特開 2024-166200 ゲノム編集による遺伝子サイレンシング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024166200

(43)【公開日】2024-11-28

(54)【発明の名称】ゲノム編集による遺伝子サイレンシング

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20241121BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20241121BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/09 110

A01H1/00 A ZNA

A01H1/00 A

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024131763

(22)【出願日】2024-08-08

(62)【分割の表示】P 2021531940の分割

【原出願日】2019-11-26

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/119155

(32)【優先日】2018-12-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】520222106

【氏名又は名称】シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】ルヴ ジアン

(72)【発明者】

【氏名】チェン シ

(72)【発明者】

【氏名】ユ クン

(72)【発明者】

【氏名】リアン ダウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ホンジュ

(72)【発明者】

【氏名】シュ ジャンピン

(57)【要約】

【課題】本発明は、ゲノム編集による遺伝子サイレンシングのための方法及び組成物を提供すること。
【解決手段】メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを提供した。加えて、本発明は、ゲノム編集による遺伝子サイレンシングのための方法及び組成物を提供し、ゲノム編集によって染色体を再配置するための方法及び組成物も提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ） 標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと；
ｂ） 単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと；
ｃ） 前記二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと；
ｄ） 前記標的遺伝子の発現を減少させることと：
からなる、前記標的遺伝子の発現を減少させる方法。

【請求項2】

前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的遺伝子における前記二本鎖切断が、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

請求項１に記載の細胞が、一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体ゲノムを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記標的遺伝子が劣性又は半優性である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

１つ以上のガイド配列を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ゲノム編集によって染色体を再配置する方法であって：
ａ．部位特異的ヌクレアーゼによって前記染色体に少なくとも１つの破損を生成することと；
ｂ．再配置を有する染色体を選択することと、
を含む、方法。

【請求項10】

前記部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記染色体再配置が、欠失、重複、逆位、又は転座を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記染色体再配置が、遺伝子発現の改変を引き起こす、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記遺伝子発現改変が、前駆体ｍＲＮＡレベル、又は成熟ｍＲＮＡレベル、又は翻訳レベルでの調節を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記染色体再配置が、前記染色体が種間雑種のような１つの核に分類され得る場合に、２つの種由来の染色体を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

前記染色体再配置が、少なくとも２つの対立遺伝子又は異なる対立遺伝子からの２つの成分を融合することによって、新たな対立遺伝子生成をもたらす、請求項９に記載の方法。

【請求項16】

染色体再配置が、プロモーター、エキソン、イントロン、又は転写ターミネーターを標的とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

染色体再配置が、前記再配置された遺伝子と配列類似性を有する異なる遺伝子の遺伝子発現の改変を引き起こす、請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

前記欠失、重複、逆位、又は転座が１９塩基対以上である、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１２月４日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１９１５５号による利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
２０１８年１１月１９日に生成された、「８１７２４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題される、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下で提出された、４７キロバイトのサイズのＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表。この配列表は、その開示について参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、ゲノム編集による遺伝子サイレンシング、又はゲノム編集による染色体の再配置のための方法及び組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

遺伝子サイレンシングは、遺伝子機能を研究し、作物に重要な形質を送達するための重要なツールである。植物における遺伝子サイレンシングの伝統的戦略には、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．２００６；７１：４８１－５）、センスＲＮＡ転写産物のトランスジェニック過剰発現、ヘアピン転写産物のトランスジェニック発現、アンチセンスＲＮＡ転写産物のトランスジェニック発現が含まれる。一方、これらの技術には、いくつかの制約がある。過剰産生されたセンス転写産物については、転写産物は未熟な終止コドンを有さない必要があり、そうでない場合、効率は十分ではなく、安定ではない。ヘアピン及びアンチセンス設計では、同じ組織及び同じ発達段階でのサイレンシングＲＮＡの発現を天然の標的ｍＲＮＡと一致させることが不可能であるため、ＲＮＡサイレンシング効果には漏れがある。

【0005】

本開示は、染色体逆位を作り出すためのゲノム編集を用いた新規な遺伝子サイレンシング方法を提供する。ゲノム編集は、例えば国際公開第１８０５７８６３号、国際公開第２０１７１８０９１５号、及び国際公開第２０１７０２３９７４号のように、サイレンシングされるべき遺伝子のプロモーターに転写調節因子を近づけることを除いて、遺伝子サイレンシングでは用いられてこなかった。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、標的遺伝子の発現を減少させる方法を提供し、該方法は、標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと、単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと、二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと、標的遺伝子の発現を減少させることとからなる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、標的遺伝子における二本鎖切断は、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する。これらの方法は、細胞が一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体（hexiploid）のゲノムを有する場合に用いられ得る。これらの方法は、標的遺伝子が優性、劣性、又は半優性の場合に用いられ得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ、２つ又はそれを超えるガイド配列を利用することができる。この方法は、植物細胞において有用であるが、任意の細胞に適用可能である。

【0007】

本開示は、ゲノム編集によって染色体を再配置する方法を提供し、該方法は、部位特異的ヌクレアーゼによって染色体に少なくとも１つの破損を生成することと、再配置を有する染色体を選択することとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを利用することができる。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、欠失、重複、逆位、又は転座を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、遺伝子発現の改変を引き起こす。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子発現の改変は、前駆体ｍＲＮＡレベル、又は成熟ｍＲＮＡレベル、又は翻訳レベルでの調節を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、染色体が種間雑種のような１つの核に分類され得る場合に、２つの種由来の染色体を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、少なくとも２つの対立遺伝子又は異なる対立遺伝子由来の２つの成分を融合することによって、新たな対立遺伝子生成をもたらす。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、プロモーター、エキソン、イントロン、又は転写ターミネーターを標的とする。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、再配置された遺伝子と配列類似性を有する異なる遺伝子の遺伝子発現の改変を引き起こす。本方法の更なる実施形態では、欠失、重複、逆位、又は転座は、１９塩基対以上である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】構築物２２６０２（左）を用いた形質転換事象のグラフ表示であり、ここで、エキソン５における２つの編集は、事象ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ１３０Ａにおける欠失又は事象ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ０４９Ａにおける逆位をもたらし、また構築物２２６０４（右）を用いた形質転換事象の表示であり、ここで、エキソン５における２つの編集は、事象ＲＩＥＴ１４２３００Ａ０１４Ａにおける欠失又は事象ＲＩＥＴ１４２５００Ｂ０２４Ａ０４９Ａにおける逆位をもたらした。

【図2】内因性遺伝子座からのＤＥＰ１の発現を測定するためのワークフローを示す。

【図3】事象ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ１３０ＡからのＴ１種子の遺伝子型判定からのＰＣＲ産物のゲル電気泳動。

【図4】ＤＥＰ１に欠失を有する植物の隣の野生型イネ植物。

【図5】ＲＮＡ単離のためにサンプリングされた２～３ｃｍのイネ植物。

【図6】ＦＩ植物１７ＳＢＣ５００１４０、１７ＳＢＣ５００１４３、１７ＳＢＣ５００１４６、及び１７ＳＢＣ５００１４９からのｒｔＰＣＲ産物のゲル電気泳動。

【図7】欠失又は挿入を有するＦ１植物におけるＤＥＰ１のエキソン５のグラフ表示（上）及びゲル電気泳動によって分離されたｒｔＰＣＲ産物（下）であり、ＤＥＰ１産物は、定量され、イネユビキチン遺伝子ＯＳ０３ｇ０２３４２００の発現比に対して正規化された。

