知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024167234
(43)【公開日】2024-12-03
(54)【発明の名称】グルコース感受性インスリン誘導体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/62 20060101AFI20241126BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241126BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20241126BHJP
【ＦＩ】
C07K14/62 ZNA
A61P3/10
A61K38/28
C07K14/62
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024134315
(22)【出願日】2024-08-09
(62)【分割の表示】P 2024069771の分割
【原出願日】2024-04-23
(31)【優先権主張番号】23169455.5
(32)【優先日】2023-04-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】23199974.9
(32)【優先日】2023-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】トマス・ホウ－イェンセン
(72)【発明者】
【氏名】リーネ・デュ・ブロン
(72)【発明者】
【氏名】トマス・ボーグラム・ケルスン
(72)【発明者】
【氏名】ヘンリク・ヴァローレ
(72)【発明者】
【氏名】アリス・レイヴン・マドセン
(72)【発明者】
【氏名】ペル・サウエルベルク
(57)【要約】
【課題】本発明が解決しようとする課題は、より少ない頻度の投与を可能にするために、より長い半減期を有するグルコース感受性インスリン誘導体を提供することである。
【解決手段】本発明は、新規のインスリン誘導体、および糖尿病に関連する医学的状態の治療または予防におけるそれらの使用に関する。インスリン誘導体は、グルコース感受性であり、グルコース感受性アルブミン結合を示す。インスリン誘導体は、長い半減期を有する。本発明はまた、新規の中間体に関する。最後に、本発明は、本発明のインスリン誘導体を含む医薬組成物、および糖尿病に関連する医学的状態の治療または予防におけるかかる組成物の使用を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、新規のインスリン誘導体、および糖尿病に関連する医学的状態の治療または予防におけるそれらの使用に関する。インスリン誘導体は、グルコース感受性であり、グルコース感受性アルブミン結合を示す。インスリン誘導体は、長い半減期を有する。本発明はまた、新規の中間体に関する。最後に、本発明は、本発明のインスリン誘導体を含む医薬組成物、および糖尿病に関連する医学的状態の治療または予防におけるかかる組成物の使用を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリン誘導体であって、
Ａ．Ｂ２９Ｋを含むインスリンペプチドと、
Ｂ．ペプチド延長部Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
（式中、Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１が、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２が、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐが、１、２、または３であり、
式中、＃が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）と、
Ｃ．以下の式Ａ：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３のうちの１個が、電子求引基であり、他の２個が、水素であり、
式中、ｍが、０、１、２、または３であり、
式中、ｎが、０、１、２、または３であり、
式中、＊が、連結点を示す）の３個の修飾基と、
を含み、
１個の修飾基が、前記インスリンペプチドのＢ鎖の２９位におけるＬｙｓ残基に連結し、他の２個の修飾基が、前記ペプチド延長部におけるＬｙｓ残基の各々に連結している、インスリン誘導体。
Ａ．Ｂ２９Ｋを含むインスリンペプチドと、
Ｂ．ペプチド延長部Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
（式中、Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１が、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２が、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐが、１、２、または３であり、
式中、＃が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）と、
Ｃ．以下の式Ａ：
【化1】
式中、ｍが、０、１、２、または３であり、
式中、ｎが、０、１、２、または３であり、
式中、＊が、連結点を示す）の３個の修飾基と、
を含み、
１個の修飾基が、前記インスリンペプチドのＢ鎖の２９位におけるＬｙｓ残基に連結し、他の２個の修飾基が、前記ペプチド延長部におけるＬｙｓ残基の各々に連結している、インスリン誘導体。
【請求項2】
Ｚが、Ｇｌｙである、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項3】
Ｙが、ＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧ（配列番号１３）である、請求項１または２に記載のインスリン誘導体。
【請求項4】
ａａ１が、Ｐｒｏであり、ａａ２が、Ｇｌｕである、請求項１～３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項5】
ｐが、２である、請求項１～４のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項6】
前記ペプチド延長部が、ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４）である、請求項１～５のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項7】
前記電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、ＳＯ２Ｘ、およびＰＯＸ２の群から選択される（式中、Ｘが、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒが、Ｈ、アルキルまたはアリールである）、請求項１～６のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項8】
Ｒ１が、電子求引基であり、Ｒ２およびＲ３が、水素である、請求項１～７のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項9】
Ｒ１が、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３が、水素である、請求項１～８のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項10】
前記インスリン誘導体が、
（実施例４のインスリン誘導体）である、請求項１～９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【化2】
【請求項11】
インスリン誘導体であって、前記インスリン誘導体が、
（実施例４のインスリン誘導体）である、インスリン誘導体。
【化3】
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のインスリン誘導体を含む、組成物。
【請求項13】
医薬として使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のインスリン誘導体または請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の予防または治療に使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のインスリン誘導体または請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載のインスリン誘導体または請求項１２に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規のインスリン誘導体、およびそれらの薬学的使用に関する。さらに、本発明は、かかるインスリン誘導体を含む医薬組成物、および糖尿病に関連する医学的状態の治療または予防のためのかかる化合物の使用に関する。
【0002】
配列表の参照による組み込み
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
インスリンは、高血糖の治療に最も有効な薬物であるが、インスリン投薬量は、生理学的グルコース範囲が狭いため、過多と過少との間の微妙なバランスである。健康な人は、絶食状態においてほぼ５ｍＭのグルコースレベルを有し、糖尿病患者は、食事および基礎インスリン調製物の両方を投与してほぼ５ｍＭを得ようと試みる。しかしながら、約３ｍＭ未満の血糖値（低血糖症）は、しばしば、インスリン治療中に生じ、低血糖症は、不快感、意識を失う（ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｎｃｉｓｅｎｅｓｓ）、脳損傷、または死亡につながる可能性がある。したがって、糖尿病患者は、低血糖症を恐れて高いまたは中程度に高い血糖値を積極的に治療することに躊躇する。より高い血糖値でのみ活性であるか、またはデポーから放出され、より低い血糖値では不活性または弱く活性であるインスリン薬物が開発されれば、糖尿病治療を助けることができるであろう。
【0004】
特許文献１は、グルコース感受性アルブミン結合を示すジボロン含有部分を有するグルコース感受性インスリン誘導体を開示している。したがって、これらのインスリン誘導体は、グルコース濃度に依存するインスリン活性を示す。より少ない頻度の投与を可能にするために、より長い半減期を有するグルコース感受性インスリン誘導体に対するニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０２０／２０１０４１号
【発明の概要】
【0006】
最も広い態様では、本発明は、インスリン誘導体に関する。これらのインスリン誘導体は、グルコース濃度に依存するインスリン活性を示し、したがってグルコース感受性インスリン誘導体として機能する。
【0007】
本発明のインスリン誘導体は、グルコースおよびアルブミン（ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）の両方に結合し、ＨＳＡ親和性はグルコース感受性である。したがって、ＨＳＡの存在下での見かけのヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）親和性もまた、グルコース感受性になる。ＨＳＡ結合されたインスリンの画分は、ＨＩＲへの結合から遮蔽されるが、ＨＳＡからのグルコース促進放出は、インスリンの遊離画分を増加させ、したがってグルコースは、ＨＩＲの見かけの親和性を高める。したがって、本発明のインスリン誘導体は、グルコースおよびアルブミンの存在下において、グルコースが存在しないときよりも高い見かけのインスリン受容体親和性を示す。
【0008】
本発明のインスリン誘導体は、高いグルコース感受性を示し、長い半減期を有する。
【0009】
一態様では、本発明のインスリン誘導体は、Ｂ２９Ｋを含むインスリンペプチドと、インスリンペプチドＢ鎖のＮ末端におけるペプチド延長部と、３個の修飾基とを含み、１個の修飾基は、インスリンペプチドのＢ鎖の２９位におけるＬｙｓ残基に連結し、他の２個の修飾基は、ペプチド延長部におけるＬｙｓ残基に連結している。
【0010】
一態様では、ペプチド延長部は、
Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
の配列を有する
（式中、Ｚは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１は、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２は、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐは、１、２、または３であり、
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）。
Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
の配列を有する
（式中、Ｚは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１は、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２は、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐは、１、２、または３であり、
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）。
【0011】
一態様では、修飾基は、式Ａ：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３のうちの１個は、電子求引基であり、他の２個が、水素であり、
式中、ｍは、０、１、２、または３であり、ｎは、０、１、２、または３であり、＊は、連結点を示す）である。
【化1】
式中、ｍは、０、１、２、または３であり、ｎは、０、１、２、または３であり、＊は、連結点を示す）である。
【0012】
一態様では、本発明は、本発明によるインスリン誘導体を含む医薬組成物に関する。一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明によるインスリン誘導体に関する。一態様では、本発明は、糖尿病の治療において使用するための本発明によるインスリン誘導体に関する。一態様では、本発明は、本発明によるインスリン誘導体の医学的使用に関する。
【0013】
一態様では、本発明のインスリン誘導体は、高いグルコース感受性を示す。一態様では、本発明のインスリン誘導体は、長い半減期を有する。一態様では、本発明のインスリン誘導体は、高いグルコース感受性を示し、長い半減期を有する。
【0014】
本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかになるであろうさらなる問題も解決し得る。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、それぞれ３ｍＭおよび２０ｍＭのＤ－グルコースでの、実施例４のインスリン誘導体およびヒトインスリンについてのヒト初代肝細胞におけるインスリン受容体リン酸化の濃度応答曲線を示す（実施例１３を参照）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
一態様では、本発明のインスリン誘導体は、インスリンペプチドと、インスリンペプチドＢ鎖のＮ末端におけるペプチド延長部と、３個の修飾基とを含む。
【0017】
インスリン誘導体
本明細書で使用される場合、「インスリン誘導体」という用語は、修飾インスリンペプチドを意味し、修飾は、化学部分の連結および／またはペプチド延長部の存在の形態である。
本明細書で使用される場合、「インスリン誘導体」という用語は、修飾インスリンペプチドを意味し、修飾は、化学部分の連結および／またはペプチド延長部の存在の形態である。
【0018】
一態様では、修飾は、式Ａの修飾基の共有結合的連結の形態である。一態様では、修飾は、インスリンペプチドＢ鎖のＮ末端におけるペプチド延長部の存在の形態である。一態様では、修飾は、式Ａの修飾基の共有結合的連結およびインスリンペプチドＢ鎖のＮ末端におけるペプチド延長部の存在の形態である。
【0019】
インスリンペプチド
本明細書で使用される場合、「インスリンペプチド」という用語は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のいずれかであるペプチドを意味する。一実施形態では、本明細書で使用される「インスリンペプチド」という用語は、インスリン活性を有する、すなわち、インスリン受容体を活性化するヒトインスリンまたはその類似体のいずれかであるペプチドを意味する。
本明細書で使用される場合、「インスリンペプチド」という用語は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のいずれかであるペプチドを意味する。一実施形態では、本明細書で使用される「インスリンペプチド」という用語は、インスリン活性を有する、すなわち、インスリン受容体を活性化するヒトインスリンまたはその類似体のいずれかであるペプチドを意味する。
【0020】
ヒトインスリン
本明細書で使用される場合、「ヒトインスリン」という用語は、その構造および特性が周知のヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖と称される２つのポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は、ジスルフィド架橋によって接続され、第１の架橋は、Ａ鎖の７位におけるシステインとＢ鎖の７位におけるシステインとの間であり、また第２の架橋は、Ａ鎖の２０位におけるシステインとＢ鎖の１９位におけるシステインとの間である。第３の架橋は、Ａ鎖の６位におけるシステインとＡ鎖の１１位におけるシステインとの間に存在する。ヒトインスリンＡ鎖は、次の配列 ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）を有する一方、ヒトインスリンＢ鎖は、次の配列 ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）を有する。
本明細書で使用される場合、「ヒトインスリン」という用語は、その構造および特性が周知のヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖と称される２つのポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は、ジスルフィド架橋によって接続され、第１の架橋は、Ａ鎖の７位におけるシステインとＢ鎖の７位におけるシステインとの間であり、また第２の架橋は、Ａ鎖の２０位におけるシステインとＢ鎖の１９位におけるシステインとの間である。第３の架橋は、Ａ鎖の６位におけるシステインとＡ鎖の１１位におけるシステインとの間に存在する。ヒトインスリンＡ鎖は、次の配列 ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）を有する一方、ヒトインスリンＢ鎖は、次の配列 ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）を有する。
【0021】
インスリン類似体
本明細書で使用される場合、「インスリン類似体」という用語は、インスリンの１個以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ／または１個以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失しており、かつ／または１個以上のアミノ酸残基がインスリンに付加および／もしくは挿入されている、修飾ヒトインスリンを意味する。本明細書で使用される場合、「インスリン類似体」という用語は、インスリン活性を示す、すなわち、インスリン受容体に結合しインスリン受容体を活性化する、インスリン類似体を意味する。
本明細書で使用される場合、「インスリン類似体」という用語は、インスリンの１個以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ／または１個以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失しており、かつ／または１個以上のアミノ酸残基がインスリンに付加および／もしくは挿入されている、修飾ヒトインスリンを意味する。本明細書で使用される場合、「インスリン類似体」という用語は、インスリン活性を示す、すなわち、インスリン受容体に結合しインスリン受容体を活性化する、インスリン類似体を意味する。
【0022】
ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して、１０個未満のアミノ酸修飾（置換、欠失、付加（すなわち、延長）、挿入、およびそれらの任意の組み合わせ）、あるいはヒトインスリンに対して、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の修飾を含む。一態様では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して、１０個未満のアミノ酸修飾（置換、欠失、付加（すなわち、延長）、挿入、およびそれらの任意の組み合わせ）、あるいはヒトインスリンに対して、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の修飾を有する。
【0023】
インスリン分子における修飾は、鎖（ＡまたはＢ）、位置、および天然アミノ酸残基を置換するアミノ酸残基の１文字または３文字のコードを述べることで表される。本明細書では、「Ａ１」、「Ａ２」、および「Ａ３」などの用語は、インスリンのＡ鎖の（Ｎ末端から数えて）それぞれ１位、２位、および３位などにおけるアミノ酸を表す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３などの用語は、インスリンのＢ鎖の（Ｎ末端から数えて）それぞれ１位、２位、および３位などにおけるアミノ酸を示す。アミノ酸の１文字コードを使用すると、Ｂ２９Ｋという用語は、Ｂ２９位におけるアミノ酸がＫであることを指定している。アミノ酸の３文字コードを使用すると、対応する表現は、Ｂ２９Ｌｙｓである。「ｄｅｓＢ３０」とは、Ｂ３０アミノ酸を欠くインスリン類似体を意味する。
【0024】
特定の実施形態では、類似体は、特定の変化を「有する」または「含む」。他の特定の実施形態では、類似体は、変化「からなる」。「からなる」または「からなっている」という用語が類似体に関連して使用される場合、例えば、類似体が、特定のアミノ酸変異の群からなるか、またはなっている場合、当然のことながら、特定のアミノ酸変異は、類似体における唯一のアミノ酸変異である。対照的に、特定のアミノ酸変異の群を「含む」類似体は、追加的な変異を有してもよい。
