特開 2024-167865 肝線維症の治療及び／又は予防のための医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024167865

(43)【公開日】2024-12-04

(54)【発明の名称】肝線維症の治療及び／又は予防のための医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20241127BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241127BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241127BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20241127BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20241127BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20241127BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20241127BHJP

   A61K 31/4166 20060101ALI20241127BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P1/16

A61P43/00 111

A61K9/08

A61K9/14

A61K9/20

A61K9/48

A61K31/4166

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023195463

(22)【出願日】2023-11-16

(31)【優先権主張番号】202310583492.0

(32)【優先日】2023-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】520422566

【氏名又は名称】遵義医科大学附属医院

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】謝 睿

(72)【発明者】

【氏名】徐 靖宇

(72)【発明者】

【氏名】宮 幗唯

(72)【発明者】

【氏名】杜 倩

(72)【発明者】

【氏名】胡 艶霞

(72)【発明者】

【氏名】丁 建紅

(72)【発明者】

【氏名】呉 先麗

(72)【発明者】

【氏名】楊 暁旭

(72)【発明者】

【氏名】婁 俊

(72)【発明者】

【氏名】劉 奇

(72)【発明者】

【氏名】李 卓

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA29

4C076AA36

4C076AA53

4C076BB01

4C076BB11

4C084AA17

4C084MA16

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZC411

4C084ZC412

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC38

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA16

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA43

4C086MA52

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA75

4C086ZC41

(57)【要約】      （修正有）

【課題】肝線維症を効果的に治療でき、安全で信頼性が高く、安価である医薬品を提供する。
【解決手段】医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用を提供する。好ましくは、チャネル遮断薬は、ナトリウムチャネル遮断薬であり、より好ましくは、ナトリウムチャネル遮断薬は、フェニトインナトリウムを含むことを特徴とする、使用である。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝線維症の治療及び／又は予防のための医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用。

【請求項2】

前記チャネル遮断薬は、ナトリウムチャネル遮断薬であることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

【請求項3】

前記ナトリウムチャネル遮断薬は、フェニトインナトリウムを含むことを特徴とする、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記肝線維症は、四塩化炭素誘発性肝線維症を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項5】

前記医薬品は、薬学的に許容可能な補助材料をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項6】

前記医薬品の剤形は、医学的に認められる任意の剤形であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記医薬品の剤形は、粉剤、注射液、カプセル、錠剤、経口液剤を含むことを特徴とする、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

肝臓組織のオートファージーを抑制するための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用。

【請求項9】

肝星細胞増殖を抑制するための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用。

【請求項10】

肝細胞α-SMAをダウンレギュレートするための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医薬の技術分野に関し、特に、肝線維症の治療及び／又は予防のための医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

慢性肝疾患は、人々の生活の質に深刻な影響を与える世界的な難題であり、肝硬変及び原発性肝細胞癌の発病率及び死亡率はいずれも非常に高く、肝線維症は、これらの慢性肝疾患の病理学的基礎であり、肝硬変、肝癌の発病メカニズムでもある。肝線維症は、アルコール、ウイルス、医薬品、毒素、免疫及び代謝障害などを含む様々な原因で引き起こされる可能性があることが、多数の研究により確認されている。これらの物質の持続的な刺激は、深刻な肝臓損傷を引き起こす可能性がある。肝線維症の発生メカニズムも様々な要因に関連し、肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣｓ）の活性化はその発症メカニズムにおける重要な要因の一つである。様々な要因の影響を受け、肝実質細胞は持続性の炎症性壊死を引き起こし、ＨＳＣｓが活性化され、さらに大量に増殖し、同時に大量の細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）を放出する。これらの物質は線維性結合組織の大量増殖を促進し、最終的には線維性瘢痕を形成し、さらに肝臓の構造及び機能に損傷を与え、最終的には肝線維症を引き起こす。したがって、活性化されたＨＳＣｓの抑制は、肝線維症の治療において重要な意味を有する。

