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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024167316
(43)【公開日】2024-12-03
(54)【発明の名称】抗ＴＳＬＰナノ抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20241126BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241126BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241126BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20241126BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241126BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241126BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20241126BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241126BHJP
A61P 11/06 20060101ALN20241126BHJP
A61P 11/00 20060101ALN20241126BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/00 C
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
A61K39/395 N
A61K39/395 L
A61K51/10 200
A61K47/68
C07K16/00
A61P11/06
A61P11/00
【審査請求】有
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024146304
(22)【出願日】2024-08-28
(62)【分割の表示】P 2023540115の分割
【原出願日】2022-05-16
(31)【優先権主張番号】202210111727.1
(32)【優先日】2022-01-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522084968
【氏名又は名称】上海洛啓生物医薬技術有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＮＯＶＡＭＡＢ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ２０１，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １０，Ｌａｎｅ ５００，Ｆｕｒｏｎｇｈｕａ Ｒｏａｄ，Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１３２１，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】万 亜坤
(72)【発明者】
【氏名】李 光輝
(72)【発明者】
【氏名】朱 敏
(72)【発明者】
【氏名】盖 軍偉
(72)【発明者】
【氏名】沈 暁寧
(57)【要約】 （修正有）
【課題】良い遮断活性、良い臨床治療効果を有し、そして生産が簡便な抗ＴＳＬＰナノ抗体、およびその使用を提供する。
【解決手段】本発明は、抗ＴＳＬＰのナノ抗体を提供し、また、上記ナノ抗体をコードするコード配列、相応する発現ベクターおよび当該ナノ抗体を発現することができる宿主細胞、ならびに本発明のナノ抗体の生産方法を提供する。本発明のナノ抗体は良いＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲ遮断活性を有する。本発明のナノ抗体はピキア・パストリスで発現し、その発酵タンクの発現収量が１７－２３ｇ／Ｌに達する。
【選択図】図２
【解決手段】本発明は、抗ＴＳＬＰのナノ抗体を提供し、また、上記ナノ抗体をコードするコード配列、相応する発現ベクターおよび当該ナノ抗体を発現することができる宿主細胞、ならびに本発明のナノ抗体の生産方法を提供する。本発明のナノ抗体は良いＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲ遮断活性を有する。本発明のナノ抗体はピキア・パストリスで発現し、その発酵タンクの発現収量が１７－２３ｇ／Ｌに達する。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＴＳＬＰナノ抗体であって、前記ナノ抗体におけるＶＨＨ鎖の相補性決定領域であるＣＤＲ領域が、配列番号１４で示されるＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＣＤＲ２、および配列番号１６で示されるＣＤＲ３からなることを特徴とする抗ＴＳＬＰナノ抗体。
【請求項2】
前記抗ＴＳＬＰナノ抗体のＶＨＨ鎖は、さらに、フレームワーク領域ＦＲを含み、前記のフレームワーク領域ＦＲは以下の群から選ばれる一つまたは複数であることを特徴とする請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体：
（１）配列番号１７で示されるＦＲ１：配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号２０で示されるＦＲ４；
（２）配列番号２３で示されるＦＲ１、配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号２４で示されるＦＲ４。
（１）配列番号１７で示されるＦＲ１：配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号２０で示されるＦＲ４；
（２）配列番号２３で示されるＦＲ１、配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号２４で示されるＦＲ４。
【請求項3】
前記抗ＴＳＬＰナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２１、配列番号２５、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体。
【請求項4】
ＴＳＬＰエピトープに対する抗体である請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体を有することを特徴とする抗ＴＳＬＰ抗体。
【請求項5】
一つまたは複数の請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体を含むことを特徴とする抗ＴＳＬＰ抗体。
【請求項6】
前記抗体は、単量体、二価抗体、および／または多価抗体を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の抗体。
【請求項7】
請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体からなる群から選ばれるタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項10】
抗ＴＳＬＰナノ抗体を生成する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ） ナノ抗体の生成に適する条件において、請求項９に記載の宿主細胞を培養する
ことによって、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の抗ＴＳＬＰナノ抗体を単離または回収する；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗ＴＳＬＰナノ抗体を精製および／または修飾する。
（ａ） ナノ抗体の生成に適する条件において、請求項９に記載の宿主細胞を培養する
ことによって、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の抗ＴＳＬＰナノ抗体を単離または回収する；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗ＴＳＬＰナノ抗体を精製および／または修飾する。
【請求項11】
以下のものを含有することを特徴とする免疫複合体：
（ａ） 請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
（ａ） 請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
【請求項12】
請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体を含むことを特徴とする多重特異性抗体。
【請求項13】
以下のものを有することを特徴とする組み換えタンパク質：
（ｉ） 請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ） 発現および／または精製を補助するタグ配列。
（ｉ） 請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ） 発現および／または精製を補助するタグ配列。
【請求項14】
以下のものを含有することを特徴とする薬物組成物：
（ｉ）請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
（ｉ）請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
【請求項15】
請求項１に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体の使用であって、（ａ）ＴＳＬＰに関連する疾患を予防および／または治療する薬物の製造、ならびに／あるいは（ｂ）ＴＳＬＰを検出する試薬、検出プレートまたはキットの製造のためであることを特徴とする使用。
【請求項16】
サンプルにおけるＴＳＬＰタンパク質を検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（１）サンプルを請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体と接触させる；
（２）抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＴＳＬＰタンパク質が存在することを意味する。
（１）サンプルを請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体と接触させる；
（２）抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＴＳＬＰタンパク質が存在することを意味する。
【請求項17】
ＴＳＬＰタンパク質の検出試薬であって、以下のものを含むことを特徴とする検出試薬：
（ｉ）請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ）検出に許容されるベクター。
（ｉ）請求項１に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、請求項４に記載の抗ＴＳＬＰ抗体または請求項５に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ）検出に許容されるベクター。
【請求項18】
ＴＳＬＰタンパク質を検出するキットであって、請求項７に記載の免疫複合体、ならびに説明書を含むことを特徴とするキット。
【請求項19】
請求項１１に記載の免疫複合体の使用であって、体内においてＴＳＬＰタンパク質を検出する造影剤の製造のためであることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学または生物製薬の技術分野に関し、より具体的に、抗ＴＳＬＰナノ抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、中等・重症喘息の治療経路はいずれもＴｈ２細胞の応答を抑える試みに集中している。重症喘息を治療するための抗体薬物は、Ｔｈ２経路におけるＩｇＥ（オマリズマブ）、ＩＬ５（メポリズマブ、レスリズマブ）、ＩＬ５Ｒ（ベンラリズマブ）、ＩＬ４Ｒ（デュピルマブ）などを標的とするものが多い。以上の薬物のいずれも、好酸球性喘息に対して良い制御効果を有し、いずれも皮下または静脈注射の手段によって治療する。約三分の一の重症喘息患者はＴｈ２炎症経路活性化の特徴がなく、現在、このような非Ｔｈ２型の疾患に対して既存の標準のケア・治療で抑えられない患者は生物治療の選択がないため、新たな治療経路の開発が望まれている。
