて、Ｘのアミノ酸のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に付加配列（例えばタンパク質発現及び回収のための配列、例えばシグナル配列、タグ配列等；タンパク質の標識のための配列；他のドメイン等）を有していてもよい。
【0016】
＜タンパク質＞
本開示のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、ＰＥＴへの結合能を有する。
本開示のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、ＰＥＴへの結合能を有する。
【0017】
配列番号１：
ＴＴＰＶＰＶＳＧＳＬ ＥＶＫＶＮＤＷＧＳＧ ＡＥＹＤＶＴＬＮＬＤ
ＧＱＹＤＷＴＶＫＶＫ ＬＡＰＧＡＴＶＧＳＦ ＷＳＡＮＫＱＥＧＮＧ
ＹＶＩＦＴＰＶＳＷＮ ＫＧＰＴＡＴＦＧＦＩ ＶＮＧＰＱＧＤＫＶＥ
ＥＩＴＬＥＩＮＧＱＶ Ｉ
ＴＴＰＶＰＶＳＧＳＬ ＥＶＫＶＮＤＷＧＳＧ ＡＥＹＤＶＴＬＮＬＤ
ＧＱＹＤＷＴＶＫＶＫ ＬＡＰＧＡＴＶＧＳＦ ＷＳＡＮＫＱＥＧＮＧ
ＹＶＩＦＴＰＶＳＷＮ ＫＧＰＴＡＴＦＧＦＩ ＶＮＧＰＱＧＤＫＶＥ
ＥＩＴＬＥＩＮＧＱＶ Ｉ
【0018】
配列番号１のアミノ酸配列は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来耐熱性キチナーゼのＣＢＭ２ファミリーキチン結合ドメイン（以下、「ＰｆＣｈＢＤ２」とも記す。）のアミノ酸配列を表す。発明者らは、ＰｆＣｈＢＤ２のアミノ酸配列に対する上記の４変異が、ＰＥＴへの結合能を向上させることを見出した。かかる４変異を有するタンパク質は、ＰＥＴへの結合能を有するタンパク質として有用となる可能性がある。
【0019】
本開示のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。以下に、配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を示す。
【0020】
配列番号２：
ＴＴＰＶＰＶＳＧＳＬ ＥＶＨＶＰＤＷＧＳＧ ＡＶＹＧＶＴＬＮＬＤ
ＧＱＹＤＷＴＶＫＶＫ ＬＡＰＧＡＴＶＧＳＦ ＷＳＡＮＫＱＥＧＮＧ
ＹＶＩＦＴＰＶＳＷＮ ＫＧＰＴＡＴＦＧＦＩ ＶＮＧＰＱＧＤＫＶＥ
ＥＩＴＬＥＩＮＧＱＶ Ｉ
ＴＴＰＶＰＶＳＧＳＬ ＥＶＨＶＰＤＷＧＳＧ ＡＶＹＧＶＴＬＮＬＤ
ＧＱＹＤＷＴＶＫＶＫ ＬＡＰＧＡＴＶＧＳＦ ＷＳＡＮＫＱＥＧＮＧ
ＹＶＩＦＴＰＶＳＷＮ ＫＧＰＴＡＴＦＧＦＩ ＶＮＧＰＱＧＤＫＶＥ
ＥＩＴＬＥＩＮＧＱＶ Ｉ
【0021】
本開示のタンパク質は、上記の配列同一性を満たす範囲において、配列番号１に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇ以外の変異を含んでいても含んでいなくてもよい。例えば、本開示のタンパク質は、Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を含んでいる限り、配列番号２に対して、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。この場合、欠失、置換、又は付加されるアミノ酸の個数は、タンパク質がＰＥＴへの結合能を有する限り制限されず、例えば、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個であってもよい。欠失、置換、又は付加されるアミノ酸の位置は、例えば配列番号１のＮ末端から１～１２番目、１４番目、１６～２１番目、２３番目、又は２５～１０１番目からなる群より選択される１又は複数の範囲であってよい。
【0022】
本開示のタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。付加的なアミノ酸配列としては、本開示のタンパク質を組み換え技術により作製するための付加配列が挙げられる。かかる付加配列としては、タンパク質の合成開始点となるアミノ酸（Ｎ末端のメチオニン残基等）、Ｎ末端のシグナル配列（例えば、大腸菌におけるタンパク質分泌のためのシグナル配列）、タグ配列（例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等）、プロテアーゼ認識配列（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列）等が挙げられる。また、本開示のタンパク質は、後述する標識物質及び／又は酵素ドメインを含んでいてもよい。
【0023】
本開示のタンパク質は１０１～１０００アミノ酸からなるものであってもよく、１０１～５００アミノ酸からなるものであってもよく、１０１～３００アミノ酸からなるものであってもよい。
【0024】
本開示のタンパク質は、ＰＥＴへの結合能を有する。本開示のタンパク質がＰＥＴへの結合能を有する条件は特に制限されず、例えば、いずれかの温度条件でＰＥＴへの結合能を有すればよい。本開示のタンパク質は、例えば２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、又は６５℃でＰＥＴへの結合能を有する。好ましくは、本開示のタンパク質は、少なくとも２５℃でＰＥＴへの結合能を有することが好ましく、少なくとも２５℃～４０℃でＰＥＴへの結合能を有することがより好ましく、少なくとも２５～５０℃でＰＥＴへの結合能を有することがさらに好ましく、少なくとも２５℃～６０℃の温度域でＰＥＴへの結合能を有することが特に好ましい。
また、例えば、本開示のタンパク質は、いずれかのｐＨ条件でＰＥＴへの結合能を有すればよい。本開示のタンパク質は、例えばｐＨ４、５、６、７、８、９、又は１０でＰＥＴへの結合能を有する。好ましくは、本開示のタンパク質は、少なくともｐＨ８でＰＥＴへの結合能を有することが好ましく、少なくともｐＨ６～８でＰＥＴへの結合能を有することがより好ましく、少なくともｐＨ５～９でＰＥＴへの結合能を有することがさらに好ましく、少なくともｐＨ４～１０でＰＥＴへの結合能を有することが特に好ましい。
また、例えば、本開示のタンパク質は、いずれかのｐＨ条件でＰＥＴへの結合能を有すればよい。本開示のタンパク質は、例えばｐＨ４、５、６、７、８、９、又は１０でＰＥＴへの結合能を有する。好ましくは、本開示のタンパク質は、少なくともｐＨ８でＰＥＴへの結合能を有することが好ましく、少なくともｐＨ６～８でＰＥＴへの結合能を有することがより好ましく、少なくともｐＨ５～９でＰＥＴへの結合能を有することがさらに好ましく、少なくともｐＨ４～１０でＰＥＴへの結合能を有することが特に好ましい。
【0025】
本開示において、ＰＥＴへの結合能は以下の少なくともいずれかの方法により確認する。以下のいずれかの方法により結合が確認できた場合に、試験対象のタンパク質がＰＥＴへの結合能を有すると判断する。
１．結合させたＰＥＴを熱処理してＳＤＳ－ＰＡＧＥにより結合したタンパク質量を解析する方法：ＰＥＴフィルム又はＰＥＴ粉末と試験対象のタンパク質を混合し反応させたのち、遠心して得られたＰＥＴ沈殿物を洗浄する。洗浄したＰＥＴフィルム又はＰＥＴ粉末をサンプルバッファーに懸濁して加熱することにより、ＰＥＴに結合していたタンパク質を変性させて回収する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより結合していたタンパク質量を解析する。または、ＰＥＴの有無で上澄中のタンパク質量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより比較することで、ＰＥＴに結合して減少したタンパク質量を算出し、結合した量を解析する。
２．反応後上澄の２８０ｎｍ吸光度減少：よく洗浄したＰＥＴフィルム又はＰＥＴ粉末と試験対象のタンパク質を含むタンパク質溶液を混合して、結合反応を行う。上澄みを回収し、タンパク質に由来する２８０ｎｍ吸光度の減少を計測することで、ＰＥＴへ結合して減少した溶液中のタンパク質量を推定する。
１．結合させたＰＥＴを熱処理してＳＤＳ－ＰＡＧＥにより結合したタンパク質量を解析する方法：ＰＥＴフィルム又はＰＥＴ粉末と試験対象のタンパク質を混合し反応させたのち、遠心して得られたＰＥＴ沈殿物を洗浄する。洗浄したＰＥＴフィルム又はＰＥＴ粉末をサンプルバッファーに懸濁して加熱することにより、ＰＥＴに結合していたタンパク質を変性させて回収する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより結合していたタンパク質量を解析する。または、ＰＥＴの有無で上澄中のタンパク質量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより比較することで、ＰＥＴに結合して減少したタンパク質量を算出し、結合した量を解析する。
２．反応後上澄の２８０ｎｍ吸光度減少：よく洗浄したＰＥＴフィルム又はＰＥＴ粉末と試験対象のタンパク質を含むタンパク質溶液を混合して、結合反応を行う。上澄みを回収し、タンパク質に由来する２８０ｎｍ吸光度の減少を計測することで、ＰＥＴへ結合して減少した溶液中のタンパク質量を推定する。
【0026】
一態様において、本開示のタンパク質は、さらに標識物質を含んでいてもよい。標識物質とは、本開示のタンパク質を検出可能とする標識となる物質である。本開示のタンパク質が標識物質を含むと、ＰＥＴへ結合した本開示のタンパク質の容易な検出が可能となる。
標識物質としては、蛍光色素、蛍光タンパク質、アルキニル基（例えば、ラマン分光用タグとしてのアルキニル基）等が挙げられる。なかでも、蛍光色素又は蛍光タンパク質が好ましい。
蛍光色素としては、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）等が挙げられる。赤色蛍光タンパク質としては、例えば、ｓｔａｇＲＦＰが知られている（Nature Communications (2020) 11:1848）。
標識物質としては、蛍光色素、蛍光タンパク質、アルキニル基（例えば、ラマン分光用タグとしてのアルキニル基）等が挙げられる。なかでも、蛍光色素又は蛍光タンパク質が好ましい。
蛍光色素としては、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）等が挙げられる。赤色蛍光タンパク質としては、例えば、ｓｔａｇＲＦＰが知られている（Nature Communications (2020) 11:1848）。
【0027】
一態様において、本開示のタンパク質は、さらに酵素ドメインを含んでいてもよい。「酵素ドメイン」とは、酵素活性を有するドメインである。本態様において、酵素ドメインは、「配列番号１のアミノ酸配列に対してＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｋ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異を有するアミノ酸配列を含み、ＰＥＴへの結合能を有する」ドメイン（以下、「ＰＥＴ結合ドメイン」とも記す。）に連結されているドメインである。換言すると、本開示のタンパク質は酵素ドメインとＰＥＴ結合ドメインとが連結したタンパク質であってもよい。
【0028】
酵素ドメインにおける酵素の種類は特に制限されず、例えば、ＰＥＴ分解酵素ドメイン等が挙げられる。例えば、本開示のタンパク質がＰＥＴ分解酵素ドメインとＰＥＴ結合ドメインが連結したタンパク質である場合、ＰＥＴ結合ドメインによってＰＥＴへの結合を担保したうえで、ＰＥＴ分解酵素ドメインによってＰＥＴの分解が可能となるため、効率的なＰＥＴの分解が可能となると考えられる。
【0029】
ＰＥＴ分解酵素としては、各種の酵素が知られており、例えば、国際公開第２０１９／１６８８１１号；特開２０１５－１１９６７０号公報；国際公開第２０１２／０９９０１８号；特表２０１９－５２７０６０号公報；Meilleur, C.; Hupe, J. F.; Juteau, P.; Shareck, F. Isolation and Characterization of a New Alkali-Thermostable Lipase Cloned from a Metagenomic Library. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2009, 36, 853-61；Danso, D.; Schmeisser, C.; Chow, J.; Zimmermann, W.; Wei, R.; Leggewie, C.; Li, X.; Hazen, T.; Streit, W. R. New Insights into the Function and Global Distribution of Polyethylene Terephthalate (Pet)-Degrading Bacteria and Enzymes in Marine and Terrestrial Metagenomes. Appl. Environ. Microbiol. 2018, 84, No. e02773-17等に記載の酵素が挙げられる。
【0030】
ＰＥＴ分解酵素のＰＥＴ加水分解活性の至適ｐＨ（最も活性が高いｐＨ）は特に制限されず、中性付近であることが実用上好ましい。例えば、至適ｐＨはｐＨ５．０～９．５であることが好ましく、ｐＨ５．５～９．０であることがより好ましく、ｐＨ６．０～８．０であってもよい。
【0031】
ＰＥＴは７０℃付近にガラス転移温度を有し、ＰＥＴの分解を高温で行うと分解効率が高まることが期待されることから、ＰＥＴ分解酵素のＰＥＴ加水分解活性の至適温度は、ｐＨ７において、６０℃超であることが好ましく、６５℃以上であることがより好ましい。また、ＰＥＴの分解が促進される範囲で、低エネルギーで分解を行う観点からは、ＰＥＴ分解酵素のＰＥＴ加水分解活性の至適温度は９０℃以下であってもよく、８５℃以下であってもよく、８０℃以下であってもよい。
上記至適温度は以下のように測定する。２枚の非晶性ＰＥＴディスク（厚さ０．２５ｍｍ、表面積合計０．３２ｃｍ２、質量合計４．０ｍｇ）に、５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の２５０μＬの０．１μＭタンパク質を添加し、各温度で６０分間インキュベートする。ＨＰＬＣで分解産物濃度を分析し、分解産物濃度の合計をタンパク質濃度及び反応時間で除算して、活性値を得る。
上記至適温度は以下のように測定する。２枚の非晶性ＰＥＴディスク（厚さ０．２５ｍｍ、表面積合計０．３２ｃｍ２、質量合計４．０ｍｇ）に、５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の２５０μＬの０．１μＭタンパク質を添加し、各温度で６０分間インキュベートする。ＨＰＬＣで分解産物濃度を分析し、分解産物濃度の合計をタンパク質濃度及び反応時間で除算して、活性値を得る。
【0032】
ＰＥＴの加水分解による分解産物としては、ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）、モノ（ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＭＨＥＴ）、テレフタル酸（ＴＰＡ）、及びエチレングリコール（ＥＧ）が挙げられる。ＰＥＴ分解酵素によるＰＥＴの分解産物は、これらすべてであってもよく、これらのうち一部であってもよく、これらが連結した部分分解産物であってもよい。
【0033】
ＰＥＴ分解酵素の融解温度（Ｔｍ）は、７０．０℃以上であることが好ましく、７２．０℃以上であることがより好ましく、７４．０℃以上であることがさらに好ましい。ＰＥＴの分解が促進される範囲で、低エネルギーで分解を行うことが望ましいため、ＰＥＴ分解酵素の融解温度（Ｔｍ）は、１００．０℃以下であってもよく、９５．０℃以下であってもよく、９０．０℃以下であってもよい。
