特開 2024-167864 肝線維症治療薬の製造におけるＫ＋チャネル遮断薬の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024167864

(43)【公開日】2024-12-04

(54)【発明の名称】肝線維症治療薬の製造におけるＫ＋チャネル遮断薬の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20241127BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241127BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241127BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20241127BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P1/16

A61P43/00 105

A61P43/00 111

A61K31/18

【審査請求】有

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023195224

(22)【出願日】2023-11-16

(31)【優先権主張番号】202310579539.6

(32)【優先日】2023-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】520422566

【氏名又は名称】遵義医科大学附属医院

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】謝 睿

(72)【発明者】

【氏名】徐 靖宇

(72)【発明者】

【氏名】杜 倩

(72)【発明者】

【氏名】胡 艶霞

(72)【発明者】

【氏名】丁 建紅

(72)【発明者】

【氏名】呉 先麗

(72)【発明者】

【氏名】楊 暁旭

(72)【発明者】

【氏名】婁 俊

(72)【発明者】

【氏名】劉 奇

(72)【発明者】

【氏名】李 卓

【テーマコード（参考）】

4C084

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084ZA751

4C084ZB211

4C084ZC022

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA16

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA75

4C206ZB21

(57)【要約】      （修正有）

【課題】既存のＫ^＋チャネル遮断薬の新しい用途を提供する。
【解決手段】肝線維症を治療するための医薬品の製造における、既存のＫ^＋チャネル遮断薬（ソタロール）の使用を提供する。ソタロールは、肝線維症を効果的に抑制し、線維化関連タンパク質α－ＳＭＡの発現を減少させることが証明されている。具体的な経路は、オートファージー並びにＥＭＴ系分子の発現及び／又は機能を制御することにより、肝星細胞線維化に対する抑制を実現することである。臨床的に肝線維症を治療するために新たな投薬の選択肢を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝線維症治療薬の製造におけるＫ^＋チャネル遮断薬の使用。

【請求項2】

前記Ｋ^＋チャネル遮断薬は、タロールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬の技術分野に関し、具体的には、肝線維症治療薬の製造におけるＫ^＋チャネル遮断薬の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

肝線維症は、反応の長期的な影響によって引き起こされる肝臓への慢性損傷であり、その発病因子は多く、さらに肝硬変又は肝がんに進行する可能性があり、人間の健康と生命を深刻に脅かしている。肝線維化の段階は、慢性肝疾患に共通する病理学的基礎だけでなく、肝硬変及びＨＣＣに進行する重要な部分である。近年、関連研究により、肝線維症、さらには初期の肝硬変さえも、回復できることが判明した。現在、如何に肝線維症を効果的に防止するかは、国内外の研究者の研究重点となっている。

【0003】

臨床的には、線維症の治療は、主に肝線維症の病因を除去して治療を行うことであり、主に、例えば、抗ウイルス治療、禁酒及び食事制御等を含む。しかし、これらの方法は、治療期間が長く、治療効果が低く、副作用が多く、患者のコンプライアンスが悪い等の欠点があり、患者の予後が悪い。そのため、肝線維症に対する新しい潜在的な作用標的を探し、肝線維症の臨床治療をより正確で効果的に指導することは、患者の予後を改善するのに積極的な意義を有する。新薬の開発コストは高いため、肝線維症の治療に適用可能な既存の非抗線維症薬を臨床段階で見出すことが望ましい。