【0003】
胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＴＳＬＰ）は、４ヘリックスバンドルのフォールディング構造を有する短鎖型サイトカインで、ＩＬ－２サイトカインファミリーに属する。ＴＳＬＰは、炎症促進性刺激（たとえば、肺内におけるアレルゲン、ウイルスやほかの病原体）に対して生成する上皮サイトカインで、気道炎症の発生と持続において重要な役割を果たす。ＴＳＬＰは下流のＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３を含むＴｈ２サイトカインの放出を駆動し、炎症および喘息の症状につながる。また、ＴＳＬＰは非Ｔｈ２型炎症に関与する多くの種類の細
胞を活性化させることもできる。そのため、ＴＳＬＰの炎症カスケード反応の早期の上流における活性化は既に幅広い喘息患者の群衆における一つの潜在的な標的とされている。ＴＳＬＰを遮断すると、免疫細胞の炎症性サイトカインの放出が阻止されることで、喘息の悪化を予防し、喘息のコントロールを改善し、そして慢性閉塞性肺疾患などの関連疾患を対処することができる。
胞を活性化させることもできる。そのため、ＴＳＬＰの炎症カスケード反応の早期の上流における活性化は既に幅広い喘息患者の群衆における一つの潜在的な標的とされている。ＴＳＬＰを遮断すると、免疫細胞の炎症性サイトカインの放出が阻止されることで、喘息の悪化を予防し、喘息のコントロールを改善し、そして慢性閉塞性肺疾患などの関連疾患を対処することができる。
【0004】
ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、すなわち、重鎖ナノ抗体ＶＨＨ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である、ラクダの体内に存在する天然の軽鎖欠失の重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＣＡｂ）の可変領域をクローニングして得られる一つの重鎖可変領域からなるナノ抗体は、現在、獲得できる、完全な機能を備えて安定した、抗原に結合できる最小の単位である。ナノ抗体は、安定性が高い、水溶性が良い、ヒト化が簡単、標的性が高い、透過性が強いといった特徴があり、免疫実験、診断と治療
において、想像を絶する大きな役割を果たしている。ナノ抗体は段々新世代の抗体治療の新興勢力になりつつある。
そのため、本分野では、良い遮断活性、良い臨床治療効果を有し、そして生産が簡便な抗ＴＳＬＰナノ抗体の開発が切望されている。
において、想像を絶する大きな役割を果たしている。ナノ抗体は段々新世代の抗体治療の新興勢力になりつつある。
そのため、本分野では、良い遮断活性、良い臨床治療効果を有し、そして生産が簡便な抗ＴＳＬＰナノ抗体の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、良い遮断活性、良い臨床治療効果を有し、そして生産が簡便な抗ＴＳＬＰナノ抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の第一の側面では、抗ＴＳＬＰナノ抗体であって、前記ナノ抗体におけるＶＨＨ鎖の相補性決定領域であるＣＤＲ領域が以下の群から選ばれる一つまたは複数であるものを提供する：
（１） 配列番号１で示されるＣＤＲ１、配列番号２で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ３で示されるＣＤＲ３；
（２） 配列番号１４で示されるＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １６で示されるＣＤＲ３；ならびに
（３） 配列番号２７で示されるＣＤＲ１、配列番号２８で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ２９で示されるＣＤＲ３。
もう一つの好適な例において、前記のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔てられている。
（１） 配列番号１で示されるＣＤＲ１、配列番号２で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ３で示されるＣＤＲ３；
（２） 配列番号１４で示されるＣＤＲ１、配列番号１５で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １６で示されるＣＤＲ３；ならびに
（３） 配列番号２７で示されるＣＤＲ１、配列番号２８で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ２９で示されるＣＤＲ３。
もう一つの好適な例において、前記のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔てられている。
【0007】
もう一つの好適な例において、前記ＶＨＨ鎖は、さらに、フレームワーク領域ＦＲを含み、前記のフレームワーク領域ＦＲは以下の群から選ばれる一つまたは複数：
（１） 配列番号４で示されるＦＲ１、配列番号５で示されるＦＲ２、配列番号６で示されるＦＲ３、および配列番号７で示されるＦＲ４；
（２） 配列番号１０で示されるＦＲ１：配列番号５で示されるＦＲ２、配列番号６で示されるＦＲ３、および配列番号 １１で示されるＦＲ４；
（３） 配列番号１７で示されるＦＲ１：配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号 ２０で示されるＦＲ４；
（４） 配列番号２３で示されるＦＲ１、配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（５） 配列番号３０で示されるＦＲ１、配列番号３１で示されるＦＲ２、配列番号３２で示されるＦＲ３、および配列番号 ３３で示されるＦＲ４；ならびに
（６） 配列番号３６で示されるＦＲ１、配列番号３１で示されるＦＲ２、配列番号３２で示されるＦＲ３、および配列番号 ３７で示されるＦＲ４。
（１） 配列番号４で示されるＦＲ１、配列番号５で示されるＦＲ２、配列番号６で示されるＦＲ３、および配列番号７で示されるＦＲ４；
（２） 配列番号１０で示されるＦＲ１：配列番号５で示されるＦＲ２、配列番号６で示されるＦＲ３、および配列番号 １１で示されるＦＲ４；
（３） 配列番号１７で示されるＦＲ１：配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号 ２０で示されるＦＲ４；
（４） 配列番号２３で示されるＦＲ１、配列番号１８で示されるＦＲ２、配列番号１９で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（５） 配列番号３０で示されるＦＲ１、配列番号３１で示されるＦＲ２、配列番号３２で示されるＦＲ３、および配列番号 ３３で示されるＦＲ４；ならびに
（６） 配列番号３６で示されるＦＲ１、配列番号３１で示されるＦＲ２、配列番号３２で示されるＦＲ３、および配列番号 ３７で示されるＦＲ４。
【0008】
もう一つの好適な例において、前記のナノ抗体のＶＨＨ鎖のＣＤＲ領域は配列番号１－３、配列番号１４－１６、配列番号２７－２９のうちのいずれかと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0009】
もう一つの好適な例において、前記のナノ抗体のＶＨＨ鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は配列番号１－３、配列番号１４－１６、配列番号２７－２９のうちのいずれかと比べ、一つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換を含む。
【0010】
もう一つの好適な例において、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも１個（たとえば１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経たもので、かつＴＳＬＰとの特異的結合能力を維持できる誘導配列を含む。
【0011】
もう一つの好適な例において、前記ナノ抗体は、ＴＳＬＰに特異的に結合することができる。
【0012】
もう一つの好適な例において、前記ナノ抗体は、有効にＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの相互作用を遮断することができる。
【0013】
もう一つの好適な例において、前記ＴＳＬＰは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のＴＳＬＰである。
【0014】
もう一つの好適な例において、前記ＴＳＬＰは、ヒト、マウス、ラット、または非ヒト霊長類動物（たとえば、サル）のＴＳＬＰである。
【0015】
もう一つの好適な例において、前記のナノ抗体はヒト化抗体、ラクダ由来抗体、キメラ抗体を含む。
【0016】
もう一つの好適な例において、前記ナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４、配列番号３８、またはこれらの組み合わせ６からなる群から選ばれる。
【0017】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体は、単量体、二量体（二価抗体）、四量体（四価抗体）、および／または多量体（多価抗体）を含む。
【0018】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体は、一つまたは複数の配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４または配列番号３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
【0019】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体は、二つまたは複数の配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４、配列番号３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
【0020】
もう一つの好適な例において、前記ＶＨＨ鎖の間は連結ペプチドを介して連結している。
【0021】
もう一つの好適な例において、前記連結ペプチドは以下の配列から選ばれる：（ＧａＳｂ）ｘ（ただし、ａ、ｂ、ｘ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０である（好ましくは、ａ＝４かつｂ＝１、ｘ＝４である））。
【0022】
もう一つの好適な例において、前記連結ペプチドの配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【0023】
本発明の第二の側面では、抗ＴＳＬＰ抗体であって、ＴＳＬＰエピトープに対する抗体で、かつ本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体を有するものを提供する。
【0024】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰ抗体は、一つまたは複数の抗ＴＳＬＰナノ抗体を含む。
【0025】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰ抗体は、単量体、二量体（二価抗体）、四量体（四価抗体）、および／または多量体（多価抗体）を含む。
【0026】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰ抗体は、一つまたは複数の配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４または配列番号３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
【0027】