本開示において、タンパク質の融解温度（Ｔｍ）は以下の手順で円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルにより測定される。１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の１３μＭのタンパク質溶液を調製する。２０℃で２５０～２００ｎｍにおけるタンパク質のＣＤスペクトルを測定する。タンパク質を２０℃から１℃／分の速度で加熱しながら、２３０ｎｍにおけるタンパク質のシグナルを追跡する。９５℃で、２５０～２００ｎｍにおける変性タンパク質のＣＤスペクトルを測定する。２３０ｎｍにおけるシグナルの温度依存性のカーブフィッティングにより、タンパク質のＴｍを推定する。
本開示において、タンパク質の融解温度（Ｔｍ）は以下の手順で円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルにより測定される。１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の１３μＭのタンパク質溶液を調製する。２０℃で２５０～２００ｎｍにおけるタンパク質のＣＤスペクトルを測定する。タンパク質を２０℃から１℃／分の速度で加熱しながら、２３０ｎｍにおけるタンパク質のシグナルを追跡する。９５℃で、２５０～２００ｎｍにおける変性タンパク質のＣＤスペクトルを測定する。２３０ｎｍにおけるシグナルの温度依存性のカーブフィッティングにより、タンパク質のＴｍを推定する。
【0034】
＜ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体＞
本開示のポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質をコードする塩基配列を含む。
本開示の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。
本開示の形質転換体は、前記組換えベクターを含む。
本開示のポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質をコードする塩基配列を含む。
本開示の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。
本開示の形質転換体は、前記組換えベクターを含む。
【0035】
ポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドの核酸配列は、コドンの縮重の範囲内で変化させることができる。組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得て、タンパク質を発現させる場合、宿主において使用頻度の高いコドンを採用することが好ましい。
【0036】
組換えベクターは、本開示のタンパク質を発現可能な任意の組換えベクターであってよい。好ましい組換えベクターとしては、プラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターは、発現に必要なプロモーターを有し、ターミネーター、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）などの他の構成要素を有してもよい。
宿主は、本開示のタンパク質を発現可能であれば特に制限されず、用いる組換えベクターと併せて選択される。宿主として、微生物細胞を用いることが簡便であり、例えば、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母）等を用いてもよい。
発現ベクター及び宿主を用いてタンパク質の作製を行う際の、形質転換、発現、及び回収における条件は、当業者に周知の方法を採用できる。
宿主は、本開示のタンパク質を発現可能であれば特に制限されず、用いる組換えベクターと併せて選択される。宿主として、微生物細胞を用いることが簡便であり、例えば、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母）等を用いてもよい。
発現ベクター及び宿主を用いてタンパク質の作製を行う際の、形質転換、発現、及び回収における条件は、当業者に周知の方法を採用できる。
【0037】
＜組成物＞
本開示の組成物は、本開示のタンパク質を含む。本開示のタンパク質は、未精製の状態（例えば、タンパク質を発現する宿主を含む状態、又はタンパク質を発現する宿主から分泌された粗タンパク質液を含む状態）、又は精製された状態で組成物に含まれていてもよく、好ましくは精製された状態で組成物に含まれる。
本開示の組成物は、本開示のタンパク質を含む。本開示のタンパク質は、未精製の状態（例えば、タンパク質を発現する宿主を含む状態、又はタンパク質を発現する宿主から分泌された粗タンパク質液を含む状態）、又は精製された状態で組成物に含まれていてもよく、好ましくは精製された状態で組成物に含まれる。
【0038】
本開示の組成物は、本開示のタンパク質の他に、タンパク質の安定化に適する緩衝液等を含んでもよい。緩衝液としては、組成物の液性を中性付近に維持する緩衝液が好ましく、例えば、リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
本開示の組成物は、本開示のタンパク質及び緩衝液の他、安定化剤等の添加剤を含んでもよい。
本開示の組成物は、本開示のタンパク質及び緩衝液の他、安定化剤等の添加剤を含んでもよい。
【0039】
＜ＰＥＴの検出方法＞
一実施形態において、標識物質を含む本開示のタンパク質をＰＥＴへ接触させることと、前記標識物質を蛍光検出することと、を含む、ＰＥＴの検出方法が提供される。かかる方法によれば、本開示のタンパク質がＰＥＴに結合するため、標識物質を検出することで、ＰＥＴを効率的に検出することができる。標識物質の詳細は上述の通りである。
一実施形態において、標識物質を含む本開示のタンパク質をＰＥＴへ接触させることと、前記標識物質を蛍光検出することと、を含む、ＰＥＴの検出方法が提供される。かかる方法によれば、本開示のタンパク質がＰＥＴに結合するため、標識物質を検出することで、ＰＥＴを効率的に検出することができる。標識物質の詳細は上述の通りである。
【0040】
＜ＰＥＴの分解方法＞
一実施形態において、ＰＥＴ分解酵素ドメインを含む本開示のタンパク質をＰＥＴへ接触させることを含む、ＰＥＴの分解方法が提供される。かかる方法によれば、本開示のタンパク質がＰＥＴに結合するため、ＰＥＴを効率的に分解することができる。ＰＥＴを分解する際の温度及び反応時間は、ＰＥＴの分解に適する範囲で適宜設定することができる。ＰＥＴ分解酵素ドメインの詳細は上述の通りである。
一実施形態において、ＰＥＴ分解酵素ドメインを含む本開示のタンパク質をＰＥＴへ接触させることを含む、ＰＥＴの分解方法が提供される。かかる方法によれば、本開示のタンパク質がＰＥＴに結合するため、ＰＥＴを効率的に分解することができる。ＰＥＴを分解する際の温度及び反応時間は、ＰＥＴの分解に適する範囲で適宜設定することができる。ＰＥＴ分解酵素ドメインの詳細は上述の通りである。
【実施例0041】
次に本開示の実施形態を実施例により具体的に説明するが、本開示の実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0042】
１．背景と目的
自然界で、セルラーゼやキチナーゼが持つ糖鎖結合モジュール（Carbohydrate-Binding Module、ＣＢＭ）には、結晶性セルロースやキチンへの酵素の結合能を向上させ、分解活性を向上させるものがある。ＣＡＺｙ（Carbohydrate-Active EnZymes）データベース上で、ＣＢＭファミリーはアミノ酸配列の相同性から分類され、現在９６のファミリーが存在する。また、ＣＢＭには、結晶性セルロースのような不溶性糖質に結合できるタイプＡ、不溶性基質を除く多種の糖鎖内部に結合できるタイプＢ、糖鎖の末端に結合できるタイプＣという３つのタイプがある。特に、タイプＡのＣＢＭでは表面に露出した芳香族残基が平らな結晶性セルロースやキチン表面と結合するために、平面的な相互作用表面を形成している。ＣＢＭはＰＥＴに対して親和性を持つ可能性があり、ＰＥＴとの相互作用にはタイプＡのＣＢＭが持つ露出した芳香族アミノ酸残基が重要な役割を果たしていることが示唆されている。平らな結晶性セルロースやキチンのようにＰＥＴ表面にも、タイプＡのＣＢＭが持つ露出した芳香族アミノ酸が相互作用できると考えられる。そのため、酵素のＰＥＴへの結合能を向上させるための戦略として、ＣＢＭを酵素に融合するアプローチが行われている。
自然界で、セルラーゼやキチナーゼが持つ糖鎖結合モジュール（Carbohydrate-Binding Module、ＣＢＭ）には、結晶性セルロースやキチンへの酵素の結合能を向上させ、分解活性を向上させるものがある。ＣＡＺｙ（Carbohydrate-Active EnZymes）データベース上で、ＣＢＭファミリーはアミノ酸配列の相同性から分類され、現在９６のファミリーが存在する。また、ＣＢＭには、結晶性セルロースのような不溶性糖質に結合できるタイプＡ、不溶性基質を除く多種の糖鎖内部に結合できるタイプＢ、糖鎖の末端に結合できるタイプＣという３つのタイプがある。特に、タイプＡのＣＢＭでは表面に露出した芳香族残基が平らな結晶性セルロースやキチン表面と結合するために、平面的な相互作用表面を形成している。ＣＢＭはＰＥＴに対して親和性を持つ可能性があり、ＰＥＴとの相互作用にはタイプＡのＣＢＭが持つ露出した芳香族アミノ酸残基が重要な役割を果たしていることが示唆されている。平らな結晶性セルロースやキチンのようにＰＥＴ表面にも、タイプＡのＣＢＭが持つ露出した芳香族アミノ酸が相互作用できると考えられる。そのため、酵素のＰＥＴへの結合能を向上させるための戦略として、ＣＢＭを酵素に融合するアプローチが行われている。
【0043】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来耐熱性キチナーゼのＣＢＭ２ファミリーキチン結合ドメイン（ＰｆＣｈＢＤ２）はタイプＡのＣＢＭである。ＰｆＣｈＢＤ２は耐熱性が高く、ＰＥＴのガラス転移温度よりも高い８５℃でも構造を保つことが確認されており、ＰＥＴ結合ドメインのテンプレート構造として適している。
【0044】
本研究では、ＰｆＣｈＢＤ２をテンプレートとし飽和変異導入とファージディスプレイ法を用いて人工的に進化させることでＰＥＴに結合能を持つタンパク質の開発を試みた。ファージベクターに組み込んだＰｆＣｈＢＤ２の遺伝子に飽和変異導入を行い、プラスミドライブラリを構築した。プラスミドライブラリから大腸菌を用いて、ＰｆＣｈＢＭ２変異体を提示したファージライブラリを作製した。ファージライブラリに対して、非晶性ＰＥＴフィルム片とのアフィニティセレクションを行うことでＰＥＴに結合能を持つタンパク質の創出を行った。
【0045】
２．ＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅの作製
ＰＥＴに結合するＰｆＣｈＢＤ２変異体の創出を行うために、まずＰｆＣｈＢＤ２を表面に提示するファージを発現させるプラスミドＤＮＡを作製した。ファージ発現用のプラスミドはｆＡＤＬ－１ｅを用いた。ｆＡＤＬ－１ｅはファージベクターであり、目的遺伝子を挿入したｆＡＤＬ－１ｅを大腸菌（ＳＳ３２０株）に形質転換すると、目的タンパクを表面に提示したＭ１３ファージを発現させることができる。ｆＡＤＬ－１ｅには選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子が組み込まれている。またＰＥＴに結合したファージを回収するため、ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子とｇ３ｐタンパク質遺伝子の間にトリプシン切断部位を挿入した。
ＰＣＲにより増幅したＰｆＣｈＢＤ２をコードするＤＮＡ及びｆＡＤＬ－１ｅをライゲーションして、ファージ感染耐性を持つ大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換した。その大腸菌を培養し、プラスミド抽出することでＰｆＣｈＢＤ２プラスミドＤＮＡを得た。
ＰＥＴに結合するＰｆＣｈＢＤ２変異体の創出を行うために、まずＰｆＣｈＢＤ２を表面に提示するファージを発現させるプラスミドＤＮＡを作製した。ファージ発現用のプラスミドはｆＡＤＬ－１ｅを用いた。ｆＡＤＬ－１ｅはファージベクターであり、目的遺伝子を挿入したｆＡＤＬ－１ｅを大腸菌（ＳＳ３２０株）に形質転換すると、目的タンパクを表面に提示したＭ１３ファージを発現させることができる。ｆＡＤＬ－１ｅには選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子が組み込まれている。またＰＥＴに結合したファージを回収するため、ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子とｇ３ｐタンパク質遺伝子の間にトリプシン切断部位を挿入した。
ＰＣＲにより増幅したＰｆＣｈＢＤ２をコードするＤＮＡ及びｆＡＤＬ－１ｅをライゲーションして、ファージ感染耐性を持つ大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換した。その大腸菌を培養し、プラスミド抽出することでＰｆＣｈＢＤ２プラスミドＤＮＡを得た。
【0046】
（１）ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子とプラスミド（ｆＡＤＬ－１ｅ）のＰＣＲ
＜方法＞
テンプレートＤＮＡであるＰｆＣｈＢＤ２遺伝子とｆＡＤＬ－１ｅファージベクターのＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μＬ）を５μＬ、１０μＭのプライマーＭｉｘ０．７５μＬと混合し、全量が１２．５μＬになるように超純水を加えた（表１）。混合液に２×KOD One PCR Master mix１２．５μＬを加え、サーマルサイクラーにて９８℃１０秒、６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーを表２に示す。ＰＣＲ反応液サンプルにLoading Bufferを加え、２％、１％アガロースゲルにそれぞれアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認した。バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、ゲル抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
＜方法＞
テンプレートＤＮＡであるＰｆＣｈＢＤ２遺伝子とｆＡＤＬ－１ｅファージベクターのＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μＬ）を５μＬ、１０μＭのプライマーＭｉｘ０．７５μＬと混合し、全量が１２．５μＬになるように超純水を加えた（表１）。混合液に２×KOD One PCR Master mix１２．５μＬを加え、サーマルサイクラーにて９８℃１０秒、６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーを表２に示す。ＰＣＲ反応液サンプルにLoading Bufferを加え、２％、１％アガロースゲルにそれぞれアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認した。バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、ゲル抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
【0047】
【表1】
【0048】
【表2】
【0049】
＜結果＞
予想されるＤＮＡサイズはＰｆＣｈＢＤ２が３８４ｂｐ，ｆＡＤＬ－１ｅが７９５０ｂｐである。ゲル上では４００ｂｐ，８ｋｂｐ付近にそれぞれバンドがみられたため、目的遺伝子が増幅されていたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度がＰｆＣｈＢＤ２から６．２ｎｇ／μＬ、ｆＡＤＬ－１ｅから３６．８ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルをそれぞれ２５μＬ得た。