【0004】

イオンチャネルは、近年の研究で注目されている。それは、極めて重要なタンパク質であり、細胞又は細胞小器官に対するイオンの流入又は流出を厳密に制御することにより細胞シグナル伝達を調節し、広範な生理学的及び病理学的過程に影響を与える。イオンチャネルと消化器系の研究において、肝線維症へのイオンチャネルの影響は、ますます注目を集めている。カリウムイオンチャネルは、複数の線維化疾患における線維芽細胞の機能を促進することができることが既に証明されている。肝臓において、カリウムイオンチャネルは、線維化組織及びＴＧＦ－βの発現を促進し、ＨＳＣを活性化することにより肝臓線維化を促進する。カリウムイオンチャネルと肝線維症との以上の関連のため、本発明者らは、医薬品再利用の高まりに従って、臨床的な肝線維症の治療に適用可能なカリウムイオン遮断剤を見出すことを期待している。ソタロールは、競合的なβ－アドレナリン受容体拮抗薬であり、ＩＩ群（β阻害）の作用を有することに加えて、ソタロールは、ＩＩＩ群の抗不整脈活性も有し、活動電位持続時間（ＡＰＤ）を増加させ、心房及び心室の再分極を延長することができる。また、ソタロールは、カリウムイオン遮断薬でもあり、カリウムチャネルの発現を遮断することができる。現在、ソタロールに対する研究は、不整脈への作用のみに限られ、肝線維化に対するソタロールの影響及び作用メカニズムに関する報告はない。

【発明の概要】

【0005】

従来技術の欠点に対して、本発明は、肝線維症を治療するための医薬品の製造におけるＫ^＋チャネル遮断薬の使用を提供する。

【0006】

上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を提供する。
本発明は、肝線維症を治療するための医薬品の製造におけるＫ^＋チャネル遮断薬の使用を開示する。

【0007】

好ましくは、前記Ｋ^＋チャネル遮断薬は、ソタロールである。

【0008】

本発明は、以下の有益な効果を有する。
１．ソタロールは、臨床的に使用されている抗不整脈薬として、Ｋ^＋チャネルを阻害する特性を有する。実験により、ソタロールは、肝線維症を効果的に抑制し、線維化関連タンパク質α－ＳＭＡの発現を減少させることが証明されている。具体的な経路は、オートファージー並びにＥＭＴ系分子の発現及び／又は機能を制御することにより、肝星細胞線維化に対する抑制を実現することであり、臨床的に肝線維症を治療するために新たな投薬の選択肢を提供する。

【0009】

２．本発明では、研究過程において、ソタロールは活性化された肝星細胞を抑制することで肝線維化の程度を改善することができ、具体的には、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、オートファージー経路を抑制することにより作用することが判明した。

【0010】

３．本発明では、初めてＫ^＋チャネル遮断薬（ソタロール）を使用してその肝線維症に対する影響を研究したところ、肝星細胞活性化の抑制、肝線維症の改善及び回復のためにより多くの選択肢を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１におけるＨＥ染色及びピクロシリウスレッド染色法により観察された肝臓組織の線維化の程度を示す。

【図2】実施例１において検出された血清中のＡＬＴ、ＡＳＴレベルの変化及び統計図である。

【図3】実施例２における免疫組織化学により検出された肝臓組織中のα－ＳＭＡの発現変化及び統計図である。

【図4】実施例３におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出された肝臓組織中のα－ＳＭＡの発現変化及び統計図である。

【図5】実施例３におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出された肝臓組織中のオートファージー関連指標ＬＣ３、Ｐ６２の発現変化及び統計図である。

【図6】実施例３におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出された肝臓組織中の上皮間葉転換間葉様細胞マーカーＮ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現変化及び統計図である。

【図7】実施例３におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出された肝臓組織中の上皮間葉転換間葉様細胞マーカーＺＯ－１の発現変化及び統計図である。

【図8】実施例４におけるＣＣＫ８により検出されたＨＳＣｓ細胞増殖に対するソタロールとＴＧＦ－β１の共培養の影響及び統計図である。

【図9】実施例５におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出されたＨＳＣｓ細胞中のα－ＳＭＡのタンパク質の発現レベルの変化及び統計図である。

【図10】実施例５におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出されたＨＳＣｓ細胞中のＬＣ３のタンパク質の発現レベルの変化及び統計図である。

【図11】実施例５におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出されたＨＳＣｓ細胞中のＰ６２のタンパク質の発現レベルの変化及び統計図である。

【図12】実施例５におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出されたＨＳＣｓ細胞中のＺ０－１のタンパク質の発現レベルの変化及び統計図である。

【図13】実施例５におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出されたＨＳＣｓ細胞中のＮ－ｃａｄｈｅｒｉｎのタンパク質の発現レベルの変化及び統計図である。