【0025】
インスリン類似体の例としては、
ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１のＡ鎖および配列番号３のＢ鎖）が挙げられる。
ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１のＡ鎖および配列番号３のＢ鎖）が挙げられる。
【0026】
ペプチド延長部
上述のように、本発明のインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して、１０個未満のアミノ酸修飾（置換、欠失、付加（すなわち、延長）、挿入、およびそれらの任意の組み合わせ）、あるいはヒトインスリンに対して、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の修飾を含む。これらの最大９個の修飾に加えて、本発明のインスリンペプチドは、インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端にペプチド延長部を有する。
上述のように、本発明のインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して、１０個未満のアミノ酸修飾（置換、欠失、付加（すなわち、延長）、挿入、およびそれらの任意の組み合わせ）、あるいはヒトインスリンに対して、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の修飾を含む。これらの最大９個の修飾に加えて、本発明のインスリンペプチドは、インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端にペプチド延長部を有する。
【0027】
様々なペプチド延長部またはスペーサーペプチドは、当該技術分野で公知であり、本発明のインスリン誘導体で使用され得る。一実施形態では、ペプチド延長部は、ペプチド結合を介して接続された２８～５８個のアミノ酸からなるペプチドセグメントである。本発明のペプチド延長部は、次のアミノ酸残基 Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＬｙｓ（Ｋ）のうちの１つ以上を含む。
【0028】
本発明のインスリン誘導体におけるペプチド延長部は、２個の修飾基の連結を可能にするために、２個のＬｙｓ（Ｋ）残基を含む。修飾基の連結の正確な位置は変化してもよく、また正確なペプチド配列のいくらかの変動が許容される。
【0029】
本発明のインスリン誘導体において使用されるペプチド延長部は、以下のペプチド配列：
Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
を有する
（式中、Ｚは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１は、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２は、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐは、１、２、または３であり、
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）。
Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
を有する
（式中、Ｚは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１は、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２は、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐは、１、２、または３であり、
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）。
【0030】
一実施形態では、ペプチド延長部は、例えば、ペプチド延長部における少なくとも５個のグルタミン酸（Ｇｌｕ）アミノ酸残基を有することによって、全体的に極性に保たれる。
【0031】
インスリンが組み換え的に生成される場合、単鎖インスリン前駆体として発現され、これは後に、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓリシル特異的エンドプロテアーゼ（ＡＬＰ）またはトリプシンなどのプロテアーゼを使用して２鎖インスリンへと成熟される。ＡＬＰは、リシル－プロリン結合を含むリシル結合を特異的かつ独占的に切断する。しかしながら、本発明のインスリン誘導体で使用されるペプチド延長部は、２個のリシン（Ｌｙｓ）残基を含むため、ＡＬＰによる切断は、望ましくない過剰切断産物をもたらし得る。驚くべきことに、Ｌｙｓの後にＰｒｏ－Ｇｌｕを有することによって、ＡＬＰによる切断速度が大幅に低減され、したがって、過剰切断が低減され、全体的な収量が増加することが見出された。
【0032】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体において使用されるペプチド延長部は、以下のペプチド配列：
Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
を有する
（式中、Ｚは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙは、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１３～２８個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１は、Ｐｒｏであり、
式中、ａａ２は、Ｇｌｕであり、
式中、ｐは、１、２、または３であり、
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）。
Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃
を有する
（式中、Ｚは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙは、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１３～２８個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１は、Ｐｒｏであり、
式中、ａａ２は、Ｇｌｕであり、
式中、ｐは、１、２、または３であり、
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）。
【0033】
より具体的には、ペプチド延長部は、ペプチド延長部のＣ末端セリン残基のカルボン酸、およびインスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基を介してインスリンペプチドに連結され、２個のアミノ酸残基の間にアミド結合を形成する。
【0034】
インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端におけるペプチド延長部の例としては、ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４）が挙げられる。
【0035】
修飾基Ａ
本発明のインスリン誘導体は、３個の修飾基Ａを含む。一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、式Ａの正確に３個の修飾基を有する。修飾基は、同一であっても異なっていてもよい。一実施形態では、修飾基は、同一である。修飾基は、インスリンペプチドおよびペプチド延長部においてリシン残基のイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。
本発明のインスリン誘導体は、３個の修飾基Ａを含む。一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、式Ａの正確に３個の修飾基を有する。修飾基は、同一であっても異なっていてもよい。一実施形態では、修飾基は、同一である。修飾基は、インスリンペプチドおよびペプチド延長部においてリシン残基のイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。
【0036】
本発明のインスリン誘導体の修飾基は、式Ａ：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３のうちの１個は、電子求引基であり、他の２個は、水素であり、
式中、ｍは、０、１、２、または３であり、
式中、ｎは、０、１、２、または３である）である。
【化2】
式中、ｍは、０、１、２、または３であり、
式中、ｎは、０、１、２、または３である）である。
【0037】
本出願の式全体を通して、Ｂは、ホウ素原子を示し、Ｈは、水素原子を示し、Ｎは、窒素原子を示し、Ｏは、酸素原子を示す。
【0038】
言い換えれば、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、電子求引基および水素の群から選択されるが、ただし、Ｒ１が電子求引基である場合、Ｒ２およびＲ３は水素であり、Ｒ２が電子求引基である場合、Ｒ１およびＲ３は水素であり、Ｒ３が電子求引基である場合、Ｒ１およびＲ２は水素である。
【0039】
一実施形態では、Ｒ１は、電子求引基であり、Ｒ２およびＲ３は、水素である。
【0040】
ボロン酸およびボロキソールのｐＫａを調整して中性ｐＨでのグルコースの結合を容易にするために、電子求引基を連結する。
【0041】
電子求引基（ＥＷＧ）は、隣接する原子からそれ自体に向かって電子密度を引き寄せる原子または基である。一実施形態では、電子求引基は、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、ＳＯ２Ｘ、およびＰＯＸ２の群から選択される（式中、Ｘは、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、およびアリールから選択される）。一実施形態では、電子求引基は、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、およびＳＯ２Ｘの群から選択される（式中、Ｘは、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、およびアリールから選択される）。一実施形態では、電子求引基は、ＣＦ３、Ｆ、ＳＯ２ＮＲ２、またはＣＮである（式中、Ｒは、アルキルである）。一実施形態では、電子求引基は、ＣＦ３である。一実施形態では、Ｒ１は、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３は、水素である。
【0042】
本発明のインスリン誘導体では、１個の修飾基は、インスリンペプチドのＢ鎖の２９位におけるリシン（Ｌｙｓ）残基に連結し、他の２個の修飾基は、ペプチド延長部におけるリシン（Ｌｙｓ）残基の各々に連結している。より具体的には、各修飾基は、アミド結合を形成するリシンのイプシロンアミノ基に連結している。
【0043】
式Ａは、＊で示される連結点を介してＬｙｓに共有結合的に連結する。
【0044】
式Ａの修飾基は、２つのキラル中心を有する。式Ａの修飾基におけるキラル原子の各々は、独立して、（Ｒ）または（Ｓ）形態であってもよい。一実施形態では、両方のキラル原子は、（Ｓ）形態のものである。さらに別の実施形態では、キラル中心は、式Ａ１：
に示されるとおりである。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍおよびｎは、式Ａについて上記に定義したとおりである。
【化3】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍおよびｎは、式Ａについて上記に定義したとおりである。
【0045】
特定の実施形態では、修飾基は、式Ａのものである（式中、Ｒ１は、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３は、水素であり、ｍは、２であり、ｎは、０である）。
【0046】
特定の実施形態では、修飾基は、式Ａ１のものである（式中、Ｒ１は、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３は、水素であり、ｍは、２であり、ｎは、０である）。
【0047】
本発明のインスリン誘導体の機能
驚くべきことに、本発明のインスリン誘導体は、ＨＳＡの存在下において、長い半減期および高いグルコース感受性の両方を示すことが見出された。
驚くべきことに、本発明のインスリン誘導体は、ＨＳＡの存在下において、長い半減期および高いグルコース感受性の両方を示すことが見出された。
【0048】
インスリン類似体およびインスリン誘導体のヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対する相対結合親和性は、実施例１２に記載されるように、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）での競合結合によって決定され得る。
【0049】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、インスリン受容体に結合する能力を有する。一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ＨＳＡおよび２０ｍＭのグルコースの存在下において、グルコースが存在しない場合よりも高い見かけのインスリン受容体親和性を有する。ＨＳＡの存在下での０～２０ｍＭグルコースの見かけの相対親和性（ＨＩＲグルコース係数）の増加は、インスリン誘導体のグルコース感受性を反映する。グルコースが存在しない場合と比較して、相対インスリン受容体親和性が、２０ｍＭのグルコースの存在下でより高い場合、グルコース係数は、１を上回る。一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、１．５％のＨＳＡの存在下において、少なくとも２０、３０、または４０のグルコース係数を有する。
【0050】
実施例１２に示されるデータから分かるように、インスリン骨格のＢ鎖のＮ末端におけるペプチド延長部は、０～２０ｍＭグルコースの親和性（グルコース係数）の倍率変化によって測定されるように、ＨＳＡの存在下においてグルコース感受性の減少をもたらす。驚くべきことに、本発明のインスリン誘導体は、ＨＳＡの存在下において、高いグルコース感受性を示すことが見出された。
【0051】
実施例１３に記載されるインスリン受容体リン酸化アッセイ、実施例１４に記載される脂質生成アッセイ、および実施例１５に記載されるグリコーゲン蓄積アッセイは、インスリン誘導体の機能的（アゴニスト）活性の尺度として使用され得る。実施例１３、１４、および１５に示されるデータから分かるように、本発明のインスリン誘導体は、インスリン受容体を活性化する。ＬＹＤブタへの皮下投与時の半減期（Ｔ１／２）は、実施例１６に記載される方法を使用して決定することができる。実施例１６におけるＬＹＤブタの薬物動態（ＰＫ）研究から分かるように、本発明の化合物は、延長された半減期（Ｔ１／２）を示す。
【0052】
中間産物
本発明は、インスリンペプチドのＮ末端にペプチド延長部を有するインスリン類似体の形態の中間生成物をさらに提供する。
本発明は、インスリンペプチドのＮ末端にペプチド延長部を有するインスリン類似体の形態の中間生成物をさらに提供する。
【0053】
インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端にペプチド延長部を有するインスリン類似体の例としては、
ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１のＡ鎖および配列番号５のＢ鎖）が挙げられる。
ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１のＡ鎖および配列番号５のＢ鎖）が挙げられる。
【0054】
ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２でＢ１から延長されたｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを意味する。Ｃ末端セリン（Ｓ）は、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンのＢ１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）に接続される。
【0055】
一般的な定義
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、それ故に「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小限の要素以外の異なる構造的要素を有してもよい。「化合物」という用語はまた、本明細書の薬学的に関係のある形態を包含することも意味し、すなわち、本発明は、本明細書で定義される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステルに関する。
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、それ故に「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小限の要素以外の異なる構造的要素を有してもよい。「化合物」という用語はまた、本明細書の薬学的に関係のある形態を包含することも意味し、すなわち、本発明は、本明細書で定義される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステルに関する。
【0056】
「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、例えば、本発明の文脈で使用される場合、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸からなる。
【0057】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質原性（または天然）アミノ酸（その中でも、２０個の標準アミノ酸）、ならびに非タンパク質原性（または非天然）アミノ酸を含む。タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質に自然に組み込まれるものである。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸である。非タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質中に見られないか、または標準細胞機構によって生成されないかのいずれかである（例えば、それらは、翻訳後修飾に供された可能性がある）。
【0058】
一般に、アミノ酸残基（ペプチド／タンパク質配列）は、それらの完全な名称、それらの１文字コード、および／またはそれらの３文字コードによって特定され得る。これらの３つの方法は、完全に同等である。本出願の全体を通して、光学異性体が記載されていない本発明のインスリンペプチドおよびペプチド延長部の各アミノ酸は、（別段の指定がない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、しばしば側鎖と呼ばれる１個以上の追加の基を含有する分子である。
【0059】
本明細書では、「アミノ酸残基」という用語は、形式上、ヒドロキシ基がカルボキシ基から除去されており、かつ／または形式上、水素原子がアミノ基から除去されている、アミノ酸である。
【0060】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～２４個の炭素原子の分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基である。例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｓ－ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、およびテトラデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
「アリール」という用語は、５～１２個の炭素原子を有する環状または多環式芳香環を意味する。アリール基の例としては、フェニル、ビフェニル、およびナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
ある特定の特徴を「含む」または「含んでいる」という用語は、問題の主題がそれらのある特定の特徴を含むが、他の特徴の存在を除外しないことを意味すると解釈されるものである。
【0063】
医薬組成物
本発明はまた、本発明のインスリン誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステル、および１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物にも関する。かかる組成物は、当該技術分野で公知のとおりに調製されてもよい。
本発明はまた、本発明のインスリン誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステル、および１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物にも関する。かかる組成物は、当該技術分野で公知のとおりに調製されてもよい。
【0064】
「賦形剤」という用語は、活性治療成分以外の任意の成分を広範に指す。賦形剤は、不活性物質、非活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であってもよい。賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤として様々な目的を果たし、かつ／または活性物質の投与および／もしくは吸収を改善するように機能し得る。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、等張性調節剤、キレート剤および安定剤である。様々な賦形剤を伴う薬学的に活性な成分の製剤は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第２１版（２００５）および任意のその後の版）を参照されたい。
【0065】
本発明の組成物は、液体製剤、すなわち、水を含む水性製剤の形態であってもよい。液体製剤は、溶液または懸濁液であってもよい。本発明の組成物は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈注射によって実施される非経口投与用であってもよい。
【0066】
