特開 2024-166267 ポリマー色素がコンジュゲートされた抗体の乾燥のための新規製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024166267

(43)【公開日】2024-11-28

(54)【発明の名称】ポリマー色素がコンジュゲートされた抗体の乾燥のための新規製剤

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/532 20060101AFI20241121BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20241121BHJP

【ＦＩ】

G01N33/532 A

G01N33/532 B

C12Q1/04

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024153702

(22)【出願日】2024-09-06

(62)【分割の表示】P 2024527546の分割

【原出願日】2021-11-12

(71)【出願人】

【識別番号】510005889

【氏名又は名称】ベックマン コールター， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．

【住所又は居所原語表記】２５０ Ｓ． Ｋｒａｅｍｅｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｂｒｅａ， ＣＡ ９２８２１， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アディティヤ ジャラレ

(72)【発明者】

【氏名】ラジェシュ ヴェンカテシュ

(72)【発明者】

【氏名】スミート チャウラ

(72)【発明者】

【氏名】メフル ジヴラジャニ

(72)【発明者】

【氏名】ナイナ アローラ

(72)【発明者】

【氏名】ゴピナド ジャッカ

(72)【発明者】

【氏名】シヴァ ランジニ スリニバサン

(57)【要約】

【課題】パネル中に複数の蛍光色素コンジュゲートを含む組成物を提供すること。
【解決手段】新規ドライダウン緩衝液を、フローサイトメトリーにおける使用のための基材上の複数の蛍光色素コンジュゲートの乾燥における使用のために提供する。水性緩衝液は、水溶性モノマー；タンパク質安定剤；炭水化物安定剤；および両性イオン性界面活性剤を含む。蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含むマルチカラーパネルと混合され、基材上で乾燥され、生体試料で再構成されると、緩衝液は、水溶性モノマーまたは両性イオン性界面活性剤なしの緩衝液の使用と比較した場合に、蛍光ポリマー色素コンジュゲートの凝集の減少、ならびに単球および顆粒球の非特異的結合の減少を提供する。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２１年１１月１２日に出願されている。

【背景技術】

【0002】

背景
マルチカラーフローサイトメトリーは、複数の蛍光マーカーを使用して、目的の細胞下位集団を同定および特徴付け、１秒あたり数万個の細胞の迅速な分析を可能にする、急速に進化している技術である。フローサイトメトリーは、全血試料、骨髄、および他の生物学的検体を含む異なる生体試料を染色するために抗体色素コンジュゲートを使用する。正常なヒト全血試料では、異なる種類の細胞が、異なるマーカーを発現する、例えば、Ｔ細胞においてＣＤ４、およびＢ細胞においてＣＤ２０を発現する。相互排他的マーカー（１つの特定の細胞型においてのみ発現されるマーカー）が、それらの対応物である抗マーカー抗体蛍光色素コンジュゲートを使用して染色される場合、それぞれの細胞からのシグナル（蛍光）は、分析のために、フローサイトメーターにおいて捕捉され、デジタル変換される。

【0003】

マルチカラー乾燥試薬は、生体試料のフローサイトメトリー分析において有用な異なる抗体色素コンジュゲートの多様性を含む、乾燥された利用されるカクテルである。乾燥試薬技術は、生体分子の安定性を増加させて室温での保管を可能にし、試料調製を簡素化し、ユーザーのエラーを最小化するために使用される。

【0004】

マルチカラー乾燥試薬カクテルは、低分子（例えば、ＦＩＴＣ）、タンデム（例えば、ＰＣ５．５）、または大分子（例えば、ＡＰＣ）色素（例えば、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰＥ、ＣＤ２０－ＡＰＣ、ＰＣ５．５など）にコンジュゲートされたいくつかの異なる抗体を含んでいてもよく、さまざまな生物学的検体中の細胞を染色し、フローサイトメーターにおいてそれを分析するために使用され得る。

【0005】

既存の古典的な（モノマー）色素（ＦＩＴＣ、ＰＣ５．５、ＡＰＣなど）コンジュゲートと比較して、ポリマー色素コンジュゲートは、構造および複雑性において異なる。ポリマー色素の構造の剛性は、より明るい発光をもたらす回転エネルギーを低減するのを助ける。そのため、ポリマー色素コンジュゲートは、ほとんど発現されない受容体を有する細胞の同定および分析において特に有用である。これらの明るいポリマー色素は、はっきりしない集団の検出および分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を可能にし得る。しかしながら、青紫色ポリマー色素などのポリマー色素は、それらの固有の疎水性を理由として、互いと相互作用し、凝集体を形成する傾向がある。

【0006】

従来の乾燥技術は、一定期間にわたる安定性を伴って、機能性（抗原に対する親和性）または物理的性質（明るさおよび漏出など）を変更することなく、単一チューブ中で異なる古典的色素コンジュゲートのドライダウンを可能にする。「試薬緩衝液（Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ）」（ＲＢ）は、機能性（抗原に対する親和性）または物理的性質（明るさおよび蛍光など）を変更することなく、単一チューブ中で異なるモノマー色素コンジュゲートを乾燥するために以前に開発された、犠牲タンパク質（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、炭水化物安定剤、抗菌剤および緩衝剤を含む先行技術の製剤である。「物理的性質」は、蛍光色素コンジュゲートの明るさ、および他のチャネルへのその漏出を指す。例えば、従来の乾燥技術を使用して乾燥され、生物学的検体を染色するために使用された場合に、ＣＤ４－ＰＥ色素コンジュゲートを使用する所望のフローサイトメトリー結果が示される。図１Ａに示されるように、所望の機能性、物理的性質、ならびにＣＤ４ ＰＥ＋単球およびＣＤ４ ＰＥ＋リンパ球細胞集団の分離能が示される。同様に、従来技術を使用して乾燥され、血液試料で再構成された場合に、所望のフローサイトメトリー結果が、ＣＤ２０ ＡＰＣ色素コンジュゲートについて示される。図１Ｂに示されるように、所望の機能性、物理的性質、およびＣＤ２０ ＡＰＣ＋細胞集団のフローサイトメトリー分離能が示される。

【0007】

試薬緩衝液を使用する従来の乾燥技術を使用して、チューブ中で２つのポリマー色素抗体コンジュゲートをドライダウンする場合、ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を防止できず、凝集をもたらす。一般に、２つまたはそれよりも多くのポリマー色素抗体コンジュゲートが、従来の乾燥技術を使用して乾燥される場合、それらは、互いと相互作用する傾向があり、所望されない結果をもたらす。凝集は、補正できない他のチャネルにおける偽陽性集団をもたらす。この課題を、図２Ａおよび図２Ｂに図示する。

【0008】

図２Ａは、混合され、従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合の、ＣＤ２０－６０５およびＣＤ４－７８６ポリマー色素抗体コンジュゲートの所望されないフローサイトメトリー結果を示す。ｘおよびｙ軸において集団を分離できないことは、漏出の問題であると仮定された。しかしながら、漏出の補正後でさえ、集団は分離されなかった（図２Ｂ）。

【0009】

図２Ｂは、漏出の補正とともに、混合され、従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合の、ＣＤ２０－６０５およびＣＤ４－７８６ポリマー色素抗体コンジュゲートの所望されないフローサイトメトリー結果を示す。それらの個々の蛍光チャネルに対して集団を補正できないことは、２つのポリマー色素抗体コンジュゲートが、従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合の、ポリマー色素抗体コンジュゲートの凝集に起因すると見なされた。

【0010】

改善された機能性、物理的性質、およびフローサイトメトリー分離能を可能にする、ポリマー色素抗体コンジュゲートを安定に保つことができ、乾燥しながらおよび再構成の間に凝集を回避することができる新規緩衝液製剤についての必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

開示の概要
新規緩衝液組成物は、基材上の複数の色素コンジュゲートの乾燥における使用のために提供される。色素コンジュゲートは、蛍光色素コンジュゲートを含んでいてもよい。蛍光色素コンジュゲートは、蛍光色素、および抗体などの結合パートナーのコンジュゲートであってもよい。蛍光色素コンジュゲートは、抗体などの結合パートナーにコンジュゲートされた蛍光ポリマー色素であってもよい。蛍光色素コンジュゲートは、フローサイトメトリーにおいて使用されてもよい。緩衝液組成物は、水溶性モノマー；タンパク質安定剤；炭水化物安定剤；および両性イオン性界面活性剤を含む。緩衝液組成物が、２つまたはそれよりも多くの蛍光色素コンジュゲートを含むマルチカラー蛍光色素コンジュゲートパネルと混合され、基材上で乾燥され、生物学的検体で再構成される場合、緩衝液は、タンパク質安定剤、水溶性モノマーまたは両性イオン性界面活性剤なしの緩衝液の使用と比較した場合に、蛍光色素コンジュゲートの凝集の減少を提供する。一部の例では、緩衝液組成物は、タンパク質安定剤、モノマーまたは両性イオン性界面活性剤なしの緩衝液の使用と比較した場合に、単球への色素の非特異的結合の減少および／または顆粒球への色素の非特異的結合の減少も提供する。

【0012】

一部の実施形態では、本開示は、パネル中に複数の蛍光色素コンジュゲートを含む組成物を提供する。適切な緩衝液の存在下では、複数の蛍光色素コンジュゲートを、パネル中で使用して、細胞の下位集団を同定することができる。適切な緩衝液なしでは、蛍光色素コンジュゲートは、互いと相互作用し、データ解釈に影響を及ぼし得る染色の人為現象を引き起こす可能性がある。

【0013】

緩衝液組成物は、水溶性モノマー；タンパク質安定剤；炭水化物安定剤；および両性イオン性界面活性剤を含む、基材上の複数の色素コンジュゲートの乾燥における使用のために提供される。複数の色素結合パートナーコンジュゲートのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つが、蛍光ポリマー色素部分を含んでいてもよい。

【0014】

水溶性モノマーは、それぞれ必要に応じて、それらに結合した水溶性部分を有する、アリール部分またはヘテロアリール部分を含むモノマー単位であってもよい。水溶性部分は、１つまたはそれよりも多くのポリ（エチレングリコール）部分であってもよい。水溶性モノマーは、モノマーＡサブユニット、モノマーＢサブユニット、またはモノマーＡおよびモノマーＢサブユニットの組合せを有する複数の蛍光ポリマー色素のうちの少なくとも１つの調製における使用のために適切であり得る。水溶性モノマーは、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系水溶性モノマーであってもよい。水溶性モノマーは、フルオレン系水溶性モノマーであってもよい。

【0015】

水溶性モノマーは、式（Ｉ）：

【化1】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、水溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホラミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化2】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^３は、水溶化部分であり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＲ^４、または－ＣＨ_２であり；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系モノマーであってもよい。

【0016】

一部の実施形態では、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、およびＰＥＧからなる群から選択される。

【0017】

水溶性モノマーは、式（ＩＩ）：

【化3】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、アルキン、水素、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＸは、ＣまたはＳｉであり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するフルオレン系モノマーであってもよい。

【0018】

一部の実施形態では、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、およびＰＥＧからなる群から選択される。

【0019】

水溶性モノマーは、式（ＩＩＩ）：

【化4】

（式中、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であり；それぞれのＺは、独立して、Ｏ、ＣＨ_２、およびＮＨからなる群から選択され；それぞれのＲ_１は、独立して、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_３）であり；それぞれのＲ_２は、独立して、Ｈ、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_６）であり；それぞれのｎは、独立して、１～６であり；それぞれのｍは、独立して、５～５０である）
に記載の化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系モノマーであってもよい。一部の実施形態では、Ｇ_１、Ｇ_２は、それぞれ、Ｂｒであり；それぞれのＺは、Ｏであり；それぞれのＲ_１は、ＣＨ_３であり；それぞれのＲ_２は、Ｈであり；それぞれのｎは、２～４であり；それぞれのｍは、独立して、５～２０である。一部の実施形態では、それぞれのｎは、３であり；それぞれのｍは、１１または１２である。

【0020】

タンパク質安定剤は、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびゼラチンからなる群の１つまたはそれよりも多くから選択されてもよい。

【0021】

炭水化物安定剤は、二糖炭水化物安定剤であってもよい。二糖炭水化物安定剤は、トレハロース、スクロース、マルトース、セロビオース、もしくはメリビオース、またはそれらの水和物であってもよい。具体的な実施形態では、二糖炭水化物安定剤は、トレハロースまたはその水和物であってもよい。炭水化物安定剤は、トレハロース二水和物であってもよい。

【0022】

両性イオン性界面活性剤は、式（ＸＶ）：

【化5】

（式中、Ｙ＝ＣＯ_２－またはＳＯ_３－であり、Ｗ＝ＨまたはＯＨであり、Ｚ＝ＣＨ_３またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒ＝Ｃ_１～１５アルキルである）であり；独立して、それぞれのｐ＝０または１であり；ｑ＝０～２１であり；必要に応じて、Ｗ＝Ｈであり、Ｚ＝ＣＨ_３であり、ｑ＝１１～１５である）
に記載の構造を含んでいてもよい。

【0023】

両性イオン性界面活性剤は、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオプロパンスルホネート（ＤＭＭＡ）；３－［Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］－プロパンスルホネート（ＤＭＰＡ）；Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタイン；およびＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタインからなる群から選択されてもよい。

【0024】

必要に応じて、緩衝液組成物は、保存剤、抗酸化剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および着色剤からなる群から選択される、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、または３つもしくはそれよりも多くの追加の添加剤を含んでいてもよい。

【0025】

緩衝液組成物は、ｐＨ６．５～７．５の範囲のｐＨを有していてもよい。一部の例では、水性緩衝液組成物は、ｐＨ７．０～７．４の範囲内のｐＨを有していてもよい。

【0026】

緩衝液組成物は、試験あたり、２００～８００μｇのモノマー；２０００～３０００μｇの炭水化物安定剤；８．４～７２μｇのタンパク質安定剤；および２～１５μｇの両性イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。

【0027】

緩衝液組成物は、試験あたり、３００～６００μｇのモノマー；２２００～２８００μｇの炭水化物安定剤；１５～２０μｇのタンパク質安定剤；および８～１２μｇの両性イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。

【0028】

一部の実施形態では、緩衝液組成物は、複数の蛍光色素コンジュゲートを含んでいてもよい。一部の実施形態では、緩衝液組成物は、複数の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含んでいてもよい。蛍光ポリマー色素コンジュゲートは、本開示にそれぞれ記載の、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩＩ）、式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）、式（Ｘ）、式（ＸＩ）、式（ＸＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、および／または式（ＸＩＶ）に記載の構造を含んでいてもよい。

【0029】

他の実施形態では、水性緩衝液組成物は、複数の蛍光色素コンジュゲートを含まない。さらなる実施形態では、水性緩衝液組成物は、任意の蛍光色素コンジュゲートを含まない。

【0030】

単一反応物フィルムを調製する新規方法であって、本開示に記載の緩衝液組成物を含む液相中で一緒に複数の反応物を基材上に分注するステップであって、複数の反応物が、第１の反応物および第２の反応物を含み、第１の反応物が、第１の色素にコンジュゲートされた第１の結合パートナーを含み、第１の色素が、蛍光ポリマー色素を含み；第２の反応物が、第２の色素にコンジュゲートされた第２の結合パートナーを含む、ステップ；ならびに液相の水性緩衝液中で一緒に第１の反応物および第２の反応物を乾燥して、基材上に第１の単一反応物フィルムを形成するステップを含む、方法が提供される。第２の色素は、蛍光ポリマー色素であってもよい。単一反応物フィルムは、複数の反応物を含む均一フィルムであってもよい。複数の反応物は、異なる結合パートナー色素コンジュゲートをそれぞれ含む、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、１２もしくはそれよりも多くの反応物、または２～２０、３～１８、もしくは４～１２の異なる反応物を含んでいてもよい。色素は、蛍光色素であってもよい。蛍光色素は、蛍光ポリマー色素であってもよい。例えば、それぞれの反応物は、固有の蛍光色素コンジュゲートであってもよい。複数の反応物は、２つまたはそれよりも多くの固有の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含んでいてもよい。基材は、チューブ、ウェル、膜、またはビーズであってもよい。基材は、反応容器の内面を含んでいてもよい。

【0031】

本開示は、本開示の新規方法によって調製される複数の反応物を含む均一フィルムである単一反応物フィルムを提供する。単一反応物フィルムは、液体生体試料の第１のアリコートに曝され、処理され、フローサイトメトリーによって分析された後、第１の反応物および第２の反応物を含む第２の単一反応物フィルムを液体生体試料の第２のアリコートに曝し、処理し、フローサイトメトリーによって分析することによって得られた第２のフローサイトメトリープロットと比較した場合に、単球の非特異的結合の減少；顆粒球の非特異的結合の減少；蛍光色素コンジュゲートの非特異的相互作用の減少；蛍光色素コンジュゲートの凝集の減少のうちの１つまたはそれよりも多くを示す第１のフローサイトメトリープロットを提供し、ここで、第２の単一反応物フィルムは、水溶性モノマーなしおよび両性イオン性界面活性剤なしの従来技術の液相を用いて調製される。蛍光色素コンジュゲートは、蛍光ポリマー色素コンジュゲートであってもよい。

【0032】

本開示に記載の緩衝液組成物は、凝集および結果として生じた他のチャネルへの偽陽性集団を回避しながら、機能性（すなわち、分析物に対する親和性）および物理的性質（明るさまたは蛍光など）を変更することなく、単一チューブ中で異なる蛍光色素コンジュゲートを乾燥して、均一フィルムを提供することを可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1A】図１Ａは、従来の乾燥技術の試薬緩衝液を使用して乾燥された場合のＣＤ４－ＰＥコンジュゲートのフローサイトメトリー密度プロットを示す。所望の機能性（抗原に対する親和性）、物理的性質（明るさまたは蛍光など）、および細胞集団の分離能を示す。

【0034】

【図1B】図１Ｂは、従来の乾燥技術の試薬緩衝液を使用して乾燥された場合のＣＤ２０－ＡＰＣコンジュゲートのフローサイトメトリー密度プロットを示す。所望の機能性（抗原に対する親和性）および物理的性質（明るさまたは蛍光など）および細胞集団の分離能を示す。

【0035】

【図2A】図２Ａは、コンペンセーションなしの従来の乾燥技術の試薬緩衝液を使用して混合および乾燥された場合のＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６ポリマー色素コンジュゲートのフローサイトメトリー二次元ドットプロットを示す。所望されない結果、ならびにｘおよびｙ軸において集団を分離できないことを示した。

【0036】

【図2B】図２Ｂは、コンペンセーションありの従来の乾燥技術の試薬緩衝液を使用して混合および乾燥された場合のＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６ポリマー色素コンジュゲートのフローサイトメトリー結果を示す。集団をコンペンセーションできないことは、２つのポリマー色素が従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合のポリマー色素抗体コンジュゲートの凝集に起因すると見なされた。

【0037】

【図3A】図３Ａは、コンペンセーションなしの安定剤を有するＤＭ ２（ＤＭ２＋Ｓ）ＤＭ緩衝液におけるＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６ポリマー色素コンジュゲートのドライダウンのフローサイトメトリー二次元ドットプロットを示す。６１０蛍光チャネルの漏出が、７８０蛍光チャネルにおいて観察される。

【0038】

【図3B】図３Ｂは、コンペンセーションありの本発明のＤＭ緩衝液ＤＭ２＋ＳにおけるＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮ ｖ ７８６ポリマー色素コンジュゲートのドライダウンのフローサイトメトリーの二次元ドットプロットを示す。ＤＭ２＋Ｓ ＤＭ緩衝液は、任意の非特異的相互作用なしで、細胞集団を分離することができる。

【0039】

【図4】図４は、代表的なモノマーＡおよびモノマーＢの化学構造を示す。

【0040】

【図5】図５は、動員パーセンテージを測定し、非特異的事象の低減を実証するための、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５を使用するＤＭにおけるカゼインの用量設定についてのフローサイトメトリーのプロットを示す。

【0041】

【図6】図６は、試験あたり２００μｇ（上側パネル）および４００μｇ（下側パネル）のモノマーＡ濃度での３色試験のための乾燥製剤の二次元蛍光ドットプロットを示す。集団の広がりの低減が、試験あたり４００μｇのモノマーＡで観察された。

【0042】

【図7A】図７Ａは、ＤＭＭＡの用量最適化における散乱性のフロープロットを示す。図７Ａは、未染色（左上）、乾燥ＤＭ単独（左から２番目、上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．００４％（左から３番目、上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．００８％（右上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０１８％（左下パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０２１％（下中央パネル）、およびＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０３％（右下パネル）を示す。０．００４％および０．００８％のＤＭＭＡは、他のＤＭＭＡ濃度と比較して、非特異的好中球のプルアウト（矢印によって示す）が少ないことを示す。

【0043】

【図7B】図７Ｂは、未染色（左上）、乾燥ＤＭ単独（左から２番目、上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．００４％（左から３番目、上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．００８％（右上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０１８％（左下パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０２１％（下中央パネル）、およびＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０３％（右下パネル）を含む、ＤＭ中のＤＭＭＡの用量最適化のためのすべての製剤についてのＣＤ２０－ＳＮｖ６０５のドットプロットを示す。０．００４％、０．００８％および０．０１８％のＤＭＭＡは、ＤＭおよび他のＤＭＭＡ濃度と比較して、６１０チャネルにおける非特異的単球のプルアウト（矢印によって示す）が少ないことを示す。

【0044】

【図7C】図７Ｃは、未染色（左上）、乾燥ＤＭ単独（左から２番目、上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．００４％（左から３番目、上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．００８％（右上パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０１８％（左下パネル）、ＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０２１％（下中央パネル）、およびＤＭ中乾燥ＤＭＭＡ０．０３％（右下パネル）を含む、ＤＭ中のＤＭＭＡの用量最適化のためのすべての製剤についてのＨＬＡＤＲ－７８６のドットプロットを示す。

【0045】

【図7D】図７Ｄは、乾燥ＤＭ単独（左上パネル）、ＤＭ中の乾燥ＤＭＭＡ０．００４％（上中央パネル）、ＤＭ中の乾燥ＤＭＭＡ０．００８％（右上パネル）、ＤＭ中の乾燥ＤＭＭＡ０．０１８％（左下パネル）、ＤＭ中の乾燥ＤＭＭＡ０．０２１％（下中央パネル）、およびＤＭ中の乾燥ＤＭＭＡ０．０３％（右下パネル）についてのＣＤ２０－６０５およびＨＬＡＤＲ－７８６の二次元ドットプロットを示す。

