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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024169482
(43)【公開日】2024-12-05
(54)【発明の名称】ケイ素ナノ粒子を含む送達システム
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20241128BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241128BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241128BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241128BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20241128BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241128BHJP
A61K 33/00 20060101ALI20241128BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20241128BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20241128BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20241128BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P27/02
A61K47/02
A61K47/18
A61K47/24
A61K31/7105
A61K33/00
A61K9/14
A61K9/10
A61K9/51
A61K31/713
A61P43/00 105
【審査請求】有
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024158947
(22)【出願日】2024-09-13
(62)【分割の表示】P 2021557827の分割
【原出願日】2020-03-30
(31)【優先権主張番号】1904337.1
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(71)【出願人】
【識別番号】512021597
【氏名又は名称】エスアイエスエイエフ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＳＡＦ ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】サフィー－シーベルト，ローハイ スザンナ
(72)【発明者】
【氏名】バラン－ラシュワルツカ，ポーリーナ マルゴジャタ
(72)【発明者】
【氏名】ステラ，フラヴィア マリア
(72)【発明者】
【氏名】トラビ－ポーア，ナスルーラ
(57)【要約】
【課題】角膜を含むがこれに限定されない身体部位にｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを送達する、有効で安全かつ非侵襲性の手段を提供する。
【解決手段】ケイ素ナノ粒子、少なくとも１つのアミノ酸、及び少なくとも１つの脂質を含み、該ケイ素ナノ粒子が少なくとも５０重量％のケイ素を含む、短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡなどの核酸を制御して放出するための組成物を開示する。関連する組成及び方法も開示する。
【選択図】図１
【解決手段】ケイ素ナノ粒子、少なくとも１つのアミノ酸、及び少なくとも１つの脂質を含み、該ケイ素ナノ粒子が少なくとも５０重量％のケイ素を含む、短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡなどの核酸を制御して放出するための組成物を開示する。関連する組成及び方法も開示する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡである核酸を制御して放出するための組成物であって、
少なくとも１つの脂質で表面処理され、少なくとも１つのアミノ酸でさらに処理されたケイ素ナノ粒子を含み、
前記ケイ素ナノ粒子は、少なくとも５０重量％のケイ素を含み、前記短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡがロードされており、
ケイ素の核酸に対する比が２：１～８：１である、組成物。
少なくとも１つの脂質で表面処理され、少なくとも１つのアミノ酸でさらに処理されたケイ素ナノ粒子を含み、
前記ケイ素ナノ粒子は、少なくとも５０重量％のケイ素を含み、前記短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡがロードされており、
ケイ素の核酸に対する比が２：１～８：１である、組成物。
【請求項2】
前記核酸は短鎖干渉ＲＮＡである、
請求項１に記載の組成物。
請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ケイ素の核酸に対する比は２：１～３：１である、
請求項１に記載の組成物。
請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
遺伝子導入試薬をさらに含む、及び／又は、少なくとも１つの二糖をさらに含む、
請求項１に記載の組成物。
請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記遺伝子導入試薬はリポフェクタミンである、
請求項４に記載の組成物。
請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
脂質のケイ素に対する比は１：１～１５：１である、及び／又は、アミノ酸のケイ素に対する比は０．０５：１～２：１である、
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ケイ素ナノ粒子は２０～２００ｎｍの平均直径を有する、
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記少なくとも１つの脂質は、ホスファチジルコリン、水素化ホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ミリストイル（ｍｉｒｙｓｔｏｉｌ）ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、コレステリルＮ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメート、ステアリルアミン、又はそれらの組合せから選択される、
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記少なくとも１つの脂質は、ホスファチジルコリン、水素化ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、コレステリルＮ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメート、ステアリルアミン、又はそれらの組合せから選択される、
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記少なくとも１つのアミノ酸は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、又はそれらの組合せから選択される、
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡである核酸を制御して放出するための薬物の製造における組成物の使用であって、
前記組成物は、少なくとも１つの脂質で表面処理され、少なくとも１つのアミノ酸でさらに処理されたケイ素ナノ粒子を含み、
前記ケイ素ナノ粒子は、少なくとも５０重量％のケイ素を含むと共に、前記短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡがロードされており、
ケイ素の核酸に対する比が２：１～８：１である、使用。
前記組成物は、少なくとも１つの脂質で表面処理され、少なくとも１つのアミノ酸でさらに処理されたケイ素ナノ粒子を含み、
前記ケイ素ナノ粒子は、少なくとも５０重量％のケイ素を含むと共に、前記短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡがロードされており、
ケイ素の核酸に対する比が２：１～８：１である、使用。
【請求項12】
眼の障害の処置に使用するための薬物の製造における、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項13】
眼部に送達するための薬物の製造における、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項14】
眼組織の処置のための薬物の製造における、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項15】
前記眼組織が、角膜、強膜、虹彩、毛様体、脈絡膜、小帯線維、水晶体嚢、水晶体核、硝子体、及び網膜から選択される、
請求項１４に記載の使用。
請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
眼球の障害の処置のための薬物の製造における、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項17】
前記眼球の障害は、黄斑変性、結膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、円錐角膜、白内障、網膜炎、又はぶどう膜炎から選択される、
請求項１６に記載の使用。
請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前記眼球の障害は黄斑変性である、
請求項１７に記載の使用。
請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
前記脂質および前記アミノ酸は、
（ａ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびグリシンであるか、または、
（ｂ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ジオレオイルＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメートコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびグリシンである、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびグリシンであるか、または、
（ｂ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ジオレオイルＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメートコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびグリシンである、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記脂質および前記アミノ酸は、
（ａ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびグリシンであるか、または、
（ｂ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ジオレオイルＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメートコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびグリシンである、
請求項１１～１８のいずれか１項に記載の使用。
（ａ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびグリシンであるか、または、
（ｂ）ステアリルアミン（ＳＡ）、ジオレオイルＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメートコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびグリシンである、
請求項１１～１８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物活性剤の送達のための送達システムに関する。より具体的に、しかし排他的ではなく、この発明は、短鎖干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、又は他の核酸の送達のためのケイ素ナノ粒子の使用に関する。また、本発明は関連する組成物にも関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療は、その特異性のため、遺伝子疾患の治療の取り組みとして少なからぬ興味を引いている。短鎖干渉ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとしても知られる）は、実質的にいずれの遺伝子も標的にするように設計することができ、疾患の処置に大きな可能性を有する。ｓｉＲＮＡ技術が医学において大きな治療の可能性をもつことは明らかである。しかしながら、そのインビボ及びインビトロの用途における主な制限の１つは、ｓｉＲＮＡ分子が細胞膜を超えられず、細胞質に達することができないということである。ｓｉＲＮＡ骨格のリン酸基から生じる負の電荷が、負荷電細胞膜に静電的に反発するので、ｓｉＲＮＡが細胞膜を超えて拡散できない。また、細胞膜を超えてｓｉＲＮＡを送達することは、ネイキッドｓｉＲＮＡ分子を劣化させる、有効な細胞及び全身の防御機構による、そのインビトロの短い半減期によっても妨げられる。ｓｉＲＮＡの高分子量、標的組織における低特異性及び低取り込み、細胞毒性、及び望ましくないオフターゲット作用など、医学においてｓｉＲＮＡ治療法を適切に適用することに対する他の障害が存在する。
【0003】
また、ｍＲＮＡは治療剤としての有望性を示す。ｍＲＮＡには、ＤＮＡに対するいくつかの利点があり、これには、いずれの核移行の要求もなく、ゲノム組込みを損傷する可能性のリスクがはるかに低いことを含む。ｓｉＲＮＡが、遺伝子の高発現又は不適切な発現に起因する障害の処置に大きく可能性を示す一方、ｍＲＮＡは、遺伝子低発現に起因する障害の処置に使用される可能性がある。また、ｍＲＮＡには、抗腫瘍ワクチンを含むワクチンに使用される可能性がある。ｍＲＮＡに基づく治療法は、任意の治療用核酸のものと同様の課題、すなわち送達の安全性、特異性、及び効率の課題に直面している。
【0004】
また、ＲＮＡ治療法（ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ治療法を含む）は、眼の障害の処置に適用可能であるが、内因性の物理的バリア、効果的な薬剤クリアランス機構、及び他の眼球組織の複雑性により、眼球のＲＮＡ送達に大きな課題をもたらしている。眼球表面は、短い接触時間、涙液の存在、及び角膜細胞透過を合わせた作用のため、薬剤送達において、より複雑な生物学的バリアの１つである。眼の障害の局所処置における大きな課題の１つは、液体の喪失及び病原体侵入に対する有効なバリアを形成するように適応する角膜の構造である。
【0005】
すべての眼組織に注射によってアクセス可能であるが、ｓｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシング及びｍＲＮＡ媒介処置に必要とされる頻回の処置レジメンでは、局所適用が好ましいと考えられる。従来より、角膜への薬剤送達は、点眼剤が鼻涙管を介して速やかに排出されるため、問題になる。速やかな涙の排出は、瞬目反射と併せて、活性剤の角膜を通る吸収に利用できる角膜前滞留時間を短くする。点眼製剤に含有される活性化合物の９５％が、結膜を超えられない、又は鼻涙管を介した排出によって喪失するため、失われると推定されている。眼球の保護機構があるにもかかわらず、局所製剤はある程度の成功を収めているが、角膜のバリア特性のため、なお課題に直面している。
【0006】
ｓｉＲＮＡを眼球表面に直接滴下することは、インビトロにおける眼球表面及び前部障害の処置に用いられている。しかしながら、ｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを含む任意の化合物を眼球に局所投与することは、眼球の解剖学的な制約及び生理学的な保護機構によって、限定的となっている。臨床試験に進んでいる、いくつかの化学改変ｓｉＲＮＡ治療法を以下に列挙しているが、その大多数は硝子体内注射に関与する。
・ＳＹＬ１００１、Ｓｙｌｅｎｔｈｉｓ Ｓ．Ａ．、フェーズ１、２完了、フェーズ３進行中－点眼剤
・ＳＹＬ０４００１２ （ｂａｍｏｓｉｒａｎ）、Ｓｙｌｅｎｔｈｉｓ Ｓ．Ａ．、フェーズ１、２完了－点眼剤
・Ｓｉｒｎａ－０２７（ＡＧＮ２１１７４５）、Ａｌｌｅｒｇａｎ、フェーズ１、２完了－硝子体内注射
・Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ（Ｃａｎｄ５）、ＯＰＫＯ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ．、フェーズ２完了－硝子体内注射
・ＱＰＩ－１００７、Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、フェーズ１完了－硝子体内注射
・ＰＦ－０４５２３６５５、Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、フェーズ１完了－硝子体内注射
・ＳＹＬ１００１、Ｓｙｌｅｎｔｈｉｓ Ｓ．Ａ．、フェーズ１、２完了、フェーズ３進行中－点眼剤
・ＳＹＬ０４００１２ （ｂａｍｏｓｉｒａｎ）、Ｓｙｌｅｎｔｈｉｓ Ｓ．Ａ．、フェーズ１、２完了－点眼剤
・Ｓｉｒｎａ－０２７（ＡＧＮ２１１７４５）、Ａｌｌｅｒｇａｎ、フェーズ１、２完了－硝子体内注射
・Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ（Ｃａｎｄ５）、ＯＰＫＯ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ．、フェーズ２完了－硝子体内注射
・ＱＰＩ－１００７、Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、フェーズ１完了－硝子体内注射
・ＰＦ－０４５２３６５５、Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、フェーズ１完了－硝子体内注射
【0007】
眼疾患におけるＲＮＡに基づく治療は頻回の処置レジメンを必要とするので、複数回の注射を必要とすることにより、白内障、網膜剥離、硝子体出血及び眼内炎の可能性が高まる。
