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特開2024-170428グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024170428
(43)【公開日】2024-12-10
(54)【発明の名称】グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241203BHJP
C07K 14/475 20060101ALI20241203BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20241203BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/14 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241203BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241203BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241203BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20241203BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241203BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20241203BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241203BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241203BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20241203BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241203BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20241203BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241203BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241203BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20241203BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241203BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241203BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20241203BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20241203BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20241203BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/475 ZNA
C07K14/47
C07K14/765
C12N15/12
C12N15/14
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61P3/04
A61P3/10
A61P3/06
A61P9/10 101
A61P13/12
A61P9/12
A61P9/00
A61P19/10
A61P29/00
A61P1/16
A61P17/04
A61P17/00
A61P43/00 111
A61K47/65
A61K38/18
A61K38/22
C07K14/475
C07K19/00 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024135217
(22)【出願日】2024-08-14
(62)【分割の表示】P 2021546056の分割
【原出願日】2019-10-22
(31)【優先権主張番号】62/748,603
(32)【優先日】2018-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】510020022
【氏名又は名称】ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ランキン，マシュー エム．
(72)【発明者】
【氏名】リン－シュミット，シェファン
(72)【発明者】
【氏名】ファン，チチ
(72)【発明者】
【氏名】ファーマン，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】ジェン，ソンマオ
(72)【発明者】
【氏名】ラングワラ，シャミナ
(72)【発明者】
【氏名】ネルソン，セレーナ エム．
(72)【発明者】
【氏名】マリカン，シャノン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】それぞれＧＬＰ１又はＧＤＦ１５に比べて改善された代謝安定性及び薬物動態プロファイルを有するＧＬＰ１アナログ若しくはその誘導体及び／又はＧＤＦ１５アナログ若しくはその誘導体を提供する。
【解決手段】グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチドと、第１のリンカーペプチドと、血清アルブミンタンパク質と、第２のリンカーペプチドと、ＧＤＦ１５タンパク質と、を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチドと、第１のリンカーペプチドと、血清アルブミンタンパク質と、第２のリンカーペプチドと、ＧＤＦ１５タンパク質と、を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパ
ク質であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチドと、第１
のリンカーペプチドと、血清アルブミンタンパク質と、第２のリンカーペプチドと、ＧＤ
Ｆ１５タンパク質と、を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
ク質であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチドと、第１
のリンカーペプチドと、血清アルブミンタンパク質と、第２のリンカーペプチドと、ＧＤ
Ｆ１５タンパク質と、を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
【請求項2】
ＧＬＰ１ペプチドが、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
【請求項3】
前記第１のリンカーペプチドが、配列番号５～２５からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
【請求項4】
前記血清アルブミンタンパク質が、配列番号２６又は配列番号２７から選択されるアミ
ノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
ノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
【請求項5】
前記第２のリンカーペプチドが、配列番号２８～３０からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号３１又は配列番号３２から選択されるアミノ酸
配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
【請求項7】
前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が、配列番号３３～７４及び８４からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質。
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質。
【請求項8】
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする、単離核酸。
【請求項9】
請求項８に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項10】
請求項８に記載の単離核酸又は請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項11】
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質と、医薬上許容できる担体と、
を含む、医薬組成物。
を含む、医薬組成物。
【請求項12】
疾患又は障害を治療又は予防することを、それを必要とする対象において行う方法であ
って、前記疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、
インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、
先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、
糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する
高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性
脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿
疹からなる群から選択され、前記方法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、そ
れを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
って、前記疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、
インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、
先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、
糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する
高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性
脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿
疹からなる群から選択され、前記方法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、そ
れを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項13】
食物摂取を低減することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方
法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与する
ことを含む、方法。
法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与する
ことを含む、方法。
【請求項14】
ＧＬＰ１受容体活性を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であっ
て、前記方法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象
に投与することを含む、方法。
て、前記方法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象
に投与することを含む、方法。
【請求項15】
ＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）活性を調節することを、それを必要とする対象におい
て行う方法であって、前記方法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必
要とする前記対象に投与することを含む、方法。
て行う方法であって、前記方法は、有効量の請求項１１に記載の医薬組成物を、それを必
要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項16】
前記医薬組成物が注射により投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、請求項８に記載の単離核酸、
及び／又は請求項９に記載のベクターを含む、キット。
及び／又は請求項９に記載のベクターを含む、キット。
【請求項18】
前記キットが注射用デバイスを更に含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項19】
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を含む医薬組成物を生成する方
法であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を医薬上許容できる担体と組み合
わせて前記医薬組成物を得ることを含む、方法。
法であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を医薬上許容できる担体と組み合
わせて前記医薬組成物を得ることを含む、方法。
【請求項20】
請求項１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する方法であって、前記
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成するための条件下で前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、前記細胞又は培養物か
ら前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成するための条件下で前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、前記細胞又は培養物か
ら前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年１０月２２日出願の米国特許仮出願第６２／７８４，６０３号の
優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１０月２２日出願の米国特許仮出願第６２／７８４，６０３号の
優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本発明は、概して、新規グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（
ＧＤＦ１５）融合タンパク質を対象とする。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、Ｇ
ＬＰ１Ｒ及び／又はＧＤＦ１５Ｒを調節する。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方
法に関する。新規ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、とりわけ、肥満、２型糖尿病
、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症などの疾患及び障害を
予防する、治療する、又は寛解させるのに有用である。
本発明は、概して、新規グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（
ＧＤＦ１５）融合タンパク質を対象とする。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、Ｇ
ＬＰ１Ｒ及び／又はＧＤＦ１５Ｒを調節する。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方
法に関する。新規ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、とりわけ、肥満、２型糖尿病
、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症などの疾患及び障害を
予防する、治療する、又は寛解させるのに有用である。
【0003】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＰＲＤ３４７４配列表」及び２０１９年１０月１４日の作成日
で、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、３２７ｋ
ｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細
書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「ＰＲＤ３４７４配列表」及び２０１９年１０月１４日の作成日
で、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、３２７ｋ
ｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細
書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
ＴＧＦβファミリーのメンバーであるＧＤＦ１５は、２５ｋＤａホモ二量体として血漿