予想されるＤＮＡサイズはＰｆＣｈＢＤ２が３８４ｂｐ，ｆＡＤＬ－１ｅが７９５０ｂｐである。ゲル上では４００ｂｐ，８ｋｂｐ付近にそれぞれバンドがみられたため、目的遺伝子が増幅されていたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度がＰｆＣｈＢＤ２から６．２ｎｇ／μＬ、ｆＡＤＬ－１ｅから３６．８ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルをそれぞれ２５μＬ得た。
【0050】
（２）ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子とプラスミド（ｆＡＤＬ－１ｅ）のライゲーション及び形質転換
＜方法＞
（１）で得られた２つのＤＮＡサンプルを各１μＬ、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixを２μＬ加え、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応液０．８μＬをエレクトロコンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ株）５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。ＤＨ１０Ｂ株はバクテリオファージに対して感染耐性を持つ。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした。
寒天培地にできたコロニーから一つ選択して、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。細菌培養液の入ったチューブを回収し、６，０００ｇで３分間遠心分離した。上清を除き、沈殿した大腸菌からQIAprep Spin Miniprep Kitを用いて、プラスミド抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したプラスミドのＤＮＡ濃度を測定した。目的遺伝子が正確にプラスミドに挿入されているのか確認するために、精製したプラスミドＤＮＡサンプルをシーケンス解析した。シーケンス解析にはユーロフィンジェノミクスのＤＮＡシーケンスサービスを用いた。
＜方法＞
（１）で得られた２つのＤＮＡサンプルを各１μＬ、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixを２μＬ加え、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応液０．８μＬをエレクトロコンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ株）５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。ＤＨ１０Ｂ株はバクテリオファージに対して感染耐性を持つ。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした。
寒天培地にできたコロニーから一つ選択して、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。細菌培養液の入ったチューブを回収し、６，０００ｇで３分間遠心分離した。上清を除き、沈殿した大腸菌からQIAprep Spin Miniprep Kitを用いて、プラスミド抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したプラスミドのＤＮＡ濃度を測定した。目的遺伝子が正確にプラスミドに挿入されているのか確認するために、精製したプラスミドＤＮＡサンプルをシーケンス解析した。シーケンス解析にはユーロフィンジェノミクスのＤＮＡシーケンスサービスを用いた。
【0051】
＜結果＞
ＤＮＡ濃度３０ｎｇ／μＬのプラスミドＤＮＡを５０μＬ得た。また、シーケンス解析の結果から、挿入した遺伝子の末端に１塩基挿入されてしまい、ｆＡＤＬ－１ｅに存在するファージの感染に必要なｇ３ｐタンパク質をコードする遺伝子のコドンがずれていることが分かった。
ＤＮＡ濃度３０ｎｇ／μＬのプラスミドＤＮＡを５０μＬ得た。また、シーケンス解析の結果から、挿入した遺伝子の末端に１塩基挿入されてしまい、ｆＡＤＬ－１ｅに存在するファージの感染に必要なｇ３ｐタンパク質をコードする遺伝子のコドンがずれていることが分かった。
【0052】
（３）ＰｆＣｈＢＤ２プラスミドＤＮＡのＰＣＲ
＜方法＞
（２）で得られたプラスミドＤＮＡサンプルのｇ３ｐタンパク質をコードする遺伝子を正しいコドンに戻すためにプライマーを設計した。（２）で得られたプラスミドＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして、ＰＣＲ溶液を表１に従って調製した。（１）と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーを表２に示す。Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、反応液サンプルを１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖ、２５分電気泳動した。その後、MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認し、バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。（１）と同様にゲル抽出を行い、吸光度計を用いて、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
＜方法＞
（２）で得られたプラスミドＤＮＡサンプルのｇ３ｐタンパク質をコードする遺伝子を正しいコドンに戻すためにプライマーを設計した。（２）で得られたプラスミドＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして、ＰＣＲ溶液を表１に従って調製した。（１）と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーを表２に示す。Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、反応液サンプルを１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖ、２５分電気泳動した。その後、MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認し、バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。（１）と同様にゲル抽出を行い、吸光度計を用いて、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
【0053】
＜結果＞
予想されるＤＮＡサイズは８３１８ｂｐである。ゲル上では８ｋｂｐ付近にバンドがみられたため、目的のＤＮＡが増幅されていたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度３５．６ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルが２５μＬ得られた。
予想されるＤＮＡサイズは８３１８ｂｐである。ゲル上では８ｋｂｐ付近にバンドがみられたため、目的のＤＮＡが増幅されていたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度３５．６ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルが２５μＬ得られた。
【0054】
（４）ＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅのライゲーション及び形質転換
＜方法＞
（３）で得られたＤＮＡサンプルを１μＬとNE Builder HiFi DNA Assembly Master Mix １μＬを混合し、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ＤＮＡサンプルをライゲーションした。（２）と同様に形質転換を行い、プラスミド抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したプラスミドＤＮＡのＤＮＡ濃度を測定した。精製したプラスミドＤＮＡサンプルのシーケンス解析を行った。
＜方法＞
（３）で得られたＤＮＡサンプルを１μＬとNE Builder HiFi DNA Assembly Master Mix １μＬを混合し、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ＤＮＡサンプルをライゲーションした。（２）と同様に形質転換を行い、プラスミド抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したプラスミドＤＮＡのＤＮＡ濃度を測定した。精製したプラスミドＤＮＡサンプルのシーケンス解析を行った。
【0055】
＜結果＞
ＤＮＡ濃度１２４．７ｎｇ／μＬのプラスミドＤＮＡが５０μＬ得られた。また、シーケンス解析の結果からＰｆＣｈＢＤ２遺伝子が正確に挿入され、コドンが正確なプラスミドを得られたことが分かった。ここで得られたプラスミドＤＮＡをＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅと呼ぶ（図１）。
ＤＮＡ濃度１２４．７ｎｇ／μＬのプラスミドＤＮＡが５０μＬ得られた。また、シーケンス解析の結果からＰｆＣｈＢＤ２遺伝子が正確に挿入され、コドンが正確なプラスミドを得られたことが分かった。ここで得られたプラスミドＤＮＡをＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅと呼ぶ（図１）。
【0056】
３．ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍプラスミドライブラリの作製
ここでは、飽和変異導入を用いて、ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子のＫ２７０、Ｎ２７２、Ｅ２７９、Ｄ２８１にあたるコドンにランダムな変異を加え、ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍの飽和変異体ライブラリを作製した。飽和変異導入では、変異を加えたいアミノ酸座位に対応するコドンに対して、ランダムな変異が導入されるようにプライマーを設計し、ＰＣＲを行う。このＰＣＲによって、目的のアミノ酸座位に対応するコドンに対して、ランダムにコドンを発生させることができる。プライマー設計の際、コドンに対するランダムな変異を加えるためにコドンＮＮＫを用いた。ＮからはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの塩基、ＫからはＧ、Ｔの塩基がランダムに合成される。コドンＮＮＫを用いることで、コードされるアミノ酸の比率のばらつきを抑え、２０種類のアミノ酸を網羅することができる。また、ストップコドンが発生する確率を３．１２５％に抑えることができる。
ここでは、飽和変異導入を用いて、ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子のＫ２７０、Ｎ２７２、Ｅ２７９、Ｄ２８１にあたるコドンにランダムな変異を加え、ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍの飽和変異体ライブラリを作製した。飽和変異導入では、変異を加えたいアミノ酸座位に対応するコドンに対して、ランダムな変異が導入されるようにプライマーを設計し、ＰＣＲを行う。このＰＣＲによって、目的のアミノ酸座位に対応するコドンに対して、ランダムにコドンを発生させることができる。プライマー設計の際、コドンに対するランダムな変異を加えるためにコドンＮＮＫを用いた。ＮからはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの塩基、ＫからはＧ、Ｔの塩基がランダムに合成される。コドンＮＮＫを用いることで、コードされるアミノ酸の比率のばらつきを抑え、２０種類のアミノ酸を網羅することができる。また、ストップコドンが発生する確率を３．１２５％に抑えることができる。
【0057】
（１）ＰｆＣｈＢＤ２への変異導入
＜方法＞
ＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅをテンプレートＤＮＡ（１ｎｇ μＬ－１）として１μＬ、１０μＭのプライマーＭｉｘを０．７５μＬ混合し、全量が１２．５μＬになるように超純水を加えた。混合液に２×KOD One PCR Master mix １２．５μＬを加え、サーマルサイクラーで９８℃１０秒、６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーを表３に示す。ＰＣＲ反応液サンプルにＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認し、バンドをゲルから全て切り出してマイクロチューブに入れた。２章（１）と同様にゲル抽出を行い、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
＜方法＞
ＰｆＣｈＢＤ２－ｆＡＤＬ－１ｅをテンプレートＤＮＡ（１ｎｇ μＬ－１）として１μＬ、１０μＭのプライマーＭｉｘを０．７５μＬ混合し、全量が１２．５μＬになるように超純水を加えた。混合液に２×KOD One PCR Master mix １２．５μＬを加え、サーマルサイクラーで９８℃１０秒、６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーを表３に示す。ＰＣＲ反応液サンプルにＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、１％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認し、バンドをゲルから全て切り出してマイクロチューブに入れた。２章（１）と同様にゲル抽出を行い、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
【0058】
【表3】
【0059】
＜結果＞
予想されるＤＮＡサイズは８３１８ｂｐである。ゲル上では８ｋｂｐ付近にバンドがみられたため、目的のＤＮＡが増幅されていたことが分かった。ゲル抽出後、ＤＮＡ濃度１９．１ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルが２５μＬ得られた。ここで得られたＤＮＡサンプルをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｆＡＤＬ－１ｅとする。
予想されるＤＮＡサイズは８３１８ｂｐである。ゲル上では８ｋｂｐ付近にバンドがみられたため、目的のＤＮＡが増幅されていたことが分かった。ゲル抽出後、ＤＮＡ濃度１９．１ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルが２５μＬ得られた。ここで得られたＤＮＡサンプルをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｆＡＤＬ－１ｅとする。
【0060】
（２）ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｆＡＤＬ－１ｅのライゲーション及び形質転換