【0003】

現在、肝線維症の治療は依然として萌芽段階にあり、いくつかの有効な医薬品が発見されているが、多くは病因治療であり、治療期間が長く、治療効果が低く、副作用が多いなどの欠点が存在し、その治療法は世界の医学界を困惑させている。肝線維症を引き起こす要因を早期に発見し、さらに慢性肝疾患への進行をタイムリーに抑制することは現在の主要なタスクの一つである。したがって、肝線維症の発病メカニズムを研究し、新たな治療標的を探し、肝線維症を効果的に治療でき、安全で信頼性が高く、安価である医薬品を開発することは、非常に重要な社会的及び医学的意義を有する。

【発明の概要】

【0004】

本発明の目的は、肝線維症を治療及び／又は予防する医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用を提供することにより、上記の従来技術に存在する問題を解決することである。

【0005】

上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術的手段を提供する。
本発明は、肝線維症の治療及び／又は予防のための医薬品の製造におけるチャネル遮断薬の使用を提供する。

【0006】

好ましくは、前記チャネル遮断薬はナトリウムチャネル遮断薬である。

【0007】

好ましくは、前記ナトリウムチャネル遮断薬はフェニトインナトリウムを含む。

【0008】

好ましくは、前記肝線維症は四塩化炭素誘発性肝線維症を含む。

【0009】

好ましくは、前記医薬品は薬学的に許容可能な補助材料をさらに含む。

【0010】

好ましくは、前記医薬品の剤形は医学的に認められる任意の剤形である。

【0011】

好ましくは、前記医薬品の剤形は、粉剤、注射液、カプセル、錠剤、経口液剤を含む。

【0012】

本発明は、肝臓組織のオートファージーを抑制するための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用をさらに提供する。

【0013】

本発明は、肝星細胞増殖を抑制ためのする医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用をさらに提供する。

【0014】

本発明は、肝細胞α－ＳＭＡをダウンレギュレートするための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用をさらに提供する。

【0015】

本発明は、肝細胞ＬＣ３をダウンレギュレートするための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用をさらに提供する。

【0016】

本発明は、肝細胞Ｐ６２をアップレギュレートするための医薬品の製造におけるフェニトインナトリウムの使用を提供する。

【0017】

本発明は、以下の技術的効果を開示する。
本発明は、細胞レベルでフェニトインナトリウムがオートファージーを制御することにより肝星細胞の活性化に影響を与えて肝線維症を改善することができることを証明した。また、本発明は、さらに疾患モデルを確立することにより、動物レベルでフェニトインナトリウムの肝線維症に対する治療効果を検証した結果、肝線維症の治療及び／又は予防のための医薬品の製造に使用できることを証明した。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】マウス肝線維症モデル及びフェニトインナトリウム治療後のマウス肝機能への影響を示す図である（Ａ：各群のマウス肝臓の一般的な形態；Ｂ：各実験群のマウスのＡＬＴ統計図；Ｃ：各実験群のマウスのＡＳＴの統計図）。

【図2】ＨＥ、Ｍａｓｓｏｎ、ピクロシリウスレッドで染色して各群のマウスの肝線維症を観察する場合である（Ａ：ＨＥ染色、Ｂ：Ｍａｓｓｏｎ染色、Ｃ：テンシドク染色）。

【図3】免疫組織化学技術により検出された各実験群におけるα－ＳＭＡの発現状況（Ａ）及び統計図（Ｂ）である。

【図4】Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより検出された各群の実験マウスの肝臓組織における肝線維症指標及び自己関連指標の発現、並びに統計図である（Ａ、Ｄ：各群の実験マウス肝臓組織におけるα－ＳＭＡの発現状況及び統計図；Ｂ、Ｅ：各群の実験マウス肝臓組織におけるＬＣ３の発現状況及び統計図；Ｃ、Ｆ：各群の実験マウス肝臓組織におけるＰ６２の発現状況及び統計図）。

【図5】図５はＣＣＫ８法による肝星細胞ＨＳＣ増殖に対するフェニトインナトリウムの影響の検出を示す。

【図6】ＣＣＫ８法によるＨＳＣｓ増殖に対するＴＧＦ－β１の影響及びＴＧＦ－β１誘発ＨＳＣｓ増殖に対するフェニトインナトリウムの影響の検出を示す。

【図7】Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより検出された異なる実験群細胞におけるα－ＳＭＡ、ＬＣ３、Ｐ６２の発現及び統計図である（Ａ、Ｄ：各実験群のＨＳＣ細胞におけるα－ＳＭＡの発現状況及び統計図；Ｂ、Ｅ：各実験群のＨＳＣｓにおけるＬＣ３の発現状況及び統計図；Ｃ、Ｆ：各実験群のＨＳＣｓにおけるＰ６２の発現状況及び統計図）。