【0008】
ＲＮＡ送達の他の取り組みは、改変ウイルス粒子を含有する眼注射剤を含む。この粒子は、眼に核酸ペイロードを送達するように改変される。そうしたウイルスの種類は（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレンチウイルス）ＲＮＡｉ療法のベクターとして研究されている。自己相補的ＡＡＶ又はヘルパー依存型アデノウイルスなどの改変ウイルスベクターは、ウイルス性送達において現在の最新技術である。いくつかの眼科用途が現在開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、突然変異誘発の可能性、限定的なロード能力、適切な標的化、挿入予測性、作製の高コスト、及び有害免疫反応性を含む不利点がある。
【0009】
ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを発現するプラスミドベクターの送達は、いくらかの成功を含みながら試みられているが、そうしたＤＮＡに基づく発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれ、挿入変異誘発の確率を高める可能性がある。改変非ウイルス性ＲＮＡ送達システムの利点は、これらが比較的安全であり、標的リガンドで容易に修飾することができるということである。さらに、ＲＮＡをナノ担体に封入することは、長期にわたるＲＮＡの持続放出形態を提供することに有用であり、ゆえに処置レジメンを改善させ得る。
【0010】
天然及び合成のポリマー、ポリプレックス、リポソーム、リポプレックス、ペプチド、及びデンドリマーナノ物質を含む多数の非ウイルス性担体が、ＲＮＡ送達に対して提案されている。これらの方策の大部分が、インビボ及びインビトロにおいて異なる程度の成功を含みながら試みられているが、そのいずれも、眼及び他の組織の障害におけるＲＮＡ療法の臨床における用途に用いられていない。
【0011】
多くの種類のポリマーが、オリゴヌクレオチドを送達するために用いられているが、共有結合又は封入の必要なくＲＮＡを静電的に結合することができるということ、及びアミン官能基化カチオン性ポリマーがエンドソーム緩衝作用を与えて、細胞質基質内ＲＮＡ送達に逃れることができるということから、カチオン性ポリマーを使用することに多くの注目が集まっている。多数の物質が研究されているが、安全性の懸念なくＲＮＡ送達を向上するための生分解性ナノ単体の開発は課題となっている。
【0012】
利用可能なＲＮＡ送達の方策が多数あるにもかかわらず、インビボにおいて安全で効果的な送達がないことにより、病院でのＲＮＡ治療法の移行を限定的にしている。オリゴヌクレオチドを効果的に凝縮し、生理学的条件において安定し、眼球のバリア機構を問わず細胞の取り込みを促進し、ＲＮＡの細胞質への放出を促進することができる強力な担体システムが、ＲＮＡ送達に必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
このように、角膜を含むがこれに限定されない身体部位にｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを送達する、有効で安全かつ非侵襲性の手段が未だ求められている。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明の第１の態様において、ケイ素ナノ粒子、少なくとも１つのアミノ酸、及び少なくとも１つの脂質を含み、該ケイ素ナノ粒子が少なくとも５０重量％のケイ素を含む、短鎖干渉ＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸を制御して放出するための組成物を提供する。
【0015】
有利には、そうした組成物における脂質の存在は、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸のロードを高めることができる必要なゼータ電位をもたらして、標的部位における核酸放出速度を制御するように、ケイ素ナノ粒子の表面電荷に有益な作用を有する。また、製剤における少なくとも１つの脂質の存在により、ケイ素ナノ粒子が生体利用可能なオルトケイ酸（ＯＳＡ）分解生成物に加水分解するように、ケイ素の加水分解速度を制御することができる。特定の実施形態において、核酸はＲＮＡである。特定の実施形態において、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。特定の実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
【0016】
上述の組成物は少なくとも１つのアミノ酸をさらに含む。有利には、組成物におけるアミノ酸の存在は、経時で、ケイ素ナノ粒子によって輸送される核酸の放出速度に影響することが認められている。
【0017】
好ましくは、上述の組成物は遺伝子導入試薬をさらに含む。
【0018】
本発明の第２の態様において、薬物として使用するための、本発明の第１の態様における組成物を提供する。
【0019】
本発明の第３の態様において、眼部に送達するための、本発明の第１の態様における組成物を提供する。
【0020】
自明のことではあるが、本発明の１つの態様に関して記載した特徴は本発明の他の態様に組み込むことができる、ということが理解される。例えば、本発明の方法は、本発明の装置に関して記載した任意の特徴を組み込むことができ、その逆もまた同様である。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図5】図５は、ＨＣＥ細胞における本発明の組成物の遺伝子導入効率の結果を示す。第１欄の細胞はＤＡＰＩで染色され、及び青色で原蛍光を発して核を示す。第２欄の細胞は緑色で原蛍光を発光し、本発明の製剤Ｆ２～Ｆ５の正常な遺伝子導入を示す。
【図6】図６は、ゲル電気泳動実験の結果を示し、本発明において調製したケイ素ナノ粒子が、特に２：１以上のケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対する比で（例えば２：１～８：１の範囲の比で）、ｍＲＮＡを正常に封入することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明の第１の態様において、ケイ素ナノ粒子、少なくとも１つのアミノ酸、及び少なくとも１つの脂質を含み、該ケイ素ナノ粒子が少なくとも５０重量％のケイ素を含む、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸を制御して放出するための組成物を提供する。
【0023】
（定義）
本開示において、化合物の誘導体は、実質的に同じ構造を有するが、１つ以上の置換を有する化合物とすることができる。例えば、１つ以上の化学基を、付加する、欠失させる、又は他の基に置換することができる。特定の好ましい実施形態において、誘導体は、それが由来する化合物の医薬又は化粧料活性の少なくとも一部、例えば、それが由来する化合物の活性の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％を保持する。一部の実施形態において、誘導体は、それが由来する化合物と比較して医薬又は化粧料活性の増大を示し得る。例えば、ペプチドの場合では、ペプチド誘導体は、１つ以上のアミノ酸残基を付加した、欠失させた、又は他のアミノ酸残基に置換したペプチドを包含することができる。置換の場合、置換は、非保存置換又は保存置換、好ましくは保存置換とすることができる。
本開示において、化合物の誘導体は、実質的に同じ構造を有するが、１つ以上の置換を有する化合物とすることができる。例えば、１つ以上の化学基を、付加する、欠失させる、又は他の基に置換することができる。特定の好ましい実施形態において、誘導体は、それが由来する化合物の医薬又は化粧料活性の少なくとも一部、例えば、それが由来する化合物の活性の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％を保持する。一部の実施形態において、誘導体は、それが由来する化合物と比較して医薬又は化粧料活性の増大を示し得る。例えば、ペプチドの場合では、ペプチド誘導体は、１つ以上のアミノ酸残基を付加した、欠失させた、又は他のアミノ酸残基に置換したペプチドを包含することができる。置換の場合、置換は、非保存置換又は保存置換、好ましくは保存置換とすることができる。
【0024】
本開示の文脈において、ＰＣはホスファチジルコリンを示し、ＳＡはステアリルアミンを示し、ＤＯＰＥはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを示し、ＤＣ－コレステロールは、コレステリル３β－Ｎ－（ジメチルアミノエチル）カルバメートハイドロクロライドを示す。
【0025】
（ケイ素ナノ粒子）
本発明のすべての態様において、組成物はケイ素ナノ粒子を含む。ケイ素ナノ粒子は、５～４００ｎｍ、例えば５０～３５０ｎｍ、例えば８０～３１０ｎｍ、例えば１００～２５０ｎｍ、例えば１２０～２４０ｎｍ、例えば１５０～２２０ｎｍ、例えば約２００ｎｍの公称径を有する。ケイ素ナノ粒子は、純ケイ素又は加水分解可能なケイ素含有物質のいずれかから作製される。ケイ素ナノ粒子は好ましくは多孔性である。上記で示す公称径は平均径を指し得、ケイ素ナノ粒子試料における総粒子の少なくとも９０％は特定した寸法範囲内にあるとすることができる。ケイ素ナノ粒子は、純ケイ素又は加水分解可能なケイ素含有物質のいずれかから作製される。ケイ素ナノ粒子は、粒子をフッ化水素酸（ＨＦ）／エタノール混合物に接触させて、電流を印加するなどの標準的な技術によって多孔性に作製することができる。孔の密度及びその寸法を、ＨＦ濃度及び電流密度及び露出時間を変えることによって制御し、走査電子顕微鏡法及び／又は窒素吸着脱着容積等温測定によってモニタリングすることができる。
本発明のすべての態様において、組成物はケイ素ナノ粒子を含む。ケイ素ナノ粒子は、５～４００ｎｍ、例えば５０～３５０ｎｍ、例えば８０～３１０ｎｍ、例えば１００～２５０ｎｍ、例えば１２０～２４０ｎｍ、例えば１５０～２２０ｎｍ、例えば約２００ｎｍの公称径を有する。ケイ素ナノ粒子は、純ケイ素又は加水分解可能なケイ素含有物質のいずれかから作製される。ケイ素ナノ粒子は好ましくは多孔性である。上記で示す公称径は平均径を指し得、ケイ素ナノ粒子試料における総粒子の少なくとも９０％は特定した寸法範囲内にあるとすることができる。ケイ素ナノ粒子は、純ケイ素又は加水分解可能なケイ素含有物質のいずれかから作製される。ケイ素ナノ粒子は、粒子をフッ化水素酸（ＨＦ）／エタノール混合物に接触させて、電流を印加するなどの標準的な技術によって多孔性に作製することができる。孔の密度及びその寸法を、ＨＦ濃度及び電流密度及び露出時間を変えることによって制御し、走査電子顕微鏡法及び／又は窒素吸着脱着容積等温測定によってモニタリングすることができる。
【0026】
ケイ素ナノ粒子は、純ケイ素又は他の加水分解可能なケイ素含有物質とすることができる。ケイ素ナノ粒子が純ケイ素ではない場合、少なくとも５０重量％のケイ素を含む。例えば、ケイ素ナノ粒子は、少なくとも６０、７０、８０、９０、又は９５％のケイ素を含むことができる。ケイ素ナノ粒子は、好ましくは、同じ寸法の純ケイ素粒子における加水分解速度の少なくとも１０％の加水分解速度（例えば、室温のＰＢＳバッファーにおいて）を示す。ケイ素含有物質の加水分解のアッセイは、例えば国際公開第２０１１／００１４５６号など、当該技術分野で広く知られている。
【0027】
本発明のすべての態様におけるナノ粒子（例えば、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化したナノ粒子）は、好ましくは多孔性である。例えば、その多孔性により、同等の寸法を有する非孔性物質の表面積に対して、その表面積が少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、又は４倍増加し得る。一部の実施形態において（例えば、ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、その総面積は、好ましくは、その多孔性のため、対応する非孔性粒子の表面積に対して、少なくとも５０％又は少なくとも１００％増加する。多くの場合、多孔性ケイ素ナノ粒子は、実際に、その多孔性のため総表面積がはるかに大きく増加することとなる。
【0028】
好ましくは、（例えば、ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子を、皮膚表面への送達又は眼の局所送達などの局所送達のため製剤化するとき）ケイ素ナノ粒子は、２～３００ｎｍ、例えば２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、例えば２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、特に２０～２００ｎｍの平均径を有する。有利には、この寸法のケイ素ナノ粒子は、ｐｉｌｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ ｏｓｔｒａ又は汗管（孔）を阻害するには小さいが、その小さな寸法により、粒子が、表面薬剤リザーバーのみとして作用するのではなく、毛包の底部まで能動的に透過することができるので、皮膚送達に好適である。
【0029】
（脂質）
本発明のすべての態様において、（例えば、ナノ粒子を、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化するとき）ケイ素ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上、このように製剤化したナノ粒子は眼部に送達することに適切とすることができる）で表面処理される。ケイ素ナノ粒子を脂質で表面処理することは、生物活性剤の放出速度の制御を支援するということが分かっている。生物活性剤（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸）の特性を条件として、ナノ粒子表面を処理するために使用する脂質の種類が、その放出速度に影響を及ぼす。特に、ケイ素ナノ粒子を脂質で表面処理することは、短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡのロードを高めることができる必要なゼータ電位をもたらして、標的部位におけるその放出速度を制御するように、ケイ素ナノ粒子の表面電荷に有益な作用を有する。
本発明のすべての態様において、（例えば、ナノ粒子を、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化するとき）ケイ素ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上、このように製剤化したナノ粒子は眼部に送達することに適切とすることができる）で表面処理される。ケイ素ナノ粒子を脂質で表面処理することは、生物活性剤の放出速度の制御を支援するということが分かっている。生物活性剤（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸）の特性を条件として、ナノ粒子表面を処理するために使用する脂質の種類が、その放出速度に影響を及ぼす。特に、ケイ素ナノ粒子を脂質で表面処理することは、短鎖干渉ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡのロードを高めることができる必要なゼータ電位をもたらして、標的部位におけるその放出速度を制御するように、ケイ素ナノ粒子の表面電荷に有益な作用を有する。
【0030】
（ケイ素対脂質の比）
好ましくは、（例えば、脂質を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上から選択するとき）脂質のケイ素に対する比は、１：１～１５：１、例えば１：１～１３：１、１：１～１２：１、１：１～１１：１、１：１～１０：１、１：１～９：１、１：１～８：１、１：１～１３：１、２：１～１２：１、２：１～１１：１、２：１～１０：１、２：１～９：１、２：１～８：１、例えば１：１～７：１、２：１～７：１、３：１～６：１、４：１～５：１である。有利には、この脂質のケイ素に対する比は、ケイ素ナノ粒子によって輸送される生物活性剤（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸）の放出を制御し、安定化させることができるとともに、ケイ素の生体利用可能な分解生成物であるＯＳＡの放出を制御することができる多重膜小胞システムを提供する。
好ましくは、（例えば、脂質を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上から選択するとき）脂質のケイ素に対する比は、１：１～１５：１、例えば１：１～１３：１、１：１～１２：１、１：１～１１：１、１：１～１０：１、１：１～９：１、１：１～８：１、１：１～１３：１、２：１～１２：１、２：１～１１：１、２：１～１０：１、２：１～９：１、２：１～８：１、例えば１：１～７：１、２：１～７：１、３：１～６：１、４：１～５：１である。有利には、この脂質のケイ素に対する比は、ケイ素ナノ粒子によって輸送される生物活性剤（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸）の放出を制御し、安定化させることができるとともに、ケイ素の生体利用可能な分解生成物であるＯＳＡの放出を制御することができる多重膜小胞システムを提供する。
【0031】
有利には、脂質化合物は、ケイ素ナノ粒子の表面電荷に著しい作用をもたらすことができる。ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、及びレシチンで処理したケイ素ナノ粒子は、ゼータ電位分析を行ったとき、負の表面電荷を示した（１：１～１：３の範囲のケイ素：脂質の比で、－６０～－２０ｍＶの範囲）。ステアリルアミンで処理したケイ素ナノ粒子表面は、正のゼータ電位を示す（１：１～１：３の範囲のケイ素：脂質の比で、０～４０ｍＶの範囲）。
【0032】
一実施形態において、本発明の第１の態様の組成物は、コーティングしたナノ粒子の総重量に基づく少なくとも５重量％の脂質、例えば少なくとも２０重量％、典型的に少なくとも３０重量％、及び特に少なくとも５０重量％の脂質で表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。例えば１：１、１．５：１、２：１、又は２．５：１など、０．８：１～３：１の脂質対ケイ素のモル比が、特に有利であることが分かっている。
【0033】
特定の実施形態において（例えば、ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達することに適切とすることができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、コーティングしたナノ粒子の総重量に基づく少なくとも５重量％のリン脂質、例えば少なくとも２０重量％、典型的に少なくとも３０重量％、及び特に少なくとも５０重量％のリン脂質で表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。例えば１：１、１．５：１、２：１、又は２．５：１など、０．８：１～３：１の脂質対ケイ素のモル比が、特に有利であることが分かっている。