＜方法＞
（１）で得られたＤＮＡサンプルと等量のNE Builder HiFi DNA Assembly Master Mixを加え、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応液０．８μＬをエレクトロコンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ株）５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした。ここまでの操作を寒天培地プレートが１０枚になるように行った。寒天培地に生じたコロニーを計測した後、白金耳を用いて全てのコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加液体ＬＢ培地にそれぞれ集め、３７℃、１，０００ｒｐｍで１晩培養した。１０個の液体培地から２００μＬずつ回収した。その後、２章（２）と同様にプラスミド抽出とＤＮＡ濃度の測定を行った。
＜方法＞
（１）で得られたＤＮＡサンプルと等量のNE Builder HiFi DNA Assembly Master Mixを加え、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応液０．８μＬをエレクトロコンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ株）５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした。ここまでの操作を寒天培地プレートが１０枚になるように行った。寒天培地に生じたコロニーを計測した後、白金耳を用いて全てのコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加液体ＬＢ培地にそれぞれ集め、３７℃、１，０００ｒｐｍで１晩培養した。１０個の液体培地から２００μＬずつ回収した。その後、２章（２）と同様にプラスミド抽出とＤＮＡ濃度の測定を行った。
【0061】
＜結果＞
１０枚のカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に生じたコロニーの数を表４に示す。各プレートによってコロニーの数にはばらつきがあった。また、コロニー数の合計は１２，２９４個であった。プラスミド抽出を行った結果、ＤＮＡ濃度３１．４ｎｇ／μＬのプラスミドライブラリが５０μＬ得られた。ここで得られたプラスミドライブラリを０世代としてＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０とする。
１０枚のカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に生じたコロニーの数を表４に示す。各プレートによってコロニーの数にはばらつきがあった。また、コロニー数の合計は１２，２９４個であった。プラスミド抽出を行った結果、ＤＮＡ濃度３１．４ｎｇ／μＬのプラスミドライブラリが５０μＬ得られた。ここで得られたプラスミドライブラリを０世代としてＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０とする。
【0062】
【表4】
【0063】
４．ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍファージライブラリの作製とバイオパニング
ファージディスプレイ法を用いてＰＥＴに結合するＰｆＣｈＢＤ２変異体を選抜するために、ＰｆＣｈＢＤ２変異体を表面に提示させたファージを発現、精製することでファージライブラリを作製した。得られたファージライブラリとＰＥＴフィルムを用いてバイオパニングを行った。バイオパニングでは、非晶性ＰＥＴフィルム片への結合、洗浄、回収、増殖のラウンドを、洗浄強度と温度を変化させて繰り返した。ファージの発現にはＳＳ３２０株を宿主として用いた。ＳＳ３２０株はＦ因子を持ち、ファージライブラリの構築に適した大腸菌である。
ファージディスプレイ法を用いてＰＥＴに結合するＰｆＣｈＢＤ２変異体を選抜するために、ＰｆＣｈＢＤ２変異体を表面に提示させたファージを発現、精製することでファージライブラリを作製した。得られたファージライブラリとＰＥＴフィルムを用いてバイオパニングを行った。バイオパニングでは、非晶性ＰＥＴフィルム片への結合、洗浄、回収、増殖のラウンドを、洗浄強度と温度を変化させて繰り返した。ファージの発現にはＳＳ３２０株を宿主として用いた。ＳＳ３２０株はＦ因子を持ち、ファージライブラリの構築に適した大腸菌である。
【0064】
（１）ファージライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０ファージ０世代の作製
＜方法＞
ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０プラスミドライブラリ０．５μＬをエレクトロコンピテントセル（ＳＳ３２０株）５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ液体培地に植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。
細菌培養液１０ｍＬを１３，０００ｇで５分間遠心して、大腸菌を沈殿させた。上清を新しいチューブに移し、上清と５×ＰＥＧ／ＮａＣｌが４：１になるように５×ＰＥＧ／ＮａＣｌを加えた。転倒混和し、チューブを氷上で１時間インキュベートした。１３，０００ｇで１０分間遠心し、ファージを沈殿させた。上清を取り除き、再び遠心後、完全に上清を取り除いた。沈殿したファージにTris Buffer Saline：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１２０μＬ加え、ボルテックスで再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。再びボルテックスし、１３，０００ｇで１分間遠心分離してファージ溶液を回収した。
１×ＴＢＳバッファーでブランクをとり、２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定した。ファージベクターインサートの長さ（８，３０３ｂｐ）を１ビリオンあたりの塩基数として、以下の式から得られたファージ溶液のビリオン数を求めた。
＜方法＞
ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０プラスミドライブラリ０．５μＬをエレクトロコンピテントセル（ＳＳ３２０株）５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ液体培地に植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。
細菌培養液１０ｍＬを１３，０００ｇで５分間遠心して、大腸菌を沈殿させた。上清を新しいチューブに移し、上清と５×ＰＥＧ／ＮａＣｌが４：１になるように５×ＰＥＧ／ＮａＣｌを加えた。転倒混和し、チューブを氷上で１時間インキュベートした。１３，０００ｇで１０分間遠心し、ファージを沈殿させた。上清を取り除き、再び遠心後、完全に上清を取り除いた。沈殿したファージにTris Buffer Saline：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１２０μＬ加え、ボルテックスで再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。再びボルテックスし、１３，０００ｇで１分間遠心分離してファージ溶液を回収した。
１×ＴＢＳバッファーでブランクをとり、２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定した。ファージベクターインサートの長さ（８，３０３ｂｐ）を１ビリオンあたりの塩基数として、以下の式から得られたファージ溶液のビリオン数を求めた。
【0065】
【数1】
【0066】
＜結果＞
ＰＥＧ沈殿後の、ファージ溶液の吸光度を表６に示す。２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度の差から、ファージのビリオン数を求めると、７９０×１０１０ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬのファージ溶液が１２０μＬ得られたことが分かった。ここで得られたファージをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０ファージとした。
ＰＥＧ沈殿後の、ファージ溶液の吸光度を表６に示す。２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度の差から、ファージのビリオン数を求めると、７９０×１０１０ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍＬのファージ溶液が１２０μＬ得られたことが分かった。ここで得られたファージをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０ファージとした。
【0067】
（２）細菌細胞（ＳＳ３２０株）の準備
＜方法＞
ＳＳ３２０を２×ＹＴ液体培地で３７℃、２５０ｒｐｍで１日インキュベートした。培養液：新しい２×ＹＴ液体培地が１：１０になるように混合し、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。６００ｎｍでの吸光度を測定し、吸光度が０．５～１．０になるように調整した。室温で１時間以内にファージを感染させた。
＜方法＞
ＳＳ３２０を２×ＹＴ液体培地で３７℃、２５０ｒｐｍで１日インキュベートした。培養液：新しい２×ＹＴ液体培地が１：１０になるように混合し、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。６００ｎｍでの吸光度を測定し、吸光度が０．５～１．０になるように調整した。室温で１時間以内にファージを感染させた。
【0068】
（３）バイオパニング
＜方法＞
１．５ｍＬチューブに表５の組成となるように、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）、（１）で得られたＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０ファージ、及び超純水を加えた。非晶性ＰＥＴフィルムはGood Fellow社の厚さ０．２５ｍｍのAmorphous PET firmを直径５．５ｍｍのディスクにし、２０％エタノールに加えて、２０ｒｐｍで１時間洗浄し、２０％エタノールですすぎ、乾燥させたものを使用した。
＜方法＞
１．５ｍＬチューブに表５の組成となるように、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）、（１）で得られたＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０ファージ、及び超純水を加えた。非晶性ＰＥＴフィルムはGood Fellow社の厚さ０．２５ｍｍのAmorphous PET firmを直径５．５ｍｍのディスクにし、２０％エタノールに加えて、２０ｒｐｍで１時間洗浄し、２０％エタノールですすぎ、乾燥させたものを使用した。
【0069】
【表5】
【0070】
結合ステップでは、ファージと非晶性ＰＥＴフィルムを結合させるために、調製した非晶性ＰＥＴフィルムを含む溶液を２５℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。その後、上清を新しいチューブに移し変えて保存した。洗浄ステップでは、洗浄を行うために５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５００μＬを加え、２５℃、１，０００ｒｐｍで５分インキュベートした。洗浄液を新しいチューブに移し替えて保存した。１ラウンドでは、洗浄を５回行い、その都度洗浄液を回収し、洗浄液１～５とした。非晶性ＰＥＴフィルムに結合したファージを溶出するために、０．２５％トリプシン溶液を５００μＬ加え、３７℃、１，０００ｒｐｍで２０分インキュベートした。ファージを含む溶出液を新しいチューブに保存した。また、上清と洗浄液にも終濃度０．２５％になるようにトリプシンを加え、トリプシン処理した。
【0071】
感染・増幅ステップでは、上清、洗浄液１～５とファージ溶出液に（２）で得られたＳＳ３２０培養液を等量加え、３７℃，１，０００ｒｐｍで３０分間ファージを大腸菌（ＳＳ３２０）に感染させた。必要に応じて適当に希釈し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした（１ラウンドでは希釈なし、２ラウンドでは洗浄液１、２を含む培養液を５倍希釈、洗浄液３～５を２倍希釈、３ラウンドでは洗浄液１～３を含む培養液を５倍希釈、洗浄液４、５を２倍希釈した）。その後、コロニー数の計測を行った。ファージ溶出液を感染させた大腸菌を植菌した寒天培地に生えたコロニーを白金耳でカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ液体培地に全て回収し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。細菌培養液を１３，０００ｇで２分間遠心し、大腸菌を沈殿させた。上清を用いてＰＥＧ沈殿を行い、ファージを精製した。また、沈殿物を用いてプラスミド抽出を行った。これらで得たファージライブラリとプラスミドライブラリを新しい世代として保存した。
【0072】
ここまでを１ラウンドとして、合計３ラウンド行った（図２）。２ラウンドでは、前のラウンドで得た新しい世代を用いて、洗浄回数を１０回に増やして再び同様の操作を行った。次の３ラウンドでは、結合と洗浄ステップでのインキュベートの温度条件を２５℃から６０℃へ変更して２ラウンドと同じ操作を行った。また、３ラウンドではファージ溶出液を含む大腸菌を植菌した寒天培地に生えたコロニーを１つずつカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ液体培地に植菌し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１日インキュベートした。細菌培養液を１３，０００ｇで２分間遠心し、沈殿物を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをシーケンス解析した。
【0073】
＜結果＞
１、２ラウンドでのＰＥＧ沈殿によって得られたファージの吸光度測定を行った。２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度の差から、ファージベクターインサートの長さ（８，３０３ｂｐ）を１ビリオンあたりの塩基数として計算し、各ラウンドで得られたファージ溶液のビリオン数を求めた（表６）。各ラウンドでファージが得られていることが分かった。また、並行して行ったプラスミド抽出から、プラスミドＤＮＡが得られた。
１、２ラウンドでのＰＥＧ沈殿によって得られたファージの吸光度測定を行った。２６９ｎｍと３２０ｎｍの吸光度の差から、ファージベクターインサートの長さ（８，３０３ｂｐ）を１ビリオンあたりの塩基数として計算し、各ラウンドで得られたファージ溶液のビリオン数を求めた（表６）。各ラウンドでファージが得られていることが分かった。また、並行して行ったプラスミド抽出から、プラスミドＤＮＡが得られた。
【0074】
【表6】
【0075】