もう一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰ抗体は、二つの配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４または配列番号３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
【0028】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、ＴＳＬＰに特異的に結合することができる。
【0029】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、特異的に正確な空間構造を有するＴＳＬＰタンパク質に対するものである。
【0030】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、有効にＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの相互作用を遮断することができる。
【0031】
もう一つの好適な例において、前記の抗体のＴＳＬＰに対する親和力（ＫＤ値）は３．７７ｎＭ未満である。
【0032】
もう一つの好適な例において、前記的抗体は優れたＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲ遮断活性を有し、かつ遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブ（Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂ）よりも良く、ここで、対照抗体テゼペルマブはアストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）またはアムジェン（Ａｍｇｅｎ）社から得られるものである。
【0033】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は有効にＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞の増殖を抑制することができ、その抑制活性が対照抗体テゼペルマブよりも良い。
【0034】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、ナノ抗体である。
【0035】
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体からなる群から選ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0036】
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは組み合わせの様態である。
【0037】
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号９、１３、２２、２６、３５または３９で示される配列のうちの一つまたは複数を含む。
【0038】
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。
【0039】
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
【0040】
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、ほかの遺伝子導入系、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0041】
もう一つの好適な例において、前記発現ベクターはウイルスベクター、たとえば、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルスを含む。
【0042】
本発明の第五の側面では、本発明の第四の側面に記載の発現ベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第三の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
【0043】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含む。
【0044】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、ファージ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0045】
もう一つの好適な例において、前記原核細胞は、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、ストレプトマイセス菌、プロテウス・ミラビリス、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれる。
【0046】
もう一つの好適な例において、前記真核細胞は、ピキア・パストリス、出芽酵母、分裂酵母、トリコデルマ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0047】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、ピキア・パストリスである。
【0048】
本発明の第六の側面では、抗ＴＳＬＰナノ抗体を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）ナノ抗体の生成に適する条件において、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞を培養することによって、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の抗ＴＳＬＰナノ抗体を単離または回収する；ならびに
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた抗ＴＳＬＰナノ抗体を精製および／または修飾する。
（ａ）ナノ抗体の生成に適する条件において、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞を培養することによって、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ）前記培養物から前記の抗ＴＳＬＰナノ抗体を単離または回収する；ならびに
（ｃ）任意に、工程（ｂ）で得られた抗ＴＳＬＰナノ抗体を精製および／または修飾する。
【0049】
本発明の第七の側面では、以下のものを含有する免疫複合体を提供する：
（ａ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
（ａ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
【0050】
もう一つの好適な例において、前記の放射性核種は、以下のものを含む：
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる診断用同位体；ならびに／あるいは
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる治療用同位体。
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる診断用同位体；ならびに／あるいは
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる治療用同位体。
【0051】
もう一つの好適な例において、前記複合部分は薬物または毒素である。
【0052】
もう一つの好適な例において、前記の薬物は細胞毒性薬物である。
【0053】
もう一つの好適な例において、前記の細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0054】
もう一つの好適な例において、特に有用な細胞毒性薬物の例は、たとえば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、たとえばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（たとえばＤＭ１やＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅ）、ベンゾジアゼピン系（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）またはベンゾジアゼピン含有薬物
（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇ）（たとえばピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン系（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン系（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））およびビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ）、またはこれらの組み合わせを含む。
（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇ）（たとえばピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン系（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン系（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））およびビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ）、またはこれらの組み合わせを含む。
【0055】
もう一つの好適な例において、前記の毒素は、オーリスタチン類（たとえば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン、マイタンシノイド、リシン、リシンＡ－鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアミシン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0056】
もう一つの好適な例において、前記複合部分は検出可能なマーカーである。
【0057】
もう一つの好適な例において、前記複合部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばＩＬ－２など）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ）、または
任意の様態のナノ粒子からなる群から選ばれる。
任意の様態のナノ粒子からなる群から選ばれる。
【0058】
本発明の第八の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体を含む多重特異性抗体を提供する。
【0059】
もう一つの好適な例において、前記多重特異性抗体は、さらに、抗体のＦｃ断片を含む。
【0060】
本発明の第九の側面では、以下のものを有する組み換えタンパク質を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
【0061】
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列はＦｃタグ、ＨＡタグおよび６Ｈｉｓタグを含む。
【0062】
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は特異的にＴＳＬＰタンパク質に結合するものである。
【0063】
本発明の第十の側面では、以下のものを含有する薬物組成物を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体。
【0064】
もう一つの好適な例において、前記の免疫複合体の複合部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
【0065】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、さらに、ほかの免疫系疾患または腫瘍疾患を治療する薬物を含む。