【図8】２つの転座で同定されたＥ０植物、ＲＩＥＴ１４２５００Ａ０８４ＡからのＤＥＰ１のエキソン５のグラフ表示。

【図9】染色体転座及び重複について選択するために、２つ以上のゲノム編集標的がどのように使用され得るかを示す概略図。

【図10】逆位がどのように遺伝子サイレンシングに導くことができるかを示す概略図。

【図11】六倍体又は倍数体ゲノムの遺伝子オルソログをサイレンシングするために、染色体逆位によるサイレンシングがどのように使用され得るかを示す概略図。

【発明を実施するための形態】

【0009】

配列表における配列の簡単な説明
配列番号１は、ＤＥＮＳＥ ＡＮＤ ＥＲＥＣＴ ＰＡＮＩＣＬＥ １のコード配列である

【0010】

配列番号２は、ベクター２２６０３由来のｇＲＮＡ－Ｂ及びｇＲＮＡ－Ｄ発現カセットである

【0011】

配列番号３は、ＤＥＰ１のエキソン５を標的とするガイドＲＮＡ－Ｂである

【0012】

配列番号４は、同様にエキソン５を標的とするｇＲＮＡ－Ｄである

【0013】

配列番号５は、２２６０４ ｇＲＮＡ－Ａ、ｇＲＮＡ－Ｄ、ｇＲＮＡ－Ｂ、及びｇＲＮＡ－Ｃである

【0014】

配列番号６は、ガイドＲＮＡ－Ａである

【0015】

配列番号７は、ガイドＲＮＡ－Ｃである

【0016】

配列番号８は、ＣＡＳ９発現カセットである

【0017】

配列番号９は、ＣＡＳ９ Ｔａｑｍａｎアッセイフォワードプライマーである

【0018】

配列番号１０は、ＣＡＳ９ Ｔａｑｍａｎアッセイリバースプライマーである

【0019】

配列番号１１は、ＣＡＳ９ Ｔａｑｍａｎアッセイプローブである

【0020】

配列番号１２は、ｇＲＮＡ－Ａ Ｔａｑｍａｎアッセイフォワードプライマーである

【0021】

配列番号１３は、ｇＲＮＡ－Ａ Ｔａｑｍａｎアッセイリバースプライマーである

【0022】

配列番号１４は、ｇＲＮＡ－Ａ Ｔａｑｍａｎアッセイプローブである

【0023】

配列番号１５は、ｇＲＮＡ－Ｃ Ｔａｑｍａｎアッセイフォワードプライマーである

【0024】

配列番号１６は、ｇＲＮＡ－Ｃ Ｔａｑｍａｎアッセイリバースプライマーである

【0025】

配列番号１７は、ｇＲＮＡ－Ｃ Ｔａｑｍａｎアッセイプローブである

【0026】

配列番号１８は、ｇＲＮＡ－Ｄ Ｔａｑｍａｎアッセイフォワードプライマーである

【0027】

配列番号１９は、ｇＲＮＡ－Ｄ Ｔａｑｍａｎアッセイリバースプライマーである

【0028】

配列番号２０は、ｇＲＮＡ－Ｄ Ｔａｑｍａｎアッセイプローブである

【0029】

配列番号２１は、ＤＥＰ１ ＰＣＲプライマー１である

【0030】

配列番号２２は、ＤＥＰ１ ＰＣＲプライマー２である

【0031】

配列番号２３は、ＲＮＡ－ＡとＲＮＡ－Ｂとの間の逆位である

【0032】

配列番号２４は、ｇＲＮＡ－ＢとｇＲＮＡ－Ｄとの間の欠失である

【0033】

配列番号２５は、ｇＲＮＡ－ＡとｇＲＮＡ－Ｂとの間の逆位である

【0034】

配列番号２６は、発現対照として選択されたＲＩＥＴ１４２３００Ａ０１４Ａである

【0035】

配列番号２７は、１４ＳＢＣ５００７７３のセンス遺伝子型判定プライマーである

【0036】

配列番号２８は、１４ＳＢＣ５００７７３のアンチセンス遺伝子型判定プライマーである

【0037】

配列番号２９は、エキソン１に位置するＤＥＰ１ ｑＲＴ－ＰＣＲセンスプライマーである

【0038】

配列番号３０は、３’ＵＴＲに位置するＤＥＰ１ ｑＲＴ－ＰＣＲアンチセンスプライマーである

【0039】

配列番号３１は、イネユビキチン（Ｏｓ０３ｇ０２３４２００）ｑＲＴ－ＰＣＲプライマー１である

【0040】

配列番号３２は、イネユビキチン（Ｏｓ０３ｇ０２３４２００）ｑＲＴ－ＰＣＲプライマー２である

【0041】

配列番号３３は、野生型ＤＥＰ１ ｑＲＴ－ＰＣＲプライマー１である

【0042】

配列番号３４は、野生型ＤＥＰ１ ｑＲＴ－ＰＣＲプライマー２である

【0043】

配列番号３５は、ｇＲＮＡ－ＡとｇＲＮＡ－Ｂ、ｇＲＮＡ－ＣとｇＲＮＡ－Ｄとの間の転座である

【0044】

この説明は、本発明を実施することができる全ての異なる方法、又は本発明に追加することができる全ての特徴の詳細なカタログであることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関連して示される特徴は、他の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関連して示される特徴は、その実施形態から削除されてもよい。加えて、本明細書で示唆される様々な実施形態に対する多数のバリエーション及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱するものではない。従って、以下の説明は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図しており、その全ての置換、組合せ、及びバリエーションを網羅的に特定することを意図していない。

【0045】

別途定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書に言及されている全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【0046】

以下の定義及び方法は、本発明をより良く定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に断らない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術における当業者による従来の使用に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５^th ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４にも見出すことができる。

【0047】

本発明の実施形態及び添付の特許請求の範囲の記載で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段の明確な指示をしない限り、複数形も含むことが意図される。

【0048】

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意の及び全ての可能な組合せを指し、包含する。

【0049】

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物の量、用量、時間、温度等の測定可能な値を指す場合、特定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又は更には０．１％の変動を包含することを意味する。

【0050】

「含む」及び／又は「含んでいる」という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、工程、操作、エレメント、及び／又は成分の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、エレメント、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しない。

【0051】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が請求項に記載された特定の材料又は工程、並びに請求項に記載された発明の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されることを意味する。従って、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項で使用される場合、「を含む」と同等であると解釈されることを意図しない。

【0052】

本明細書で使用される場合、「増幅された」という用語は、核酸分子の少なくとも１つを鋳型として使用する、核酸分子の複数のコピー又は核酸分子に相補的な複数のコピーの構築を意味する。例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）を参照されたい。増幅の産物は、アンプリコンと呼ばれる。

【0053】

「コード配列」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ等のＲＮＡに転写される核酸配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、次いで、生物において翻訳されて、タンパク質を産生する。

【0054】

本明細書で使用される場合、用語トランスジェニック「事象」は、異種ＤＮＡ、例えば、１つ以上の目的の遺伝子（例えば、導入遺伝子）を含む発現カセットを有する単一の植物細胞の形質転換及び再生によって産生される組換え植物を指す。「事象」という用語は、異種ＤＮＡを含む形質転換体の元の形質転換体及び／又は子孫を指す。「事象」という用語はまた、形質転換体と別の系統との間の性的異系交配によって産生される子孫を指す。反復親に対して戻し交配を繰り返した後でも、挿入されたＤＮＡと形質転換された親からの隣接するＤＮＡは、同じ染色体上の位置で交配の子孫に存在する。通常、植物組織の形質転換は複数の事象を生じ、事象の各々は、植物細胞のゲノムの異なる位置へのＤＮＡ構築物の挿入を表している。導入遺伝子の発現又は他の望ましい特徴に基づいて、特定の事象が選択される。従って、本明細書で使用される「事象ＭＩＲ６０４」、「ＭＩＲ６０４」又は「ＭＩＲ６０４事象」は、ＭＩＲ６０４形質転換体の元のＭＩＲ６０４形質転換体及び／又は子孫を意味する（米国特許第７，３６１，８１３号明細書、第７，８９７，７４８号明細書、第８，３５４，５１９号明細書、及び第８，８８４，１０２号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0055】

本明細書で使用される「発現カセット」は、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸分子を意味し、目的のヌクレオチド配列（典型的には、コード領域）に作動可能に連結されたプロモーターを含み、これは終結シグナルに作動可能に連結されている。発現カセットはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、又は翻訳されないＲＮＡも、センス又はアンチセンス方向にコードしてもよい。発現カセットはまた、目的のヌクレオチド配列の直接発現に必要ではないが、発現ベクターからカセットを除去するための便利な制限部位のために存在する配列を含んでもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかしながら、典型的には、発現カセットは、宿主に対して異種であり、即ち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞内に天然には存在せず、当技術方法で既知の形質転換プロセスによって宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されていなければならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下にあってもよいし、又は宿主細胞が何らかの特定の外部刺激にさらされたときにのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。植物等の多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、又は器官、又は発生段階に特異的であり得る。発現カセット又はその断片はまた、植物に形質転換される場合、「挿入された配列」又は「挿入配列」と称され得る。

【0056】

「遺伝子」は、ゲノム内に位置し、前述のコード核酸配列に加えて、コード部分の発現、即ち転写及び翻訳の制御に関与する他の主に調節性の核酸配列を含む、規定された領域である。遺伝子は、コード領域及び非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列、並びに５’及び３’非翻訳領域）の両方を含み得る。遺伝子は、典型的には、ｍＲＮＡ、機能性ＲＮＡ、又は調節配列を含む特定のタンパク質を発現する。遺伝子は、機能的タンパク質を産生するために使用され得るか、又はされ得ない。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード領域のみを指す。「天然遺伝子」という用語は、天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」という用語は、１）天然では、共存して見出されない調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列、又は２）天然には隣接していないタンパク質の一部をコードする配列、又は３）天然には隣接していないプロモーターの一部を含む任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含むか、又は同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。遺伝子は、「単離」されてもよく、これは天然の状態で核酸分子と関連して通常見出される成分を実質的に又は本質的に含まない核酸分子を意味する。このような成分としては、他の細胞材料、組換え産生由来の培養培地、及び／又は核酸分子を化学的に合成する際に使用される種々の化学物質が挙げられる。

【0057】

ポリヌクレオチドコード配列の「発現する」又は「発現」という用語は、配列が転写され、場合により翻訳されることを意味する。

【0058】

「目的の遺伝子」、「目的のヌクレオチド配列」、又は「目的の配列」は、植物に移入された場合に、抗生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、疾病耐性、又は他の害虫に対する耐性、除草剤耐性、栄養価の改善、工業プロセスにおける性能の改善、又は生殖能力の変化等の所望の特徴を植物に付与する任意の遺伝子を指す。「目的の遺伝子」はまた、植物において商業的に価値のある酵素又は代謝産物を産生するために植物に移入されるものであってもよい。

【0059】

本明細書で使用される場合、「異種」は、それが導入される宿主細胞と天然に関連しない核酸分子又はヌクレオチド配列を指し、これは、別の種に由来するか、又は同じ種若しくは生物に由来するが、その元の形態又は細胞内で主に発現される形態から改変されている（天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーを含む）。従って、ヌクレオチド配列が導入される細胞のものとは異なる生物又は種に由来するヌクレオチド配列は、その細胞及び細胞の子孫に関して異種である。加えて、異種ヌクレオチド配列は、同じ天然の元の細胞型に由来し、挿入されるが、非天然の状態で存在する（例えば、異なるコピー数で存在する）、及び／又は核酸分子の天然の状態で見出されるものとは異なる調節配列の制御下に存在する、ヌクレオチド配列を含む。核酸配列はまた、例えば、発現ベクターのような核酸構築物において、それが関連し得る他の核酸配列に対して異種であり得る。非限定的な一例として、プロモーターは、その特定のプロモーターと関連して天然には存在しない、即ち、プロモーターに対して異種の１つ以上の調節エレメント及び／又はコード配列と組み合わせて、核酸構築物中に存在し得る。

【0060】

「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸配列である。相同核酸配列はまた、例えば核酸構築物中に存在し得る他の核酸配列と天然に関連する核酸配列であり得る。非限定的な一例として、プロモーターは、その特定のプロモーターと関連して天然に存在する、即ち、プロモーターと相同の１つ以上の調節エレメント及び／又はコード配列と組み合わせて、核酸構築物中に存在し得る。

【0061】

「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすような、単一の核酸配列上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、コード配列又は機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、そのコード配列又は機能性ＲＮＡと作動可能に連結されている。センス又はアンチセンス配向におけるコード配列は、調節配列に作動可能に連結され得る。従って、ヌクレオチド配列と作動可能に関連する調節配列又は制御配列（例えば、プロモーター）は、ヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。例えば、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、そのＧＦＰヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。

【0062】

制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、目的のヌクレオチド配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーターとコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。

【0063】

本明細書で使用される「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される単離された核酸である。プライマー対又はセットは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の核酸増幅方法による核酸分子の増幅のために使用され得る。

【0064】

「プローブ」は、標的核酸分子の一部に相補的であり、典型的には、標的核酸分子を検出及び／又は定量するために使用される、単離された核酸分子である。従って、いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な部分又はレポーター分子（例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、蛍光剤又は酵素）が結合している単離された核酸分子であり得る。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸だけでなく、標的核酸配列に特異的に結合し、その標的核酸配列の存在を検出し及び／又はその量を定量するために使用することができるポリアミド及び他のプローブ材料も含むことができる。

【0065】

ＴａｑＭａｎプローブは、特定のプライマーセットによって増幅されたＤＮＡ領域内でアニールするように設計される。Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長し、新生鎖を一本鎖鋳型から相補鎖の３’から５’を合成すると、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼは、プローブを介して新生鎖を伸長し、その結果、鋳型にアニールしたプローブを分解する。プローブの分解は、それからフルオロフォアを放出し、クエンチャーへの近接を破壊し、従って、クエンチング効果を軽減し、フルオロフォアの蛍光を可能にする。従って、定量的ＰＣＲサーマルサイクラーで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォア及びＰＣＲに存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。