アリールホウ素化合物は、中性値付近のｐＨにおいて、水溶液中で低い安定性しか有しない場合がある。本発明のインスリン誘導体は、水溶液中で改善した安定性を示す。安定性は、例えば、長期間、例えば１週間にわたって、２５℃または３７℃において中性ｐＨで水溶液中に静置した後のインスリン誘導体の純度を測定することによって評価され得る。
【0067】
薬学的適応
糖尿病
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」または「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」という用語には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病（妊娠中）、および高血糖症を引き起こす他の状態が含まれる。この用語は、膵臓が生成するインスリンの量が不十分であるか、または体の細胞がインスリンに適切に応答できず、それ故に細胞がグルコースを吸収するのを妨げる、代謝障害に対して使用される。結果として、グルコースは、血液中に蓄積する。
糖尿病
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」または「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」という用語には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病（妊娠中）、および高血糖症を引き起こす他の状態が含まれる。この用語は、膵臓が生成するインスリンの量が不十分であるか、または体の細胞がインスリンに適切に応答できず、それ故に細胞がグルコースを吸収するのを妨げる、代謝障害に対して使用される。結果として、グルコースは、血液中に蓄積する。
【0068】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）および若年発症糖尿病とも呼ばれる、１型糖尿病は、通常は絶対的インスリン欠乏をもたらすベータ細胞破壊によって引き起こされる。
【0069】
非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）および成人発症糖尿病としても知られる、２型糖尿病は、主要なインスリン抵抗性、それ故に相対的なインスリン欠乏および／またはインスリン抵抗性を伴う主要なインスリン分泌不全に関連している。
【0070】
一実施形態では、本発明によるインスリン誘導体は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの治療または予防のための医薬として使用される。一実施形態では、本発明によるインスリン誘導体は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、または１型糖尿病の治療または予防のための医薬として使用される。別の実施形態では、本発明によるインスリン誘導体は、２型糖尿病における疾患の進行を遅延または予防するための医薬として使用される。「治療」という用語は、参照される疾患、障害、または状態の予防および最小化の両方を含むことを意味する（すなわち、「治療」は、文脈によって別段の指示がないか、または明確に矛盾しない限り、本発明のインスリン誘導体または本発明のインスリン誘導体を含む組成物の予防的および治療的投与の両方を指す）。
【0071】
投与の方法
投与の経路は、本発明のインスリン誘導体を体内の所望のまたは適切な場所に、例えば非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内で）効果的に輸送する任意の経路であってもよい。
投与の経路は、本発明のインスリン誘導体を体内の所望のまたは適切な場所に、例えば非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内で）効果的に輸送する任意の経路であってもよい。
【0072】
非経口投与については、本発明のインスリン誘導体は、既知のインスリンの製剤と類似的に製剤化される。さらに、非経口投与については、本発明のインスリン誘導体は、既知のインスリンの投与と類似的に投与されてもよく、医師は、この手順に精通している。
【0073】
投与される本発明のインスリン誘導体の量、本発明のインスリン誘導体を投与する頻度の決定、および任意選択で別の抗糖尿病化合物と一緒に、どの本発明の化合物を投与するかの選択は、糖尿病の治療に精通している専門家と相談して決定される。
【0074】
非限定的な実施形態
本発明は、本発明の以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される。
１．インスリン誘導体であって、
Ａ．Ｂ２９Ｋを含むインスリンペプチドと、
Ｂ．ペプチド延長部Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃と、
（式中、Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１が、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２が、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐが、１、２、または３であり、
式中、＃が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）
Ｃ．式Ａの３個の修飾基と、
（式中、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３のうちの１個が、電子求引基であり、他の２個が、水素であり、
式中、ｍが、０、１、２、または３であり、
式中、ｎが、０、１、２、または３であり、
式中、＊が、連結点を示す）を含み、
１個の修飾基が、インスリンペプチドのＢ鎖の２９位におけるＬｙｓ残基に連結し、他の２個の修飾基が、ペプチド延長部におけるＬｙｓ残基の各々に連結している、インスリン誘導体。
２．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～４個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態に記載のインスリン誘導体。
３．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６．Ｚが、１～４個のＧｌｙアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７．Ｚが、１～３個のＧｌｙアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８．Ｚが、１～２個のＧｌｙアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９．Ｚが、Ｇｌｙである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１１．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１２．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１３．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１４．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１５．Ｙが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１６．Ｙが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１７．Ｙが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１８．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１８～２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１９．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２０．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２１個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２１．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１８～２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２２．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２３．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２１個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２４．Ｙが、ＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧ（配列番号１３）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２５．ａａ１が、Ｐｒｏである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２６．ａａ２が、Ｇｌｕである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２７．ｐが、２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２８．ペプチド延長部が、ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２９．修飾基が、式Ａ１：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３のうちの１個が、電子求引基であり、他の２個が、水素であり、
式中、ｍが、０、１、２、または３であり、
式中、ｎが、０、１、２、または３であり、
式中、＊が、連結点を示す）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３０．電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、ＳＯ２Ｘ、およびＰＯＸ２の群から選択される（式中、Ｘが、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒが、Ｈ、アルキルまたはアリールである）、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３１．電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、およびＳＯ２Ｘの群から選択される（式中、Ｘが、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒが、Ｈ、アルキルまたはアリールである）、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３２．Ｘが、ＯＲである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３３．Ｘが、ＮＲ２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３４．Ｒが、Ｈである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３５．Ｒが、アルキルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３６．アルキルが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、およびイソプロピルの群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３７．アルキルが、メチルおよびエチルの群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３８．アルキルが、メチルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３９．Ｒが、アリールである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４０．アリールが、フェニルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４１．電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＳＯ２ＮＲ２、またはＣＮの群から選択される（式中、Ｒが、アルキルである）、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４２．電子求引基が、ＣＦ３およびＦの群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４３．電子求引基が、ＣＦ３である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４４．Ｒ１が、電子求引基であり、Ｒ２およびＲ３が、水素である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４５．Ｒ１が、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３が、水素である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４６．ｍが、０、１、２、または３であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４７．ｍが、１、２、または３であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４８．ｍが、３であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４９．ｍが、２であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５０．ｍが、１であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５１．ｍが、０であり、ｎが、３である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５２．ｍが、０であり、ｎが、２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５３．ｍが、０であり、ｎが、１である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５４．式Ａ中の両方のキラル原子が、（Ｓ）形態である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５５．インスリンペプチドが、ヒトインスリンである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５６．インスリンペプチドが、ヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５７．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、１０個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５８．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、９個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５９．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、８個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６０．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、７個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６１．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、６個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６２．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、５個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６３．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、４個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６４．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、３個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６５．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、２個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６６．インスリンペプチドが、ｄｅｓＢ３０を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６７．インスリンペプチドが、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６８．インスリンペプチドが、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであり、
ペプチド延長部が、Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃であり、
（式中、Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙが、Ｌｙｓ－Ｐｒｏとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１３～２３個のアミノ酸残基からなり、
式中、ｐが、１、２、または３であり、
式中、＃が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）
式中、Ｒ１が、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３が、水素であり、ｍが、２であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６９．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７０．Ｚが、Ｇｌｙと任意選択でそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７１．Ｚが、Ｇｌｙである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７２．Ｙが、Ｌｙｓ－Ｐｒｏとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７３．ｐが、２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７４．インスリンペプチドが、インスリン受容体に結合する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７５．インスリンペプチドが、インスリン受容体に結合し、インスリン受容体を活性化する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７６．インスリン誘導体が、インスリン受容体に結合する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７７．インスリン誘導体が、インスリン受容体を活性化する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７８．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７９．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも２０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８０．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも３０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８１．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも４０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８２．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより２０倍～８０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８３．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより３０倍～６０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８４．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより４０倍～６０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８５．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより５０倍～６０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８６．インスリン受容体親和性が、実施例１２に記載のアッセイによって決定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８７．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１５時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８８．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１６時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８９．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１７時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９０．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１８時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９１．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１９時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９２．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、１５～２５時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９３．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、１７～２３時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９４．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、１８～２３時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９５．Ｔ１／２が、実施例１６に記載の方法によって決定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９６．インスリン誘導体が、実施例４のインスリン誘導体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９７．インスリン誘導体が、下記である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９８．インスリン誘導体が、下記である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９９．インスリン誘導体が、下記である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１００．インスリン誘導体が、下記である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０１．インスリン誘導体が、下記である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０２．インスリン誘導体が、実施例４のインスリン誘導体である、インスリン誘導体。