中で循環し、脳幹発現受容体ＧＦＲＡＬとの相互作用を通じてその生物学的機能を引き出
す分泌タンパク質である（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２３：１
１５０－７（２０１７）、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２３：１１５８－
６６（２０１７），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１
７），Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１２１５－９（２０１
７））。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は多くの個人で１５０～１１５０ｐｇ／ｍＬの範囲であ
る（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃ
ｌｅ．３：２３９－４３（２０１２））。ＧＤＦ１５の高い血漿中濃度は、癌における食
欲不振及び悪液質による体重減少、また腎不全及び心不全における体重減少と関連してい
る。更に、ＧＤＦ１５は、Ｒｏｕｘ－ｅｎ－Ｙ胃バイパス（ＲＹＧＢ）手術後の体重減少
を経験している患者において増加する（Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ
５７：３０９－１６（２０１１））。
中で循環し、脳幹発現受容体ＧＦＲＡＬとの相互作用を通じてその生物学的機能を引き出
す分泌タンパク質である（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２３：１
１５０－７（２０１７）、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２３：１１５８－
６６（２０１７），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１
７），Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１２１５－９（２０１
７））。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は多くの個人で１５０～１１５０ｐｇ／ｍＬの範囲であ
る（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃ
ｌｅ．３：２３９－４３（２０１２））。ＧＤＦ１５の高い血漿中濃度は、癌における食
欲不振及び悪液質による体重減少、また腎不全及び心不全における体重減少と関連してい
る。更に、ＧＤＦ１５は、Ｒｏｕｘ－ｅｎ－Ｙ胃バイパス（ＲＹＧＢ）手術後の体重減少
を経験している患者において増加する（Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ
５７：３０９－１６（２０１１））。
【0005】
体重減少とＧＤＦ１５との間の相関関係は、げっ歯類で保存されている。ＧＤＦ１５の
過剰発現は、食物摂取の減少、体重の低下をもたらし、高脂肪食給餌にあたり、マウスを
肥満、脂肪肝、及び耐糖能障害から保護する（Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅ
ｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３１：１５５３－６０（２００６），Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２００７），Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ３８：１５５５－６４（２０１４），Ｍａ
ｃｉａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３４８６８（２０１２），Ｊｏｎｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１５２２－３０（２０１８），Ｘｉ
ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。ＧＤ
Ｆ１５でトランスフェクトされた前立腺腫瘍細胞の異種移植片も、食物摂取及び体重を減
少させる（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２０
０７））。反対に、数多くの研究者は、ＧＤＦ１５を欠損したマウスがより体重を増加さ
せ、野生型動物よりも大きい脂肪量を有することを報告している（Ｓｔｒｅｌａｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２９：１３６４０－８（２００９），Ｃａｓａｎｏｖ
ａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９８：４４４－７（２０１３），Ｂ
ｏｎａｔｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍｅｒ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ １：ｅ００
２５５０（２０１２），Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ．８：ｅ５５１７４
（２０１３））。
過剰発現は、食物摂取の減少、体重の低下をもたらし、高脂肪食給餌にあたり、マウスを
肥満、脂肪肝、及び耐糖能障害から保護する（Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅ
ｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３１：１５５３－６０（２００６），Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２００７），Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ３８：１５５５－６４（２０１４），Ｍａ
ｃｉａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３４８６８（２０１２），Ｊｏｎｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１５２２－３０（２０１８），Ｘｉ
ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。ＧＤ
Ｆ１５でトランスフェクトされた前立腺腫瘍細胞の異種移植片も、食物摂取及び体重を減
少させる（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２０
０７））。反対に、数多くの研究者は、ＧＤＦ１５を欠損したマウスがより体重を増加さ
せ、野生型動物よりも大きい脂肪量を有することを報告している（Ｓｔｒｅｌａｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２９：１３６４０－８（２００９），Ｃａｓａｎｏｖ
ａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９８：４４４－７（２０１３），Ｂ
ｏｎａｔｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍｅｒ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ １：ｅ００
２５５０（２０１２），Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ．８：ｅ５５１７４
（２０１３））。
【0006】
薬理学的に投与されたＧＤＦ１５がエネルギー摂取を減少させ、それによって体重減少
を誘発する可能性は、マウス、ラット、及びサルにおいて実証されている。組換えＧＤＦ
１５を投与した非肥満マウスは、食べる量が減り、体重が減少する（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２００７），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１７），Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７），Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ
Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ４２：５６１－７１（２０１８））。食物摂取及び体重の減少は、
ＧＤＦ１５の投与後の遺伝的及び食餌誘導性肥満ラット及びマウスモデルでも観察されて
いる（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２００７
），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１７），Ｍｕｌｌ
ｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７），Ｙａｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５８－６６（２０１７），Ｔｓａｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ４２：５６１－７１（２０１８），Ｘｉｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。食餌誘導性
肥満マウスにおけるＧＤＦ１５投与を介した体重減少は、グルコース恒常性の強化並びに
血漿トリグリセリド及びコレステロールの低下を含む代謝改善をもたらす。これらの効果
は、自然発症肥満非ヒト霊長類における組換えヒトＧＤＦ１５を用いた６週間の毎日投与
レジメンが食物摂取、体重、及び血漿中トリグリセリド濃度を減少させ、耐糖能を改善し
たことから、より高い種にも当てはまる（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎ
ｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。更に、組換えＧＤＦ１５の半減期は、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）との融合によって延長されることが以前に実証されており、ヒトへ
の週１回投与に適した治療薬となることが予測される（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７）及び米国特許公開第２０１７／０３
２７５６０号）。
を誘発する可能性は、マウス、ラット、及びサルにおいて実証されている。組換えＧＤＦ
１５を投与した非肥満マウスは、食べる量が減り、体重が減少する（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２００７），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１７），Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７），Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ
Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ４２：５６１－７１（２０１８））。食物摂取及び体重の減少は、
ＧＤＦ１５の投与後の遺伝的及び食餌誘導性肥満ラット及びマウスモデルでも観察されて
いる（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０（２００７
），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１７），Ｍｕｌｌ
ｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７），Ｙａｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５８－６６（２０１７），Ｔｓａｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ４２：５６１－７１（２０１８），Ｘｉｏｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。食餌誘導性
肥満マウスにおけるＧＤＦ１５投与を介した体重減少は、グルコース恒常性の強化並びに
血漿トリグリセリド及びコレステロールの低下を含む代謝改善をもたらす。これらの効果
は、自然発症肥満非ヒト霊長類における組換えヒトＧＤＦ１５を用いた６週間の毎日投与
レジメンが食物摂取、体重、及び血漿中トリグリセリド濃度を減少させ、耐糖能を改善し
たことから、より高い種にも当てはまる（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎ
ｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。更に、組換えＧＤＦ１５の半減期は、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）との融合によって延長されることが以前に実証されており、ヒトへ
の週１回投与に適した治療薬となることが予測される（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７）及び米国特許公開第２０１７／０３
２７５６０号）。
【0007】
ＧＬＰ１は、同じく食物摂取を減少させ、体重減少をもたらす、腸内分泌細胞に由来す
るペプチドホルモンである。この機能は、中枢神経系内のＧＬＰ１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）
との相互作用によって媒介され、末梢組織におけるこのリガンド／受容体相互作用は、グ
ルコース刺激インスリン分泌の増強、グルカゴン放出の抑制、及び胃内容物排出の遅延を
含む更なる生物学的効果を有する（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔ ２７
：７４０－５６（２０１８））。これらの生物学的効果の全てを活用すると、ＧＬＰ１Ｒ
アゴニストは、ヒトにおけるグルコース恒常性を改善し、体重減少を促進する。加えて、
ＧＬＰ１Ｒアゴニストの投与は、糖尿病患者における心血管転帰を著しく改善することが
報告されているが、正確な機構はまだ決定されていない（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２９：２３８－４８（２０１８））。ＧＬ
Ｐ１Ｒアゴニスト作用物質は、酵素的開裂を防止するための修飾を有する天然ヒトＧＬＰ
１又はエキセンディン－４（アメリカドクトカゲの唾液から単離されたペプチド）のいず
れかに基づくペプチド配列である。ＧＬＰ１Ｒアゴニストは、脂質化、抗体Ｆｃ又はヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）などの半減期を延長するプラットフォームを介して送達され得
る（Ｃｈｅａｎｇ ａｎｄ Ｍｏｙｌｅ，Ｃｈｅｍ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：６６２－
７１（２０１８））。
るペプチドホルモンである。この機能は、中枢神経系内のＧＬＰ１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）
との相互作用によって媒介され、末梢組織におけるこのリガンド／受容体相互作用は、グ
ルコース刺激インスリン分泌の増強、グルカゴン放出の抑制、及び胃内容物排出の遅延を
含む更なる生物学的効果を有する（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔ ２７
：７４０－５６（２０１８））。これらの生物学的効果の全てを活用すると、ＧＬＰ１Ｒ
アゴニストは、ヒトにおけるグルコース恒常性を改善し、体重減少を促進する。加えて、
ＧＬＰ１Ｒアゴニストの投与は、糖尿病患者における心血管転帰を著しく改善することが
報告されているが、正確な機構はまだ決定されていない（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２９：２３８－４８（２０１８））。ＧＬ
Ｐ１Ｒアゴニスト作用物質は、酵素的開裂を防止するための修飾を有する天然ヒトＧＬＰ
１又はエキセンディン－４（アメリカドクトカゲの唾液から単離されたペプチド）のいず
れかに基づくペプチド配列である。ＧＬＰ１Ｒアゴニストは、脂質化、抗体Ｆｃ又はヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）などの半減期を延長するプラットフォームを介して送達され得
る（Ｃｈｅａｎｇ ａｎｄ Ｍｏｙｌｅ，Ｃｈｅｍ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：６６２－
７１（２０１８））。
【0008】
したがって、それぞれＧＬＰ１又はＧＤＦ１５に比べて改善された代謝安定性及び薬物
動態プロファイルを有するＧＬＰ１アナログ若しくはその誘導体及び／又はＧＤＦ１５ア
ナログ若しくはその誘導体を得ることが望ましい。このような誘導体は、より長い作用持
続時間を有するＧＤＦ１受容体及びＧＤＦ１５受容体の調節を提供し、そのような調節を
必要とする対象の治療薬として好適であろう。
動態プロファイルを有するＧＬＰ１アナログ若しくはその誘導体及び／又はＧＤＦ１５ア
ナログ若しくはその誘導体を得ることが望ましい。このような誘導体は、より長い作用持
続時間を有するＧＤＦ１受容体及びＧＤＦ１５受容体の調節を提供し、そのような調節を
必要とする対象の治療薬として好適であろう。
【0009】
前述の議論は、単に当該技術分野に直面する問題の性質のより良い理解を提供するため
に提示されており、かかる参照が本出願の「先行技術」を構成することを容認するものと
して解釈されるべきではない。