【0066】

プライマー及びプローブは、一般に、５～１００ヌクレオチド又はそれを超える長さである。いくつかの実施形態では、プライマー及びプローブは、少なくとも２０ヌクレオチド以上の長さ、又は少なくとも２５ヌクレオチド以上、又は少なくとも３０ヌクレオチド以上の長さであり得る。このようなプライマー及びプローブは、当技術分野で既知の最適なハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。本発明によるプライマー及びプローブは、標的配列と完全な配列相補性を有し得るが、標的配列とは異なり、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブは、本発明による従来の方法によって設計され得る。

【0067】

プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されている。ＰＣＲ－プライマー対は、例えば、その目的のために意図されるコンピュータープログラムを使用することによって、既知の配列から誘導され得る。

【0068】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡの特定の断片を「増幅」するための技術である。ＰＣＲを行うためには、複製されるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が既知でなければならない。一般に、増幅されるＤＮＡ（既知の配列）の各鎖の３’末端のヌクレオチド配列に相補的（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）なプライマー又は短いオリゴヌクレオチドが使用される。ＤＮＡサンプルを加熱してその鎖を分離し、プライマーと混合する。プライマーは、ＤＮＡサンプル中のそれらの相補的配列にハイブリダイズする。元のＤＮＡ鎖を鋳型として使用して合成が開始する（５’から３’方向）。反応混合物は、４つ全てのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを含有しなければならない。重合は、新たに合成された各鎖が他のプライマーによって認識される配列を含むのに十分に進行するまで続く。これが起こると、元の分子と同一である２つのＤＮＡ分子が生成される。これらの２つの分子は、それらの鎖を分離するために加熱され、このプロセスが繰り返される。各サイクルでＤＮＡ分子の数が２倍になる。自動化された装置を用いて、複製の各サイクルを５分未満で完了することができる。３０サイクル後、ＤＮＡの単一分子として開始したものは、１０億を超えるコピーに増幅されている（２³⁰＝１．０２×１０⁹）。

【0069】

オリゴヌクレオチドプライマー対のオリゴヌクレオチドは、反対のＤＮＡ鎖上に位置し、増幅されるべき領域に隣接するＤＮＡ配列に相補的である。アニーリングされたプライマーは、新たに合成されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズする。最初の増幅サイクルは、その５’末端がオリゴヌクレオチドプライマーの位置によって固定されるが、その３’末端が可変である（不規則な（ｒａｇｇｅｄ）３’末端）２つの新しいＤＮＡ鎖を生じる。２つの新しい鎖は、次に、所望の長さの相補鎖の合成のための鋳型として働くことができる（５’末端はプライマーによって規定され、合成は、対向するプライマーの末端を越えて進行することができないため、３’末端は固定される）。数サイクル後、所望の固定長の産物が優勢になり始める。

【0070】

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応とも称される定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ産物の蓄積をリアルタイムでモニターする。ｑＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分子生物学の実験室技術であり、標的ＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために使用される。特異的配列の１コピーでさえ、ＰＣＲにおいて増幅及び検出することができる。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型のコピーを指数関数的に生成する。これは、出発標的配列の量と任意の特定のサイクルで蓄積されたＰＣＲ産物の量との間の定量的関係を生じる。鋳型、試薬制限又はピロリン酸分子の蓄積で見出されるポリメラーゼ反応の阻害剤のために、ＰＣＲ反応は、最終的に、指数関数的速度（即ち、プラトー相）で鋳型を生成するのを停止し、ＰＣＲ産物の終点定量を信頼できないものにする。従って、重複反応は、可変量のＰＣＲ産物を生成し得る。ＰＣＲ反応の指数関数相の間のみ、鋳型配列の開始量を決定するために外挿し戻すことが可能である。ＰＣＲ産物が蓄積するときのＰＣＲ産物の測定（即ち、リアルタイム定量ＰＣＲ）は、反応の指数関数相における定量を可能にし、従って、従来のＰＣＲに関連する変動性を除去する。リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、陽性反応は、蛍光シグナルの蓄積によって検出される。ＤＮＡサンプル中の１つ以上の特異的配列について、定量的ＰＣＲは、検出及び定量の両方を可能にする。この量は、コピーの絶対数、又はＤＮＡインプットに対して正規化された場合の相対量、又は更なる正規化遺伝子のいずれかであり得る。リアルタイムＰＣＲの最初の記録以来、それは、ｍＲＮＡ発現研究、ゲノム又はウイルスＤＮＡにおけるＤＮＡコピー数測定、対立遺伝子識別アッセイ、遺伝子の特異的スプライスバリアントの発現分析、並びにパラフィン包埋組織及びレーザー捕獲顕微解剖細胞における遺伝子発現を含む、増大する及び多様な数の応用に使用されてきた。

【0071】

本明細書で使用される場合、「Ｃｔ値」という表現は、「閾値サイクル」を指し、これは、「増幅された標的の量が固定閾値に達する分数サイクル数」と定義される。いくつかの実施形態では、これは、増幅曲線と閾値線との交点を表す。増幅曲線は、典型的には、所与のサイクル（Ｘ軸）での各反応の相対蛍光（Ｙ軸）の変化を示す「Ｓ」字形であり、これは、いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ機器によってＰＣＲ中に記録される。閾値線は、いくつかの実施形態では、反応がバックグラウンドを超える蛍光強度に達する検出のレベルである。Ｌｉｖａｋ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）２５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０２－４０８を参照されたい。これは、ＰＣＲにおける標的の濃度の相対的尺度である。一般に、ｑＰＣＲのような定量アッセイのための良好なＣｔ値は、いくつかの実施形態では、所与の参照遺伝子について１０～４０の範囲である。Ｃｔレベルは、サンプル中の標的核酸の量に反比例する（即ち、Ｃｔレベルが低いほど、サンプル中の検出可能な標的核酸の量が多い）。加えて、ｑＰＣＲのような定量アッセイについての良好なＣｔ値は、標的ｇＤＮＡの比例希釈で線形応答範囲を示す。

【0072】

いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲは、Ｃｔ値が定量分析のためにリアルタイムで収集され得る条件下で行われる。例えば、典型的なｑＰＣＲ実験において、ＤＮＡ増幅は、伸長段階の間のＰＣＲの各サイクルでモニターされる。ＤＮＡが増幅の対数線形相にある場合、蛍光の量は、一般にバックグラウンドを超えて増加する。いくつかの実施形態では、Ｃｔ値は、この時点で収集される。

【0073】

本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、任意の生細胞を指す。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、単離することができる。細胞は、生物に再生することができてもできなくてもよい。細胞は、組織、カルス、培養物、器官、又は部分の状態であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、植物細胞であってもよい。本発明の植物細胞は、単離された単一細胞の形態であり得るか、又は培養された細胞であり得るか、又は例えば植物組織若しくは植物器官のようなより高度に組織化された単位の一部であり得る。植物細胞は、被子植物若しくは裸子植物に由来し得るか、又はその一部であり得る。更なる実施形態では、植物細胞は、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞であってもよい。単子葉植物細胞は、例えば、トウモロコシ、イネ、モロコシ、サトウキビ、大麦、小麦、カラス麦、芝草、又は観賞用草細胞であり得る。双子葉植物細胞は、例えば、タバコ、コショウ、ナス、ヒマワリ、アブラナ科、アマ、ジャガイモ、綿、大豆、テンサイ、又はアブラナ細胞であってもよい。

【0074】

「植物部分」という用語は、限定されるものではないが、本明細書で使用される場合、胚、花粉、胚珠、種子、葉、茎、苗条、花、枝、果実、穀粒、穂（ｅａｒ）、穂軸（ｃｏｂ）、殻、柄、根、根端、葯、植物細胞を含み、植物細胞は、植物及び／又は植物の一部、植物プロトプラスト、植物組織、植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊等において無傷である植物細胞を含む。本明細書で使用される場合、「苗条」は、葉及び茎を含む地上部分を指す。更に、本明細書で使用される場合、「植物細胞」は、細胞壁を含み、プロトプラストとも称され得る、植物の構造的及び生理的単位を指す。

【0075】

細胞、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、植物及び／又は植物部分の状況における「導入している」又は「導入する」という用語は、核酸分子が細胞、真核細胞、植物細胞、並びに／又は植物及び／若しくは植物部分の細胞の内部に接近するように、核酸分子を細胞、真核細胞、植物、植物部分及び／又は植物細胞と接触させることを意味する。２つ以上の核酸分子が導入される場合、これらの核酸分子は、単一のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物の一部として、又は別個のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物として組み立てられ得、同じ又は異なる核酸構築物上に位置し得る。従って、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象において、別々の形質転換事象において、又は例えば繁殖プロトコルの一部として、植物細胞に導入され得る。

【0076】

「逆位」は、染色体のセグメントが端から端まで反転する染色体再配置である。逆位は、単一の染色体が破損を経て自己内で再配置されると起こる。染色体の「転座」は、非相同染色体間での部分の再配置である。

【0077】

本明細書で使用される場合、「形質転換された」及び「遺伝子導入」という用語は、少なくとも１つの組換え（例えば、異種）ポリヌクレオチドの全部又は一部を含有する任意の細胞、原核細胞、真核細胞、植物、植物細胞、カルス、植物組織、又は植物部分を指す。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドの全部又は一部は、染色体又は安定な染色体外エレメントに安定的に統合され、その結果、連続した世代に渡される。本発明の目的のために、「組換えポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子工学によって変更され、再配置され、又は改変されたポリヌクレオチドを指す。例としては、異種配列に結合又は連結された任意のクローン化ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドが挙げられる。「組換え」という用語は、自然発生的変異のような天然に存在する事象から、又は非自然発生的変異誘発に続く選択的繁殖から生じるポリヌクレオチドの変化を指すものではない。

【0078】

本明細書で使用される「形質転換」という用語は、異種核酸の細胞への導入を指す。細胞の形質転換は、安定的であっても一過性であってもよい。従って、本発明の遺伝子導入細胞、植物細胞、植物及び／又は植物部分は、安定的に形質転換され得るか、又は一過性に形質転換され得る。形質転換は、宿主細胞のゲノムへの核酸分子の転移を指し得、遺伝的に安定な継承をもたらす。いくつかの実施形態では、植物、植物部分及び／又は植物細胞への導入は、細菌媒介形質転換、粒子衝撃形質転換、リン酸カルシウム媒介形質転換、シクロデキストリン媒介形質転換、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、ナノ粒子媒介形質転換、ポリマー媒介形質転換、ウイルス媒介核酸送達、ウィスカー媒介核酸送達、マイクロインジェクション、超音波処理、浸潤、ポリエチレングリコール媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、又は植物、植物部分及び／若しくはその細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的及び／若しくは生物学的メカニズム、又はそれらの任意の組合せを介する。