【0034】
一実施形態において、リン脂質は、５００～１０００の範囲の数平均分子量を有する。特に適切なリン脂質はグリセロリン脂質である。特に適切なリン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）又は水素化ホスファチジルコリンなど、極性頭部基が四級アンモニウム部分と連結したものである。リン脂質の種類は、製剤の特性に依存して選択することができ、中性又は負荷電脂質は非プロトン性製剤に好ましい一方、正荷電及びＣＨ３短鎖の脂質はプロトン性製剤に好ましい。好ましくは、側鎖は、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールの鎖などの、炭素原子が１５以上の脂肪族側鎖、又はエーテル単位が６以上反復するエーテル側鎖である。
【0035】
好ましくは（例えば、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上を含み、眼部に送達することに適切とすることができる、製剤において）、脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ステアリルアミン（ＳＡ）、レシチン、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【0036】
さらなる実施形態において、ケイ素ナノ粒子表面は、ホスファチジルコリン、水素化ホスファチジルコリン、ステアリルアミン、レシチン、又はそれらの組合せで処理することができる。これは、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡが荷電する場合、特に有利とすることができる。
【0037】
特定の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、コーティングしたナノ粒子の総重量に基づく少なくとも５重量％の水素化ホスファチジルコリン、例えば少なくとも２０重量％、典型的に少なくとも３０重量％、及び特に少なくとも５０重量％の水素化ホスファチジルコリンで表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。例えば１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、又は４．５：１など、０．８：１～５：１の水素化ホスファチジルコリン対ケイ素のモル比が、特に有利であることが分かっている。
【0038】
特定の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、コーティングしたナノ粒子の総重量に基づく少なくとも５重量％のホスファチジルコリン、例えば少なくとも２０重量％、典型的に少なくとも３０重量％、及び特に少なくとも５０重量％のホスファチジルコリンで表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。例えば１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、又は４．５：１など、０．８：１～５：１のホスファチジルコリン対ケイ素のモル比が、特に有利であることが分かっている。
【0039】
特定の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、コーティングしたナノ粒子の総重量に基づく少なくとも５重量％のレシチン、例えば少なくとも２０重量％、典型的に少なくとも３０重量％、及び特に少なくとも５０重量％のレシチンで表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。例えば１：１、１．５：１、２：１、又は２．５：１など、０．８：１～３：１のレシチン対ケイ素のモル比が、特に有利であることが分かっている。
【0040】
特定の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、コーティングしたナノ粒子の総重量に基づく少なくとも５重量％のステアリルアミン、例えば少なくとも２０重量％、典型的に少なくとも３０重量％、及び特に少なくとも５０重量％のステアリルアミンで表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。例えば１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、２：０．７５、２：１．５、又は３：１など、０．８：１～３．５：１の脂質対ケイ素のモル比が、特に有利であることが分かっている。
【0041】
特定の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、好ましくは１：１～２０：１の、より好ましくは７：１～１０：１のＰＣ：ＳＡの重量比、例えば７２：８のＰＣ：ＳＡの重量比のＰＣ及びＳＡで表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。
【0042】
特定の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、本発明の第１の態様の組成物は、ＤＯＰＥ、ＳＡ、及びＤＣ－コレステロールで表面処理したケイ素ナノ粒子を含む。ＤＯＰＥ：ＳＡの重量比は、１：１～１０：１、例えば４：１～８：１の範囲とすることができる。ＤＯＰＥ：ＤＣ－コレステロールの重量比は、１：１～５：１、例えば１：１～３：１の範囲とすることができる。ＳＡ：ＤＣ－コレステロールの重量比は、１：１～１：５、例えば１：２～１：４の範囲とすることができる。一部の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上と共に製剤化し、そうしたナノ粒子は眼部に送達するために製剤化することができるとき）、ＤＯＰＥ：ＳＡ：ＤＣ－コレステロールの重量比は、４８：８：２４とすることができる。
【0043】
（アミノ酸）
本発明のすべての態様において、（例えば、本発明のナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子はさらにアミノ酸で処理される。最も広義では、「アミノ酸」という用語は、アミン（－ＮＨ２）及びカルボキシル（－ＣＯＯＨ）の官能基を含む、任意の人工又は自然起源の有機化合物を包含する。これは、α、β、γ、及びδアミノ酸を含む。これは、任意のキラル配置のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、（例えば、本発明のナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、アミノ酸は、好ましくは自然起源のαアミノ酸である。これは、タンパク質を構成するアミノ酸又はタンパク質を構成しないアミノ酸（カルニチン、レボチロキシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、又はシトルリンなど）とすることができる。好ましい実施形態において、（例えば、本発明のナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、又はグリシン、又はアルギニン及びグリシンの混合物を含む。特に好ましい実施形態において、アミノ酸はグリシンを含む。
本発明のすべての態様において、（例えば、本発明のナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子はさらにアミノ酸で処理される。最も広義では、「アミノ酸」という用語は、アミン（－ＮＨ２）及びカルボキシル（－ＣＯＯＨ）の官能基を含む、任意の人工又は自然起源の有機化合物を包含する。これは、α、β、γ、及びδアミノ酸を含む。これは、任意のキラル配置のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、（例えば、本発明のナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、アミノ酸は、好ましくは自然起源のαアミノ酸である。これは、タンパク質を構成するアミノ酸又はタンパク質を構成しないアミノ酸（カルニチン、レボチロキシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、又はシトルリンなど）とすることができる。好ましい実施形態において、（例えば、本発明のナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、又はグリシン、又はアルギニン及びグリシンの混合物を含む。特に好ましい実施形態において、アミノ酸はグリシンを含む。
【0044】
好ましい実施形態において（例えば、ナノ粒子を、アルギニン、グリシン、及びヒスチジンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、本発明のすべての態様の製品に存在するｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡの少なくとも７０重量％、例えば少なくとも８０重量％、例えば少なくとも９０重量％は、表面処理したナノ粒子に会合する。
【0045】
ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸と脂質処理ケイ素ナノ粒子との分子会合は、有利には、表面処理したケイ素ナノ粒子（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上、並びに／又はグリシン、アルギニン、及びヒスチジンの１つ以上で処理したナノ粒子）が分解すると、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸が生体利用可能になるということを確実にする。組成物の分解速度は、ケイ素ナノ粒子の加水分解によって決定される。この速度が制御可能であるので、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの核酸が生体利用可能になる速度もまた、用量ダンピングしないように、及び／又はナノ粒子が適用部位から離れた位置に向かうときにのみ放出を確実にするように、制御することができる。例えば、これは、ナノ粒子が、適用される皮膚表面から基底位置に移動したときであり得る。
【0046】
脂質処理ケイ素ナノ粒子（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上で処理したナノ粒子）をアミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンの１つ以上、好ましくはグリシン）で処理することが、ケイ素ナノ粒子にロードしたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）などの核酸に有益な安定化作用をもたらすことが分かっている。特に、脂質処理ケイ素ナノ粒子をアミノ酸で処理することが、生物学的液体において、例えば眼球組織において、ＲＮＡなどの核酸を安定化させることが示されている。このようにアミノ酸と共に製剤化した脂質処理ケイ素ナノ粒子は、特に眼部への送達に適切とすることができ、核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）を眼部に送達するための送達システムを提供することができる。
【0047】
本発明のすべての態様の特定の実施形態において、（例えば、ナノ粒子を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子はさらにアルギニン、グリシン、又はそれらの組合せで処理される。グリシン及びアルギニンの１つ以上で表面処理し、ＲＮＡなどの核酸をロードしたケイ素ナノ粒子は、生物学的液体におけるより良好な生物活性安定性を示し、眼球細胞及び細胞質環境においてｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなどのＲＮＡなどの荷電核酸を効果的に送達した。
【0048】
（アミノ酸のケイ素に対する比）
好ましくは、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）アミノ酸のケイ素に対する比は、０．０５：１～２：１、例えば０．０５：１～１．８：１、０．０５：１～１．６：１、０．０５：１～１．４：１、０．０５：１～１．２：１、０．０５：１～１：１、０．０５：１～０．９：１、０．０５：１～０．８：１、０．０５：１～０．６：１、０．０５：１～０．５：１、０．０５：１～０．４：１、０．０５：１～０．３：１、０．０５：１～０．２：１、好ましくは０．２：１～０．８：１、特に０．３：１～０．７：１である。有利には、このアミノ酸のケイ素に対する比は、さらに、ケイ素ナノ粒子によって輸送されるＲＮＡ分子の放出速度に影響を及ぼし、該ＲＮＡ分子を安定化させる。
好ましくは、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）アミノ酸のケイ素に対する比は、０．０５：１～２：１、例えば０．０５：１～１．８：１、０．０５：１～１．６：１、０．０５：１～１．４：１、０．０５：１～１．２：１、０．０５：１～１：１、０．０５：１～０．９：１、０．０５：１～０．８：１、０．０５：１～０．６：１、０．０５：１～０．５：１、０．０５：１～０．４：１、０．０５：１～０．３：１、０．０５：１～０．２：１、好ましくは０．２：１～０．８：１、特に０．３：１～０．７：１である。有利には、このアミノ酸のケイ素に対する比は、さらに、ケイ素ナノ粒子によって輸送されるＲＮＡ分子の放出速度に影響を及ぼし、該ＲＮＡ分子を安定化させる。
【0049】
本発明のすべての態様において、（眼部に送達するために製剤化し得る）ケイ素ナノ粒子は、脂質（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上）並びにアミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンの１つ以上、例えばグリシン、又はグリシン及びアルギニンの混合物）で処理される。アミノ酸は任意のアミノ酸とすることができる。好ましくは、アミノ酸はアルギニン又はグリシン又はグリシンとアルギニンとの組合せである。脂質は任意の脂質とすることができる。好ましくは、脂質はリン脂質である。より好ましくは、脂質は、水素化ＰＣ、ＰＣ、ＤＯＰＥ、レシチン、ステアリルアミン、及びそれらの誘導体の１つ以上から選択される。任意で、脂質は、ＤＣ－コレステロール及び／又はその誘導体を含む。好ましくは、アミノ酸のケイ素に対する比は、０．０５：１～０．４：１、例えば０．０８：１～０．３５：１、特に０．０９：１～０．３２：１である。一部の実施形態において、（例えば、脂質を、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上から選択するとき）、アミノ酸は、アルギニンとグリシンとの組合せであり、Ａｒｇ：Ｇｌｙの比は、１：０．６～３：１、例えば１：０．８～２．５：１、例えば１：１～２：１である。有利には、そうした比は、高速度のＲＮＡ放出を行い、並びに眼球細胞及び細胞質環境において効果的にＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）を送達するということが分かっている。このように、アミノ酸と共に製剤化した、本発明の脂質処理ケイ素ナノ粒子は、特に眼部への送達に適切とすることができ、核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）を眼部に送達するための送達システムを提供することができる。
【0050】
本発明のすべての態様の他の実施形態において、（例えば、本発明のナノ粒子を眼部に送達するために製剤化するとき）脂質処理ケイ素ナノ粒子はアルギニンで処理される。脂質は任意の脂質とすることができる。好ましくは、脂質は、水素化ＰＣ、ＰＣ、ＤＯＰＥ、レシチン、ステアリルアミン、及びそれらの誘導体の１つ以上から選択される。任意で、脂質は、ＤＣ－コレステロール及び／又はその誘導体を含む。好ましくは、アルギニンのケイ素に対する比は、０．０５：１～０．４：１、例えば０．０８：１～０．３５：１、特に０．０９：１～０．３２：１である。有利には、そうした比は、高速度のＲＮＡ放出を行い、並びに眼球細胞及び細胞質環境において効果的にＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）を送達するということが分かっている。このように、アミノ酸と共に製剤化した、本発明の脂質処理ケイ素ナノ粒子は、特に眼部への送達に適切とすることができ、核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）を眼部に送達するための送達システムを提供することができる。
【0051】
本発明のすべての態様の他の実施形態において、（例えば、ナノ粒子を眼部に送達するために製剤化するとき）脂質処理ケイ素ナノ粒子はグリシンで処理される。脂質は任意の脂質とすることができる。好ましくは、脂質は、水素化ＰＣ、ＰＣ、ＤＯＰＥ、レシチン、ステアリルアミン、及びそれらの誘導体の１つ以上から選択される。任意で、脂質は、ＤＣ－コレステロール及び／又はその誘導体を含む。好ましくは、グリシンのケイ素に対する比は、０．０５：１～０．５：１、例えば０．０８：１～０．４５：１、特に０．０９：１～０．４２：１である。有利には、そうした比は、高速度のＲＮＡ放出を行い、眼球細胞及び細胞質環境において効果的にｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡなどの荷電ＲＮＡを送達するということが分かっており、そうした比は細胞内部移行を支える。このように、アミノ酸と共に製剤化した、本発明の脂質処理ケイ素ナノ粒子は、特に眼部への送達に適切とすることができ、核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）を眼部に送達するための送達システムを提供することができる。
【0052】
（ＲＮＡ）
本発明のすべての態様の好ましい実施形態において、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子には、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡであり得るＲＮＡをロードする。最も広義では、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を包含し、５～５０塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子を含み、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する。例えば、１０～４５塩基対、１５～４０塩基対、２０～３０塩基対、特に２０～２５塩基対の長さである。「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡを包含し、任意で、５プライムキャップ及び／又はポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡを含むことができる。あるいは、これらの特徴の１つ又は両方がなくともよい。