１０３．インスリン誘導体が、下記である、インスリン誘導体。
１０４．実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体を含む、組成物。
１０５．医薬として使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０６．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの予防または治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０７．１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の予防または治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０８．糖尿病の予防または治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０９．糖尿病の治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１１０．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物の使用。
１１１．１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物の使用。
１１２．糖尿病の治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物の使用。
１１３．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
１１４．１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
１１５．糖尿病の治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
本発明は、本発明の以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される。
１．インスリン誘導体であって、
Ａ．Ｂ２９Ｋを含むインスリンペプチドと、
Ｂ．ペプチド延長部Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－ａａ１－ａａ２－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃と、
（式中、Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなり、
式中、ａａ１が、不在か、またはＰｒｏであり、
式中、ａａ２が、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
式中、ｐが、１、２、または３であり、
式中、＃が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）
Ｃ．式Ａの３個の修飾基と、
【化4】
式中、ｍが、０、１、２、または３であり、
式中、ｎが、０、１、２、または３であり、
式中、＊が、連結点を示す）を含み、
１個の修飾基が、インスリンペプチドのＢ鎖の２９位におけるＬｙｓ残基に連結し、他の２個の修飾基が、ペプチド延長部におけるＬｙｓ残基の各々に連結している、インスリン誘導体。
２．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～４個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態に記載のインスリン誘導体。
３．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６．Ｚが、１～４個のＧｌｙアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７．Ｚが、１～３個のＧｌｙアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８．Ｚが、１～２個のＧｌｙアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９．Ｚが、Ｇｌｙである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１１．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１２．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１３．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１４．Ｙが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１５．Ｙが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１５～３０個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１６．Ｙが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１７．Ｙが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１８．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１８～２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１９．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２０．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２１個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２１．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１８～２３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２２．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２３．Ｙが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２１個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２４．Ｙが、ＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧ（配列番号１３）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２５．ａａ１が、Ｐｒｏである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２６．ａａ２が、Ｇｌｕである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２７．ｐが、２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２８．ペプチド延長部が、ＧＫＰＥ（ＧＥＱＰ）４ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
２９．修飾基が、式Ａ１：
【化5】
式中、ｍが、０、１、２、または３であり、
式中、ｎが、０、１、２、または３であり、
式中、＊が、連結点を示す）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３０．電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、ＳＯ２Ｘ、およびＰＯＸ２の群から選択される（式中、Ｘが、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒが、Ｈ、アルキルまたはアリールである）、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３１．電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＸ、およびＳＯ２Ｘの群から選択される（式中、Ｘが、ＯＲまたはＮＲ２であり、Ｒが、Ｈ、アルキルまたはアリールである）、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３２．Ｘが、ＯＲである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３３．Ｘが、ＮＲ２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３４．Ｒが、Ｈである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３５．Ｒが、アルキルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３６．アルキルが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、およびイソプロピルの群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３７．アルキルが、メチルおよびエチルの群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３８．アルキルが、メチルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
３９．Ｒが、アリールである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４０．アリールが、フェニルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４１．電子求引基が、ＣＦ３、Ｆ、ＳＯ２ＮＲ２、またはＣＮの群から選択される（式中、Ｒが、アルキルである）、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４２．電子求引基が、ＣＦ３およびＦの群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４３．電子求引基が、ＣＦ３である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４４．Ｒ１が、電子求引基であり、Ｒ２およびＲ３が、水素である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４５．Ｒ１が、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３が、水素である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４６．ｍが、０、１、２、または３であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４７．ｍが、１、２、または３であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４８．ｍが、３であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
４９．ｍが、２であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５０．ｍが、１であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５１．ｍが、０であり、ｎが、３である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５２．ｍが、０であり、ｎが、２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５３．ｍが、０であり、ｎが、１である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５４．式Ａ中の両方のキラル原子が、（Ｓ）形態である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５５．インスリンペプチドが、ヒトインスリンである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５６．インスリンペプチドが、ヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５７．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、１０個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５８．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、９個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
５９．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、８個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６０．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、７個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６１．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、６個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６２．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、５個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６３．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、４個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６４．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、３個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６５．インスリンペプチドが、ヒトインスリンに対して、２個未満のアミノ酸修飾を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６６．インスリンペプチドが、ｄｅｓＢ３０を含むヒトインスリン類似体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６７．インスリンペプチドが、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６８．インスリンペプチドが、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであり、
ペプチド延長部が、Ｚ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒ）ｐ－＃であり、
（式中、Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～５個のアミノ酸残基からなり、
式中、Ｙが、Ｌｙｓ－Ｐｒｏとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１３～２３個のアミノ酸残基からなり、
式中、ｐが、１、２、または３であり、
式中、＃が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖のＮ末端への連結点を示す）
式中、Ｒ１が、ＣＦ３であり、Ｒ２およびＲ３が、水素であり、ｍが、２であり、ｎが、０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
６９．Ｚが、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～３個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７０．Ｚが、Ｇｌｙと任意選択でそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される１～２個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７１．Ｚが、Ｇｌｙである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７２．Ｙが、Ｌｙｓ－Ｐｒｏとそれに続く、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎから独立して選択される２０～２５個のアミノ酸残基からなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７３．ｐが、２である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７４．インスリンペプチドが、インスリン受容体に結合する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７５．インスリンペプチドが、インスリン受容体に結合し、インスリン受容体を活性化する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７６．インスリン誘導体が、インスリン受容体に結合する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７７．インスリン誘導体が、インスリン受容体を活性化する能力を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７８．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
７９．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも２０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８０．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも３０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８１．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも４０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８２．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより２０倍～８０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８３．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより３０倍～６０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８４．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより４０倍～６０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８５．インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、グルコースが存在しないときより５０倍～６０倍高い見かけのインスリン受容体親和性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８６．インスリン受容体親和性が、実施例１２に記載のアッセイによって決定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８７．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１５時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８８．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１６時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