１ラウンドでは、溶出したファージを感染させた大腸菌をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ寒天培地に植菌したものに、４４７個のコロニーが生じた。生じたコロニーを回収して細菌培養した後、ＰＥＧ沈殿とプラスミド抽出より得られたファージとプラスミドＤＮＡを１世代として、ファージをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ１ファージ、プラスミドＤＮＡをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ１とした。また、洗浄液を感染させた大腸菌を植菌した寒天培地全てにコロニーが区別できないほどに多数の大腸菌が生えていた。
【0076】
２ラウンドでは、溶出したファージを感染させた大腸菌をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加２×ＹＴ寒天培地に植菌したものに、９７２個のコロニーが生じた。生じたコロニーを回収して細菌培養した後、得られたファージとプラスミドＤＮＡを２世代として、ファージをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２ファージ、プラスミドＤＮＡをＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２とした。また、洗浄液を感染させた大腸菌を植菌したプレートの全てにコロニーが生じた。コロニーの計測可能なプレートで、コロニー計測を行った（図３：ラウンド２、３での洗浄液（Ｗａｓｈ）と溶出液を植菌したカナマイシン５０μｇ ｍＬ－１添加２×ＹＴ寒天培地に生じたコロニー数）。
【0077】
３ラウンドでは、溶出したファージを感染させた大腸菌を２×ＹＴ寒天培地に植菌したものに、２９個のコロニーが生じた。２９個のコロニーをそれぞれプラスミド抽出し、シーケンス解析を行った結果、３つのＰｆＣｈＢＤ２変異体が存在していることが分かった。３つの変異体はＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｔ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｌ－Ｄ２８１Ｒ、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｐ－Ｅ２７９Ｌ－Ｄ２８１Ｗ（Ｎ２７２のコドン違い）であり、これらのプラスミドＤＮＡを３世代として保存した（図４）。また、２９個のコロニー中２７個のコロニーから同一のコドンを持つＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のプラスミドＤＮＡが得られた。
【0078】
＜考察＞
２ラウンドでのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）は、Ｗａｓｈ４から１０にかけてコロニー形成単位が低くなっていることが確認できた（図３）。また、２ラウンドで得た２世代のコロニー形成単位がＷａｓｈ９、１０よりも明らかに大きいことから、非晶性ＰＥＴフィルムと相互作用しているファージを溶出ステップによって回収できたと考えられる。しかし、３ラウンドでは２ラウンドと異なり、３世代のコロニー形成単位がＷａｓｈ９、１０よりも大きくなることはなかった。これは、２ラウンドより温度条件が厳しくなったことで、洗浄ステップによって取り除かれるファージが多くなったためと考えられる。そのため、３ラウンドで得られた変異体は耐熱性が他の変異体に比べて高い可能性がある。３世代では、２９個のコロニーから３種類の変異体が得られた。ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体は２９個のコロニー中２７個のコロニーから得られた。そのため、他の２種類の変異体に比べてＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体は、耐熱性が高い可能性がある。
２ラウンドでのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）は、Ｗａｓｈ４から１０にかけてコロニー形成単位が低くなっていることが確認できた（図３）。また、２ラウンドで得た２世代のコロニー形成単位がＷａｓｈ９、１０よりも明らかに大きいことから、非晶性ＰＥＴフィルムと相互作用しているファージを溶出ステップによって回収できたと考えられる。しかし、３ラウンドでは２ラウンドと異なり、３世代のコロニー形成単位がＷａｓｈ９、１０よりも大きくなることはなかった。これは、２ラウンドより温度条件が厳しくなったことで、洗浄ステップによって取り除かれるファージが多くなったためと考えられる。そのため、３ラウンドで得られた変異体は耐熱性が他の変異体に比べて高い可能性がある。３世代では、２９個のコロニーから３種類の変異体が得られた。ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体は２９個のコロニー中２７個のコロニーから得られた。そのため、他の２種類の変異体に比べてＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体は、耐熱性が高い可能性がある。
【0079】
３つの変異体のＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｔ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｌ－Ｄ２８１Ｒ、及びＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｐ－Ｅ２７９Ｌ－Ｄ２８１Ｗはファージディスプレイ法を用いたアフィニティセレクションによって得られた。
【0080】
５．次世代シーケンス解析
バイオパニングによる０世代のプラスミドライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０から２世代のプラスミドライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２の変化を確認するために、各ライブラリに対して次世代シーケンス解析を行った。次世代シーケンス解析では、調製したＤＮＡライブラリに対して蛍光物質を持つ基質ヌクレオチドを利用した伸長反応を行い、解析することで膨大な数の塩基配列を同時に配列決定することできる。
バイオパニングによる０世代のプラスミドライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０から２世代のプラスミドライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２の変化を確認するために、各ライブラリに対して次世代シーケンス解析を行った。次世代シーケンス解析では、調製したＤＮＡライブラリに対して蛍光物質を持つ基質ヌクレオチドを利用した伸長反応を行い、解析することで膨大な数の塩基配列を同時に配列決定することできる。
【0081】
（１）次世代シーケンス解析用ＤＮＡサンプルの調製
＜方法＞
ここでは、次世代シーケンサＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いるＭｉＳｅｑ Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ法による次世代シーケンス解析のためのＤＮＡサンプルを調製した。プラスミドライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０とラウンド２で得られたＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２をテンプレートＤＮＡとして、４つの変異箇所を含むＤＮＡ領域を増幅させ、リンカー配列を末端に付随させるプライマーを設計した（表７）。ＰＣＲ溶液を表１に従って調製した。サーマルサイクラーにて９８℃１０秒，６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、反応液サンプルを２％アガロースゲルにそれぞれアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。その後、MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認し、バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。２章（１）と同様にゲル抽出を行い、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。その後ＤＮＡが精製されているか確認するために再び２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
＜方法＞
ここでは、次世代シーケンサＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いるＭｉＳｅｑ Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ法による次世代シーケンス解析のためのＤＮＡサンプルを調製した。プラスミドライブラリＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０とラウンド２で得られたＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２をテンプレートＤＮＡとして、４つの変異箇所を含むＤＮＡ領域を増幅させ、リンカー配列を末端に付随させるプライマーを設計した（表７）。ＰＣＲ溶液を表１に従って調製した。サーマルサイクラーにて９８℃１０秒，６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、反応液サンプルを２％アガロースゲルにそれぞれアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。その後、MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認し、バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。２章（１）と同様にゲル抽出を行い、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。その後ＤＮＡが精製されているか確認するために再び２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
【0082】
【表7】
【0083】
予想されるバンドサイズは３０３ｂｐである。ゲル上では３００ｂｐ付近にそれぞれバンドがみられたため、目的遺伝子が増幅されていたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度がＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ０から３１ｎｇ／μＬ、ＰｆＣｈＢＤ２－４Ｍ－ｇｅｎｅ２から６２ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプル２５μＬが得られた。また、これら精製後のＤＮＡサンプルにおいてそれぞれ１つのバンドが確認されたことから、ＤＮＡサンプルが精製されていることが確認できた。
【0084】
（２）次世代シーケンス解析
＜方法＞
（１）で精製したＤＮＡサンプルを北海道システム・サイエンス株式会社の次世代シーケンス解析サービスで解析してもらった。以降北海道システム・サイエンス株式会社の次世代シーケンス解析サービスで行われたことを示す。Agilent 2200 Tape Stationシステムによるサンプルの濃度測定・品質の確認を行った。イルミナ社の16s Metagenomic Sequencing Library Preparationプロトコルに従い、シーケンス用ライブラリ調製を行った。次世代シーケンサＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いて、MiSeq Paired-End法３００塩基読み取りにより塩基配列データを取得した。出力された解析生データより、塩基配列のテキストデータを取得した。所定のフィルタリングによるリードデータの選別を行った。Ｉｎｄｅｘ情報による各サンプルデータの振り分けを行った。振り分けされたデータについてサンプルごとにリードトリミングを行った。トリミングされたデータについて二つのリード配列の連結を行った。連結されたデータについて、同一配列のリードデータの集計を行った。集計を行った配列データについて、ターゲット領域の切り出しと同一配列の集計、アミノ酸翻訳と同一配列の集計、及びターゲット領域のアラインメントを行った。
＜方法＞
（１）で精製したＤＮＡサンプルを北海道システム・サイエンス株式会社の次世代シーケンス解析サービスで解析してもらった。以降北海道システム・サイエンス株式会社の次世代シーケンス解析サービスで行われたことを示す。Agilent 2200 Tape Stationシステムによるサンプルの濃度測定・品質の確認を行った。イルミナ社の16s Metagenomic Sequencing Library Preparationプロトコルに従い、シーケンス用ライブラリ調製を行った。次世代シーケンサＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いて、MiSeq Paired-End法３００塩基読み取りにより塩基配列データを取得した。出力された解析生データより、塩基配列のテキストデータを取得した。所定のフィルタリングによるリードデータの選別を行った。Ｉｎｄｅｘ情報による各サンプルデータの振り分けを行った。振り分けされたデータについてサンプルごとにリードトリミングを行った。トリミングされたデータについて二つのリード配列の連結を行った。連結されたデータについて、同一配列のリードデータの集計を行った。集計を行った配列データについて、ターゲット領域の切り出しと同一配列の集計、アミノ酸翻訳と同一配列の集計、及びターゲット領域のアラインメントを行った。
【0085】
＜結果＞
次世代シーケンス解析の結果によって得られた塩基配列のリード数と翻訳して得られたアミノ酸配列のユニーク数を表８に示す。０世代ではユニーク数が１７，７９１種類、２世代では３，８２７種類であった。また、ストップコドンの発生、塩基の欠失や挿入によって、アミノ酸の数に異常があったアミノ酸配列は、０世代には１，４５６種類でリード数が１２，２７９個、２世代には２５９種類でリード数が４２４個であった。ユニーク数とアミノ酸数に異常があったアミノ酸配列の差から、真のユニーク数を計算した。真のユニーク数は０世代で１６，３３５個、２世代で３，５６８個となっていた。０世代から２世代にかけて真のユニーク数が減少し、アミノ酸数に異常のあるアミノ酸配列の種類とリード数が減っていることが分かった。
次世代シーケンス解析の結果によって得られた塩基配列のリード数と翻訳して得られたアミノ酸配列のユニーク数を表８に示す。０世代ではユニーク数が１７，７９１種類、２世代では３，８２７種類であった。また、ストップコドンの発生、塩基の欠失や挿入によって、アミノ酸の数に異常があったアミノ酸配列は、０世代には１，４５６種類でリード数が１２，２７９個、２世代には２５９種類でリード数が４２４個であった。ユニーク数とアミノ酸数に異常があったアミノ酸配列の差から、真のユニーク数を計算した。真のユニーク数は０世代で１６，３３５個、２世代で３，５６８個となっていた。０世代から２世代にかけて真のユニーク数が減少し、アミノ酸数に異常のあるアミノ酸配列の種類とリード数が減っていることが分かった。
【0086】
【表8】
【0087】