【0046】

【図8A】図８Ａは、未染色（左上）、乾燥ＤＭ（左から２番目、上パネル）、ＤＭＭＡ０．００８％（右上）、ＤＭＭＡ０．００８％＋カゼイン２．５×（左下）、ＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ２ ｄｉｌ（下中央パネル）、およびＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ３ ｄｉｌ（右下）を含む、０．００８％のＤＭＭＡとの添加剤の組合せについての散乱性のフロープロットを示す。散乱性は、矢印で示されるように、非特異的顆粒球および単球のプルアウトを示すＤＭを除いて、組合せのそれぞれについて類似しているように見える。

【0047】

【図8B】図８Ｂは、単一ＣＤ２０（左上）、乾燥ＤＭ（左から２番目、上パネル）、ＤＭＭＡ０．００８％（右上）、ＤＭＭＡ０．００８％＋カゼイン２．５×（左下）、ＤＭＭＡ０．００２％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ２ ｄｉｌ（下中央パネル）、およびＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ３ ｄｉｌ（右下）を含む、０．００８％のＤＭＭＡとの添加剤の組合せについてのＣＤ２０－ＳＮｖ６０５のドットプロットを示す。

【0048】

【図8C】図８Ｃは、単一ＨＬＡＤＲ（左上）、乾燥ＤＭ（左から２番目、上パネル）、ＤＭＭＡ０．００８％（右上）、ＤＭＭＡ０．００８％＋カゼイン２．５×（左下）、ＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ２ ｄｉｌ（下中央パネル）、およびＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ３ ｄｉｌ（右下）を含む、０．００８％のＤＭＭＡとの添加剤の組合せについてのＨＬＡＤＲ－７８６のドットプロットを示す。ＨＬＡＤＲ＋の動員％は、個々の液体単一と比較して、０．００８％のＤＭＭＡとのすべての組合せにおいて類似していることが見出された。

【0049】

【図8D】図８Ｄは、乾燥ＤＭ（左上パネル）、ＤＭＭＡ０．００８％（右上）、ＤＭＭＡ０．００２％＋カゼイン２．５×（左下）、ＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ２ ｄｉｌ（下中央パネル）、およびＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ３ ｄｉｌ（右下）を含む、０．００８％のＤＭＭＡとの添加剤の組合せについてのＣＤ２０－ＳＮｖ ６０５およびＨＬＡＤＲ－７８６の二次元ドットプロットを示す。０．００８％のＤＭＭＡとのすべての組合せにおける二重陽性集団の動員％は、ＤＭと比較して、類似していることが見出された。

【0050】

【図9】図９は、試験群ＤＭ２＋Ｓ、トレハロース＋モノマー、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋ＤＭＭＡ（左から右、上パネル）、ＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、下パネル）のそれぞれにおける、乾燥チューブの物理的外観および性質を示す。ここで、ＤＭ２＋Ｓは、対照群としての役割を果たす。物理的観察は、モノマーなしで、乾燥フィルムの色の変化（典型的には、赤色フィルムが薄橙色～茶色になる）が存在することを示す。フィルムの収縮が、カゼインおよびＤＭＭＡなしの群において観察された。乾燥フィルムの外観の変化は、ＤＭ２＋Ｓと比較して、ＤＭＭＡなしのチューブにおいて観察されなかった。しかしながら、カゼインなしのチューブは、乾燥フィルムの最低限の収縮を示す。

【0051】

【図10A】図１０Ａは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、トレハロース＋ＤＭＭＡ、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）におけるＣＤ５６－ＳＮｖ４２８についての側方散乱ＳＳＣ対ＦＬプロットを示す。カゼインおよびＤＭＭＡが存在しない場合、非特異的単球のプルアウトが存在する（矢印で示す）。モノマーの非存在は、リンパ球における陰性集団の広がりを引き起こす（矢印で示す）。陰性集団の広がりは、モノマーおよびカゼインの非存在下、ＳＮ色素の間の非特異的相互作用に主に起因する。

【0052】

【図10B】図１０Ｂは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、トレハロース＋ＤＭＭＡ、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）におけるＣＤ２０－ＳＮｖ６０５についての側方散乱ＳＳＣ対ＦＬプロットを示す。カゼインが存在しない場合、非特異的単球のプルアウトが存在する（矢印で示す）。モノマーの非存在は、リンパ球における陰性集団の広がりを引き起こす（矢印で示す）。陰性集団の広がりは、モノマーおよびカゼインの非存在下、ＳＮ色素の間の非特異的相互作用に主に起因する。

【0053】

【図10C】図１０Ｃは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、トレハロース＋ＤＭＭＡ、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）におけるＣＤ４－ＳＮｖ７８６についての側方散乱ＳＳＣ対ＦＬプロットを示す。モノマーの非存在は、リンパ球における陰性集団の広がりを引き起こす（矢印で示す）。

【0054】

【図10D】図１０Ｄは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、トレハロース＋ＤＭＭＡ、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）におけるＣＤ５６－ＳＮｖ４２８対ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５についての二次元フロープロットを示す。モノマーおよびカゼインの非存在は、ＳＮ集団の間の非特異的相互作用／集団の広がり（矢印で示す）を引き起こす。このプロットは、モノマーおよびカゼイン両方が、非特異的相互作用を防止するために重要であることを示す。

【0055】

【図10E】図１０Ｅは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、トレハロース＋ＤＭＭＡ、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）におけるＣＤ４－ＳＮｖ７８６対ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５についての二次元フロープロットを示す。モノマーおよびカゼインの非存在は、ＳＮ集団の間の非特異的相互作用／集団の広がり（矢印で示す）を引き起こす。このプロットは、モノマーおよびカゼイン両方が、非特異的相互作用を防止するために重要であることを図示す。

【0056】

【図10F】図１０Ｆは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、トレハロース＋ＤＭＭＡ、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）におけるＣＤ４－ＳＮｖ７８６対ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８についての二次元フロープロットを示す。モノマーおよびカゼインの非存在は、ＳＮ集団の間の非特異的相互作用／集団の広がり（矢印で示す）を引き起こす。そのため、モノマーおよびカゼイン両方が、非特異的相互作用を防止するために重要である。

【0057】

【図11A】図１１Ａは、ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ａ７５０のゲーティング、本発明のＤＭ２＋Ｓドライダウン緩衝液を有するカクテルにおける乾燥、および血液試料による再構成を含む、３つのポリマー色素コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６についての代表的なＳＳＣ対ＦＬの重ね合わせフロープロットを示す。第２の群では、同じ抗体の液体カクテルを、市販のＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液を使用して調製した。ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液は、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブと比較して、非特異的顆粒球および単球のプルアウト（矢印で示す）を引き起こした。

【0058】

【図11B】図１１Ｂは、本発明のＤＭ２＋Ｓドライダウン緩衝液を用いて乾燥され、血液試料で再構成された、３つのポリマー色素抗体コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６についての代表的な二次元重ね合わせフロープロットを示す。第２の群では、同じ抗体の液体カクテルを、市販のＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液を使用して調製した。ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液は、ＤＭ２＋Ｓと比較した場合に、ＳＮコンジュゲートのすべての組合せにおいて非特異的リンパ球のプルアウト（例えば、ＣＤ５６およびＣＤ２０における非特異的リンパ球のプルアウト）を引き起こした。

【0059】

【図12】図１２は、６か月経過したオープンパウチでのＤＭ２＋Ｓ緩衝液乾燥チューブの写真を示す。

【0060】

【図13A】図１３Ａは、新鮮、３か月経過したおよび６か月経過したＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性を示す。３つのロットのそれぞれにおけるＳＮ色素の異なる組合せについての代表的な二次元重ね合わせフロープロットを示す。乾燥チューブは、１２の異なる結合パートナー色素コンジュゲートを含有する；すなわち、１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）。これらのロットを、１つのフローサイトメーター機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。プロトコールおよび方法で述べる染色－溶解－洗浄プロトコールを、研究のために使用した。これらの重ね合わせは、３か月および６か月熟成したロットにおける集団が、新鮮なロットと完全に重なることを示す。加えて、非特異的相互作用または集団の広がりは、すべての試験ドナーにおいて、６か月熟成されたロットで観察されなかった。

【0061】

【図13B】図１３Ｂは、３か月および新鮮なロットと比較した、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性：３つのロットすべてにおけるＳＮ対古典的組合せについての代表的な二次元重ね合わせフロープロットを示す。１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を含有する乾燥チューブを、１つのフローサイトメトリー機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。ＣＤ３ ＥＣＤ－Ａ対ＣＤ２０Ｖｉｏｌｅｔ６１０－Ａ（左パネル）、ＣＤ８ ＫＯ５２５－Ａ対ＣＤ４Ｖｉｏｌｅｔ７８０－Ａ（中央パネル）、およびＣＤ４５ ＡＰＣ－Ａ７５０－Ａ対ＣＤ５６ＰＢ４５０－Ａ（右パネル）についての６か月および３か月熟成されたロットと新鮮なロットについての重ね合わせフロープロットは、３か月および６か月熟成されたロットにおける集団が、新鮮なロットと完全に重なることを示す。加えて、非特異的相互作用または集団の広がりは、すべての試験ドナーにおいて、６か月経過したロットで観察されなかった。

【0062】

【図13C】図１３Ｃは、３か月および新鮮なロットと比較した、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性：３つのロットすべてにおける古典的対古典的組合せについての代表的な二次元重ね合わせフロープロットを示す。１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を含有する乾燥チューブを、１つのフローサイトメトリー機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。ＣＤ１６ ＦＩＴＣ－Ａ対ＣＤ２５ＰＥ－Ａ（左パネル）、ＣＤ８ ＫＯ５２５－Ａ対ＣＤ４５ＡＰＣ－Ａ７５０－Ａ（中央パネル）、およびＣＤ３ ＥＣＤ－Ａ対ＣＤ１０ＡＰＣ－Ａ（右パネル）についての６か月および３か月熟成されたロットと新鮮なロットについての重ね合わせは、３か月および６か月熟成されたロットにおける集団が、新鮮なロットと完全に重なることを示す。加えて、非特異的相互作用または集団の広がりは、すべての試験ドナーにおいて、６か月経過したロットで観察されなかった。

【発明を実施するための形態】

【0063】

開示の詳細な説明
本開示は、一緒にドライダウンされた場合に、２つまたはそれよりも多くの色素コンジュゲートの凝集を最小化するための組成物および方法を提供する。蛍光色素コンジュゲートの混合物における蛍光色素構造の完全性を維持するのを助け、凝集を減少させ、非特異的相互作用および染色の人為現象を減少させるドライダウン緩衝液組成物が提供される。例えば、ドライダウン緩衝液組成物は、一緒にドライダウンされる場合または再構成の間に、２つまたはそれよりも多くの蛍光ポリマー色素コンジュゲートの凝集を減少させ、または防止するために使用され得る。

【0064】

蛍光色素コンジュゲートの間の凝集は、液体カクテル中で、または蛍光色素コンジュゲートのカクテルを乾燥しながら、または再構成の間に起こり得る。本発明は、例えば、蛍光ポリマー色素コンジュゲートが乾燥の間に相互作用しないように、凝集を減少させ、または回避するためのドライダウン緩衝液組成物を提供することによって課題を解決する。再構成の際に、蛍光色素コンジュゲートは、独立して、分析される液体試料中の標的分析物に結合することができ、凝集または架橋から生じる誤った結果が、実質的に低減または排除される。

【0065】

蛍光色素の非特異的相互作用を減少させ、または排除することができ、目的の抗原に対する蛍光色素コンジュゲートの天然の結合能力も妨げない、新規ドライダウン緩衝液を開発した。

【0066】

図２Ｂおよび図３Ｂは、実施例１に従って、（図２Ｂ）従来のドライダウン技術、および（図３Ｂ）本発明のドライダウン（「ＤＭ」）緩衝液ＤＭ２＋Ｓチューブを使用してドライダウンされ、処理されたＣＤ２０－６０５およびＣＤ４－７８６ポリマー色素コンジュゲートの比較フローサイトメトリードットプロットを示す。図２Ｂは、従来のドライダウン技術を使用してドライダウンされたポリマー色素コンジュゲートが、細胞集団を分離することに失敗したことを示すが、図３Ｂは、本発明のＤＭ緩衝液ＤＭ２＋Ｓが、任意の非特異的相互作用なしで細胞集団を分離することができたことを示す。

【0067】

定義

【0068】

本明細書で使用される場合、以下の用語およびその変形形態は、異なる意味がそのような用語が使用される文脈によって明確に意図されない限り、下記に示される意味を有する。

【0069】

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り、同様に複数の形態を含むことが意図される。

【0070】

「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つまたはそれよりも多くのあらゆる可能な組合せを指し、それを包含する。

【0071】

「約」という用語は、化合物、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値を指す場合、規定された値の１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動、および値を測定するための試験方法における少なくとも業界標準の変動を包含することを意味する。

【0072】

「患者」、「対象（単数）」または「対象（複数）」という用語は、限定されるものではないが、ヒトを含み、この用語は、他の哺乳動物、または家畜動物もしくはエキゾチックアニマル、例えば、イヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、鳥類、または爬虫類も包含し得る。

【0073】

他に規定されない限り、「室温」という用語の語句は、１８～２７℃を指す。

【0074】

他に規定されない限り、「パーセント」または「％」という用語は、重量パーセントを指す。

【0075】

それ自身または別の置換基の一部としての「活性化エステル」または「活性エステル」という用語は、アミノ酸誘導体のカルボキシル基と遊離アミノ基との容易な縮合を促進するために、ペプチド化学において用いられるカルボキシル活性基を指す。これらのカルボキシル活性基の説明は、ペプチド化学の一般的な教科書、例えば、K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin, Inc., New York, 1966, pp. 50-51およびE. Schroder and K. Lubke, "The Peptides"; Vol. 1, Academic Press, New York, 1965, pp. 77-128に見出される。

【0076】

「アシル」という用語は、本明細書で使用される場合、カルボニル部分を含有する基を指し、ここで、基は、カルボニル炭素原子を介して結合している。カルボニル炭素原子は、水素に結合して「ホルミル」基を形成するか、または別の炭素原子に結合しており、これは、アルキル、アリール、アラルキル シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル基などの一部であり得る。アシル基は、カルボニル基に結合した、０～約１２、０～約２０、または０～約４０個の追加の炭素原子を含み得る。アシル基は、本明細書の意味内で、二重または三重結合を含み得る。アシル基は、必要に応じて、本明細書の意味内で、ヘテロ原子も含み得る。アシル基の例としては、限定されるものではないが、ニコチノイル基（ピリジル－３－カルボニル） アセチル、ベンソイル、フェニルアセチル、ピリジルアセチル、シンナモイル、およびアクリルオキシ基などが挙げられる。カルボニル炭素原子に結合している炭素原子を含有する基が、ハロゲンを含有する場合、基は、「ハロアシル」基と称される。例は、トリフルオロアセチル基である。

【0077】

それ自身または別の置換基の一部としての「アルデヒド」という用語は、－ＣＨＯ基を有する化学化合物を指す。

【0078】

それ自身または別の置換基の一部としての「アルケン」または「アルケニル」という用語は、２個の炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を有する、直鎖状、分枝鎖状、または環状炭化水素のいずれかを指す。アルケン基の例としては、限定されるものではないが、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、イソペンテニル、１，３－ペンタジエニル、１，４－ペンタジエニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、１，３－ヘキサジエニル、１，４－ヘキサジエニル、１，５－ヘキサジエニル、２，４－ヘキサジエニル、または１，３，５－ヘキサトリエニルが挙げられる。アルケン基は、典型的には一価であるが、例えば、アルケニル基が２つの部分を一緒に連結する場合、二価であり得る。

【0079】

それ自身または別の置換基の一部としての「アルコキシ」という用語は、アルキル基を結合点に接続する酸素原子を有する、上記に定義されるアルキル基を指す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ－プロポキシ、ブトキシ、２－ブトキシ、イソ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。アルコキシ基は、ここに記載される各種の置換基でさらに置換され得る。例えば、アルコキシ基は、ハロゲンで置換されて、「ハロ－アルコキシ」基を形成することができる。

【0080】

それ自身または別の置換基の一部としての「アルキル」という用語は、示された炭素原子の数を有する直鎖状または分枝状の飽和脂肪族ラジカルを指す。アルキル基は、必要に応じて置換されたアルキル基であり得る。例えば、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。他のアルキル基としては、限定されるものではないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。アルキルは、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、２～３、２～４、２～５、２～６、３～４、３～５、３～６、４～５、４～６および５～６などの任意の数の炭素を含み得る。アルキル基は、典型的には一価であるが、例えば、アルキル基が２つの部分を一緒に連結する場合、二価であり得る。

【0081】

それ自身または別の置換基の一部としての「アルキン」または「アルキニル」という用語は、２個の炭素原子間に少なくとも１つの三重結合を有する、直鎖状または分枝状炭化水素のいずれかを指す。アルキニル基の例としては、限定されるものではないが、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ－ブチニル、ブタジイニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、イソペンチニル、１，３－ペンタジイニル、１，４－ペンタジイニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、１，３－ヘキサジイニル、１，４－ヘキサジイニル、１，５－ヘキサジイニル、２，４－ヘキサジイニル、または１，３，５－ヘキサトリイニルが挙げられる。アルキニル基は、典型的には一価であるが、例えば、アルキニル基が２つの部分を一緒に連結する場合、二価であり得る。

【0082】

「分析物」という用語は、試料中の分子、化合物、または他の構成要素を指す。分析物としては、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、有機分子、糖および他の炭水化物、ならびに脂質が挙げられ得る。

【0083】

それ自身または別の置換基の一部としての「アミン」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれよりも多くのアミノ基を有する、ここで定義されるアルキル基を指す。アミノ基は、第一級、第二級または第三級であり得る。アルキルアミンは、ヒドロキシ基でさらに置換され得る。本開示において有用なアミンとしては、限定されるものではないが、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、およびエタノールアミンが挙げられる。アミノ基は、アルキルアミンを化合物の残部との結合点に連結し得るか、アルキル基のオメガ位に存在し得るか、またはアルキル基の少なくとも２個の炭素原子で一緒に連結され得る。当業者は、他のアルキルアミンが本開示において有用であることを認識するであろう。

【0084】

「アミノ基」という用語は、プロトン化できない－ＮＲ_３ ^＋を除いて、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲ_２、－ＮＲ_３ ^＋（式中、それぞれのＲは、独立して選択される）の形態およびそれぞれのプロトン化形態の置換基を指す。したがって、アミノ基で置換された任意の化合物は、アミンと見なすことができる。本明細書の意味内の「アミノ基」は、第一級、第二級、第三級、または第四級アミノ基であり得る。「アルキルアミノ」基としては、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびトリアルキルアミノ基が挙げられる。

【0085】

「アミド（ａｍｉｄｅ）」という用語は、一般式ＲＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、有機基または水素原子を表す）を有する、アミン基に結合したカルボニル基を有する官能基を指す。「アミド（ａｍｉｄｏ）」という用語は、アミド（ａｍｉｄｅ）基を含有する置換基を指す。

【0086】

それ自身または別の置換基の一部としての「アンモニウム」という用語は、式ＮＨＲ_３ ^＋（式中、それぞれのＲ基は、独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、またはアルコキシ基である）を有するカチオンを指す。好ましくは、Ｒ基のそれぞれが、水素である。

【0087】

「抗体」という用語は、分析物に特異的に結合する、免疫グロブリンタンパク質またはその断片もしくは誘導体を指す。抗体は、免疫グロブリンのさまざまなクラスおよびアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＭを含む。抗体断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ’分子などの分子を含む。抗体誘導体は、キメラ抗体などの付加または置換を有する抗体またはその断片を含む。抗体は、ヒトもしくは動物起源、組換え法によるハイブリドーマ由来、または当技術分野で公知の任意の他の方法に由来し得る。

【0088】

「アラルキル」という用語は、アルキル基の水素または炭素原子が、本明細書に定義されるアリール基への結合で置き換えられている、本明細書に定義されるアルキル基を指す。代表的なアラルキル基としては、ベンジルおよびフェニルエチル基、ならびに縮合（シクロアルキルアリール）アルキル基、例えば、４－エチル－インダニルが挙げられる。アラルケニル基は、アルキル基の水素または炭素原子が、本明細書に定義されるアリール基への結合で置き換えられている、本明細書に定義されるアルケニル基である。

【0089】

それ自身または別の置換基の一部としての「アリール」という用語は、芳香環アセンブリ中にヘテロ原子を含有しない、環状芳香族炭化水素基を指す。「アリール」基は、６～１６個の環炭素原子を含有する、単環式、または縮合二環式、三環式もしくはそれよりも多くの環式の芳香環アセンブリであり得る。例えば、アリールは、限定されるものではないが、フェニル、アズレニル、ヘプタレニル、ビフェニル、インダセニル、フルオレニル、フェナントレニル、トリフェニレニル、ピレニル、ナフタセニル、クリセニル、ビフェニレニル、アントラセニル、ベンジルまたはナフチルであり得る。「アリーレン」は、アリール基に由来する二価ラジカルを意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ－アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシおよびオキシ－Ｃ_２～Ｃ_３－アルキレンから選択される１つ、２つまたは３つのラジカルによって、一置換、二置換または三置換され得、これらのすべては、必要に応じて、例えば、本明細書の以下で定義されるもの、あるいは１－もしくは２－ナフチル、または１－もしくは２－フェナントレニルでさらに置換される。アルキレンジオキシは、フェニルの２個の隣接する炭素原子に結合した二価置換基、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。オキシ－Ｃ_２～Ｃ_３－アルキレンも、フェニルの２個の隣接する炭素原子に結合した二価置換基、例えば、オキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ－Ｃ_２～Ｃ_３－アルキレン－フェニルの例は、２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イルである。

【0090】

それ自身または別の置換基の一部としての「アリールオキシ」という用語は、Ｏ－アリール基を指し、ここで、アリールは、上記に定義される通りである。アリールオキシ基は、非置換であり得るか、または１つもしくは２つの好適な置換基で置換され得る。「フェノキシ」という用語は、アリールオキシ基を指し、ここで、アリール部分は、フェニル環である。「（ヘテロ）アリールオキシ」という用語は、本明細書で使用される場合、－Ｏ－ヘテロアリール基を意味し、ここで、ヘテロアリールは、下記に定義される通りである。「（ヘテロ）アリールオキシ」という用語は、その部分が、アリールオキシまたは（ヘテロ）アリールオキシ基のいずれかであることを示すために使用される。