８９．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１７時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９０．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１８時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９１．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、少なくとも１９時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９２．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、１５～２５時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９３．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、１７～２３時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９４．インスリン誘導体が、ＬＹＤブタに皮下投与すると、１８～２３時間のＴ１／２を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９５．Ｔ１／２が、実施例１６に記載の方法によって決定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９６．インスリン誘導体が、実施例４のインスリン誘導体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
９７．インスリン誘導体が、下記である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
１０３．インスリン誘導体が、下記である、インスリン誘導体。
【化11】
１０５．医薬として使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０６．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの予防または治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０７．１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の予防または治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０８．糖尿病の予防または治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１０９．糖尿病の治療に使用するための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体。
１１０．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物の使用。
１１１．１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物の使用。
１１２．糖尿病の治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物の使用。
１１３．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドロームＸまたはインスリン抵抗性症候群などのメタボリックシンドロームの治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
１１４．１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
１１５．糖尿病の治療または予防のための方法であって、その治療または予防を必要とする対象者に、治療有効量の実施形態１～１０３のいずれか１つに記載のインスリン誘導体または実施形態１０４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【実施例0075】
実施例におけるインスリンコンジュゲートは、アミノ酸に対する標準的な一文字略語を使用して描かれる。システイン残基の硫黄原子は、ジスルフィド架橋を図示するために具体的に描き出される。コンジュゲーションによって修飾される残基は、関連するアミノ酸において修飾が行われた正確な場所を示すために描き出される。ペプチド化学において標準的であるように、インスリンのＮ末端は、小型文字Ｈ－で示され、Ｃ末端は、小型文字－ＯＨで示される。Ｈ－および－ＯＨは、末端残基がコンジュゲーションによって修飾される場合には使用されず、その場合、残基は、上述のように拡大して描かれる。
材料および方法
略語リスト
材料および方法
略語リスト
【0076】
【表1】
【0077】
インスリン変異体の調製
［実施例１］
［酵母におけるインスリン変異体の発現、およびＡＬＰなどでの形質転換］
インスリン類似体を、例えば、国際公開第２０１７／０３２７９８号に開示されるように、周知の技法を使用して酵母において発現させた。より具体的には、イオン交換捕捉によって単離し、以下に記載されるＡＬＰでの処理によって２鎖インスリン類似体に切断した単鎖前駆体として、インスリン類似体を発現させた。
［実施例１］
［酵母におけるインスリン変異体の発現、およびＡＬＰなどでの形質転換］
インスリン類似体を、例えば、国際公開第２０１７／０３２７９８号に開示されるように、周知の技法を使用して酵母において発現させた。より具体的には、イオン交換捕捉によって単離し、以下に記載されるＡＬＰでの処理によって２鎖インスリン類似体に切断した単鎖前駆体として、インスリン類似体を発現させた。
【0078】
ＳＰセファロースＢＢ上での前駆体の捕捉：
酵母上清を、ＳＰセファロースＢＢで充填されたカラム上に１０～２０ＣＶ／時間の流量で充填した。０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５による洗浄、および４０％ ＥｔＯＨによる洗浄を行った。類似体を０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５／３５％ ＥｔＯＨで溶出した。
酵母上清を、ＳＰセファロースＢＢで充填されたカラム上に１０～２０ＣＶ／時間の流量で充填した。０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５による洗浄、および４０％ ＥｔＯＨによる洗浄を行った。類似体を０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５／３５％ ＥｔＯＨで溶出した。
【0079】
ＡＬＰ消化：
単鎖前駆体の溶液をｐＨ９に調整し、ＡＬＰ酵素を１：１００（ｗ／ｗ）添加した。ＵＨＰＬＣで反応を追跡した。ＲＰ－ＨＰＬＣ精製用に調製するために、ＡＬＰ切断プールをｐＨ２．５に調整し、２倍に希釈した。
単鎖前駆体の溶液をｐＨ９に調整し、ＡＬＰ酵素を１：１００（ｗ／ｗ）添加した。ＵＨＰＬＣで反応を追跡した。ＲＰ－ＨＰＬＣ精製用に調製するために、ＡＬＰ切断プールをｐＨ２．５に調整し、２倍に希釈した。
【0080】
ＲＰ－ＨＰＬＣ精製：
精製をＲＰ－ＨＰＬＣ Ｃ１８によって以下のように実施した：
カラム：１５ｕｍ Ｃ１８ ５０×２５０ｍｍ ２００Å
緩衝液：
Ａ：０．２％ギ酸、５％ ＥｔＯＨ、
Ｂ：０．２％ギ酸、５０％ ＥｔＯＨ
勾配：２０～５５％ Ｂ緩衝液。
勾配：２０ＣＶ
流量 ２０ＣＶ／時間
充填ｇ 約５ｇ／Ｌ樹脂
画分をＵＨＰＬＣによって分析し、プールし、凍結乾燥させた。
精製をＲＰ－ＨＰＬＣ Ｃ１８によって以下のように実施した：
カラム：１５ｕｍ Ｃ１８ ５０×２５０ｍｍ ２００Å
緩衝液：
Ａ：０．２％ギ酸、５％ ＥｔＯＨ、
Ｂ：０．２％ギ酸、５０％ ＥｔＯＨ
勾配：２０～５５％ Ｂ緩衝液。
勾配：２０ＣＶ
流量 ２０ＣＶ／時間
充填ｇ 約５ｇ／Ｌ樹脂
画分をＵＨＰＬＣによって分析し、プールし、凍結乾燥させた。
【0081】
実施例で調製および使用したインスリン類似体は以下である：
ＧＫＰＥ－（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号５）
（ＧＱＥＰ）４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号６）
（ＧＱＥＰ）２４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号７）
（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号８）。
ＧＫＰＥ－（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧ－ＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、ＧＫＰＥ－ＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＰ－ＧＥＱＧ－ＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｂ１Ｆに接続されたＣ末端Ｓ）でＢ１から延長されたｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを意味する。他の骨格についても同様である。
ＧＫＰＥ－（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号５）
（ＧＱＥＰ）４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号６）
（ＧＱＥＰ）２４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号７）
（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１および配列番号８）。
ＧＫＰＥ－（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧ－ＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、ＧＫＰＥ－ＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＰ－ＧＥＱＧ－ＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｂ１Ｆに接続されたＣ末端Ｓ）でＢ１から延長されたｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを意味する。他の骨格についても同様である。
【0082】
構成ブロックの調製
［実施例２］
［（Ｓ）－４－（（Ｓ）－２，３－ビス（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）プロパンアミド）－５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－５－オキソペンタン酸
］
ＮＢＳ（３４．０ｇ、１９１ｍｍｏｌ）を濃硫酸（４００ｍＬ）中の３－トリフルオロメチル－４－メチル安息香酸（３９．０ｇ、１９１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を氷水（２Ｌ）に注いだ。得られた沈殿物を濾過して取り除き、水（５００ｍＬ）で洗浄し、酢酸エチル（４００ｍＬ）中に溶解し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、３－ブロモ－４－メチル－５－トリフルオロメチル安息香酸を白色固体として得た。収量：５３．４ｇ（９８％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δＨ）：１３．７１（ｂｓ，１Ｈ）；８．３５（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，１Ｈ）；８．１５（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ）；２．５６（ｓ，３Ｈ）。
［実施例２］
［（Ｓ）－４－（（Ｓ）－２，３－ビス（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）プロパンアミド）－５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－５－オキソペンタン酸
］
【化12】
【0083】
濃硫酸（２４ｍＬ）をメタノール（５００ｍＬ）中の３－ブロモ－４－メチル－５－トリフルオロメチル安息香酸（３５．０ｇ、１２４ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、反応混合物を還流下で４時間、および室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で蒸発させ、ジエチルエーテル（２５０ｍＬ）中に溶解し、水（２×１００ｍＬ）、ならびに炭酸カリウム（１００ｍＬ）の飽和溶液および食塩水（１００ｍＬ）の混合物で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、３－ブロモ－４－メチル－５－トリフルオロメチル安息香酸メチルを白色固体として得た。収量：３５．３ｇ（９６％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δＨ）：８．３６（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）；８．１３（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．９０（ｓ，３Ｈ）；２．５５（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，３Ｈ）。
【0084】
水（３００ｍＬ）中のＮＢＳ（３１．７ｇ、１７８ｍｍｏｌ）および３－ブロモ－４－メチル－５－トリフルオロメチル安息香酸メチル（３５．３ｇ、１１９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、８０℃において１００Ｗの電球下で６時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、３－ブロモ－４－ブロモメチル－５－トリフルオロメチル安息香酸メチルを黄色固体として得た。収量：４４．０ｇ（９８％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δＨ）：８．４７（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）；８．３１（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．７５（ｓ，２Ｈ）；３．９８（ｓ，３Ｈ）。
【0085】
ＭｅＣＮ（０．５Ｌ）中、３－ブロモ－４－ブロモメチル－５－トリフルオロメチル安息香酸メチル（４４．０ｇ、１１７ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（２２．９ｇ、２３４ｍｍｏｌ）の溶液を７５℃で一晩撹拌した。懸濁液を濾紙を通して濾過し、蒸発させた。粗生成物をジクロロメタン中に溶解し、再び濾過した。蒸発により、４－（アセトキシメチル）－３－ブロモ－５－（トリフルオロメチル）安息香酸メチルを白色固体として得た。収量：３７．９ｇ（９１％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δＨ）：８．４９（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）；８．３４（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）；５．３７（ｓ，２Ｈ）；３．９９（ｓ，３Ｈ）；２．１１（ｓ，３Ｈ）。
【0086】
脱水テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中、４－（アセトキシメチル）－３－ブロモ－５－（トリフルオロメチル）安息香酸メチル（３７．９ｇ、１０７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラート）ジボロン（２９．８ｇ、１１７ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（３１．４ｇ、２９４ｍｍｏｌ）、および［１，１－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１．５７ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下で１３日間、７５℃で撹拌した。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラム（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ、０．０６３～０．２００ｍｍ、溶離液：シクロヘキサン／酢酸エチル８：１）を通して濾過して、４－（アセトキシメチル）－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－５－（トリフルオロメチル）安息香酸メチルを得た。収量：３１．１ｇ（７２％）。ＲＦ（ＳｉＯ２、シクロヘキサン／酢酸エチル８：１）：０．４０。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δＨ）：８．６５（ｓ，１Ｈ）；８．４３（ｓ，１Ｈ）；５．４８（ｓ，２Ｈ）；３．９７（ｓ，３Ｈ）；２．０５（ｓ，３Ｈ）；１．３６（ｓ，１２Ｈ）。
【0087】
水（３００ｍＬ）中の４－（アセトキシメチル）－３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－５－（トリフルオロメチル）安息香酸メチル（３１．０ｇ、７７．１ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（１５．４ｇ、３８６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で３時間撹拌した。次いで、水（１００ｍＬ）中の塩酸（３５ｍＬ）の溶液を添加して、ｐＨを１に低下させた。反応混合物を一晩撹拌した。沈殿物を濾過して取り除き、乾燥させて、１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボン酸を白色固体として得た。収量：１６．６ｇ（８６％）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δＨ）：１３．４７（ｂｓ，１Ｈ）；９．６６（ｓ，１Ｈ）；８．６２（ｓ，１Ｈ）；８．２４（ｓ，１Ｈ）；５．２２（ｓ，２Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δＨ）：１３．４７（ｂｓ，１Ｈ）；９．６６（ｓ，１Ｈ）；８．６２（ｓ，１Ｈ）；８．２４（ｓ，１Ｈ）；５．２２（ｓ，２Ｈ）。
【0088】
ＭｅＣＮ（０．５Ｌ）中、ペンタフルオロフェノール（７．４８ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボン酸（１０．０ｍｇ、４０．７ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８．３７ｍｇ、４０．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、蒸発させ、ＭｅＣＮ中に溶解し、再濾過し、蒸発させて、ペンタフルオロフェニル１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキシレートを白色固体として得た。
収量：１６．７ｇ（１００％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δＨ）：９．７９（ｓ，１Ｈ）；８．８６（ｓ，１Ｈ）；８．４６（ｓ，１Ｈ）；５．３０（ｓ，２Ｈ）。
収量：１６．７ｇ（１００％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，δＨ）：９．７９（ｓ，１Ｈ）；８．８６（ｓ，１Ｈ）；８．４６（ｓ，１Ｈ）；５．３０（ｓ，２Ｈ）。
【0089】