に提示されており、かかる参照が本出願の「先行技術」を構成することを容認するものと
して解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
一般的な一態様では、本発明は、新規グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分
化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質に関する。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質は、ＧＬＰ１Ｒ及び／又はＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）を調節する。
化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質に関する。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質は、ＧＬＰ１Ｒ及び／又はＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）を調節する。
【0011】
本明細書では、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（ＧＤＦ１
５）融合タンパク質が提供される。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペ
プチド、第１のリンカーペプチド、血清アルブミンタンパク質、第２のリンカーペプチド
、及びＧＤＦ１５タンパク質を含む。
５）融合タンパク質が提供される。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペ
プチド、第１のリンカーペプチド、血清アルブミンタンパク質、第２のリンカーペプチド
、及びＧＤＦ１５タンパク質を含む。
【0012】
特定の実施形態では、ＧＬＰ１ペプチドは、配列番号１～４からなる群から選択される
アミノ酸配列を含む。
アミノ酸配列を含む。
【0013】
特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、配列番号５～２５からなる群から選
択されるアミノ酸配列を含む。
択されるアミノ酸配列を含む。
【0014】
特定の実施形態では、血清アルブミンタンパク質は、配列番号２６又は配列番号２７か
ら選択されるアミノ酸配列を含む。
ら選択されるアミノ酸配列を含む。
【0015】
特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、配列番号２８～３０からなる群から
選択されるアミノ酸配列を含む。
選択されるアミノ酸配列を含む。
【0016】
特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号３１又は配列番号３２から選
択されるアミノ酸配列を含む。
択されるアミノ酸配列を含む。
【0017】
特定の実施形態では、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、配列番号３３～７４及
び８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
び８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0018】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする単離核酸も提供される。本
発明の単離核酸を含むベクターも提供される。本発明の単離核酸又は本発明のベクターを
含む宿主細胞も提供される。
発明の単離核酸を含むベクターも提供される。本発明の単離核酸又は本発明のベクターを
含む宿主細胞も提供される。
【0019】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び医薬上許容できる担体を含む医薬組
成物も提供される。
成物も提供される。
【0020】
疾患又は障害を治療又は予防することを、それを必要とする対象において行う方法も提
供され、当該疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム
、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症
、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症
、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関
連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコ
ール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並
びに湿疹からなる群から選択され、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを
必要とする対象に投与することを含む。
供され、当該疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム
、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症
、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症
、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関
連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコ
ール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並
びに湿疹からなる群から選択され、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを
必要とする対象に投与することを含む。
【0021】
食物摂取を低減することを、それを必要とする対象において行う方法も提供され、この
方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0022】
ＧＬＰ１受容体活性を調節することを、それを必要とする対象において行う方法も提供
され、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するこ
とを含む。
され、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するこ
とを含む。
【0023】
ＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）活性を調節することを、それを必要とする対象におい
て行う方法も提供され、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする
対象に投与することを含む。
て行う方法も提供され、この方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする
対象に投与することを含む。
【0024】
特定の実施形態では、医薬組成物は、注射により投与される。
【0025】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、本発明の単離核酸、及び／又は本発明
のベクターを含むキットも提供される。キットは、例えば、注射用デバイスを更に含むこ
とができる。
のベクターを含むキットも提供される。キットは、例えば、注射用デバイスを更に含むこ
とができる。
【0026】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を含む医薬組成物を生成する方法も提供
される。この方法は、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を医薬上許容できる担体と組
み合わせて医薬組成物を得ることを含む。
される。この方法は、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を医薬上許容できる担体と組
み合わせて医薬組成物を得ることを含む。
【0027】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する方法も提供される。この方法
は、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する条件下で、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
タンパク質を細胞又は培養物から回収することと、を含む。
は、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する条件下で、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
タンパク質を細胞又は培養物から回収することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0028】
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せ
て読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実
施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
て読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実
施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図1】リラグルチド（ｌｉｒａ）の毎日投与及び／又はＨＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号８１）の隔日投与を受けたＤＩＯマウスにおける（０日目からの）体重変化率を実証するグラフを示す。
【図2】ＧＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７２）、ＧＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（Ｉ８９Ｒ）、（配列番号７３、Ｉ８９Ｒ変異によりＧＤＦ１５活性が失われる）、ＧＬＰ１（９－３９）－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７４、ＧＬＰ１活性を失わせる）、又はＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７５）の毎日投与を受けたＤＩＯマウスにおける（０日目からの）平均体重変化率を実証するグラフを示す。デュラグルチド投与が陽性対照となり、溶媒投与が陰性対照となった。±ＳＥＭ、ｎ＝８。
【図3】ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の概略図を示す。
【図4】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける食物摂取に対する配列番号４５、４９、５０、３３、４６、及び４４の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、２４時間での投与前の食物摂取と比較した食物摂取の変化率として提示される。
【図5】免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって決定されるように、マウスにおける投与から２４時間後のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４５、４９、５０、３３、４６、及び４４）の血漿中濃度を実証するグラフを示す。
【図6】ＧＦＲＡＬ欠損マウスにおける食物摂取に対する配列番号４５、５０、４６、及び４４の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、２４時間での無傷のＧＬＰ１アームを有する試験物品の血漿中濃度に対する、食品摂取の（溶媒投与と比較した）変化率として提示される。
【図7】ＧＦＲＡＬ欠損マウスにおける食物摂取に対する配列番号４５の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、２４時間での無傷のＧＬＰ１群を有する試験物品の血漿中濃度に対する、食品摂取の（溶媒投与と比較した）変化率として提示される。
【図8】ＧＦＲＡＬ欠損マウスにおける食物摂取に対する配列番号３３の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、２４時間での無傷のＧＬＰ１群を有する試験物品の血漿中濃度に対する、食品摂取の（溶媒投与と比較した）変化率として提示される。
【図9】マウスにおける耐糖能に対する配列番号５０、４６、及び４４の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の血漿中濃度に対する、溶媒投与と比較したデルタＡＵＣの変化率として提示される。
【図10】マウスにおける耐糖能に対する配列番号４５及び４９の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の血漿中濃度に対する、溶媒投与と比較したデルタＡＵＣの変化率として提示される。
【図11】マウスにおける耐糖能に対する配列番号３３の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の血漿中濃度に対する、溶媒投与と比較したデルタＡＵＣの変化率として提示される。
【図12】マウスにおける耐糖能に対する配列番号４５及び配列番号３６の皮下投与の効果を実証するグラフを示す。データは、無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の血漿中濃度に対する、溶媒投与と比較したデルタＡＵＣの変化率として提示される。
【図13】カニクイザルにおける段階的グルコース注入中のインスリン分泌に対する、配列番号４５及び４４の皮下投与の影響を実証するグラフを示す。データは、無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の血漿中濃度に対する、グルコースＡＵＣに正規化された（ベースラインと比較した）ＩＳＲ ＡＵＣの倍率変化として提示される。
【図14】食餌誘導性肥満マウスにおけるＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４５及び４４）の毎日皮下投与の体重減少有効性を実証するグラフを示す。データは、０日目からの体重の変化率として提示される。
【図15】免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって決定されるように、食餌誘導性肥満マウスにおける毎日投与７日後のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４５及び４４）の血漿中濃度を実証するグラフを示す。
【図16】自然発症肥満非ヒト霊長類における、ベースライン及び４週間にわたるＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４及び８３）のそれぞれのＱＷ皮下投与後の食物摂取の３日間の変化率を実証するグラフを示す。データは、個々の対象に対して提示され、それらの血漿中の検出可能なレベルの試験物品を有さないものは、ｘ軸の下に概説されるように、図に含まれない。
【図17】イムノアッセイによって決定されるように、自然発症肥満非ヒト霊長類においてＱＷで投与するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４及び８３）の濃度を変化させた４週間の投与中の全試験物品の血漿中濃度を実証するグラフを示す。データは平均（±ＳＥＭ）として提示される。
【図18】イムノアッセイによって決定されるように、自然発症肥満非ヒト霊長類においてＱＷで投与するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４）の濃度を変化させた４週間の投与中のＧＬＰ１部分含有試験物品の血漿中濃度を実証するグラフを示す。データは平均（±ＳＥＭ）として提示される。
【図19】自然発症肥満非ヒト霊長類においてＱ３Ｄで投与するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４、８３及び８４）の濃度を漸増させた２１日間の投与前、投与中、及び投与後の、絶対的な毎日の食物摂取を実証するグラフを示す。データは、群当たり１０体の対象の平均（±ＳＥＭ）として提示される。
【図20】自然発症肥満非ヒト霊長類においてＱ３Ｄで投与するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４、８３及び８４）の濃度を漸増させた２１日間の投与後の体重変化（ベースラインに対して）を実証するグラフを示す。データは、群当たり１０体の対象の平均（±ＳＥＭ）として提示される。
【図21】イムノアッセイによって決定されるように、自然発症肥満非ヒト霊長類においてＱ３Ｄで投与するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４、８３、及び８４）の濃度を漸増させた２１日間の処置中及び投与後の全試験物品の血漿中濃度を実証するグラフを示す。データは、個々の対象に対して提示される。
【図22】イムノアッセイによって決定されるように、自然発症肥満非ヒト霊長類においてＱ３Ｄで投与するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号４４及び８４）の濃度を漸増させた２１日間の投与中及び投与後のＧＬＰ１部分含有試験物品の血漿中濃度を実証するグラフを示す。データは、個々の対象に対して提示される。
【発明を実施するための形態】
【0029】