【0091】

それ自身または別の置換基の一部としての「ヘテロアリール」という用語は、５～１６個の環原子を含有する、単環式、または縮合二環式もしくは三環式芳香環アセンブリを指し、ここで、環原子のうちの１～４個は、それぞれ、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子である。例えば、ヘテロアリールとしては、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、または例えば、アルキル、ニトロもしくはハロゲンによって置換された、特に、一置換もしくは二置換された、任意の他のラジカルが挙げられる。ピリジルは、２－、３－または４－ピリジル、有利には、２－または３－ピリジルを表す。チエニルは、２－または３－チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは、２－、３－または４－キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは、１－、３－または４－イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくは、それぞれ、３－ベンゾピラニルまたは３－ベンゾチオピラニルを表す。チアゾリルは、好ましくは、２－または４－チアゾリルを表し、４－チアゾリルが最も好ましい。トリアゾリルは、好ましくは、１－、２－または５－（１，２，４－トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは、５－テトラゾリルである。

【0092】

一部の実施形態では、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、または置換された、特に、一置換もしくは二置換されたラジカルのいずれかである。

【0093】

一部の実施形態では、アリールおよびヘテロアリール基についての置換基は、多様であり、ゼロから芳香環系上の空原子価の総数までの範囲の数の、－ハロゲン、－ＯＲ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－Ｒ’、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、－ＮＲ’Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、－Ｎ_３、－ＣＨ（Ｐｈ）_２、パーフルオロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルコキシ、およびパーフルオロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルから選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、独立して、水素、（Ｃ_１～Ｃ_５）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルから選択される。

【0094】

アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて、式－Ｔ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｑ－Ｕ－（式中、ＴおよびＵは、独立して、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＨ_２－または単結合であり、ｑは、０～２の整数である）の置換基で置き換えられていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて、式－Ａ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｂ－（式中、ＡおよびＢは、独立して、－ＣＨ_２－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－または単結合であり、ｒは、１～３の整数である）の置換基で置き換えられていてもよい。そのようにして形成される新しい環の単結合のうちの１つは、必要に応じて、二重結合で置き換えられていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて、式－（ＣＨ_２）_ｓ－Ｘ－（ＣＨ_２）_ｔ－（式中、ｓおよびｔは、独立して、０～３の整数であり、Ｘは、－Ｏ－、－ＮＲ’－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、または－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－である）の置換基で置き換えられていてもよい。－ＮＲ’－および－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－中の置換基Ｒ’は、水素または非置換（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルから選択される。

【0095】

本明細書で使用される場合、それ自身または別の置換基の一部としての「アジドという用語は、構造－Ｎ_３を指す。

【0096】

「結合パートナー」という用語は、分析物に特異的に結合することができる分子を指す。結合パートナーは、抗体もしくはその抗原結合性断片、または他のタンパク質、ペプチド、多糖、脂質、核酸、もしくは核酸アナログ、例えば、オリゴヌクレオチドもしくはＰＮＡ（ペプチド核酸）を含む、多くの異なる種類の分子のいずれかであり得る。

【0097】

それ自身または別の置換基の一部としての「ボロン酸」という用語は、構造－Ｂ（ＯＨ）_２を指す。ボロン酸は、クエンチャーの合成におけるさまざまなステップでボロン酸エステルとして存在し得ることが当業者によって認識される。ボロン酸は、そのようなエステルを含むことを意味する。「ボロン酸エステル（ｂｏｒｏｎｉｃ ｅｓｔｅｒ）」または「ボロン酸エステル（ｂｏｒｏｎａｔｅ ｅｓｔｅｒ）」という用語は、本明細書で使用される場合、－Ｂ（Ｚ^１）（Ｚ^２）部分（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、それぞれの場合におけるホウ素に結合した原子が酸素原子である部分を一緒に形成する）を含有する化学化合物を指す。一部の実施形態では、ボロン酸エステル部分は、５員環である。一部の他の実施形態では、ボロン酸エステル部分は、６員環である。一部の他の実施形態では、ボロン酸エステル部分は、５員環および６員環の混合物である。

【0098】

それ自身または別の置換基の一部としての「カルバメート」という用語は、構造－ＮＲ’’ＣＯ_２Ｒ’（式中、Ｒ’およびＲ’’は、独立して、水素、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルから選択される）を有する官能基を指す。カルバメートの例としては、ｔ－Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ－カルボニル、ａｌｌｏｃ、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９－（２－スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９－（２，７－ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、Ｔｂｆｍｏｃ、Ｃｌｉｍｏｃ、Ｂｉｍｏｃ、ＤＢＤ－Ｔｍｏｃ、Ｂｓｍｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、２－フェニルエチルカルバメート、Ａｄｐｏｃ、２－クロロエチルカルバメート、１，１－ジメチル－２－ハロエチルカルバメート、ＤＢ－ｔ－ＢＯＣ、ＴＣＢＯＣ、Ｂｐｏｃ、ｔ－Ｂｕｍｅｏｃ、Ｐｙｏｃ、Ｂｎｐｅｏｃ、Ｖ－（２－ピバロイルアミノ）－１，１－ジメチルエチルカルバメート、ＮｐＳＳＰｅｏｃが挙げられる。

【0099】

それ自身または別の置換基の一部としての「カルボン酸」という用語は、構造Ｒ－ＣＯＯＨ（式中、Ｒは、原子の炭素含有基である）を指す。

【0100】

それ自身または別の置換基の一部としての「カルボキシレート」という用語は、カルボン酸のコンジュゲート塩基を指し、これは、一般に、式ＲＣＯＯ^－によって表され得る。例えば、「マグネシウムカルボキシレート」という用語は、カルボン酸のマグネシウム塩を指す。それ自身または別の置換基の一部としての本明細書で使用される「カルボン酸エステル」という用語は、カルボン酸に由来する化合物を指し、これは、一般に、式ＲＣＯＯＲ’（式中、Ｒ’は、アルキル、アルケン、アルキン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（非置換アリール）アルキル、および（非置換アリール）オキシ－アルキルまたは原子の他の炭素含有基であり得る）によって表され得る。Ｒ’は、必要に応じて、官能基を含有する。

【0101】

「ＣＤ」という用語は、分化抗原群を指す。

【0102】

「発色団」という用語は、共有結合し得る反応性基（例えば、カルボキシレート部分、アミノ部分、ハロアルキル部分など）を有する化合物を指す。好適な発色団の例としては、限定されるものではないが、米国特許第７，６８７，２８２号；同第７，６７１，２１４号；同第７，４４６，２０２号；同第６，９７２，３２６号；同第６，７１６，９７９号；同第６，５７９，７１８号；同第６，５６２，６３２号；同第６，３９９，３９２号；同第６，３１６，２６７号；同第６，１６２，９３１号；同第６，１３０，１０１号；同第６，００５，１１３号；同第６，００４，５３６号；同第５，８６３，７５３号；同第５，８４６，７３７号；同第５，７９８，２７６号；同第５，７２３，２１８号；同第５，６９６，１５７号；同第５，６５８，７５１号；同第５，６５６，４４９号；同第５，５８２，９７７号；同第５，５７６，４２４号；同第５，５７３，９０９号；および同第５，１８７，２８８号に記載されるものが挙げられ、これらの特許は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0103】

フローサイトメトリーにおける「コンペンセーション」という用語は、蛍光漏出（多重パラメーターのフローサイトメトリーデータのスペクトルの重なり）について補正する数学的プロセスである。例えば、コンペンセーションは、その色素の測定に専念するものを除く、すべての検出器からの任意の所与の蛍光色素のシグナルを除去することによって行われ得る。蛍光色素は、広範囲のスペクトルを有し得るので、それらは、重なり、データ解析の間に所望されない混乱を引き起こし得る。

【0104】

それ自身または別の置換基の一部としての「シクロアルキル」という用語は、３～１２個の環原子を含有するか、または単環式環の示される原子の数の、飽和または部分的に不飽和の、単環式、縮合二環式または架橋多環式の環アセンブリを指し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが挙げられる。二環式および多環式環としては、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが挙げられる。例えば、Ｃ_３～_８シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、およびノルボルナンが挙げられる。

【0105】

それ自身または別の置換基の一部としての「ジアゾニウム塩」という用語は、Ｒ－Ｎ_２ ^＋Ｘ^－（式中、Ｒは、任意の有機基（例えば、アルキルまたはアリール）であり得、Ｘは、無機または有機アニオン（例えば、ハロゲン）である）の構造を有する有機化合物の群を指す。

【0106】

「ＤＭ－２」または「ＤＭ２」という用語は、ＤＭ－２を指す。「Ｓ」という用語は、「ＤＭ２＋Ｓ」緩衝液への言及において、安定剤を指す。「ＤＭ２＋Ｓ」は、本開示の記載のＤＭ緩衝液であり、ここで、例えば、表３に従って、炭水化物安定剤は、トレハロースまたはその水和物であり、水溶性モノマーは、モノマーＡであり、タンパク質安定剤は、カゼインであり、両性イオン性界面活性剤はＤＭＭＡである。

【0107】

「色素コンジュゲート」という用語は、結合パートナーにコンジュゲートされた色素を指す。

【0108】

「蛍光色素」という用語は、光励起の際に再発光することができる、光で励起可能なフルオロフォアを含む色素を指す。「蛍光色素」という用語は、蛍光モノマー性色素および他の従来の蛍光色素の両方を包含する、蛍光ポリマー性色素および蛍光非ポリマー性色素の両方を包含する。例えば、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）（「ＳＮ」）ｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）は、青紫色レーザー（４０５ｎｍ）によって最適に励起され、４１４ｎｍの励起極大、４２８ｎｍの発光ピークを有する蛍光ポリマー色素であり、４５０／５０バンドパスフィルターまたは等価物を使用して検出することができる。ＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６は、コアＳＮ ｖ４２８ポリマー色素に由来するタンデムポリマー色素である。両方とも、４１４ｎｍに極大励起を有する、同じ吸光度特性を共有する。それぞれ、６０５ｎｍおよび７８６ｎｍのＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６についての発光ピークで、それらは、フローサイトメーターの６１０／２および７８０／６０ｎｍバンドパスフィルターを使用して最適に検出される。

【0109】

「フルオロフォア」という用語は、光励起の際に再発光することができる、蛍光化学化合物を指す。フルオロフォアは、典型的には、いくつかの混合芳香族基、またはいくつかのπパイ結合を有する平面および環状分子を含有し得る。

【0110】

それ自身または別の置換基の一部としての「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。

【0111】

それ自身または別の置換基の一部としての「（ヘテロ）アリールアミノ」という用語は、アリール基で置換されたアミンラジカル（例えば、－ＮＨ－アリール）を指す。アリールアミノはまた、アミン基で置換されたアリールラジカル（例えば、－アリール－ＮＨ_２）であってもよい。アリールアミノは、置換または非置換であり得る。

【0112】

本明細書で使用される場合、それ自身または別の置換基の一部としての「ヒドラゾン」という用語は、構造

【化6】

（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）を指す。Ｒは、限定されるものではないが６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む、水溶化ポリマーであり得る。

【0113】

それら自身または別の置換基の一部としての「ヒドラジン」および「ヒドラジド」という用語は、単結合した窒素を含有し、その１つが、第一級アミン官能基である、化合物を指す。

【0114】

「炭化水素」または「ヒドロカルビル」という用語は、炭素および水素原子を含む分子または官能基を指す。この用語は、通常、炭素および水素原子の両方を含むが、水素原子の一部またはすべてが、他の官能基で置換されている、分子または官能基も指し得る。「ヒドロカルビル」という用語は、直鎖状、分枝状または環状炭化水素に由来する官能基を指し、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、アシル、またはそれらの任意の組合せであり得る。ヒドロカルビル基は、（Ｃ_ａ～Ｃ_ｂ）ヒドロカルビル（式中、ａおよびｂは、整数であり、ａ～ｂのいずれかの数の炭素原子を有することを意味する）として示すことができる。例えば、（Ｃ_１～Ｃ_４）ヒドロカルビルは、ヒドロカルビル基が、メチル（Ｃ_１）、エチル（Ｃ_２）、プロピル（Ｃ_３）、またはブチル（Ｃ_４）であり得ることを意味し、（Ｃ_０～Ｃ_ｂ）ヒドロカルビルは、ある特定の実施形態では、ヒドロカルビル基が存在しないことを意味する。ヒドロカルビレン基は、ジラジカル炭化水素、例えば、２つの場所で結合した炭化水素である。

【0115】

「標識された結合パートナー」という用語は、色素にコンジュゲートされている結合パートナーを指す。

【0116】

「リンカー」または「連結」という用語は、２つの基を接続し、長さが１００個またはそれ未満の原子の骨格を有する、連結部分を指す。リンカーまたは連結は、２つの基を接続する共有結合であってもよく、または長さが１～１００個の間の原子の鎖、例えば、長さが１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０個、またはそれよりも長い炭素原子の鎖であってもよく、ここで、リンカーは、直鎖状、分枝状、環状、または単一原子であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、３つまたはそれよりも多くの基を接続する連結部分を指す分枝状リンカーである。ある特定の場合では、リンカー骨格の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはそれよりも多くの炭素原子は、必要に応じて、硫黄、窒素、または酸素ヘテロ原子で置換されていてもよい。一部の実施形態では、リンカー骨格としては、連結官能基、例えば、エーテル、チオエーテル、アミノ、アミド、スルホンアミド、カルバメート、チオカルバメート、尿素、チオ尿素、エステル、チオエステル、またはイミンが挙げられる。骨格原子間の結合は、飽和または不飽和であり得、一部の場合では、１つ、２つ、または３つを超えない不飽和結合がリンカー骨格に存在する。リンカーとしては、例えば、アルキル、アリールまたはアルケニル基を有する、１つまたはそれよりも多くの置換基が挙げられ得る。リンカーとしては、限定されないが、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、第三級アミン、直鎖状または分枝状であり得るアルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）などが挙げられ得る。リンカー骨格としては、環状基、例えば、アリール、複素環、またはシクロアルキル基が挙げられ得、ここで、環状基の２個またはそれよりも多くの原子、例えば、２、３または４個の原子が、骨格に含まれる。リンカーは、切断可能または切断不能であり得る。

【0117】

リンカー部分は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０２０／０１９０２５３Ａ１号に教示されるように、「Ｌ」または「Ａ」に結合することができる。リンカー部分は、スルホンアミド、ジスルホンアミド、セレノミド、スルフィンアミド、スルタム、ジスルフィンアミド、アミド、セレニンアミド、ホスホンアミド、ホスフィンアミド、ホスホンアミデート、または第二級アミンを含み得る。

【0118】

ここに記載されるように、またそれぞれがリンカー部分に関連するように、「スルホンアミド」という用語は、部分－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ－を指し；「ジスルホンアミド」という用語は、部分－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲＳ（Ｏ）_２－を指し；「セレノンアミド」という用語は、部分－Ｓｅ（Ｏ）_２ＮＲ－を指し；「スルフィンアミド」という用語は、部分－Ｓ（Ｏ）ＮＲ－を指し；「ジスルフィンアミド」という用語は、部分－Ｓ（Ｏ）ＮＲＳ（Ｏ）－を指し；「セレニンアミド」という用語は、部分－Ｓｅ（Ｏ）ＮＲ－を指し；「ホスホンアミド」という用語は、部分－ＮＲ－ＰＲ（Ｏ）ＮＲ－を指し；「ホスフィンアミド」という用語は、部分－ＰＲ（Ｏ）ＮＲ－を指し；「ホスホンアミデート」という用語は、部分－Ｏ－ＰＲ（Ｏ）ＮＲ－を指し；「スルタム」という用語は、環状スルホンアミドを指し（例えば、Ｒ基は、アルキレン部分を介して硫黄原子に結合している）；ここで、それぞれの用語について、Ｒ基は、独立して、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、またはアリールである。

【0119】

本明細書で使用される場合、それ自身または別の置換基の一部としての「Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル」という用語は、構造

【化7】

（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0120】

「反応物溶液」という用語は、標識された結合パートナーを含む溶液を指す。一部の実施形態では、標識された結合パートナーに加えて、反応物溶液は、安定剤、塩、緩衝液、界面活性剤、および／または他の試薬をさらに含む。それ自身または別の置換基の一部としての「マレイミド」という用語は、構造

【化8】

（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0121】

「ＭｄＦｌ」または「ＭＤＦｌ」という用語は、蛍光強度中央値を指す。

【0122】

「動員％」という用語は、関連する集団のゲーティングされた細胞の数を指す。

【0123】

「マルチカラー抗体パネル」という用語は、血液を染色し、フローサイトメーターにおいてそれを分析するために直接使用され得る、液体または乾燥フォーマットの複数の異なる蛍光色素コンジュゲート（例えば、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰＥ、ＣＤ２０－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＣ５．５、ＣＤ１６－ＦＩＴＣ、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３－ＥＣＤ、ＣＤ３８－ＰＣ５．５、ＣＤ２７－ＰＣ７、ＣＤ１０－ＡＰＣ、ＣＤ１４－ＡＰＣＡ７００、ＣＤ４５－ＡＡ７５０、ＣＤ８－ＫＲＯ、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６など）を含むカクテルを指す。

【0124】

「マルチカラー乾燥試薬」という用語は、血液を染色し、フローサイトメーターにおいてそれを分析するために直接使用され得る、乾燥フォーマットの異なる蛍光色素コンジュゲート（ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰＥ、ＣＤ２０－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＣ５．５など）のカクテルを指す。ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＥＣＤ、ＰＣ５、ＰＣ５．５、ＰＣ７、ＡＰＣ、ＡＡ７００、ＡＡ７５０、ＰＢＥおよびＫｒＯなどの従来の色素のみを有するマルチカラー乾燥試薬カクテルは、従来の乾燥技術を使用して乾燥され得る。しかしながら、従来の乾燥技術は、カクテル中の複数の蛍光ポリマー色素抗体コンジュゲートを乾燥する間に、無効になることが見出された。これらのポリマー色素コンジュゲートは、非特異的に相互作用する傾向があり、集団の分離において困難さをもたらし、これは、所与の試料中の所望の細胞集団の同定における課題をもたらす可能性がある。

【0125】

本明細書における「多重化」という用語は、複数の分析物を同時にアッセイすることができる、アッセイまたは他の分析方法を指す。

【0126】

「オリゴエーテル」という用語は、エーテル官能性を有する構造繰り返し単位を含有するオリゴマーを指す。本明細書で使用される場合、「オリゴマー」は、同じまたは異なる式の１つまたはそれよりも多くの同定可能な構造繰り返し単位を含有する分子を意味することが理解される。

【0127】

「有機基」という用語は、任意の炭素含有官能基を指す。炭素含有官能基の例としては、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ（カルボニル）基などの酸素含有基；カルボン酸、カルボキシレート、およびカルボン酸エステルを含むカルボキシル基；アルキルおよびアリールスルフィド基などの硫黄含有基；ならびに他のヘテロ原子含有基が挙げられ得る。有機基の非限定的な例としては、ＯＲ、ＯＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｒ、Ｃ（Ｏ）、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、Ｎ（Ｒ）_２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）_２、ＳＯ_３Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｓ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、（ＣＨ_２）_０～２Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ_２）_０～２Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）ＣＯＮ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２Ｒ、Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（ＣＯＲ）ＣＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｒ、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ）Ｒ、Ｃ（＝ＮＯＲ）Ｒ、および置換または非置換（Ｃ_１～Ｃ_１００）ヒドロカルビルが挙げられ、ここで、Ｒは、水素（他の炭素原子を含む例において）または炭素に基づく部分であり得、炭素に基づく部分は、置換または非置換であり得る。

【0128】

「ＰＥＧ」という用語は、式－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）_ｎ－またはその誘導体によって記載されるエチレングリコールモノマー単位に基づく、生体適合性の水溶化線状ポリマーのファミリーである、ポリエチレングリコール、またはポリ（エチレングリコール）を指す。一部の実施形態では、「ｎ」は、１０００もしくはそれ未満、５００もしくはそれ未満、２００もしくはそれ未満、１００もしくはそれ未満、５０もしくはそれ未満、４０もしくはそれ未満、３０もしくはそれ未満、２０もしくはそれ未満、１５もしくはそれ未満、例えば、３～１５、または１０～１５である。ＰＥＧポリマー基は、任意の好都合な長さのものであり得、限定されるものではないが、アルキル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、アシルオキシ、およびアミド末端基および／または置換基を含む、各種の末端基および／またはさらなる置換基を含み得ることが理解される。「ＰＥＧ」の後の数は、平均分子量を指し、Ｍｗは、重量平均分子量を指し、Ｍｎは、数平均分子量を指す。

【0129】

「ＰＢＳ」という用語は、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化カリウム、およびリン酸二水素カリウムを含有し得る水性緩衝液である、リン酸緩衝食塩水を指す。例えば、ＰＢＳは、ｍｉｌｌｉＱ水または脱イオン水、および１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４を含有し得る。ｐＨは、約ｐＨ７．０～７．４であってもよい。ＰＢＳは、アジ化ナトリウムなどのアジドを用いて保存されてもよく、または保存されなくてもよい。ＰＢＳは、等張性溶液である。

【0130】

それ自身または別の置換基の一部としての「ホスホラミド」という用語は、構造

【化9】

（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0131】

それ自身または別の置換基の一部としての「ホスホンアミデート」という用語は、構造

【化10】

（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0132】

それ自身または別の置換基の一部としての「ホスフィンアミド」という用語は、構造

【化11】

（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0133】

「物理的性質」という用語は、蛍光色素コンジュゲートの明るさまたは蛍光、および他のチャネルへのその漏出を含む性質を指す。

【0134】

「ポリマー色素コンジュゲート」という用語は、結合パートナーにコンジュゲートされたポリマー色素を指す。例えば、ポリマー色素コンジュゲートは、限定されるものではないが、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、フルオレン、およびそれらの組合せを含む、モノマーサブユニット有する蛍光ポリマーを含み得る。