本発明のすべての態様の好ましい実施形態において、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子には、ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡであり得るＲＮＡをロードする。最も広義では、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を包含し、５～５０塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子を含み、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する。例えば、１０～４５塩基対、１５～４０塩基対、２０～３０塩基対、特に２０～２５塩基対の長さである。「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡを包含し、任意で、５プライムキャップ及び／又はポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡを含むことができる。あるいは、これらの特徴の１つ又は両方がなくともよい。
【0053】
本発明のすべての態様の好ましい実施形態におけるＲＮＡは（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、自然起源である、又は、活性の向上、血清安定性の増加、オフターゲットになることが少ない、及び免疫学的活性化の低下などの治療特性を高めるため化学的に修飾することができる。ＲＮＡの化学修飾は、当該技術分野で一般に知られる任意の修飾を含むことができる。
【0054】
特定の実施形態において、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。他の実施形態において、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
【0055】
他の実施形態において、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、核酸はＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション生成物である。
【0056】
（ケイ素の核酸に対する比）
好ましくは（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、ケイ素の核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）に対する比は、１：１～８：１、例えば１：１～６：１、１：１～５：１、１：１～４：１、又は１：１～３：１である。好ましくは、ケイ素の核酸に対する比は、１：１～３：１である。有利には、このケイ素の核酸に対する比は、さらに、ケイ素ナノ粒子によって輸送される核酸分子（ｓｉＲＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子など）の放出速度に影響を及ぼし、該核酸分子を安定化させる。こうしたケイ素の核酸に対する比を有する製剤は、特に眼部への送達に適切とすることができ、核酸を眼球組織に送達するための送達システムを提供することができる。
好ましくは（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、ケイ素の核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）に対する比は、１：１～８：１、例えば１：１～６：１、１：１～５：１、１：１～４：１、又は１：１～３：１である。好ましくは、ケイ素の核酸に対する比は、１：１～３：１である。有利には、このケイ素の核酸に対する比は、さらに、ケイ素ナノ粒子によって輸送される核酸分子（ｓｉＲＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子など）の放出速度に影響を及ぼし、該核酸分子を安定化させる。こうしたケイ素の核酸に対する比を有する製剤は、特に眼部への送達に適切とすることができ、核酸を眼球組織に送達するための送達システムを提供することができる。
【0057】
（他の成分）
（遺伝子導入試薬）
本発明のすべての態様の好ましい実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子は、遺伝子導入剤で表面処理することができる。最も広義では、「遺伝子導入」とは、ネイキッド又は精製の核酸を真核生物細胞に計画的に導入するプロセスである。また、遺伝子導入は、他の方法及び細胞型をも指し得る。ｍＲＮＡを、その配列の翻訳をするため、細胞に遺伝子導入することができる。ｓｉＲＮＡを、ＲＮＡサイレンシングを行うため（すなわち、標的遺伝子におけるＲＮＡ及びタンパク質の喪失）、遺伝子導入することができる。
（遺伝子導入試薬）
本発明のすべての態様の好ましい実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、脂質処理ケイ素ナノ粒子は、遺伝子導入剤で表面処理することができる。最も広義では、「遺伝子導入」とは、ネイキッド又は精製の核酸を真核生物細胞に計画的に導入するプロセスである。また、遺伝子導入は、他の方法及び細胞型をも指し得る。ｍＲＮＡを、その配列の翻訳をするため、細胞に遺伝子導入することができる。ｓｉＲＮＡを、ＲＮＡサイレンシングを行うため（すなわち、標的遺伝子におけるＲＮＡ及びタンパク質の喪失）、遺伝子導入することができる。
【0058】
最も広義では、「遺伝子導入試薬」とは、ネイキッド又は精製の核酸を真核生物細胞に導入しやすくする薬剤である。例えば、一部の遺伝子導入試薬は、ネイキッド又は精製のｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを真核生物細胞に誘導しやすくする薬剤である。
【0059】
本発明のすべての態様の他の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化し、そうした製剤が眼部に送達することに適切とすることができるとき）、遺伝子導入試薬は、リポフェクション（リポソーム遺伝子導入）試薬、デンドリマー、塩化カルシウム溶液と合わせたホスフェートイオンを含むＨＥＰＥバッファー生理食塩水（ＨｅＢＳ）、又はジエチルアミノエチル－デキストラン（ＤＥＡＥ－デキストラン）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーとすることができる。
【0060】
好ましい実施形態において、（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、遺伝子導入試薬は、リポフェクタミンなどのリポフェクション試薬である。
【0061】
本発明の種々の態様に使用するためのＲＮＡなど（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）の核酸を、種々の形態で提供することができる。例えば、一部の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、ＲＮＡなどの核酸は、（単独、又は種々の他の核酸との組合せで）例えばバッファーなどの溶液中で提供される。一部の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、ＲＮＡなどの核酸は、単独、又は他の単離した核酸との組合せで、塩として提供される。一部の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、ＲＮＡなどの核酸は、再構成可能な凍結乾燥形態で提供される。例えば、一部の実施形態において、ＲＮＡなどの核酸は、凍結乾燥ペレット単独で、又は他の単離した核酸を含む凍結乾燥ペレットで提供することができる。一部の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、ＲＮＡなどの核酸は、ビーズ、又は膜などの固体物質に固定して提供される。一部の実施形態において（例えば、本発明のケイ素ナノ粒子を、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化するとき）、ＲＮＡなどの核酸は、宿主細胞、例えばプラスミドを含む細胞株、又は安定的に組み込んだ配列を含む細胞株において、提供される。
【0062】
本発明に従って使用するためのＲＮＡなどの核酸は、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、並びにＰＮＡ（ペプチド核酸）又はＲＮＡ若しくはＤＮＡ間のハイブリッドを含む。また、この用語は、例えば、当該技術分野で知られる標識、メチル化、「キャップ」、自然起源のヌクレオチドの１つ以上を類似体で置換、ヌクレオチド間修飾、例えば無荷電結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、負荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、及び正荷電結合によるもの（例えば、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）などペンダント部分を含むもの、インターカレーターによるもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーターを含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキレーターを含むもの、修飾結合によるもの（例えば、αアノマー核酸など）など既知の種類の修飾、並びに、非修飾形態のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む。
【0063】
本明細書で使用するとき、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、プリン及びピリミジン塩基だけでなく、修飾した他の複素環塩基も含有する部分を含むということが理解される。そうした修飾は、メチル化プリン若しくはピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の複素環を含む。また、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドは糖部分の修飾を含み得、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン、脂肪族基で置換される、又はエーテル、若しくはアミンなどとして官能基化される。ヌクレオチド又はポリヌクレオチドの他の修飾は、それぞれの相補ピリミジン又はプリン、例えば、イソグアニン及びイソシステインなどと水素結合を形成するプリン又はピリミジン塩基の官能基を再編成、付加、置換、又は改変することに関与する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド及び／又はプローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの修飾ヌクレオチドを含む。
【0064】
一部の実施形態において、本明細書に開示するＲＮＡなどの核酸は１つ以上の一般的な塩基を含む。本明細書で使用するとき、「一般的な塩基」という用語は、Ａ、Ｕ／Ｔ、Ｃ、及びＧから選択される１つを超えるヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド類似体を指す。一部の実施形態において、一般的な塩基は、デオキシイノシン、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、６－ニトロインドール、５－ニトロインドールからなる群より選択することができる。
【0065】
（ケイ素ナノ粒子の調製）
本発明に関するケイ素ナノ粒子は、当該技術分野で従来用いられている技術によって、例えば、ミリングプロセスによって又は粒子径を小さくする他の既知の技術によって、簡便に調製することができる。ケイ素含有ナノ粒子を、ケイ酸ナトリウム粒子、コロイダルシリカ、又はシリコンウエハー材料から作製することができる。マクロ又はミクロスケールの粒子を、ボールミル、遊星型ボールミル、又は他の寸法を小さくする機構において粉砕する。得られた粒子を空気分級してナノ粒子を回収することができる。また、ナノ粒子の作製にプラズマ法及びレーザーアブレーションを使用することも可能である。
本発明に関するケイ素ナノ粒子は、当該技術分野で従来用いられている技術によって、例えば、ミリングプロセスによって又は粒子径を小さくする他の既知の技術によって、簡便に調製することができる。ケイ素含有ナノ粒子を、ケイ酸ナトリウム粒子、コロイダルシリカ、又はシリコンウエハー材料から作製することができる。マクロ又はミクロスケールの粒子を、ボールミル、遊星型ボールミル、又は他の寸法を小さくする機構において粉砕する。得られた粒子を空気分級してナノ粒子を回収することができる。また、ナノ粒子の作製にプラズマ法及びレーザーアブレーションを使用することも可能である。
【0066】
多孔性粒子を、本明細書に記載の方法を含む、当該技術分野で従来用いられる方法によって作製することができる。
【0067】
（クリーム剤及びゲル剤の調製）
クリーム剤及びゲル剤を、単にクリーム基剤又はゲル基剤に本発明のケイ素ナノ粒子を分散（すなわち混合）させることで製剤化することができる。例えば、ケイ素ナノ粒子を、医薬用クリーム基剤に入れてかく拌することができる。ゲル剤について、粉末を、粉末形態のゲルマトリックスへとかく拌して、その後ゲルを水和させることができる、又は粉末を、予め水和させたゲルに入れてかく拌することができる。
クリーム剤及びゲル剤を、単にクリーム基剤又はゲル基剤に本発明のケイ素ナノ粒子を分散（すなわち混合）させることで製剤化することができる。例えば、ケイ素ナノ粒子を、医薬用クリーム基剤に入れてかく拌することができる。ゲル剤について、粉末を、粉末形態のゲルマトリックスへとかく拌して、その後ゲルを水和させることができる、又は粉末を、予め水和させたゲルに入れてかく拌することができる。
【0068】
（眼部への送達）
本発明の第３の態様において、本発明の第１の態様における組成物（例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化した組成物）を提供し、これは眼部に送達するためのものである。
本発明の第３の態様において、本発明の第１の態様における組成物（例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１つ以上、並びに／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１つ以上と共に製剤化した組成物）を提供し、これは眼部に送達するためのものである。
【0069】
すべての眼組織に注射によってアクセス可能であるが、ｓｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシング処置に必要とされる頻回の処置レジメンでは、局所適用が好ましい。しかしながら、眼球表面は、短い接触時間、涙による希釈、及び角膜細胞透過不良を合わせた作用のため、薬剤送達において、より複雑な生物学的バリアの１つである。
【0070】
本発明の組成物は、線維層、血管層、及び網膜の組織の１つ以上などの眼組織にｓｉＲＮＡを送達する、有効で、臨床において安全、且つ非侵襲性の手段を提供する。例えば、本発明の組成物は、角膜、強膜、虹彩、毛様体、脈絡膜、小帯線維、水晶体嚢、水晶体核、硝子体、及び網膜の組織から選択される１つ以上の組織にｓｉＲＮＡを送達する、有効で、臨床において安全、且つ非侵襲性の手段を提供する。
【0071】
本発明の組成物は、活性医薬剤、特にｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡなどの核酸を封入して安定化することができる。次に、本発明のナノ粒子は、眼の細胞に（例えば角膜、強膜、虹彩、毛様体、脈絡膜、小帯線維、水晶体嚢、水晶体核、硝子体、及び網膜の細胞の１つ以上に）、核酸（例えばｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡ）などのこれらの活性医薬剤を送達することができる。眼組織の１つ以上に組成物を適用すると、眼球細胞はナノ粒子を内部移行させる。これにより、核酸（例えばｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡ）などのこれらの活性医薬剤が、眼球細胞に透過し、標的部位における核酸の制御された放出を確実にすることができる。
【0072】
本発明の第１の態様の組成物は眼部に送達するために製剤化することができる。例えば、組成物は、１つ以上の、眼部に適合性のある賦形剤と共に製剤化することができる。組成物は、眼障害の処置に使用することができる。例えば、本発明の第１の態様の組成物は、黄斑変性、結膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、円錐角膜、白内障、網膜炎、及びぶどう膜炎、特に黄斑変性の処置に使用することができる。黄斑変性は、加齢黄斑変性を含むことができる。
【0073】
また、本発明は、さらなる態様において、本発明の第１の態様の組成物に関する方法及び薬剤を提供する。例えば、本発明の第１の態様における組成物を、任意で１つ以上の、眼部に適合性である賦形剤と組み合わせて、１つ以上の眼組織に（例えば、角膜、強膜、虹彩、毛様体、脈絡膜、小帯線維、水晶体嚢、水晶体核、硝子体、及び網膜の組織から選択される１つ以上の組織に）送達することを含む方法を提供する。本発明の第１の態様における組成物を、任意で１つ以上の、眼部に適合性である賦形剤と組み合わせて、１つ以上の眼組織に送達することを含む、眼障害を処置するための方法を提供する。例えば、そうした方法は、黄斑変性、結膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、円錐角膜、白内障、網膜炎、又はぶどう膜炎、特に黄斑変性を処置することを含むことができる。
【実施例0074】
本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに記載する。
【0075】
（材料）
（ケイ素調製）
片面研磨のＰ型又はＮ型ケイ素ウエハーをＳｉ－Ｍａｔ（独国）から購入した。すべての洗浄及びエッチング試薬はクリーンルーム級であった。１：１（ｖ／ｖ）の純エタノール及び１０％水性ＨＦ酸中において、８０ｍＡ／ｃｍ２陽極電流密度で、２～１０分間、ｐ型Ｓｉを陽極エッチングすることによって、エッチングケイ素を調製した。エッチング後、試料を純エタノールで洗浄して、高純度の乾燥窒素流下で乾燥させてから、使用した。
（ケイ素調製）
片面研磨のＰ型又はＮ型ケイ素ウエハーをＳｉ－Ｍａｔ（独国）から購入した。すべての洗浄及びエッチング試薬はクリーンルーム級であった。１：１（ｖ／ｖ）の純エタノール及び１０％水性ＨＦ酸中において、８０ｍＡ／ｃｍ２陽極電流密度で、２～１０分間、ｐ型Ｓｉを陽極エッチングすることによって、エッチングケイ素を調製した。エッチング後、試料を純エタノールで洗浄して、高純度の乾燥窒素流下で乾燥させてから、使用した。