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は
記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明
細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキスト
を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又
は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するもの
ではない。
記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明
細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキスト
を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又
は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するもの
ではない。
【0030】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が
属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、
本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、
本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
【0031】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ
」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。
」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。
【0032】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、
全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべ
きである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、
１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０
％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使
用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲
内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を
明示的に含む。
全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべ
きである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、
１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０
％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使
用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲
内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を
明示的に含む。
【0033】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全て
の要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用す
るだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は
確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図さ
れる。
の要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用す
るだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は
確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図さ
れる。
【0034】
本明細書で使用されるとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」
、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（havi
ng｝」、「含有する（contains）」、又は「含有する（containing）」あるいはこれらの
任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これ
ら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であること
が意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス
、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示
的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に
本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又
は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例え
ば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない
）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並び
にＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される
。
、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（havi
ng｝」、「含有する（contains）」、又は「含有する（containing）」あるいはこれらの
任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これ
ら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であること
が意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス
、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示
的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に
本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又
は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例え
ば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない
）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並び
にＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される
。
【0035】
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、
個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つ
の要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第
１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしの第２の要素が
適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であ
ることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本
明細書で使用される用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうち
の２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれることが理解され、したがって、用語「及
び／又は」の要件を満たす。
個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つ
の要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第
１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしの第２の要素が
適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であ
ることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本
明細書で使用される用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうち
の２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれることが理解され、したがって、用語「及
び／又は」の要件を満たす。
【0036】
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」
、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記
載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、また機能的に同じ又は類似する、
それらからのわずかな相違を除外しないことを示すことも理解されたい。最小値では、数
値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的
及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用
すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記
載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、また機能的に同じ又は類似する、
それらからのわずかな相違を除外しないことを示すことも理解されたい。最小値では、数
値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的
及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用
すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【0037】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、ＧＬＰ１ペプチド、リンカーペプチド
、血清アルブミンタンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、及びペプチドをコードするポリヌ
クレオチド）に関連する、「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、以下の配
列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は本開示を考慮して当該技術分野において
既知の方法を使用した目視検査によって測定したときに、比較し、一致が最大になるよう
にアラインメントした場合、同一であるか、又は指定の割合の同一であるアミノ酸残基若
しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
、血清アルブミンタンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質、及びペプチドをコードするポリヌ
クレオチド）に関連する、「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、以下の配
列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は本開示を考慮して当該技術分野において
既知の方法を使用した目視検査によって測定したときに、比較し、一致が最大になるよう
にアラインメントした場合、同一であるか、又は指定の割合の同一であるアミノ酸残基若
しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
【0038】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として
作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入
力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパ
ラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメ
ータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入
力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパ
ラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメ
ータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0039】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａ
ｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７
０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法
、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕ
ｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏ
ｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行う
ことができる。
ｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７
０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法
、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕ
ｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏ
ｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行う
ことができる。
【0040】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それ
ぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬ
ＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工
学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入
手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワー
ドとアラインメントしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満た
すかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、
高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それ
を含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次
いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワード
ヒットを両方向に延長する。
ぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬ
ＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工
学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入
手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワー
ドとアラインメントしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満た
すかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、
高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それ
を含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次
いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワード
ヒットを両方向に延長する。
【0041】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配
列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を
参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確
率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に
生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最
小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．０
０１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を
参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確
率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に
生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最
小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．０
０１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
【0042】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記
載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコー
ドされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプ
チドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチ
ドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、
２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコー
ドされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプ
チドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチ
ドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、
２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【0043】
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ま
しくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、あらゆる哺乳
動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウ
マ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど
、より好ましくはヒトが挙げられる。
しくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、あらゆる哺乳
動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウ
マ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど
、より好ましくはヒトが挙げられる。
【0044】
本発明の方法に関して用語「投与」は、本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又は
その形態、組成物、若しくは医薬を使用することにより、本明細書に記載の症候群、障害
、又は疾患を治療的又は予防的に予防する、治療する、又は寛解させる方法を意味する。
このような方法は、有効量の当該コンジュゲート、化合物、その形態、組成物、若しくは
医薬を、組み合わせ形態で、治療過程における異なる時点で又は同時に投与することを含
む。本発明の方法は、既知の治療的処置レジメンを全て包含するものとして理解されるも
のである。
その形態、組成物、若しくは医薬を使用することにより、本明細書に記載の症候群、障害
、又は疾患を治療的又は予防的に予防する、治療する、又は寛解させる方法を意味する。
このような方法は、有効量の当該コンジュゲート、化合物、その形態、組成物、若しくは
医薬を、組み合わせ形態で、治療過程における異なる時点で又は同時に投与することを含
む。本発明の方法は、既知の治療的処置レジメンを全て包含するものとして理解されるも
のである。
【0045】
用語「有効量」は、研究者、獣医師、医師、又はその他の臨床医が探求している生物学
的又は医学的反応を組織系、動物、又はヒトにおいて惹起する（治療される症候群、障害
若しくは疾患、又は、治療される症候群、障害若しくは疾患の症状を予防する、治療する
、又は寛解させることを含む）活性コンジュゲート、化合物、又は薬剤の量を意味する。
的又は医学的反応を組織系、動物、又はヒトにおいて惹起する（治療される症候群、障害
若しくは疾患、又は、治療される症候群、障害若しくは疾患の症状を予防する、治療する
、又は寛解させることを含む）活性コンジュゲート、化合物、又は薬剤の量を意味する。
【0046】
本明細書で使用するとき、用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、並
びに、直接的又は間接的に特定の成分の特定の量の組み合わせから生じる任意の生成物を
包含するものとする。
びに、直接的又は間接的に特定の成分の特定の量の組み合わせから生じる任意の生成物を
包含するものとする。
【0047】
用語「単離（された）」は、その起源の細胞材料、細菌材料、ウイルス材料、若しくは
培養培地を実質的に含まない核酸若しくはポリペプチド（ＤＮＡ組換え技術により生成さ
れた場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学合成された場合）を指し得る
。更に、単離ポリペプチドは、単離ポリペプチドとして対象に投与され得るものを指し、
換言すれば、ポリペプチドは、カラムに被着するか又はゲル内に埋め込まれている場合、
単純に「単離された」とみなすことはできない。更に、「単離核酸フラグメント」又は「
単離ペプチド」は、フラグメントとして自然発生しない、及び／又は典型的には機能状態
にない核酸又はタンパク質フラグメントである。
培養培地を実質的に含まない核酸若しくはポリペプチド（ＤＮＡ組換え技術により生成さ
れた場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学合成された場合）を指し得る
。更に、単離ポリペプチドは、単離ポリペプチドとして対象に投与され得るものを指し、
換言すれば、ポリペプチドは、カラムに被着するか又はゲル内に埋め込まれている場合、
単純に「単離された」とみなすことはできない。更に、「単離核酸フラグメント」又は「
単離ペプチド」は、フラグメントとして自然発生しない、及び／又は典型的には機能状態
にない核酸又はタンパク質フラグメントである。
【0048】
本明細書で使用するところの「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子
」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾
ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボ
ヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではない
が、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及
び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより
典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを
含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくは
ＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドに
は、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由によ
り修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリ
チル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに
行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポ
リヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞
のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた
、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾
ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボ
ヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではない
が、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及
び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより
典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを
含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくは
ＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドに
は、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由によ
り修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリ
チル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに
行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポ
リヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞
のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた
、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【0049】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語に
は、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポ
リペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる
。発現されるポリペプチドは、宿主細胞の細胞質中、細胞培養の増殖培地などの細胞外環
境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
は、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポ
リペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる
。発現されるポリペプチドは、宿主細胞の細胞質中、細胞培養の増殖培地などの細胞外環
境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
【0050】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」
は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認
識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される
。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、結合（例えば、融合）
ペプチド／ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）を含むものを含む、任意の長さのア
ミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用され得る。ポリマーは、
直鎖又は分枝鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断
され得る。これらの用語はまた、自然に修飾された又は介入によって修飾されたアミノ酸
ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化
、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との接合などが挙げら
れる。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ
酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が
含まれる。
は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認
識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される
。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、結合（例えば、融合）
ペプチド／ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）を含むものを含む、任意の長さのア
ミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用され得る。ポリマーは、
直鎖又は分枝鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断
され得る。これらの用語はまた、自然に修飾された又は介入によって修飾されたアミノ酸
ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化
、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との接合などが挙げら
れる。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ
酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が
含まれる。
【0051】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領
域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途
明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途
明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0052】
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパ
ク質
ＧＤＦ１５及びＧＬＰ１シグナル伝達の両方は、食物摂取を低減することができるが、
これらの効果は互いに独立しているように見える。例えば、ＧＤＦ１５効果は、マウスに
おいてＧＬＰ１Ｒの非存在下で維持され、反対に、ＧＬＰ１投与は依然として、ＧＦＲＡ
Ｌの非存在下で食物摂取効果をもたらす（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０
：２５５－９（２０１７），Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：
１１５０－７（２０１７））。したがって、両方の機構を同時に標的化することは、いず
れかの機構のみよりも大きな食物摂取低減及び体重減少をもたらし得ると仮定される。ヒ
ト血清アルブミンとの融合を通してＧＤＦ１５及びＧＬＰ１アゴニストの、独立している
が相補的な薬理学を組み合わせることは、週１回の投与に好適な単一の完全組換え分子に
よって体重減少、インスリン感受性、インスリン分泌、及び心血管転帰に利益をもたらす
ことになる。このアプローチの大きな課題は、全ての所望の効果を得るのに十分な、但し
標的上の有害効果を回避する、所望のレベルで対応する受容体と会合する、バランスの取
れた様式で分子内のそれぞれのアゴニストを送達することである。このバランスは、分子
のアゴニストアームのいずれかの効力及び／又は薬物動態特性を調整することによって微
調整され得る。
ク質
ＧＤＦ１５及びＧＬＰ１シグナル伝達の両方は、食物摂取を低減することができるが、
これらの効果は互いに独立しているように見える。例えば、ＧＤＦ１５効果は、マウスに
おいてＧＬＰ１Ｒの非存在下で維持され、反対に、ＧＬＰ１投与は依然として、ＧＦＲＡ
Ｌの非存在下で食物摂取効果をもたらす（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０
：２５５－９（２０１７），Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：