【0135】

「実質的に低減された」という用語は、測定可能な量の少なくとも１０％、少なくとも２５％、または少なくとも５０％の低減を指す。

【0136】

「置換、置換された（substituted）」という用語は、本明細書に定義される分子また
は有機基と併せて本明細書で使用される場合、そこに含有される１個またはそれよりも多くの水素原子が、１個またはそれよりも多くの非水素原子によって置き換えられている状態を指す。「官能基」または「置換基」という用語は、本明細書で使用される場合、分子上もしくは有機基上にあり得るか、またはそこで置換され得る、基を指す。置換基または官能基の例としては、限定されるものではないが、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）；ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ（カルボニル）基、カルボン酸、カルボキシレート、およびカルボン酸エステルを含むカルボキシル基などの基中の酸素原子；チオール基、アルキルおよびアリールスルフィド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホンアミド基などの基中の硫黄原子；アミン、ヒドロキシアミン、ニトリル、ニトロ基、Ｎ－オキシド、ヒドラジド、アジド、およびエナミンなどの基中の窒素原子；ならびにさまざまな基中の他のヘテロ原子が挙げられる。置換された炭素（または他の）原子に結合し得る置換基の非限定的な例としては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、ＣＮ、ＮＯ、ＮＯ_２、ＯＮＯ_２、アジド、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｒ、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオノ）、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、Ｎ（Ｒ）_２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）_２、ＳＯ_３Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｓ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、（ＣＨ_２）_０～２Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ_２）_０～２Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）ＣＯＮ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２Ｒ、Ｎ（Ｒ）ＳＯ_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｎ（ＣＯＲ）ＣＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｒ、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ）Ｒ、およびＣ（＝ＮＯＲ）Ｒが挙げられ、ここで、Ｒは、水素または炭素に基づく部分であり得；例えば、Ｒは、水素、（Ｃ_１～Ｃ_１００）ヒドロカルビル、アルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキルであり得るか；または窒素原子にもしくは窒素原子に隣接して結合する２つのＲ基は、窒素原子または原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成し得る。

【0137】

それ自身または別の置換基の一部としてのいずれかの「スルホネート官能基」または「スルホネート」という用語は、遊離スルホネートアニオン（－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｏ－）およびその塩の両方を指す。したがって、スルホネートという用語は、スルホネート塩、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウムおよびアンモニウムスルホネートを包含する。

【0138】

それ自身または別の置換基の一部としての「スルホンアミド」という用語は、式－ＳＯ_２ＮＲ－（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）の基を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0139】

それ自身または別の置換基の一部としての「スルホンアミド」という用語は、式－ＳＯ_２ＮＲ_２（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）の基を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0140】

それ自身または別の置換基の一部としての「スルフィンアミド」という用語は、式－ＳＯＮＲ_２－（式中、Ｒは、例えば、水溶化部分、水素、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アリール、またはその他であり得、カルボキシル基を含有し得る）の基を指す。Ｒは、限定されるものではないが、６つまたはそれよりも多くのモノマー単位を含むポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ＰＥＧ、カルボン酸またはカルボン酸エステルが末端の修飾ＰＥＧを含む水溶化ポリマーであり得る。

【0141】

それ自身または別の置換基の一部としての「シリル」という用語は、Ｓｉ（Ｒ^ｚ）_３（式中、それぞれのＲ^ｚは、独立して、アルキル、アリールまたは原子の他の炭素含有基である）を指す。

【0142】

それ自身または別の置換基の一部としての「チオール」という用語は、硫黄－水素結合から構成される官能基を含有する化合物を指す。チオール官能基の一般化学構造は、Ｒ－ＳＨ（式中、Ｒは、アルキル、アルケン、アリール、または原子の他の炭素含有基を表す）である。

【0143】

「水溶化部分」という用語は、それ自身または別の置換基の一部として本明細書で使用される場合、例えば、生理学的条件下などの水性環境で十分に水和し、それが結合する分子の水溶性を増加させることができる、任意の親水性基を指す。分子の水溶性の増加は、結合する部分に非常に依存し得る。一部の例では、水溶性の増加（結合する部分なしの分子の溶解性と比較した）は、２倍もしくはそれよりも高い、５倍もしくはそれよりも高い、１０倍もしくはそれよりも高い、２５倍もしくはそれよりも高い、５０倍もしくはそれよりも高い、または１００倍もしくはそれよりも高い。「水溶化部分」は、限定されるものではないが、ＰＥＧ基、限定されるものではないが、カルボン酸およびカルボキシレートを含む、カルボキシ基、ポリビニルアルコール、グリコール、ペプチド、ポリホスフェート、ポリアルコール、スルホネート、ホスホネート、ボロネート、アミン、アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、アルコール、両性イオン性誘導体、炭水化物、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、置換ＰＥＧ基、限定されるものではないが、置換カルボン酸および置換カルボキシレートを含む、置換カルボキシ基、置換グリコール、置換ペプチド、置換ポリホスフェート、置換ポリアルコール、置換スルホネート、置換ホスホネート、置換ボロネート、置換アミン、置換アンモニウム、置換スルホニウム、置換ホスホニウム、アルコール、置換両性イオン性誘導体、置換炭水化物、置換ヌクレオチド、置換ポリヌクレオチド、ならびにそれらの組合せなどの部分を含む。

【0144】

「水溶性ポリマー」（ＷＳＰ）という用語は、本明細書で使用される場合、１ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、例えば、３ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、１０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、２０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、３０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、４０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、５０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、６０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、７０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、８０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、９０ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、１００ｍｇ／ｍＬもしくはそれよりも高い、またはさらに高い、本明細書で使用される「水」への溶解度を有するポリマーを指す。水溶性ポリマーが、ある特定の条件下で、水性系において別個の水に水和したナノ粒子を形成し得、凝集に抵抗し得ることが理解される。
反応容器

【0145】

本明細書に開示される「反応容器」は、結合パートナーまたはその色素コンジュゲートと標的分析物との間の反応が起こり得る任意の入れ物であり得る。例えば、反応容器は、チューブ、プレート、マイクロタイタープレートのウェル、チャンバー、およびスライドであり得る。好ましい実施形態では、反応容器は、結合反応が閉鎖環境で起こり得るように、蓋またはキャップを有する。
基材

【0146】

反応容器は、１つまたはそれよりも多くの基材を含む。「基材」は、限定されるものではないが、プラスチック、ニトロセルロース、酢酸セルロース、石英、およびガラスを含む、任意の好適な表面であり得る。プラスチックの非限定的な例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、シクロ－オレフィン、およびポリカーボネートが挙げられ得る。一部の実施形態では、基材は、膜である。基材は、反応容器、例えば、プラスチックチューブまたはマイクロタイタープレートのウェルの本体の内面であり得る。基材はまた、ビーズであり得る。一部の実施形態では、標識された結合パートナー（例えば、膜）を受ける基材の少なくとも１つは、反応容器の本体の内面に結合する。一部の実施形態では、膜基材は、シートまたはロールであり、これは、溶液を預けるのを容易にし、乾燥するのを容易にする。一部の実施形態では、膜は、個々に乾燥された反応物スポットを分けるために切断され得る。一部の実施形態では、切断膜は、反応容器に容易に落とされる。一部の好ましい実施形態では、切断膜は、液体が反応容器にまたはその外にピペッティングされる場合に、膜が容器から逃げないように、反応容器の表面に結合する。

【0147】

頭字語「ＳＮ」は、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）を指す。

【0148】

頭字語「ＳＳＣ」は、側方散乱を指す。

【0149】

「ＷＢＣ」という用語は、白血球を指す。
液体試料

【0150】

反応容器は、液体試料を受けるように構成される。本発明で使用される液体試料は、典型的には、主に水性媒体として得られるか、またはそこに分散された、標的分析物を含む。試料は、生体材料の任意の起源、例えば、直接的にまたは間接的に、生物から得ることができる、タンパク質、炭水化物、またはポリヌクレオチドであり得る。試料としては、例えば、細胞、組織または流体、ならびにウイルス、マイコプラズマ、および化石を含む、その生物によって残された沈着物が挙げられ得る。試料は、全体的にまたは部分的に、合成手段により調製された標的分析物を含んでいてもよい。試料の非限定的な例としては、血液、血清、血漿、尿、精液、乳、痰、粘液、頬スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、吸引物、針生検、例えば、手術または解剖によって得られた組織の切片、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、および尿生殖路の外分泌物、涙液、唾液、腫瘍、器官、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養構成物質の試料（限定されるものではないが、細胞培養培地における細胞の成長から生じる条件付け培地、推定のウイルス感染細胞、組換え細胞、および細胞構成要素を含む）が挙げられる。
標的分析物

【0151】

本発明は、特定の標的分析物の存在、および一部の場合ではその量を検出するように設計される。「標的分析物」という用語は、生体試料において検出される標的分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、有機分子、糖および他の炭水化物、ならびに脂質を指す。標的分析物が、液体試料に含まれ、一部の点でアクセス可能であるか、アクセス可能になって、本発明の分析物特異的結合パートナーに結合することは、本発明の重要な態様である。標的分析物は、生体試料、例えば、血液試料、細胞系開発試料、組織培養試料などにおいて見出され得る。

【0152】

標的分析物は、ビーズ上に存在し得るか、または細胞の表面上に存在およびアクセス可能であり得る。有用な分析物の例としては、限定されるものではないが、以下：１）特異的細胞表面マクロ分子および抗原（ホルモン、タンパク質複合体、および細胞受容体によって認識される分子を含む）、ならびに２）異常なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、または異常な量のある特定のメッセンジャーＲＮＡを含む、透過処理された細胞中の細胞のタンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。これらの分析物の検出は、それらが、各種のがんの初期ステージで見出されるものなどのまれな細胞に含有されるか、および／またはその識別子である状況において特に有用である。
結合パートナー

【0153】

「結合パートナー」という用語は、標的分析物のエピトープに特異的に結合する分子を指す。多くの異なる種類の結合パートナーを、本システムおよび方法において使用することができる。一実施形態では、結合パートナーは、抗体である。特定の分析物に結合するために使用される抗体は、好ましくは、モノクローナルであり、したがって、分析物の単一エピトープに対するものである。モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技法を使用して調製することができ、典型的には、所望の結合特性を有する抗体を産生するＢ細胞系を使用する、ハイブリドーマの作出により調製される。単一エピトープに対する抗体は、他の方法、例えば、組換え法により作製することもできる。一部の実施形態では、ポリクローナル抗体を、本システムおよび方法における特異的結合パートナーとして使用することができる。例えば、結合パートナーは、分析物のエピトープに対して生じるポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体は、当技術分野で公知の方法で、例えば、宿主を免疫化すること、および宿主から血漿または血清を収集することによって、調製することができる。抗体のＦｃ部分を欠いている断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を含む、それらの特異的結合特性を保持する抗体断片も、本発明における特異的結合パートナーとして使用することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、パパインおよびペプシンなどのタンパク質分解酵素でモノクローナル抗体を切断することによって生成することができる。Ｆａｂ’断片は、ジチオスレイトールまたはメルカプトエタノールなどの試薬によるＦ（ａｂ’）２断片の還元的切断によって生成することができる。あるいは、抗体断片は、組換え法を使用して、例えば、ファージディスプレイライブラリーの使用により生成することができる。

【0154】

抗体または抗体断片もしくは誘導体以外の結合パートナーも、本システムおよび方法において使用することができる。例えば、結合パートナーは、核酸または核酸アナログ、例えば、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡプローブであってもよい。一実施形態では、アプタマーを、特異的結合パートナーとして使用することができる。アプタマーは、高い親和性および特異性を有するタンパク質およびペプチドを含む事前選択された標的に結合することができる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子である。標的分析物に結合して、受容体－リガンド、酵素－基質、酵素－阻害剤、および酵素－補因子の対を形成することができる他の結合パートナーも使用することができる。そのような結合パートナー対の具体例としては、炭水化物およびレクチン、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、葉酸および葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２および内因子、プロテインＡおよび免疫グロブリン、ならびにプロテインＧおよび免疫グロブリンが挙げられる。標的分析物と共有結合を形成する結合パートナーも含まれる。
色素

【0155】

「色素」は、検出可能シグナルを提供する部分であり、これは、直接的または間接的のいずれかで、結合パートナーに結合し得るか、またはそれに組み込まれ得る。本発明で使用される色素は、有色性、蛍光性、または発光性であり得、典型的には、フローサイトメーターにおける検出器、例えば、ＰＭＴまたはＡＰＤによって検出される。蛍光色素は、モノマー性またはポリマー性であり得る。モノマー性色素の非限定的な例としては、フルオレセイン、ローダミン、およびシアニンが挙げられる。例えば、一般に使用されるモノマー性色素蛍光色素としては、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）（励起極大４９４ｎｍ／発光極大５２０ｎｍ）、ＰＥ（Ｒ－フィコエリトリン）（励起極大４９６ｎｍ／発光極大５７８ｎｍ）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）（励起極大６５０ｎｍ／発光極大６６０ｎｍ）、およびＰｅｒＣＰ（植物プランクトンに由来するカロテノイド－タンパク質複合体）（励起極大４８２ｎｍ／発光極大６７８ｎｍ）、Ｃｙ５．５（シアニン色素）（励起極大６７５ｎｍ／発光極大６９４ｎｍ）が挙げられ得る。他のシアニン色素は、２－、３－、５－、または７－メチン構造から合成され得、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、およびＣｙ７．ＰＣ５．５を含み得る。蛍光色素は、タンデム色素であってもよい。タンデム色素としては、ＰＥ－Ｃｙ５．５タンデム（励起極大５６６ｎｍ／発光極大６７１ｎｍ）、ＡＰＣ－Ｃｙ５．５タンデム（励起極大６５６ｎｍ／発光極大７００ｎｍ）、およびＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５タンデム（励起極大４８９ｎｍ／発光極大６７９ｎｍ）が挙げられ得る。

【0156】

蛍光色素は、蛍光ポリマー色素であってもよい。蛍光ポリマー性色素は、化学的および生物学的標的の分析のために特に有用である。それらは、それらが含む複数の発色団のおかげで、非常に反応性の光学的レポーターおよび効率的な光吸収材である。蛍光ポリマー性色素の例としては、限定されるものではないが、発色団の繰り返し単位を有するコンジュゲートされたポリマー、コンジュゲートされた分子の凝集体、側鎖を介して飽和ポリマーに結合した発光色素、半導体量子ドット、および樹状構造が挙げられる。米国特許第７，２１４，４８９号、同第８，３５４，２３９号、同第８，５７５，３０３号に開示される蛍光ポリマー性およびモノマー性色素も、本出願のために使用することができる。

【0157】

一部の場合では、蛍光色素は、式（ＩＶ）：

【化12】

（式中、
それぞれのＡは、独立して、芳香族コモノマーおよびヘテロ芳香族コモノマーからなる群から選択され；
それぞれのＬは、リンカー部分であり；
それぞれのＭは、独立して、芳香族コモノマー、ヘテロ芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されたエチレン、およびエチニレンからなる群から選択され；
Ｇ^１およびＧ^２は、独立して、未修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から選択され；
ａ、ｃ、およびｄは、独立して、構造内のそれぞれの単位のモル％を定義し、それぞれの単位が均等にまたはランダムに繰り返され得、ここで、それぞれのａは、１０～１００％のモル％であり、それぞれのｃは、０～９０％のモル％であり、それぞれのｄは、０～２５％のモル％であり；
それぞれのｂは、独立して、０または１であり；
ｍは、１～約１０，０００の整数である）
に記載の構造を有する蛍光ポリマー色素であってもよい。

【0158】

Ｌは、ポリマー主鎖にそって均等にまたはランダムに分布するアリールまたはヘテロアリール基を含むリンカー部分であってもよく、別の基材、アクセプター色素、分子または結合剤へのコンジュゲーションのための、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびそれらの保護基からなる群から選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されていてもよい。

【0159】

蛍光ポリマー色素は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０／０１９０２５３号に記載されるように、結合パートナーにコンジュゲートして、例えば、モノマーＡサブユニットおよびモノマーＢサブユニットを有する蛍光ポリマー色素コンジュゲートを形成してもよい。蛍光ポリマー色素コンジュゲートは、式Ｖ：

【化13】

（式中、
それぞれのＡは、独立して、芳香族コモノマーおよびヘテロ芳香族コモノマーからなる群から選択され；
Ｌ^１、Ｌ^２、およびＬ^３は、リンカー部分であり；
Ｗは、水溶化部分であり；
それぞれのＥは、独立して、選択された発色団、機能性部分、または結合パートナーであり；
それぞれのＢは、独立して、芳香族コモノマー、ヘテロ芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されたエチレン、およびエチニレンからなる群から選択され；
Ｇ^１およびＧ^２は、独立して、未修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から選択され；
下付き文字ｎおよびｍは、独立して、１～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｐは、０～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｎ、ｍ、およびｐの合計は、２～１０，０００の範囲であり；
下付き文字ｑは、１、２、３、または４であり；
下付き文字ｒは、１、２、３、または４であり；
下付き文字ｓは、０、１、２、または３であり；
下付き文字ｔは、１または２であり、
下付き文字ｒおよびｓの合計は、１～４の範囲であり；
ＡおよびＢは、コンジュゲートされたポリマー中でランダムにまたは非ランダムに分布している）
の構造を有していてもよい。

【0160】

蛍光色素は、水溶性モノマーＡサブユニットおよびモノマーＢサブユニットを有する蛍光ポリマー色素であってもよい。ポリマー色素は、水溶性蛍光ポリマー色素であってもよい。例えば、モノマーＡまたはモノマーＢは、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）部分を含んでいてもよい。モノマーＡまたはモノマーＢは、フルオレン部分を含んでいてもよい。一部のコンジュゲートされたポリマー色素では、モノマーＢは、ポリマーのバンドギャップを変更するために使用され得る。モノマー単位は、水溶性であってもよく、例えば、１つもしくはそれよりも多く、または２つもしくはそれよりも多くの水溶化部分（Ｗ）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を含む。一部の実施形態では、モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、水溶性モノマー分子である。水溶性モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、ＤＨＰ部分、および１つもしくはそれよりも多く、または２つもしくはそれよりも多くのＰＥＧ部分を含んでいてもよい。水溶性モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、スルホンアミド基を介して結合した可溶化ＰＥＧ部分とともに、ＤＨＰ部分を含んでいてもよい。

【0161】

ＤＨＰ部分を含む水溶性モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、式（Ｉ）：

【化14】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、水素、アルキル、ＰＥＧ、ハロゲン、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびそれらの保護基から選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、水溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホラミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化15】

からなる群から選択され；
；
それぞれのＲ^３は、水溶化部分であり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＲ^４、または－ＣＨ_２であり；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の構造を有していてもよい。

【0162】

一部の実施形態では、ＤＨＰ部分を含む水溶性モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、式（ＩＩＩ）：

【化16】

（式中、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であり；それぞれのＺは、独立して、Ｏ、ＣＨ_２、およびＮＨからなる群から選択され；それぞれのＲ_１は、独立して、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_３）であり；それぞれのＲ_２は、独立して、Ｈ、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_６）であり；それぞれのｎは、独立して、１～６であり；それぞれのｍは、独立して、５～５０である）
に記載の化学構造を有していてもよい。一部の実施形態では、Ｇ_１、Ｇ_２は、それぞれ、Ｂｒであり；それぞれのＺは、Ｏであり；それぞれのＲ_１は、ＣＨ_３であり；それぞれのＲ_２は、Ｈであり；それぞれのｎは、独立して、２～４であり；それぞれのｍは、独立して、５～２０である。一部の実施形態では、それぞれのｎは、３であり；それぞれのｍは、１１である。

【0163】

水溶性モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、フルオレン部分、および１つもしくはそれよりも多く、または２つもしくはそれよりも多くのＰＥＧ部分を含んでいてもよい。フルオレン部分を含む水溶性モノマーＡまたはモノマーＢは、それぞれ独立して、式（ＩＩ）：

【化17】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびそれらの保護基から選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＸは、ＣまたはＳｉであり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の構造を有していてもよい。

【0164】

蛍光ポリマー色素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１９／０１４４６０１号に開示される任意の色素であってもよい。蛍光ポリマー色素は、例えば、式ＶＩ：

【化18】

（式中、
それぞれのＸは、独立して、ＣおよびＳｉからなる群から選択され；
それぞれのＹは、独立して、結合、ＣＲ^１Ｒ^２およびＳｉＲ^１Ｒ^２からなる群から選択され；
Ｙが結合である場合、Ｘは、両方の環に直接結合し；
それぞれのＲ^１は、独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、および

【化19】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、および

【化20】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^３は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、およびＰＥＧからなる群から選択され；それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＨ、ＮＲ^４、およびＣＨ_２からなる群から選択され；
それぞれのＭは、独立して、ポリマーのバンドギャップを変更することができる電子リッチリンカー単位であり、ポリマー主鎖に沿って均等にまたはランダムに分布しており；
それぞれのＲ^４は、１０ｍｇ／ｍＬの場合に、過剰に水への溶解性を付与することができる非イオン性側鎖であり、それぞれ独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（式中、それぞれのｘ’は、独立して、０～２０の整数であり；それぞれのｙ’は、独立して、０～５０の整数である）、およびＣ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基からなる群から選択され；
それぞれの必要に応じたリンカーＬは、ポリマー主鎖に沿って均等にまたはランダムに分布したアリールまたはヘテロアリール基であり、別の基材、アクセプター色素、分子または結合剤へのコンジュゲーションのための、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびそれらの保護基からなる群から選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されていてもよく；
それぞれのＧ^１およびＧ^２は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、基材または結合剤へのコンジュゲーションのための、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびそれらの保護基から選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリール（hetroaryl）
からなる群から選択され；
ａ、ｃ、およびｄは、構造内のそれぞれの単位のモル％を定義し、それぞれの単位が均等にまたはランダムに繰り返され得、ここで、ａは、１０～１００％のモル％であり、ｃは、０～９０％のモル％であり、それぞれのｄは、０～２５％のモル％であり；
それぞれのｂは、独立して、０または１であり；
ｍは、１～約１０，０００の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
の構造を有する青紫色蛍光ポリマー色素であってもよい。

【0165】

一部の場合では、それぞれのＭは、独立して、

【化21】

（式中、それぞれのＲ^４は、１０ｍｇ／ｍＬの場合に、過剰に水への溶解性を付与することができる非イオン性側鎖であり、それぞれ独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（式中、それぞれのｘ’は、独立して、０～２０の整数であり；それぞれのｙ’は、独立して、０～５０の整数である）、およびＣ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基からなる群から選択される）
からなる群から選択されてもよい。

【0166】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＶＩＩ：

【化22】

（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｚ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎは、前に定義された通りである）
の構造を有していてもよい。