【0066】
もう一つの好適な例において、前記ほかの免疫系疾患または腫瘍疾患を治療する薬物は、ブデソニド、フルチカゾン、ベクロメタゾン、モメタゾンフランカルボン酸エステル、アルブテロール、テオフィリン、ホルモテロール、チオトロピウム臭化物、スルファサラジン、メトトレキセート、シクロホスファミド、フルオロウラシル、ブレオマイシン、アナストロゾール、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0067】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、ＴＳＬＰに関連する疾患または病症を予防および／または治療する薬物の製造に使用されるものである。
【0068】
もう一つの好適な例において、前記ＴＳＬＰに関連する疾患または病症は、免疫系疾患または腫瘍疾患を含む。
【0069】
もう一つの好適な例において、前記免疫系疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、潰瘍性大腸炎、クローン病、鼻炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アレルギー性肺炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、鼻ポリープ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0070】
もう一つの好適な例において、前記腫瘍疾患は、乳癌、膵臓腺癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、結腸・直腸癌、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌、肝臓癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0071】
本発明の第十一の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第十の側面に記載の薬物組成物の使用であって、（ａ）ＴＳＬＰに関連する疾患を予防および／または治療する薬物の製造、ならびに／あるいは（ｂ）ＴＳＬＰを検出する試薬、検出プレートまたはキットの製造のための使用を提供する。
【0072】
もう一つの好適な例において、前記ＴＳＬＰに関連する疾患または病症は、免疫系疾患または腫瘍疾患を含む。
【0073】
もう一つの好適な例において、前記免疫系疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、潰瘍性大腸炎、クローン病、鼻炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アレルギー性肺炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、鼻ポリープ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0074】
もう一つの好適な例において、前記腫瘍疾患は、乳癌、膵臓腺癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、結腸・直腸癌、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌、肝臓癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0075】
もう一つの好適な例において、前記ＴＳＬＰはヒトＴＳＬＰである。
【0076】
もう一つの好適な例において、前記試薬は診断試薬である。
【0077】
もう一つの好適な例において、前記診断試薬は造影剤である。
【0078】
もう一つの好適な例において、前記試薬はサンプルにおけるＴＳＬＰタンパク質またはその断片を検出するためのものである。
【0079】
もう一つの好適な例において、前記の検出はフローサイトメトリーによる検出、細胞免疫蛍光による検出を含む。
【0080】
もう一つの好適な例において、前記使用は診断的および／または非診断的なもの、ならびに／あるいは治療的および／または非治療的なものである。
【0081】
本発明の第十二の側面では、サンプルにおけるＴＳＬＰタンパク質を検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１）サンプルを、本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質と接触させる；
（２）抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＴＳＬＰタンパク質が存在することを意味する。
（１）サンプルを、本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質と接触させる；
（２）抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＴＳＬＰタンパク質が存在することを意味する。
【0082】
もう一つの好適な例において、前記方法は非診断的で非治療的なものである。
【0083】
本発明の第十三の側面では、ＴＳＬＰタンパク質の検出試薬であって、以下のものを含む検出試薬を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質；ならびに
（ｉｉ）測定学的に許容される担体。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、または本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質；ならびに
（ｉｉ）測定学的に許容される担体。
【0084】
もう一つの好適な例において、前記の免疫複合体の複合部分は診断用同位体である。
【0085】
もう一つの好適な例において、前記の測定学的に許容される担体は無毒で、不活性の水系担体の媒体である。
【0086】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フローサイトメトリー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、磁性ナノ粒子およびイメージング剤からなる群から選ばれる一つまたは複数の試薬である。
【0087】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は体内における検出のためのものである。
【0088】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬の剤形は液状または粉状（たとえば、水溶液剤、注射剤、凍結乾燥粉末、錠剤、トローチ剤、エアロゾル吸入剤）である。
【0089】
本発明の第十四の側面では、ＴＳＬＰタンパク質を検出するキットであって、本発明の第七の側面に記載の免疫複合体または本発明の第十三の側面に記載の検出試薬、ならびに説明書を含むキットを提供する。
【0090】
もう一つの好適な例において、前記の説明書に、前記のキットが非侵襲的に被験対象のＴＳＬＰ発現を検出するためのものであると記載されている。
【0091】
本発明の第十五の側面では、本発明の第七の側面に記載の免疫複合体の使用であって、体内においてＴＳＬＰタンパク質を検出する造影剤の製造のための使用を提供する。
【0092】
もう一つの好適な例において、前記検出は、ＴＳＬＰに関連する疾患または病症の診断または予後のためのものである。
【0093】
本発明の第十六の側面では、疾患を治療する方法であって、必要な対象に、本発明の第一の側面に記載の抗ＴＳＬＰナノ抗体、本発明の第二の側面に記載の抗ＴＳＬＰ抗体、本発明の第七の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第八の側面に記載の多重特異性抗体、または本発明の第九の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第十の側面に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
【0094】
もう一つの好適な例において、前記の対象はヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。
【0095】
もう一つの好適な例において、前記非ヒト哺乳動物は、齧歯動物（たとえば、ネズミ、ウサギ）、非ヒト霊長類動物（たとえば、サル）を含む。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1A】図１Ａは、３１株の候補抗体のフローサイトメトリーによる遮断活性検出の結果である。結果から、３１株の候補抗体のうち、１４株の抗体の遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かったことがわかる。
【図1B】図１Ｂは、３１株の候補抗体のフローサイトメトリーによる遮断活性検出の結果である。結果から、３１株の候補抗体のうち、１４株の抗体の遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かったことがわかる。
【発明を実施するための形態】
【0097】
初めて、意外に、１種類の抗ＴＳＬＰナノ抗体を見出したが、実験結果から、本発明のナノ抗体は有効にＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの相互作用を遮断することができ、かつ遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かったこと、有効にＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞の増殖を抑制することができ、その抑制活性が対照抗体テゼペルマブよりも良かったこと、ピキア・パストリスにおける発酵タンク発現の収量が１７～２３ｇ／Ｌに達し、顕著に業界のレベルよりも高かったことがわかる。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。
【0098】
用語
本明細書で用いられるように、用語「本発明ナノ抗体」、「本発明のナノ抗体」、「本発明の抗ＴＳＬＰナノ抗体」、「本発明ＴＳＬＰナノ抗体」、「抗ＴＳＬＰナノ抗体」、「ＴＳＬＰナノ抗体」は同様の意味を持ち、入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＴＳＬＰ（ヒトＴＳＬＰを含む）を認識してそれに結合するナノ抗体を指す。
本明細書で用いられるように、用語「本発明ナノ抗体」、「本発明のナノ抗体」、「本発明の抗ＴＳＬＰナノ抗体」、「本発明ＴＳＬＰナノ抗体」、「抗ＴＳＬＰナノ抗体」、「ＴＳＬＰナノ抗体」は同様の意味を持ち、入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＴＳＬＰ（ヒトＴＳＬＰを含む）を認識してそれに結合するナノ抗体を指す。
【0099】
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
【0100】
本明細書で用いられるように、用語「単一ドメイン」、「ＶＨＨ」、「ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」、「重鎖抗体」（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ、またはナノ抗体ｎａｎｏｂｏｄｙ）は同様の意味を持ち、かつ入れ替えて使用することができ、クローン抗体の重鎖の可変領域を指し、１つの重鎖可変領域のみからなるナノ抗体（ＶＨＨ）を構築し、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である。通常、まず天然の軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）が欠けた抗体を得た後、さらに抗体の重鎖の可変領域をクローンし、１つの重鎖可変領域だけからなるナノ抗体（ＶＨＨ）を構築する。
【0101】
本明細書で用いられるように、用語の「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）ＦＲと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１－３２４２，巻Ｉ，６４７－６６９頁（１９９１）を参照する）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【0102】