【0076】
エッチングしたケイ素ウエハーＰ＋又はＮ－を、ミリングボール及び／又は乳棒と乳鉢を用いて粉砕した。微細粉末を、Ｒｅｔｓｃｈブランドのふるい（ゲージ３８μｍ）振とう器ａｓ２００を用いてふるいにかけた。ふるいの開口寸法によって、選択した均一の寸法（２０～１００μｍ）を得る。ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅシステム及びＭａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＰＣＳによって、粒子径を測定した。さらに使用するまで、試料を密閉容器にて保管する。
【0077】
また、ナノケイ素粉末をＳｉｇｍａ及びＨｅｆｅｌ Ｋａｉｅｒ（中国）から得た。粒子径をＰＣＳによって測定し、粒子径を記録してから（径は２０～１００ｎｍの範囲であった）、ロード及びエッチングを行った。ケイ素ウエハーを、ミリングボールを用いて又は乳棒と乳鉢を用いて粉砕した。微細粉末を、Ｒｅｔｓｃｈブランドのふるい（ゲージ３８μｍ）振とう器ａｓ２００を用いてふるいにかけ、所望の寸法を有する均一のナノ粒子を回収した。
【0078】
（ケイ素ナノ粒子の活性化）
２５０ｍｌのエタノール及び５００ｍｇの１００ｎｍ径の多孔性ケイ素ナノ粒子を混合して、マグネットバーを用いて３０分間かく拌した。次に、溶液を３０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清を捨てて、ナノ粒子を５ｍｌの蒸留水で洗浄し、丸底フラスコに移した。フラスコの内容物を凍結させた（－２５℃で２時間）。凍結させたナノ粒子を凍結乾燥器を用いて一晩凍結乾燥させた。得られた乾燥粉末は活性化ナノ粒子である。
２５０ｍｌのエタノール及び５００ｍｇの１００ｎｍ径の多孔性ケイ素ナノ粒子を混合して、マグネットバーを用いて３０分間かく拌した。次に、溶液を３０００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清を捨てて、ナノ粒子を５ｍｌの蒸留水で洗浄し、丸底フラスコに移した。フラスコの内容物を凍結させた（－２５℃で２時間）。凍結させたナノ粒子を凍結乾燥器を用いて一晩凍結乾燥させた。得られた乾燥粉末は活性化ナノ粒子である。
【0079】
（アミン、脂質、リポフェクタミンをロードしたｓｉＲＮＡナノ粒子の調製）
製剤ＳＩＳ００５－ＰＳ９１及びＳＩＳ００５－ＤＳ６１（グリシン含む）の両方を、ｓｉＲＮＡを含有するケイ素ナノ粒子の水性懸濁液中にリポソーム形成物質の薄いフィルムを溶解することによって調製した。次に、混合物を３回凍結融解し、インビトロでＨＣＥＳ細胞において遺伝子導入効率について試験した。並行して、ＳＩＳ００５－ＰＤＳ１０５１製剤を、角膜のｓｉＲＮＡ送達システムに好ましいと考えられる、さらなる正の電荷を導入することを狙いとするさらなる修飾の後（負のゼータ電位を有することが示されたので）、試験した。この目的のため、製剤におけるカチオン性脂質の比を増加させた。
製剤ＳＩＳ００５－ＰＳ９１及びＳＩＳ００５－ＤＳ６１（グリシン含む）の両方を、ｓｉＲＮＡを含有するケイ素ナノ粒子の水性懸濁液中にリポソーム形成物質の薄いフィルムを溶解することによって調製した。次に、混合物を３回凍結融解し、インビトロでＨＣＥＳ細胞において遺伝子導入効率について試験した。並行して、ＳＩＳ００５－ＰＤＳ１０５１製剤を、角膜のｓｉＲＮＡ送達システムに好ましいと考えられる、さらなる正の電荷を導入することを狙いとするさらなる修飾の後（負のゼータ電位を有することが示されたので）、試験した。この目的のため、製剤におけるカチオン性脂質の比を増加させた。
【0080】
コロイド安定性を、非ロード及びロード製剤の両方について、ゼータ電位測定と並行して、動的光散乱法によって評価した。また、ｓｉＲＮＡの封入効率を分光光度法によって測定した。遺伝子導入（細胞内移行）の効率を、フローサイトメトリー、続いて、ｓｉＲＮＡロード製剤での処置後にインビトロにおけるノックダウンを測定するため行ったデュアルルシフェラーゼアッセイによって、ヒト角膜上皮細胞において評価する。
【0081】
（遺伝子導入のための製剤の調製手順（ＳＩ００５－ＰＳ９１、ＳＩ００５－ＤＳ６１、ＳＩ００５－ＤＳＣ６１３など））
これらと他の製剤との成分を以下の表に示す。
これらと他の製剤との成分を以下の表に示す。
【表1】
【0082】
（材料）
ケイ素ナノ粒子、ヌクレアーゼ非含有水、クロロホルム
脂質：ステアリルアミン（ＳＡ）、カタログ番号３０５３９１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
卵黄のＬ－α－ホスファチジルコリン（ＰＣ）、カタログ番号６１７５５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
ジオレオイルＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、カタログ番号Ｐ１２２３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｎ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメートコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、カタログ番号９２２４３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
１００μＭ（１．３３μｇ／μｌ）非特異性ＮＳＣ４（カスタマイズしたｓｉＲＮＡ二本鎖、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）
１００μＭ（１．３３μｇ／μｌ）標的化ｓｉＬＵＣ（カスタマイズしたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）
１００μＭ（１．３３μｇ／μｌ）ＦＡＭタグ付きｓｉＲＮＡ（緑色ｓｉＧＬＯ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）
ケイ素ナノ粒子、ヌクレアーゼ非含有水、クロロホルム
脂質：ステアリルアミン（ＳＡ）、カタログ番号３０５３９１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
卵黄のＬ－α－ホスファチジルコリン（ＰＣ）、カタログ番号６１７５５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
ジオレオイルＬ－α－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、カタログ番号Ｐ１２２３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｎ－（２－ジメチルアミノエチル）カルバメートコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、カタログ番号９２２４３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
１００μＭ（１．３３μｇ／μｌ）非特異性ＮＳＣ４（カスタマイズしたｓｉＲＮＡ二本鎖、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）
１００μＭ（１．３３μｇ／μｌ）標的化ｓｉＬＵＣ（カスタマイズしたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）
１００μＭ（１．３３μｇ／μｌ）ＦＡＭタグ付きｓｉＲＮＡ（緑色ｓｉＧＬＯ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）
【0083】
（機器）
回転式蒸発システム、ボルテックス、超音波浴処理機、水浴、丸底フラスコ、一般的な試験管、エッペンドルフチューブ、マイクロピペット、凍結乾燥システム、ゼータサイザー、高速遠心機、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計、蛍光リーダー
回転式蒸発システム、ボルテックス、超音波浴処理機、水浴、丸底フラスコ、一般的な試験管、エッペンドルフチューブ、マイクロピペット、凍結乾燥システム、ゼータサイザー、高速遠心機、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計、蛍光リーダー
【0084】
（手順）
蛍光性ｓｉＲＮＡは作業時に光に暴露させないということが留意される（例えば、フラスコ及び試験管をアルミニウムホイルで覆う）。
（Ａ－ケイ素ナノ粒子／脂質組成物におけるｓｉＲＮＡのロード）
（ステップＩ－成分１、ｓｉＲＮＡ－ＳｉＮＰ混合物の調製）
１．ヌクレアーゼ非含有水中にろ過したケイ素ナノ粒子溶液０．２ｍｇ／ｍｌを調製する
２．それぞれが１４０μｇのＳｉＮＰを含有するように、上述の溶液を８つのエッペンドルフマイクロチューブに入れてアリコート（７００μｌ）の分取をする。
３．各アリコートに対して、ｓｉＲＮＡ及びグリシンを添加して、ヌクレアーゼ非含有水で体積を１．４ｍｌに調節する。
４．チューブを十分に混合させて、試料をかく拌しながら室温で１時間インキュベートする。
蛍光性ｓｉＲＮＡは作業時に光に暴露させないということが留意される（例えば、フラスコ及び試験管をアルミニウムホイルで覆う）。
（Ａ－ケイ素ナノ粒子／脂質組成物におけるｓｉＲＮＡのロード）
（ステップＩ－成分１、ｓｉＲＮＡ－ＳｉＮＰ混合物の調製）
１．ヌクレアーゼ非含有水中にろ過したケイ素ナノ粒子溶液０．２ｍｇ／ｍｌを調製する
２．それぞれが１４０μｇのＳｉＮＰを含有するように、上述の溶液を８つのエッペンドルフマイクロチューブに入れてアリコート（７００μｌ）の分取をする。
３．各アリコートに対して、ｓｉＲＮＡ及びグリシンを添加して、ヌクレアーゼ非含有水で体積を１．４ｍｌに調節する。
【表2】
【0085】
（ステップＩＩ－成分２、脂質フィルムの調製）
１．各脂質成分（ＳＡ、ＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにクロロホルムに溶解する。
２．所望の量の各脂質を小さい丸底フラスコに移して、十分に混合させる。各脂質混合物を８つのレプリケート（８つのフラスコ中）に調製する。
ａ．（脂質基剤ＤＳ６１）
６８μｇのＤＯＰＥ（３４０μｌ）
１２μｇのＳＡ（６０μｌ）
ｂ．（脂質基剤ＰＳ９１）
７２μｇのＰＣ（３６０μｌ）
８μｇのＳＡ（４０μｌ）
ｃ．（脂質基剤ＤＳＣ６１３）
４８μｇのＤＯＰＥ（２４０μｌ）
８μｇのＳＡ（４０μｌ）
２４μｇのＤＣ－Ｃｈｏｌ（１２０μｌ）
ｄ．（脂質基剤ＰＤＳ１０５１）
５０μｇのＰＣ（２５０μｌ）
２５μｇのＤＯＰＥ（１２５μｌ）
５μｇのＳＡ（２５μｌ）
ｅ．（脂質基剤ＰＤＳ１０５２）
４８μｇのＰＣ（２４０μｌ）
２３μｇのＤＯＰＥ（１１５μｌ）
９μｇのＳＡ（４５μｌ）
ｆ．（脂質基剤ＰＤＳＣ１０５１４）
４０μｇのＰＣ（２００μｌ）
２０μｇのＤＯＰＥ（１００μｌ）
４μｇのＳＡ（２０μｌ）
１６μｇのＤＣ－Ｃｈｏｌ（８０μｌ）
３．回転式蒸発システムを用いて溶媒を慎重に蒸発させて、薄い脂質フィルムを形成する。乾燥した脂質を真空下に配置して、残りの溶媒を取り除く。
１．各脂質成分（ＳＡ、ＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにクロロホルムに溶解する。
２．所望の量の各脂質を小さい丸底フラスコに移して、十分に混合させる。各脂質混合物を８つのレプリケート（８つのフラスコ中）に調製する。
ａ．（脂質基剤ＤＳ６１）
６８μｇのＤＯＰＥ（３４０μｌ）
１２μｇのＳＡ（６０μｌ）
ｂ．（脂質基剤ＰＳ９１）
７２μｇのＰＣ（３６０μｌ）
８μｇのＳＡ（４０μｌ）
ｃ．（脂質基剤ＤＳＣ６１３）
４８μｇのＤＯＰＥ（２４０μｌ）
８μｇのＳＡ（４０μｌ）
２４μｇのＤＣ－Ｃｈｏｌ（１２０μｌ）
ｄ．（脂質基剤ＰＤＳ１０５１）
５０μｇのＰＣ（２５０μｌ）
２５μｇのＤＯＰＥ（１２５μｌ）
５μｇのＳＡ（２５μｌ）
ｅ．（脂質基剤ＰＤＳ１０５２）
４８μｇのＰＣ（２４０μｌ）
２３μｇのＤＯＰＥ（１１５μｌ）
９μｇのＳＡ（４５μｌ）
ｆ．（脂質基剤ＰＤＳＣ１０５１４）
４０μｇのＰＣ（２００μｌ）
２０μｇのＤＯＰＥ（１００μｌ）
４μｇのＳＡ（２０μｌ）
１６μｇのＤＣ－Ｃｈｏｌ（８０μｌ）
３．回転式蒸発システムを用いて溶媒を慎重に蒸発させて、薄い脂質フィルムを形成する。乾燥した脂質を真空下に配置して、残りの溶媒を取り除く。
【0086】
（ステップＩＩＩ－ｓｉＲＮＡ－ＳｉＮＰ（成分１）のリポソーム（成分２）での封入）
１．薄い脂質フィルム（ステップＩＩより）をｓｉＲＮＡロード又は空のＳｉナノ粒子試料（ステップＩより）と共に溶解させる。脂質フィルム（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）を含有する各フラスコに、別々に２００μｌの１、２、３、又は４のケイ素ナノ粒子／ｓｉＲＮＡ混合物を添加する。
２．２００μｌのヌクレアーゼ非含有水を各フラスコに添加して、溶液の体積を４００μｌに調節する。
３．各フラスコをパラフィルムで覆い、内容物を十分に混合して、室温で１時間インキュベートする。
４．脂質フィルムを完全に溶解するようにボルテックスにかける。フラスコを１５秒間音波浴処理して、脂質の溶解を促す。
５．各フラスコのすべての内容物を別々にエッペンドルフマイクロチューブに移す。
６．すべてのチューブを冷凍庫（－２０℃）に置き、少なくとも３時間（又は一晩）保管する。
７．試料を冷凍庫から取り出し、３０℃の水浴に１０分間入れる。室温で冷却し、十分にボルテックスにかける。
８．凍結融解（ステップ５及び６）をさらに２回繰り返す。
９．すべての試料を、アッセイするまで冷凍庫（－２０℃）に保管する。
１０．それぞれロードした試料は、４００μｌ体積に［１０μｇのｓｉＲＮＡ：２０μｇのＳｉＮＰ：８０μｇの脂質基剤：１０μｇのグリシン］を含有する。
１．薄い脂質フィルム（ステップＩＩより）をｓｉＲＮＡロード又は空のＳｉナノ粒子試料（ステップＩより）と共に溶解させる。脂質フィルム（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）を含有する各フラスコに、別々に２００μｌの１、２、３、又は４のケイ素ナノ粒子／ｓｉＲＮＡ混合物を添加する。
【表3】
３．各フラスコをパラフィルムで覆い、内容物を十分に混合して、室温で１時間インキュベートする。
４．脂質フィルムを完全に溶解するようにボルテックスにかける。フラスコを１５秒間音波浴処理して、脂質の溶解を促す。
５．各フラスコのすべての内容物を別々にエッペンドルフマイクロチューブに移す。
６．すべてのチューブを冷凍庫（－２０℃）に置き、少なくとも３時間（又は一晩）保管する。
７．試料を冷凍庫から取り出し、３０℃の水浴に１０分間入れる。室温で冷却し、十分にボルテックスにかける。
８．凍結融解（ステップ５及び６）をさらに２回繰り返す。
９．すべての試料を、アッセイするまで冷凍庫（－２０℃）に保管する。
１０．それぞれロードした試料は、４００μｌ体積に［１０μｇのｓｉＲＮＡ：２０μｇのＳｉＮＰ：８０μｇの脂質基剤：１０μｇのグリシン］を含有する。
【0087】
（Ｂ－ケイ素ナノ粒子／脂質製剤の特徴）
（封入効率）
ｓｉＲＮＡ封入効率を、ロードした粒子を遊離（非結合）したｓｉＲＮＡから高速遠心によって分離した後、封入効率を測定することによって検討した。
１．５０μｌの各試料を遠心用マイクロチューブに採取する。
２．すべての試料を２１，０００×ｇで３０分間遠心する。
３．各試料の２５μｌ（上半分）の上清を別のチューブに（Ｓ１と表示）に移し、アッセイするまで４℃で保管する（ｓｉＧｌｏロード試料の場合、光に暴露させない）。
４．２５μｌの２％ＳＤＳをペレット試料（残りの上清を含む）に添加して、脂質二重層を崩壊させて、結合したｓｉＲＮＡを放出する。
５．再びチューブを２１，０００×ｇで３０分間遠心して、上清を採取する（Ｓ２と表示）。
６．ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて、すべての上清Ｓ１及びＳ２試料において、２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定する。ｓｉＧｌｏをロードした試料では、Ｓ１及びＳ２の上清試料の両方において蛍光強度（ＦＩ）を測定する。
７．封入効率（ＥＥ％）を計算する。
式中、ＯＤＳ１－上清Ｓ１の吸光度（２６０ｎｍ）（第１の遠心後）、
ＯＤＳ２－上清Ｓ２の吸光度（２６０ｎｍ）（第２の遠心後）。
ｓｉＧｌｏをロードした試料では、それぞれＯＤＳ１及びＯＤＳ２の代わりにＦＩＳ１及びＦＩＳ２を使用。
８．上清試料におけるｓｉＲＮＡの濃度及びケイ素ナノ粒子製剤に封入したｓｉＲＮＡの量は、ｓｉＲＮＡ較正曲線（以前に記載したような）を用いて決定することができる。
（封入効率）
ｓｉＲＮＡ封入効率を、ロードした粒子を遊離（非結合）したｓｉＲＮＡから高速遠心によって分離した後、封入効率を測定することによって検討した。
１．５０μｌの各試料を遠心用マイクロチューブに採取する。
２．すべての試料を２１，０００×ｇで３０分間遠心する。
３．各試料の２５μｌ（上半分）の上清を別のチューブに（Ｓ１と表示）に移し、アッセイするまで４℃で保管する（ｓｉＧｌｏロード試料の場合、光に暴露させない）。
４．２５μｌの２％ＳＤＳをペレット試料（残りの上清を含む）に添加して、脂質二重層を崩壊させて、結合したｓｉＲＮＡを放出する。
５．再びチューブを２１，０００×ｇで３０分間遠心して、上清を採取する（Ｓ２と表示）。
６．ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて、すべての上清Ｓ１及びＳ２試料において、２６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定する。ｓｉＧｌｏをロードした試料では、Ｓ１及びＳ２の上清試料の両方において蛍光強度（ＦＩ）を測定する。
７．封入効率（ＥＥ％）を計算する。
【数1】
ＯＤＳ２－上清Ｓ２の吸光度（２６０ｎｍ）（第２の遠心後）。
ｓｉＧｌｏをロードした試料では、それぞれＯＤＳ１及びＯＤＳ２の代わりにＦＩＳ１及びＦＩＳ２を使用。
８．上清試料におけるｓｉＲＮＡの濃度及びケイ素ナノ粒子製剤に封入したｓｉＲＮＡの量は、ｓｉＲＮＡ較正曲線（以前に記載したような）を用いて決定することができる。
【0088】
（ゼータサイザー測定）
コロイド安定性を、ゼータ電位測定と並行して、動的光散乱法によって評価した。非ロード（空）の製剤試料及びｓｉＬＵＣ／ＮＳＣ４をロードした製剤試料に測定を行う。
１．２００μｌの各試料を採取して、ヌクレアーゼ非含有超純水で１ｍｌの総体積に希釈する。
２．試料を折り曲げキャピラリーセルにロードする。
３．ゼータサイザーを用いて、粒子寸法、多分散性指標、及びゼータ電位について試料を読み取る。トリプリケートで各測定を行う。データを図１、図２、及び図３に示す。
コロイド安定性を、ゼータ電位測定と並行して、動的光散乱法によって評価した。非ロード（空）の製剤試料及びｓｉＬＵＣ／ＮＳＣ４をロードした製剤試料に測定を行う。