【図14】実施例５におけるＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔにより検出されたＨＳＣｓ細胞中のＶｉｍｅｎｔｉｎのタンパク質の発現レベルの変化及び統計図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の実施例における図面を参照しながら本発明の実施例における技術的解決策を明確かつ完全に説明するが、明らかに、説明される実施例は、本発明の実施例の一部にすぎず、全ての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力をせずに得られる全ての他の実施例は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。

【0013】

特に明示しない場合、実施例に用いられる技術的手段は、当業者によく知られた一般的な手段である。

【0014】

本発明は、肝線維症治療薬の製造におけるＫ^＋チャネル遮断薬の使用を開示する。ここで、Ｋ^＋チャネル遮断薬は、肝線維症を改善し、具体的には、前記Ｋ^＋チャネル遮断薬は、ソタロールである。

【0015】

以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。

【0016】

実施例１：四塩化炭素（ＣＣｌ_４）により誘発されたマウス肝線維症
実験材料
６０匹の健康な雄Ｃ５７マウス（２０－２５ｇ／匹）、強制経口投与針、１ｍＬ注射器、ＣＣｌ_４溶液、オリーブ油、ソタロール溶液。

【0017】

実験方法：ＣＣｌ_４をオリーブ油溶液（ＣＣｌ_４：オリーブ油＝１：４、ｖ／ｖ）に溶解した（使用時に調製した；０．１ｍＬ／２０ｇ）。週に２回、合計８週間強制経口投与した。ソタロール溶液と生理食塩水を混合した（使用時に調製した；濃度１ｍｍ；０．２ｍＬ／２０ｇ）。1日１回、合計６－８週間腹腔内注射した。マウスをａ．正常対照群、ｂ．モデル群（マウスにＣＣｌ_４を８週間強制経口投与）、ｃ．ＣＣｌ_４＋ソタロール群（マウスにＣＣｌ_４単独を２週間投与した後、ソタロールとＣＣｌ_４を６週間共投与）、ｄ．ソタロール群（ソタロールを８週間腹腔内間注射）にランダムに分けた。マウスはモデル確立後の２、４、６、８週目にそれぞれ順に安楽死させ、各群について毎回１匹安楽死させた。肝臓サンプルを取り出して－８０℃の冷蔵庫に入れて急速冷凍して保存し、他の肝臓を４％のパラホルムアルデヒドに入れて２４時間固定した後、パラフィンに包埋した。外観、ピクロシリウスレッド染色、ＨＥ染色により肝臓線維症の重症度を観察し、染色結果が肝臓線維症を示す場合、モデル確立に成功したものとみなし、次に、全てのマウスを安楽死させ、眼球血を採取して肝臓機能指標（ＡＬＴ、ＡＳＴ）を測定し、肝臓組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋して使用に備えた。

【0018】

実験結果：図１－２に示すように、８週目にモデル群から眼球血を採取して検出した結果、ＡＬＴ、ＡＳＴはいずれも顕著に上昇した。染色結果は図１に示すように、ＨＥ染色の結果として、正常群では、肝臓組織の構造は明らかで、肝小葉の構造は正常で、肝細胞は完全で、模様は明確であった。モデル群では、肝臓組織が損傷し、線維組織が顕著に増殖した。四塩化炭素＋ソタロール群では、肝臓組織の損傷及び線維組織の増殖の程度はいずれも顕著に軽減した。シリウスレッド染色結果から分かるように、モデル群では、赤色のコラーゲン線維は、太く長くなり、一部は偽小葉を形成し、マウス肝線維症モデルの確立に成功したことを示している。ソタロール群では、明らかなコラーゲン線維は見られず、１ｍｍの濃度では、ソタロールはマウスの肝線維症を引き起こすことができないことを示している。

【0019】

実施例２：異なる群間の肝線維症指標であるα－ＳＭＡのタンパク質発現レベルの免疫組織化学検出
実験材料：Ｃ５７マウス、α－ＳＭＡ一次抗体、免疫組織化学キット、ＰＢＳ溶液、クエン酸ナトリウム溶液など