【0167】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＶＩＩＩ：

【化23】

（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｚ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎは、前に定義された通りであり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択される）
の構造を有していてもよい。

【0168】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＩＸ：

【化24】

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５ Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ、Ｚ、ａ、ｂ、ｄ、ｆ、ｍおよびｎは、前に定義された通りである）
の構造を有していてもよい。

【0169】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式Ｘ：

【化25】

（式中、Ｇ^１、Ｇ^２、ａ、ｆ、およびｎは、前に定義された通りである）
の構造を有していてもよい。

【0170】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＸＩ：

【化26】

（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｚ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎは、前に定義された通りであり；
ｇおよびａは、一緒に、１０～１００％のモル％である）
の構造を有するコポリマーであってもよい。

【0171】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＸＩＩ：

【化27】

（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｚ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍおよびｎは、前に定義された通りであり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｇおよびａは、一緒に、１０～１００％のモル％である）
の構造を有するコポリマーであってもよい。

【0172】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＸＩＩＩ：

【化28】

（式中、
Ｘ、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ、Ｚ、ａ、ｂ、ｄ、ｆ、ｍおよびｎは、前に定義された通りであり；
それぞれのｇおよびａは、一緒に、１０～１００％のモル％である）
の構造を有するコポリマーであってもよい。

【0173】

一部の場合では、蛍光ポリマー色素は、式ＸＩＶ：

【化29】

（式中、
Ｇ^１、Ｇ^２、ａ、ｆ、およびｎは、前に定義された通りであり；
それぞれのｇおよびａは、一緒に、１０～１００％のモル％である）
の構造を有するコポリマーであってもよい。

【0174】

蛍光ポリマー色素は、モノマーＡおよびモノマーＢなどの水溶性モノマーの重合によって調製されてもよく、これは、高度にコンジュゲートされた蛍光骨格の形成をもたらす。キャッピングが、適切な官能性を使用する活性化によってポリマーに対して行われてもよく、これは、結合パートナーにコンジュゲートすることができるポリマーをもたらす。あるいは、モノマーＡまたはモノマーＢは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０／０１９０２５３号に従って、適切な官能性を使用する活性化によって直接修飾されてもよい。活性化されたポリマーは、結合パートナーにコンジュゲートされていてもよい。任意の適切な結合パートナー、例えば、抗体を用いてもよく、続いて、例えば標準的な手順を使用することによって、精製されてもよい。

【0175】

ポリマー色素は市販されている。例えば、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）（「ＳＮ」）ｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）は、青紫色レーザー（４０５ｎｍ）によって最適に励起され、４１４ｎｍの励起極大、４２８ｎｍの発光ピークを有するポリマー色素であり、４５０／５０バンドパスフィルターまたは等価物を使用して検出することができる。ＳＮ ｖ４２８は、タンデム色素のためにアミンにより活性化され、続いてタンデムコンジュゲートのために活性化され得る明るいポリマー色素である。ポリマー色素の構造の剛性は、より明るい発光をもたらす回転エネルギーを低減するのを助け得る。これは、最適化されたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）効率および安定性の増加を達成するのを助け得る。

【0176】

ＳＮ ｖ４２８は、青紫色レーザーによって励起可能な最も明るい色素の１つであり、そのため、これは、ぼんやりと発現されるマーカーを評価するために特に適している。ＳＮがコンジュゲートされた抗体としては、抗ＣＤ１９抗体－ＳＮ ｖ４２８、抗ＣＤ２２抗体－ＳＮ ｖ４２８、抗ＣＤ２５抗体－ＳＮ ｖ４２８、および抗ＣＤ３８抗体－ＳＮ
ｖ４２８抗体－ポリマー性色素コンジュゲートが挙げられ得る。ＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）は、コアＳＮ ｖ４２８ポリマー色素に由来するタンデムポリマー色素である。両方とも、４１４ｎｍに極大励起を有する、同じ吸光度特性を共有する。それぞれ、６０５ｎｍおよび７８６ｎｍのＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６についての発光ピークで、それらは、フローサイトメーターの６１０／２および７８０／６０ｎｍバンドパスフィルターを使用して最適に検出される。

【0177】

蛍光ポリマー色素は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｂｌｕｅ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）ＶｉｏｌｅｔおよびＢｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ色素を含む、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから市販されている蛍光ポリマー性色素であってもよい。蛍光ポリマー色素は、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ４３６、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ６００、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ６４５、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ７０２、およびＳｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ７８０色素を含む、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている蛍光ポリマー性色素であってもよい。
水溶性モノマー

【0178】

「水溶性モノマー」は、それぞれ必要に応じて、それらに結合した１つまたはそれよりも多くの水溶化部分を有する、アリール部分またはヘテロアリール部分を含むモノマー単位であってもよい。水溶性部分は、１つまたはそれよりも多くのＰＥＧ部分であってもよい。水溶性モノマーは、モノマーＡサブユニット、モノマーＢサブユニット、またはモノマーＡおよびモノマーＢサブユニットの組合せを有する複数の蛍光ポリマー色素のうちの少なくとも１つの調製における使用のために適切であり得る。水溶性モノマーは、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系水溶性モノマーであってもよい。水溶性モノマーは、フルオレン系水溶性モノマーであってもよい。

【0179】

水溶性モノマーは、式（Ｉ）：

【化30】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、水溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホラミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化31】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^３は、水溶化部分であり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＲ^４、または－ＣＨ_２であり；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系モノマーであってもよい。

【0180】

水溶性モノマーは、式（ＩＩ）：

【化32】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＸは、ＣまたはＳｉであり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の構造を有するフルオレン系モノマーであってもよい。

【0181】

水溶性モノマーは、式（ＩＩＩ）：

【化33】

（式中、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であり；それぞれのＺは、独立して、Ｏ、ＣＨ_２、およびＮＨからなる群から選択され；それぞれのＲ_１は、独立して、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_３）であり；それぞれのＲ_２は、独立して、Ｈ、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_６）であり；それぞれのｎは、独立して、１～６であり；それぞれのｍは、独立して、５～５０である）
に記載の化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系モノマーであってもよい。一部の実施形態では、Ｇ_１、Ｇ_２は、それぞれ、Ｂｒであり；それぞれのＺは、Ｏであり；それぞれのＲ_１は、ＣＨ_３であり；それぞれのＲ_２は、Ｈであり；それぞれのｎは、独立して、２～４であり；それぞれのｍは、独立して、５～２０である。一部の実施形態では、それぞれのｎは、３であり；それぞれのｍは、独立して、１１または１２である。
標識された結合パートナー

【0182】

色素は、結合パートナーおよび標識中に位置する反応性対の間のさまざまな連結化学によって結合パートナーにコンジュゲートされ得る。反応性対としては、限定されるものではないが、マレイミド／チオール、スクシミジルエステル（ＮＨＳエステル）／アミン、アジド化学、カルボキシ／ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／アミン、アミン／スルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート）／チオール、およびアミン／ＢＭＰＨ（Ｎ－［^～－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド．ＴＦＡ）／チオールが挙げられ得る。

【0183】

蛍光ポリマー色素は、コンジュゲーションを提供する官能基を含むことができるコンジュゲートされたポリマー鎖上の末端を特徴とする。一部の場合では、そのような官能性は、末端リンカーと称する。これらの末端リンカーにより、共有結合が形成されて、例えば、タンパク質、ペプチド、親和性リガンド、抗体、抗体断片、ポリヌクレオチド、またはアプタマーなどの結合パートナーが結合し得る。加えて、オルトゴナルな官能基は、ドナーアクセプターポリマー性タンデム色素中のアクセプターシグナリング発色団のコンジュゲーションまたは結合のいずれかのために使用され得るコンジュゲートされたポリマー鎖に沿って挿入され得る。

【0184】

コンジュゲーションを行うための方法は、当技術分野において周知である。コンジュゲーションを行うための市販のキットはまた、例えば、Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏ．）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）から容易に入手可能である。
ドライダウンプロセス

【0185】

乾燥試薬技術を、生体分子の安定性を増加させるために使用し得る。乾燥プロセスは、例えばチューブの底で、均一な試薬層を作出するために使用され得る。乾燥試薬は、冷蔵保存は必要としない。乾燥試薬は、室温で保管されてもよい。抗体パネルは、単回使用カクテルで供給されてもよい。抗体パネルは、チューブまたはプレートフォーマットを含む各種の基材において提供されてもよい。試薬は、コンジュゲートされた抗体を乾燥するため、それらを室温での保管のために安定化するために、使用され得る。試薬フォーマットは、抗体カクテルを作出する異なる試薬を組み合わせるために適合され得る。抗体カクテルは、多重性の抗体－色素コンジュゲート、例えば、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、または１２もしくはそれよりも多くの抗体コンジュゲート、または１～２０、２～１５、または３～１２の異なる抗体－色素コンジュゲートを含んでいてもよい。

【0186】

乾燥試薬技術は、カクテルを有する一覧のビーズを乾燥する能力を可能にし得る。抗体－色素および抗体－ポリマー色素コンジュゲートを含む結合パートナー－色素コンジュゲートは、フローサイトメトリーアッセイにおいて使用され得る。チューブまたはウェルの底で均一な層を作出する試薬を乾燥する任意の適切な乾燥プロセスが用いられ得る。

【0187】

犠牲タンパク質、炭水化物安定剤、抗菌剤および緩衝剤を含む先行技術の「試薬緩衝液」製剤（ＲＢ）は、機能性（抗原に対する親和性）および物理的性質（明るさまたは蛍光など）を変更することなく、単一チューブ中で異なるモノマー性コンジュゲート色素を乾燥するために以前に開発された。従来技術のＲＢ製剤は、両性イオン性界面活性剤または水溶性モノマーを含まない。物理的性質は、コンジュゲートの明るさ、および他のチャネルへのその漏出を指す。

【0188】

図１Ａに図示されるように、所望の機能性、物理的性質、およびＣＤ４ ＰＥ単球およびＣＤ４ ＰＥ＋リンパ球細胞集団の分離を含めて、モノマー性ＣＤ４－ＰＥ色素コンジュゲートを使用する所望のフローサイトメトリー結果が、従来のドライダウン技術を使用して乾燥され、血液試料で再構成される場合に示される。同様に、図１Ｂに図示されるように、所望の機能性、物理的性質、およびＣＤ２０ ＡＰＣ＋細胞集団の分離を含めて、モノマー性ＣＤ２０ ＡＰＣ色素コンジュゲートの所望のフローサイトメトリー結果が、先行技術の技術を使用して乾燥され、血液試料で再構成される場合に示される。

【0189】

ＲＢなどの従来の乾燥技術は、チューブ中で２つまたはそれよりも多くのポリマー色素コンジュゲートをドライダウンするために使用される場合に、ポリマー構造の完全性を変更し、ポリマー色素コンジュゲートの凝集をもたらすことが見出された。凝集は、非特異的相互作用を増加させ、染色の人為現象を作出する。図２Ａおよび２Ｂは、従来技術が、２つのポリマー色素コンジュゲートが従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合に、ポリマー色素コンジュゲートの凝集に起因して、ポリマー色素を使用して染色された細胞集団を分離することができないことを表す。

【0190】

図２Ａは、コンペンセーションなしの、混合され、従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合のＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６ポリマー色素抗体コンジュゲートの所望されないフローサイトメトリー結果を示す。非特異的相互作用、ならびにｘおよびｙ軸において集団を分離できないことを示した。

【0191】

図２Ｂは、コンペンセーションありの、混合され、従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合のＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６ポリマー色素抗体コンジュゲートの所望されないフローサイトメトリー結果を示す。非特異的相互作用を防止できないことは、２つのポリマー色素が、従来の乾燥技術を使用して乾燥された場合のポリマー色素抗体コンジュゲートの凝集に起因すると見なされた。

【0192】

したがって、乾燥の間に、蛍光色素コンジュゲートを安定に保ち、凝集を減少させるために、新しい緩衝液組成物についての必要性が存在する。

【0193】

上記で述べた技術的課題を克服するために、最初に、蛍光色素コンジュゲートは、混合された場合に、その液体状態で安定でなければならない。２つの蛍光色素コンジュゲートの混合物は、液体状態でさえ、一緒に混合された場合に、非特異的相互作用の増加をもたらすことが見出されたが、漏出はコンペンセーションできた。液体状態での限界を克服するために、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ、カタログ番号：５６３７９４）およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製（Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、カタログ番号：ＳＢ－４４０１－４２）を含む、市販の緩衝液を試験した。ポリマー色素コンジュゲートの乾燥の間のＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ ＢｕｆｆｅｒまたはＳｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの使用は、低い安定性および凝集の課題を解決しなかった。

【0194】

他の技法を、蛍光色素コンジュゲートを乾燥するために適合させ、これは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１９／０２４２８８２号に記載されるように、別々での基材上の蛍光色素コンジュゲートの膜固定化を含んでいた。これらの試みから、蛍光色素コンジュゲートは、基材膜上で、別々に異なるスポットで乾燥できたが、２つの蛍光色素コンジュゲートは、混合および乾燥できなかったと結論付けた。ポリマー色素コンジュゲートを別々に乾燥する不利益は、セルロース膜上で蛍光色素コンジュゲートを乾燥することが、現在の乾燥技法からの逸脱、ＤＵＲＡＣｌｏｎｅ（商標）チューブ基材の内側でセルロース膜を維持する不都合、および高コンペンセーション値による他のチャネルにおける漏出の許容を含むという事実を含む。これらの実験は、乾燥プロセスの間に障壁を形成し、それぞれの蛍光色素コンジュゲートの個別化を防止する緩衝液の存在下でのみ、１つよりも多くの蛍光色素コンジュゲートを乾燥することができたことを示した。

【0195】

蛍光色素コンジュゲートは、マルチカラー乾燥試薬（例えば、ＤＵＲＡＣｌｏｎｅ（商標）チューブ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）において用いられてもよい。マルチカラー乾燥試薬は、血液を染色し、フローサイトメーターにおいてそれを分析するために直接使用され得る、異なる蛍光色素コンジュゲート（ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰＥ、ＣＤ２０－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＣ５．５など）のカクテルである。既存のモノマー性コンジュゲート色素と比較して、ポリマー色素コンジュゲートは、その構造および複雑性において相違する。

【0196】

異なるコンジュゲートを用いるマルチカラー乾燥試薬カクテルを達成するために、従来の乾燥技術が用いられる。従来の色素、例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＥＣＤ、ＰＣ５、ＰＣ５．５、ＰＣ７、ＡＰＣ、ＡＡ７００、ＡＡ７５０、ＰＢＥおよびＫｒＯは、従来の乾燥技術を使用して乾燥され得る。

【0197】

ポリマー色素コンジュゲートの導入により、従来の乾燥技術は、カクテル中の複数のポリマー色素抗体コンジュゲートを乾燥する間に、無効になることが見出された。これらのポリマー色素コンジュゲートは、非特異的に相互作用する傾向があり、集団の分離において困難さをもたらし、これは、所与の試料中の所望の細胞集団の同定における課題をもたらす可能性がある。
組成物

【0198】

従来の乾燥技術の限界を克服するために、色素カクテル中で１つまたはそれよりも多くの蛍光（ポリマーまたはモノマー）色素コンジュゲートを乾燥するために使用され得る、新規「乾燥ミックス（Ｄｒｙ Ｍｉｘ）」（「ＤＭ」）緩衝液を開発した。色素カクテルは、１つよりも多くの蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含んでいてもよい。色素カクテルは、１つよりも多くの従来の非ポリマー蛍光色素コンジュゲートを含んでいてもよい。色素カクテルは、１つまたはそれよりも多くの蛍光ポリマー色素コンジュゲート、および１つまたはそれよりも多くの従来の非ポリマー蛍光色素コンジュゲートの組合せを含んでいてもよい。

【0199】

蛍光色素コンジュゲートは、カクテル中の他の従来の色素と一緒に乾燥されてもよい。いくつかの構成要素を、実施例１のプロトコールに従って、ＤＭ緩衝液製剤における使用のために評価した。ＤＭ緩衝液の開発の間に評価されたこれらの構成要素に対する実験の結果を、表１に示す。

【0200】

本発明のＤＭ緩衝液製剤は、典型的には、水溶性モノマー、タンパク質安定剤、炭水化物安定剤、両性イオン性界面活性剤、および必要に応じて着色剤、および必要に応じて保存剤を含む、水溶液である。

【0201】

溶液中で使用される安定剤としては、タンパク質安定剤（例えば、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン）、および炭水化物安定剤（例えば、トレハロース、デキストロース、スクロース）が挙げられ得る。一部の実施形態では、安定剤は、乾燥構成要素の基材への結合を容易にし得、その結果、安定剤は、反応容器を開けたときに、チューブの底に残ったままで、吹き飛ばされないか、またはキャップに付かないであろう。ＤＭ緩衝液組成物は、試験あたり、２００～８００μｇの水溶性モノマー；２０００～３０００μｇの炭水化物安定剤；８．４～７２μｇのタンパク質安定剤；および２～１５μｇの両性イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。
希釈剤

【0202】

ＤＭ緩衝液のための希釈剤は、水および等張緩衝液からなる群から選択されてもよい。水は、脱イオン水（ＤＩ水）であってもよい。等張緩衝液は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液であってもよい。
タンパク質安定剤

【0203】

「タンパク質安定剤」という用語は、非特異的結合を低減する、例えば、細胞間相互作用を低減する、または抗体と非標的分子との間の非特異的結合を阻止する助けになるのに役立つタンパク質を指す。タンパク質安定剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、さまざまなゼラチン、およびカゼインを含んでいてもよい。さまざまなタンパク質安定剤は、表１に示されるように、ＤＭ緩衝液組成物において評価された。タンパク質安定剤は、カゼインであってもよい。タンパク質安定剤は、ゼラチンであってもよい。一部の実施形態では、タンパク質安定剤は、ＢＳＡであってもよい。一部の実施形態では、タンパク質安定剤は、ＢＳＡではない。ドライダウン緩衝液は、１つまたはそれよりも多くのタンパク質安定剤を含んでいてもよい。

【0204】

ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎまたはｇｅｌａｔｉｎｅ）は、通常、動物の身体のパーツから採取されたコラーゲンに由来するタンパク質である。これは、乾燥するともろく、湿るとベタベタする。これは、加水分解を受けた後、加水分解コラーゲン、コラーゲン加水分解物、ゼラチン加水分解物、加水分解ゼラチン、およびコラーゲンペプチドと称されることもある。Ａ型ゼラチン、Ｂ型ゼラチン、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）高精製Ａ型ゼラチン、およびゼラチン－冷水魚を含む、いくつかの種類のゼラチンが市販されている。これらのそれぞれは、候補ＤＭ緩衝液構成要素として評価された。表１に報告されるように、乾燥フォーマットのＡ型ゼラチンは、対応する液体カクテルと比較して、より広い陰性集団の広がりを示した。Ｂ型ゼラチン乾燥ミックスは、非特異的相互作用を防止することができたが、ストックの調製は困難であった。Ｂ型ゼラチンの有効濃度は、試験あたり１５０マイクログラム～４５０マイクログラムの範囲内であった。Ｂ型ゼラチンと同等の濃度のＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）高精製Ａ型ゼラチンは、非特異的相互作用の防止に有効であったが、安定性がいくらか低減された。Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）高精製Ａ型ゼラチンの既成の溶液の濃度は、定量化され、有効な乾燥ミックスの濃度は、試験あたり６７マイクログラム～１３５マイクログラムの範囲内であった。ゼラチン－冷水魚は、性能の観点から、Ｂ型ゼラチンと同等であった。ゼラチン－冷水魚の有効濃度は、試験あたり１５０マイクログラム～４５０マイクログラムンも範囲内であった。

【0205】

カゼインは、リンタンパク質のファミリー（アルファＳ１、アルファＳ２、ベータ、およびカッパ）である。これらのタンパク質は、哺乳動物の乳中で見出され、牛乳中で見出されるタンパク質の約８０％を構成している。１つの一般的な形態は、カゼイン酸ナトリウムである。カゼインは、多くの数のプロリンアミノ酸残基を含有し、これは、タンパク質の一般的な二次構造モチーフの形成を妨げる。カゼインは、ジスルフィド架橋を含有せず、そのため、相対的にわずかな三次構造を有する。カゼイン１０×ブロッキング緩衝液（約１４ｍｇ／ｍＬ～約１８ｍｇ／ｍＬの範囲内）を、乾燥ミックスの構成要素の１つとして用いた。５×（２倍希釈）および２．５×（４倍希釈）濃度のカゼインは、１超のポリマーコンジュゲートの添加により、２つのポリマー色素抗体コンジュゲートの相互作用を効果的に防止できた。
炭水化物安定剤

【0206】

「炭水化物安定剤」は、基材への乾燥および／または生体試料による再構成の際に、溶液中での色素抗体コンジュゲートの安定性を増加させるのを助けるために使用される、炭水化物分子である。

【0207】

候補多糖を評価した。カラギーナンは、硫酸化アニオン性多糖である。カラギーナンのストックの調製は、困難であることが見出された。カラギーナンのＤＭ緩衝液組成物への添加は、顆粒球における非特異的結合を増加させた。アルギン酸ナトリウムは、アルギン酸のナトリウム塩であり、これは、（１→４）－連結されたベータ－Ｄ－マンヌロン酸およびアルファ－Ｌ－グルロン酸残基のホモポリマーブロックを含む線状多糖である。ストックの調製は、困難であり、全体的な顆粒球、単球、およびリンパ球の広がりは、アルギン酸ナトリウムをＤＭ緩衝液組成物に添加した場合よりも高かった。

【0208】

炭水化物安定剤は、二糖であってもよい。二糖は、トレハロース、スクロース、マルトース、セロビオース、メリビオース、またはそれらの水和物もしくは塩であってもよい。一部の実施形態では、二糖は、トレハロースまたはその水和物である。トレハロースは、２つのアルファ－グルコース単位間に１，１－グリコシド結合を有する非還元性二糖である。トレハロースは、トレハロース二水和物であってもよい。二糖安定剤は、水性緩衝溶液中に、試験あたり約２０００～約３０００マイクログラム、もしくは試験あたり約２２００マイクログラム～約２８００マイクログラム、もしくは試験あたり約２５００マイクログラム、またはストック調製物中に約４００ｍｇ／ｍＬの範囲で存在していてもよい。