【図8】Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ実験技術により検出されたラパマイシン添加後のＨＳＣｓにおけるα－ＳＭＡ及びオートファージー関連タンパク質ＬＣ３、Ｐ６２の発現及び統計図である（ここで、Ａ、Ｄ：ＨＳＣｓにおけるα－ＳＭＡの発現状況及び統計図；Ｂ、Ｅ：ＨＳＣｓにおけるＬＣ３の発現状況及び統計図；Ｃ、Ｆ：ＨＳＣｓにおけるＰ６２の発現状況及び統計図）。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の様々な例示的な実施形態を詳細に説明するが、以下の詳細な説明は本発明を限定するものではなく、本発明のいくつかの態様、特性及び実施形態をより詳細に説明するものと理解すべきである。

【0020】

実施例１：フェニトインナトリウムの動物実験
１．肝線維化マウスモデルの確立及び治療
１．１実験ステップ及び方法
（１）実験群分け：モデル群、治療群、正常群及び医薬品群（各群１５匹の健康な雄Ｃ５７マウス（重慶騰シン生物技術有限会社から購入）、合計６０匹のマウス）

【0021】

（２）肝線維化マウスモデルの確立：正常に飼育された雄Ｃ５７マウスの体重が２０ｇに達した時点でモデル確立を開始した。モデル群、治療群のマウスに２０％ＣＣｌ_４オリーブ油溶液（５ｍＬ／ｋｇ）を週２回、合計８週間胃内投与した。全てのマウスはいずれも正常に飼育した。

【0022】

（３）フェニトインナトリウムによる予防・治療：モデル確立の２週目後に、治療群及び医薬品群にフェニトインナトリウム（１ｍＭ；１０ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内注射し、毎日１回腹腔内注射し、モデル群のモデル確立に成功した後は注射を停止した。正常群及びモデル群のマウスに、同じ体積の生理食塩水を腹腔内注射した。

【0023】

（４）サンプル採取：モデリングに成功した後に各群のマウスを解剖し、眼球血を採取して血清学的指標を測定した。肝臓を採取して肝臓の外観を肉眼で観察し、撮影して記録し、肝臓組織から２つのサンプルを採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、最終的にはパラフィン切片を作成し、ＨＥ、ピクリン酸ピクロシリウスレッド、Ｍａｓｓｏｎ染色及び免疫組織化学に用い、残りの組織を－８０℃で凍結保存して使用に備えた。

【0024】

（５）肝臓切片のＨＥ染色：マウスの肝臓組織をホルマリンで固定し、それをパラフィン内に包埋し、粘着スライドガラスを使用してパラフィン切片を作成し、７０℃の恒温器内に入れ、１－２時間ベーキングした後、通常の脱パラフィン処理し（キシレン溶液Ｉに１０分間、キシレン溶液ＩＩに１０分間、無水エタノールに５分間、９５％エタノールに５分間、８０％エタノールに５分間、７５％エタノールに５分間、５０％エタノールに５分間浸漬し、最後にＰＢＳバッファーで３回洗浄し（各回１０分間））、その後、染色し（ヘマトキシリンで５分間染色した後、塩酸エタノールで１０秒間分化し、次に、青色に回復するまで水道水で１０分間洗浄し、次に、０．５％エオシン液で３分間染色し、さらに流水で５分間洗浄し）、最後に、サンプルを脱水し（５０％エタノールで１分間、７５％エタノールで１分間、８０％エタノールで１分間、９５％エタノールで１分間、無水エタノールで１分間）、中性ゴムでスライドを密封し、最後に顕微鏡で観察し、撮影して保存した。