【0020】

実験方法：実施例１のパラフィンブロックを取り、切片を作成した後に手順に従って免疫組織化学操作を行い、順に１００％、９５％、８０％、７５％のエタノールに５ｍｉｎ浸漬し、さらにＰＢＳで洗浄し、過酸化水素水でカタラーゼを除去し、クエン酸ナトリウム修復液で抗原を修復し、冷却した後にＰＢＳで洗浄し、室温で３０ｍｉｎブロッキングした後に一次抗体を添加し、４℃で一晩インキュベートし、翌日、二次抗体で室温で１ｈインキュベートし、さらにＤＢＡで染色し、ヘマトキシリンで再染色し、塩酸アルコールで分化し、脱水し、密封し、最後に顕微鏡で観察し、撮影した。

【0021】

実験結果：図３に示すように、ソタロールは四塩化炭素誘発性肝線維化マウス中のα－ＳＭＡの発現をダウンレギュレートすることができる。

【0022】

実施例３：Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技術による異なる実験群の肝線維化指標α－ＳＭＡ及びオートファージー関連指標、上皮間葉転換（ＥＭＴ）などの発現状況の検出
実験材料：マウス肝臓組織、ピンセット、ハサミ、２ｍｍ鋼球、磁石、細胞溶解液、ＰＢＳ液、ＢＣＡタンパク質定量キット、脱脂粉乳、α－ＳＭＡ、オートファージー及びＥＭＴ関連一次抗体及び対応する二次抗体など

【0023】

実験方法：実施例１の肝臓組織を取り、ピンセット及びハサミで米粒程度の大きさを切り出し、マークを付けた１．５ｍＬのＥＰチューブ内に添加し、各ＥＰチューブ内に２つの２ｍｍ鋼球を入れ、２００－２５０μＬの細胞溶解液を添加し、パラメータを設定した後に粉砕機に入れて十分に粉砕し、その後、磁石で鋼球を吸引して取り出し、氷上で３０ｍｉｎ作用した後に１２０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離した。標準曲線を作成し、９６ウェルプレートの各ウェルにタンパク質サンプル１μＬ、ＰＢＳ液１９μＬ、ＢＣＡ作動液２００μＬ（５０：１）を添加し、各ウェルにさらに２つの付加ウェルを追加した。３７℃の乾燥オーブンに３０ｍｉｎ入れた。ＥＬＩＳＡを使用して５６０ｎｍでのＯＤ値を測定し、タンパク質濃度を計算し、沸騰水でタンパク質を５分間煮沸した後にサンプルをローディングし、さらにゲル電気泳動、転写、密封を順に行い、一次抗体及び二次抗体をインキュベートした後に露光した。

【0024】

実験結果：図４－図７に示すように、ソタロールで処理した後に、ＣＣｌ_４により誘導された肝臓組織中のα－ＳＭＡ、ＬＣ３の発現が顕著に低減され、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現が抑制され、Ｐ６２及びＺＯ－１の蓄積が促進された。

【0025】

実施例４：ＣＣＫ８によるソタロールとＴＧＦ－β１の共培養のＨＳＣｓ細胞増殖に対する影響の検出
実験材料：ＨＳＣ－Ｔ６細胞、ＤＭＥＭ完全培地、９６ウェルプレート、カウントプレート、ＣＣＫ－８作動液など