当業者に知られるように、免疫複合体および融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素およびほかの診断または治療分子と本発明の抗体またはその断片が結合してなる複合体を含む。さらに、本発明は、前記の抗ＴＳＬＰ抗体またはその断片と結合した細胞表面マーカーあるいは抗原を含む。
【0103】
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができる。
【0104】
本明細書で用いられるように、用語「可変領域」と「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は入れ替えて使用することができる。
【0105】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つの相補性決定領域を含む。
【0106】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖は上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【0107】
本発明において、用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＴＳＬＰタンパク質と結合するポリペプチド、たとえば重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。これらは、開始のメチオニンを含有してもよく、含有しなくてもよい。
【0108】
また、本発明は、本発明の抗体のほかのタンパク質あるいは融合発現産物を提供する。具体的に、本発明は、可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同様であるか、あるいは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の相同性を持つものであれば、この可変領域を含有する重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質複合体と融合発現産物（すなわち免疫複合体と融合発現産物）を含む。
【0109】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖可変領域に位置する３つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分かれ、４つのＦＲのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その中のＦＲで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるＣＤＲおよび相応の軽鎖におけるＣＤＲが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がＦＲあるいはＣＤＲ領域を構成するか確認することができる。
【0110】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原結合に関与するため、特に注目されている。そのため、ＣＤＲ含有モノクローナル抗体の重鎖可変領域鎖を有する分子は、そのＣＤＲはここで同定されるＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を持つものであれば、本発明に含まれる。
【0111】
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【0112】
本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、基本的に本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをいう。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似体は、（ｉ）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、あるいは（ｉｉ）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、あるいは（ｉｉｉ）成熟のポリペプチドと別の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールのようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、あるいは（ｉｖ）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列または蛋白質前駆体配列、あるいは６Ｈｉｓタグと形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。
【0113】
本発明の抗体とは、ＴＳＬＰ結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドのことである。当該用語は、さらに、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異の様態を含む。これらの突然変異の様態は、１個または複数個（通常は１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端への１個または複数個（通常は２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。また、Ｃ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の機能を変えることはない。この用語は、さらに、本発明の抗体の活性断片と活性誘導体を含む。
【0114】
当該ポリペプチドの変異の様態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低い厳格さの条件において本発明の抗体のコードＤＮＡと交雑が可能なＤＮＡがコードするタンパク質、および抗本発明の抗体の抗血清で得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【0115】
本発明は、さらに、ほかのポリペプチド、たとえばナノ抗体またはその断片の融合タンパク質を含む。ほとんど全長のポリペプチドのほか、本発明は、さらに、本発明のナノ抗体の断片を含む。通常、当該断片は本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続のアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続のアミノ酸を有する。
【0116】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【0117】
【表A】
【0118】
さらに、本発明は、上記抗体またはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
【0119】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドだけをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な付加コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の付加コード配列）および非コード配列を含む。
【0120】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
【0121】
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、たとえば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の時だけハイブリダイズすることである。そして、ハイブリダイズできるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0122】
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列あるいは断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。適用できる方法として、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成する。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。また、重鎖のコード配列を発現タグ（たとえば６Ｈｉｓ）一体に融合させ、融合タンパク質を形成してもよい。
【0123】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。本発明に係る生物分子（核酸、タンパク質など）は単離の形態で存在する生物分子を含む。
【0124】
現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0125】
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【0126】
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、ミバエＳ２若しくはＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞のような動物細胞などがある。
【0127】
ＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。
【0128】
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
【0129】
上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【0130】
本発明の抗体は単独に使用してもよく、検出可能なマーカー（診断目的）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。
【0131】
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0132】
本発明の抗体と結合または複合することができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物毒素、３．サイトカイン、たとえばＩＬ－２など、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．磁性ナノ粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））などを含むが、これらに限定されない。
【0133】
胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＴＳＬＰ）
胸腺間質性リンパ球新生因子は、４ヘリックスバンドルのフォールディング構造を有する短鎖型サイトカインで、ＩＬ－２サイトカインファミリーに属する。新たなサイトカインとして、ＴＳＬＰは、通常、肺、皮膚および腸管障壁の表面の上皮細胞において発現される。動物実験では、ＴＳＬＰはアレルゲンによって誘導されたモデルマウスの肺において高発現であるが、ＴＳＬＰ受容体欠失マウスでは、喘息の所見が明らかに軽減し、肺臓特異性ＴＳＬＰ遺伝子組み換えマウスでは、Ｔｈ２型炎症およびＩｇＥが向上する気管炎症が現れ、そして高反応性であることが示された。さらなる研究では、ＴＳＬＰは骨髄由
来の樹状細胞を活性化させて共刺激分子を上方調節し、Ｔｈ２型ケモカインＣＣＬ１７が生成することが示唆された。そのため、ＴＳＬＰは気管アレルギー性炎症を起こす要因で必須条件である。喘息を含む様々な疾患における多くの炎症経路の上流の調節因子で、気管炎症の発生および持続に非常に重要である。さらに、研究では、ＴＳＬＰはアトピー性皮膚炎（ＡＤ）の発症機序に関わるサイトカインでもあることが示された。より重要なのは、多くの異なる腫瘍において、ＴＳＬＰレベルが向上し、また腫瘍がもう一つのＢＣＬ－２と呼ばれるタンパク質を発現するように誘導することもでき、腫瘍は死亡しないようにそのタンパク質によって守られることを見出した研究者が既にいることである。そのため、ＴＳＬＰは腫瘍の生存にも非常に重要である。