【0209】

トレハロースデカノエート、トレハローステトラデカノエート、およびトレハロースヘキサデカノエートを含む、トレハロース誘導体も評価した。トレハロース二水和物と同等の用量での３つすべてについて、化合物は、すべての細胞を完全に溶解し、用量を低下させることにより、チューブを乾燥させないであろう。
界面活性剤

【0210】

さまざまな種類の界面活性剤を、ＤＭ緩衝液製剤における非特異的相互作用を防止するために探索した。（表１を参照されたい）。

【0211】

少なくとも１０個の炭素のアルキル基を有するアルキルサルフェートおよびアルキルスルホネートを含む、アニオン性界面活性剤を評価した。サルコシル、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１０ＣＯ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２ＣＯＯＮａとしても公知のＮ－ラウリルサルコシンナトリウム塩は、アニオン性界面活性剤である。Ｎ－ラウリルサルコシンナトリウム塩は、単球および顆粒球における非特異的結合を防止することが見出されたが、ポリマー間相互作用を防止することはできなかった。リグノスルホン酸（「ＬＳＡ」）、３－（２－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－２－［２－メトキシ－４－（３－スルホプロピル）フェノキシ］プロパン－１－スルホン酸は、アニオン性界面活性剤である。ＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６集団の陰性バックグラウンドは、ＬＳＡが添加された場合のＤＭ緩衝液と比較して、増加した。

【0212】

非イオン性界面活性剤を、ＤＭ緩衝液製剤における可能性がある使用について評価した。ポリソルベート８０を、非イオン性界面活性剤として試験した。「エステル連結非イオン性界面活性剤」という用語は、エステル連結によって接続されるか、またはそれを含む、疎水性基および親水性基を含有する非イオン性有機化合物を指す。エステル連結非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレングリコールソルビタンエステル（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ、ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ソルビタンアルキルエステル（Ｓｐａｎ）が挙げられる。ＳＮ ｖ６０５コンジュゲートによる非特異的単球のプルアウトおよび集団の広がりは、乾燥ミックス中に０．０１５％および０．０７５％のポリソルベート８０で含まれた。

【0213】

両性イオン性界面活性剤を、ＤＭ緩衝液製剤における可能性がある使用について評価した。両性イオン性界面活性剤である、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシン、またはＮ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタインとしても公知のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラデシルアンモニオ）プロパンスルホネート、ミリスチルスルホベタイン、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１３Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ^－）としても公知の３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオプロパンスルホネート（ＤＭＭＡ）；およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１６洗浄剤（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）としても公知の３－［Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］－プロパンスルホネート（ＤＭＰＡ）を、ＤＭ緩衝液組成物において評価した。Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢは、単球および顆粒球における非特異的結合を防止できたが、ポリマー相互作用を防止することはできなかった。ＤＭＰＡは、室温で沈殿するが、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢと機能的に同等であった。ＤＭＰＡの有効濃度範囲は、０．００２％～０．００６％であった。ＤＭＭＡは、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢと機能的に同等であり、したがって、さらなる試験のために考慮した。ＤＭＭＡの有効濃度は、０．００２％～０．０３７％、または０．００４％～０．０１８％の範囲であることが見出された。

【0214】

一部の実施形態では、両性イオン性界面活性剤は、化学式（ＸＶ）：

【化34】

（式中、Ｙ＝ＣＯ_２－またはＳＯ_３－であり、Ｗ＝ＨまたはＯＨであり、Ｚ＝ＣＨ_３またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒ＝Ｃ_１～１５アルキルである）であり；独立してそれぞれ、ｐ＝０または１であり；ｑ＝０～２１である）
に記載の構造を有する。一部の実施形態では、Ｗ＝Ｈであり、Ｚ＝ＣＨ_３であり、ｑ＝１１～１５である。一部の実施形態では、両性イオン性界面活性剤は、ＤＭＭＡ、ＤＭＰＡ、Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタイン、ラウリルヒドロキシスルタイン、ラウリルスルタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、デシルベタイン、ラウリルベタイン、ベヘニル（behanyl）ベタイン、コカミドプロピルベタイ
ン、またはコカミドプロピルヒドロキシスルタインであってもよい。一部の実施形態では、両性イオン性界面活性剤は、ＤＭＭＡ、ＤＭＰＡ、Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタインであってもよい。
抗酸化剤

【0215】

抗酸化化合物を、ＤＭ緩衝液製剤の候補構成要素として評価した。抗酸化剤は、１つもしくはそれよりも多く、２つもしくはそれよりも多く、または３つもしくはそれよりも多くのカルボン酸またはカルボキシレート部分、およびＣ_１～Ｃ_８またはＣ_２～Ｃ_６脂肪族部分を含んでいてもよい。脂肪族部分は、直鎖状、分枝鎖状、もしくはシクロ－アルキルまたはアルケニル部分であってもよい。例えば、Ｌ－アスコルビン酸およびクエン酸を、抗酸化剤として評価した。ＳＮ ｖ６０５コンジュゲートによる非特異的単球のプルアウトは、０．２ｍＭおよび０．６ｍＭの濃度のＬ－アスコルビン酸で低かった。０．６ｍＭのＬ－アスコルビン酸は、Ｖ６１０チャネルにおいて、ＳＮ ｖ７８６陽性集団の低い広がりを有していた。クエン酸は、顆粒球の脱顆粒を低減し、ＳＮ ｖ６０５コンジュゲートにおける非特異的単球のプルアウトは、すべての濃度で低かった。しかしながら、クエン酸は、集団の広がりを含む、追加の影響を有していなかった。
モノマー

【0216】

蛍光色素コンジュゲート間、特に蛍光ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を防止するために、さまざまな水溶性モノマー種を検討した。用いるモノマーを、コンジュゲートポリマー色素の調製において使用された合成モノマーから選択した。ポリマー色素は、モノマーＡサブユニットおよびモノマーＢサブユニットを有する蛍光ポリマーを含む、水溶性のコンジュゲートされたポリマーであってもよい。例えば、モノマーＡまたはモノマーＢは、ＤＨＰを含んでいてもよい。ポリマー色素およびモノマーは、ＵＳ２０２０／０１９０２５３号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＤＨＰ骨格を含有するコンジュゲートされたポリマー色素が用いられてもよい。一部の実施形態では、９，１０－ジヒドロフェナントレンＤＨＰ系構造を有するモノマーＡを、ＤＭ緩衝液組成物製剤における使用のために検討し、実施例１に従って試験した。

【0217】

水溶性モノマーは、それぞれ必要に応じて、それらに結合した水溶性部分を有する、アリール部分またはヘテロアリール部分を含むモノマー単位であってもよい。水溶性部分は、１つまたはそれよりも多くのＰＥＧ部分であってもよい。水溶性モノマーは、モノマーＡサブユニット、モノマーＢサブユニット、またはモノマーＡおよびモノマーＢサブユニットの組合せを有する複数の蛍光ポリマー色素のうちの少なくとも１つの調製における使用のために適切であり得る。水溶性モノマーは、ＤＨＰ系水溶性モノマーであってもよい。水溶性モノマーは、フルオレン系水溶性モノマーであってもよい。

【0218】

水溶性モノマーは、式（Ｉ）：

【化35】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、水溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホラミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化36】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^３は、水溶化部分であり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＲ^４、または－ＣＨ_２であり；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するＤＨＰ系モノマーであってもよい。

【0219】

一部の実施形態では、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、およびＰＥＧからなる群から選択される。

【0220】

水溶性モノマーは、式（ＩＩ）：

【化37】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＸは、ＣまたはＳｉであり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の構造を有するフルオレン系モノマーであってもよい。

【0221】

一部の実施形態では、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、およびＰＥＧからなる群から選択される。

【0222】

水溶性モノマーは、式（ＩＩＩ）：

【化38】

（式中、それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であり；それぞれのＺは、独立して、Ｏ、ＣＨ_２、およびＮＨからなる群から選択され；それぞれのＲ_１は、独立して、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_３）であり；それぞれのＲ_２は、独立して、Ｈ、アルキル（Ｃ_１～Ｃ_６）であり；それぞれのｎは、独立して、１～６であり；それぞれのｍは、独立して、５～５０である）
に記載の化学構造を有するＤＨＰ系モノマーであってもよい。一部の実施形態では、Ｇ_１およびＲ_２は、それぞれ、Ｂｒであり；それぞれのＺは、Ｏであり；それぞれのＲ_１は、ＣＨ_３であり；それぞれのＲ_２は、Ｈであり；それぞれのｎは、独立して、２～４であり；それぞれのｍは、独立して、５～２０である。一部の実施形態では、それぞれのｎは、３であり；それぞれのｍは、１１である。

【0223】

具体的なモノマーＡおよびモノマーＢ種の化学構造を、図４に示す。図４に示されるモノマーＡが、２つのＳＮコンジュゲート間の非特異的相互作用を防止できたことが見出された。有効濃度は、試験あたり２００～８００マイクログラム（５０ｕＬ）の範囲内であることが見出された。しかしながら、モノマーＢは、２つのＳＮコンジュゲート間の非特異的相互作用を防止できず、陰性細胞におけるいくらかの非特異的結合も示した。

【0224】

理論によって縛られないが、モノマーＡは、ポリマー骨格とランダムに相互作用し、そのため、２つのポリマーコンジュゲート間の相互作用を防止すると仮定される。対照的に、ゼラチンまたはカゼインなどのタンパク質安定剤は、その粘着性の特質に起因して、これらの色素コンジュゲートをマスクし、それらが近接して接近するのを防止する可能性がある。
保存剤

【0225】

水性ＤＭ緩衝液組成物は、任意の適切な保存剤を含んでいてもよい。保存剤は、抗酸化剤、バイオサイド、または抗菌剤であってもよい。保存剤は、無機塩であってもよい。保存剤は、アジ化ナトリウム、２－クロロアセトアミド、２－メチルイソチアゾリノン、サリチル酸、ＰｒｏＣｌｉｎ（商標）、Ｋａｔｈｏｎ（商標）ＣＧ、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、または２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オンであってもよい。
着色剤

【0226】

水性ＤＭ緩衝液組成物は、着色剤を含んでいてもよい。着色剤は、ＦＤ＆Ｃ着色剤であってもよい。着色剤は、例えば、アルラレッド（ＦＤ＆Ｃ赤色４０号、６－ヒドロキシ－５－［（２－メトキシ－５－メチル－４－スルホナトフェニル）アゾ］－２－ナフタレンスルホン酸二ナトリウム）であってもよい。
ポリマー

【0227】

異なる溶媒中の蛍光ポリマー色素も、ＤＭ緩衝液組成物の調製のために検討した。しかしながら、液体カクテルと比較して、より広い陰性集団の広がりを示した。

【0228】

試験された異なる試薬から、最初に、トレハロース二水和物、モノマーＡ、Ｂ型ゼラチン、およびＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ両性イオン性界面活性剤を含有するＤＭ緩衝液を製剤化した。

【0229】

初期の技術的解決手段は、色素構造の完全性を維持し、凝集を減少させるために、蛍光色素コンジュゲートを乾燥するためのＤＭ緩衝液の形態において開発された。一実施形態では、ゼラチンおよびモノマーＡを有するＤＭ緩衝液製剤は、乾燥プロセスの間に、凝集の問題を減少させた。従来のドライダウン技術における最適なタンパク質安定剤濃度、ならびに最適な濃度のモノマーおよびゼラチンを用いて、ＤＭは、蛍光色素コンジュゲートの完全性の維持を支援し、蛍光色素コンジュゲートの乾燥の間の凝集に関連する課題を解決する。

【0230】

ＤＭ緩衝液は、水溶性モノマー；タンパク質安定剤；炭水化物安定剤；および両性イオン性界面活性剤を含む。ＤＭ緩衝液は、ＤＨＰ系モノマー、および１つもしくはそれよりも多く、または２つもしくはそれよりも多くのポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性モノマーを含んでいてもよい。水溶性モノマーは、式（Ｉ）に記載の構造を含んでいてもよい。タンパク質安定剤は、アルブミンタンパク質であってもよい。タンパク質安定剤は、ゼラチンタンパク質であってもよい。タンパク質安定剤は、カゼインタンパク質を含んでいてもよい。

【0231】

その後、ＤＭ緩衝液を、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲート間の非特異的相互作用および非特異的単球のプルアウトを防止するためにさらに改善し、これを「ＤＭ２」（ＤＭ ２）と名付けた。ＤＭ２は、トレハロース二水和物、モノマーＡ、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）Ａ型ゼラチンおよびＤＭＭＡ界面活性剤を含有する。

【0232】

安定性を改善するために、ＤＭ２を、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）Ａ型ゼラチンをカゼイン１０×ブロッキング緩衝液で置き換えることによってさらに最適化した。この緩衝液を、「ＤＭ２＋Ｓ」（安定剤）と名付けた。最終製剤中に存在する添加剤を、表２に提供する。ＤＭ２＋Ｓ緩衝液のｐＨは、７～７．４であることが見出された。ＤＭ２＋Ｓを使用して作製された乾燥チューブは、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲートの非特異的相互作用の防止だけでなく、カクテルに懸濁されたコンジュゲートの性能（明るさおよび集団の動員）を妨げることのない非特異的プルアウトの防止、および乾燥製品のより高い安定性の達成（まだ６か月のリアルタイム安定性が確立されたところまで）をもたらした。乾燥チューブの調製において、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲートのバルク製剤を使用した。

【実施例0233】

（実施例１Ａ）
試験手順
本実施例で使用された一般的なプロセスおよび手順を下記に示す。

【0234】

乾燥：乾燥という用語は、本明細書で使用される場合、ある特定数の時間の間の特定の真空圧力での真空乾燥を指す。

【0235】

２つのコンジュゲートの混合：２つのコンジュゲートの混合は、５ｍｌのチューブ中で２つのコンジュゲートを混合することを指す。

【0236】

液体試験：液体試験という用語は、試験チューブ中でコンジュゲートを一緒に混合し（液体カクテル）、続いて、混合されたコンジュゲートを使用して細胞を染色することを指す。

【0237】

乾燥試験：乾燥試験という用語は、試験チューブ中でコンジュゲートを一緒に混合し、真空乾燥を使用して乾燥し、続いて、乾燥されたコンジュゲートを使用して細胞を染色することを指す。

【0238】

試験は、本明細書で使用される場合、以下のプロトコールを指す。
１． 必要なｘ個のチューブを準備する（ｘ個のチューブは試験される性能に依存する）。
２． 計算された体積のコンジュゲートされた抗体（必要な用量）を、それぞれのチューブ、または次のステップのための使用される乾燥試験チューブに添加する。
３． それぞれのチューブにおいて、１００μＬの全血を添加する。チューブを、６～８秒間、穏やかにボルテックスする。
４． 光から保護して、室温（１８～２７℃）で１５～２０分間インキュベートする。
５． ２ｍｌのＶｅｒｓａＬｙｓｅ＋ＩＯＴｅｓｔ３ Ｆｉｘａｔｉｖｅ混合物（２ｍｌのＶｅｒｓａｌｙｓｅ Ｒｅｆ．Ａ０９７７７＋５０μｌのＩＯＴｅｓｔ３ ｆｉｘａｔｉｖｅ １０× Ｒｅｆ．Ａ０７８００）を添加する。すぐにボルテックスして適正な混合を確保し、光から保護して、室温（１８～２７℃）で２０分間インキュベートする。
６． 室温で５分間、３００ｇで遠心分離する。
７． 上清を吸引によって除去する。
８． 細胞ペレットを、３ｍＬの１×ＰＢＳを使用して再懸濁する。
９． 室温で５分間、３００ｇで遠心分離する。
１０． 上清を吸引によって除去し、細胞ペレットを、０．３ｍｌの１×ＰＢＳ １Ｘまたは１×ＰＢＳ＋０．１％ホルムアルデヒド（１ｍｌの１×ＰＢＳ＋１２．５μｌの１０×ＩＯＴｅｓｔ３ ｆｉｘａｔｉｖｅ）を使用して再懸濁する。

【0239】

コンペンセーション：サイトメトリーにおいて、コンペンセーションは、異なる蛍光色素の発光スペクトルのチャネル間のシグナル重複の数学的補正である。したがって、この補正因子を使用して、他の望ましくないチャネルへのシグナルのブリーディング（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）を排除した。手動のコンペンセーションを行って、コンジュゲートの性能を評価した。
（実施例１Ｂ）
フローサイトメトリーのプロトコール

【0240】

以下のプロトコールを、検体処理のために用いた。

【0241】

染色溶解洗浄プロトコールを使用して、フローサイトメトリー取得のための試料を調製および処理した。試料を、ＤｘＦＬＥＸ／ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）において処理および取得して、さまざまな製剤の性能を解析した。
１． １００μＬのＫ２ＥＤＴＡ抗凝固血液を乾燥染色チューブまたは液体抗体カクテルを有するチューブに添加し、６～８秒間ボルテックスする。室温で１５～２０分間、暗所でインキュベートする。
２． ２ｍＬのＶｅｒｓａ Ｆｉｘ（１ｍｌのＶｅｒｓａｌｙｓｅについて、２５μＬのＩＯＴｅｓｔ ３ ｆｉｘａｔｉｖｅを添加）溶解試薬溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を添加し、短時間ボルテックスして、適正な混合を確保する。室温で２０分間、暗所でインキュベートする。
３． ｌｙｓｉｓ ＆ ｆｉｘ緩衝液（Ｖｅｒｓａ Ｆｉｘ）とのインキュベーション後、室温で５分間、３００ｇで遠心分離して、ＷＢＣをペレット化する。上清を吸引および廃棄し、ボルテックスによってペレットをバラバラにする。
４． ３ｍＬの１×ＰＢＳを添加し、室温で５分間、３００ｇで遠心分離する。
５． 上清を吸引および廃棄し、ペレットを３００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、チューブを穏やかにボルテックスし、推奨される設定において、ＤｘＦＬＥＸフローサイトメーターにおいてチューブを取得する。

【0242】

機器の設定：

【0243】

フローサイトメーター機器の設定を、ＣｙｔｏＦＬＥＸまたはＤｘＦＬＥＸ Ｄａｉｌｙ ＱＣ蛍光スフェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。ＱＣビーズを使用して、機器の日常的な品質管理マネージメントを行い、ゲインの標的値を特定する。ＱＣプロトコールによって特定されるゲインのための推奨設定を、フローサイトメーターにおける試験チューブの取得のために使用した。

【0244】

コンペンセーションを、汎用コンペンセーションキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ならびに液体および／または乾燥フォーマット中の単一のＳＮポリマー色素コンジュゲートを使用して、１２色について設定した。
（実施例２）
乾燥ミックスの構成要素の選択

【0245】

水性ＤＭ緩衝液製剤を、蛍光色素コンジュゲートを乾燥するために開発した。従来の乾燥技術で開始して、いくつかの試薬（表１）を、ポリマー色素抗体コンジュゲートの非特異的相互作用および非特異的結合の防止について試験した。水またはＰＢＳを、これらの試薬のストック溶液の調製において使用した。試験された試薬およびそれぞれの試薬についての結果を、表１に示す。太字の書体で示された試薬をさらに評価した。

【0246】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0247】

以下のＤＭ候補試薬を、ポリマー色素コンジュゲートチューブのドライダウンにおいて使用した：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＰＥＧ５５０（ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル、平均Ｍ_ｎ５５０）、ＢＳＡ－ｏｘ（酸化ＢＳＡ）、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ洗浄剤（Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタイン）、Ｎ－ラウリルサルコシンナトリウム塩、モノマーＡ、モノマーＢ、異なる溶媒中のポリマー、Ａ型ゼラチン、Ｂ型ゼラチン、リグノスルホン酸、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、カゼインブロッキング緩衝液１０×、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）高精製Ａ型ゼラチン、ゼラチン－冷水魚、Ｌ－アスコルビン酸、クエン酸、ポリソルベート８０、アクリルアミド、トレハロースデカノエート、トレハロース（treahalose）－テトラデカノエート、トレハロース－ヘキサデカノエート、３－［Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］－プロパンスルホネート（ＤＭＰＡ）、および３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＤＭＭＡ）。モノマーＡおよびモノマーＢの化学構造を、図４に示す。モノマーＡは、３，３’－（（２，７－ジブロモ－９，１０－ジヒドロフェナントレン－９，１０－ジイル）ビス（オキシ））ビス（Ｎ－（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５－ドデカオキサヘプタトリアコンタン－３７－イル）プロパン－１－スルホンアミド）であってもよい。ドライダウンチューブを、実施例１のプロトコールに従って、試験した。試験の結果を表１に示す。Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）、モノマーＡ、Ｂ型ゼラチン、カゼインブロッキング緩衝液１０×、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）高精製Ａ型ゼラチン、ゼラチン冷水魚、ＤＭＰＡ、およびＤＭＭＡを、さらなる試験のために選択した。

【0248】

試験された異なる試薬から、トレハロース二水和物、モノマーＡ、Ｂ型ゼラチン、およびＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（登録商標）洗浄剤（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタイン；Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタイン）を含有する、最初のＤＭ（ＤＭ）緩衝液製剤を開発した。

【0249】

その後、改善されたＤＭ緩衝液製剤を、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲート間の非特異的相互作用および非特異的単球のプルアウトを防止するために開発し、これを、ＤＭ２（ＤＭ ２）と名付けた。ＤＭ２は、トレハロース二水和物、モノマーＡ、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）ゼラチンおよびＤＭＭＡを含有する。しかしながら、後で、ＤＭ２を使用して調製された乾燥チューブが、安定性の問題を有することが見出された。最終的に、ＤＭ２を、Ｐｒｉｏｎｅｘをカゼイン１０×ブロッキング緩衝液で置き換えることによってさらに最適化した。この緩衝液を、ＤＭ２＋Ｓ（安定剤）と名付けた。

【0250】

最終ＤＭ緩衝液製剤中に存在する添加剤を、表２に提供する。ＤＭ２＋Ｓ緩衝液のｐＨは、７～７．４であることが見出された。ＤＭ緩衝液ＤＭ２＋Ｓを使用して作製された乾燥チューブは、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲートの非特異的相互作用の防止だけでなく、カクテルに懸濁されたコンジュゲートの性能（明るさおよび集団の動員）を妨げることのない非特異的プルアウトの防止、および乾燥製品のより高い安定性の達成（今のところ６か月のリアルタイム安定性が確立された）をもたらした。乾燥チューブの調製において、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲートのバルク製剤を使用した。