【0025】

（６）肝臓切片のＭａｓｓｏｎトリクローム染色：肝臓のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、調製されたＷｅｉｇｅｒｔ鉄ヘマトキシリン染料を組織に滴下して５－１０分間染色し、次に、酸性エタノール分化液で５－１５秒分化し、水洗し、さらにＭａｓｓｏｎブルーイング液で３－５分間ブルーイングし、蒸留水で１分間洗浄し、ポンソーレッドマゼンタ染色液で５－１０分間染色し、次に、蒸留水と弱酸溶液を２：１の比率で用いて弱酸作動液を調製し、弱酸作動液で１分間洗浄した。リンモリブデン酸溶液で１－２分間洗浄し、弱酸作動液で１分間洗浄し、アニリンブルー染色液で１－２分間染色し、弱酸作動液で１分間洗浄し、９５％エタノールで迅速に脱水し、無水エタノールで３回（毎回５－１０秒）脱水し、キシレンで３回（毎回１－２分間）透明にし、中性ゴムで封入し、顕微鏡で撮影して記録した。

【0026】

（７）肝臓切片のピクリン酸ピクロシリウスレッド染色：清潔な環境において、肝臓のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、次に、ヘマトキシリン溶液に入れて２分間浸漬し、さらに水道水で１０分間洗浄し、最後に１％の塩酸エタノールで５秒間分化し、さらに水道水で１０分間洗浄し、最後にピクリン酸ピクロシリウスレッド染色液に２０分間浸漬し、さらに水道水で５分間洗浄した。最後に脱水し、封入し、顕微鏡で撮影して記録した。

【0027】

（８）免疫組織化学：肝臓のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、パラフィン切片を３％Ｈ_２Ｏ_２溶液に浸漬し、５－１０分間インキュベートを継続し、次に、蒸留水で洗浄し、さらにＰＢＳで５分間洗浄し、２回繰り返し、クエン酸ナトリウムで抗原を修復し、ＰＢＳで５分間洗浄した。α－ＳＭＡ抗体を滴下し、４℃で一晩撹拌した。３０ｍｉｎ再加熱した後、ＰＢＳで洗浄し、３回（毎回５分間）繰り返し、酵素標識モノクローナル抗体マウスウサギＩｇＧを滴下し、３７℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。発色剤で１分間発色させ（ＤＡＢ）、次に、水で徹底的に洗浄し、再び染色し、脱水し、透明にし、最後に封入し、顕微鏡で写真を取って分析した。

【0028】

（９）タンパク質免疫ブロット実験（Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ）：
１）タンパク質原液の抽出
細胞タンパク質の抽出：インキュベータから、タンパク質を抽出する必要がある細胞を取り出し、調製されたＰＢＳ溶液で２回洗浄し、清潔な濾紙に置き、残ったＰＢＳを乾燥し、次に、細胞の成長状況に応じて特定量のＲＩＰＡタンパク質溶解液を添加し、約３０分間静置してタンパク質を分解させた。次に、分解したタンパク質原液をセルスクレーパーで掻き取って、準備したＥＰチューブに入れ、次に、高速遠心機に入れ、４℃の条件で１２０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離終了後、上清を取って次のタンパク質の定量を行った。

【0029】

２）タンパク質の定量
ＥＰチューブを取り、そこに標準タンパク質ＢＳＡ ２５μＬ及びＰＢＳ ７５μＬを添加し、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ標準タンパク質溶液を調製した。次に、９６ウェルプレートを取り、ウェルにそれぞれ特定量のＰＢＳ及びＢＳＡを添加し、標準曲線を作成し、次に、タンパク質原液を希釈し、ＥＰチューブにＰＢＳ溶液８７μＬを添加し、次に、遠心分離したタンパク質原液（３０倍希釈）を３μＬ添加した。次に、Ａ液とＢ液を用いて５０：１の濃度配合比でＢＣＡ作動液を調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μＬを加え、恒温器中で３０分間静置し、温度を３７℃に設定した。最後にマイクロプレートリーダーでタンパク質原液の濃度を検出し、濃度配合比を計算した後、ＲＩＰＡプロテアーゼ溶解液をタンパク質原液に添加し、タンパク質原液が同じ濃度になるように調整した後、各ＥＰチューブに等量の５×ローディングバッファーを添加し、沸騰水中で５分間煮沸して、冷却した後、－２０℃の冷蔵庫に入れた。

