特開 2024-168106 ジアホラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024168106

(43)【公開日】2024-12-05

(54)【発明の名称】ジアホラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/02 20060101AFI20241128BHJP

【ＦＩ】

C12N9/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023084531

(22)【出願日】2023-05-23

(71)【出願人】

【識別番号】303046299

【氏名又は名称】旭化成ファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】芳陵 一生

(72)【発明者】

【氏名】大西 良介

(72)【発明者】

【氏名】高橋 俊文

(57)【要約】

【課題】充分なジアホラーゼ活性を有し、臨床診断・産業利用における使用に、より適したジアホラーゼを提供する。
【解決手段】ＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）によって生産されたジアホラーゼ。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）によって生産されたジアホラーゼ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規なジアホラーゼ（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）に関する。

【背景技術】

【0002】

ジアホラーゼ（ＥＣ．１．６．５．２）は、様々な技術分野において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの利用が検討され、一部が実用化されている。

【0003】

例えば、臨床診断の技術分野では、ジアホラーゼが還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を基質とするという特性を利用して、種々の体外診断用試薬に使用されている。

【0004】

体外診断用試薬としては、例えば、酵素サイクリング法を用いたアンモニア測定用試薬がある。検体中のアンモニアとデアミド－ＮＡＤ^＋からアデノシン５’－三リン酸の存在下でＮＡＤ^＋合成酵素を触媒としてＮＡＤ^＋が生じ、さらにグルコース及びグルコース脱水素酵素によりＮＡＤＨが生成する。この時、テトラゾリウム塩及びジアホラーゼの存在により、ＮＡＤＨは酸化され、再びＮＡＤ^＋となり、そこから、グルコース及びグルコース脱水素酵素によりさらにＮＡＤＨが生成する、いわゆるサイクリング反応が行なわれる。この例では、反応生成物であるホルマザンの吸光度を測定することによりアンモニアを定量測定できる（特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４１２７７６７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、充分なジアホラーゼ活性を有し、臨床診断・産業利用における使用に、より適したジアホラーゼを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、ＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）によって生産されたジアホラーゼを用いることで課題を解決することを見出し、本発明を完成した。

【0008】

本発明は、上記目的を達成するために、下記のジアホラーゼを提供する。
［１］ＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）によって生産されたジアホラーゼ。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、充分なジアホラーゼ活性を有し、臨床診断・産業利用における使用に、より適したジアホラーゼを提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

【0011】

本実施形態に係るジアホラーゼは、ＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）によって生産された酵素である。

【0012】

本菌株を公知のものと区別するため、ＤＩ－１株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）として寄託した。

【0013】

本実施形態に係るジアホラーゼを製造するに当たっては、微生物を栄養培地で培養し、菌体中又は培養液中にジアホラーゼを産生させる。培養終了後、生産物が菌体中にある場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊して菌体抽出液を得る。また、生産物が菌体外に放出され、培養液中にある場合には、遠心分離又は濾過により培養液中の菌体及び不溶成分を除去すればよい。また、必要に応じてＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ及び／又は適当な界面活性剤などを添加してジアホラーゼの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよいジアホラーゼを得ることができる。生成したジアホラーゼの配列を決定する場合には、エドマン分解法や質量分析法などの既知の方法を採用することができる。

【0014】

微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。

【0015】

炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、グリセロール、糖蜜などが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆タンパク、カゼイン加水分解物などが使用される。

【0016】

培養時の各成分の量（濃度）は非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）２３、４５６－４７５）等に倣ってジアホラーゼを生産する範囲で適宜選択し得る。

【0017】

その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

【0018】

培養温度は微生物が発育し、ジアホラーゼを生産する範囲で適宜変更し得る。

【0019】

培養物中のジアホラーゼは、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、ジアホラーゼが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりジアホラーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。菌体及び不溶成分の除去は、濾過が困難な場合はパーライトなど濾過助剤の使用検討、遠心分離が困難な場合はイオン交換基をもつ可溶性ポリマーなどの凝集剤の使用検討を行い、適当な経済的な工程を加えることは常法である。ジアホラーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチーム、ザイモリアーゼなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤及び／又は界面活性剤を添加してジアホラーゼを可溶化し水溶液として分離採取する。

【0020】

この様にして得られたジアホラーゼ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱させればよい。

【0021】

次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析して、より低分子量の不純物を除去することができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し、これらの手段を用いて得られるジアホラーゼ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製されたジアホラーゼが得られる。

【0022】

本実施形態に係るジアホラーゼが充分なジアホラーゼ活性を有し、実用的であることが確認された。したがって、本実施形態に係るジアホラーゼは、産業上、特に体外診断用酵素として有用である。

【0023】

次に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【実施例0024】

＜ジアホラーゼ（ＤＩ）活性測定方法＞
〔反応試薬混合液〕
０．２Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０） ０．５ｍｌ
０．２５％（Ｗ／Ｖ） ＮＴＢ溶液 ０．１ｍｌ
１％（Ｗ／Ｖ） ＢＳＡ溶液 ０．１ｍｌ
１０ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 ０．１ｍｌ
精製水 ０．２ｍｌ
〔酵素溶解希釈用液〕
０．１％（Ｗ／Ｖ） ＢＳＡを含む０．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
〔反応停止液〕
０．１Ｎ ＨＣｌ溶液

【0025】

小試験管に上記反応試薬混合液１．０ｍｌを分注し、３７℃で５分間予備加温した後、上記酵素溶解希釈用液でＢ倍に希釈した酵素試料液０．１ｍｌを加えて混和して、３７℃で酵素反応を開始する。１０分経過後、上記反応停止液２．０ｍｌを加えて混和し、反応を停止させ、５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。盲検として酵素試料液の代わりに上記酵素溶解希釈用液を用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素試料液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ－Ａｂ）をΔＡとし、以下の式より酵素活性を算出する。酵素の希釈倍率Ｂは、ΔＡ≦０．３７０となるように設定する。酵素活性１単位（１ユニット）は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ^＋に変換する酵素量とした。

【0026】

酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ΔＡ／１０）／１２．４｝×（３．１０／０．１０）×Ｂ
１０：反応時間（分）
１２．４：ＮＴＢＨ_２の５５０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／μｍｏｌ）
３．１０：反応総液量（ｍｌ）
０．１０：反応に供した酵素試料液量（ｍｌ）

【0027】

＜ジアホラーゼ（ＤＩ）の生産及び活性測定＞
ＤＩ－１株（ＮＩＴＥ Ｐ－０３８１６）をＬＢ培地中で前培養し、前培養液をグリセロール、酵母エキス、ペプトン等を含有する培地中に懸濁し、２Ｌ培養装置を用いて３４℃で２４時間培養した。培養後の培養液を遠心分離して、菌体を採取した。次いでこの菌体を機械的方法で破壊しジアホラーゼを可溶化後、遠心分離した上清の活性を前記ＤＩ活性測定方法により測定し、酵素活性を算出したところ、ＤＩ活性が９５．０Ｕ／ｍＬであった。