【0251】

【表2】

【0252】

【表3】

【0253】

表３は、試験あたりのＤＭ２＋Ｓ ＤＭ緩衝液の構成要素の好ましい量を示す。一部の実施形態では、量は、色素コンジュゲートなしの２８．４８マイクロリットルの緩衝液あたりである。一部の実施形態では、量は、色素コンジュゲートありの５０マイクロリットルの緩衝液あたりである。

【0254】

一部の実施形態では、ＤＭ緩衝液は、トレハロース、モノマーＡ、ＤＭＭＡ、およびカゼインを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ドライダウン緩衝液は、試験あたり２０００～３０００マイクログラムのトレハロース；試験あたり２００～８００マイクログラムのモノマーＡ；試験あたり８．４～７２マイクログラムのカゼイン；および試験あたり２～１５マイクログラムのＤＭＭＡが得られるように、適切な濃度を含み得る。一部の実施形態では、ＤＭ緩衝液は、色素コンジュゲートなしで、７０～１０５ｍｇ／ｍＬ、または８０～１００ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物；７～２８ｍｇ／ｍＬ、または１０～２０ｍｇ／ｍＬのモノマーＡ；０．０７～０．５３ｍｇ／ｍＬ、または０．２～０．４ｍｇ／ｍＬのＤＭＭＡ、および０．３～２．５ｍｇ／ｍＬ、または０．５～０．８ｍｇ／ｍＬのカゼインを含み得る、水性緩衝液である。ＤＭ緩衝液は、例えば、水またはＰＢＳ緩衝液中の、ストック濃度の炭水化物安定剤、水溶性モノマー、両性イオン性界面活性剤、およびタンパク質安定剤から調製されてもよい。例えば、ストック濃度は、約４００ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、約４０ｍｇ／ｍｌのモノマーＡ、約１．５ｍｇ／ｍｌのＤＭＭＡ、および／または約２～２０ｍｇ／ｍＬのカゼインを含み得る。
（実施例３）
ＤＭ緩衝液のための実験の設計およびそれらの結果

【0255】

最適な結果を達成するために、ＤＭ緩衝液のそれぞれの構成要素（トレハロース二水和物、アジ化ナトリウムおよびアルラレッドを除く）の濃度を用量設定および最適化した。

【0256】

１．トレハロース二水和物：

【0257】

トレハロース二水和物は、従来技術の構成要素の１つであった。この添加剤の非存在下では、コンジュゲートおよび他の緩衝液の構成要素をドライダウンすることは困難であった。

【0258】

２．カゼイン１０×ブロッキング緩衝液の用量設定：

【0259】

２．１：実験：１

【0260】

目的：液体フォーマットで、非特異的結合の防止におけるカゼインの最適な濃度を見出すこと。

【0261】

方法：この実験では、異なる濃度（５×、２．５×、１．２５×、０．６２５×および０．３１×）の既成の溶液のカゼイン１０×ブロッキング緩衝液を、実施例１のプロトコールに従って試験した。

【0262】

結果および観察：

【0263】

図５は、カゼインの用量設定、ならびに陰性対照（カゼインなし）、０．３１×、０．６２５×、１．２５×、２．２５×および５×カゼインを用いる比較ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５フロープロットを示す。１．２５×、２．５×および５×濃度のカゼインは、Ｖ６１０チャネルにおいて、非特異的単球のプルアウトの低減を助ける。加えて、ＣＤ２０＋細胞の動員％は、ＣＤ２０単一（カゼインなし）と比較した場合に、すべての製剤にわたって同じであった。ＨＬＡＤＲ＋細胞の動員％は、すべての群において一貫していることも見出された（データは示さない）。そのため、カゼイン単独を、異なる濃度で、乾燥チューブにおいてさらに評価した。カゼインの濃度をさらに最適化して、乾燥チューブのための最適な濃度を見出した。

【0264】

２．２：実験：２

【0265】

目的：乾燥フォーマットで、非特異的結合の防止におけるカゼインの最適な濃度を見出すこと。

【0266】

方法：この実験では、異なる濃度（４×、２．５×および１×）の既成の溶液のカゼイン１０×ブロッキング緩衝液を使用して、定位置の他の添加剤と一緒に１２の異なる抗体コンジュゲートを乾燥した。２．５×が、標準の濃度である。そのため、２．５×濃度を、参照として、１×および４×濃度と比較した。ここで、２つの異なるロット（Ｌ１およびＬ２）のカゼイン１０×ブロッキング緩衝液を試験した。

【0267】

結果および観察：

【0268】

異なる濃度（４×、２．５×および１×）を有するＤＭ緩衝液の二重蛍光プロット（Ｖ６１０対Ｖ７８０、ＰＢ４５０対Ｖ６１０およびＰＢ４５０対Ｖ７８０）の重なりを比較した（データは示さない）。異なる濃度にわたる、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）（青紫色チャネル）対従来のチャネル、および古典的対古典的コンジュゲートチャネルについての二重蛍光プロットの重なりも比較した（データは示さない）。これらの比較はすべて、試験されたカゼインの異なる濃度にわたって有意な変動がなかったことを確認した。表４および表５は、すべての特異性に対するデルタ動員絶対％およびＭｄＦＩについて、カゼインの異なる濃度にわたる比較を示す。

【0269】

【表4】

【0270】

【表5-1】

【表5-2】

【0271】

この実験は、重ね合わせプロット、ＭｄＦＩ、およびデルタ動員絶対％が、カゼイン１０×ブロッキング緩衝液の異なる濃度（１×、２．５×、４×）の有意な変動を有さないことを実証する。デルタ動員絶対％は、カゼイン１０×ブロッキング緩衝液の異なる濃度の最小限の効果／効果なしに起因して、ロット間および試験された異なる濃度にわたって＜５％であることが見出された。したがって、１×～４×のカゼインブロッキング緩衝液を、他の従来の色素と一緒に、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲートを乾燥するために使用することができる。

【0272】

モノマーＡの用量設定：
３．１：実験：１

【0273】

目的：２つのポリマー色素抗体コンジュゲートのドライダウンのためのモノマーＡ濃度を用量設定すること。

【0274】

方法：５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、４００μｇおよび８００μｇの試験あたりマイクログラムのモノマー濃度を、一定に保たれた他の添加剤と一緒に、乾燥フォーマットのＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５およびＣＤ３－ＳＮ－ｖ７８６からなる製剤において試験した。

【0275】

結果および観察：ＣＤ２０－ＳＮ ｖ６０５およびＣＤ３－ＳＮ ｖ７８６とさまざまな用量のモノマーＡの二次元フローサイトメーター蛍光プロットを解析した（データは示さない）。異なる用量のモノマーから、２００μｇおよび４００μｇのモノマーは、ポリマー色素コンジュゲートの相互作用を防止するのに十分であった。
３．２：実験：２

【0276】

目的：３つのポリマー色素抗体コンジュゲートのドライダウンのためのモノマーＡ濃度を用量設定すること。

【0277】

方法：試験あたり２００マイクログラムおよび試験あたり４００マイクログラムのモノマーＡ濃度を、一定に保たれた他の添加剤と一緒に、乾燥フォーマットのＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ＣＤ１９－ＳＮ ｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ３－ＳＮｖ７８６からなる製剤において試験した。

【0278】

結果および観察：図６は、試験あたり２００μｇ（上の行）および４００μｇ（下の行）のモノマー濃度に対して試験された３色についての乾燥製剤の二重蛍光プロットを示す。２００μｇ～４００μｇのモノマーＡで、４００μｇを含有するチューブは、１つのチャネルから他のチャネルに漏れる集団の広がりの観点から、より良好な結果を示し（図６において矢印および円によって示される通り）、ポリマー色素抗体コンジュゲートの相互作用を防止するのに十分であった。

【0279】

４．ＤＭＭＡの用量設定：

【0280】

非特異的相互作用の防止における、ＤＭＭＡ（３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート）の役割を評価すること。
４．１：実験１：２つのＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）ポリマー色素抗体コンジュゲートの存在下での両性イオン性界面活性剤ＤＭＭＡの用量設定

【0281】

目的：２つのＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲート間の非特異的相互作用の防止におけるＤＭＭＡの最適な濃度を見出すこと。

【0282】

方法：この実験では、異なる濃度のＤＭＭＡ（Ｓｉｇｍａ、パーツ番号Ｔ７７６３－５Ｇ）を、ＤＭバージョン１において、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢをＤＭＭＡで置き換えることによって試験した。ＤＭＭＡは、水溶性両性イオン性界面活性剤である。ＤＭＭＡを、容易な製造可能性を伴う非特異的相互作用の低減におけるＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）に対するより良好な選択肢を見出すために、試験した。異なる濃度のＤＭＭＡを、試験された群の詳細と一緒に、表６に提供する。

【0283】

【表6】

【0284】

ここで、ＤＭＭＡの異なる濃度、すなわち、０．０３％、０．０１５％、０．００７５％および０．００３７５％を、液体および乾燥チューブにおいて試験し、ＤＭ緩衝液と比較した。ＤＭＭＡの濃度を、ＤＭ緩衝液の構成要素の１つであるＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（登録商標）濃度（０．１５％）に基づいて選択した。適切な対照を、実験において使用した。表６で述べるように、０．１５％のＤＭＭＡを、最終製剤に添加して、個々の濃度のＤＭＭＡを実現した。ＤＭＭＡの効果を、２つのＳｕｐｅｒｎｏｖａ（商標）コンジュゲートＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５およびＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６を使用して試験した。検体を、実施例１Ｂに従うプロトコールを使用して処理した。実験を、２人のドナーに対して行った。

【0285】

結果および観察：ＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５、ＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６および二重陽性集団についての散乱性のフロープロットを、試験されたすべての乾燥ＤＭＭＡ製剤について比較した（データは示さない）。ＤＭＭＡは、界面活性剤であり、より高い濃度で細胞死を引き起こし得る。ＤＭ対試験されたＤＭＭＡの濃度のそれぞれの重ね合わせ散布図を解析した。０．０３％のＤＭＭＡは、細胞死を引き起こし、他のパラメーターについて評価しなかった。０．００７５％および０．００３７５％のＤＭＭＡは、ＤＭと同等の散乱性を示した。同様に、ＣＤ２０＋およびＨＬＡＤＲ＋の動員％は、個々の液体単一と比較して、０．００７５％および００３７５％のＤＭＭＡにおいて類似していることが見出された。加えて、０．００７５％および０．００３７５％のＤＭＭＡは、ＤＭと比較して、６１０チャネルにおける７８６＋集団の広がりが少ないことを示した。

【0286】

この実験は、０．００７５％および０．００３７５％のＤＭＭＡが、ＤＭと同等の散乱性、ＣＤ２０＋およびＨＬＡＤＲ＋集団の動員％を示すことを実証する。ＤＭＭＡの濃度を、最適な濃度を得るために、０．００７５％～０．００３７５％の範囲内でさらに最適化した。
４．２：実験２：２つのＳｕｐｅｒｎｏｖａ（商標）コンジュゲートの存在下でのＤＭＭＡの用量最適化

【0287】

目的：２つのＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）コンジュゲート間の非特異的相互作用の防止におけるＤＭＭＡの最適な濃度を見出すこと。

【0288】

方法：この実験では、ＤＭＭＡの濃度を、最適な濃度を見出すために、０．０３％～０．００４％でさらに最適化した。異なる濃度のＤＭＭＡを、試験された群の詳細と一緒に、表７に提供する。

【0289】

【表7】

【0290】

ここで、ＤＭＭＡの異なる濃度、すなわち、０．０３％、０．０２１％、０．０１８％、０．００８％および０．００４％を、乾燥チューブにおいて試験し、ＤＭと比較した。適切な対照を、実験において使用した。表７で述べるように、０．１５％のＤＭＭＡを、最終製剤に添加して、個々の濃度のＤＭＭＡを実現した。ＤＭＭＡの効果を、２つのＳｕｐｅｒｎｏｖａ（商標）コンジュゲート、ＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５およびＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６を使用して試験した。検体を、実施例１Ｂで述べたプロトコールを使用して処理した。実験を、２人のドナーに対して行った。

【0291】

図７Ａ～Ｄは、試験された乾燥ＤＭＭＡ製剤すべてについてのＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５、ＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６および二重陽性集団の散乱性のフロープロットを示す。図７Ａは、未染色およびＤＭと一緒に試験されたＤＭＭＡのすべての濃度の散布図を示す。０．００４％および０．００８％のＤＭＭＡは、他のＤＭＭＡ濃度と比較して、非特異的好中球のプルアウト（矢印によって示す）が少ないことを示す。同様に、０．００４％、０．００８％および０．０１８％のＤＭＭＡは、ＤＭおよび他のＤＭＭＡ濃度と比較して、Ｖ６１０チャネルにおける非特異的単球のプルアウト（矢印で示す、図７Ｂ）が少ないことを示す。ＣＤ２０＋およびＨＬＡＤＲ＋の動員％は、個々の液体単一と比較して、すべてのＤＭＭＡ濃度において類似していることが見出された。同様に、すべてのＤＭＭＡ濃度における二重陽性集団の動員％は、ＤＭと比較して、類似していることが見出された。加えて、０．００４％、０．００８％および０．０１８％のＤＭＭＡは、ＤＭと比較して、Ｖ６１０チャネルにおける７８６＋事象の類似の広がりを示す。この実験は、０．００４％、０．００８％および０．０１８％のＤＭＭＡが、ＤＭと比較して、より良好な性能を示すことを実証する。そのため、これらのＤＭＭＡ濃度を、他の選択された添加剤との組合せにおいてさらに評価した。

【0292】

５．異なる濃度の選択された添加剤の性能を評価すること。
５．１：実験１：選択された添加剤の組合せの性能評価

【0293】

目的：ＳＮコンジュゲート間の非特異的結合および非特異的相互作用の防止における選択された添加剤の組合せの性能を評価すること。

【0294】

方法：この実験では、選択された添加剤の組合せ、例えば、ＤＭＭＡ＋カゼイン、ＤＭＭＡ＋Ｐｒｉｏｎｅｘを評価した。異なる濃度の添加剤を、試験された群の詳細と一緒に、表８に提供する。

【0295】

【表8】

【0296】

ここで、ＤＭＭＡの異なる濃度、すなわち、０．０１８％および０．００８％を、乾燥チューブ中で、異なる希釈のカゼインおよびＰｒｉｏｎｅｘとの組合せにおいて試験し、ＤＭバージョン１と比較した。適切な対照を、実験において使用した。ＤＭＭＡの効果を、２つのＳｕｐｅｒｎｏｖａ（商標）コンジュゲートＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５およびＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６を使用して試験した。検体を、実施例１Ｂのプロトコールを使用して処理した。実験を、４人のドナーに対して行った。

【0297】

結果および観察：ＤＭＭＡ０．００８％との添加剤の組合せについてのＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５、ＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６および二重陽性集団の散乱性のフロープロットを比較した。図８Ａは、ＤＭと比較した、ＤＭＭＡ０．００８％との添加剤の組合せの散布図を示す。散乱性は、ＤＭを除いて、それぞれの濃度について類似しているように見える。ＤＭは、矢印で示されるように、非特異的顆粒球および単球のプルアウトを示す。同様に、ＤＭは、０．００８％のＤＭＭＡとの他の組合せと比較して、Ｖ６１０チャネルにおけるより高い非特異的顆粒球および単球のプルアウトを示す（矢印で示す、図８Ｂ）。ＣＤ２０＋およびＨＬＡＤＲ＋の動員％は、個々の液体単一と比較して、０．００８％のＤＭＭＡとのすべての組合せにおいて類似していることが見出された（図８Ｂ、図８Ｃ）。同様に、０．００８％のＤＭＭＡとのすべての組合せにおける二重陽性集団の動員％は、ＤＭと比較して、類似していることが見出された。

【0298】

同様に、ＣＤ２０－ＳＮ－ｖ６０５、ＨＬＡＤＲ－ＳＮ－ｖ７８６および二重陽性集団の散乱性のフロープロットを、ＤＭＭＡ０．０１８％との添加剤の組合せについての比較した（データは示さない）。ＤＭＭＡ０．０１８％との添加剤のすべての組合せの散布図を、ＤＭと比較した。散乱性は、すべての組合せについて類似しているように見える。ＤＭおよびＤＭＭＡ０．０１８＋カゼイン１×は、０．０１８％のＤＭＭＡとの他の組合せと比較して、Ｖ６１０チャネルにおけるより高い非特異的単球のプルアウトを示す。ＣＤ２０＋およびＨＬＡＤＲ＋の動員％は、個々の液体単一と比較して、０．０１８％のＤＭＭＡとの組合せのそれぞれにおいて類似していることが見出された。同様に、０．０１８％のＤＭＭＡとのすべての組合せにおける二重陽性集団の動員％は、ＤＭと比較して、類似していることが見出された。しかしながら、ＤＭＭＡ０．０１８％＋カゼイン２．５×および０．０１８％のＤＭＭＡとＰｒｉｏｎｅｘの組合せは、ＤＭと比較して、Ｖ６１０において、７８６＋事象の広がりが少ないことを示した。

【0299】

カゼインおよびＰｒｉｏｎｅｘ（ＤＭバージョン１において、ゼラチンをカゼインおよびＰｒｉｏｎｅｘによって置き換えた）などの異なる濃度の単一添加剤についてのＣＤ２０－６０５、ＨＬＡＤＲ－７８６および二重陽性集団の散乱性のフロープロットを比較した（データは示さない）。散乱性は、組合せのそれぞれについて類似していると思われる。ＤＭ単独と単一のすべては、添加剤とＤＭＭＡとの組合せと比較して、Ｖ６１０チャネルにおけるより高い非特異的単球のプルアウトを示す。ＣＤ２０＋およびＨＬＡＤＲ＋の動員％は、個々の液体単一と比較して、すべての単一において類似していることが見出された。同様に、単一のそれぞれにおける二重陽性集団の動員％は、ＤＭと比較して、類似していることが見出された。単一とＰｒｉｏｎｅｘ希釈は、ＤＭと比較して、Ｖ６１０チャネルにおける７８６＋事象の広がりが少ないことを示す。

【0300】

全体として、すべての組合せのうち、ＤＭＭＡ０．００８％＋ｐｒｉｏｎｅｘ ２ ｄｉｌおよび３ ｄｉｌ、ＤＭＭＡ０．０１８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ３ ｄｉｌおよびＤＭＭＡ０．０１８％＋カゼイン２．５×は、Ｖ６１０チャネルにおける非特異的単球のプルアウトの低減、およびＳＮコンジュゲート間の非特異的相互作用の低減の観点から、良好な性能を提供した。この実験は、ＤＭＭＡ０．００８％＋ｐｒｉｏｎｅｘ ２ ｄｉｌおよび３ ｄｉｌ、ＤＭＭＡ０．０１８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ３ ｄｉｌおよびＤＭＭＡ０．０１８％＋カゼイン２．５×を含む組合せが、２つのＳＮコンジュゲートを用いて試験された場合に、非特異的結合および非特異的相互作用の低減の観点から、良好な性能を提供したことを実証する。

【0301】

これらの実験から、ＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ２希釈、およびＤＭＭＡ０．０１８％＋カゼイン２．５×希釈を有するＤＭ緩衝液は、ＳＮコンジュゲート間の非特異的相互作用、およびまた非特異的プルアウトの低減における良好な性能を示した。しかしながら、開発の間に、ＤＭＭＡ０．００８％＋Ｐｒｉｏｎｅｘ ２希釈（ＤＭ２製剤と名付けた）が、安定性の問題を示したことが見出され、そのため、さらに評価しなかった。ＤＭＭＡ０．０１８％＋カゼイン２．５×（ＤＭ２＋Ｓと名付けた）を用いるその後の実験は、この製剤が、良好な安定性：これまでに確立された乾燥チューブの６か月のリアルタイム安定性（試験進行中）を有することを示した。
６：添加剤、最終製剤（ＤＭ２＋Ｓ）における添加剤マイナス１（ＡＭＯ）の機能性試験

【0302】

目的：散乱性および非特異的相互作用に対するＤＭ２＋安定剤緩衝液（最終製剤）中に存在するそれぞれの添加剤の効果を理解するために、緩衝液マイナス構成要素のそれぞれの１つを分析した。

【0303】

方法：実験を、下記で述べる乾燥製剤において、４色パネル（ＣＤ４５－ＡＡ７５０、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５ ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を使用して行った。ＤＭ２＋Ｓは、他の群と比較するために、この実験において対照としての役割を果たした。
１． ＤＭ２＋Ｓ
２． ＤＭ２＋Ｓ モノマーなし
３． ＤＭ２＋Ｓ ＤＭＭＡなし
４． ＤＭ２＋Ｓ カゼインなし
５． ＤＭ２＋Ｓ トレハロース＋モノマー
６． ＤＭ２＋Ｓ トレハロース＋ＤＭＭＡ
７． ＤＭ２＋Ｓ トレハロース＋カゼイン

【0304】

トレハロースがドライダウンのために必要であることが以前の実験から確立されており、そのため、トレハロースなしのＤＭ２＋Ｓは、この実験のために使用しなかった。実験を、単一反復で、６人のドナーに対して行った。試料処理プロトコールは、プロトコールおよび方法で述べたものに従った。停止ゲートを、１００００ ＣＤ４５＋リンパ球に設定した。ドライダウン後、すべての群からの乾燥チューブを、任意の明白な変化について、物理的に観察した。加えて、二重蛍光プロットの散乱性も、任意の非特異的プルアウトおよび非特異的相互作用について観察した。

【0305】

図９は、試験群ＤＭ２＋Ｓ、トレハロース＋モノマー、トレハロース＋カゼイン、トレハロース＋ＤＭＭＡ（左から右、上パネル）、ＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、下パネル）のそれぞれにおける、物理的外観および乾燥チューブの性質を示す。ここで、ＤＭ２＋Ｓは、対照群としての役割を果たす。物理的観察は、モノマーなしで、乾燥フィルムの色の変化（典型的には、赤色フィルムが薄橙色～茶色になる）が存在することを示す。フィルムの収縮が、カゼインおよびＤＭＭＡなしの群において観察された。乾燥フィルムの外観の変化は、ＤＭ２＋Ｓと比較して、ＤＭＭＡなしのチューブにおいて観察されなかった。しかしながら、カゼインなしのチューブは、乾燥フィルムの最低限の収縮を示す。