１．２００μｌの各試料を採取して、ヌクレアーゼ非含有超純水で１ｍｌの総体積に希釈する。
２．試料を折り曲げキャピラリーセルにロードする。
３．ゼータサイザーを用いて、粒子寸法、多分散性指標、及びゼータ電位について試料を読み取る。トリプリケートで各測定を行う。データを図１、図２、及び図３に示す。
【0089】
（ＨＣＥＳ細胞における遺伝子導入効率）
遺伝子導入（細胞内移行）の効率を、フローサイトメトリーによって、ヒト角膜上皮細胞において評価した。この研究の目的のため、蛍光タグ付きｓｉＲＮＡプローブ（ｓｉＧｌｏ）をロードした製剤試料を用いる。
１．１０％ＦＢＳで富栄養化した１ｍｌのＤＭＥＭ中にウェル（１２ウェルプレートにおいて）あたり２×１０５ＨＣＥＳ細胞を播種し、標準的な条件で２４時間成長させる（８０％の培養密度まで）。
２．１０％ＦＢＳで富栄養化した、ウェルあたり９５０μｌの新しいＤＭＥＭで培地を交換する。
３．ｓｉＧｌｏをロードしたケイ素ナノ粒子／脂質の試料を室温に調節する。
４．１５１μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中で６μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を３μｌのｓｉＧｌｏ原液（１００μＭ）に混合することによって、リポフェクタミン遺伝子導入試薬を含むコントロールの試料を調製し、室温で１５分間インキュベートする。
５．３つのレプリケートの細胞を、０．１μＭのｓｉＧｌｏ濃度を得るようにウェルあたり５３．３μｌの各ｓｉＧｌｏロード製剤又はＬＰＦコントロールを添加することによって、処理する。
６．細胞を標準的な条件で２４時間成長させる（５％ＣＯ２で３７℃）。
７．培地を捨て、ウェルを５００μｌのＰＢＳで洗浄する。
８．３００μｌのトリプシン－ＥＤＴＡを添加して、プレートを３７℃で１０分間インキュベートする。
９．直ちに、１０％ＦＢＳで富栄養化した３００μｌのＤＭＥＭを添加して、トリプシン処理を停止する。
１０．細胞を別々にマイクロチューブに移して、１０００～２０００ｒｐｍで５分間遠心する。
１１．上清を捨て、５００μｌのＰＢＳ中に細胞を慎重に懸濁させる。
１２．試料を１０００～２０００ｒｐｍで５分間遠心する。
１３．上清を捨て、ＰＩ色素を含有する６００μｌのＦＡＣＳバッファー中に細胞を慎重に再懸濁させる。
１４．フローサイトメーターを用いて試料を分析する。
遺伝子導入（細胞内移行）の効率を、フローサイトメトリーによって、ヒト角膜上皮細胞において評価した。この研究の目的のため、蛍光タグ付きｓｉＲＮＡプローブ（ｓｉＧｌｏ）をロードした製剤試料を用いる。
１．１０％ＦＢＳで富栄養化した１ｍｌのＤＭＥＭ中にウェル（１２ウェルプレートにおいて）あたり２×１０５ＨＣＥＳ細胞を播種し、標準的な条件で２４時間成長させる（８０％の培養密度まで）。
２．１０％ＦＢＳで富栄養化した、ウェルあたり９５０μｌの新しいＤＭＥＭで培地を交換する。
３．ｓｉＧｌｏをロードしたケイ素ナノ粒子／脂質の試料を室温に調節する。
４．１５１μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中で６μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を３μｌのｓｉＧｌｏ原液（１００μＭ）に混合することによって、リポフェクタミン遺伝子導入試薬を含むコントロールの試料を調製し、室温で１５分間インキュベートする。
５．３つのレプリケートの細胞を、０．１μＭのｓｉＧｌｏ濃度を得るようにウェルあたり５３．３μｌの各ｓｉＧｌｏロード製剤又はＬＰＦコントロールを添加することによって、処理する。
６．細胞を標準的な条件で２４時間成長させる（５％ＣＯ２で３７℃）。
７．培地を捨て、ウェルを５００μｌのＰＢＳで洗浄する。
８．３００μｌのトリプシン－ＥＤＴＡを添加して、プレートを３７℃で１０分間インキュベートする。
９．直ちに、１０％ＦＢＳで富栄養化した３００μｌのＤＭＥＭを添加して、トリプシン処理を停止する。
１０．細胞を別々にマイクロチューブに移して、１０００～２０００ｒｐｍで５分間遠心する。
１１．上清を捨て、５００μｌのＰＢＳ中に細胞を慎重に懸濁させる。
１２．試料を１０００～２０００ｒｐｍで５分間遠心する。
１３．上清を捨て、ＰＩ色素を含有する６００μｌのＦＡＣＳバッファー中に細胞を慎重に再懸濁させる。
１４．フローサイトメーターを用いて試料を分析する。
【0090】
（ノックダウン効率）
ノックダウン誘導の効率を測定するため、特異的（ｓｉＬＵＣ）、非特異的（ＮＳＣ４）をロードした試験用製剤試料、及び非ロード製剤でデュアルルシフェラーゼアッセイを行う。
１．１０％ＦＢＳで富栄養化した１００μｌのＤＭＥＭ中にウェル（９６ウェルプレートにおいて）あたり６．５×１０３ＨＣＥＳ細胞を播種し、標準的な条件で２４時間成長させる。すべての製剤試料をそれぞれ５つのレプリケートにおいて研究するため、２つのプレートを調製する。
２．製造者による手順に従ってリポフェクタミン２０００を用いてウミシイタケ及びＬｕｃ２ｐプラスミドを細胞に遺伝子導入する。ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で５０μｌの総体積まで希釈した、０．３μｌのリポフェクタミン２０００、１ｎｇのウミシイタケプラスミド、及び５ｎｇのＬｕｃ２ｐプラスミドを含有する５０μｌの試薬混合物を各ウェルに添加する。
３．細胞を、５％ＣＯ２において３７℃で２４時間成長させる。
４．ウェルあたり９０μｌの新しいＤＭＥＭで培地を交換する。
５．製剤試料を室温に調節する。３２μｌの各試料を２８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合する。
６．リポフェクタミン遺伝子導入試薬を含むコントロールの試料を調製する。
・１．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を５５．８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合し、室温で５分間インキュベートしてから、３μｌのｓｉＬＵＣ原液を添加し、１０分間インキュベーションを続ける。
・１．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を５５．８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合し、室温で５分間インキュベートしてから、３μｌのＮＳＣ４原液を添加し、１０分間インキュベーションを続ける。
・１．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を５５．８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合し、室温で１５分間インキュベートする。
７．５つのレプリケートの細胞を、ウェルあたり１０μＭのロードした若しくは空の製剤又はＬＰＦコントロールを添加することによって、処理する。
８．細胞を標準的な条件で成長させる（５％ＣＯ２において３７℃）。
９．４８時間後、培地を捨てて、ウェルをＰＢＳで洗浄する。
１０．ウェルあたり２０μｌのパッシブ溶解バッファーを添加する。
１１．オービタルシェーカーにおいてプレートを室温で１５分間インキュベートする（９００ｒｐｍ）。
１２．製造者による手順に従って、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキット及びＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡプレートリーダーを用いて発光レベルを読み取る。
ノックダウン誘導の効率を測定するため、特異的（ｓｉＬＵＣ）、非特異的（ＮＳＣ４）をロードした試験用製剤試料、及び非ロード製剤でデュアルルシフェラーゼアッセイを行う。
１．１０％ＦＢＳで富栄養化した１００μｌのＤＭＥＭ中にウェル（９６ウェルプレートにおいて）あたり６．５×１０３ＨＣＥＳ細胞を播種し、標準的な条件で２４時間成長させる。すべての製剤試料をそれぞれ５つのレプリケートにおいて研究するため、２つのプレートを調製する。
２．製造者による手順に従ってリポフェクタミン２０００を用いてウミシイタケ及びＬｕｃ２ｐプラスミドを細胞に遺伝子導入する。ＯｐｔｉＭＥＭ培地中で５０μｌの総体積まで希釈した、０．３μｌのリポフェクタミン２０００、１ｎｇのウミシイタケプラスミド、及び５ｎｇのＬｕｃ２ｐプラスミドを含有する５０μｌの試薬混合物を各ウェルに添加する。
３．細胞を、５％ＣＯ２において３７℃で２４時間成長させる。
４．ウェルあたり９０μｌの新しいＤＭＥＭで培地を交換する。
５．製剤試料を室温に調節する。３２μｌの各試料を２８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合する。
６．リポフェクタミン遺伝子導入試薬を含むコントロールの試料を調製する。
・１．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を５５．８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合し、室温で５分間インキュベートしてから、３μｌのｓｉＬＵＣ原液を添加し、１０分間インキュベーションを続ける。
・１．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を５５．８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合し、室温で５分間インキュベートしてから、３μｌのＮＳＣ４原液を添加し、１０分間インキュベーションを続ける。
・１．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬を５５．８μｌのＯｐｔｉＭＥＭに混合し、室温で１５分間インキュベートする。
７．５つのレプリケートの細胞を、ウェルあたり１０μＭのロードした若しくは空の製剤又はＬＰＦコントロールを添加することによって、処理する。
８．細胞を標準的な条件で成長させる（５％ＣＯ２において３７℃）。
９．４８時間後、培地を捨てて、ウェルをＰＢＳで洗浄する。
１０．ウェルあたり２０μｌのパッシブ溶解バッファーを添加する。
１１．オービタルシェーカーにおいてプレートを室温で１５分間インキュベートする（９００ｒｐｍ）。
１２．製造者による手順に従って、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキット及びＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡプレートリーダーを用いて発光レベルを読み取る。
【0091】
（ｓｉＲＮＡロードケイ素ナノ粒子をリポフェクタミンに合わせる（ＳＩＳ００５－ＬＰＦ））
１．それぞれが２０μｇのＳｉＮＰを含有するように、ケイ素ナノ粒子懸濁液を６つのエッペンドルフマイクロチューブに入れてアリコートの分取をする。
２．上述のＳｉＮＰアリコートに、１０μｇのｓｉＲＮＡを添加する。
ａ．２つのマイクロチューブに、３７μｌの２０μＭのｓｉＬｕｃ２ｐ（標的化ｓｉＲＮＡ）を添加する。
ｂ．２つのマイクロチューブに、３７μｌの２０μＭのＮＳＣ４（非特異的ｓｉＲＮＡ）を添加する。
ｃ．（非ロードコントロール）空のコントロールを調製するため、ｓｉＲＮＡなしのＳｉＮＰを含有する残りの２つのマイクロチューブを置いておく。
３．試料をかく拌しながら室温で１時間インキュベートしてから、ボルテックスにかけて、チューブを冷凍庫（－２０℃）に置き、２～３時間保管する。
４．水を蒸発させるため、試料を凍結乾燥システムに一晩接続する。
５．さらなる分析の前に、上述のｓｉＲＮＡロード（又は非ロードのコントロール）ＳｉＮＰ試料をリポフェクタミン溶液（リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬、カタログ番号１３７７８０７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解し、１５０μｌの総体積までヌクレアーゼ非含有水中に希釈し、ボルテックスにかけ、室温で１時間インキュベートする。
１．それぞれが２０μｇのＳｉＮＰを含有するように、ケイ素ナノ粒子懸濁液を６つのエッペンドルフマイクロチューブに入れてアリコートの分取をする。
２．上述のＳｉＮＰアリコートに、１０μｇのｓｉＲＮＡを添加する。
ａ．２つのマイクロチューブに、３７μｌの２０μＭのｓｉＬｕｃ２ｐ（標的化ｓｉＲＮＡ）を添加する。
ｂ．２つのマイクロチューブに、３７μｌの２０μＭのＮＳＣ４（非特異的ｓｉＲＮＡ）を添加する。
ｃ．（非ロードコントロール）空のコントロールを調製するため、ｓｉＲＮＡなしのＳｉＮＰを含有する残りの２つのマイクロチューブを置いておく。
３．試料をかく拌しながら室温で１時間インキュベートしてから、ボルテックスにかけて、チューブを冷凍庫（－２０℃）に置き、２～３時間保管する。
４．水を蒸発させるため、試料を凍結乾燥システムに一晩接続する。
５．さらなる分析の前に、上述のｓｉＲＮＡロード（又は非ロードのコントロール）ＳｉＮＰ試料をリポフェクタミン溶液（リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬、カタログ番号１３７７８０７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解し、１５０μｌの総体積までヌクレアーゼ非含有水中に希釈し、ボルテックスにかけ、室温で１時間インキュベートする。
【表4】
【0092】
（図３に示す結果）
ロードしたときの本発明のケイ素ナノ粒子における表面電荷の変化を評価した。通常、粒子の表面電荷は、表面において負荷電ｓｉＲＮＡ分子と結合した後、減少する（より正である値からより負である値に変化する）。この作用は、試験した製剤試料のほぼ半数において観察されたが、残りの試料はいずれの有意差も示さなかった。ｓｉＲＮＡをロードした後のＺＰの変化を図３に示す。ＰＥを含有するすべての試料のゼータ電位はｓｉＲＮＡのロードに影響されなかった。同様に、レシチンを含む大部分の製剤は、ＺＰの有意差を示さなかった。７５μｇ：２００μｇの比のレシチン－Ｓｉ－ＮＰ（Ｆ３１）試料のみが、ｓｉＲＮＡをロードしたとき、表面電荷の減少を示した（ｐ＝０．０００１）。また、ＰＣをロードした両方のナノ粒子（Ｆ０１、Ｆ０２）では、ｓｉＲＮＡロードの後、ＺＰの有意な減少を観察し（７５μｇ：２００μｇのＳｉ：ＰＣ比ではｐ＝０．０００２、及び１５０μｇ：２００μｇのＳｉ：ＰＣ比ではｐ＝０．０００５）、アルギニンもロードしたＰＣ－ＳｉＮＰ（Ｆ０４、Ｆ０７）では、アミノ酸含有量に関わらず、ＺＰの有意な減少を観察した（７５μｇ：２００μｇ：２０μｇのＳｉ：ＰＣ：Ａｒｇ比ではｐ＝０．０１９６、及び７５μｇ：２００μｇ：４０μｇのＳｉ：ＰＣ：Ａｒｇ比ｐ＝０．０４９０）。
ロードしたときの本発明のケイ素ナノ粒子における表面電荷の変化を評価した。通常、粒子の表面電荷は、表面において負荷電ｓｉＲＮＡ分子と結合した後、減少する（より正である値からより負である値に変化する）。この作用は、試験した製剤試料のほぼ半数において観察されたが、残りの試料はいずれの有意差も示さなかった。ｓｉＲＮＡをロードした後のＺＰの変化を図３に示す。ＰＥを含有するすべての試料のゼータ電位はｓｉＲＮＡのロードに影響されなかった。同様に、レシチンを含む大部分の製剤は、ＺＰの有意差を示さなかった。７５μｇ：２００μｇの比のレシチン－Ｓｉ－ＮＰ（Ｆ３１）試料のみが、ｓｉＲＮＡをロードしたとき、表面電荷の減少を示した（ｐ＝０．０００１）。また、ＰＣをロードした両方のナノ粒子（Ｆ０１、Ｆ０２）では、ｓｉＲＮＡロードの後、ＺＰの有意な減少を観察し（７５μｇ：２００μｇのＳｉ：ＰＣ比ではｐ＝０．０００２、及び１５０μｇ：２００μｇのＳｉ：ＰＣ比ではｐ＝０．０００５）、アルギニンもロードしたＰＣ－ＳｉＮＰ（Ｆ０４、Ｆ０７）では、アミノ酸含有量に関わらず、ＺＰの有意な減少を観察した（７５μｇ：２００μｇ：２０μｇのＳｉ：ＰＣ：Ａｒｇ比ではｐ＝０．０１９６、及び７５μｇ：２００μｇ：４０μｇのＳｉ：ＰＣ：Ａｒｇ比ｐ＝０．０４９０）。
【0093】
ｓｉＲＮＡのロードは、ステアリルアミン表面処理ケイ素ナノ粒子の表面電荷に最も大きい影響を及ぼし、高負電荷を誘導した。これまでの分析で示したように、ＳＡ及びＳＡ＋アルギニンをロードした空のＳｉ－ＮＰは、正又はおおよそ中性の表面電荷を有しており、ゆえにアニオン性ｓｉＲＮＡ分子を効果的に誘引した。
【0094】
（ｍＲＮＡ封入効率におけるロード比の影響）
試料を、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇにおける上述のプロトコルに従って調製した。各試料は、１０：２４：４：１２：５のケイ素ナノ粒子：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）：ステアリルアミン：コレステリル３β－Ｎ－（ジメチルアミノエチル）カルバメートハイドロクロライド（ＤＣ－コレステロール）：グリシンの重量比からなるものであった。試料を、以下の表に示すように核酸のケイ素ナノ粒子に対する様々な比で調製した。
表５は、様々なｍＲＮＡロード比を有するＰｒｏＳｉｌｉｃ－ＤＳＣ６１３Ｇ製剤試料を示す。
＊ これは、他のすべての成分（ケイ素ナノ粒子、脂質、及びアミノ酸）のｍＲＮＡに対する重量比である。
＊＊ おおよその電荷比（Ｎ／Ｐ比として知られる）を、ｍＲＮＡの長さ、ＲＮＡの平均分子質量（約３２５Ｄａ）、及びカチオン性脂質の分子量（ステアリルアミン：２６９．５Ｄａ、ＤＣ－コレステロール：５００．８Ｄａ）に基づいて計算する。
試料を、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇにおける上述のプロトコルに従って調製した。各試料は、１０：２４：４：１２：５のケイ素ナノ粒子：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）：ステアリルアミン：コレステリル３β－Ｎ－（ジメチルアミノエチル）カルバメートハイドロクロライド（ＤＣ－コレステロール）：グリシンの重量比からなるものであった。試料を、以下の表に示すように核酸のケイ素ナノ粒子に対する様々な比で調製した。
表５は、様々なｍＲＮＡロード比を有するＰｒｏＳｉｌｉｃ－ＤＳＣ６１３Ｇ製剤試料を示す。
【表5】
＊＊ おおよその電荷比（Ｎ／Ｐ比として知られる）を、ｍＲＮＡの長さ、ＲＮＡの平均分子質量（約３２５Ｄａ）、及びカチオン性脂質の分子量（ステアリルアミン：２６９．５Ｄａ、ＤＣ－コレステロール：５００．８Ｄａ）に基づいて計算する。
【0095】
（ゲル電気泳動法を用いたケイ素ナノ粒子製剤によるｍＲＮＡの封入の評価）
ｍＲＮＡ封入効率におけるケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対するロード比の影響をゲル電気泳動法によって検討した。１％のＥ－Ｇｅｌ ＥＸプレキャストアガロースゲルを用いた。Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ１００イメージングシステム（Ｋｏｄａｋ）を用いて、ゲルを可視化した。結果を図６に示す。