【0079】

植物を形質転換するための手順は、当技術分野で周知且つ日常的であり、文献を通して記載される。植物の形質転換のための方法の非限定的な例としては、細菌媒介核酸送達（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からの細菌を介する）、ウイルス媒介核酸送達、炭化ケイ素又は核酸ウィスカー媒介核酸送達、リポソーム媒介核酸送達、マイクロインジェクション、マイクロ粒子衝撃、リン酸カルシウム媒介形質転換、シクロデキストリン媒介形質転換、エレクトロポレーション、ナノ粒子媒介形質転換、超音波処理、浸潤、ＰＥＧ媒介核酸取り込み、並びに植物細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）及び／又は生物学的メカニズム（これらの任意の組み合わせを含む）を介する形質転換が挙げられる。当技術分野で既知の種々の植物形質転換法への一般的なガイドとしては、Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３），ｐａｇｅｓ ６７－８８）及びＲａｋｏｗｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７：８４９－８５８（２００２））が挙げられる。

【0080】

アグロバクテリウム媒介形質転換は、形質転換の高い効率のため、及び多くの異なる種とのその広範な有用性のために、植物を形質転換するために一般に使用される方法である。アグロバクテリウム媒介形質転換は、典型的には、目的の外来ＤＮＡを担持するバイナリーベクターを、共存するＴｉプラスミド上又は染色体上のいずれかで宿主アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株によって担持されるｖｉｒ遺伝子の補体に依存し得る適切なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に導入することを含む（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：１５９－１６９）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）への導入は、組換えバイナリーベクターを担持する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に動員することができるプラスミドを担持するヘルパー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いる三親交配手順によって達成することができる。或いは、組換えバイナリーベクターは、核酸形質転換によってアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に導入され得る（Ｈｏｅｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ １９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：９８７７）。

【0081】

組換えアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物の形質転換は、通常、植物からの外植片とのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の共培養を含み、当技術分野で周知の方法に従う。形質転換された組織は、典型的には、バイナリープラスミドＴ－ＤＮＡ境界の間に抗生物質又は除草剤耐性マーカーを保有する選択培地上で再生される。

【0082】

植物、植物部分及び植物細胞を形質転換するための別の方法は、植物組織及び細胞において不活性又は生物学的に活性な粒子を推進することを含む。例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、同第５，０３６，００６号明細書及び同第５，１００，７９２号明細書を参照されたい。一般に、この方法は、細胞の外表面に浸透し、その内部に組み込むのに有効な条件下で、植物細胞において不活性又は生物学的に活性な粒子を推進することを含む。不活性粒子が利用される場合、ベクターは、目的の核酸を含むベクターで粒子をコーティングすることによって、細胞に導入され得る。或いは、１つ以上の細胞をベクターによって取り囲むことができ、その結果、ベクターは、粒子の伴流によって細胞内に運ばれる。生物学的に活性な粒子（例えば、各々が導入されることが求められる１つ以上の核酸を含む、乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）もまた、植物組織中に推進され得る。

【0083】

ポリヌクレオチドの状況における「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、細胞のゲノムに統合されないことを意味する。

【0084】

本明細書で使用される場合、細胞に導入されるポリヌクレオチドの状況において、「安定的に導入する」、「安定的に導入される」、「安定な形質転換」、又は「安定的に形質転換される」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定的に統合され、従って、細胞がポリヌクレオチドで安定的に形質転換されていることを意味する。従って、統合されたポリヌクレオチドは、その子孫によって、より詳細には、複数の連続した世代の子孫によって遺伝され得る。本明細書で使用される「ゲノム」は、核及び／又は色素体ゲノムを含み、従って、例えば、葉緑体ゲノムへのポリヌクレオチドの統合を含む。本明細書で使用される安定な形質転換はまた、染色体外に維持されるポリヌクレオチド（例えば、ミニ染色体）を指す。

【0085】

一過性の形質転換は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はウェスタンブロットによって検出され得、これは、生物に導入された１つ以上の核酸分子によってコードされるペプチド又はポリペプチドの存在を検出し得る。細胞の安定な形質転換は、例えば、生物（例えば、植物）に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出され得る。細胞の安定な形質転換は、例えば、植物又は他の生物に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定な形質転換はまた、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当技術分野で周知の他の増幅反応によって検出することができ、核酸分子の標的配列とハイブリダイズする特異的プライマー配列を使用し、標的配列の増幅をもたらし、これは、標準的な方法に従って検出され得る。形質転換はまた、当技術分野で周知の直接配列決定及び／又はハイブリダイゼーションプロトコルによって検出することができる。

【0086】

従って、本発明の特定の実施形態において、植物細胞は、当技術分野で既知の任意の方法によって、また本明細書に記載されるように、形質転換され得、無傷の植物は、種々の既知の技術のいずれかを使用して、これらの形質転換細胞から再生され得る。植物細胞、植物組織培養物及び／又は培養プロトプラストからの植物再生は、例えば、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｖｏｌ．１，ＭａｃＭｉｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３））；及びＶａｓｉｌ Ｉ．Ｒ．（ｅｄ．）（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｖｏｌ．Ｉ（１９８４），ａｎｄ Ｖｏｌ．ＩＩ（１９８６））に記載されている。形質転換された遺伝子導入植物、植物細胞、及び／又は植物組織培養物を選択する方法は、当技術分野で慣用的であり、本明細書に提供される本発明の方法において使用され得る。

【0087】

「形質転換及び再生プロセス」は、植物細胞に導入遺伝子を安定的に導入し、遺伝子導入植物細胞から植物を再生するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、形質転換及び再生は、形質転換された細胞が選択剤の存在下で生存し、発達的に繁殖するように、導入遺伝子が選択マーカーを含み、形質転換された細胞が導入遺伝子を組み込んで発現する選択プロセスを含む。「再生」は、植物細胞、植物細胞の群、又は植物片、例えばプロトプラスト、カルス、又は組織部分から植物全体を成長させることを指す。

【0088】

「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指すために互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにＲＮＡ及びＤＮＡのキメラを含むＲＮＡ及びＤＮＡの両方を包含する。核酸分子という用語は、鎖の長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。ヌクレオチドは、糖、リン酸、及びプリン又はピリミジンのいずれかである塩基を含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。核酸分子は、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、変化した塩基対合能力又はヌクレアーゼに対する増大した耐性を有する核酸分子を調製するために使用され得る。本明細書に提供される核酸配列は、左から右への５’から３’方向に提示され、米国配列規則、３７ ＣＦＲ§§１．８２１－１．８２５及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）規格ＳＴ．２５に記載されているヌクレオチド文字を表すための標準コードを使用して表される。

【0089】

「核酸断片」は、所与の核酸分子の断片である。「ＲＮＡ断片」は、所与のＲＮＡ分子の断片である。「ＤＮＡ断片」は、所与のＤＮＡ分子の断片である。「核酸断片」は、所与の核酸分子の断片であり、分子から単離されていない。「ＲＮＡ断片」は、所与のＲＮＡ分子の断片であり、分子から単離されていない。「ＤＮＡ断片」は、所与のＤＮＡ分子の断片であり、分子から単離されていない。ポリヌクレオチドのセグメントは、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又は５００以上のヌクレオチド長であり得る。ガイド配列のセグメント又は部分は、ガイド配列の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、例えば、ガイド配列の３分の１以下、例えば、７、６、５、４、３、又は２ヌクレオチド長であり得る。

【0090】

分子の状況における「に由来する」という用語は、親分子又はその親分子からの情報を使用して単離又は作製された分子を指す。例えば、Ｃａｓ９単一変異体ニッカーゼ及びＣａｓ９二重変異体ヌル－ヌクレアーゼは、各々、野生型Ｃａｓ９タンパク質に由来する。

【0091】

高等植物において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内に含まれる情報のタンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は、生物の各細胞に含まれる遺伝物質の全体である。他に示されない限り、本発明の特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列並びに明示的に示される配列を暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。核酸分子という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。

【0092】

本明細書で使用される「配列同一性」は、成分（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）のアライメントのウィンドウ全体にわたって、２つの最適に整列されたポリヌクレオチド又はペプチド配列が不変である程度を指す。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含むがこれらに限定されない、既知の方法によって容易に計算することができる。

【0093】

本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列される場合の試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「問い合わせ」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の線状ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドの百分率を指す。いくつかの実施形態では、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列中の同一アミノ酸の百分率を指すことができる。

【0094】

本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という表現は、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列の状況において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は目視検査によって測定して、最大対応について比較及び整列された場合に、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基～約１５０残基である配列の領域にわたって存在する。従って、本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又はそれを超える残基である配列の領域にわたって存在する。いくつかの特定の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。更なる実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。更に、代表的な実施形態では、実質的に同一のヌクレオチド又はタンパク質配列は、実質的に同じ機能を行う（例えば、特定のゲノム標的への誘導、特定のゲノム標的部位のエンドヌクレアーゼ切断）。

【0095】

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0096】

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性方法の検索等のツールによって、及び場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の一部として入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、実施することができる。試験配列及び参照配列の整列されたセグメントについての「同一性分数」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント（即ち、参照配列全体又は参照配列のより小さい規定された部分）中の成分の総数で割ったものである。配列同一性パーセントは、同一性分数に１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的のために、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。

【0097】

ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、又は満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、１９９０）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（１対のマッチング残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下し、累積スコアが１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの累積のためにゼロ以下になるか、又はいずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

【0098】

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列は、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小合計確率が約０．１未満～約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。従って、本発明のいくつかの実施形態では、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小合計確率は、約０．００１未満である。

【0099】

２つのヌクレオチド配列はまた、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合、実質的に同一であると考えられ得る。いくつかの代表的な実施形態では、実質的に同一であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。

【0100】

核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザン及びノーザンハイブリダイゼーションの状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なっている。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列についての熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃低くなるように選択される。

【0101】

Ｔ_mとは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴ_mに等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいてフィルター上に１００を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃での５０％ホルムアミドと１ｍｇのヘパリンであり、ハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間、０．１ ５Ｍ ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２ｘ ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記載については、下記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄の前に、低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１ｘ ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４～６ｘ ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的には、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）を含み、温度は、典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるものよりも２倍（又はそれよりも高い）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、ヌクレオチド配列のコピーが遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を用いて作製される場合に起こり得る。

【0102】

以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用され得るハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。別の実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄し、又は５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。なお更なる実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄し、又は５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、６５℃で０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する。

【0103】

「単離された」核酸分子若しくはヌクレオチド配列又は「単離された」ポリペプチドは、ヒトの手によって、その天然の環境とは別に存在し、及び／又はその天然の環境におけるその機能と比較して異なる、改変された、調節された、及び／又は変更された機能を有し、従って天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列又はポリペプチドである。単離された核酸分子又は単離されたポリペプチドは、精製された形態で存在し得るか、又は非天然環境（例えば、組換え宿主細胞）において存在し得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されるという用語は、それが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離されることを意味する。ポリヌクレオチドはまた、それが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離され、次いで遺伝的状況、染色体、染色体位置、及び／又はそれが天然に存在しない細胞に挿入される場合、単離される。本発明の組換え核酸分子及びヌクレオチド配列は、上記で定義したように「単離された」と考えることができる。