１１５０－７（２０１７））。したがって、両方の機構を同時に標的化することは、いず
れかの機構のみよりも大きな食物摂取低減及び体重減少をもたらし得ると仮定される。ヒ
ト血清アルブミンとの融合を通してＧＤＦ１５及びＧＬＰ１アゴニストの、独立している
が相補的な薬理学を組み合わせることは、週１回の投与に好適な単一の完全組換え分子に
よって体重減少、インスリン感受性、インスリン分泌、及び心血管転帰に利益をもたらす
ことになる。このアプローチの大きな課題は、全ての所望の効果を得るのに十分な、但し
標的上の有害効果を回避する、所望のレベルで対応する受容体と会合する、バランスの取
れた様式で分子内のそれぞれのアゴニストを送達することである。このバランスは、分子
のアゴニストアームのいずれかの効力及び／又は薬物動態特性を調整することによって微
調整され得る。
【0053】
一般的な一態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因
子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質に関する。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は
、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド、第１のリンカーペプチド（例えば、アミノ（Ｎ
）－末端リンカー）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質、第２のリンカーペプチ
ド（例えば、カルボキシ（Ｃ）－末端リンカー）、及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体
タンパク質を含む。
子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質に関する。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は
、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド、第１のリンカーペプチド（例えば、アミノ（Ｎ
）－末端リンカー）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質、第２のリンカーペプチ
ド（例えば、カルボキシ（Ｃ）－末端リンカー）、及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体
タンパク質を含む。
【0054】
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）又はＧＬＰ１変異体ペプチド
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）は、腸内で合成され、食物摂取に応答して放出さ
れるインスリン分泌促進物質である。これは主にＧＬＰ１－（７－３７）及びＧＬＰ１－
（７－３６）ＮＨ２の２つの形態で分泌され、その両方とも、グルコース刺激によるイン
スリン分泌を増強する膵臓ベータ細胞を含む多くの組織と、満腹感及び食事量を制御する
脳幹に見られる特異的なＧＬＰ１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）に結合する。
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）は、腸内で合成され、食物摂取に応答して放出さ
れるインスリン分泌促進物質である。これは主にＧＬＰ１－（７－３７）及びＧＬＰ１－
（７－３６）ＮＨ２の２つの形態で分泌され、その両方とも、グルコース刺激によるイン
スリン分泌を増強する膵臓ベータ細胞を含む多くの組織と、満腹感及び食事量を制御する
脳幹に見られる特異的なＧＬＰ１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）に結合する。
【0055】
多くのＧＬＰ１アナログ及び誘導体が既知であり、本明細書では「ＧＬＰ－１変異体」
と呼ぶ場合がある。これらのＧＬＰ１変異体ペプチドは、アメリカドクトカゲの毒に見ら
れるペプチドであるエキセンディンを含み得る。これらのエキセンディンは、天然のＧＬ
Ｐ１との配列相同性を有しており、ＧＬＰ１受容体に結合し、シグナル伝達カスケード応
答を開始させることができる。
と呼ぶ場合がある。これらのＧＬＰ１変異体ペプチドは、アメリカドクトカゲの毒に見ら
れるペプチドであるエキセンディンを含み得る。これらのエキセンディンは、天然のＧＬ
Ｐ１との配列相同性を有しており、ＧＬＰ１受容体に結合し、シグナル伝達カスケード応
答を開始させることができる。
【0056】
ＧＬＰ１及びＧＬＰ１変異体ペプチドは、様々な方法で作用することが示されており、
これには、食物摂取の減少、インスリン放出の刺激、グルカゴン分泌の低下、胃排出の阻
害、及びグルコース利用の増強を挙げることができるが、これらに限定されない。
これには、食物摂取の減少、インスリン放出の刺激、グルカゴン分泌の低下、胃排出の阻
害、及びグルコース利用の増強を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0057】
ＧＬＰ１Ｒは、７回膜貫通ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体のクラスＢファミリー
に属し、膵島のα－、β－、及びδ－細胞、心臓、腎臓、胃、腸、迷走神経の神経節神経
、並びに視床下部及び脳幹を含む中枢神経系（ＣＮＳ）のいくつかの領域を含むがこれら
に限定されない広範囲の組織で発現する。ＧＬＰ１Ｒは、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇαｉ、及び
Ｇαｏに結合して（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ－Ｒａｆｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：１１３２－４０（１９９９）；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５４６：７９－８６（２００１
））、細胞内カルシウム、アデニル酸シクラーゼ、及びホスホリパーゼＣの増加、並びに
ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ－３Ｋ、Ｅｐａｃ２、及びＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化をも
たらし得る（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８４：３４３４－８（１９８７
）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：５７－６
２（１９９３）；及びＨｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０：１７７４９－５７（１
９９５））。
に属し、膵島のα－、β－、及びδ－細胞、心臓、腎臓、胃、腸、迷走神経の神経節神経
、並びに視床下部及び脳幹を含む中枢神経系（ＣＮＳ）のいくつかの領域を含むがこれら
に限定されない広範囲の組織で発現する。ＧＬＰ１Ｒは、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇαｉ、及び
Ｇαｏに結合して（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ－Ｒａｆｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：１１３２－４０（１９９９）；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５４６：７９－８６（２００１
））、細胞内カルシウム、アデニル酸シクラーゼ、及びホスホリパーゼＣの増加、並びに
ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ－３Ｋ、Ｅｐａｃ２、及びＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化をも
たらし得る（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８４：３４３４－８（１９８７
）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：５７－６
２（１９９３）；及びＨｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０：１７７４９－５７（１
９９５））。
【0058】
本明細書では、第１の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第１の構成要素は、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチドである。本明細書で使用する
とき、用語「ＧＬＰ１ペプチド」、「ＧＬＰ１変異体ペプチド」、「ＧＬＰ１ペプチド変
異体」、及び「ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド」は互換的に使用される。ＧＬＰ１
又はＧＬＰ１変異体ペプチドは、表１に提供される配列のうちの１つを含み得る。ＧＬＰ
１又はＧＬＰ１変異体ペプチドは、表１に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５
％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５
％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変
異体ペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）インビトロ安定性
、（ｉｉｉ）インビトロ効力、（ｉｖ）ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質との
組み合わせにおけるインビトロ効力の保持、（ｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロ
シル化の可能性の欠如、並びに（ｖｉ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５変異体タンパク質の特性（
例えば、インビボ安定性、インビボ効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ
１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））
のうちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
、第１の構成要素は、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチドである。本明細書で使用する
とき、用語「ＧＬＰ１ペプチド」、「ＧＬＰ１変異体ペプチド」、「ＧＬＰ１ペプチド変
異体」、及び「ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド」は互換的に使用される。ＧＬＰ１
又はＧＬＰ１変異体ペプチドは、表１に提供される配列のうちの１つを含み得る。ＧＬＰ
１又はＧＬＰ１変異体ペプチドは、表１に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５
％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５
％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変
異体ペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）インビトロ安定性
、（ｉｉｉ）インビトロ効力、（ｉｖ）ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質との
組み合わせにおけるインビトロ効力の保持、（ｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロ
シル化の可能性の欠如、並びに（ｖｉ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５変異体タンパク質の特性（
例えば、インビボ安定性、インビボ効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ
１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））
のうちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
【0059】
ＧＬＰ１融合ペプチドの第１の構成要素を構成するＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ドは、天然のＧＬＰ１に十分な相同性及び機能性を有するペプチドを包含することが意図
される。ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチドは、膵臓及び脳幹を含む組織においてＧＬ
Ｐ１受容体に結合することができ、その結果、天然のＧＬＰ１がこれらの組織内のＧＬＰ
１受容体に結合したときと同じシグナル伝達経路を生じさせ、同じ又は類似のインスリン
分泌活性を呈するように設計される。
ドは、天然のＧＬＰ１に十分な相同性及び機能性を有するペプチドを包含することが意図
される。ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチドは、膵臓及び脳幹を含む組織においてＧＬ
Ｐ１受容体に結合することができ、その結果、天然のＧＬＰ１がこれらの組織内のＧＬＰ
１受容体に結合したときと同じシグナル伝達経路を生じさせ、同じ又は類似のインスリン
分泌活性を呈するように設計される。
【0060】
【表1】
【0061】
第１のリンカーペプチド：アミノ末端リンカー（Ｎ末端リンカー）
本明細書では、第２の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第２の構成要素は、第１のリンカーペプチド（すなわち、アミノ末端リンカーペプチド
）である。第１のリンカーペプチドは、表２に提供される配列のうちの１つを含み得る。
第１のリンカーペプチドは、表２に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５％、７
６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８
６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。
本明細書では、第２の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第２の構成要素は、第１のリンカーペプチド（すなわち、アミノ末端リンカーペプチド
）である。第１のリンカーペプチドは、表２に提供される配列のうちの１つを含み得る。
第１のリンカーペプチドは、表２に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５％、７
６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８
６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。
【0062】
第１のリンカーペプチドは、例えば、約５～約６０個のアミノ酸残基、約１０～約５０
個のアミノ酸残基、約１０～約６０個のアミノ酸残基、約５～約５０個のアミノ酸残基、
約１５～約４０アミノ酸残基、約１２～約３０アミノ酸残基、約１２～約４２アミノ酸残
基、約２０～約２５アミノ酸残基、約８～約４８個のアミノ酸残基、約１０～約４６アミ
ノ酸残基、約１２～約４４アミノ酸残基、約１４～約４２アミノ酸残基、約１６～約４０
アミノ酸残基、約１８～約３８アミノ酸残基、約２０～約３６個のアミノ酸残基、約２０
～約４２個のアミノ酸残基、約２２～約３４個のアミノ酸残基、約２４～約３２個のアミ
ノ酸残基、約２６～約３０個のアミノ酸残基、又はそれらの間の任意の値を含み得る。第
１のリンカーペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２
、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、
５６、５７、５８、５９、又は６０個のアミノ酸残基を含み得る。
個のアミノ酸残基、約１０～約６０個のアミノ酸残基、約５～約５０個のアミノ酸残基、
約１５～約４０アミノ酸残基、約１２～約３０アミノ酸残基、約１２～約４２アミノ酸残
基、約２０～約２５アミノ酸残基、約８～約４８個のアミノ酸残基、約１０～約４６アミ
ノ酸残基、約１２～約４４アミノ酸残基、約１４～約４２アミノ酸残基、約１６～約４０
アミノ酸残基、約１８～約３８アミノ酸残基、約２０～約３６個のアミノ酸残基、約２０
～約４２個のアミノ酸残基、約２２～約３４個のアミノ酸残基、約２４～約３２個のアミ
ノ酸残基、約２６～約３０個のアミノ酸残基、又はそれらの間の任意の値を含み得る。第
１のリンカーペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２
、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、
５６、５７、５８、５９、又は６０個のアミノ酸残基を含み得る。
【0063】
特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、アラニンプロリン反復（すなわち、
ＡＰ反復）を含有することができ、ＡＰジペプチドはＡＰ単位と称され得る。ＡＰ反復は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個のＡＰ単位を含