２－クロロトリチルクロリド樹脂１００～２００メッシュ１．５ｍｍｏｌ／ｇ（３、４．４７ｇ、６．７１ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（３０ｍＬ）中に３０分間放置し膨潤させた。脱水ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の（２Ｓ）－５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝－５－オキソペンタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、１．９０ｇ、４．４７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．９６ｍＬ、１７．０ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、メタノール／ジクロロメタン混合物（４：１、２×５分、２×４０ｍＬ）中のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．５６ｍＬ、８．９５ｍｍｏｌ）の溶液で処理した。次いで、樹脂をＤＭＦ（２×３０ｍＬ）、ジクロロメタン（２×４０ｍＬ）およびＤＭＦ（３×４０ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（１×５分、１×２０分、２×４０ｍＬ）で処理することにより、Ｆｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＭＦ（３×４０ｍＬ）、２－プロパノール（２×４０ｍＬ）およびジクロロメタン（３×４０ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ（４０ｍＬ）中、（Ｓ）－２，３－ビス（（（（９Ｈ－フルオレン－９－ｙｌ）メトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（Ｆｍｏｃ－Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ、３．６８ｇ、６．７１ｍｍｏｌ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、２．５５ｇ、６．７１ｍｍｏｌ）、および２，４，６－トリメチルピリジン（１．６０ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に添加し、混合物を２時間振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（２×４０ｍＬ）、ジクロロメタン（２×４０ｍＬ）およびＤＭＦ（２×４０ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（１×５分、１×３０分、２×４０ｍＬ）で処理することにより、Ｆｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＭＦ（３×４０ｍＬ）、２－プロパノール（２×４０ｍＬ）およびジクロロメタン（３×４０ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のペンタフルオロフェニル１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキシレート（５．５３ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．９９ｍＬ、３５．８ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６×４０ｍＬ）およびジクロロメタン（１０×５０ｍＬ）で洗浄した。生成物を、２，２，２－トリフルオロエタノール（６０ｍＬ）で１６時間処理することによって樹脂から切断した。樹脂を濾過して取り除き、ジクロロメタン（４×５０ｍＬ）で洗浄した。粗生成物（４）を真空中で乾燥させ、酢酸エチル（２×７０ｍＬ）および１Ｍの硫酸水素カリウム水溶液（５０ｍＬ）で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。次いで、粗生成物をジエチルエーテル（２０ｍＬ）中で粉砕して、（Ｓ）－４－（（Ｓ）－２，３－ビス（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）プロパンアミド）－５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－５－オキソペンタン酸をベージュ色固体として得た。収量：１．８９ｇ（５７％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＡｃＯＤ－ｄ４，δＨ）：８．５０（ｓ，１Ｈ）；８．４６（ｓ，１Ｈ）；８．２９（ｓ，１Ｈ）；８．２６（ｓ，１Ｈ）；５．２８（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，４Ｈ）；５．２０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）；４．５５（ｄｄ，Ｊ＝８．５および５．２Ｈｚ，１Ｈ）；４．０８（ｄｄ，Ｊ＝６．０および２．１Ｈｚ，２Ｈ）；２．５７－２．４２（ｍ，２Ｈ）；２．３４－２．１６（ｍ，１Ｈ）；２．１７－２．０８（ｍ，１Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：７４６．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【0090】
［実施例３］
［（Ｓ）－３－（２，３－ビス（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）プロパンアミド）プロパン酸＝Ｎアルファ，Ｎベータ－ビス－（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）－Ｌ－ジアミノプロピオナント］－ベータ－アラニン］
ＭｅＣＮ（４００ｍＬ）および水（４００ｍＬ）の混合物中、Ｌ－ジアミノプロパン酸塩酸塩（（Ｓ）－２，３－ジアミノプロパン酸塩酸塩）（１５．０ｇ、１０７ｍｍｏｌ）、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（４６．６ｇ、２１４ｍｍｏｌ）、および重炭酸カリウム（３２．０ｇ、３２０ｍｍｏｌ）の溶液を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、ｐＨ＝１が達成されるまで残渣を硫酸水素カリウムの飽和水溶液で酸性化した。反応混合物を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、（Ｓ）－２，３－ビス（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸をオフホワイト色固体として得た。収量：２８．２ｇ（８７％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δＨ）：５．８５（ｂｓ，１Ｈ）；５．１７（ｂｓ，１Ｈ）；４．３１（ｂｓ，１Ｈ）；３．６４－３．４６（ｍ，２Ｈ）；１．４６（ｓ，１８Ｈ）。
［（Ｓ）－３－（２，３－ビス（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）プロパンアミド）プロパン酸＝Ｎアルファ，Ｎベータ－ビス－（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）－Ｌ－ジアミノプロピオナント］－ベータ－アラニン］
【化13】
【0091】
ジクロロメタン（３００ｍＬ）中、（Ｓ）－２，３－ビス（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（２７．９ｇ、９１．７ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル３－アミノプロパノエート（１６．７ｇ、９１．７ｍｍｏｌ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ、２１．１ｇ、１１０ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、１５．０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６４．０ｍＬ、３６７ｍｍｏｌ）の溶液を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル（６００ｍＬ）中に溶解し、１Ｍの塩酸水溶液（４×３００ｍＬ）および重炭酸ナトリウムの飽和水溶液（４×３００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３－（２，３－ビス（（ｔｅｒｔ－ブトキシ－カルボニル）アミノ）プロパンアミド）プロパノエートをオフホワイト色固体として得た。収量：３６．１ｇ（９１％）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δＨ）：７．０１（ｂｓ，１Ｈ）；５．７５（ｂｓ，１Ｈ）；５．１４（ｂｓ，１Ｈ）；４．１５（ｂｓ，１Ｈ）；３．５７－３．３９（ｍ，４Ｈ）；２．４３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；１．４５（ｓ，２７Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δＨ）：７．０１（ｂｓ，１Ｈ）；５．７５（ｂｓ，１Ｈ）；５．１４（ｂｓ，１Ｈ）；４．１５（ｂｓ，１Ｈ）；３．５７－３．３９（ｍ，４Ｈ）；２．４３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；１．４５（ｓ，２７Ｈ）。
【0092】
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３－（２，３－ビス（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパンアミド）プロパノエート（３６．１ｇ、８３．７ｍｍｏｌ）の溶液に、９５％トリフルロ酢酸水溶液（３００ｍＬ）を添加し、溶液を３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＭｅＣＮ（３×３００ｍＬ）で共蒸発させ、脱水ジエチルエーテル（３００ｍＬ）中の１Ｍ塩化水素溶液で処理した。沈殿物を濾過して取り除き、ＭｅＣＮ（２×６００ｍＬ）で粉砕して、（Ｓ）－３－（（２－カルボキシエチル）アミノ）－３－オキソプロパン－１，２－ジアミニウムクロリドを白色粉末として得た。
収量：２２．２ｇ（１００％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δＨ）：４．３５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．６３－３．４６（ｍ，４Ｈ）；２．６７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）。
収量：２２．２ｇ（１００％）。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δＨ）：４．３５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．６３－３．４６（ｍ，４Ｈ）；２．６７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）。
【0093】
水（５０ｍＬ）中の（Ｓ）－３－（（２－カルボキシエチル）アミノ）－３－オキソプロパン－１，２－ジアミニウムクロリド（６．４１ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３３．８ｍｍｏｌ、２４３ｍｍｏｌ）の溶液に、１，４－ジオキサン（１００ｍＬ）中のペンタフルオロフェニル１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキシレート（実施例２からの、２０．０ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、溶液を一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）と１Ｍ硫酸水素カリウム水溶液（１５００ｍＬ）との間で分割した。有機層を、１Ｍ硫酸水素カリウム水溶液（１×３００ｍＬ）で洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジエチルエーテル（２×１５０ｍＬ）で粉砕し、濾過した。固体を７０％水性ＭｅＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解し、凍結乾燥させて、（Ｓ）－３－（２，３－ビス（１－ヒドロキシ－４－（トリフルオロメチル）－１，３－ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２］オキサボロール－６－カルボキサミド）プロパンアミド）プロパン酸を白色粉末として得た。収量：１２．１ｇ（８０％）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＡｃＯＤ－ｄ４，δＨ）：８．５１（ｓ，１Ｈ）；８．４７（ｓ，１Ｈ）；８．２９（ｓ，１Ｈ）；８．２７（ｓ，１Ｈ）；５．２８（ｓ，４Ｈ）；５．１５（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）；４．１５－３．９９（ｍ，２Ｈ）；３．６１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．６７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：６３２．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＡｃＯＤ－ｄ４，δＨ）：８．５１（ｓ，１Ｈ）；８．４７（ｓ，１Ｈ）；８．２９（ｓ，１Ｈ）；８．２７（ｓ，１Ｈ）；５．２８（ｓ，４Ｈ）；５．１５（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）；４．１５－３．９９（ｍ，２Ｈ）；３．６１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．６７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ：６３２．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【0094】
インスリン誘導体の調製
実施例２の構成ブロックをテトラヒドロフラン中でＮＨＳ／ＤＩＣで活性化し、ｔＢｕ保護基をＴＦＡで処理することによって除去した。次いで、ＴＦＡを、インスリンとのコンジュゲーションの前に蒸発させた。
実施例２の構成ブロックをテトラヒドロフラン中でＮＨＳ／ＤＩＣで活性化し、ｔＢｕ保護基をＴＦＡで処理することによって除去した。次いで、ＴＦＡを、インスリンとのコンジュゲーションの前に蒸発させた。
【0095】
実施例３の構成ブロックを、インスリンとのコンジュゲーションの前に、ＭｅＣＮ中のＮＨＳ／ＤＩＣを使用して活性化した。
【0096】
Ｃ１８カラム、ならびに水中の０．１％ＴＦＡを緩衝液Ａとして、およびＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡを緩衝液Ｂとして使用して、ＬＣＭＳ分析を実施した。
【0097】
ホウ素－インスリン誘導体のＬＣＭＳは、一般に、主ピークとして様々な脱水種、例えば、最大で「ｍ」数のボロキソールを有するイオン化状態「ｎ」に関する［Ｍ＋ｎＨ－１×ｍ Ｍ水］ｎ＋を示す。
【0098】
［実施例４］
ＧＫＰＥ－（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（５３６ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４（５．６ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２．４ｍＬ）中に溶解し、１．０ＭのＮａＯＨ水溶液によってｐＨを１０．８に調整した。実施例２の構成ブロック（１４７ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を上述のようにＮＨＳ活性化し、ｔＢｕ脱保護し、次いで、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に溶解し、１０分間にわたって所与のインスリン溶液に滴加し、一方で０．１ＭのＮａＯＨを滴加することによってｐＨを１０．８付近に保持した。ＬＣＭＳは、所望の生成物の形成を示す。混合物をＭｅＣＮおよび水で希釈し、１ＭのＨＣｌを滴加することによってｐＨを３．８に調整した。生成物を、水中の０．１％ＴＦＡを緩衝液Ａとして、およびＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡを緩衝液Ｂとして使用した、Ｃ１８カラム上の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。生成物を凍結乾燥によって単離した。ＬＣＭＳ測定値１８９４．１［Ｍ＋６Ｈ－５×水］６＋、計算値１８９４．１；１６２３．６［Ｍ＋７Ｈ－５×水］７＋、計算値１６２３．６；１４２０．８［Ｍ＋８Ｈ－５×水］８＋、計算値１４２０．８；および１２６３．０［Ｍ＋９Ｈ－５×水］９＋、計算値１２６３．０、Ｃ４８０Ｈ６６６Ｂ６Ｆ１８Ｎ１２２Ｏ１６９Ｓ６に関する。
【化14】
【0099】
［実施例５］
［（比較化合物）］
実施例５のインスリン誘導体を、（ＧＱＥＰ）４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンおよび実施例２の構成ブロックから、実施例４のインスリン誘導体と同様に調製した。生成物のＬＣＭＳの測定値２０４９．０［Ｍ＋５Ｈ－３×水］５＋、計算値２０４９．０。
［（比較化合物）］
【化15】
【0100】
［実施例６］
［（比較化合物）］
実施例６のインスリン誘導体を、（ＧＱＥＰ）２４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンおよび実施例２の構成ブロックから、実施例４のインスリン誘導体と同様に調製した。生成物のＬＣＭＳの測定値１８４７．８［Ｍ＋１０Ｈ－３×水］１０＋、計算値１８４７．８。
［（比較化合物）］
【化16】
【0101】
［実施例７］
［（比較化合物）］
実施例７のインスリン誘導体を、（ＧＱＥＰ）４－ＧＱＥＧＧＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンおよび実施例３の構成ブロックから、実施例４のインスリン誘導体と同様に調製した。生成物のＬＣＭＳの測定値２０２９．２［Ｍ＋５Ｈ－２×水］５＋、計算値２０２９．４。
［（比較化合物）］
【化17】
【0102】
［実施例８］
［（比較化合物）］
実施例８のインスリン誘導体を、（ＧＥＱＰ）４－ＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－Ｂ１ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンおよび実施例３の構成ブロックから、実施例４のインスリン誘導体と同様に調製した。生成物のＬＣＭＳの測定値２０３６．３［Ｍ＋５Ｈ－４×水］５＋、計算値２０３６．６。
［（比較化合物）］
【化18】
【0103】
［実施例９］
［（先行技術化合物）］
ここで示されるインスリン誘導体は、国際公開第２０２０／２０１０４１号における実施例３２４の化合物である。これは先行技術化合物であるが、参照しやすいように構造をここに示す。
［（先行技術化合物）］
【化19】
【0104】
［実施例１０］
［先行技術化合物）］
ここで示されるインスリン誘導体は、国際公開第２０２０／２０１０４１号における実施例２８０の化合物である。これは先行技術化合物であるが、参照しやすいように構造をここに示す。
［先行技術化合物）］
【化20】
【0105】
［実施例１１］
［ＡＬＰ切断速度］
インスリンが組み換え的に生成される場合、単鎖前駆体として発現され、これは後に、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓリシル特異的エンドプロテアーゼＥＣ ３．４．２１．５０（ＡＬＰ）またはトリプシンなどのプロテアーゼを使用して２鎖インスリンへと成熟される。ＡＬＰは、リシル－プロリン結合を含むリシル結合を特異的かつ独占的に切断する（Ｎｏｒｉｏｋａ ＆ Ｓａｋｉｙａｍａ（１９９３）Ｌｙｓｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ Ｌｙｔｉｃｕｓ：Ｉｔｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｐ．１０１－１０６、Ｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ Ｍ４９７－Ｉ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．１４４３－１４４５）。
［ＡＬＰ切断速度］
インスリンが組み換え的に生成される場合、単鎖前駆体として発現され、これは後に、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓリシル特異的エンドプロテアーゼＥＣ ３．４．２１．５０（ＡＬＰ）またはトリプシンなどのプロテアーゼを使用して２鎖インスリンへと成熟される。ＡＬＰは、リシル－プロリン結合を含むリシル結合を特異的かつ独占的に切断する（Ｎｏｒｉｏｋａ ＆ Ｓａｋｉｙａｍａ（１９９３）Ｌｙｓｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ Ｌｙｔｉｃｕｓ：Ｉｔｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｐ．１０１－１０６、Ｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ Ｍ４９７－Ｉ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．１４４３－１４４５）。
【0106】
切断部位の左側にあるＰｎ－Ｐ１および右側にあるＰ１’－Ｐｎ
’の周辺位置におけるアミノ酸残基（ＡＡ）は、酵素の切断能力に影響を与えることなく、非常に広範囲にわたって変化させることができる（Ｓａｋｉｙａｍａ ＆ Ｍａｓａｋｉ（１９９４）Ｌｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｏｆ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２４４，ｐｐ．１２６－１３７）。
【0107】
しかしながら、切断速度は、特定の隣接するアミノ酸によって影響を受ける。例えば、プロリンがＰ１’位に見られる場合、または１もしくは２個の塩基性アミノ酸がリシン残基に先行する場合、切断はゆっくりと進行する（Ｔｓｕｓａｎａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｆ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．１１１－１２１、Ｓａｋｉｙａｍａ ＆ Ｍａｓａｋｉ（１９９４），Ｌｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｏｆ Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２４４，ｐｐ．１２６－１３７）。
【0108】
この実施例では、リシン（Ｋ）の後の第２の位置（Ｐ２’）にグルタミン酸（Ｅ）を有するＡＬＰ切断速度に対する効果を決定した。参照インスリン前駆体は、Ｐ２’においてグリシン（Ｇ）を含有した。両方の場合において、切断部位（Ｐ１’）の後の第１の位置におけるアミノ酸は、プロリン（Ｐ）であった。
【0109】
ＡＬＰ切断速度を決定するために、表１の２つのインスリン前駆体をＡＬＰで切断し、切断産物の形成をＵＰＬＣ－ＭＳによって経時的に追跡した（結果を表２および表３に示す）。
【表2】
【0110】