【0104】

従って、「単離された核酸分子」又は「単離されたヌクレオチド配列」は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、それが直接隣接している（５’末端に１つ、３’末端に１つ）ヌクレオチド配列に対して直接隣接していない核酸分子又はヌクレオチド配列である。従って、一実施形態では、単離された核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列のいくつか又は全てを含む。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか、又は他の配列とは無関係に別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換え核酸を含む。それはまた、更なるポリペプチド又はペプチド配列をコードするハイブリッド核酸分子の一部である組換え核酸を含む。「単離された核酸分子」又は「単離されたヌクレオチド配列」はまた、同じ天然の元の細胞型に由来し、挿入されるが、非天然の状態で存在する、例えば異なるコピー数で存在する、及び／又は核酸分子の天然の状態で見出されるものとは異なる調節配列の制御下で存在する、ヌクレオチド配列を含み得る。

【0105】

「単離された」という用語は、更に、細胞物質、ウイルス物質、及び／又は培養培地を実質的に含まない核酸分子、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、ペプチド、又は断片（例えば、組換えＤＮＡ技術によって生成された場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（例えば、化学的に合成された場合）を指すことができる。更に、「単離された断片」は、断片として天然には存在せず、そのようなものとして天然の状態では見出されない核酸分子、ヌクレオチド配列、又はポリペプチドの断片である。「単離された」は、調製物が技術的に純粋（均質）であることを必ずしも意味しないが、意図された目的のために使用することができる形態でポリペプチド又は核酸を提供するのに十分に純粋である。

【0106】

本発明の代表的な実施形態では、「単離された」核酸分子、ヌクレオチド配列、及び／又はポリペプチドは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％（ｗ／ｗ）又はそれを超える純度である。他の実施形態では、「単離された」核酸、ヌクレオチド配列、及び／又はポリペプチドは、出発物質と比較して、核酸（ｗ／ｗ）の少なくとも約５倍、１０倍、２５倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍又はそれを超える濃縮が達成されていることを示す。

【0107】

「野生型」ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、天然に存在する（「天然」）又は内因性のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を指す。従って、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物内に天然に存在する、又は生物に内因性のｍＲＮＡである。「相同」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連するヌクレオチド配列である。

【0108】

「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」という用語は、コード配列の翻訳開始コドンと終結コドンとの間にコードされるアミノ酸配列を指す。「開始コドン」及び「終結コドン」という用語は、各々、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び連鎖終結を指定するコード配列中の３つの隣接するヌクレオチド（「コドン」）の単位を指す。

【0109】

「プロモーター」は、通常そのコード配列の上流（５’）にあるヌクレオチド配列を指し、これはＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子に対する認識を提供することによってコード配列の発現を制御する。「プロモーター調節配列」は、近位及びより遠位の上流エレメントから成る。プロモーター調節配列は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、エンハンサー、プロモーター、非翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列が含まれる。これらには、天然及び合成配列、並びに天然及び合成配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得的エレメント、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を高めるために挿入された異種エレメントであり得る。エンハンサーは、両方の配向（通常又は反転）で作動することができ、プロモーターから上流又は下流のいずれかに移動させても機能することができる。「プロモーター」という用語の意味は、「プロモーター調節配列」を含む。

【0110】

「一次形質転換体」及び「Ｔ０世代」は、最初に形質転換された（即ち、形質転換から減数分裂及び受精を経ていない）組織と同じ遺伝的世代である遺伝子導入植物を指す。「二次形質転換体」及び「Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３等の世代」は、１つ以上の減数分裂及び受精サイクルを経て一次形質転換体に由来する遺伝子導入植物を指す。これらは、一次若しくは二次形質転換体の自家受精、又は一次若しくは二次形質転換体と他の形質転換された若しくは形質転換されていない植物との交配によって誘導され得る。

【0111】

「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノムに導入され、安定的に維持されている核酸分子を指す。導入遺伝子は、少なくとも１つの発現カセットを含んでもよく、典型的には、少なくとも２つの発現カセットを含み、１０以上の発現カセットを含んでもよい。導入遺伝子には、例えば、形質転換される特定の植物の遺伝子と異種又は同種の遺伝子が含まれ得る。更に、導入遺伝子には、非天然生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子が含まれ得る。「内因性遺伝子」という用語は、生物のゲノム中の天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって生物に導入される遺伝子を指す。

【0112】

「イントロン」は、ほとんど真核生物の遺伝子内にのみ存在するが、遺伝子産物中のアミノ酸配列には翻訳されないＤＮＡの介在区分を指す。イントロンは、スプライシングと呼ばれるプロセスを経て未熟なｍＲＮＡから除去され、スプライシングは、エキソンをそのままに残してｍＲＮＡを形成する。本発明の目的のために、「イントロン」という用語の定義は、標的遺伝子に由来するイントロンのヌクレオチド配列に対する改変を含むが、但し、改変されたイントロンは、その関連する５’調節配列の活性を有意に低下させないことを条件とする。

【0113】

「エキソン」は、タンパク質又はその一部のコード配列を有するＤＮＡの部分を指す。エキソンは、介在する非コード配列（イントロン）によって分離されている。本発明の目的のために、「エキソン」という用語の定義は、標的遺伝子に由来するエキソンのヌクレオチド配列に対する改変を含むが、但し、改変されたエキソンは、その関連する５’調節配列の活性を有意に低下させないことを条件とする。

【0114】

「切断」又は「切断している」という用語は、ポリヌクレオチドのリボシルホスホジエステルバックボーンにおける共有結合ホスホジエステル結合の切断を意味する。「切断」又は「切断している」という用語は、一本鎖切断及び二本鎖切断の両方を包含する。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。切断は、平滑末端又は互い違いの末端のいずれかの生成をもたらすことができる。「ヌクレアーゼ切断部位」又は「ゲノムヌクレアーゼ切断部位」は、特定のヌクレアーゼによって認識されるヌクレアーゼ切断配列を含むヌクレオチドの領域であり、これは、一方又は両方の鎖においてゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を切断するように作用する。ヌクレアーゼ酵素によるこのような切断は、細胞内でＤＮＡ修復機構を開始させ、それが相同組換えを起こすための環境を確立する。

【0115】

「ドナー分子」、又は「ドナー配列」は、標的ポリヌクレオチド、典型的には標的ゲノム部位での挿入を意図したヌクレオチドポリマー又はオリゴマーである。ドナー配列は、１つ以上の導入遺伝子、発現カセット、又は目的のヌクレオチド配列であってよい。ドナー分子は、一本鎖、部分的二本鎖、又は二本鎖のいずれかのドナーＤＮＡ分子であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、天然又は改変ポリヌクレオチド、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、又はＤＮＡ断片（一本鎖又は少なくとも部分的に二本鎖、又は完全に二本鎖のＤＮＡ分子のいずれか）、又はＰＧＲ増幅ｓｓＤＮＡ又は少なくとも部分的にｄｓＤＮＡ断片であり得る。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、環状化ＤＮＡ分子の一部である。ｄｓＤＮＡ断片は一般にｓｓＤＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対して耐性があるので、完全二本鎖ドナーＤＮＡは、安定性の増加をもたらし得るため有利である。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド分子は、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、２５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、７５００、１００００、１５，０００又は２０，０００ヌクレオチドを含むことができる（本明細書に明示的に列挙されていないこの範囲内の任意の値を含む）。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、異種核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも１つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも１つの発現カセットを含む導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標的ゲノムに対して天然である遺伝子の対立遺伝子改変を含む。対立遺伝子改変は、少なくとも１つのヌクレオチド挿入、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、及び／又は少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み得る。いくつかの実施形態では、対立遺伝子改変は、ＩＮＤＥＬを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標的ゲノム部位に対する相同アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム核酸配列と少なくとも９０％同一である少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含み、場合により導入遺伝子等の異種核酸配列を更に含み得る。

【0116】

本明細書で使用される場合、本発明の１つ以上のヌクレオチド配列に関連した用語「近位」又は「の近位」は、すぐ隣（例えば、介在配列を有さない）、又は約１塩基～約５００塩基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００塩基）（この範囲内に含まれるが本明細書に明示的に列挙されない任意の値を含む）分離されていることを意味する。

【0117】

本明細書で使用される場合、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、一般に、Ｃａｓ又はＣｐｆ１タンパク質のようなＣＲＩＳＰＲシステムエフェクターに結合し、Ｃａｓ又はＣｐｆ１タンパク質を標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）内の特定の位置に標的化することを補助し得るＲＮＡ分子（又は集合的にＲＮＡ分子の群）を指す。本発明のガイドＲＮＡは、操作された単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）であり得、ここで、例えば、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメント及び場合によりｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含む。本発明のガイドＲＮＡはまた、デュアルガイドシステムであり得、ここで、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、物理的に異なる分子であり、次いで、相互作用して、Ｃａｓ９のようなＣＲＩＳＰＲシステムエフェクターの動員のため、及び標的ポリヌクレオチドへのそのタンパク質の標的化のための二重鎖を形成する。

【0118】

本明細書で使用される場合、用語「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡセグメント」は、ポリヌクレオチド標的化ガイド配列、タンパク質結合に関与するステム配列、及び場合により３’－オーバーハング配列を含むＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子の部分を指す。ポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、標的ＤＮＡ中の配列に相補的な核酸配列である。このポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、「プロトスペーサー」とも称される。換言すれば、本発明のｃｒＲＮＡ分子のポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、ハイブリダイゼーション（即ち、塩基対合）を介して配列特異的方法で標的ＤＮＡと相互作用する。従って、ｃｒＲＮＡ分子のポリヌクレオチド標的化ガイド配列のヌクレオチド配列は、様々であり、ＤＮＡガイドＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用するであろう標的ＤＮＡ内の位置を決定し得る。

【0119】

ｃｒＲＮＡ分子のポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、改変されて（例えば、遺伝子操作により）、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズすることができる。本発明のｃｒＲＮＡ分子のポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、約１２ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ｃｒＲＮＡのポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１２ｎｔ～約５０ｎｔ、約１２ｎｔ～約４０ｎｔ、約１２ｎｔ～約３０ｎｔ、約１２ｎｔ～約２５ｎｔ、約１２ｎｔ～約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ～約１９ｎｔの長さを有し得る。例えば、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、約１７ｎｔ～約２７ｎｔの長さを有し得る。例えば、ｃｒＲＮＡのポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、約１９ｎｔ～約２０ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約１９ｎｔ～約７０ｎｔ、約１９ｎｔ～約８０ｎｔ、約１９ｎｔ～約９０ｎｔ、約１９ｎｔ～約１００ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、約２０ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約７０ｎｔ、約２０ｎｔ～約８０ｎｔ、約２０ｎｔ～約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。ｃｒＲＮＡのポリヌクレオチド標的化ガイド配列のヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡのポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡのポリヌクレオチド標的化ガイド配列は、１９ヌクレオチド長である。