み得る。特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、例えば、２～２５個のＡＰ単
位、５～２５個の単位、４～２３個のＡＰ単位、６～２１個のＡＰ単位、８～１９個のＡ
Ｐ単位、１０～１７個のＡＰ単位、１２～１５個のＡＰ単位、５～１０個のＡＰ単位、５
～１５個のＡＰ単位、１０～２５個のＡＰ単位、１５～２５個のＡＰ単位、２０～２５個
のＡＰ単位、又はそれらの間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＰ反復は、
アラニンセリンジペプチド（すなわち、ＡＳ単位）及びグリシン－セリンジペプチド（す
なわち、ＧＳ単位）に内在し得る。ＡＳ単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのアミ
ノ末端に存在し得る。ＧＳ単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのカルボキシル末端
に存在し得る。
ＡＰ反復）を含有することができ、ＡＰジペプチドはＡＰ単位と称され得る。ＡＰ反復は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個のＡＰ単位を含
み得る。特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、例えば、２～２５個のＡＰ単
位、５～２５個の単位、４～２３個のＡＰ単位、６～２１個のＡＰ単位、８～１９個のＡ
Ｐ単位、１０～１７個のＡＰ単位、１２～１５個のＡＰ単位、５～１０個のＡＰ単位、５
～１５個のＡＰ単位、１０～２５個のＡＰ単位、１５～２５個のＡＰ単位、２０～２５個
のＡＰ単位、又はそれらの間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＰ反復は、
アラニンセリンジペプチド（すなわち、ＡＳ単位）及びグリシン－セリンジペプチド（す
なわち、ＧＳ単位）に内在し得る。ＡＳ単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのアミ
ノ末端に存在し得る。ＧＳ単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのカルボキシル末端
に存在し得る。
【0064】
特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、グリシン－グリシン－グリシン－グ
リシン－セリン反復（すなわち、Ｇ４Ｓ反復）を含有し得、Ｇ４ＳペンタペプチドはＧ４
Ｓ単位と称され得る。Ｇ４Ｓ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ｓ単位を含み得る。特定の実施形態では、第１のリン
カーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ｓ単位、４～１３個のＧ４Ｓ単位、６～１１
個のＧ４Ｓ単位、８～９個のＧ４Ｓ単位、２～８個のＧ４Ｓ単位、２～６個のＧ４Ｓ単位
、６～８個のＧ４Ｓ単位、７～８個のＧ４Ｓ単位、７～９個のＧ４Ｓ単位、７～１０個の
Ｇ４Ｓ単位、又はこれらの間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＳ又はＧＳ
単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
リシン－セリン反復（すなわち、Ｇ４Ｓ反復）を含有し得、Ｇ４ＳペンタペプチドはＧ４
Ｓ単位と称され得る。Ｇ４Ｓ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ｓ単位を含み得る。特定の実施形態では、第１のリン
カーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ｓ単位、４～１３個のＧ４Ｓ単位、６～１１
個のＧ４Ｓ単位、８～９個のＧ４Ｓ単位、２～８個のＧ４Ｓ単位、２～６個のＧ４Ｓ単位
、６～８個のＧ４Ｓ単位、７～８個のＧ４Ｓ単位、７～９個のＧ４Ｓ単位、７～１０個の
Ｇ４Ｓ単位、又はこれらの間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＳ又はＧＳ
単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
【0065】
特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、グリシン－グリシン－グリシン－グ
リシン－アラニン反復（すなわち、Ｇ４Ａ反復）を含有し得、Ｇ４ＡペンタペプチドはＧ
４Ａ単位と称され得る。Ｇ４Ａ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ａ単位を含み得る。特定の実施形態では、第１のリ
ンカーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ａ単位、４～１３個のＧ４Ａ単位、６～１
１個のＧ４Ａ単位、８～９個のＧ４Ａ単位、２～８個のＧ４Ａ単位、２～４個のＧ４Ａ単
位、２～６個のＧ４Ａ単位、４～６個のＧ４Ａ単位、４～８個のＧ４Ａ単位、６～８個の
Ｇ４Ａ単位、６～９個のＧ４Ａ単位、６～１０個のＧ４Ａ単位、又はこれらの間の任意の
値を含むことができる。特定の実施形態では、グリシン－アラニンジペプチド（すなわち
、ＧＡ単位）単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
リシン－アラニン反復（すなわち、Ｇ４Ａ反復）を含有し得、Ｇ４ＡペンタペプチドはＧ
４Ａ単位と称され得る。Ｇ４Ａ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ａ単位を含み得る。特定の実施形態では、第１のリ
ンカーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ａ単位、４～１３個のＧ４Ａ単位、６～１
１個のＧ４Ａ単位、８～９個のＧ４Ａ単位、２～８個のＧ４Ａ単位、２～４個のＧ４Ａ単
位、２～６個のＧ４Ａ単位、４～６個のＧ４Ａ単位、４～８個のＧ４Ａ単位、６～８個の
Ｇ４Ａ単位、６～９個のＧ４Ａ単位、６～１０個のＧ４Ａ単位、又はこれらの間の任意の
値を含むことができる。特定の実施形態では、グリシン－アラニンジペプチド（すなわち
、ＧＡ単位）単位は、例えば、第１のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
【0066】
特定の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、ポリグリシンペプチドであり得る。
ポリグリシンペプチドは、約６～約５０個のグリシン残基、約１０～約４５個のグリシン
残基、約１５～約４０個のグリシン残基、約２０～約３５個のグリシン残基、約２５～約
３０個のグリシン残基、約２０～約２５個のグリシン残基、又はこれらの間の任意の数を
含み得る。ポリグリシンの第１のリンカーペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、
３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のグ
リシン残基を含み得る。
ポリグリシンペプチドは、約６～約５０個のグリシン残基、約１０～約４５個のグリシン
残基、約１５～約４０個のグリシン残基、約２０～約３５個のグリシン残基、約２５～約
３０個のグリシン残基、約２０～約２５個のグリシン残基、又はこれらの間の任意の数を
含み得る。ポリグリシンの第１のリンカーペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、
３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のグ
リシン残基を含み得る。
【0067】
第１のリンカーペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）イン
ビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシ
ロシル化の可能性の欠如、並びに（ｖ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の特性（例
えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ
１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））
のうちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
ビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシ
ロシル化の可能性の欠如、並びに（ｖ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の特性（例
えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ
１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体に対するアゴニスト活性を有することができるかどうか））
のうちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
【0068】
【表2】
【0069】
血清アルブミンタンパク質
本明細書では、第３の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第３の構成要素は、血清アルブミンタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
）タンパク質又はゴリラ血清アルブミン（ＧＳＡ）タンパク質）である。天然のヒト血清
アルブミンタンパク質は、１７個のジスルフィド結合を形成する３５個のシステイン（Ｃ
ｙｓ、Ｃ）残基を含んでおり、Ｃｙｓー３４残基が分子中で唯一の遊離システインである
。この遊離Ｃｙｓー３４は、複数の活性酸素種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）を捕
獲することにより、フリーラジカルスカベンジャーとして機能することがわかっている（
Ｔａｖｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ ３：４（２０
１３））。この遊離Ｃｙｓをセリン（Ｓｅｒ）に変異させて酸化による不均一性が生じる
リスクを最小化した。
本明細書では、第３の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第３の構成要素は、血清アルブミンタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
）タンパク質又はゴリラ血清アルブミン（ＧＳＡ）タンパク質）である。天然のヒト血清
アルブミンタンパク質は、１７個のジスルフィド結合を形成する３５個のシステイン（Ｃ
ｙｓ、Ｃ）残基を含んでおり、Ｃｙｓー３４残基が分子中で唯一の遊離システインである
。この遊離Ｃｙｓー３４は、複数の活性酸素種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）を捕
獲することにより、フリーラジカルスカベンジャーとして機能することがわかっている（
Ｔａｖｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ ３：４（２０
１３））。この遊離Ｃｙｓをセリン（Ｓｅｒ）に変異させて酸化による不均一性が生じる
リスクを最小化した。
【0070】
血清アルブミンタンパク質は、表３に提供される配列のうちの１つを含み得る。血清ア
ルブミンタンパク質は、表３に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５％、７６％
、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％
、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。血清アルブミンタンパク質配列は、
以下の基準：（ｉ）インビトロ安定性、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ）ＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合タンパク質の特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち
、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質
が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒ受容体に対するアゴニスト活性を有すること
ができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
ルブミンタンパク質は、表３に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５％、７６％
、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％
、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。血清アルブミンタンパク質配列は、
以下の基準：（ｉ）インビトロ安定性、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ）ＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合タンパク質の特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち
、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質
が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒ受容体に対するアゴニスト活性を有すること
ができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
【0071】
【表3】
【0072】
第２のリンカーペプチド：カルボキシ末端リンカー（Ｃ末端リンカー）
本明細書では、第４の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第４の構成要素は、第２のリンカーペプチド（すなわち、カルボキシ末端リンカーペプ
チド）である。第２のリンカーペプチドは、表４に提供される配列のうちの１つを含み得
る。第２のリンカーペプチドは、表４に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５％
、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％
、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。
本明細書では、第４の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第４の構成要素は、第２のリンカーペプチド（すなわち、カルボキシ末端リンカーペプ
チド）である。第２のリンカーペプチドは、表４に提供される配列のうちの１つを含み得
る。第２のリンカーペプチドは、表４に提供される配列のうちの１つと少なくとも７５％
、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％
、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。
【0073】
第２のリンカーペプチドは、例えば、約５～約６０個のアミノ酸残基、約１０～約５０
個のアミノ酸残基、約１０～約６０個のアミノ酸残基、約５～約５０個のアミノ酸残基、
約１５～約４０アミノ酸残基、約１２～約３０アミノ酸残基、約１２～約４２アミノ酸残
基、約２０～約２５アミノ酸残基、約８～約４８個のアミノ酸残基、約１０～約４６アミ
ノ酸残基、約１２～約４４アミノ酸残基、約１４～約４２アミノ酸残基、約１６～約４０
アミノ酸残基、約１８～約３８アミノ酸残基、約２０～約３６個のアミノ酸残基、約２０
～約４２個のアミノ酸残基、約２２～約３４個のアミノ酸残基、約２４～約３２個のアミ
ノ酸残基、約２６～約３０個のアミノ酸残基、又はそれらの間の任意の値を含み得る。第
２のリンカーペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２
、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、
５６、５７、５８、５９、又は６０個のアミノ酸残基を含み得る。
個のアミノ酸残基、約１０～約６０個のアミノ酸残基、約５～約５０個のアミノ酸残基、
約１５～約４０アミノ酸残基、約１２～約３０アミノ酸残基、約１２～約４２アミノ酸残
基、約２０～約２５アミノ酸残基、約８～約４８個のアミノ酸残基、約１０～約４６アミ
ノ酸残基、約１２～約４４アミノ酸残基、約１４～約４２アミノ酸残基、約１６～約４０
アミノ酸残基、約１８～約３８アミノ酸残基、約２０～約３６個のアミノ酸残基、約２０
～約４２個のアミノ酸残基、約２２～約３４個のアミノ酸残基、約２４～約３２個のアミ
ノ酸残基、約２６～約３０個のアミノ酸残基、又はそれらの間の任意の値を含み得る。第
２のリンカーペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２
、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、
５６、５７、５８、５９、又は６０個のアミノ酸残基を含み得る。
【0074】
特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、アラニンプロリン反復（すなわち、