【0306】

図１０Ａ～Ｃは、試験群ＤＭ２＋Ｓ、ＤＭＭＡなしのＤＭ２＋Ｓ、カゼインなしのＤＭ２＋Ｓ、モノマーなしのＤＭ２＋Ｓ（左から右、上側パネル）、ＤＭ２＋Ｓ：トレハロース＋ＤＭＭＡ、ＤＭ２＋Ｓ：トレハロース＋カゼイン、ＤＭ２＋Ｓ：トレハロース＋モノマー（左から右、下側パネル）における、それぞれ、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８；ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６についての側方散乱ＳＳＣ対ＦＬプロットを示す。カゼインおよびＤＭＭＡが存在しない場合、非特異的単球のプルアウトが存在する（矢印で示す）ことを図から観察することができる。モノマーの非存在は、リンパ球における陰性集団の広がりを引き起こす（矢印で示す）。陰性集団の広がりは、モノマーおよびカゼインの非存在下、ＳＮ色素の間の非特異的相互作用に主に起因し得る。

【0307】

図１０Ｄ～Ｆは、試験されたすべての群におけるすべてのＳＮの組合せについてのＦＬ対ＦＬ二重蛍光プロット（例えば、それぞれ、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８対ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６対ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６対ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８）が、モノマーおよびカゼインの非存在が、ＳＮ集団内のＳＮコンジュゲート間の非特異的相互作用／集団の広がりを引き起こすことを実証したことを示す。そのため、モノマーおよびカゼイン両方が、非特異的相互作用を防止するために重要であると見なされる。

【0308】

この実施例は、モノマーＡおよびカゼインが、それらなしでは細胞間相互作用の非効率的な防止が観察されるので、ＳＮコンジュゲートのドライダウンのために重要であることを実証する。加えて、カゼインは、非特異的単球のプルアウトも防止する。ＤＭＭＡは、非特異的単球のプルアウトの防止において主要な役割を有する。この実験は、個々の添加剤の機能を提供するだけでなく、品質管理の問題におけるトラブルシューティングのためにも重要である。
７：ＢＤ染色緩衝液と比較したＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの性能

【0309】

目的：ＢＤ染色緩衝液と比較したＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの性能を実証すること。

【0310】

方法：この実験は、ＢＤ染色緩衝液の性能と比較した場合の乾燥チューブの性能をチェックするために行った。ここで、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの性能を、ＢＤ ｈｏｒｉｚｏｎ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ緩衝液と比較した。実験を、４色パネルを使用して行った。群の詳細は以下の通りである。

【0311】

３つのポリマー色素コンジュゲートを、ゲーティングマーカー（ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ａ７５０、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６）と一緒に、市販のＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して評価した。染色プロトコールは、製造業者の説明書に従った。最初に、５０μｌのＢＤ ｈｏｒｉｚｏｎ
ｂｒｉｌｌｉａｎｔ緩衝液をチューブに添加し、続いて、４つのコンジュゲートを添加した。ボルテックスによって完全に混合する。その後、１００μｌの血液検体を添加した。ボルテックスによって適正に混合し、室温で３０分間インキュベートし、プロトコールおよび方法セクションにおいて述べたように、ステップ２以降に従うことによって処理した。

【0312】

３つのポリマー色素コンジュゲートを、ゲーティングマーカー（ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ａ７５０、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６）と一緒に、本発明のＤＭバージョン２＋安定剤において乾燥した。試料処理プロトコールは、プロトコールおよび方法において上記で述べたものと同じである。

【0313】

６人のドナー（単一反復による）を、２つの述べた群のすべてに対して、上記のプロトコールを用いて試験した。停止ゲートを、１００００ ＣＤ４５＋リンパ球に設定した。

【0314】

結果および観察：

【0315】

図１１Ａは、本発明のＤＭ２＋Ｓドライダウン緩衝液のいずれかを用いて乾燥され、血液試料で再構成されたか、または比較ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液を用いる、３つのポリマー色素コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６についての代表的なＳＳＣ対ＦＬ重ね合わせフロープロットを示す。比較の市販のＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液は、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブと比較して、非特異的顆粒球および単球のプルアウト（矢印で示す）を引き起こした。

【0316】

図１１Ｂは、ゲーティングマーカー（ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ａ７５０、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６）と一緒に、３つのポリマー色素コンジュゲートについての代表的な二重蛍光重ね合わせプロットを示す。比較ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液は、ＤＭ２＋Ｓと比較した場合に、ＳＮコンジュゲートのすべての組合せにおいて非特異的リンパ球プルアウトを引き起こした。

【0317】

この実施例は、ＤＭ２＋ＳおよびＢＤ染色緩衝液が、散乱性、動員％およびＭｄＦＩ値について有意差を示さないことを実証する（データは示さない）。しかしながら、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブは、ＢＤ染色緩衝液と比較した場合に、より厳格な集団（任意の非特異的プルアウトなし）を示す。そのため、データから、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブが、ＢＤ染色緩衝液と比較して、より良好な性能を有すると結論付けることができる。
（実施例４）
６か月の暫定的安定性

【0318】

目的：ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性を評価およびチェックすること

【0319】

方法：この実施例では、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性を評価した。比較のために、３か月経過したおよび新鮮なロットを、研究に含めた。それぞれのロットの詳細を、表９に示す。３か月および６か月経過した乾燥チューブの両方を、オープンパウチに属する研究において試験し、すなわち、乾燥チューブを、開いたパウチから複数回試験した。これらの乾燥チューブは、１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を含有する。これらのロットを、単一の機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。実施例１Ｂで述べた染色－溶解－洗浄プロトコールを、研究のために使用した。停止ゲートを、１００００ ＣＤ４５＋リンパ球に設定した。コンペンセーションを、新鮮なロットに対して調整した。その後、新鮮なロットのコンペンセーションを、３か月および６か月経過したロットに適用し、必要なマイナーなコンペンセーション調整を、３か月および６か月経過したロットの両方において行った。３か月および６か月経過したロットのデルタ動員絶対％およびＭｄＦＩを新鮮なロットと比較した（データは示さない）。

【0320】

【表9】

【0321】

結果および観察：

【0322】

図１２は、６か月経過した乾燥チューブにおいてドライダウンフィルムを有するチューブの写真画像を示す。外観の劣化は、ドライダウンフィルムにおいて、視覚的に観察されなかった。

【0323】

図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、研究において試験された特異性の異なる組合せについての３つのロットすべての代表的な重ね合わせプロットを示す。

【0324】

図１３Ａは、３か月および新鮮なロットと比較した、６か月の安定性についてのＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの代表的なＦＬ対ＦＬ重ね合わせプロットを示す。１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を含有する乾燥チューブを、単一のフローサイトメトリー機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。ＣＤ５６ ＰＢ４５０－Ａ対ＣＤ２０ Ｖｉｏｌｅｔ６１０（左パネル）、ＣＤ４Ｖｉｏｌｅｔ７８０対ＣＤ２０Ｖｉｏｌｅｔ６１０（中央パネル）、およびＣＤ４ Ｖｉｏｌｅｔ７８０対ＣＤ５６ＰＢ４５０（右パネル）についての３つのロットすべてにおけるＳＮ色素の異なる組合せに対する代表的なＦＬ対ＦＬ重ね合わせプロット。これらの重ね合わせは、３か月および６か月経過したロットにおける集団が、新鮮なロットと完全に重なることを示す。加えて、非特異的相互作用または集団の広がりは、すべての試験ドナーにおいて、６か月経過したロットで観察されなかった。

【0325】

図１３Ｂは、３か月および新鮮なロットと比較した、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性：３つのロットすべてにおけるＳＮ対古典的組合せについての代表的なＦＬ対ＦＬ重ね合わせプロットを示す。１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を含有する乾燥チューブを、単一のフローサイトメトリー機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。ＣＤ３ ＥＣＤ対ＣＤ２０Ｖｉｏｌｅｔ６１０（左パネル）、ＣＤ８ ＫＯ５２５対ＣＤ４Ｖｉｏｌｅｔ７８０（中央パネル）、およびＣＤ４５ ＡＰＣ－Ａ７５０対ＣＤ５６ＰＢ４５０（右パネル）に対する６か月、３か月、および新鮮なロットについての重ね合わせは、３か月および６か月経過したロットにおける集団が、新鮮なロットと完全に重なることを示す。加えて、非特異的相互作用または集団の広がりは、すべての試験ドナーにおいて、６か月経過したロットで観察されなかった。

【0326】

図１３Ｃは、３か月および新鮮なロットと比較した、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブの６か月の安定性：３つのロットすべてにおける古典的対古典的組合せについての代表的なＦＬ対ＦＬ重ね合わせプロットを示す。１２色（１２Ｃ）パネル（９Ｃの従来のコンジュゲート＋３ＣのＳＮコンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６）を含有する乾燥チューブを、単一のフローサイトメトリー機器において単一反復で、４人のドナーに対して試験した。ＣＤ１６ ＦＩＴＣ対ＣＤ２５ＰＥ（左パネル）、ＣＤ８ ＫＯ５２５対ＣＤ４５ＡＰＣ－Ａ７５０（中央パネル）、およびＣＤ３
ＥＣＤ対ＣＤ１０ＡＰＣ（右パネル）に対する６か月、３か月、および新鮮なロットについての重ね合わせは、３か月および６か月経過したロットにおける集団が、新鮮なロットと完全に重なることを示す。加えて、非特異的相互作用または集団の広がりは、すべての試験ドナーにおいて、６か月経過したロットで観察されなかった。この実施例では、６か月の暫定的安定性の結果は、ＤＭ２＋Ｓ乾燥チューブが少なくとも６か月間安定であることを示す。非特異的相互作用または広がりは、暫定的な６か月の時点で観察されなかった。リアルタイム安定性は、２４か月間計画している。
（実施例５）
標準化ＤＭ緩衝液製剤

【0327】

本発明のＤＭ緩衝液を、以下の通り調製し得る。可溶化された添加剤（構成要素）のストック調整物を、以下の通り調製し得る。ストック調製後、ＤＭ２＋Ｓ緩衝液を、表１０に示されるようにして調製する。ＤＭ２＋Ｓ緩衝液のｐＨ範囲は、７～７．４の間であることが見出された。

【0328】

【表10】

【0329】

その後、ＤＭ２＋Ｓ ＤＭ緩衝液（表１０）を使用して、３つの蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含むチューブフォーマットの単一乾燥反応物の均一フィルムとして、表１１に示されるパネル製剤を調製した。

【0330】

【表11】

【0331】

試験あたりの最終体積は、５０ｕＬである。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
基材上の複数の色素コンジュゲートの乾燥における使用のための緩衝液組成物であって、
水溶性モノマー；
タンパク質安定剤；
炭水化物安定剤；および
両性イオン性界面活性剤を含む、緩衝液組成物。
（項目２）
前記複数の色素コンジュゲートのうちの少なくとも１つが、ポリマー色素コンジュゲートを含む、項目１に記載の緩衝液組成物。
（項目３）
前記ポリマー色素コンジュゲートが、式（ＩＶ）：

【化39】

（式中、
それぞれのＡは、独立して、芳香族コモノマーおよびヘテロ芳香族コモノマーからなる群から選択され；
それぞれのＬは、リンカー部分であり；
それぞれのＭは、独立して、芳香族コモノマー、ヘテロ芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されたエチレン、およびエチニレンからなる群から選択され；
Ｇ^１およびＧ^２は、独立して、未修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から選択され；
ａ、ｃ、およびｄは、独立して、構造内のそれぞれの単位のモル％を定義し、それぞれの単位が均等にまたはランダムに繰り返され得、ここで、それぞれのａは、１０～１００％のモル％であり、それぞれのｃは、０～９０％のモル％であり、それぞれのｄは、０～２５％のモル％であり；
それぞれのｂは、独立して、０または１であり；
ｍは、１～約１０，０００の整数である）
に記載の構造を有する蛍光ポリマー色素にコンジュゲートされた結合パートナーである、項目２に記載の緩衝液組成物。
（項目４）
前記複数の色素コンジュゲートが、式（ＩＶ）に記載の構造をそれぞれ有する、２つまたはそれよりも多くの異なる蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含む、項目３に記載の緩衝液組成物。
（項目５）
前記水溶性モノマーが、前記蛍光ポリマー色素コンジュゲートのうちの少なくとも１つの調製において使用されるモノマー単位である、項目３または４に記載の緩衝液組成物。
（項目６）
前記水溶性モノマーが、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系水溶性モノマーまたはフルオレン系水溶性モノマーである、項目１～５のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目７）
前記水溶性モノマーが、式（Ｉ）：

【化40】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、水溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホラミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化41】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^３は、水溶化部分であり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、
ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、およびＣ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステルからなる群から選択され；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＲ^４、または－ＣＨ_２であり；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系水溶性モノマーである、項目１～６のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目８）
それぞれのＧ_１、Ｇ_２が、ハロゲンであり；それぞれのＺが、Ｏであり；それぞれのＲ_２が、Ｈであり；それぞれのＲ^５が、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、またはＣ_１～Ｃ_６アルコキシであり；それぞれのｎが、独立して、２～４であり；それぞれのｆが、独立して、５～２０である、項目７に記載の緩衝液組成物。
（項目９）
それぞれのｎが、３であり；それぞれのＲ^５が、－ＯＣＨ_３であり；それぞれのｆが、１１～１２である、項目７または８に記載の緩衝液組成物。
（項目１０）
前記水溶性モノマーが、式（ＩＩ）：

【化42】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＸは、ＣまたはＳｉであり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、
ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するフルオレン系水溶性モノマーである、項目１～６のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１１）
それぞれのＧ_１、Ｇ_２が、ハロゲンであり；それぞれのＸが、Ｃであり；それぞれのＺが、Ｏであり；それぞれのＲ^５が、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、またはＣ_１～Ｃ_６アルコキシであり；それぞれのｎが、独立して、２～４であり；それぞれのｆが、独立して、５～２０である、項目１０に記載の緩衝液組成物。
（項目１２）
前記両性イオン性界面活性剤が、式（ＸＶ）：

【化43】

（式中、Ｙ＝ＣＯ_２－またはＳＯ_３－であり、Ｗ＝ＨまたはＯＨであり、Ｚ＝ＣＨ_３またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒ＝Ｃ_１～１５アルキルである）であり；独立して、それぞれのｐ＝０または１であり；ｑ＝０～２１であり；必要に応じて、Ｗ＝Ｈであり、Ｚ＝ＣＨ_３であり、ｑ＝１１～１５である）
に記載の構造を有する、項目１～１１のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１３）
前記両性イオン性界面活性剤が、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオプロパンスルホネート（ＤＭＭＡ）；３－［Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］－プロパンスルホネート（ＤＭＰＡ）；Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタイン；およびＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタインからなる群から選択される、項目１～１２のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１４）
前記タンパク質安定剤が、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびゼラチンからなる群から選択される、項目１～１３のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１５）
前記炭水化物安定剤が、二糖炭水化物安定剤である、項目１～１４のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１６）
前記二糖炭水化物安定剤が、トレハロースまたはその水和物であり、必要に応じて、前記トレハロースまたはその水和物が、トレハロース二水和物である、項目１５に記載の緩衝液組成物。
（項目１７）
保存剤、抗酸化剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および着色剤から
なる群から選択される１つまたはそれよりも多くの追加の添加剤をさらに含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１８）
前記組成物が、水性組成物である、項目１～１７のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目１９）
ｐＨ６．５～７．５、またはｐＨ７．０～７．４の範囲内のｐＨを有する、項目１～１８のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目２０）
試験あたり、
２００～８００μｇの前記水溶性モノマー；
２０００～３０００μｇの前記炭水化物安定剤；
８．４～７２μｇの前記タンパク質安定剤；および
２～９μｇの前記両性イオン性界面活性剤
を含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の緩衝液組成物。
（項目２１）
単一反応物フィルムを調製する方法であって、前記方法が、
項目１～１８のいずれか一項に記載の水性緩衝液組成物を含む液相中で一緒に複数の色素コンジュゲートを基材上に分注するステップであって、前記複数の色素コンジュゲートが、少なくとも１つのポリマー色素コンジュゲートを含む、ステップ；および
前記液相の水性緩衝液中で一緒に前記複数の色素コンジュゲートを乾燥して、前記基材上に第１の単一反応物フィルムを形成するステップ
を含む、方法。
（項目２２）
前記複数の色素コンジュゲートが、２つまたはそれよりも多くのポリマー色素コンジュゲートを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記基材が、チューブ、ウェル、膜、およびビーズからなる群から選択される、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２４）
前記基材が、反応容器の内面を含む、項目２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記複数の色素コンジュゲートが、異なる結合パートナーをそれぞれ含む、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、１２もしくはそれよりも多く、または２～２０、３～１８、もしくは４～１２の異なる色素コンジュゲートを含む、項目２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の単一反応物フィルムを液体血液試料の第１のアリコートに曝すステップ、処理するステップ、ならびにフローサイトメトリーによって分析して、第２の単一反応物フィルムを前記液体生体試料の第２のアリコートに曝し、処理し、フローサイトメトリーによって分析することによって得られた第２のフローサイトメトリープロットと比較した場合に、
単球の非特異的結合の減少；
顆粒球の非特異的結合の減少；
ポリマー色素コンジュゲートの非特異的相互作用の減少；および
ポリマー色素コンジュゲートの凝集の減少
からなる群のうちの１つまたはそれよりも多くを示す第１のフローサイトメトリープロッ
トを得るステップを含み、
前記第２の単一反応物フィルムが、前記第１の単一反応物フィルムを形成するために一緒に乾燥される同じ複数の色素コンジュゲートを含む液相、ならびに前記水溶性モノマーなしおよび前記両性イオン性界面活性剤なしの従来の乾燥技術の試薬緩衝液から調製される、
項目２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
複数の蛍光ポリマー色素コンジュゲート；
水溶性モノマー；
タンパク質安定剤；
炭水化物安定剤；および
両性イオン性界面活性剤
を含む組成物。
（項目２８）
基材上に配置された単一反応物フィルムの形態の、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
単一反応物フィルムあたり、
２００～８００μｇの前記水溶性モノマー；
２０００～３０００μｇの前記炭水化物安定剤；
８．４～７２μｇの前記タンパク質安定剤；および
２～９μｇの前記両性イオン性界面活性剤
を含む、項目２７または２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記複数の蛍光ポリマー色素コンジュゲートのうちの少なくとも１つが、式（ＩＶ）：

【化44】

（式中、
それぞれのＡは、独立して、芳香族コモノマーおよびヘテロ芳香族コモノマーからなる群から選択され；
それぞれのＬは、リンカー部分であり；
それぞれのＭは、独立して、芳香族コモノマー、ヘテロ芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されたエチレン、およびエチニレンからなる群から選択され；
Ｇ^１およびＧ^２は、独立して、未修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から選択され；
ａ、ｃ、およびｄは、独立して、構造内のそれぞれの単位のモル％を定義し、それぞれの単位が均等にまたはランダムに繰り返され得、ここで、それぞれのａは、１０～１００％のモル％であり、それぞれのｃは、０～９０％のモル％であり、それぞれのｄは、０～２５％のモル％であり；
それぞれのｂは、独立して、０または１であり；
ｍは、１～約１０，０００の整数である）
に記載の構造を有する蛍光ポリマー色素部分を含む、項目２７～２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１）
前記水溶性モノマーが、前記複数の蛍光ポリマー色素のうちの少なくとも１つの調製に
おいて使用されるモノマー単位である、項目２７～３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記水溶性モノマーが、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系水溶性モノマーまたはフルオレン系モノマーである、項目２７～３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記水溶性モノマーが、式（Ｉ）：

【化45】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＲ^２は、独立して、水溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホラミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化46】

からなる群から選択され；
それぞれのＲ^３は、水溶化部分であり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ^５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、およびＣ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステルからなる群から選択され；
それぞれのＱは、独立して、結合、ＮＲ^４、または－ＣＨ_２であり；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）系水溶性モノマーである、項目２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
Ｇ_１およびＧ_２が、それぞれ、ハロであり；それぞれのＺが、Ｏであり；それぞれのＲ_２が、Ｈであり；それぞれのｎが、独立して、２～４であり；それぞれのｆが、独立して、５～２０であり；必要に応じて、それぞれのｎが、３であり；それぞれのｍが、１１～１２である、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記水溶性モノマーが、式（ＩＩ）：

【化47】

（式中、
それぞれのＧ_１、Ｇ_２は、独立して、ハロゲン、アルキル、ＰＥＧ、水素、アルキン、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフラート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、必要に応じて置換されたテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されたフルオレン、必要に応じて置換されたジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、アリールまたはヘテロアリールであって、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される官能基が末端の１つまたはそれよりも多くのペンダント鎖で置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択され；
それぞれのＸは、ＣまたはＳｉであり；
それぞれのＲ^４は、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボン酸アミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、もしくはチオール、またはそれらの保護基からなる群から選択され；
それぞれのＲ５は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステル、およびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
それぞれのＺは、独立して、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^４であり；
それぞれのｆは、独立して、０～５０の整数であり；
それぞれのｎは、独立して、１～２０の整数である）
に記載の化学構造を有するフルオレン系水溶性モノマーである、項目２７～３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記両性イオン性界面活性剤が、式（ＸＶ）：

【化48】

（式中、Ｙ＝ＣＯ_２－またはＳＯ_３－であり、Ｗ＝ＨまたはＯＨであり、Ｚ＝ＣＨ_３またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒ＝Ｃ_１～１５アルキルである）であり；独立して、それぞれ
のｐ＝０または１であり；ｑ＝０～２１であり；必要に応じて、Ｗ＝Ｈであり、Ｚ＝ＣＨ_３であり、ｑ＝１１～１５である）
に記載の構造を有する、項目２７～３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
前記両性イオン性界面活性剤が、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオプロパンスルホネート（ＤＭＭＡ）；３－［Ｎ，Ｎ－ジメチル（３－パルミトイルアミノプロピル）アンモニオ］－プロパンスルホネート（ＤＭＰＡ）；Ｎ－（アルキルＣ_１０～Ｃ_１６）－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンベタイン；およびＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタインからなる群から選択される、項目２７～３６のいずれか一項に記載の水性緩衝液組成物。
（項目３８）
前記タンパク質安定剤が、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびゼラチンからなる群から選択される、項目２７～３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
前記炭水化物安定剤が、二糖炭水化物安定剤である、項目２７～３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記二糖炭水化物安定剤が、トレハロースまたはその水和物であり、必要に応じて、前記トレハロースまたはその水和物が、トレハロース二水和物である、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
保存剤、抗酸化剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および着色剤からなる群から選択される１つまたはそれよりも多くの追加の添加剤をさらに含む、項目２７～４０のいずれか一項に記載の水性緩衝液組成物。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【外国語明細書】