【0120】

本発明はまた、操作されたｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡを提供し、ここで、ｃｒＲＮＡは、ゲノム標的配列にハイブリダイズすることができるベイトＲＮＡセグメントを含む。この操作されたｃｒＲＮＡは、デュアルガイドシステムにおけるように、物理的に異なる分子であり得る。

【0121】

本明細書で使用される場合、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」は、タンパク質結合セグメントを含むＲＮＡ分子又はその部分を指す（例えば、タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用することができる）。本発明はまた、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡを提供し、ここで、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ドナーＤＮＡ分子に結合することができるベイトＲＮＡセグメントを更に含む。操作されたｔｒａｃｒＲＮＡは、デュアルガイドシステムにおけるように、物理的に異なる分子であってもよく、又はｓｇＲＮＡ分子のセグメントであってもよい。

【0122】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡとして、又は２つ以上のＲＮＡ分子としてのいずれかで、いくつかのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えばＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知）が、そのＲＮＡ媒介エンドヌクレアーゼ活性のためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないことが当技術分野で公知であるように、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ，１５２：１１７３－１１８３；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３：７５９－７７１）。本発明のこのようなガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含み得、ベイトＲＮＡがｃｒＲＮＡの５’又は３’末端で作動可能に連結されている。Ｃｐｆ１はまた、その同族プレｃｒＲＮＡに対してＲＮａｓｅ活性を有する（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４５）。本発明のガイドＲＮＡは、Ｃｐｆ１が成熟ｃｒＲＮＡに対して有する複数のｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、これらのｃｒＲＮＡの各々は、ベイトＲＮＡに作動可能に連結される。他の実施形態では、これらのｃｒＲＮＡの少なくとも１つは、ベイトＲＮＡに作動可能に連結される。ベイトＲＮＡは、図１に示され、本明細書の実施例に記載されるように、目的の配列（ＳＯＩ）に特異的であってもよく、又は、図２に示され、本明細書の実施例に記載されるように、「普遍的」ベイトであってもよく、これは、対応する「普遍的」プレイ（ｐｒｅｙ）配列をドナーＤＮＡ分子上に有する。

【0123】

本発明はまた、本発明のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。この核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。いくつかの実施形態では、この核酸分子は、環状化されている。他の実施形態では、この核酸分子は、線状である。いくつかの実施形態では、この核酸分子は、一本鎖、部分二本鎖、又は二本鎖である。いくつかの実施形態では、この核酸分子は、少なくとも１つのポリペプチドと複合体化される。ポリペプチドは、核酸認識ドメイン又は核酸結合ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、本発明のキメラＲＮＡ、ヌクレアーゼ、及び場合によりドナー分子の送達を媒介するためのシャトルである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｅｌｄａｎシャトル（米国特許出願公開第２０１６０２９８０７８号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）である。核酸分子は、キメラＲＮＡの発現を駆動することができる発現カセットを含み得る。核酸分子は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ等のヌクレアーゼを発現することができる追加の発現カセットを更に含んでもよい。本発明はまた、本発明のキメラＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。

【0124】

「部位特異的改変ポリペプチド」は、標的ＤＮＡ（例えば、標的ＤＮＡの切断又はメチル化）及び／又は標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストン尾部のメチル化又はアセチル化）を改変する。部位特異的改変ポリペプチドは、本明細書では、「部位特異的ポリペプチド」又は「ＲＮＡ結合部位特異的改変ポリペプチド」とも称される。部位特異的改変ポリペプチドは、単一ＲＮＡ分子又は少なくとも２つのＲＮＡ分子のＲＮＡ二重鎖のいずれかであり、且つガイドＲＮＡとの関係により、ＤＮＡ配列（例えば、染色体配列又は染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）に導かれるガイドＲＮＡと相互作用する。

【0125】

いくつかの場合、部位特異的改変ポリペプチドは、天然に存在する改変ポリペプチドである。他の場合、部位特異的改変ポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチド（例えば、キメラポリペプチド又は改変された、例えば、変異、削除、挿入された天然に存在するポリペプチド）である。例示的な天然に存在する部位特異的改変ポリペプチドは、当技術分野で既知である（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ １６８：３２８－３２８．ｅ１，及びＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５（３）：１６９－１８２参照、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。これらの天然に存在するポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡに結合し、それにより標的ＤＮＡ内の特異的配列に誘導され、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成する。

【0126】

部位特異的改変ポリペプチドは、２つの部分、ＲＮＡ結合部分及び活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；及び（ｉｉ）部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化についての活性、ＤＮＡ切断についての活性、ヒストンアセチル化についての活性、ヒストンメチル化についての活性等）を示す活性部分、ここで酵素活性の部位は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。他の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する（例えば、転写を増加又は低下させるために）活性部分、ここで標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。

【0127】

いくつかの場合、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性又はグリコシラーゼ活性）を有する。他の場合、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡに関連したポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性又は脱ミリストイル化活性）を有する。

【0128】

いくつかの場合、異なる部位特異的改変ポリペプチド、例えば異なるＣａｓ９タンパク質（即ち、様々な種からのＣａｓ９タンパク質）は、本発明の様々な提供される方法において使用して、異なるＣａｓ９タンパク質の様々な酵素特性を利用する（例えば、異なるＰＡＭ配列優先（傾向）のために；増加又は低下した酵素活性のために；増加又は低下した細胞毒性レベルのために；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断の間のバランスの変更のために等）のに有利であり得る。様々な種からのＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７に開示されているもの、又はそれに由来するポリペプチド）は、標的ＤＮＡにおける異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。従って、選択される特定のＣａｓ９酵素について、ＰＡＭ配列の要件は、Ｃａｓ９活性に必要であるとして既知の５’－Ｎ ＧＧ－３’配列（ここでＮは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧのいずれかである）とは異なり得る。非常に様々な種からの多数のＣａｓ９オルソログが本明細書で特定されており、タンパク質は、僅かな同一のアミノ酸を共有する。特定された全Ｃａｓ９オルソログは同じドメイン構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有し、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及び分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する。Ｃａｓ９タンパク質は、保存された構造を有する４つの重要なモチーフを共有する；モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフである一方、モチーフ３はＨＮＨ－モチーフである。

【0129】

部位特異的改変ポリペプチドはまた、キメラ及び改変Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。例えば、部位特異的改変ポリペプチドは、改変されたＣａｓ９「塩基エディタ」であり得る。塩基の編集により、ＤＮＡ切断又はドナーＤＮＡ分子を必要とすることなく、プログラム可能な方法で、１つの標的ＤＮＡ塩基を別の塩基に直接且つ不可逆的に変換することが可能となる。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ（２０１６，Ｎａｔｕｒｅ，５３３：４２０－４２４）は、Ｃａｓ９－シチジンデアミナーゼ融合を教示し、ここでＣａｓ９も、不活性であり、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導しないように操作されている。加えて、Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ（２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４）は、ｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼに融合した触媒的に障害されたＣａｓ９を教示し、これは標的ＤＮＡ配列におけるＡ／ＴからＧ／Ｃへの変換を媒介し得る。本発明の方法及び組成物において部位特異的改変ポリペプチドとして作用し得る操作されたＣａｓ９ヌクレアーゼの別のクラスは、ＮＧ、ＧＡＡ及びＧＡＴを含む幅広いＰＡＭ配列を認識できるバリアントである（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２６１５５）。

【0130】

天然に存在するもの、及び／又は天然に存在するＣａｓ９タンパク質から変異し若しくは改変されたものを含む任意のＣａｓ９タンパク質は、本発明の方法及び組成物において部位特異的改変ポリペプチドとして使用することができる。触媒的に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生じる。これらの切断は、次いで、２つの方法：非相同末端連結及び相同組換え修復の１つで、細胞により修復される。

【0131】

非相同末端連結（ＮＨＥＪ）では、二本鎖切断は、切断された末端を互いに直接連結することによって修復される。従って、新たな核酸材料は部位に挿入されないが、いくつかの核酸材料は損失し、欠失がもたらされる場合がある。相同組換え修復では、切断された標的ＤＮＡ配列に対する相同性を有するドナーＤＮＡ分子が、切断された標的ＤＮＡ配列の修復のための鋳型として使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移動がもたらされる。従って、新たな核酸材料が部位内に挿入／コピーされ得る。いくつかの場合、標的ＤＮＡは、ドナー分子、例えばドナーＤＮＡ分子と接触する。いくつかの場合、ドナーＤＮＡ分子は、細胞内に導入される。いくつかの場合、少なくともドナーＤＮＡ分子のセグメントが、細胞のゲノムに統合される。

【0132】

ＮＨＥＪ及び／又は相同組換え修復による標的ＤＮＡの改変は、例えば、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異等をもたらす。従って、部位特異的改変ポリペプチドによるＤＮＡの切断を用いて、標的ＤＮＡ配列を切断し、外因的に提供されるドナーポリヌクレオチドの非存在下で、細胞が配列を修復することを可能にすることによって、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を削除することができる（例えば、細胞を感染に感受性にする遺伝子（例えば、Ｔ細胞をＨＩＶ感染に感受性にするＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４遺伝子）を破壊するため、ニューロンにおける疾病の原因となるトリヌクレオチドリピート配列を除去するため、研究において疾病モデルとして遺伝子ノックアウト及び変異を作製するため、等）。従って、主題の方法を用いて、標的ＤＮＡにおける遺伝子をノックアウトし（転写又は変更された転写の完全な欠如をもたらす）又は遺伝子材料を選択された遺伝子座にノックインすることができる。或いは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び部位特異的改変ポリペプチドが、標的ＤＮＡ配列に対する相同性を有する少なくとも１つのセグメントを含むドナー分子を有する細胞に共投与された場合、主題の方法を用いて、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に追加、即ち挿入又は置き換え（例えば、タンパク質をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を「ノックイン」するために）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）を追加し、制御配列を遺伝子（例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、終結コドン、スプライスシグナル、局在化シグナル等）に追加し、核酸配列を改変（例えば、変異を導入）、等することができる。従って、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び部位特異的改変ポリペプチドを含む複合体は、例えば、例えば疾病を処置するための遺伝子治療において使用される、又は抗ウイルス、抗病原、若しくは抗癌治療として使用される、農業における遺伝子改変された生物の生成、治療的、診断若しくは研究目的のための細胞によるタンパク質の大規模生産、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、削除又は置換のための病原体の遺伝子の標的化等において使用される、部位特異的な方法、即ち「標的化された」方法、例えば遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け等においてＤＮＡを改変することが望ましい、任意のインビトロ又はインビボ適用に有用である。