インスリン前駆体を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで生成した。簡潔に述べると、関連するインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を、組み換えタンパク質をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの分泌経路に誘導するように設計されたベクターにクローニングした。構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に変換し、続いて、Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｆｌｕｘｅｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔｓ：Ａ Ｃｏｎｔｉｎｏｕｓ－Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．８，ｐｐ．５０１－５１７によって記載されるように調製した（ただし、６％グルコースを添加した）定義されたグルコース培地で培養した。インスリン前駆体を含有する上清を、１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）を使用してｐＨ８．５に調整し、水で希釈して、１５０ｍｇの前駆体／Ｌの最終濃度にした。ＡＬＰをｐＨ調整した上清に０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、０分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、および１４４０分の時点で試料を取り出すことによって、反応を経時的に追跡した。ＡＬＰ反応を停止するために、上清を４ＭのＣＨ３ＣＯＯＨにおいて１：１に希釈した。ＡＬＰ切断試料中の切断産物を特定し、ＵＰＬＣ－ＭＳを使用して定量化した。結果を表２および表３に示す。
【0111】
所望の切断生成物は、「オープンインスリン前駆体」と示され、ヒトインスリンのＢ２９位におけるＬｙｓに対応するＬｙｓ残基でのみ切断される（それぞれ、配列番号２０および配列番号２１の７７位のＬｙｓ残基（Ａ７７とも示される））。したがって、オープンインスリン前駆体１については、Ａ鎖の配列は、ＳＤＤＭＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号２２）であり、Ｂ鎖の配列は、ＥＥＡＥＰＲＧＫＰＥＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＰＧＥＱＧＧＫＰＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫ（配列番号２３）である。「過剰切断インスリン前駆体」という用語は、ＡＡ７７での切断に加えて、それぞれ配列番号２０および配列番号２１の８位（ＡＡ８とも示される）および／または３２位（ＡＡ３２とも示される）のＬｙｓ残基でさらに切断された切断産物を示すために使用される。
【0112】
オープンインスリン前駆体は、リシン残基で精製および化学修飾され、次いで、それぞれＢ鎖およびＡ鎖上のＮ末端延長部のトリプシン切断によって完全に成熟され得る（この概念は、国際公開第２００５／０４７５０８Ａ１号に記載されている）。この実施例の特定のオープンインスリン前駆体１について、適切な修飾基で３個のリシン残基で共有結合的にコンジュゲートし、続いてトリプシンによってＮ末端延長部ＥＥＡＥＰＲおよびＳＤＤＭＲを切断することが、実施例４のインスリン誘導体をもたらすだろう。
【0113】
ＡＬＰ切断速度は、Ｐ２’位のアミノ酸によって大きく影響を受けることが見出された。Ｐ２’がグリシン（Ｇ）である場合、切断は３個のリシン残基の全てで急速に進行し、ＡＡ７７が完全に切断されるずっと前に、６０分後に既に過剰切断が観察された（表３）。逆に、Ｐ２’位のＡＡがグルタミン酸（Ｅ）である場合、切断は非常にゆっくりと進行した。６０分および１２０分の時点で、ＡＡ７７は、ほぼ１００％切断されるが、一方で残基ＡＡ８およびＡＡ３２での切断は検出できなかった（表２）。ＡＡ８およびＡＡ３２での切断は、２４０分よりも長い延長されたインキュベーション時間の後にのみ観察され、全ての場合において、限られた程度までしか観察されない。
【0114】
結論として、リシン残基ＡＡ８およびＡＡ３２におけるＡＬＰ過剰切断による前駆体損失は、Ｐ１’－Ｐ２’位にＰＥを有することによって、同じ位置にＰＧを有する場合と比較して、著しく低減され得る。
【表3】
【表4】
【0115】
インスリン誘導体の機能データ
［実施例１２］
［グルコースの非存在下または存在下でのヒトインスリン受容体（ＨＩＲ－Ａ）に対する親和性を決定するためのアッセイ］
インスリン受容体の調製
ヒトインスリン受容体Ａ（ＨＩＲ－Ａ）を過剰発現させるベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、および１０％のグリセロール中に溶解させた。除去された細胞溶解物を、小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）－アガロース（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ－Ａｇａｒｏｓｅからのレクチン、Ｌ１３９４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で９０分間バッチ吸収した。２０体積の５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で受容体を洗浄し、その後、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５Ｍのｎ－アセチルグルコサミン、および１０％のグリセロールで受容体を溶出した。全ての緩衝液は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７ ＰＬｏｓ Ｏｎｅ １２に記載されるようなプロテアーゼカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有した。
［実施例１２］
［グルコースの非存在下または存在下でのヒトインスリン受容体（ＨＩＲ－Ａ）に対する親和性を決定するためのアッセイ］
インスリン受容体の調製
ヒトインスリン受容体Ａ（ＨＩＲ－Ａ）を過剰発現させるベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）細胞を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、および１０％のグリセロール中に溶解させた。除去された細胞溶解物を、小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）－アガロース（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ－Ａｇａｒｏｓｅからのレクチン、Ｌ１３９４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で９０分間バッチ吸収した。２０体積の５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で受容体を洗浄し、その後、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５Ｍのｎ－アセチルグルコサミン、および１０％のグリセロールで受容体を溶出した。全ての緩衝液は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７ ＰＬｏｓ Ｏｎｅ １２に記載されるようなプロテアーゼカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有した。
【0116】
インスリン受容体シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）結合アッセイ
ＳＰＡ ＰＶＴ抗マウスビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０からなるＳＰＡ結合緩衝液中で希釈した。ＳＰＡビーズをＩＲ特異性抗体８３－７（Ｓｏｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３５，１９９－２０８）および可溶化半精製ＨＩＲ－Ａでインキュベートした。５０００ｃｐｍの１２５Ｉ－（Ｔｙｒ３１）－インスリン（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）の１０％結合を達成するように受容体濃度を調整した。冷たいリガンドの希釈系列を９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅに添加し、続いてトレーサー（１２５Ｉ－インスリン、５０００ｃｐｍ／ウェル）および最後に受容体／ＳＰＡ混合物を添加した。グルコース感受性を試験するために、結合実験を、２０ｍＭグルコースの非存在下または存在下で設定した。プレートを２２℃で２２．５時間穏やかに揺動させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で計数した。データ点を、４パラメータロジスティックモデルに適合させ、それにより、ヒトインスリン（同一プレート内の）と比較したインスリン誘導体の相対親和性を決定した。ヒトインスリンと比較したインスリン誘導体の相対親和性を決定し、０～２０ｍＭグルコースの見かけの相対親和性の増加は、各実験におけるインスリン誘導体のグルコース感受性を反映する。実験は、生理学的状態を模倣するために、１．５％のＨＳＡ（ｗ／ｗ）の非存在下および存在下で行われた。データを、表４ａ（ＨＳＡなし）および表４ｂ（１．５％のＨＳＡ）に示す。
ＳＰＡ ＰＶＴ抗マウスビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０からなるＳＰＡ結合緩衝液中で希釈した。ＳＰＡビーズをＩＲ特異性抗体８３－７（Ｓｏｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３５，１９９－２０８）および可溶化半精製ＨＩＲ－Ａでインキュベートした。５０００ｃｐｍの１２５Ｉ－（Ｔｙｒ３１）－インスリン（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）の１０％結合を達成するように受容体濃度を調整した。冷たいリガンドの希釈系列を９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅに添加し、続いてトレーサー（１２５Ｉ－インスリン、５０００ｃｐｍ／ウェル）および最後に受容体／ＳＰＡ混合物を添加した。グルコース感受性を試験するために、結合実験を、２０ｍＭグルコースの非存在下または存在下で設定した。プレートを２２℃で２２．５時間穏やかに揺動させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で計数した。データ点を、４パラメータロジスティックモデルに適合させ、それにより、ヒトインスリン（同一プレート内の）と比較したインスリン誘導体の相対親和性を決定した。ヒトインスリンと比較したインスリン誘導体の相対親和性を決定し、０～２０ｍＭグルコースの見かけの相対親和性の増加は、各実験におけるインスリン誘導体のグルコース感受性を反映する。実験は、生理学的状態を模倣するために、１．５％のＨＳＡ（ｗ／ｗ）の非存在下および存在下で行われた。データを、表４ａ（ＨＳＡなし）および表４ｂ（１．５％のＨＳＡ）に示す。
【0117】
本発明のインスリン誘導体は、ＨＳＡに結合し、それ故にＨＩＲ親和性がＨＳＡの存在下で測定される場合、ある割合のインスリン誘導体は、ＨＳＡに結合され、ヒトインスリン受容体に結合できない。したがって、「見かけの親和性」という用語は、１．５％のＨＳＡの存在下で測定された親和性を説明するために使用される。
【0118】
ＨＩＲ（ヒトインスリン受容体）グルコース係数は、個々の実験において、２０ｍＭのグルコースでの見かけの相対ＨＩＲ親和性を、グルコースの非存在下での相対親和性で割ったものとして決定された。いくつかの実験からの平均グルコース係数を表４ａおよび表４ｂに提供する。表４ａおよび表４ｂに提供されるグルコース係数は、個々の実験で決定された平均グルコース係数であり、したがって、グルコースの存在下での平均ＨＩＲ親和性を、グルコースの非存在下での平均ＨＩＲ親和性で割ることによって得られた値とはわずかに異なり得る。
【0119】
本発明のインスリン誘導体
表４ａおよび表４ｂのデータは、アルブミン依存性グルコース感受性を示す。実施例４のインスリン誘導体の見かけのインスリン受容体親和性は、ＨＳＡの非存在下と比較して、ＨＳＡの存在下で測定された場合に減少する（表４ａのデータを表４ｂのデータと比較されたい）。グルコースは、ＨＳＡへの実施例４のインスリン誘導体の結合を移動させることができ、それによって、グルコースが存在しない場合と比較して、２０ｍＭのグルコースおよび１．５％のＨＳＡの存在下で見かけのＨＩＲを増加させる（表４ｂのデータを参照された）。これは、グルコースが存在しない場合と比較して、相対インスリン受容体親和性が、２０ｍＭのグルコースの存在下でより高い場合に、１を上回るグルコース係数から容易に見ることができる。したがって、インスリン誘導体は、ＨＳＡの存在下で、グルコース感受性様式でインスリン受容体に結合し、したがって、インスリン誘導体は、糖尿病のグルコース感受性治療の可能性を有し、インスリン誘導体は、低い血糖レベルでは不活性であるか、または活性が低く、より高い血糖レベルではインスリン受容体に結合し、インスリン受容体を活性化する。表４ｂから分かるように、実施例４のインスリン誘導体は、１．５％のＨＳＡの存在下で、５１．９の高いグルコース係数を有する。
表４ａおよび表４ｂのデータは、アルブミン依存性グルコース感受性を示す。実施例４のインスリン誘導体の見かけのインスリン受容体親和性は、ＨＳＡの非存在下と比較して、ＨＳＡの存在下で測定された場合に減少する（表４ａのデータを表４ｂのデータと比較されたい）。グルコースは、ＨＳＡへの実施例４のインスリン誘導体の結合を移動させることができ、それによって、グルコースが存在しない場合と比較して、２０ｍＭのグルコースおよび１．５％のＨＳＡの存在下で見かけのＨＩＲを増加させる（表４ｂのデータを参照された）。これは、グルコースが存在しない場合と比較して、相対インスリン受容体親和性が、２０ｍＭのグルコースの存在下でより高い場合に、１を上回るグルコース係数から容易に見ることができる。したがって、インスリン誘導体は、ＨＳＡの存在下で、グルコース感受性様式でインスリン受容体に結合し、したがって、インスリン誘導体は、糖尿病のグルコース感受性治療の可能性を有し、インスリン誘導体は、低い血糖レベルでは不活性であるか、または活性が低く、より高い血糖レベルではインスリン受容体に結合し、インスリン受容体を活性化する。表４ｂから分かるように、実施例４のインスリン誘導体は、１．５％のＨＳＡの存在下で、５１．９の高いグルコース係数を有する。
【表5】
【表6】
【0120】
比較のために含まれるインスリン誘導体
表５では、インスリンＢ鎖のＮ末端でのペプチド延長部を除いて同一である３つのインスリン誘導体についてのデータを示す。インスリン誘導体の構造は、それぞれ実施例５、６、および９に提供されており、ペプチド延長部の配列は、参照しやすいように表５に示される。これらのインスリン誘導体の修飾基は、実施例４のインスリン誘導体の修飾基と同一である。しかしながら、本発明の実施例４のインスリン誘導体と比較して、これらのインスリン誘導体は、２個の修飾基のみを有する。国際公開第２０２０／２０１０４１号からの実施例３２４の先行技術化合物（参照しやすいように実施例９に示す構造）は、インスリン骨格のＢ１位にペプチド延長部ＧＫＰ（Ｇ４Ｓ）３を有する。ペプチド延長部を２０個のアミノ酸残基でさらに長くすることにより（実施例５の比較インスリン誘導体におけるように）、グルコース係数が４６．５から２６．３に減少することが分かる。ペプチド延長部が、１００個のアミノ酸残基で、実施例６の比較インスリン誘導体のように、より一層長くされる場合、グルコース係数は１８．６により一層低減される。
表５では、インスリンＢ鎖のＮ末端でのペプチド延長部を除いて同一である３つのインスリン誘導体についてのデータを示す。インスリン誘導体の構造は、それぞれ実施例５、６、および９に提供されており、ペプチド延長部の配列は、参照しやすいように表５に示される。これらのインスリン誘導体の修飾基は、実施例４のインスリン誘導体の修飾基と同一である。しかしながら、本発明の実施例４のインスリン誘導体と比較して、これらのインスリン誘導体は、２個の修飾基のみを有する。国際公開第２０２０／２０１０４１号からの実施例３２４の先行技術化合物（参照しやすいように実施例９に示す構造）は、インスリン骨格のＢ１位にペプチド延長部ＧＫＰ（Ｇ４Ｓ）３を有する。ペプチド延長部を２０個のアミノ酸残基でさらに長くすることにより（実施例５の比較インスリン誘導体におけるように）、グルコース係数が４６．５から２６．３に減少することが分かる。ペプチド延長部が、１００個のアミノ酸残基で、実施例６の比較インスリン誘導体のように、より一層長くされる場合、グルコース係数は１８．６により一層低減される。
【0121】
したがって、驚くべきことに、本発明の実施例４のインスリン誘導体は、実施例５のインスリン誘導体と類似の長さのペプチド延長部を有するにもかかわらず、５１．９のグルコース係数を示す。
【表7】
【0122】
表６では、インスリンＢ鎖のＮ末端でのペプチド延長部を除いて同一である３つのインスリン誘導体についてのデータを示す。これらのインスリン誘導体の修飾基は、表５のインスリン誘導体の修飾基とは異なる。インスリン誘導体の構造は、それぞれ実施例７、８、および１０に提供されており、ペプチド延長部の配列は、参照しやすいように表６に提供される。国際公開第２０２０／２０１０４１号からの実施例２８０の先行技術化合物（参照しやすいように実施例１０に示す構造）は、インスリン骨格のＢ１位にペプチド延長部ＧＫＰ（Ｇ４Ｓ）３を有する。実施例７および８の比較インスリン誘導体において、ペプチド延長部を２０個のアミノ酸残基でさらに長くすることにより、グルコース係数がそれぞれ１８．０から１２．６および１２．０に減少することが分かる。これは、国際公開第２０２０／２０１０４１号からの実施例３２４および２８０などの先行技術化合物においてペプチド延長部を長くすることが、グルコース係数の減少をもたらすという所見をさらに支持している。
【表8】
【0123】
［実施例１３］
［ヒト初代肝細胞におけるグルコース感受性インスリン受容体リン酸化を決定するためのアッセイ。］
インスリンがインスリン受容体に結合すると、インスリン受容体の活性化が誘発され、これはチロシンリン酸化として測定され得る。これにより、下流シグナル伝達経路が誘発され、有糸分裂促進性応答および代謝応答がもたらされる。本発明のインスリン誘導体は、アルブミンに結合し、グルコースによって移動させられ得る。実施例４のインスリン誘導体のグルコース感受性は、低グルコース濃度および高グルコース濃度で測定され、それによって、実施例４のインスリン誘導体のグルコース依存性細胞応答を検出することができる。
［ヒト初代肝細胞におけるグルコース感受性インスリン受容体リン酸化を決定するためのアッセイ。］
インスリンがインスリン受容体に結合すると、インスリン受容体の活性化が誘発され、これはチロシンリン酸化として測定され得る。これにより、下流シグナル伝達経路が誘発され、有糸分裂促進性応答および代謝応答がもたらされる。本発明のインスリン誘導体は、アルブミンに結合し、グルコースによって移動させられ得る。実施例４のインスリン誘導体のグルコース感受性は、低グルコース濃度および高グルコース濃度で測定され、それによって、実施例４のインスリン誘導体のグルコース依存性細胞応答を検出することができる。
【0124】
ドナーヒト付着可能肝細胞（ｃｒｙｏ－ｐｌａｔｅａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）を、１．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で、増加する濃度のヒトインスリン（ＨＩ）または実施例４のインスリン誘導体と１５分間インキュベートした。次いで、肝細胞を洗浄し、溶解し、インスリン受容体（ｐ－Ｔｙｒ１１５８）のリン酸化を、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋが開発した特異的インスリン受容体抗体Ｄ２（Ｏｒｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４６５，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１９，Ｐａｇｅｓ ２０－２６）およびＩＲ ｐ－Ｔｙｒ１１５８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、Ｃａｔ．＃４４－８０２Ｇ）を用いたＥＬＩＳＡを使用して明らかにした。
【0125】
インスリン受容体リン酸化方法：
ＢｉｏＩＶＴから得られたヒト肝細胞（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ ｃｒｙｏ－ｐｌａｔｅａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，ｒｅｆ．＃Ｘ００８００１－Ｐ ｌｏｔ＃ＡＣＲ；単一ドナー付着可能肝細胞＃Ｍ００９９５Ｐ）を解凍し、製造業者の指示に従って、０．１ｍＬ／ウェルの、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質混合物”（Ｚ９９０００）が補充されたＩｎｖｉｔｒｏｇｒｏ ＣＰ培地中に、５０．０００細胞／ウェルの密度で播種した。４時間後、３７℃で、一晩培養するために、５．５ｍＭのグルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾン、０．１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および１ｎＭのヒトインスリン（ＨＩ）を補充したＭ１９９培地に培地を交換する。播種の翌日、ヒト肝細胞を、１．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および３ｍＭまたは２０ｍＭのＤ－グルコースのいずれか、ならびに増加する濃度のＨＩまたは実施例４のインスリン誘導体のいずれかを補充した基礎培養培地（Ｍ１９９ ｗ．ｏフェノールレッド、ｔｗｅｅｎ ８０、およびアデノシン－５－三リン酸）に対応するアッセイ培地中で、３７℃で１５分間インキュベートした。刺激後、肝細胞を氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで細胞を溶解緩衝液の添加により４℃で３０分間可溶化した。続いて、インスリン受容体（ｐ－Ｔｙｒ１１５８）のリン酸化を、ＩＲ特異性抗体ＩＲ（Ｄ２（Ｏｒｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４６５．２０－２６）、バッチ０２６８－００００－０９４５－１Ｂ）、および検出ｐＩＲ：ｐＴｙｒ１１５８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、Ｃａｔ．＃４４－８０２Ｇ）を用いた免疫測定法ＥＬＩＳＡを使用して定量化した。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ＿１＿１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