胸腺間質性リンパ球新生因子は、４ヘリックスバンドルのフォールディング構造を有する短鎖型サイトカインで、ＩＬ－２サイトカインファミリーに属する。新たなサイトカインとして、ＴＳＬＰは、通常、肺、皮膚および腸管障壁の表面の上皮細胞において発現される。動物実験では、ＴＳＬＰはアレルゲンによって誘導されたモデルマウスの肺において高発現であるが、ＴＳＬＰ受容体欠失マウスでは、喘息の所見が明らかに軽減し、肺臓特異性ＴＳＬＰ遺伝子組み換えマウスでは、Ｔｈ２型炎症およびＩｇＥが向上する気管炎症が現れ、そして高反応性であることが示された。さらなる研究では、ＴＳＬＰは骨髄由
来の樹状細胞を活性化させて共刺激分子を上方調節し、Ｔｈ２型ケモカインＣＣＬ１７が生成することが示唆された。そのため、ＴＳＬＰは気管アレルギー性炎症を起こす要因で必須条件である。喘息を含む様々な疾患における多くの炎症経路の上流の調節因子で、気管炎症の発生および持続に非常に重要である。さらに、研究では、ＴＳＬＰはアトピー性皮膚炎（ＡＤ）の発症機序に関わるサイトカインでもあることが示された。より重要なのは、多くの異なる腫瘍において、ＴＳＬＰレベルが向上し、また腫瘍がもう一つのＢＣＬ－２と呼ばれるタンパク質を発現するように誘導することもでき、腫瘍は死亡しないようにそのタンパク質によって守られることを見出した研究者が既にいることである。そのため、ＴＳＬＰは腫瘍の生存にも非常に重要である。
【0134】
胸腺間質性リンパ球新生因子受容体（ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＳＬＰＲ）
ＴＳＬＰＲ受容体はＩ型膜貫通タンパク質で、造血サイトカイン受容体ファミリーに属する。機能性ＴＳＬＰＲ複合体は、ＴＳＬＰＲとＩＬ－７Ｒａからなる。ＴＳＬＰＲは、サイトカイン受容体様分子２またはＩ型サイトカイン受容体σ１とも呼ばれる。ＴＳＬＰは、その高親和力のヘテロ二量体受容体複合体に結合することによって細胞内２型シグナルの伝達を開始させ、ヘテロ二量体受容体複合体はその特異性受容体ＴＳＬＰＲからなるもので、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９およびＩＬ－１５における共通の受容体γ鎖と２４％の相同性を有し、そしてδ－共通鎖ＩＬ－２ファミリー、およびＴＳＬＰＲとＩＬ－７Ｒαを共発現する細胞におけるＩＬ－７Ｒαサブユニット（ＣＤ１２７）を含まない。ＴＳＬＰは、最初にＴＳＬＰＲに結合し、さらにＩＬ－７Ｒα鎖を招集する。
ＴＳＬＰＲ受容体はＩ型膜貫通タンパク質で、造血サイトカイン受容体ファミリーに属する。機能性ＴＳＬＰＲ複合体は、ＴＳＬＰＲとＩＬ－７Ｒａからなる。ＴＳＬＰＲは、サイトカイン受容体様分子２またはＩ型サイトカイン受容体σ１とも呼ばれる。ＴＳＬＰは、その高親和力のヘテロ二量体受容体複合体に結合することによって細胞内２型シグナルの伝達を開始させ、ヘテロ二量体受容体複合体はその特異性受容体ＴＳＬＰＲからなるもので、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９およびＩＬ－１５における共通の受容体γ鎖と２４％の相同性を有し、そしてδ－共通鎖ＩＬ－２ファミリー、およびＴＳＬＰＲとＩＬ－７Ｒαを共発現する細胞におけるＩＬ－７Ｒαサブユニット（ＣＤ１２７）を含まない。ＴＳＬＰは、最初にＴＳＬＰＲに結合し、さらにＩＬ－７Ｒα鎖を招集する。
【0135】
薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
【0136】
本発明の薬物組成物は直接ＴＳＬＰタンパク質分子との結合に使用することができるため、ＴＳＬＰに関連する疾患または病症（免疫系疾患や腫瘍疾患を含む）の治療に有用である。また、ほかの治療剤と併用してもよい。
【0137】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記のナノ抗体（またはその複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【0138】
薬物組成物の使用時、安全有効量の免疫複合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【0139】
抗ＴＳＬＰナノ抗体
本発明において、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４または配列番号３８のうちの一つまたは複数から選ばれる。
本発明において、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４または配列番号３８のうちの一つまたは複数から選ばれる。
【0140】
本発明の一つの好適な例において、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体は、単量体、二量体（二価抗体）、四量体（四価抗体）、および／または多量体（多価抗体）を含む。
【0141】
典型的に、前記抗ＴＳＬＰナノ抗体は、二つの配列番号８、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４または配列番号３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
【0142】
もう一つの好適な例において、前記ＶＨＨ鎖の間は連結ペプチドを介して連結している。
【0143】
もう一つの好適な例において、前記連結ペプチドは以下の配列から選ばれる：（ＧａＳｂ）ｘ（ただし、ａ、ｂ、ｘ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０である（好ましくは、ａ＝４かつｂ＝１、ｘ＝４である））。
【0144】
もう一つの好適な例において、前記連結ペプチドの配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【0145】
標識されたナノ抗体
本発明の一つの好適な例において、前記ナノ抗体は検出可能なマーカーを持つものである。より好ましくは、前記のマーカーは、同位元素、コロイド金マーカー、有色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選ばれる。
コロイド金マーカーは当業者に既知の方法によって行ってもよい。本発明の一つの好適な形態において、ＴＳＬＰのナノ抗体をコロイド金で標識し、金コロイドで標識されたナノ抗体を得る。
本発明の一つの好適な例において、前記ナノ抗体は検出可能なマーカーを持つものである。より好ましくは、前記のマーカーは、同位元素、コロイド金マーカー、有色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選ばれる。
コロイド金マーカーは当業者に既知の方法によって行ってもよい。本発明の一つの好適な形態において、ＴＳＬＰのナノ抗体をコロイド金で標識し、金コロイドで標識されたナノ抗体を得る。
【0146】
検出方法
また、本発明は、ＴＳＬＰタンパク質を検出する方法にも関する。当該方法は、基本的に、細胞および／または組織のサンプルを得る工程と、サンプルを媒体に溶解させる工程と、前記溶解されたサンプルにおけるＴＳＬＰタンパク質のレベルを検出する工程とを含む。
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは特に限定されず、代表的な例は細胞保存液に存在する細胞を含有するサンプルである。
また、本発明は、ＴＳＬＰタンパク質を検出する方法にも関する。当該方法は、基本的に、細胞および／または組織のサンプルを得る工程と、サンプルを媒体に溶解させる工程と、前記溶解されたサンプルにおけるＴＳＬＰタンパク質のレベルを検出する工程とを含む。
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは特に限定されず、代表的な例は細胞保存液に存在する細胞を含有するサンプルである。
【0147】
キット
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）あるいはカセットを含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）あるいはカセットを含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。
【0148】
また、本発明は、ＴＳＬＰレベルを検出する検出キットであって、ＴＳＬＰタンパク質を認識する抗体と、サンプルを溶解させる分解媒体と、検出に必要な汎用の試薬および緩衝液、たとえば様々な緩衝液、検出マーカー、検出基質などとを含む。当該検出キットは体外診断装置でもよい。
【0149】
応用
上記のように、本発明のナノ抗体は幅広い生物応用価値および臨床応用価値を有し、その応用はＴＳＬＰに関連する疾患または病症の診断と治療、基礎医療研究、生物学研究などの多くの分野にわたる。一つの好適な応用はＴＳＬＰに対する臨床診断および標的治療に使用されることである。
上記のように、本発明のナノ抗体は幅広い生物応用価値および臨床応用価値を有し、その応用はＴＳＬＰに関連する疾患または病症の診断と治療、基礎医療研究、生物学研究などの多くの分野にわたる。一つの好適な応用はＴＳＬＰに対する臨床診断および標的治療に使用されることである。
【0150】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（ａ）本発明のナノ抗体は、有効にＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの相互作用を遮断することができる。
（ｂ）本発明のナノ抗体は、対照抗体テゼペルマブよりも強い遮断活性を有する。
（ｃ）本発明のナノ抗体は、ピキア・パストリスにおいて発現することができ、振とう培養の発現収量が高く、かつ発酵タンクの収量が１７－２３ｇ／Ｌに達する。
（ｄ）本発明のナノ抗体は、ＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル経路に対する抑制作用が対照抗体テゼペルマブよりも顕著に良い。
（ａ）本発明のナノ抗体は、有効にＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの相互作用を遮断することができる。
（ｂ）本発明のナノ抗体は、対照抗体テゼペルマブよりも強い遮断活性を有する。
（ｃ）本発明のナノ抗体は、ピキア・パストリスにおいて発現することができ、振とう培養の発現収量が高く、かつ発酵タンクの収量が１７－２３ｇ／Ｌに達する。
（ｄ）本発明のナノ抗体は、ＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル経路に対する抑制作用が対照抗体テゼペルマブよりも顕著に良い。
【0151】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９）に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
特別に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。
特別に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。
【0152】
実施例１ ＴＳＬＰ特異性ナノ抗体のスクリーニング
フーリン切断部位が突然変異したヒトＴＳＬＰアミノ酸配列をヒトコドンに準じて最適化した後、その塩基配列をｐＦＵＳＥベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質導入して精製してヒトＴＳＬＰタンパク質を得た。高純度のタンパク質を免疫アジュバントと混合した後、それぞれ４頭の新疆フタコブラクダを、毎週１回で、計７回免疫させた後、ラクダの末梢血を採取し、ＲＮＡを単離してＶＨＨ遺伝子断片を増幅させた後、それをｐＭＥＣＳベクターにクローニングし、ＴＧ１感受性細胞に電気的形質転換し、高品質のファージディスプレイナノ抗体ライブラリーを構築した。検出したところ、４つのライブラリーでは、いずれも、キャパシティが１×１０９ＣＦＵ以上に、断片挿入率が８０％以上に達した。