【0030】

３）Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ実験手順
ａ．電気泳動ゲルの調製
ｂ．ローディングとゲルランニング：調製した電気泳動ゲルを電気泳動タンク内に入れ、電気泳動液を添加し、ローディング櫛を引き抜き、冷蔵庫内からタンパク質Ｍａｒｋｅｒを取り出し、４μＬ取って孔内に加え、残りの孔に目的タンパク質を添加し、カバーをかけ、電圧を８０Ｖに調整してゲルランニングを開始し、タンパク質Ｍａｒｋｅｒバンドが複数のバンドに分けられたときに、電圧を１２０Ｖに調整し、所望の目的タンパク質の位置が現れたときに、電気泳動を終了させた。
ｃ．転写：ＰＶＤＦ膜を取り出し、必要な大きさに切り出した後、メタノール溶液中で５－１０分間浸漬し、電気泳動タンク内のゲルを取り出し、目的タンパク質の分子量に応じてＭａｒｋｅｒバンドに合わせて必要なゲルを切り取り、マーキングしたＰＶＤＦ膜を対応するゲルに覆い、順に濾紙及びスポンジを置き、次に、電気転写タンク内に入れ、電気転写液を添加し、電圧を９０Ｖに調整し、目的タンパク質の分子量に応じて電気転写時間を設定した。
ｄ．ブロッキング：電気転写終了後、ＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＢＳＴで５ｍｉｎ洗浄し、次に、ＴＢＳＴを捨て、調製した５％タンパク質ブロッキング液を添加し、揺動シェーカーで１．５時間揺動した。
ｅ．一次抗体のインキュベーション：ブロッキングされたＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで３回洗浄し（毎回１０分間）、次に、ＰＶＤＦ膜を調製した一次抗体に移転して一晩静置した。
ｆ．二次抗体のインキュベーション：一次抗体からＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＢＳＴで３回洗浄し（毎回１０分間）、次に、二次抗体に入れて２時間揺動し、ＰＶＤＦ膜を取り出し、さらにＴＢＳＴで３回洗浄した（毎回１０分間）。
ｇ．発色：現像剤をＰＶＤＦ膜に滴下して露光させた。
ｈ．結果分析：露光結果についてソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊを用いてバンドのグレー値分析統計を行った。

【0031】

１．２．実験結果
（１）モデリング過程において、モデル群のマウスの精神状態が徐々に悪くなり、活動が低下し、摂食量及び飲水が減少し、ＣＣｌ_４の存在により肝臓の損傷をもたらし、それによりマウスの健康な成長に影響を与えることを示している。治療群はモデル群と比較して、毛皮が滑らかではないが、活動が明らかに上昇した一方、正常群及び医薬品群のマウスは、毛皮が滑らかで、活動が活発で、摂食量及び飲水量も正常であった。

【0032】

（２）モデリングに成功した後、マウスを解剖し、肉眼で肝臓の外観を観察し、撮影し記録した。図１Ａに示すように、各群のマウス肝臓の外観の違いと変化が、明らかに認められた。正常群と医薬品群は、マウス肝臓に明らかな違いがなく、肝臓の質が柔らかく、表面が滑らかであった。モデル群のマウスは、肝臓の質が硬く、光沢度が低く、表面が粗く、肝臓全体が黄変していた。治療群のマウスは、肝臓の質がモデル群よりも柔らかいが、正常群よりも硬く、光沢度が低かった。

【0033】

（３）肝機能の検出（ＡＬＴ、ＡＳＴ）：各群のマウスに対して、眼球血を採取し、遠心分離して血清を採取し、病院検査科に送ってデバイスを用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を測定した。図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、モデル群のアミノトランスフェラーゼは、正常群よりも高く、肝線維化モデルの確立に成功したことを示している。治療群のアミノトランスフェラーゼは、モデル群よりも低下し、その差は統計学的に有意であり（ｐ＜０．０５）、フェニトインナトリウムが肝線維症を改善できることを示している。医薬品群と正常群は、アミノトランスフェラーゼに明らかな違いがなく、この医薬品が肝臓に対して損傷しないことを示唆している。

【0034】

（４）肝臓切片のＨＥ、Ｍａｓｓｏｎトリクローム、ピクリン酸ピクロシリウスレッド染色：正常群及び医薬品群は、マウス肝臓組織の肝小葉が完全であり、構造も正常であった。モデル群は、マウス肝臓組織の門脈域の周囲に大量のコラーゲン沈着が見られ、門脈域と中央静脈との間に線維間隔の形成が観察され、肝小葉の構造が乱れていたのに対し、治療群は、肝線維化の程度がモデル群と比較して軽減し（図２）、フェニトインナトリウムがマウス肝臓でのコラーゲン含有量を低減し、肝線維化の程度を軽減できることを示している。