各世代の次世代シーケンス解析から得られたアミノ酸配列をカウントしたもののうち、上位を表９に示した。０世代では、ストップコドンを生じたものが多く上位になっていた。また、０世代では野生型（ＷＴ）のアミノ酸配列も多くみられたが、変異を加える際のテンプレートＤＮＡが影響していると考えられる。２世代でのカウント数上位には、０世代の次世代シーケンス解析で少ないリード数だったものが確認できた。また、２世代のカウント数上位には、０世代の次世代シーケンス解析では確認されていないものも存在していた。これは、０世代の次世代シーケンス解析では読み切れなかった配列が存在していたことを示唆する。しかし、そのような配列であってもバイオパニングの２つのラウンドを経ることで、２世代の次世代シーケンスで上位のカウント数を示すことがわかった。
【0088】
【表9】
【0089】
０世代と２世代の次世代シーケンス解析の結果得られたアミノ酸配列から、アミノ酸の数が異常な配列を除いた後、リード数をカウントした。０世代のアミノ酸分布では、ＮＮＫによる変異導入が行われていたことが分かった。０世代と２世代のアミノ酸分布を比べると、バイオパニングの２つのラウンドによって、アミノ酸分布が変化したことが分かった。
【0090】
２世代のアミノ酸分布では０世代に比べて、変異を加えたアミノ酸座位ごとに分布が変化していた。Ｋ２７０の位置でリード数（％）の上位３つは、プロリン（Ｐ）が６４．７％、それに次いでスレオニン（Ｔ）とヒスチジン（Ｈ）がそれぞれ１２％、８．８％であった。Ｎ２７２の位置でリード数は、プロリン（Ｐ）とメチオニン（Ｍ）でそれぞれ２２．３％、２２％であり、ヒスチジン（Ｈ）が１３．５％であった。また、Ｎ２７２の位置でＷＴとはコドン違いのアスパラギン（Ｎ）が１０．４％を占めていた。Ｅ２７９の位置でリード数（％）は、トリプトファン（Ｗ）が３７．４％で、それに次いでロイシン（Ｌ）とバリン（Ｖ）がそれぞれ２２％、７．８％であった。Ｄ２８１の位置でリード数は、グルタミン酸（Ｅ）が２０．５％であり、それに次いでアルギニン（Ｒ）とトリプトファン（Ｗ）がそれぞれ１５．３％，１３．３％であった。また、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）はそれぞれ１２．８％，９．７％を占めていた。
【0091】
＜考察＞
次世代シーケンス解析の結果、０世代でのアミノ酸数が異常な配列はリード数が１２，２７９個であった。０世代全体のリード数が９，９１３６個であることから、アミノ酸数が異常な配列のリード数は１２．４％を占めていることが分かった。ＮＮＫによる飽和変異導入を４箇所に行う場合、ストップコドンは１１．９％の確率で生じる。また、アミノ酸数が異常な配列にはストップコドン以外にも、塩基の欠損や挿入によってアミノ酸数が異常になってしまったものも含まれていた。このようなことから、０世代でのアミノ酸数が異常な配列のリード数は理論値に近い値であると考えられる。
アミノ酸数が異常な配列のリード数は０世代で１２，２７９個、２世代で４２４個であった。これは、バイオパニングによってアミノ酸数異常な配列が取り除かれたため、アミノ酸数が異常な配列のリード数が減少したと考えられる。また、真のユニーク数も０世代で１６，３３５種類、２世代で３，５６８種類であり、減少していた。これも、バイオパニングによって非晶性ＰＥＴフィルムに相互作用するＰｆＣｈＢＤ２変異体が選抜されたためと考えられる。
次世代シーケンス解析の結果、０世代でのアミノ酸数が異常な配列はリード数が１２，２７９個であった。０世代全体のリード数が９，９１３６個であることから、アミノ酸数が異常な配列のリード数は１２．４％を占めていることが分かった。ＮＮＫによる飽和変異導入を４箇所に行う場合、ストップコドンは１１．９％の確率で生じる。また、アミノ酸数が異常な配列にはストップコドン以外にも、塩基の欠損や挿入によってアミノ酸数が異常になってしまったものも含まれていた。このようなことから、０世代でのアミノ酸数が異常な配列のリード数は理論値に近い値であると考えられる。
アミノ酸数が異常な配列のリード数は０世代で１２，２７９個、２世代で４２４個であった。これは、バイオパニングによってアミノ酸数異常な配列が取り除かれたため、アミノ酸数が異常な配列のリード数が減少したと考えられる。また、真のユニーク数も０世代で１６，３３５種類、２世代で３，５６８種類であり、減少していた。これも、バイオパニングによって非晶性ＰＥＴフィルムに相互作用するＰｆＣｈＢＤ２変異体が選抜されたためと考えられる。
【0092】
２世代におけるカウント数上位には、３ラウンドで得られた３世代のＰｆＣｈＢＤ２変異体がすべて含まれていた（表９）。また、２世代のカウント数で１番多いカウント数だった変異体は３世代では確認できなかった。これは、２ラウンドでは温度条件が２５℃、３ラウンドでは６０℃で結合ステップと洗浄ステップを行ったことから、２ラウンドで上位のカウント数であったとしても耐熱性が低くなる変異の組み合わせが淘汰され、耐熱性の高い構造を持つＰｆＣｈＢＤ２変異体が３世代として得られたと考えられる。
０世代と２世代のアミノ酸分布を比べると、変異を加えたアミノ酸座位ごとに分布が変化していた。このことから、ＰＥＴへの結合能が向上した変異体ライブラリが得られたと考えられる。
０世代と２世代のアミノ酸分布を比べると、変異を加えたアミノ酸座位ごとに分布が変化していた。このことから、ＰＥＴへの結合能が向上した変異体ライブラリが得られたと考えられる。
【0093】
６．ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２の遺伝子作製
４章（３）で一番多く得られた３世代のＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体について、非晶性ＰＥＴへの結合能を確認するため、大腸菌を宿主とした発現系の構築を行った。タンパク質発現用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子とＨｉｓタグを持つｐＥＴ２７ｂベクターを使用した。ＰＣＲとライゲーション反応を用いて、ｐＥＴ２７ｂに蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰとＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたプラスミドＤＮＡに対してＰｆＣｈＢＤ２のＷＴと変異体の遺伝子を挿入した。ｓｔａｇＲＦＰはｔａｇＲＦＰ－Ｔの約２倍の蛍光強度で、最大吸収波長を５５５ｎｍに持つ、赤色蛍光タンパク質の一つである。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株に形質転換した。培養した大腸菌からプラスミドを抽出し、シーケンス解析で目的遺伝子が得られたことを確認した。
４章（３）で一番多く得られた３世代のＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体について、非晶性ＰＥＴへの結合能を確認するため、大腸菌を宿主とした発現系の構築を行った。タンパク質発現用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子とＨｉｓタグを持つｐＥＴ２７ｂベクターを使用した。ＰＣＲとライゲーション反応を用いて、ｐＥＴ２７ｂに蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰとＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたプラスミドＤＮＡに対してＰｆＣｈＢＤ２のＷＴと変異体の遺伝子を挿入した。ｓｔａｇＲＦＰはｔａｇＲＦＰ－Ｔの約２倍の蛍光強度で、最大吸収波長を５５５ｎｍに持つ、赤色蛍光タンパク質の一つである。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株に形質転換した。培養した大腸菌からプラスミドを抽出し、シーケンス解析で目的遺伝子が得られたことを確認した。
【0094】
（１）ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子作製のためのＰＣＲ
＜方法＞
ｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたｐＥＴ２７ｂプラスミドＤＮＡにＰｆＣｈＢＤ２遺伝子を挿入するためにプライマーを設計した（表１０）。ｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたｐＥＴ２７ｂプラスミドＤＮＡとＰｆＣｈＢＤ２のＷＴ、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のＤＮＡをテンプレートＤＮＡとした。テンプレートＤＮＡとプライマーを用いて、表１に従ってＰＣＲ溶液を調製した。サーマルサイクラーにて９８℃１０秒、６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液サンプルにＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、２％、１％アガロースゲルにそれぞれアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。
MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認した。バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、ゲル抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
＜方法＞
ｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたｐＥＴ２７ｂプラスミドＤＮＡにＰｆＣｈＢＤ２遺伝子を挿入するためにプライマーを設計した（表１０）。ｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたｐＥＴ２７ｂプラスミドＤＮＡとＰｆＣｈＢＤ２のＷＴ、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のＤＮＡをテンプレートＤＮＡとした。テンプレートＤＮＡとプライマーを用いて、表１に従ってＰＣＲ溶液を調製した。サーマルサイクラーにて９８℃１０秒、６８℃４０秒を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液サンプルにＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、２％、１％アガロースゲルにそれぞれアプライし、１００Ｖで２５分電気泳動した。
MIDORI Green Xtraでゲルを染色してバンドサイズを確認した。バンドをゲルから全て切り出しマイクロチューブに入れた。Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、ゲル抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を測定した。
【0095】
【表10】
【0096】
＜結果＞
予想されるＤＮＡサイズはｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたｐＥＴ２７ｂプラスミドＤＮＡで６０８５ｂｐ、ＰｆＣｈＢＤ２で３２８ｂｐである。ゲル上では６ｋｂｐ、３００ｂｐ付近にそれぞれバンドがみられたため、目的遺伝子が増幅されたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度がｓｔａｇＲＦＰ遺伝子から４４．７ｎｇ／μＬ、ＰｆＣｈＢＤ２のＷＴで１６１ｎｇ／μＬ、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇで５０ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルをそれぞれ２５μＬ得た。
予想されるＤＮＡサイズはｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入されたｐＥＴ２７ｂプラスミドＤＮＡで６０８５ｂｐ、ＰｆＣｈＢＤ２で３２８ｂｐである。ゲル上では６ｋｂｐ、３００ｂｐ付近にそれぞれバンドがみられたため、目的遺伝子が増幅されたことが分かった。ゲル抽出により、ＤＮＡ濃度がｓｔａｇＲＦＰ遺伝子から４４．７ｎｇ／μＬ、ＰｆＣｈＢＤ２のＷＴで１６１ｎｇ／μＬ、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇで５０ｎｇ／μＬのＤＮＡサンプルをそれぞれ２５μＬ得た。
【0097】
（２）ｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＰｆＣｈＢＤ２遺伝子のライゲーション及び形質転換
＜方法＞
（１）で得られたｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＰｆＣｈＢＤ２のＤＮＡサンプルを各１μＬ、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixを２μＬ加え計４μＬ、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応液０．８μＬをエレクトロコンピテントセルＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）株５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株はｌａｃＺＹ欠失変異体で、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド）濃度依存的なタンパク発現の誘導を行える。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした。寒天培地にできたコロニーから一つ選択して、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ液体培地と寒天培地にそれぞれ植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。細菌培養液の入ったチューブを回収し、６，０００ｇで３分間遠心分離した。上清を除き、沈殿した大腸菌からQIA prep Spin Miniprep Kitを用いて、プラスミド抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したプラスミドのＤＮＡ濃度を測定し、プラスミドＤＮＡサンプルをシーケンス解析した。
＜方法＞
（１）で得られたｓｔａｇＲＦＰ遺伝子とＰｆＣｈＢＤ２のＤＮＡサンプルを各１μＬ、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixを２μＬ加え計４μＬ、サーマルサイクラーで５０℃、１時間インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応液０．８μＬをエレクトロコンピテントセルＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）株５０μＬに混合し、エレクトロポレーションキュベットに混合液を入れた。Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株はｌａｃＺＹ欠失変異体で、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド）濃度依存的なタンパク発現の誘導を行える。エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地２００μＬを加えて懸濁した。懸濁液をマイクロチューブに回収し、３７℃、１，０００ｒｐｍで１時間インキュベートした。懸濁液をカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１日インキュベートした。寒天培地にできたコロニーから一つ選択して、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ液体培地と寒天培地にそれぞれ植菌し、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。細菌培養液の入ったチューブを回収し、６，０００ｇで３分間遠心分離した。上清を除き、沈殿した大腸菌からQIA prep Spin Miniprep Kitを用いて、プラスミド抽出を行った。吸光度計を用いて、精製したプラスミドのＤＮＡ濃度を測定し、プラスミドＤＮＡサンプルをシーケンス解析した。