【0026】

実験方法：まず、ＨＳＣ－Ｔ６肝星細胞の培養を行い、１０％ウシ胎児血清、１％二重抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン溶液）及び１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含有するＤＭＥＭ培養液において、培養条件３７℃、５％ＣＯ_２で、細胞コンフルエンスが８０％～９０％に達した後にトリプシンで消化して継代した。次に、プレートに播種し、密度が７×１０^６個／Ｌの細胞懸濁液を取り、１００μＬ／ウェルで９６ウェル培養プレートに添加した。各群６個のウェルである。実験は、対照群、ＴＧＦ－β１群、ＴＧＦ－β１＋異なる濃度（２００μＭ、４００μＭ、８００μＭ、１０００μＭ）のソタロール医薬品群、ソタロール医薬品群（２００μＭ、４００μＭ、８００μＭ、１０００μＭ）に分けた。細胞が壁に付着した後、対照群及びＴＧＦ－β１群以外に、残りの各群に対応する濃度のソタロールを添加し、３ｈ後に対応する群にＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加してマウスの肝星細胞を刺激した。４８ｈインキュベートした後、各ウェルに「１０％のＣＣＫ８＋９０％培地」混合溶液１００μＬを添加し、３７℃で１－４ｈインキュベートし、波長を４５０ｎｍに設定し、全自動マイクロプレートリーダーにより、対応する波長で吸光度値を読み取って記録した。ＣＣＫ８実験によりソタロールの細胞増殖への影響を検出し、最適な作用時点及び医薬品濃度をスクリーニングした。

【0027】

実験結果：図８に示すように、正常値と比較して、ＴＧＦ－β１で刺激した後にＨＳＣ－Ｔ６細胞の増殖を顕著に誘導することができ、ソタロール及びＴＧＦ－β１を用いた共培養により、ＴＧＦ－β１誘導での増殖傾向が抑制された。

【0028】

実施例５：Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技術によるＨＳＣｓ細胞中のα－ＳＭＡなどの発現状況の検出
実験材料：ＨＳＣ－Ｔ６細胞、ＤＭＥＭ完全培地、細胞培養皿、細胞溶解液、ＰＢＳ液、ＢＣＡタンパク質定量キット、脱脂粉乳、αＳＭＡ、オートファージー及びＥＭＴ一次抗体及び対応する二次抗体など

【0029】

実験方法：まず、正常群、ＴＧＦ－β１群、ソタロール＋ＴＧＦ－β１群、及びソタロール群に分けた。ここで、ＴＧＦ－β１刺激濃度は１０ｎｇ／ｍＬであり、ソタロール濃度は４００μｍであった。細胞培養皿を用いてＨＳＣ－Ｔ６細胞を培養し、実施例４に記載の条件で培養し、医薬品を添加し、ＴＧＦ－β１を添加した。４８ｈ後にインキュベートされた細胞を予冷したＰＢＳで３－４回洗浄した後、濾紙で残りのＰＢＳ液体を吸引して乾燥し、５０ｍＬ培養フラスコに５０μＬのＲＩＰＡ及び１００ｍｏｌ／ＬのＰＭＳＦ０．５μＬ（１００：１）を添加し、氷上で３０分間作用させた後、セルスクレーパーでタンパク質を掻き取り、タンパク質をＥＰチューブに吸引し、１２０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離した。標準曲線を作成し、９６ウェルプレートの各ウェルにタンパク質サンプル１μＬ、ＰＢＳ液１９μＬ、ＢＣＡ作動液２００μＬ（５０：１）を添加し、各ウェルにさらに２つの付加ウェルを追加した。３７℃の乾燥オーブンに３０ｍｉｎ入れた。ＥＬＩＳＡを使用して５６０ｎｍでのＯＤ値を測定し、タンパク質濃度を計算し、沸騰水でタンパク質を５分間煮沸した後にサンプルをローディングし、さらにゲル電気泳動、転写、密封を順に行い、一次抗体及び二次抗体をインキュベートした後に露光した。

【0030】

実験結果：図９－図１４に示すように、ソタロールは、ＨＳＣｓ細胞中のα－ＳＭＡの発現を顕著に減少させ、オートファージー過程において、ｓｏｔａｌｏｌ（ソタロール）は、ＬＣ３の発現を顕著に抑制し、Ｐ６２の蓄積を促進することができる。上皮間葉転換過程において、ｓｏｔａｌｏｌは、ＺＯ－１の蓄積を促進し、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現を抑制することができる。

【0031】

上述の実施例は、本発明の好ましい形態を説明するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の設計思想から逸脱しない前提で、当業者が本発明の技術的解決策に対してなされる様々な変形及び改善は、いずれも本発明の特許請求の範囲によって確定される保護範囲内に含まれるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】