フーリン切断部位が突然変異したヒトＴＳＬＰアミノ酸配列をヒトコドンに準じて最適化した後、その塩基配列をｐＦＵＳＥベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質導入して精製してヒトＴＳＬＰタンパク質を得た。高純度のタンパク質を免疫アジュバントと混合した後、それぞれ４頭の新疆フタコブラクダを、毎週１回で、計７回免疫させた後、ラクダの末梢血を採取し、ＲＮＡを単離してＶＨＨ遺伝子断片を増幅させた後、それをｐＭＥＣＳベクターにクローニングし、ＴＧ１感受性細胞に電気的形質転換し、高品質のファージディスプレイナノ抗体ライブラリーを構築した。検出したところ、４つのライブラリーでは、いずれも、キャパシティが１×１０９ＣＦＵ以上に、断片挿入率が８０％以上に達した。
【0153】
ファージディスプレイ技術により、ＴＳＬＰ特異性ナノ抗体をスクリーニングした。３回の「吸着－洗浄－集合」の過程を経た後、各ライブラリーはいずれも特異性ナノ抗体のファージの集合が現れた。その中から１２００のクローンを選んでＥＬＩＳＡ検出およびシークエンシングを行い、最終的に３１２株の異なる配列の抗体を得た。
【0154】
実施例２ フローサイトメトリーによるＴＳＬＰナノ抗体のスクリーニング 以上の配列が異なるナノ抗体をクローニングしてＴＢ培地に接種し、培養してＩＰＴＧで一晩誘導し、細胞を分解させて上清を収集して遮断活性の検出に用いた。培養されたＣＨＯＺＥＮ／ＴＳＬＰＲ安定形質移入細胞を分けて９６ウェルプレートに入れ、各ウェルに３Ｅ５細胞ずつで、３０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心して上清液を捨て、各抗体の分解液およびＴＳＬＰ－ビオチンタンパク質を入れて２０ｍｉｎインキュベートした。遠心して上清を捨て、希釈されたＳＡ－ＰＥ抗体を入れ、４℃で２０ ｍｉｎインキュベートした。さらに遠心して上清を捨て、各ウェルに２００μＬのＰＢＳ再懸濁細胞を入れ、フローサイトメーターによってサンプルのＰＥ信号を検出した。結果から、計６４株の候補抗体がＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの相互作用を遮断する機能を有することが示された。シークエンシングを合わせ、３１株の異なるファミリーの抗体を選んで発現・精製を行った。精製方法は特許ＣＮ１１０１４４０１１Ａにおける実施例４を参照する。
【0155】
以上の３１株の精製された抗体をさらにフローサイトメトリーによる遮断活性検出を行った。培養されたＨＥＫ２９３Ｆ／ＴＳＬＰＲ一過性形質移入細胞を分けて９６ウェルプレートに入れ、各ウェルに３Ｅ５細胞ずつで、３０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心して上清液を捨て、勾配希釈された各抗体（２０μｇ／ｍＬから２倍の勾配で希釈されたもの）およびＴＳＬＰ－ビオチンタンパク質を入れて２０ｍｉｎインキュベートした。本実験では、テゼペルマブを対照抗体とした。その後、遠心して上清を捨て、希釈されたＳＡ－ＰＥ抗体を入れ、４℃で２０ｍｉｎインキュベートした。さらに遠心して上清を捨て、各ウェルに２００μＬのＰＢＳ再懸濁細胞を入れ、フローサイトメーターによってサンプルのＰＥ信号を検出した。結果は図１Ａおよび１Ｂで示すように、そのうち、１４株の抗体の遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良く、１４株の抗体の番号はそれぞれＮｂ１－４１、Ｎｂ１－５１、Ｎｂ１－５９、Ｎｂ３－１８、Ｎｂ３－４３、Ｎｂ５－３１、Ｎｂ６－２９、Ｎｂ７－５４、Ｎｂ１０－５５、Ｎｂ１０－６３、Ｎｂ１０－８７、Ｎｂ１１－６、Ｎｂ１１－７２、Ｎｂ１１－７５である。
【0156】
実施例３ 抗体の親和力の測定
バイオレイヤー干渉技術（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）によって１４株の遮断型ＴＳＬＰナノ抗体の結合動態学を検出した。動態学の測定は、候補抗体をＰＢＳＴ緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈し、ＴＳＬＰ－Ｆｃ抗原をＰＢＳＴ緩衝液で２倍の勾配で６つの濃度の勾配に希釈し（２０ｎＭから２倍の勾配で希釈し）、装置の稼働条件を温度３０℃、Ｓｈａｋｅ ｓｐｅｅｄ １０００ｒｐｍとした。プロテインＡでコーティングされたプローブで抗体を捕獲し、捕獲時間が６０ｓで、勾配希釈された抗原と結合し、結合時間が２４０ｓで、解離時間が３００ｓで、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．７）で２回再生させ、毎回５ｓであった。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン９．０によって分析し、Ｇｌｏｂａｌモードでフィッティングし、結合速度（Ｋｏｎ）、解離速度（Ｋｄｉｓ）および解離定数ＫＤを計算した。結果を図２に示す。
バイオレイヤー干渉技術（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）によって１４株の遮断型ＴＳＬＰナノ抗体の結合動態学を検出した。動態学の測定は、候補抗体をＰＢＳＴ緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈し、ＴＳＬＰ－Ｆｃ抗原をＰＢＳＴ緩衝液で２倍の勾配で６つの濃度の勾配に希釈し（２０ｎＭから２倍の勾配で希釈し）、装置の稼働条件を温度３０℃、Ｓｈａｋｅ ｓｐｅｅｄ １０００ｒｐｍとした。プロテインＡでコーティングされたプローブで抗体を捕獲し、捕獲時間が６０ｓで、勾配希釈された抗原と結合し、結合時間が２４０ｓで、解離時間が３００ｓで、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．７）で２回再生させ、毎回５ｓであった。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン９．０によって分析し、Ｇｌｏｂａｌモードでフィッティングし、結合速度（Ｋｏｎ）、解離速度（Ｋｄｉｓ）および解離定数ＫＤを計算した。結果を図２に示す。
【0157】
実施例４ ピキア・パストリスによるヒト化二価抗体の発現
候補抗体に対してヒト化改変を行い、可変領域をそのままにし、４つのフレームワーク領域の配列に対してヒト化の設計を行い、改変方法は特許ＣＮ２０１８１０１５１７５２６における実施例４の方法を参照する。ヒト化された抗体のアミノ酸配列を表１に示す。
候補抗体に対してヒト化改変を行い、可変領域をそのままにし、４つのフレームワーク領域の配列に対してヒト化の設計を行い、改変方法は特許ＣＮ２０１８１０１５１７５２６における実施例４の方法を参照する。ヒト化された抗体のアミノ酸配列を表１に示す。
【0158】
【表1】
【0159】
以上のヒト化された抗体を二価の様態に構築し、リンカー（Ｇ４Ｓ）４で連結し、連結した配列は配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２で示され、その後、ピキア・パストリスで発現させた。概略的に、発現方法は以下の通りである。（１）以上のＴＳＬＰナノ抗体の二量体配列をｐＰＩＣＺａＡベクターに構築した。（２）Ｓａｃ Ｉ制限酵素で線形化した後、電気的にＸ－３３感受性細胞に形質移入した。（３）電気的に形質移入されたサンプルをそれぞれ異なる濃度のブレオマイシン耐性のＹＰＤプレート培地に塗り、３０℃のインキュベーターにおいて３－４日培養した。（４）プレート培地に単一クローンができた後、異なる濃度のプレートにおける単一クローンを選んでＢＭＧＹ培地に入れ、ＢＭＧＹ培地のＯＤ値が２０程度に達した時点で、菌体を収集してＢＭＭＹ培地に変え、２８℃、２５０ｒｐｍで培養した。（５）その後、２４ｈごとにサンプリングし、そして最終体積が１％になるようにメタノールを追加してサンプリングした。サンプルを１２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を取り、－２０℃で保存した。連続５日で誘導し、培養を終えた。（６）得られた上清サンプルに対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行った。二価単一ドメイン抗体の振とう培養の発現量は図３に示す。
【0160】
実施例５ ＥＬＩＳＡによるヒト化二価抗体の遮断活性の検出
以上の精製された二価ヒト化抗体に対してＥＬＩＳＡによって遮断活性を検出した。ヒトＴＳＬＰ抗原タンパク質を分けて９６ウェルプレートに入れ、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、３００μＬの１％ＢＳＡブロッキング液を入れ、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μＬの勾配希釈された抗体サンプルを入れ、さらに各ウェルに５０μＬの０．０２μｇ／ｍＬビオチン化されたＴＳＬＰＲタンパク質を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＳＡ－ＨＲＰ（１：１０００００で希釈されたもの）を１００μＬ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ呈色液を１００μＬ入れ、３７℃で１０ｍｉｎ呈色し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって波長４５０ｎｍにおいて吸収値を測定した。結果は図４に示すように、３株のヒト化二価抗体の遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かった。
以上の精製された二価ヒト化抗体に対してＥＬＩＳＡによって遮断活性を検出した。ヒトＴＳＬＰ抗原タンパク質を分けて９６ウェルプレートに入れ、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、３００μＬの１％ＢＳＡブロッキング液を入れ、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μＬの勾配希釈された抗体サンプルを入れ、さらに各ウェルに５０μＬの０．０２μｇ／ｍＬビオチン化されたＴＳＬＰＲタンパク質を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＳＡ－ＨＲＰ（１：１０００００で希釈されたもの）を１００μＬ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ呈色液を１００μＬ入れ、３７℃で１０ｍｉｎ呈色し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって波長４５０ｎｍにおいて吸収値を測定した。結果は図４に示すように、３株のヒト化二価抗体の遮断活性が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かった。
【0161】
実施例６ ヒト化二価抗体のＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル経路に対する抑制作用
良好に生長したＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞を１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、ＰＢＳで細胞を再懸濁させ、１ｘ１０５細胞／ウェルで分けて９６ウェルプレートに入れた。２５μＬの希釈されたヒトＴＳＬＰ因子を勾配希釈された二価ヒト化抗体またはテゼペルマブと混合し、３７度で３０分インキュベートした後、混合物を細胞に入れ、３７℃、５％ＣＯ２で２０分置いた。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ホルムアルデヒドを入れて固定し、さらに冷却しておいたホルムアルデヒドを入れて１０分インキュベートした。最後に抗リン酸化ＳＴＡＴ５－ＰＥ標識抗体を入れて３０分インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーターにセットしてＰＥ信号値を検出した。結果は図５に示すように、そのうちの２株のヒト化抗体のＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル経路に対する抑制作用が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かった。