【0098】
＜結果＞
カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に単一のコロニーがそれぞれ形成された。ＤＮＡ濃度３０ｎｇ／μＬのＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）を挿入したプラスミドＤＮＡサンプルと２６０ｎｇ／μＬのＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇを挿入したプラスミドＤＮＡサンプルをそれぞれ５０μＬ得た。また、シーケンス解析の結果から、ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子が正確に挿入されていることが分かった。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓ、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓと呼ぶ（図５）。
カナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ寒天培地に単一のコロニーがそれぞれ形成された。ＤＮＡ濃度３０ｎｇ／μＬのＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）を挿入したプラスミドＤＮＡサンプルと２６０ｎｇ／μＬのＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇを挿入したプラスミドＤＮＡサンプルをそれぞれ５０μＬ得た。また、シーケンス解析の結果から、ＰｆＣｈＢＤ２遺伝子が正確に挿入されていることが分かった。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓ、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓと呼ぶ（図５）。
【0099】
７．ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２の発現と精製
ＰｆＣｈＢＤ２のＷＴとＫ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体を用いて、非晶性ＰＥＴに対する結合実験を行うために、蛍光タンパクｓｔａｇＲＦＰをＮ末端に融合させたＰｆＣｈＢＤ２のＷＴとＫ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－２８１Ｇ変異体を作製した。６章で得られたｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓ、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓを組み込んだ大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株を液体培地で培養し、ＩＰＴＧによるタンパク質の発現誘導を行うことで目的タンパク質の生産を行った。また、生産されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。
ＰｆＣｈＢＤ２のＷＴとＫ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体を用いて、非晶性ＰＥＴに対する結合実験を行うために、蛍光タンパクｓｔａｇＲＦＰをＮ末端に融合させたＰｆＣｈＢＤ２のＷＴとＫ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－２８１Ｇ変異体を作製した。６章で得られたｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓ、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓを組み込んだ大腸菌Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）株を液体培地で培養し、ＩＰＴＧによるタンパク質の発現誘導を行うことで目的タンパク質の生産を行った。また、生産されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。
【0100】
（１）ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２とｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体の発現
＜方法＞
６章（２）で得られた寒天培地に生えたｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－ＨｉｓとｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓのコロニーを１０ｍＬのカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ培地にそれぞれ植菌して、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。培養した細菌培養液を７００ｍＬのカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地にそれぞれ植菌し、３７℃、１３０ｒｐｍで３時間培養した。培養後、３０分氷水で培地を冷却した。７００ｍＬの培地に対して、１Ｍ ＩＰＴＧを３５０μＬそれぞれ加え、２０℃、１３０ｒｐｍで１日インキュベートした。それぞれの培地を３，０００ｇで１０分間遠心分離して、沈殿物を回収した。沈殿物は、－８０℃で冷凍保存した。
＜方法＞
６章（２）で得られた寒天培地に生えたｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－ＨｉｓとｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓのコロニーを１０ｍＬのカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加ＬＢ培地にそれぞれ植菌して、３７℃、３００ｒｐｍで１日インキュベートした。培養した細菌培養液を７００ｍＬのカナマイシン５０μｇ／ｍＬ添加Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地にそれぞれ植菌し、３７℃、１３０ｒｐｍで３時間培養した。培養後、３０分氷水で培地を冷却した。７００ｍＬの培地に対して、１Ｍ ＩＰＴＧを３５０μＬそれぞれ加え、２０℃、１３０ｒｐｍで１日インキュベートした。それぞれの培地を３，０００ｇで１０分間遠心分離して、沈殿物を回収した。沈殿物は、－８０℃で冷凍保存した。
【0101】
＜結果＞
ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓの沈殿物を６．１ｇ、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓの沈殿物を３．０ｇそれぞれ得た。回収した沈殿物はどちらも赤色をしていた。
ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－ＴＥＶ－Ｈｉｓの沈殿物を６．１ｇ、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ－ＴＥＶ－Ｈｉｓの沈殿物を３．０ｇそれぞれ得た。回収した沈殿物はどちらも赤色をしていた。
【0102】
（２）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
＜方法＞
（１）で得られた沈殿物１０ｇに対して１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー（バッファー１）を加え、超音波破砕機で２０分間破砕した。破砕液を２０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。上清をカラムボリューム３ｍＬのＮｉ－ＮＴＡカラムにロードし、フロースルー（ＦＴ）を回収した。バッファー１３０ｍＬをカラムに流し入れ、カラムからでてきた３～６ｍＬを回収した。続いて５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー３０ｍＬをカラムに流し入れ、同様の操作を行った。その後、１００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー３０ｍＬをカラムに流し入れ、３ｍＬずつ試験管に回収した。それぞれの吸光度を測定し、吸光がみられたものをＳＤＳ－ＰＡＧＥによってバンドサイズを確認した。バンドが確認できたフラクションをＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（３０，０００ＭＷＣＯ）に回収し、７００μＬまで濃縮した。濃縮したタンパク質溶液をillustra NAP-10 Columnsを用いて、バッファー１に置換した１．４ｍＬのタンパク溶液を得た。その後、３ｍｇ／ｍＬのＴＥＶプロテアーゼを８０μＬ加え、１６℃で１日インキュベートした。カラムボリューム０．５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡにタンパク溶液を流し入れた。流れ出たサンプルを再びカラムに流し入れて、回収した。５００μＬずつバッファー１を流し入れて、それぞれ流れ出たタンパク溶液を回収し、バッファー１を合計３ｍＬ流し入れるまで同様の操作を行った。各フラクションの吸光度を測定し、２８０ｎｍの波長で吸光がみられたものをＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（３０，０００ＭＷＣＯ）に回収し、遠心分離でタンパク質溶液が５００μＬ以下になるまで濃縮した。
＜方法＞
（１）で得られた沈殿物１０ｇに対して１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー（バッファー１）を加え、超音波破砕機で２０分間破砕した。破砕液を２０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。上清をカラムボリューム３ｍＬのＮｉ－ＮＴＡカラムにロードし、フロースルー（ＦＴ）を回収した。バッファー１３０ｍＬをカラムに流し入れ、カラムからでてきた３～６ｍＬを回収した。続いて５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー３０ｍＬをカラムに流し入れ、同様の操作を行った。その後、１００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、及び１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー３０ｍＬをカラムに流し入れ、３ｍＬずつ試験管に回収した。それぞれの吸光度を測定し、吸光がみられたものをＳＤＳ－ＰＡＧＥによってバンドサイズを確認した。バンドが確認できたフラクションをＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（３０，０００ＭＷＣＯ）に回収し、７００μＬまで濃縮した。濃縮したタンパク質溶液をillustra NAP-10 Columnsを用いて、バッファー１に置換した１．４ｍＬのタンパク溶液を得た。その後、３ｍｇ／ｍＬのＴＥＶプロテアーゼを８０μＬ加え、１６℃で１日インキュベートした。カラムボリューム０．５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡにタンパク溶液を流し入れた。流れ出たサンプルを再びカラムに流し入れて、回収した。５００μＬずつバッファー１を流し入れて、それぞれ流れ出たタンパク溶液を回収し、バッファー１を合計３ｍＬ流し入れるまで同様の操作を行った。各フラクションの吸光度を測定し、２８０ｎｍの波長で吸光がみられたものをＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（３０，０００ＭＷＣＯ）に回収し、遠心分離でタンパク質溶液が５００μＬ以下になるまで濃縮した。
【0103】
＜結果＞
アフィニティークロマトグラフィーで得た各フラクションの吸光度測定の結果を表１１に示す。予想されるバンドサイズは４０ｋＤａである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、３５ｋＤａと４５ｋＤａの間にバンドが確認できるため、目的のタンパク質がフラクションＮｏ．２～１０に存在していることが分かった。ＴＥＶプロテアーゼ処理したタンパク質溶液をＮｉ－ＮＴＡカラムにロード後に、バッファー１を用いて回収した各フラクションの吸光度を表１２に示す。ＷＴのフラクションＮｏ．１７、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のフラクションＮｏ．１４をそれぞれ濃縮したタンパク質溶液を０．５ｍＬ得た。
アフィニティークロマトグラフィーで得た各フラクションの吸光度測定の結果を表１１に示す。予想されるバンドサイズは４０ｋＤａである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、３５ｋＤａと４５ｋＤａの間にバンドが確認できるため、目的のタンパク質がフラクションＮｏ．２～１０に存在していることが分かった。ＴＥＶプロテアーゼ処理したタンパク質溶液をＮｉ－ＮＴＡカラムにロード後に、バッファー１を用いて回収した各フラクションの吸光度を表１２に示す。ＷＴのフラクションＮｏ．１７、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のフラクションＮｏ．１４をそれぞれ濃縮したタンパク質溶液を０．５ｍＬ得た。
【0104】
【表11】
【0105】
【表12】
【0106】
（３）ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製
＜方法＞
Superdex 75 Increase 10/300GLをカラムとしてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。（２）で得られた５００μＬ以下になるまで濃縮したタンパク質溶液をカラムにそれぞれロードした。バッファーには、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）を使用し、流速を０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１フラクションあたり０．５ｍＬの条件で精製を行った。精製後、吸光のあるフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥによってバンドサイズを確認した。バンドが確認できたフラクションをＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（３０，０００ＭＷＣＯ）に回収し、１ｍＬ以下になるまで濃縮した。吸光度計を用いて、濃縮したタンパク質溶液の３４０ｎｍを基準とした２８０ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度とモル吸光係数（５４，８６０Ｍ－１ｃｍ－１）からタンパク質濃度を求めた。