【0133】

「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、「Ｃａｓタンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ」又は「Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片、又はその突然変異体若しくは変異体を指す。「Ｃａｓ突然変異体」又は「Ｃａｓ変異体」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質又はポリペプチド誘導体、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断、融合タンパク質、又はそれらの組合せを有するタンパク質を指す。特定の実施形態では、Ｃａｓ突然変異体又はＣａｓ変異体は、植物由来の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に作動可能に連結された本明細書に記載のＣａｓ９変異体等のＣａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に保持する。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ又は両方のヌクレアーゼドメインが不活性であるように突然変異され、例えば、ｄＣａｓ９と称される触媒的に死んだＣａｓ９等であり、これは、依然として特定のゲノム位置を標的とすることができるが、エンドヌクレアーゼ活性を有さない（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ，１５２：１１７３－１１８３、本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、その野生型対応物のヌクレアーゼ活性の一部又は全てを欠くように突然変異される。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１、本明細書に組み込まれる）又は任意の別のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼであってもよい。

【0134】

ａ．本発明は：標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと、単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと、二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと、標的遺伝子の発現をサイレンシングすることとからなる、標的遺伝子を遺伝子サイレンシングする方法を提供する。

【0135】

いくつかの実施形態では、本発明は、抗サイレンシングポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子を細胞内に導入することを更に含む、上記の方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗サイレンシングポリペプチドは、細胞に提供され得る。いくつかの実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、ウイルスサイレンシングサプレッサー（ＶＳＲ）であるか、又はウイルスサイレンシングサプレッサー（ＶＳＲ）に由来する。更なる実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、植物ウイルスに由来するＶＳＲである。更なる実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、トンブスウイルス、例えばＣｙｍＲＳＶ、ＣＩＲＶ、又はＴＢＳＶに由来するウイルスサイレンシングサプレッサーｐ１９タンパク質である。Ｚｈｕらは、最近、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼと共発現されたトマトブッシースタントウイルスに由来するｐ１９ ＶＳＲが、植物における遺伝子標的化効率及び／又はガイドＲＮＡ安定性を改善することを示した（米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８２号明細書）。いくつかの実施形態では、ＶＳＲは、ＨＣ－Ｐｒｏ、ｐ１４、ｐ３８、ＮＳ、ＮＳ３、ＣａＭＶ Ｐ６、ＰＮＳ１０、Ｐ１２２、２ｂ、Ｐｏｔｅｘ ｐ２５、ＴｏＲＳＶ ＣＰ、Ｐ０、及びＳＰＭＭＶ Ｐ１を含む植物ウイルスタンパク質の群から選択される（参照により本明細書に組み込まれるＣｓｏｒｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４７９－４８０ ｐ．８５－１０３を参照されたい）。

【0136】

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の核酸分子が部位特異的修飾ポリペプチドをコードする、上記の方法を提供する。更なる実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、ヌクレアーゼである。なお更なる実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、又はＴＡＬＥＮであるヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。更なる実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９若しくはＣｐｆ１、又はＣａｓ９若しくはＣｐｆ１の突然変異体、例えばヌクレアーゼ不活性化突然変異体、又はＣａｓ９若しくはＣｐｆＩの少なくとも１つのドメインと異なる部位特異的改変ポリペプチドの少なくとも１つのドメインとの融合物である。

【0137】

いくつかの実施形態では、本発明は、抗サイレンシングポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子を細胞内に導入することを更に含む、上記の方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、ウイルスサイレンシング抑制因子（ＶＳＲ）であるか又はそれに由来する。更なる実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、植物ウイルスに由来するＶＳＲである。更なる実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、Ｔｏｍｂｕｓウイルス、例えばＣｙｍＲＳＶ、ＣＩＲＶ又はＴＢＳＶに由来するウイルスサイレンシング抑制因子ｐ１９タンパク質である。Ｚｈｕ ｅｔ ａｌは、最近、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅｅａｓｅ）と共発現したトマトブッシースタントウイルスに由来するｐ１９ ＶＳＲが、植物において遺伝子標的化の効率及び／又はガイドＲＮＡ安定性を改善することを示した（米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８２号明細書）。いくつかの実施形態では、ＶＳＲは、ＨＣ－Ｐｒｏ、ｐ１４、ｐ３８、ＮＳ、ＮＳ３、ＣａＭＶ Ｐ６、ＰＮＳ１０、Ｐ１２２、２ｂ、Ｐｏｔｅｘ ｐ２５、ＴｏＲＳＶ ＣＰ、Ｐ０、及びＳＰＭＭＶ Ｐ１を含む植物ウイルスタンパク質の群から選択される（Ｃｓｏｒｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４７９－４８０ ｐ．８５－１０３を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0138】

本開示は、標的遺伝子の発現を減少させる方法を提供し、該方法は、標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと、単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと、二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと、標的遺伝子の発現を減少させることとからなる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、標的遺伝子における二本鎖切断は、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する。これらの方法は、細胞が一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体のゲノムを有する場合に用いられ得る。これらの方法は、標的遺伝子が優性、劣性、又は半優性の場合に用いられ得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ、２つ、又はそれを超えるガイド配列を利用することができる。この方法は、植物細胞において有用であるが、任意の細胞に適用可能である。

【0139】

本開示は、ゲノム編集によって染色体を再配置する方法を提供し、該方法は、部位特異的ヌクレアーゼによって染色体に少なくとも１つの破損を生成することと、再配置を有する染色体を選択することとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを利用することができる。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、欠失、重複、逆位、又は転座を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、遺伝子発現の改変を引き起こす。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子発現の改変は、前駆体ｍＲＮＡレベル、又は成熟ｍＲＮＡレベル、又は翻訳レベルでの調節を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、染色体が種間雑種のような１つの核に分類され得る場合に、２つの種由来の染色体を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、少なくとも２つの対立遺伝子又は異なる対立遺伝子由来の２つの成分を融合することによって、新たな対立遺伝子生成をもたらす。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、プロモーター、エキソン、イントロン、又は転写ターミネーターを標的とする。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、再配置された遺伝子と配列類似性を有する異なる遺伝子の遺伝子発現の改変を引き起こす。本方法の更なる実施形態では、欠失、重複、逆位、又は転座は、１９塩基対以上である。

【0140】

ここで本発明を、以下の実施例を参照して記載する。これらの実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するものではなく、特定の実施形態の例示を意図することを認識するべきである。当業者が見出す、例示した方法における任意のバリエーションは、本発明の範囲内に含まれる。

【実施例0141】

実施例１：遺伝子編集による遺伝子逆位
遺伝子編集による遺伝子逆位を試験するために、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のゲノムにおいて標的を同定した。標的遺伝子は、ＤＥＮＳＥ ＡＮＤ ＥＲＥＣＴ ＰＡＮＩＣＬＥ １（ＤＥＰ１、配列番号１）である。ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）米ｄｅｐ１変異体は、ＤＥＰ１の３’末端近くに６２５ｂｐの欠失を含む。変異体は、野生型よりも高い穀粒数及び低い植物高さを有する密で直立した穂（ｐａｎｉｃｌｅ）を有する（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４１：４９４－４９７。インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）米は、ＤＥＰ１遺伝子の野生型コピーを有する。本明細書に記載される実施例について、ＤＥＰ１はゲノム編集による遺伝子逆位の標的とされた。

【0142】

バイナリーベクター２２６０３は、ＤＥＰ１のエキソン５を標的とするガイドＲＮＡ－Ｂ（ｇＲＮＡ－Ｂ、ｇｔｃｃａａｇｃｔｇｃｇｇａｔｇｃａａ、配列番号３）を産生する発現カセット（配列番号２）と、同様にエキソン５を標的とするｇＲＮＡ－Ｄを有する第２の発現カセット（ｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇｔｔｃｃｔｇｔ、配列番号４）とを含んでいた。バイナリーベクター２２６０４は、ガイドＲＮＡ－Ａ（ａｃｔｇｃａｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇｃｇｃ、配列番号６）を産生する発現カセット（配列番号５）及びｇＲＮＡ－Ｄを有する第２の発現カセット、ｇＲＮＡ－Ｂを産生する第３の発現カセット、及びガイドＲＮＡ－Ｃ（ｃｃｃａａｔｇｃａａａｃｃｃｇａｔｔｇ、配列番号７）を産生する第４の発現カセットを含んでいた。各バイナリーベクター中の全ての発現カセットは、単一の導入遺伝子の一部である。

【0143】

本明細書に記載される全てのバイナリーベクターは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するための発現カセット（国際公開第１６１０６１２１号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及び形質転換のための選択マーカーを発現するための第２の発現カセットを含む。

【0144】

イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）近交系ＩＲ５８０２５Ｂを、Ｇｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１４（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ３３：１０８１－１０９０、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、形質転換、選択、及び再生のためのプロトコルに本質的に従うアグロバクテリウム媒介形質転換実験のために使用した。遺伝子導入イネラインを、１６時間明／３０℃及び８時間暗／２２℃の温室内で成長させた。

【0145】

Ｔ０遺伝子導入事象からの葉組織をサンプリングし、ゲノムＤＮＡ抽出、続いてＴａｑＭａｎ分析に使用した。ＴａｑＭａｎ分析は、本質的に、Ｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１（１）：１３２－４，１３６－４０，２００１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実施された。ＴａｑＭａｎを実施して、Ｃａｓ９遺伝子（表１、配列番号９～１０はプライマー；配列番号１１はプローブ）、及び一連のＤＥＰ１におけるＴａｑＭａｎアッセイ標的化変異（配列番号１２～２０）の存在を検出した。ＤＥＰ１における変異を検出するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、プロトスペーサー標的配列に隣接し、そしてプローブは、Ｃａｓ９切断部位及びＰＡＭを含むプロトスペーサーの領域にハイブリダイズする。変異（典型的には、ｉｎｄｅｌ）がＣａｓ９切断部位に導入される場合、プローブは、標的配列に結合せず、従って蛍光を生成しないであろう（シグナル０）。遺伝子型の特徴付けは、ＤＥＰ１のＴａｑＭａｎ分析に基づく（表２）。

【0146】

【表1】

【0147】

【表2】

【0148】

Ｔ０事象からの葉組織をサンプリングし、ゲノムＤＮＡ抽出に使用した。プライマー５’－ＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡ－３’（配列番号２１）及び５’－ＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＧＴＣＴＣＡＴＡ－３’（配列番号２２）を用いて、ＤＥＰ１遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を標的サイズのゲル電気泳動によって単離し、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。アンプリコン当たり１５～３０コロニーを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法を用いて、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクターに位置するＭ１３フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて配列決定した。配列を組み立て、Ｖｅｃｔｏｒ－ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＢＬＡＳＴ分析の両方を使用して、野生型ＤＥＰ１配列に対するアライメントによって分析した。