ＢｉｏＩＶＴから得られたヒト肝細胞（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ ｃｒｙｏ－ｐｌａｔｅａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，ｒｅｆ．＃Ｘ００８００１－Ｐ ｌｏｔ＃ＡＣＲ；単一ドナー付着可能肝細胞＃Ｍ００９９５Ｐ）を解凍し、製造業者の指示に従って、０．１ｍＬ／ウェルの、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質混合物”（Ｚ９９０００）が補充されたＩｎｖｉｔｒｏｇｒｏ ＣＰ培地中に、５０．０００細胞／ウェルの密度で播種した。４時間後、３７℃で、一晩培養するために、５．５ｍＭのグルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾン、０．１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および１ｎＭのヒトインスリン（ＨＩ）を補充したＭ１９９培地に培地を交換する。播種の翌日、ヒト肝細胞を、１．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および３ｍＭまたは２０ｍＭのＤ－グルコースのいずれか、ならびに増加する濃度のＨＩまたは実施例４のインスリン誘導体のいずれかを補充した基礎培養培地（Ｍ１９９ ｗ．ｏフェノールレッド、ｔｗｅｅｎ ８０、およびアデノシン－５－三リン酸）に対応するアッセイ培地中で、３７℃で１５分間インキュベートした。刺激後、肝細胞を氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで細胞を溶解緩衝液の添加により４℃で３０分間可溶化した。続いて、インスリン受容体（ｐ－Ｔｙｒ１１５８）のリン酸化を、ＩＲ特異性抗体ＩＲ（Ｄ２（Ｏｒｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４６５．２０－２６）、バッチ０２６８－００００－０９４５－１Ｂ）、および検出ｐＩＲ：ｐＴｙｒ１１５８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、Ｃａｔ．＃４４－８０２Ｇ）を用いた免疫測定法ＥＬＩＳＡを使用して定量化した。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ＿１＿１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【0126】
実施例４のインスリン誘導体は、ヒト初代肝細胞における濃度依存的な様式で、より高いＥＣ５０ではあるがＨＩと同じ最大レベルまで、ＩＲ（ｐＩＲ）のリン酸化を刺激した。実施例４のインスリン誘導体のＥＣ５０は、ｐＩＲ刺激の濃度応答曲線の左シフト（ｎ＝６）によって明らかにされるように、３ｍＭ（５８．１ｎＭ）のＤ－グルコース濃度よりも２０ｍＭ（３０．８ｎＭ）で低いことが見出された（図１に示す）。次いで、実施例４のインスリン誘導体の３ｍＭのＤ－グルコースでのＥＣ５０と２０ｍＭのＤ－グルコースｍＭでのＥＣ５０との比（ＩＲ ｐＴｙｒヒト肝細胞１．５％ ＨＳＡ ３対２０ｍＭ Ｄ－グルコース係数）を計算し、１．８９（Ｐ値＝０．０１９）であることが見出された（表７）。これは、実施例４のインスリン誘導体が、グルコースのより低いレベルよりもグルコースのより高いレベルでより高い活性を有し、したがって、実施例４のインスリン誘導体がグルコース感受性インスリン活性を示すことを示している。
【表9】
【0127】
実施例１４：細胞における炭水化物感受性グルコース取り込みを決定するためのアッセイ（ラット脂質生成アッセイ）
インスリンがインスリン受容体に結合すると、下流シグナル伝達経路の活性化が誘発される。インスリンシグナル伝達の１つの代謝エンドポイントは脂質代謝であり、インスリンの存在下で、細胞による３Ｈ－グルコース取り込みが刺激され、脂質に組み込まれるため、脂質生成アッセイを使用してエンドポイント読み出しを測定した。
インスリンがインスリン受容体に結合すると、下流シグナル伝達経路の活性化が誘発される。インスリンシグナル伝達の１つの代謝エンドポイントは脂質代謝であり、インスリンの存在下で、細胞による３Ｈ－グルコース取り込みが刺激され、脂質に組み込まれるため、脂質生成アッセイを使用してエンドポイント読み出しを測定した。
【0128】
実施例４のインスリン誘導体は、アルブミンに結合し、グルコースによって移動されることができ、グルコース感受性を与える。Ｌ－グルコースおよびＤ－グルコースの両方はアルブミンからの誘導体を移動させることができるが、Ｌ－グルコースは、代謝不活性であり、代謝に影響を与えることなく培地中のグルコース濃度を変化させるために使用される。２０ｍＭおよび３ｍＭのＬ－グルコース濃度での実施例４のインスリン誘導体の効力（ヒトインスリンに対する）の倍率変化を決定した。
【0129】
ラット脂質生成アッセイ（ｒＦＦＣ）
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットからの副睾丸脂肪パッドを、激しい振盪下で１～１．５時間、３６．５℃でＨｅｐｅｓ Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中のコラゲナーゼで分解した。懸濁液を２層のガーゼを通して濾過した。相を室温に５分間静置することによって分離し、脂肪細胞が上相に集まることを可能にした。下相を注射器で除去した。脂肪細胞を２０ｍｌのＨｅｐｅｓ Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、１．５％のＨＳＡ、０．５ｍＭのグルコース、０．１μＣｉ／ウェルのグルコース（Ｄ－［３－３Ｈ］グルコース（２０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、および３ｍＭまたは２０ｍＭのＬ－グルコースを含有するＨｅｐｅｓ Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中、９６ウェルプレートに移した。濃度応答曲線を生成するための増加量の本発明のヒトインスリンまたはインスリン誘導体を添加し、３６．５℃で２時間インキュベートした。１００μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｅｎｔ Ｅ（ｃａｔ＃６０１３６６１ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加することによって反応を停止した。Ｔｏｐ ｃｏｕｎｔｅｒで計数する前に、プレートを３時間静止させた。インスリン誘導体の３ｍＭのＬ－グルコースでのＥＣ５０と２０ｍＭのＬ－グルコースｍＭでのＥＣ５０との比（ｒＦＦＣ １．５％ ＨＳＡ ３対２０ｍＭ Ｌ－グルコース係数）を決定した（表８を参照されたい）。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットからの副睾丸脂肪パッドを、激しい振盪下で１～１．５時間、３６．５℃でＨｅｐｅｓ Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中のコラゲナーゼで分解した。懸濁液を２層のガーゼを通して濾過した。相を室温に５分間静置することによって分離し、脂肪細胞が上相に集まることを可能にした。下相を注射器で除去した。脂肪細胞を２０ｍｌのＨｅｐｅｓ Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、１．５％のＨＳＡ、０．５ｍＭのグルコース、０．１μＣｉ／ウェルのグルコース（Ｄ－［３－３Ｈ］グルコース（２０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、および３ｍＭまたは２０ｍＭのＬ－グルコースを含有するＨｅｐｅｓ Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中、９６ウェルプレートに移した。濃度応答曲線を生成するための増加量の本発明のヒトインスリンまたはインスリン誘導体を添加し、３６．５℃で２時間インキュベートした。１００μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｅｎｔ Ｅ（ｃａｔ＃６０１３６６１ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加することによって反応を停止した。Ｔｏｐ ｃｏｕｎｔｅｒで計数する前に、プレートを３時間静止させた。インスリン誘導体の３ｍＭのＬ－グルコースでのＥＣ５０と２０ｍＭのＬ－グルコースｍＭでのＥＣ５０との比（ｒＦＦＣ １．５％ ＨＳＡ ３対２０ｍＭ Ｌ－グルコース係数）を決定した（表８を参照されたい）。
【表10】
【0130】
代表的な濃度応答曲線（ｎ＝１）を図２に示す。実施例４のインスリン誘導体のＥＣ５０は、脂質生成の濃度応答曲線の左シフトによって明らかにされるように、３ｍＭのＬ－グルコース濃度よりも２０ｍＭで低いことが見出された。表８のデータは、実施例４のインスリン誘導体が、低いＬ－グルコース（３ｍＭ）と比較して、より高いレベルのＬ－グルコース（２０ｍＭ）の存在下で、より高いレベルの脂質生成（すなわち、より多くのグルコース輸送）をもたらすことを示している。これは、実施例４のインスリン誘導体が、グルコースのより低いレベルよりもグルコースのより高いレベルでより高い活性を有し、したがって、実施例４のインスリン誘導体がグルコース感受性インスリン活性を示すことを示している。
【0131】
実施例１５：ラット初代肝細胞におけるグリコーゲン蓄積を決定するためのアッセイ。
インスリンがインスリン受容体に結合すると、下流シグナル伝達経路の活性化が誘発され、インスリン感受性組織における代謝プロセスの活性化につながる。他の機能の中でも、インスリンは、肝臓におけるグリコーゲン蓄積を誘発する。したがって、２０ｍＭのグルコースおよび０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で、２４時間、初代ラット肝細胞におけるヒトインスリンまたは実施例４のインスリン誘導体の用量濃度の増加に応じて、グリコーゲンレベルの推定をエンドポイントとして使用した。細胞グリコーゲン含有量の定量化は、５５０ｎｍでの吸光度読み取りを用いた過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）アッセイの原則に基づいて、定量的比色アッセイを使用して実施された。
インスリンがインスリン受容体に結合すると、下流シグナル伝達経路の活性化が誘発され、インスリン感受性組織における代謝プロセスの活性化につながる。他の機能の中でも、インスリンは、肝臓におけるグリコーゲン蓄積を誘発する。したがって、２０ｍＭのグルコースおよび０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で、２４時間、初代ラット肝細胞におけるヒトインスリンまたは実施例４のインスリン誘導体の用量濃度の増加に応じて、グリコーゲンレベルの推定をエンドポイントとして使用した。細胞グリコーゲン含有量の定量化は、５５０ｎｍでの吸光度読み取りを用いた過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）アッセイの原則に基づいて、定量的比色アッセイを使用して実施された。
【0132】
グリコーゲン蓄積（ＰＡＳアッセイ）法：
ラット肝細胞（Ｌｏｎｚａ、ＲＳＣＰ０１）を解凍し、４％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１ｎＭのヒトインスリン（ＨＩ）を補充した基礎Ｍ１９９培養培地（５．５ｍＭのグルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ならびに４ｍｇ／ｍｌのデカドロン）中のコラーゲン被覆９６ウェルプレート中に、５０．０００細胞／ウェルの密度で３７℃で播種する。約４時間後、培地を、一晩培養するために、０．１％のＦＣＳおよび１ｎＭのＨＩを補充した基礎Ｍ１９９培養培地と交換した。単離の翌日、ラット肝細胞を、１００ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾン、０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１４．５ｍＭのグルコース、および増加する濃度のＨＩまたは実施例４の誘導体のいずれかを補充した基礎Ｍ１９９培地に対応するアッセイ培地中で、３７℃で２４時間インキュベートした。刺激後、肝細胞を氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄し、液体窒素で急速凍結し、後の分析のために－８０℃で貯蔵した。グリコーゲンレベルを測定するために、次いでプレートを解凍し、細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００に可溶化した。続いて、７％の酢酸中の０．１％の過ヨウ素酸の溶液として調製された１００μｌの過ヨウ素酸を、光から保護して、３７℃、１．５時間でプレートに添加して、グリコーゲン中のヒドロキシル基を酸化させた。次いで、８５μｌのシッフ試薬を５分間添加して、酸化部分と反応させ、プレートを室温でさらに１０分間インキュベートして、発色させた。次いで、５５０ｎｍでの吸光度を読み取った（ｓｐｅｃｔｒａＭａｘ＿１＿１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
ラット肝細胞（Ｌｏｎｚａ、ＲＳＣＰ０１）を解凍し、４％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１ｎＭのヒトインスリン（ＨＩ）を補充した基礎Ｍ１９９培養培地（５．５ｍＭのグルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ならびに４ｍｇ／ｍｌのデカドロン）中のコラーゲン被覆９６ウェルプレート中に、５０．０００細胞／ウェルの密度で３７℃で播種する。約４時間後、培地を、一晩培養するために、０．１％のＦＣＳおよび１ｎＭのＨＩを補充した基礎Ｍ１９９培養培地と交換した。単離の翌日、ラット肝細胞を、１００ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾン、０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１４．５ｍＭのグルコース、および増加する濃度のＨＩまたは実施例４の誘導体のいずれかを補充した基礎Ｍ１９９培地に対応するアッセイ培地中で、３７℃で２４時間インキュベートした。刺激後、肝細胞を氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄し、液体窒素で急速凍結し、後の分析のために－８０℃で貯蔵した。グリコーゲンレベルを測定するために、次いでプレートを解凍し、細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００に可溶化した。続いて、７％の酢酸中の０．１％の過ヨウ素酸の溶液として調製された１００μｌの過ヨウ素酸を、光から保護して、３７℃、１．５時間でプレートに添加して、グリコーゲン中のヒドロキシル基を酸化させた。次いで、８５μｌのシッフ試薬を５分間添加して、酸化部分と反応させ、プレートを室温でさらに１０分間インキュベートして、発色させた。次いで、５５０ｎｍでの吸光度を読み取った（ｓｐｅｃｔｒａＭａｘ＿１＿１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【表11】
【0133】
データは、実施例４のインスリン誘導体が、濃度依存的様式で、２０ｍＭのグルコース濃度での全用量応答曲線で、ラット初代肝細胞におけるグリコーゲン蓄積を誘発したことを示している（図３）。最大応答は、ヒトインスリンと比較してわずかに減少した（Ｅｍａｘ＝８６％、ｎ＝５）。インビトロＥＣ５０は、実施例４のインスリン誘導体については２０．４ｎＭ、２０ｍＭのグルコースでのヒトインスリン（ｎ＝５）については２．８ｎＭであると計算され、ヒトインスリンに対して効力の低下を示唆した（表９）。
【0134】
実施例１６：ＬＹＤブタにおける薬物動態研究
ＬＹＤブタにおける薬物動態研究
インスリン誘導体を、およそ７０～１１０ｋｇの体重のメスのランドレース・ヨークシャー・デュロック（ＬＹＤ）ブタに静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）投与した。ｉｖ用量は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇであり、ｓｃ用量は、１または２ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかであった。最大７２時間までの選択された時点で血液を採取し、血漿を調製し、インスリン誘導体濃度について分析した（以下を参照されたい）。ブタを一晩絶食させ、インスリン誘導体の投与の８時間後に給餌した。
ＬＹＤブタにおける薬物動態研究
インスリン誘導体を、およそ７０～１１０ｋｇの体重のメスのランドレース・ヨークシャー・デュロック（ＬＹＤ）ブタに静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）投与した。ｉｖ用量は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇであり、ｓｃ用量は、１または２ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかであった。最大７２時間までの選択された時点で血液を採取し、血漿を調製し、インスリン誘導体濃度について分析した（以下を参照されたい）。ブタを一晩絶食させ、インスリン誘導体の投与の８時間後に給餌した。
【0135】
個々の動物からの血漿濃度－時間プロファイルを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｃｅｒｔａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）または特注のＲｓｈｉｎｙアプリケーション（Ｒｓｔｕｄｉｏ．ｃｏｍ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳ）を使用した非コンパートメント薬物動態分析（ＮＣＡ）によって分析し、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎに対して検証した。
【0136】
血漿試料中のインスリン類似体濃度の定量化
血漿試料を、商標ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）でも知られている発光酸素チャネリング免疫測定法（ＬＯＣＩ）を使用して、投与されたインスリン誘導体のレベルについて分析した。アッセイ原理は、要するに次のとおりである：目的の被分析物に特異的な抗体をアクセプタービーズにコンジュゲートする。被分析物にも特異的である二次抗体をビオチン化する。次いで、２つの抗体コンジュゲートを、被分析物を含有する血漿試料と一緒にインキュベートし、免疫複合体を形成する。次に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、ビオチン化抗体に結合する。６８０ｎｍでのドナービーズの照明によって、周囲酸素が励起されて、一重項酸素を形成する。アクセプタービーズが近接している場合、一重項酸素からアクセプタービーズへのエネルギー伝達が発生し、これが次に６１５ｎｍで光を放射する。放射光の信号強度は、被分析物の濃度に比例する。既知の濃度の被分析物を混ぜた血漿試料を使用して、較正曲線を生成する。次いで、５パラメータロジスティック回帰を使用して、未知の試料濃度を較正曲線から計算する。全てのインスリン誘導体を、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社内の抗体を用いて試験した。結果を表１０に示す。
血漿試料を、商標ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）でも知られている発光酸素チャネリング免疫測定法（ＬＯＣＩ）を使用して、投与されたインスリン誘導体のレベルについて分析した。アッセイ原理は、要するに次のとおりである：目的の被分析物に特異的な抗体をアクセプタービーズにコンジュゲートする。被分析物にも特異的である二次抗体をビオチン化する。次いで、２つの抗体コンジュゲートを、被分析物を含有する血漿試料と一緒にインキュベートし、免疫複合体を形成する。次に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、ビオチン化抗体に結合する。６８０ｎｍでのドナービーズの照明によって、周囲酸素が励起されて、一重項酸素を形成する。アクセプタービーズが近接している場合、一重項酸素からアクセプタービーズへのエネルギー伝達が発生し、これが次に６１５ｎｍで光を放射する。放射光の信号強度は、被分析物の濃度に比例する。既知の濃度の被分析物を混ぜた血漿試料を使用して、較正曲線を生成する。次いで、５パラメータロジスティック回帰を使用して、未知の試料濃度を較正曲線から計算する。全てのインスリン誘導体を、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社内の抗体を用いて試験した。結果を表１０に示す。
【表12】
【0137】
表１０のＰＫデータは、本発明の実施例４のインスリン誘導体が、国際公開第２０２０／２０１０４１号の実施例３２４および２８０の先行技術化合物よりも長い半減期を有することを示している。
【0138】
本発明の特定の特徴が本明細書に例証および記載されているが、ここで、多くの修正、代用、変更、および均等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨の範囲内に含まれる全てのこうした修正および変更を網羅するよう意図されていることを理解されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリン誘導体であって、
である、インスリン誘導体。
【化1】
【請求項2】
請求項１に記載のインスリン誘導体を含む、組成物。
【請求項3】
請求項１に記載のインスリン誘導体を含む、医薬。
【請求項4】
１型糖尿病および２型糖尿病を含む糖尿病の予防または治療に使用するための、請求項３に記載の医薬。
【外国語明細書】