【0035】

（５）肝臓切片を用いる免疫組織化学による異なる実験群組織におけるα－ＳＭＡ発現の検出：図３に示すように、正常群及び医薬品群は、肝門静脈及び少量の中央静脈の辺縁にのみ少量の陽性発現が存在し、モデル群は、門脈域及び小葉内炎症壊死領域の周囲及び肝類洞壁内に大量の陽性発現が見られ、治療群は、モデル群と比較して陽性発現量が低下し、その結果は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

【0036】

（６）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる異なる実験群組織におけるα－ＳＭＡ、ＬＣ３、Ｐ６２の発現の検出：正常群と比較して、モデル群は肝臓組織における肝線維症指標α－ＳＭＡ及びオートファージー関連指標ＬＣ３の発現が上昇し、Ｐ６２の発現が低下し、治療群は、モデル群と比較して肝線維症指標α－ＳＭＡ及びオートファージー関連指標ＬＣ３の発現が低下し、Ｐ６２の発現が上昇し、その差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図４）。以上の結果は、フェニトインナトリウムが肝線維症病変を改善でき、オートファージー経路に関連する可能性があることを示している。

【0037】

実施例２：フェニトインナトリウムの細胞実験
１．肝線維症に対するフェニトインナトリウムの影響の細胞レベルでの検証
１．１．実験方法
（１）細胞培養
１）細胞蘇生
クリーンベンチ用紫外線ランプで３０分間照射した後、白色灯及び循環気流をオンにし、遠心管を取り、そこに３ｍＬの培地を添加し、直ちに－８０℃の冷蔵庫から凍結保存された細胞を取り出して３７℃の恒温水槽に入れて解凍し、次に、クリーンベンチ内で細胞を吸引して準備した遠心管に入れ、密封して遠心分離機に入れて５分間遠心分離し（回転速度：１０００ｒｐｍ）、次に、培養フラスコを準備し、細胞名及び日付をマーキングし、遠心分離終了後に上清を捨て、新しい培地を添加して均一に混合し、最後に均一に混合した細胞をマーキングした培養フラスコに入れ、７５％アルコールでフラスコをスプレーした後に恒温インキュベータに入れて培養した。

【0038】

２）細胞継代：ＤＭＥＭ完全培地、トリプシン及び滅菌ＰＢＳをクリーンベンチに入れ、３０分間再加熱し、白色灯及び循環気流をオンにし、アルコールランプを点火し、インキュベータから継代する必要がある細胞を取り出し、培地を捨て、滅菌ＰＢＳを添加して２回洗浄し、次に、ＰＢＳを捨て、フラスコに１ｍＬのトリプシンを添加し、顕微鏡下に置いて観察し、細胞間の間隔が大きくなり、細胞が丸くなったとき、直ちにトリプシンを捨て、３－５ｍＬの培地をフラスコに入れて消化を停止させ、次に、ピペットを用いて細胞をピペッティングし、新しい培養フラスコに均一に分注し、フラスコに細胞名、継代回数及び継代時間をマーキングした。最後に７５％のアルコールでフラスコをスプレーした後に恒温インキュベータに入れて引き続き培養した。

【0039】

３）細胞凍結保存：必要な試薬を再加熱し、インキュベータから凍結保存する必要がある細胞を取り出し、滅菌ＰＢＳを添加して２回洗浄し、次に、ＰＢＳを除去し、トリプシンを加えて細胞を消化し、あるレベルに達したら、３－５ｍＬの培地をフラスコに入れて消化を停止させ、次に、ピペットを用いて細胞をピペッティングし、新しい遠心管に移し、遠心分離を行い、遠心分離終了後、上清を捨て、遠心管に０．５－１ｍＬの凍結保存液を添加して均一に混合し、最後に均一に混合した液をマーキングした凍結保存管内に添加し、密封して－８０℃の冷蔵庫内に入れて凍結保存した。