【0149】

ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ０４９Ａ及びＲＩＥＴ１４２５００Ｂ０２４Ａは、エキソン５に逆位を有する２つの編集物である（図１）。ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ０４９Ａでは、ｇＲＮＡ－ＢとｇＲＮＡ－Ｄの間で４１３ｂｐ断片が反転した（ゲノム配列、配列番号２３）。以下の発現研究において、同じ構築物２２６０３由来のＲＩＥＴ１４２２０２Ａ１３０Ａを、ｇＲＮＡ－ＢとｇＲＮＡ－Ｄとの間に４４４ｂｐの欠失（ゲノム配列、配列番号２４）を有する対照として選択した。２２６０４からの編集物において、ＲＩＥＴ１４２５００Ｂ０２４Ａは、ｇＲＮＡ－ＡとｇＲＮＡ－Ｂの間の逆位（ゲノム配列、配列番号２５）で同定された。同様に、ＲＩＥＴ１４２３００Ａ０１４Ａを、更なる発現対照として選択した（ゲノム配列、配列番号２６）。

【0150】

実施例２：突然変異ＤＥＰ１を野生型ＤＥＰ１と組み合わせる
逆位ＤＥＰ１が存在する場合の野生型ＤＥＰ１の発現を調べるために、ワークフローを図２のように設計した。Ｔ１種子を自殖Ｔ０植物から回収し、次いで、１６時間明／３０℃、８時間暗／２２℃の温室内で２週間、発芽トレーに播種した。Ｔ１植物由来の葉組織をサンプリングし、ゲノムＤＮＡ抽出に使用した。１４ＳＢＣ５００７７３（ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ１３０ＡのＴ１種子）の遺伝子型判定プライマーは、５’－ＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴ－３’（センスプライマー、配列番号２７）及び５’－ＴＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＧ－３’（アンチセンスプライマー、配列番号２８）であった。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって単離した（図３）。同様のプロセスを他の事象の遺伝子型に適用した。

【0151】

選択されたＴ１植物を、同じ条件下で温室内の大きな鉢に移した（図４）。一方、５８０２５野生型種子を播種し、平行して大きな鉢に移した。開花段階で、５８０２５Ｂ野生型植物の花粉を収集し、ホモ接合削除（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ－ｄｅｌａｔｅｄ）及び逆位植物に受精させて、Ｆ１種子を作製した（表３）。

【0152】

【表3】

【0153】

実施例３：野生型ＯｓＤＥＰ１の発現を比較する
２～３ｃｍの若い穂を初期起動段階でＦ１植物からサンプリングし（図５）；各遺伝子型から５～６個の若い穂をサンプリングし、ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成をサンプルごとに扱った。ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＲＩｚｏｌ（商標）によって標準プロトコルに従って単離し、ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ第１鎖合成系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって合成した。まず、２つのＤＥＰ１対立遺伝子がＦ１穂で転写されることを確認した。センスプライマー５’－ＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧ－３’（センスプライマー、エキソン１に位置する、配列番号２９）及び５’－ＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＧＴＣ－３’（アンチセンスプライマー、３’ＵＴＲに位置する、配列番号３０）を使用した（図６）。プライマー対を用いて、野生型５８０２５Ｂ由来のアンプリコンは、１４６７ｂｐの大きさであり；１７ＳＢＣ５００１４０のＦ１植物では、２つのバンドが存在し、１つは野生型ＤＥＰ１であり、１つは４４４ｂｐ欠失を有するＤＥＰ１であった。１７ＳＢＣ５００１４６及び１７ＳＢＣ５００１４９において、アンプリコンは、２つの対立遺伝子からのサイズが類似し、野生型ＤＥＰ１アンプリコンと比較して１０２ｂｐ欠失を有していた。更に、欠失及び逆位を有するＤＥＰ１転写産物の存在を、コロニー配列決定によって確認した。

【0154】

次いで、同一遺伝子型で各サンプルからのｃＤＮＡを混合し、セミｑＲＴ－ＰＣＲを介してＷＴ／欠失とＷＴ／逆位の間で野生型ＤＥＰ１発現を比較した。イネユビキチン（Ｏｓ０３ｇ０２３４２００）を、プライマー５’－ＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣ－３’（配列番号３１）及び５’－ＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡ－３’（配列番号３２）を用いた発現対照のために選択した。野生型ＤＥＰ１特異的プライマーセット、５’－ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡ－３’（配列番号３３）及び５’－ＣＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧ－３’（配列番号３４）を増幅するように設計した。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって単離し、面積サイズに基づいてＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ ＨＰソフトウェアによって定量した。発現比は、逆位を有するＦ１における野生型ＤＥＰ１バンドの面積を、欠失を有するＦ１におけるそれで除算し、次いで、ユビキチン対照の発現比によって調整した（図７、表４）。両方のタイプの逆位は、野生型ＤＥＰ１の発現を減少させることができた。

【0155】

【表4】

【0156】

実施例４：ゲノム編集による転座
実施例１に示したのと同じプロセス、Ｅ０植物、ＲＩＥＴ１４２５００Ａ０８４Ａを、２つの転座で同定した（図８、配列番号１０５、配列番号３５）。同じ位置で逆位を生じるかわりに、ｇＲＮＡ－Ａ及び－Ｂ領域とｇＲＮＡ－Ｃ及び－Ｄ領域から遊離した２つの断片が存在した。遺伝子の一部若しくは遺伝子全体（プロモーター及びターミネーター領域を含む）、又は複数の遺伝子が、近くの新しい位置又は別の染色体に転座することがある。遺伝子全体又は複数の遺伝子の転座の標的化によって、図９の設計に基づいて重複が達成され得る。遺伝子の発現をより多くのコピーでアップレギュレートすることができる。別の側面では、ゲノムが１つの核に分類された２つの種を形成すれば、ゲノム編集を介して対立遺伝子の交換が達成され得る。多すぎるコピーを用いた重複も、遺伝子サイレンシングをもたらし得；ＨＡ４１２のように、高オレイン酸ヒマワリ近交系は、ＨａＦＡＤ２－１の無傷コピーを３つ有するが、発現はない。

【0157】

遺伝子の一部は、同じ領域又は新しい領域に転座することができる。同じ領域における転座の場合、部分重複又はヘアピンループ構造が生成され得る（図１０）。ヒマワリでは、ＨａＦＡＤ２－１（ＯＤＳ）の部分重複は、無傷ＯＤＳ遺伝子をサイレンシングし、核において高オレイン酸を導き（Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００９）２８１：４３－５４）；これはまた、生成されたハイブリッドにおける他の野生型ＨａＦＡＤ２－１をサイレンシングし得る。同様の設計は、非トランスジェニック遺伝子サイレンシングツールを提供することができる。ＴａＭＬＯと同様に、編集されたＴａＭＬＯ－Ａは、Ｂ及びＤ対立遺伝子の発現をサイレンシングし得、これは、疾患耐性を達成し得るが、三重突然変異体における成長ペナルティーが軽減される（図１１）。同じ戦略を使用して、パラログも発現において改変され得る。転座はまた、遺伝子を融合させ、新しい遺伝子又は同じ遺伝子の新しい対立遺伝子を生成することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2024166200000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-09-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ａ） 標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと；
ｂ） 単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと；
ｃ） 前記二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択し、前記選択された細胞が、前記標的遺伝子の逆位コピーを含むことと；
ｄ） 前記標的遺伝子の発現を減少させ、前記細胞は、植物細胞であることと：
ｅ） 野生型コピーの植物細胞との交配において前記逆位コピーの植物細胞を使用し、それにより野生型／逆位の植物細胞を産生することと；
からなる、前記標的遺伝子の発現を減少させる方法。

【請求項2】

前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的遺伝子における前記二本鎖切断が、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

請求項１に記載の細胞が、一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体ゲノムを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記標的遺伝子が劣性又は半優性である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

１つ以上のガイド配列を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含む、請求項６に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0157】

遺伝子の一部は、同じ領域又は新しい領域に転座することができる。同じ領域における転座の場合、部分重複又はヘアピンループ構造が生成され得る（図１０）。ヒマワリでは、ＨａＦＡＤ２－１（ＯＤＳ）の部分重複は、無傷ＯＤＳ遺伝子をサイレンシングし、核において高オレイン酸を導き（Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００９）２８１：４３－５４）；これはまた、生成されたハイブリッドにおける他の野生型ＨａＦＡＤ２－１をサイレンシングし得る。同様の設計は、非トランスジェニック遺伝子サイレンシングツールを提供することができる。ＴａＭＬＯと同様に、編集されたＴａＭＬＯ－Ａは、Ｂ及びＤ対立遺伝子の発現をサイレンシングし得、これは、疾患耐性を達成し得るが、三重突然変異体における成長ペナルティーが軽減される（図１１）。同じ戦略を使用して、パラログも発現において改変され得る。転座はまた、遺伝子を融合させ、新しい遺伝子又は同じ遺伝子の新しい対立遺伝子を生成することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕
ａ） 標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと；
ｂ） 単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと；
ｃ） 前記二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと；
ｄ） 前記標的遺伝子の発現を減少させることと：
からなる、前記標的遺伝子の発現を減少させる方法。
〔２〕前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記標的遺伝子における前記二本鎖切断が、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記〔１〕に記載の細胞が、一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体ゲノムを有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記標的遺伝子が劣性又は半優性である、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕１つ以上のガイド配列を更に含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕前記１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含む、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記細胞が植物細胞である、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕ゲノム編集によって染色体を再配置する方法であって：
ａ．部位特異的ヌクレアーゼによって前記染色体に少なくとも１つの破損を生成することと；
ｂ．再配置を有する染色体を選択することと、
を含む、方法。
〔１０〕前記部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記染色体再配置が、欠失、重複、逆位、又は転座を含む、前記〔９〕に記載の方法。
〔１２〕前記染色体再配置が、遺伝子発現の改変を引き起こす、前記〔９〕に記載の方法。
〔１３〕前記遺伝子発現改変が、前駆体ｍＲＮＡレベル、又は成熟ｍＲＮＡレベル、又は翻訳レベルでの調節を含む、前記〔９〕に記載の方法。
〔１４〕前記染色体再配置が、前記染色体が種間雑種のような１つの核に分類され得る場合に、２つの種由来の染色体を含む、前記〔９〕に記載の方法。
〔１５〕前記染色体再配置が、少なくとも２つの対立遺伝子又は異なる対立遺伝子からの２つの成分を融合することによって、新たな対立遺伝子生成をもたらす、前記〔９〕に記載の方法。
〔１６〕染色体再配置が、プロモーター、エキソン、イントロン、又は転写ターミネーターを標的とする、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１７〕染色体再配置が、前記再配置された遺伝子と配列類似性を有する異なる遺伝子の遺伝子発現の改変を引き起こす、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１８〕前記欠失、重複、逆位、又は転座が１９塩基対以上である、前記〔１１〕に記載の方法。

【外国語明細書】