ｍＲＮＡ封入効率におけるケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対するロード比の影響をゲル電気泳動法によって検討した。１％のＥ－Ｇｅｌ ＥＸプレキャストアガロースゲルを用いた。Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ１００イメージングシステム（Ｋｏｄａｋ）を用いて、ゲルを可視化した。結果を図６に示す。
【0096】
図６は、１列目に非ロードｍＲＮＡ（Ｕ０）を示す。ｍＲＮＡをロードしたケイ素ナノ粒子（Ｌ０．５、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８）を、左から右に、ケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対する比が増加する順に２～９列目に示す。等しい量のｍＲＮＡ（１００ｎｇ）を１～９列のそれぞれにロードした。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＥ－Ｇｅｌ １Ｋｂ Ｐｌｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（８０ｎｇ）をマーカーとしてＭ列にロードした。１０列目は空にしておいた（ブランク溶液として）。
【0097】
電気泳動は、本発明のＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇ製剤が正常にｍＲＮＡを封入し、２：１を超える比など、ケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対する比がより高いと、特に良好に封入するということを示した。図６におけるコントロール列（非ロードｍＲＮＡ、Ｕ０）は、予想されるように、単一の速く移動するバンドを示す。また、このバンドは、２列目（ロードしたＬ０．５）及び３列目（ロードしたＬ１）においても観察された。この観察されるバンドは、非結合ｍＲＮＡに対応する。２列目及び３列目のバンドの強度（特に３列目）は、コントロール（Ｕ０）に比べて低いものであった。これは、ケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対する比が非常に低い試料においても、一部のｍＲＮＡはなおケイ素ナノ粒子によって封入され、ゆえにバンドにおいて観察されないということを示している。
【0098】
効率的に封入されたｍＲＮＡは、ゲルの孔を通って移動できず、ウェルに留まる（Ｕ０、Ｌ０．５、及びＬ１とは異なり、バンドが現れない）。図６は、１～３列目と比較してケイ素ナノ粒子の含有量が増えた試料Ｌ２～Ｌ８が正常にｍＲＮＡを封入することを示す。これは、Ｕ０、Ｌ０．５、及びＬ１に見受けられるバンドの不在によって証明される。これは、本発明のケイ素ナノ粒子製剤が正常にｍＲＮＡを封入することができるということを示す。この結果は、最適なロード比（最大のｍＲＮＡ封入を示すが、用いられるナノ粒子の量を最小にする比）が、２：１（ケイ素ナノ粒子：ｍＲＮＡ）及び１１：１（送達システムの他のすべての成分：ｍＲＮＡ）に対応するＬ２である、ということを示唆する。同じロード比が、ｓｉＲＮＡロードに有効であることが分かっている。この比は、約２．５のＮ／Ｐ電荷比に対応する。
【0099】
（分光光度法を用いる封入効率の評価）
また、ｍＲＮＡ封入の効率（ＥＥ、パーセンテージとして表す）を概算するため、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇ試料（Ｕ０～Ｌ８）をまた遠心して、非結合ｍＲＮＡを分離した。上清液体中の核酸含有量を分光光度法によって測定して、以下の式を用いて封入効率を計算した。
ＯＤ非ロードは、非ロードｍＲＮＡコントロール（ＵＯ）の吸光度である。ＯＤロードは、各試料Ｌ０．５～Ｌ８の吸光度である。
また、ｍＲＮＡ封入の効率（ＥＥ、パーセンテージとして表す）を概算するため、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇ試料（Ｕ０～Ｌ８）をまた遠心して、非結合ｍＲＮＡを分離した。上清液体中の核酸含有量を分光光度法によって測定して、以下の式を用いて封入効率を計算した。
【数2】
【0100】
結果を図７に示し、これはゲル電気泳動法実験の結果を裏付けるものである。ケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対する比が増加すると、封入効率も、プラトーに達するまで増加し、２：１を超えるケイ素のｍＲＮＡに対する比で横ばいになる。
【0101】
（インビボにおけるケイ素ナノ粒子製剤活性の評価）
試料を、上述のＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇにおけるプロトコルに従って調製した。これらの試料は、以下の重量比でｓｉＲＮＡ、ケイ素ナノ粒子、脂質、及びグリシンを含む。
ＳＡはステアリルアミンであり、ＤＯＰＥはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであり、ＰＣはホスファチジルコリンであり、ＤＣ－Ｃｈｏｌはコレステリル３β－Ｎ－（ジメチルアミノエチル）カルバメートハイドロクロライドである。
試料を、上述のＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇにおけるプロトコルに従って調製した。これらの試料は、以下の重量比でｓｉＲＮＡ、ケイ素ナノ粒子、脂質、及びグリシンを含む。
【表6】
ＳＡはステアリルアミンであり、ＤＯＰＥはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであり、ＰＣはホスファチジルコリンであり、ＤＣ－Ｃｈｏｌはコレステリル３β－Ｎ－（ジメチルアミノエチル）カルバメートハイドロクロライドである。
【0102】
（ｓｉＲＮＡをロードしたケイ素ナノ粒子製剤の調製）
特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）及び非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＳＣ４）を含む試料を調製した。両方のｓｉＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ及びＮＳＣ４）を、１９ｂｐの中央２本鎖領域、及び各３’末端に対称ｄＴｄＴジヌクレオチドオーバーハングを有する、２１ｍｅｒとして設計した。ｓｉＲＮＡはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（白国）から提供された。
特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）及び非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＳＣ４）を含む試料を調製した。両方のｓｉＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ及びＮＳＣ４）を、１９ｂｐの中央２本鎖領域、及び各３’末端に対称ｄＴｄＴジヌクレオチドオーバーハングを有する、２１ｍｅｒとして設計した。ｓｉＲＮＡはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（白国）から提供された。
【0103】
試料を調製するため、ヌクレアーゼ非含有水に溶解したｓｉＲＮＡを、ナノ粒子水溶液に添加して、室温で６０分間インキュベートした。２：１のケイ素ナノ粒子のｍＲＮＡに対する比を用いた（これが、上述のゲル電気泳動法及び分光光度法実験において最適比であると分かったため）。
【0104】
（生動物のイメージング）
内務省（スコットランド）及び保健、社会福祉及び公共安全省（北アイルランド）によって倫理上の承認を得て、英国動物福祉法に従って、動物を以下の実験に用いた。角膜への蛍光ｓｉＲＮＡ（ＤＹ－５４７－標識ｓｉＧＬＯ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、英国）の送達を評価する実験を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに行った。製剤のｓｉＲＮＡの生物学的利用能及びサイレンシング活性を評価するため、角膜上皮に特異的にホタルルシフェラーゼを発現させるように（内在性のＫｒｔ１２プロモーターの制御下において）、レポーターノックインマウス株（Ｋｒｔ１２＋／ｌｕｃ２）を用いた。この動物モデルは、以前に報告されたようにＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドから開発され、レポーター遺伝子発現モニタリングを用いるｓｉＲＮＡ送達方法のインビボ評価において信頼できるモデルを提供する。インビボのイメージングのため、約１．５Ｌ／ｍｉｎの酸素流中で１．５～２％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、英国）を用いてマウスに麻酔した。ｓｉＧｌｏの蛍光を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ３．２ソフトウェアと共にＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳスペクトルによって（両方ともＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、英国）、ＤｓＲｅｄフィルターの組合せを用いて（励起５３５ｎｍ、吸収５７０ｎｍ）、局所適用後の所定の時点において、検出した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定するため、Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓゲル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、英国）と１：１ｗ／ｗで混合したルシフェリン（３０ｍｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を、イメージング直前に麻酔したマウスの眼に点眼した。生物発光の読み取りを、ＩＶＩＳスペクトルによって約１０分にわたって行って、信号が取得時間内で安定に保たれていることを確認した後、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを用いて定量化した。信号強度の定量化のため、対象領域（ＲＯＩ）を各眼において別々に選択し、実験を通してＲＯＩパラメーター（寸法及び形状）を一定に保った。スプリットボディコントロール測定方法（ｓｐｌｉｔ ｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｒｅｇｉｍｅ）を用いて、値を右眼／左眼の比（ＲＥ／ＬＥ）として表す。
内務省（スコットランド）及び保健、社会福祉及び公共安全省（北アイルランド）によって倫理上の承認を得て、英国動物福祉法に従って、動物を以下の実験に用いた。角膜への蛍光ｓｉＲＮＡ（ＤＹ－５４７－標識ｓｉＧＬＯ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、英国）の送達を評価する実験を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに行った。製剤のｓｉＲＮＡの生物学的利用能及びサイレンシング活性を評価するため、角膜上皮に特異的にホタルルシフェラーゼを発現させるように（内在性のＫｒｔ１２プロモーターの制御下において）、レポーターノックインマウス株（Ｋｒｔ１２＋／ｌｕｃ２）を用いた。この動物モデルは、以前に報告されたようにＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドから開発され、レポーター遺伝子発現モニタリングを用いるｓｉＲＮＡ送達方法のインビボ評価において信頼できるモデルを提供する。インビボのイメージングのため、約１．５Ｌ／ｍｉｎの酸素流中で１．５～２％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、英国）を用いてマウスに麻酔した。ｓｉＧｌｏの蛍光を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ３．２ソフトウェアと共にＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳスペクトルによって（両方ともＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、英国）、ＤｓＲｅｄフィルターの組合せを用いて（励起５３５ｎｍ、吸収５７０ｎｍ）、局所適用後の所定の時点において、検出した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定するため、Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓゲル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、英国）と１：１ｗ／ｗで混合したルシフェリン（３０ｍｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を、イメージング直前に麻酔したマウスの眼に点眼した。生物発光の読み取りを、ＩＶＩＳスペクトルによって約１０分にわたって行って、信号が取得時間内で安定に保たれていることを確認した後、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを用いて定量化した。信号強度の定量化のため、対象領域（ＲＯＩ）を各眼において別々に選択し、実験を通してＲＯＩパラメーター（寸法及び形状）を一定に保った。スプリットボディコントロール測定方法（ｓｐｌｉｔ ｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｒｅｇｉｍｅ）を用いて、値を右眼／左眼の比（ＲＥ／ＬＥ）として表す。
【0105】
（インビボのｓｉＲＮＡ処置）
実験を、一方の眼における試験の処置を同じ動物の他方の眼における負のコントロールと比較することによって、スプリットボディコントロールを用いて行った。処置の間、マウスに上述のように麻酔した。２：１のＳｉＮＰ対ｍＲＮＡ重量比で複合させた、２５μＭのｓｉＲＮＡを含有するケイ素ナノ粒子製剤を調製し、眼に対して４μＬの総体積でインタクトな角膜に液滴として経局所で適用した。適用後、マウスをさらに１５分間麻酔したままにして、吸収させて取り込みを最大限にした。処置後、蛍光及び発光実験を以下のように行った。
実験を、一方の眼における試験の処置を同じ動物の他方の眼における負のコントロールと比較することによって、スプリットボディコントロールを用いて行った。処置の間、マウスに上述のように麻酔した。２：１のＳｉＮＰ対ｍＲＮＡ重量比で複合させた、２５μＭのｓｉＲＮＡを含有するケイ素ナノ粒子製剤を調製し、眼に対して４μＬの総体積でインタクトな角膜に液滴として経局所で適用した。適用後、マウスをさらに１５分間麻酔したままにして、吸収させて取り込みを最大限にした。処置後、蛍光及び発光実験を以下のように行った。
【0106】
（角膜へのｓｉＲＮＡ透過の評価）
ｓｉＲＮＡの角膜への送達を検討するため、インビボの蛍光研究を、ｓｉＧｌｏを含有する点眼剤を用いて野生型マウスに行った。蛍光性ｓｉＲＮＡ－ケイ素ナノ粒子製剤を右眼の上に適用し、同じ量のネイキッドｓｉＧｌｏを、各マウスの左眼にコントロールとして経局所で適用した。蛍光ライブイメージングを、ｓｉＧｌｏ適用の１５分（すなわち処置手技後直ちに）、及び３時間、６時間、及び２４時間後にＩＶＩＳスペクトルによって取得し、信号強度を、処置前に測定したバックグラウンドの蛍光（すなわち未処置の眼）に対してノーマライズし、上述のように定量化した。３時間又は２４時間のいずれかで測定を行った後、マウスを絶命させ、眼を除去し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに室温で３０分間固定し、ＰｏｌｙＦｒｅｅｚｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）に浸漬して、－８０℃で直ちに凍結した。５マイクロメートルの切片をクリオスタット（ＣＭ １８５０、Ｌｅｉｃａ）を用いて切って、ＤＡＰＩ含有封入剤（ＤＡＰＩ Ｉ、Ｖｙｓｉｓ、米国）と共にＡＰＥＳコーティングスライド（３－アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）に載せ、ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラに２０×／４０×Ｎ Ａｒｃｈｏｐｌａｎレンズを備えたＡｘｉｏＳｃｏｐｅ Ａ１顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、独国）によって、蛍光を可視化した。
ｓｉＲＮＡの角膜への送達を検討するため、インビボの蛍光研究を、ｓｉＧｌｏを含有する点眼剤を用いて野生型マウスに行った。蛍光性ｓｉＲＮＡ－ケイ素ナノ粒子製剤を右眼の上に適用し、同じ量のネイキッドｓｉＧｌｏを、各マウスの左眼にコントロールとして経局所で適用した。蛍光ライブイメージングを、ｓｉＧｌｏ適用の１５分（すなわち処置手技後直ちに）、及び３時間、６時間、及び２４時間後にＩＶＩＳスペクトルによって取得し、信号強度を、処置前に測定したバックグラウンドの蛍光（すなわち未処置の眼）に対してノーマライズし、上述のように定量化した。３時間又は２４時間のいずれかで測定を行った後、マウスを絶命させ、眼を除去し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに室温で３０分間固定し、ＰｏｌｙＦｒｅｅｚｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）に浸漬して、－８０℃で直ちに凍結した。５マイクロメートルの切片をクリオスタット（ＣＭ １８５０、Ｌｅｉｃａ）を用いて切って、ＤＡＰＩ含有封入剤（ＤＡＰＩ Ｉ、Ｖｙｓｉｓ、米国）と共にＡＰＥＳコーティングスライド（３－アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）に載せ、ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃカメラに２０×／４０×Ｎ Ａｒｃｈｏｐｌａｎレンズを備えたＡｘｉｏＳｃｏｐｅ Ａ１顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、独国）によって、蛍光を可視化した。
【0107】
（ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの評価）