良好に生長したＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞を１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、ＰＢＳで細胞を再懸濁させ、１ｘ１０５細胞／ウェルで分けて９６ウェルプレートに入れた。２５μＬの希釈されたヒトＴＳＬＰ因子を勾配希釈された二価ヒト化抗体またはテゼペルマブと混合し、３７度で３０分インキュベートした後、混合物を細胞に入れ、３７℃、５％ＣＯ２で２０分置いた。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ホルムアルデヒドを入れて固定し、さらに冷却しておいたホルムアルデヒドを入れて１０分インキュベートした。最後に抗リン酸化ＳＴＡＴ５－ＰＥ標識抗体を入れて３０分インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーターにセットしてＰＥ信号値を検出した。結果は図５に示すように、そのうちの２株のヒト化抗体のＢａＦ３／ＴＳＬＰＲ－ＩＬ７Ｒ細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル経路に対する抑制作用が顕著に対照抗体テゼペルマブよりも良かった。
【0162】
実施例７ ヒト化二価抗体の７Ｌ発酵タンクにおける収量の評価
以上の３つの抗体の発現菌株のグリセロールストックをそれぞれ１：１００で増幅培養して一次シードを得た後、新鮮な培地に移して二次シードの培養を行い、二次ジードの培養が合格すると７Ｌ発酵タンクに接種して発酵培養を行い、アンモニア水を自動流加し、発酵培養のｐＨが６．０になるように調整した。培養過程において、定時的に発酵液のｐＨ、菌体の湿重量、菌液のＯＤ値などを検出し、そして溶存酸素の変化に応じて撹拌の回転数、タンクの圧力および酸素の導入量を調整した。発酵菌体の湿重量および溶存酸素の変化に応じ、発酵培養の異なる段階でそれぞれグリセロール追加培地およびメタノール追加培地を流加した。メタノールで誘導して１６０ｈ～２００ｈ培養し、発酵を停止させた。上記３つのヒト化二価抗体の収量を検出したところ、それぞれ１７ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌおよび２３ｇ／Ｌであった。当該抗体の収量は既に報告されたすべての種類の抗体の発酵発現収量を遥かに超え、業界のトップレベルに達した。
以上の３つの抗体の発現菌株のグリセロールストックをそれぞれ１：１００で増幅培養して一次シードを得た後、新鮮な培地に移して二次シードの培養を行い、二次ジードの培養が合格すると７Ｌ発酵タンクに接種して発酵培養を行い、アンモニア水を自動流加し、発酵培養のｐＨが６．０になるように調整した。培養過程において、定時的に発酵液のｐＨ、菌体の湿重量、菌液のＯＤ値などを検出し、そして溶存酸素の変化に応じて撹拌の回転数、タンクの圧力および酸素の導入量を調整した。発酵菌体の湿重量および溶存酸素の変化に応じ、発酵培養の異なる段階でそれぞれグリセロール追加培地およびメタノール追加培地を流加した。メタノールで誘導して１６０ｈ～２００ｈ培養し、発酵を停止させた。上記３つのヒト化二価抗体の収量を検出したところ、それぞれ１７ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌおよび２３ｇ／Ｌであった。当該抗体の収量は既に報告されたすべての種類の抗体の発酵発現収量を遥かに超え、業界のトップレベルに達した。
【0163】
配列情報：
配列番号１：
ＧＦＴＬＤＤＳＤＭＧ
配列番号２：
ＩＳＳＬＧＧＴ
配列番号３：
ＡＰＧＴＤＲＹＳＤＣＰＮＥＹＳＶ
配列番号４：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ
配列番号５：
ＷＹＲＱＡＰＧＤＥＣＥＬＶＳＴ
配列番号６：
ＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＨＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＨＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号７：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＬＤＤＳＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＤＥＣＥＬＶＳＴＩＳＳＬＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＨＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＨＤＴＡＶＹＹＣＡＰＧＴＤＲＹＳＤＣＰＮＥＹＳＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号９：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＡＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ
配列番号１１：
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＬＤＤＳＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＤＥＣＥＬＶＳＴＩＳＳＬＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＨＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＨＤＴＡＶＹＹＣＡＰＧＴＤＲＹＳＤＣＰＮＥＹＳＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３：
ＧＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＴＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＣＴＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＡＴＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＴＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣ
配列番号１４：
ＧＦＴＦＤＤＳＤＭＧ
配列番号１５：
ＩＳＳＤＧＭＴ
配列番号１６：
ＡＡＴＫＹＳＳＤＹＤＶＡＥＤＷＲＲＧＶＣＧＤＭＤＹ
配列番号１７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＥＴＬＲＬＳＣＴＡＳ
配列番号１８：
ＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＩ
配列番号１９：
ＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号２０：
ＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２１：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＥＴＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＤＤＳＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＩＩＳＳＤＧＭＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＫＹＳＳＤＹＤＶＡＥＤＷＲＲＧＶＣＧＤＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２２：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＡＴＧＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＧＡＣＴＡＴＧＡＣＧＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２３：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＥＴＬＲＬＳＣＴＡＳ
配列番号２４：
ＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２５：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＥＴＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＤＤＳＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＩＩＳＳＤＧＭＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＫＹＳＳＤＹＤＶＡＥＤＷＲＲＧＶＣＧＤＭＤＹＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２６：
ＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＴＡＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＴＡＴＧＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＴＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴ
配列番号２７：
ＧＦＴＳＧＧＳＤＭＧ
配列番号２８：
ＩＳＳＤＧＳＴ
配列番号２９：
ＡＡＴＤＹＧＬＧＰＰＰＳＳＴＧＱＣＹＧＭＤＹ
配列番号３０：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ
配列番号３１：
ＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＤＬＶＳＹ
配列番号３２：
ＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３３：
ＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３４：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＳＧＧＳＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＤＬＶＳＹＩＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＤＹＧＬＧＰＰＰＳＳＴＧＱＣＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３５：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＴＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号３６：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ
配列番号３７：
ＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３８：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＳＧＧＳＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＤＬＶＳＹＩＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＤＹＧＬＧＰＰＰＳＳＴＧＱＣＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３９：
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配列番号４０：
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配列番号１５：
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配列番号１６：
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【0164】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】