＜方法＞
Superdex 75 Increase 10/300GLをカラムとしてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。（２）で得られた５００μＬ以下になるまで濃縮したタンパク質溶液をカラムにそれぞれロードした。バッファーには、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）を使用し、流速を０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１フラクションあたり０．５ｍＬの条件で精製を行った。精製後、吸光のあるフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥによってバンドサイズを確認した。バンドが確認できたフラクションをＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（３０，０００ＭＷＣＯ）に回収し、１ｍＬ以下になるまで濃縮した。吸光度計を用いて、濃縮したタンパク質溶液の３４０ｎｍを基準とした２８０ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度とモル吸光係数（５４，８６０Ｍ－１ｃｍ－１）からタンパク質濃度を求めた。
【0107】
＜結果＞
予想されるバンドサイズは４０ｋＤａである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、３５ｋＤａと４５ｋＤａの間にバンドが確認できたため、目的のタンパク質が精製できたことがわかった。ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２ではフラクションＮｏ．５～１９、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１ＧではフラクションＮｏ．３～１６をそれぞれ回収して、濃縮した。タンパク質濃度が４０．９μＭのｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２と２５．９μＭのｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇがそれぞれ約８００μＬ得られた。
予想されるバンドサイズは４０ｋＤａである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、３５ｋＤａと４５ｋＤａの間にバンドが確認できたため、目的のタンパク質が精製できたことがわかった。ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２ではフラクションＮｏ．５～１９、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１ＧではフラクションＮｏ．３～１６をそれぞれ回収して、濃縮した。タンパク質濃度が４０．９μＭのｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２と２５．９μＭのｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇがそれぞれ約８００μＬ得られた。
【0108】
８．ＰＥＴに対する結合量の測定
ＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）とＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１ＧのＰＥＴ結合能を確認するために、７章で精製したタンパク質と非晶性ＰＥＴとをインキュベートした。遠心分離後、上清に含まれるＰｆＣｈＢＤ２に融合させた蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰの最大吸収波長５５５ｎｍの吸光度から上清に含まれるタンパク質量を測定した。基質のみとタンパク質のみの吸光度も測定することで、基質１ｍｇあたりに結合したタンパク質量を求めた。また、赤色蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰを用いたタンパク質の定量を行ったのは、基質である非晶性ＰＥＴが２８０ｎｍの吸収を示し、計測精度に問題があったためである。
ＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）とＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１ＧのＰＥＴ結合能を確認するために、７章で精製したタンパク質と非晶性ＰＥＴとをインキュベートした。遠心分離後、上清に含まれるＰｆＣｈＢＤ２に融合させた蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰの最大吸収波長５５５ｎｍの吸光度から上清に含まれるタンパク質量を測定した。基質のみとタンパク質のみの吸光度も測定することで、基質１ｍｇあたりに結合したタンパク質量を求めた。また、赤色蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰを用いたタンパク質の定量を行ったのは、基質である非晶性ＰＥＴが２８０ｎｍの吸収を示し、計測精度に問題があったためである。
【0109】
（１）ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２の検量線の作成
＜方法＞
７章（３）で精製したｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２を終濃度が０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭになるように５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）に混合した。吸光度を測定し、その結果から検量線を作成した。以降の実験ではこの検量線を用いてタンパク質濃度を測定した。
＜方法＞
７章（３）で精製したｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２を終濃度が０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭになるように５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）に混合した。吸光度を測定し、その結果から検量線を作成した。以降の実験ではこの検量線を用いてタンパク質濃度を測定した。
【0110】
（２）ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２とｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体の結合能の測定
＜方法＞
７章（３）で得られた精製したｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２及びｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇと基質を用いて、表１３にしたがって溶液を調製した。基質には非晶性ＰＥＴを用いた。同様に、基質のみの溶液とタンパク質のみの溶液も調製した。また、溶液は各３つずつ用意した。調製した溶液を２５℃で１時間インキュベートした。遠心分離によって基質を沈殿させ、上清の吸光度を測定した。
＜方法＞
７章（３）で得られた精製したｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２及びｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇと基質を用いて、表１３にしたがって溶液を調製した。基質には非晶性ＰＥＴを用いた。同様に、基質のみの溶液とタンパク質のみの溶液も調製した。また、溶液は各３つずつ用意した。調製した溶液を２５℃で１時間インキュベートした。遠心分離によって基質を沈殿させ、上清の吸光度を測定した。
【0111】
【表13】
【0112】
＜結果＞
吸光度測定の結果から、（１）で得られた検量線を用いて各溶液のｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２及びｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇの濃度を求めた。タンパク質のみの溶液から基質とタンパク質を含む溶液と基質のみの溶液のタンパク質濃度の差をとることで、基質に結合したタンパク質量（ｎｍｏｌ）を求めた。
非晶性ＰＥＴへのｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）の結合量は０．３（±０．６４）ｎｍｏｌ／ｍｇで、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体は３．８７（±０．８６）ｎｍｏｌ／ｍｇであった（図６）。
吸光度測定の結果から、（１）で得られた検量線を用いて各溶液のｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２及びｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇの濃度を求めた。タンパク質のみの溶液から基質とタンパク質を含む溶液と基質のみの溶液のタンパク質濃度の差をとることで、基質に結合したタンパク質量（ｎｍｏｌ）を求めた。
非晶性ＰＥＴへのｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）の結合量は０．３（±０．６４）ｎｍｏｌ／ｍｇで、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体は３．８７（±０．８６）ｎｍｏｌ／ｍｇであった（図６）。
【0113】
＜考察＞
結合実験の結果、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）はほとんど非晶性ＰＥＴへ結合しないことがわかった。バイオパニングによって得られた３世代のＰｆＣｈＢＤ２変異体を用いたｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇは非晶性ＰＥＴへの結合能を獲得していた。
結合実験の結果、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２（ＷＴ）はほとんど非晶性ＰＥＴへ結合しないことがわかった。バイオパニングによって得られた３世代のＰｆＣｈＢＤ２変異体を用いたｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇは非晶性ＰＥＴへの結合能を獲得していた。
【0114】
下表に、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のアミノ酸配列（配列番号３）及び遺伝子配列（配列番号４）を示す。下表において、Ｎ末端部（１～２４４番目のアミノ酸、１～７３２番目の塩基）は赤色蛍光タンパク質ｓｔａｇＲＦＰを示す。網掛け部（２４５～２４７番目のアミノ酸、７３３～７４１番目の塩基）はリンカー配列を示す。Ｃ末端の太字下線部（２４８～３４８番目のアミノ酸、７４２～１０４４番目の塩基）はＰｆＣｈＢＤ２変異体を示す。囲み字は変異点を示す。
【0115】
【表14】
【0116】
下表に、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体における変異箇所を示す。なお、本実施例において、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体における変異アミノ酸番号（２７０、２７２、２７９、及び２８１）は、ＰｆＣｈＢＤ２の由来するキチン分解酵素を基準としたアミノ酸座位で示されている。ＰｆＣｈＢＤ２はキチン分解酵素のＣ末端ドメインであり、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇとキチン分解酵素とではＮ末端のアミノ酸数が異なる。そのため、上記の２７０、２７２、２７９、及び２８１というアミノ酸番号は、ｓｔａｇＲＦＰ－ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇにおける、Ｎ末端から２６０番目、２６２番目、２６９番目、及び２７１番目のアミノ酸にそれぞれ相当する。
【0117】
【表15】
【0118】
上記アミノ酸配列において、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体における各変異（すなわち、配列番号３のＮ末端から２６０番目、２６２番目、２６９番目、及び２７１番目の変異）は、それぞれＰｆＣｈＢＤ２のＫ１３Ｈ、Ｎ１５Ｐ、Ｅ２２Ｖ、及びＤ２４Ｇの変異に対応する。
【0119】
９．総括
今回の研究では、ファージディスプレイ法を用いて、ＰＥＴに結合能を持つタンパク質の創出を行った。ファージライブラリを用いたバイオパニングでは、３ラウンドを通して３つのＰｆＣｈＢＤ２変異体が３世代として得られた。また、バイオパニング前の０世代と２ラウンドで得られた２世代のプラスミドライブラリを次世代シーケンス解析で比較すると、飽和変異導入した各アミノ酸座位でアミノ酸分布が変化していた。バイオパニングの３ラウンドでは、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体が一番多く確認できた。このことから、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体が他の変異体よりも耐熱性やＰＥＴ結合能が高いと考え、ＰＥＴとの結合実験を行った。結合実験では、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体はＰＥＴへの結合能を獲得していた。これらのことから、ファージディスプレイ法を用いたＰＥＴとのアフィニティセレクションによって、ＰＥＴへの結合能を獲得したタンパク質の創出が可能であることがわかった。この戦略は、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のＰＥＴへの結合能を向上させることにおいても応用できると考えられる。
今回の研究では、ファージディスプレイ法を用いて、ＰＥＴに結合能を持つタンパク質の創出を行った。ファージライブラリを用いたバイオパニングでは、３ラウンドを通して３つのＰｆＣｈＢＤ２変異体が３世代として得られた。また、バイオパニング前の０世代と２ラウンドで得られた２世代のプラスミドライブラリを次世代シーケンス解析で比較すると、飽和変異導入した各アミノ酸座位でアミノ酸分布が変化していた。バイオパニングの３ラウンドでは、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体が一番多く確認できた。このことから、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体が他の変異体よりも耐熱性やＰＥＴ結合能が高いと考え、ＰＥＴとの結合実験を行った。結合実験では、Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体はＰＥＴへの結合能を獲得していた。これらのことから、ファージディスプレイ法を用いたＰＥＴとのアフィニティセレクションによって、ＰＥＴへの結合能を獲得したタンパク質の創出が可能であることがわかった。この戦略は、ＰｆＣｈＢＤ２－Ｋ２７０Ｈ－Ｎ２７２Ｐ－Ｅ２７９Ｖ－Ｄ２８１Ｇ変異体のＰＥＴへの結合能を向上させることにおいても応用できると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】