ルシフェラーゼレポーターマウス（ｎ＝７）を用いて、本発明のケイ素ナノ粒子によって局所送達した後の角膜におけるｓｉＲＮＡの生物学的利用能を測定した。スプリットボディコントロール実験において、ケイ素ナノ粒子製剤と複合させたルシフェラーゼ標的ｓｉＬｕＣを、麻酔したマウスの右眼（ＲＥ）のインタクトな角膜に液滴として経局所で適用したが、左眼（ＬＥ）は、負のコントロールとしてケイ素ナノ粒子製剤と複合させたＮＳＣ４で対応して処置した。処置を、連続する８日間、毎日繰り返し、インビボにおける眼球の発光測定を約４～５時間後に行うようにした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現における処置の効果を、処置レジメンにおいて毎日、及び休薬期間をモニタリングするため処置の中止後さらに８日間、ルシフェラーゼ生物発光活性を測定することによって（上述のように）、判定した。各実験動物において、処置前に４日間、２４時間間隔で、眼球のルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによって、ベースラインの発光を定義した。相対的なＲＥ／ＬＥルシフェラーゼ生物発光活性を、ＩＶＩＳ ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを用いて定量化し、平均値±標準偏差としてプロットした。
ルシフェラーゼレポーターマウス（ｎ＝７）を用いて、本発明のケイ素ナノ粒子によって局所送達した後の角膜におけるｓｉＲＮＡの生物学的利用能を測定した。スプリットボディコントロール実験において、ケイ素ナノ粒子製剤と複合させたルシフェラーゼ標的ｓｉＬｕＣを、麻酔したマウスの右眼（ＲＥ）のインタクトな角膜に液滴として経局所で適用したが、左眼（ＬＥ）は、負のコントロールとしてケイ素ナノ粒子製剤と複合させたＮＳＣ４で対応して処置した。処置を、連続する８日間、毎日繰り返し、インビボにおける眼球の発光測定を約４～５時間後に行うようにした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現における処置の効果を、処置レジメンにおいて毎日、及び休薬期間をモニタリングするため処置の中止後さらに８日間、ルシフェラーゼ生物発光活性を測定することによって（上述のように）、判定した。各実験動物において、処置前に４日間、２４時間間隔で、眼球のルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによって、ベースラインの発光を定義した。相対的なＲＥ／ＬＥルシフェラーゼ生物発光活性を、ＩＶＩＳ ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを用いて定量化し、平均値±標準偏差としてプロットした。
【0108】
（統計分析）
データは、特に明記しない限り、平均±標準偏差として示されており、少なくとも３つの独立した測定を表す。一元配置又は二元配置分散分析、その後の９５％信頼水準におけるテューキーのＨＳＤポストホック検定によって、統計的有意性を評価した。インビトロのデュアルルシフェラーゼアッセイでは、ノックダウンレベルを分析するため各製剤に別々に、両側スチューデントｔ検定を行った（ｓｉＬｕｃ対ＮＳＣ４コントロール）。インビボのルシフェラーゼ実験では、処置開始前の最初の４日における７匹すべてのマウスの平均の右／左の比（ベースラインとして設定）を、その後の日において測定した右／左の比と比較することによって、統計分析を行った。 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）を用いて統計分析を行った。
データは、特に明記しない限り、平均±標準偏差として示されており、少なくとも３つの独立した測定を表す。一元配置又は二元配置分散分析、その後の９５％信頼水準におけるテューキーのＨＳＤポストホック検定によって、統計的有意性を評価した。インビトロのデュアルルシフェラーゼアッセイでは、ノックダウンレベルを分析するため各製剤に別々に、両側スチューデントｔ検定を行った（ｓｉＬｕｃ対ＮＳＣ４コントロール）。インビボのルシフェラーゼ実験では、処置開始前の最初の４日における７匹すべてのマウスの平均の右／左の比（ベースラインとして設定）を、その後の日において測定した右／左の比と比較することによって、統計分析を行った。 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）を用いて統計分析を行った。
【0109】
（結果）
（ケイ素に基づくｓｉＲＮＡ送達システムの特徴）
本発明のケイ素ナノ粒子送達システムの２つの変異形（ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇ）を、核酸送達に一般に用いられるカチオン性脂質、ステアリルアミン及びＤＣ－コレステロールでケイ素を表面機能化することによって製剤化し、約３５０ｎｍの同様の流体力学的寸法及び比較される正のゼータ電位値を有するハイブリッド粒子を得た。ゲル電気泳動法によって検討した、カチオン性ケイ素ナノ粒子製剤のｓｉＲＮＡとの複合化は、２：１の最小ＳｉＮＰ－ｓｉＲＮＡｗ／ｗ比で、核酸の完全な封入を示した。種々のｗ／ｗ比における複合化ｓｉＲＮＡのパーセンテージを、分光光度法によって測定し、担体に付加したｓｉＲＮＡ量と粒子分離後の溶液中のｓｉＲＮＡ濃度との差から計算した。ステアリルアミンで機能化した粒子と比較して、カチオン性コレステロール誘導体を含有するナノ粒子との複合化において、ｓｉＲＮＡ封入のより高い効率を観察した。しかしながら、両方の変異形は、１ｍｇのケイ素ナノ粒子あたり１３～４８ｎｍｏｌの範囲のｓｉＲＮＡロード能力を示した。上述のｓｉＲＮＡロード研究の後、すべてのさらなる実験のため、２：１のＳｉＮＰ／ｓｉＲＮＡの固定比を選んだ。
（ケイ素に基づくｓｉＲＮＡ送達システムの特徴）
本発明のケイ素ナノ粒子送達システムの２つの変異形（ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇ）を、核酸送達に一般に用いられるカチオン性脂質、ステアリルアミン及びＤＣ－コレステロールでケイ素を表面機能化することによって製剤化し、約３５０ｎｍの同様の流体力学的寸法及び比較される正のゼータ電位値を有するハイブリッド粒子を得た。ゲル電気泳動法によって検討した、カチオン性ケイ素ナノ粒子製剤のｓｉＲＮＡとの複合化は、２：１の最小ＳｉＮＰ－ｓｉＲＮＡｗ／ｗ比で、核酸の完全な封入を示した。種々のｗ／ｗ比における複合化ｓｉＲＮＡのパーセンテージを、分光光度法によって測定し、担体に付加したｓｉＲＮＡ量と粒子分離後の溶液中のｓｉＲＮＡ濃度との差から計算した。ステアリルアミンで機能化した粒子と比較して、カチオン性コレステロール誘導体を含有するナノ粒子との複合化において、ｓｉＲＮＡ封入のより高い効率を観察した。しかしながら、両方の変異形は、１ｍｇのケイ素ナノ粒子あたり１３～４８ｎｍｏｌの範囲のｓｉＲＮＡロード能力を示した。上述のｓｉＲＮＡロード研究の後、すべてのさらなる実験のため、２：１のＳｉＮＰ／ｓｉＲＮＡの固定比を選んだ。
【0110】
ナノ粒子の物理化学的特性は薬剤送達に重要な役割を果たすので、ｓｉＲＮＡロード複合体の粒子径及び表面電荷を測定した。ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇは、空の担体及びロードした担体を比較したとき、寸法及びゼータ電位において有意差を示さなかったが、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇは、ｓｉＲＮＡと複合化したとき、平均粒子径の増加及び負の表面電荷を示し、ハイブリッド粒子表面における核酸分子の吸収とともに、ｓｉＲＮＡの内部封入を示唆した（以下の表を参照）。この研究において検討した製剤を、特にｓｉＲＮＡ送達のために設計された、市販される脂質に基づく担体である、遺伝子サイレンシングの至適基準のリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸと比較した。また、空及びｓｉＲＮＡロードのＲＮＡｉＭＡＸのゼータサイザー分析は、核酸との複合化後の、粒子径の増大、及び表面電荷の正の値から負の値への逆転を示した。
表７は、粒子特性の特徴を示す。
表７は、粒子特性の特徴を示す。
【表7】
【0111】
測定をヌクレアーゼ非含有水中で行った。データは平均±標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【0112】
（インビトロにおける角膜細胞へのｓｉＲＮＡ送達の評価）
最初のインビトロにおけるスクリーニングのため、ヒト角膜上皮細胞株（ＨＣＥ－Ｓ）を用いて、細胞毒性の可能性と共に、細胞遺伝子導入における本発明のケイ素ナノ粒子送達システムの効果を評価した。遺伝子導入効率を、担体システムにロードした蛍光オリゴヌクレオチド２本鎖による処置の２４時間後に行ったフローサイトメトリー分析によって定量化した。図８が参照される。ＲＮＡｉＭＡＸ試薬で観察された８４±１％のＦＡＭ陽性細胞と比較して、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇは５５±２％のＦＡＭ陽性細胞を示し、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇは６５±６％のＦＡＭ陽性細胞を示した。
最初のインビトロにおけるスクリーニングのため、ヒト角膜上皮細胞株（ＨＣＥ－Ｓ）を用いて、細胞毒性の可能性と共に、細胞遺伝子導入における本発明のケイ素ナノ粒子送達システムの効果を評価した。遺伝子導入効率を、担体システムにロードした蛍光オリゴヌクレオチド２本鎖による処置の２４時間後に行ったフローサイトメトリー分析によって定量化した。図８が参照される。ＲＮＡｉＭＡＸ試薬で観察された８４±１％のＦＡＭ陽性細胞と比較して、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇは５５±２％のＦＡＭ陽性細胞を示し、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇは６５±６％のＦＡＭ陽性細胞を示した。
【0113】
遺伝子導入後の細胞生存度を、膜破壊の一般的指標であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色に基づいて評価した。これは、リポフェクタミンと対照的に、ケイ素ナノ粒子製剤が角膜上皮細胞に十分に許容されることを示した。図９が参照される。リポフェクタミンは、インビトロにおける外因性核酸の細胞への送達に極めて有効であるにもかかわらず、臨床における用途に適切でない。リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを遺伝子導入した細胞の５０％を超えるものが、膜の損傷、及び膜不透過ＰＩ色素の内部移行を示すが、ケイ素ナノ粒子製剤での処置後、８６％及び９８％を超えるインタクトな細胞が観察された。
【0114】
ｓｉＲＮＡの生物学的利用能を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて遺伝子発現研究において評価した。ケイ素に基づく送達システムと複合させた０．１μＭのｓｉＬｕｃでＨＣＥ－Ｓ細胞を処理した後、それぞれＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇにおいて、４６±５％（ｐ＜０．０１、ｓｉＬｕｃ対ＮＳＣ４コントロール）及び３８±８％（ｐ＜０．０１）のノックダウンを得たが、ＲＮＡｉＭＡＸに遺伝子導入したｓｉＬｕｃは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を６６±９％低下させた（ｐ＜０．００１）。図１０が参照される。このように、ケイ素ナノ粒子送達システムは、安全であり、細胞に十分に許容されながら、市販のｓｉＲＮＡ遺伝子導入試薬の効力の最大７０％を示した。
【0115】
（局所のケイ素ナノ粒子製剤によるインビボの眼球におけるｓｉＲＮＡ送達の評価）
インビトロにおける正常なｓｉＲＮＡ送達及び遺伝子ノックダウンを示した後、２つのケイ素ナノ粒子製剤（ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇ）を前眼部への局所投与についてインビボで評価した。まず、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇを、蛍光ｓｉＧｌｏと複合し、ネイキッドｓｉＧｌｏコントロールを反対の眼に滴下する片側の処置の後、野生型マウスに点眼剤として適用した。眼球の蛍光性を、インビボのイメージングシステムを用いて２４時間までモニタリングした。第１の測定を、マウスがなお処置後の麻酔状態にある、投与の１５分後に行い、その後の測定を投与後３時間、６時間、及び２４時間で繰り返した。等しい量のｓｉＧｌｏを各眼に経局所で適用したが、１５分後に測定した、最も高い蛍光強度は、ＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇでの処置において観察し、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇではわずかに少なく、ネイキッドｓｉＧｌｏでは２倍少ない（ｐ＜０．０５）。図１１が参照される。これは、ネイキッドオリゴヌクレオチドと比較して、製剤化した薬剤の眼球表面付着性の増大、及び、２つのケイ素ナノ粒子製剤における滞留時間の向上を示した。３時間後、インビボの蛍光信号は、ｓｉＧｌｏ－ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇで処置した眼において３倍低下したが、能動的な眼球のクリアランス機構のため、ｓｉＧｌｏ－ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及び未製剤化のｓｉＧｌｏの点眼剤ではベースライン水準に戻った。インビボの信号強度におけるさらなる緩やかな低下が観察されたが、ｓｉＧｌｏ－ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇで処置した眼における蛍光性は、２４時間まで持続し、すべての時点において未製剤化のネイキッドｓｉＧｌｏで処置した眼のものよりも有意に高かった（３時間及び６時間においてｐ＜０．０１、並びに２４時間においてｐ＜０．０５）。これは、経局所で投与した、本発明のケイ素ナノ粒子と共に製剤化したｓｉＲＮＡ薬剤の有効な取り込みを示唆する。ナノ粒子の組織への浸透を検証するため、角膜層におけるｓｉＲＮＡの分布を、処置後の角膜切片の蛍光顕微鏡観察によって検討した。赤色のｓｉＧｌｏ蛍光を、点眼剤適用の３時間後に採取した、ＰｒｏＳｉｌｉｃで処置した眼のすべての切片において、すべての角膜層にわたり検出したが、ネイキッドｓｉＧｌｏのコントロールにおいて、バックグランドを超える蛍光は観察されなかった。ｓｉＲＮＡ製剤投与の２４時間後に、蛍光は、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇで処置した角膜切片においてのみ観察された。
インビトロにおける正常なｓｉＲＮＡ送達及び遺伝子ノックダウンを示した後、２つのケイ素ナノ粒子製剤（ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇ）を前眼部への局所投与についてインビボで評価した。まず、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及びＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇを、蛍光ｓｉＧｌｏと複合し、ネイキッドｓｉＧｌｏコントロールを反対の眼に滴下する片側の処置の後、野生型マウスに点眼剤として適用した。眼球の蛍光性を、インビボのイメージングシステムを用いて２４時間までモニタリングした。第１の測定を、マウスがなお処置後の麻酔状態にある、投与の１５分後に行い、その後の測定を投与後３時間、６時間、及び２４時間で繰り返した。等しい量のｓｉＧｌｏを各眼に経局所で適用したが、１５分後に測定した、最も高い蛍光強度は、ＳＩＳ００５－ＤＣＳ６１３Ｇでの処置において観察し、ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇではわずかに少なく、ネイキッドｓｉＧｌｏでは２倍少ない（ｐ＜０．０５）。図１１が参照される。これは、ネイキッドオリゴヌクレオチドと比較して、製剤化した薬剤の眼球表面付着性の増大、及び、２つのケイ素ナノ粒子製剤における滞留時間の向上を示した。３時間後、インビボの蛍光信号は、ｓｉＧｌｏ－ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇで処置した眼において３倍低下したが、能動的な眼球のクリアランス機構のため、ｓｉＧｌｏ－ＳＩＳ００５－ＰＳ９１Ｇ及び未製剤化のｓｉＧｌｏの点眼剤ではベースライン水準に戻った。インビボの信号強度におけるさらなる緩やかな低下が観察されたが、ｓｉＧｌｏ－ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇで処置した眼における蛍光性は、２４時間まで持続し、すべての時点において未製剤化のネイキッドｓｉＧｌｏで処置した眼のものよりも有意に高かった（３時間及び６時間においてｐ＜０．０１、並びに２４時間においてｐ＜０．０５）。これは、経局所で投与した、本発明のケイ素ナノ粒子と共に製剤化したｓｉＲＮＡ薬剤の有効な取り込みを示唆する。ナノ粒子の組織への浸透を検証するため、角膜層におけるｓｉＲＮＡの分布を、処置後の角膜切片の蛍光顕微鏡観察によって検討した。赤色のｓｉＧｌｏ蛍光を、点眼剤適用の３時間後に採取した、ＰｒｏＳｉｌｉｃで処置した眼のすべての切片において、すべての角膜層にわたり検出したが、ネイキッドｓｉＧｌｏのコントロールにおいて、バックグランドを超える蛍光は観察されなかった。ｓｉＲＮＡ製剤投与の２４時間後に、蛍光は、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇで処置した角膜切片においてのみ観察された。
【0116】
インビボにおける取り込みの研究の後、ＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３ＧによるｓｉＲＮＡ送達を、ルシフェラーゼ発現を角膜上皮のみに限定したマウスレポーターモデルを用いて機能アッセイにおいてさらに検討した。インビボの処置の前に、レポーターマウスにおける基底角膜ルシフェラーゼ活性を、４日間２４時間毎に定量化して、スプリットボディコントロール実験における一貫した右対左の比を確認した。ｓｉＬｕｃ又はコントロールｓｉＲＮＡと複合させたＳＩＳ００５－ＤＳＣ６１３Ｇを、１日毎に８回、同じ動物の反対の眼に点眼剤として経局所で適用し、角膜ルシフェラーゼ発現を、処置レジメンにおいて及びその後の８日において、生動物イメージングによって毎日評価した。ルシフェラーゼ発現の低下が、処置開始の２４時間内に観察され、最大の阻害（４１％±１３、ｐ＜０．００１）を１１日目に得た。有意な遺伝子サイレンシング作用が処置レジメン全体にわたって持続し、処置終了後に４日間続いた。予想されるように、眼球の生物発光レベル低下は、処置停止後に緩やかにベースラインに戻り、これは遺伝子抑制からの正常な回復を示すものであった。これらの結果について図１２及び図１３が参照される。重要な点として、肉眼による処置した目の検査、及び局所処置後の毎日の動物の目視検査により、点眼剤からの有害作用は示されず、ケイ素ナノ粒子製剤がインビボにおいて十分に許容されるものであることを示唆した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