【0040】

（２）ＣＣＫ－８実験
状態が良好な細胞を消化し、次に、細胞計数を行い、濃度配合比を計数した後、対応する体積の細胞懸濁液及び培地を取って実験に必要な細胞濃度に調整し、十分に均一に混合した後に９６ウェルプレートに添加し、実験要件に応じて細胞にさまざまな介入を行い、４８時間後に各ウェルに１０％ＣＣＫ８溶液（培地とＣＣＫ８との比は１０：１）を添加し、インキュベータに入れて引き続き１－４時間培養した後、マイクロプレートリーダーで吸光度を検出し、最後に結果を分析統計した。

【0041】

（３）Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ実験：実施例１の動物実験と同じである。
１．２．実験結果
（１）ＣＣＫ８法による肝星細胞ＨＳＣ増殖に対するフェニトインナトリウムの影響の検出及びＩＣ５０値の計算：ＣＣＫ８法により肝星細胞ＨＳＣ増殖に対するフェニトインナトリウムの影響を検出し、ＨＣＳ細胞に対する異なる濃度のフェニトインナトリウムの増殖抑制率を計算した結果、肝星細胞に対するフェニトインナトリウムのＩＣ５０値は２３４μＭであった（図５）。

【0042】

（２）ＣＣＫ－８法によるＴＧＦ－β１誘発ＨＳＣｓの増殖に対するフェニトインナトリウムの影響の検出：ＩＣ５０値に基づいて医薬品の濃度を確定し、ＰＨＴの濃度を２００μＭにして細胞レベルの相関実験を行った。ＣＣＫ８法によりＨＳＣｓ増殖に対するＴＧＦ－β１の影響を検出したところ、結果として、正常群と比較して、ＴＧＦ－β１刺激後にＨＳＣｓの増殖が促進され、フェニトインナトリウムを添加した後、ＴＧＦ－β１により促進されたＨＳＣｓの増殖が抑制され、結果は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図６）。

【0043】

（３）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる異なる実験群細胞におけるα－ＳＭＡ、ＬＣ３、Ｐ６２の発現の検出：図７に示すように、ＴＧＦ－β１とフェニトインナトリウムの共刺激群は、ＴＧＦ－β１単独刺激群と比較して、共刺激群のα－ＳＭＡ発現が明らかに低下し、その差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。また、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ実験の結果から分かるように、ＴＧＦ－β１単独刺激群と比較して、フェニトインナトリウムとＴＧＦ－β１の共刺激下で、オートファージー関連タンパク質ＬＣ３の発現量は顕著に低下し、オートファージー基質タンパク質Ｐ６２の発現量は顕著に上昇し、その差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。これらの結果から分かるように、ＴＧＦ－β１は、ＨＳＣの活性化過程におけるオートファージーの発生を促進できるのに対し、フェニトインバツとＴＧＦ－β１の共培養は、ＨＳＣ活性化過程におけるオートファージーの発生を抑制し、ＨＳＣの活性化を抑制することにより、肝線維症の発生の進行に影響を与える可能性がある。

【0044】

（４）フェニトインナトリウムによるＨＳＣｓの活性化の逆転がオートファージー発生の抑制によることがＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより実証された：図８に示すように、フェニトインナトリウムとＴＧＦ－β１でＨＳＣｓを共培養した後のα－ＳＭＡ及びオートファージー関連タンパク質ＬＣ３の発現が低下し、Ｐ６２の発現が上昇し、オートファージーアゴニストであるラパマイシンを添加した後、フェニトインナトリウム及びＴＧＦ－β１群と比較して、ラパマイシン、フェニトインナトリウム及びＴＧＦ－β１を加えた群は、α－ＳＭＡ及びオートファージー関連タンパク質ＬＣ３の発現が上昇し、オートファージー基質タンパク質Ｐ６２の発現が低下し、差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。オートファージーアゴニストを添加した後に、結果が回復されたことを示しており、フェニトインナトリウムが確かにオートファージー経路を調整することにより肝星細胞の活性化に影響を与え、さらに肝線維化を改善する作用を発揮することを示している。

【0045】

上述の実施例は、本発明の好ましい形態を説明するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の設計思想から逸脱しない前提で、当業者が本発明の技術的手段に対してなされる各種の変形及び改善は、いずれも本発明の特許請求の範囲によって確定される保護範囲内に含まれるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】