ＡＰ反復）を含有することができ、ＡＰジペプチドはＡＰ単位と称され得る。ＡＰ反復は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個のＡＰ単位を含
み得る。特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、例えば、２～２５個のＡＰ単
位、５～２５個の単位、４～２３個のＡＰ単位、６～２１個のＡＰ単位、８～１９個のＡ
Ｐ単位、１０～１７個のＡＰ単位、１２～１５個のＡＰ単位、５～１０の単位、５～１５
個の単位、１０～２５個の単位、１５～２５個の単位、２０～２５個の単位、又はそれら
の間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＰ反復は、アラニンセリンジペプチ
ド（すなわち、ＡＳ単位）及びグリシン－セリンジペプチド（すなわち、ＧＳ単位）に内
在し得る。ＡＳ単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。Ｇ
Ｓ単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのカルボキシル末端に存在し得る。
ＡＰ反復）を含有することができ、ＡＰジペプチドはＡＰ単位と称され得る。ＡＰ反復は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７個のＡＰ単位を含
み得る。特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、例えば、２～２５個のＡＰ単
位、５～２５個の単位、４～２３個のＡＰ単位、６～２１個のＡＰ単位、８～１９個のＡ
Ｐ単位、１０～１７個のＡＰ単位、１２～１５個のＡＰ単位、５～１０の単位、５～１５
個の単位、１０～２５個の単位、１５～２５個の単位、２０～２５個の単位、又はそれら
の間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＰ反復は、アラニンセリンジペプチ
ド（すなわち、ＡＳ単位）及びグリシン－セリンジペプチド（すなわち、ＧＳ単位）に内
在し得る。ＡＳ単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。Ｇ
Ｓ単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのカルボキシル末端に存在し得る。
【0075】
特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、グリシン－グリシン－グリシン－グ
リシン－セリン反復（すなわち、Ｇ４Ｓ反復）を含有し得、Ｇ４ＳペンタペプチドはＧ４
Ｓ単位と称され得る。Ｇ４Ｓ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ｓ単位を含み得る。特定の実施形態では、第２のリン
カーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ｓ単位、４～１３個のＧ４Ｓ単位、６～１１
個のＧ４Ｓ単位、８～９個のＧ４Ｓ単位、２～８個のＧ４Ｓ単位、２～６個のＧ４Ｓ単位
、６～８個のＧ４Ｓ単位、７～８個のＧ４Ｓ単位、７～９個のＧ４Ｓ単位、７～１０個の
Ｇ４Ｓ単位、又はこれらの間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＳ又はＧＳ
単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
リシン－セリン反復（すなわち、Ｇ４Ｓ反復）を含有し得、Ｇ４ＳペンタペプチドはＧ４
Ｓ単位と称され得る。Ｇ４Ｓ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ｓ単位を含み得る。特定の実施形態では、第２のリン
カーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ｓ単位、４～１３個のＧ４Ｓ単位、６～１１
個のＧ４Ｓ単位、８～９個のＧ４Ｓ単位、２～８個のＧ４Ｓ単位、２～６個のＧ４Ｓ単位
、６～８個のＧ４Ｓ単位、７～８個のＧ４Ｓ単位、７～９個のＧ４Ｓ単位、７～１０個の
Ｇ４Ｓ単位、又はこれらの間の任意の値を含み得る。特定の実施形態では、ＡＳ又はＧＳ
単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
【0076】
特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、グリシン－グリシン－グリシン－グ
リシン－アラニン反復（すなわち、Ｇ４Ａ反復）を含有し得、Ｇ４ＡペンタペプチドはＧ
４Ａ単位と称され得る。Ｇ４Ａ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ａ単位を含み得る。特定の実施形態では、第２のリ
ンカーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ａ単位、４～１３個のＧ４Ａ単位、６～１
１個のＧ４Ａ単位、８～９個のＧ４Ａ単位、２～８個のＧ４Ａ単位、２～４個のＧ４Ａ単
位、２～６個のＧ４Ａ単位、４～６個のＧ４Ａ単位、４～８個のＧ４Ａ単位、６～８個の
Ｇ４Ａ単位、６～９個のＧ４Ａ単位、６～１０個のＧ４Ａ単位、又はこれらの間の任意の
値を含むことができる。特定の実施形態では、グリシン－アラニンジペプチド（すなわち
、ＧＡ単位）単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
リシン－アラニン反復（すなわち、Ｇ４Ａ反復）を含有し得、Ｇ４ＡペンタペプチドはＧ
４Ａ単位と称され得る。Ｇ４Ａ反復は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、又は１５個のＧ４Ａ単位を含み得る。特定の実施形態では、第２のリ
ンカーペプチドは、例えば、２～１５個のＧ４Ａ単位、４～１３個のＧ４Ａ単位、６～１
１個のＧ４Ａ単位、８～９個のＧ４Ａ単位、２～８個のＧ４Ａ単位、２～４個のＧ４Ａ単
位、２～６個のＧ４Ａ単位、４～６個のＧ４Ａ単位、４～８個のＧ４Ａ単位、６～８個の
Ｇ４Ａ単位、６～９個のＧ４Ａ単位、６～１０個のＧ４Ａ単位、又はこれらの間の任意の
値を含むことができる。特定の実施形態では、グリシン－アラニンジペプチド（すなわち
、ＧＡ単位）単位は、例えば、第２のリンカーペプチドのアミノ末端に存在し得る。
【0077】
特定の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、ポリグリシンペプチドであり得る。
ポリグリシンペプチドは、約６～約５０個のグリシン残基、約１０～約４５個のグリシン
残基、約１５～約４０個のグリシン残基、約２０～約３５個のグリシン残基、約２５～約
３０個のグリシン残基、約２０～約２５個のグリシン残基、又はこれらの間の任意の数を
含み得る。ポリグリシンの第２のリンカーペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、
３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のグ
リシン残基を含み得る。
ポリグリシンペプチドは、約６～約５０個のグリシン残基、約１０～約４５個のグリシン
残基、約１５～約４０個のグリシン残基、約２０～約３５個のグリシン残基、約２５～約
３０個のグリシン残基、約２０～約２５個のグリシン残基、又はこれらの間の任意の数を
含み得る。ポリグリシンの第２のリンカーペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、
３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のグ
リシン残基を含み得る。
【0078】
第２のリンカーペプチド配列は、以下の基準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）イン
ビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシ
ロシル化の可能性の欠如、並びに（ｖ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の特性（例
えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ
１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体のアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうち
の少なくとも１つに基づいて選択され得る。
ビトロ効力、（ｉｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシ
ロシル化の可能性の欠如、並びに（ｖ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の特性（例
えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチ
ド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ
１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体のアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうち
の少なくとも１つに基づいて選択され得る。
【0079】
【表4】
【0080】
ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）
スーパーファミリーに属するタンパク質である。ＧＤＦ１５は、２５－ｋＤａ二量体とし
て循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５は、前立腺由来因子（ＰＤＦ）、マクロフ
ァージ阻害性サイトカイン－１（ＭＩＣ－１）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）
活性化遺伝子（ＮＡＧ－１）及び胎盤ＴＧＦ－β（ＰＴＧＦβ）とも称される。
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）
スーパーファミリーに属するタンパク質である。ＧＤＦ１５は、２５－ｋＤａ二量体とし
て循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５は、前立腺由来因子（ＰＤＦ）、マクロフ
ァージ阻害性サイトカイン－１（ＭＩＣ－１）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）
活性化遺伝子（ＮＡＧ－１）及び胎盤ＴＧＦ－β（ＰＴＧＦβ）とも称される。
【0081】
ＧＤＦ１５機能は、まだ完全に解明されていないが、エネルギー恒常性、体重調節、並
びに癌及び慢性疾患によって引き起こされる悪液質を含むが、これらに限定されない、複
数の生物過程に関与している。薬理学的に投与されたＧＤＦ１５がエネルギー摂取を減少
させ、それによって体重減少を誘発する可能性は、マウス、ラット、及びサルにおいて実
証されている。（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０
（２００７），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１７）
，Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７）
，Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ４２：５６１－７１（２０１
８））。ＧＤＦ１５投与によって媒介される体重減少は、グルコース恒常性の強化及び血
漿トリグリセリド及びコレステロールの低下を含む代謝改善をもたらす（Ｘｉｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。
びに癌及び慢性疾患によって引き起こされる悪液質を含むが、これらに限定されない、複
数の生物過程に関与している。薬理学的に投与されたＧＤＦ１５がエネルギー摂取を減少
させ、それによって体重減少を誘発する可能性は、マウス、ラット、及びサルにおいて実
証されている。（Ｊｏｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：１３３３－４０
（２００７），Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２５５－９（２０１７）
，Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１１５０－７（２０１７）
，Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓｉｔｙ ４２：５６１－７１（２０１
８））。ＧＤＦ１５投与によって媒介される体重減少は、グルコース恒常性の強化及び血
漿トリグリセリド及びコレステロールの低下を含む代謝改善をもたらす（Ｘｉｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ９：４１２（２０１７））。
【0082】
ＧＤＦ１５は、ＧＤＮＦファミリー受容体α様（ＧＦＲＡＬ）に結合し、膜貫通受容体
は、脳幹のニューロンにのみ存在する（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｓｕ ｅｔ
ａｌ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。ＧＤＦ１５結合
時に、ＧＦＲＡＬは、ＡＫＴ、ＥＲＫ、及びＰＬＣγの翻訳後修飾を含む下流細胞内リン
酸化カスケードを刺激するチロシンキナーゼ、ＲＥＴと複合体を形成する。このカスケー
ドの追加の分子及び細胞成分は、まだ解明されていないが、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬシグ
ナル伝達の最終的な効果は、食物摂取の減少及び体重減少である（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ａ
ｎｄ Ｒａｎｇｗａｌａ，２０１８）。
は、脳幹のニューロンにのみ存在する（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｓｕ ｅｔ
ａｌ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。ＧＤＦ１５結合
時に、ＧＦＲＡＬは、ＡＫＴ、ＥＲＫ、及びＰＬＣγの翻訳後修飾を含む下流細胞内リン
酸化カスケードを刺激するチロシンキナーゼ、ＲＥＴと複合体を形成する。このカスケー
ドの追加の分子及び細胞成分は、まだ解明されていないが、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬシグ
ナル伝達の最終的な効果は、食物摂取の減少及び体重減少である（Ｍｕｌｌｉｃａｎ ａ
ｎｄ Ｒａｎｇｗａｌａ，２０１８）。
【0083】
本明細書では、第５の構成要素を含むＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供され
、第５の成分は、ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質である。ＧＤＦ１５タンパ
ク質は、表５に提供される配列を含み得、ＧＤＦ１５変異体タンパク質は、表５に提供さ
れる配列の変異体を含み得る。ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質は、表５に提
供される配列のうちの１つと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０
％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の
同一性を含み得る。ＧＤＦ１５及び／又はＧＤＦ１５変異体タンパク質配列は、以下の基
準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｉｉ）インビトロ効力、
（ｉｖ）ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体タンパク質との組み合わせにおけるインビトロ効力
の保持、（ｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロシル化の可能性の欠如、並びに（ｖ
ｉ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５変異体タンパク質の特性（例えば、インビボ安定性、インビボ
効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変
異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体に対す
るアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて
選択され得る。
、第５の成分は、ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質である。ＧＤＦ１５タンパ
ク質は、表５に提供される配列を含み得、ＧＤＦ１５変異体タンパク質は、表５に提供さ
れる配列の変異体を含み得る。ＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質は、表５に提
供される配列のうちの１つと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０
％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の
同一性を含み得る。ＧＤＦ１５及び／又はＧＤＦ１５変異体タンパク質配列は、以下の基
準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）インビトロ安定性、（ｉｉｉ）インビトロ効力、
（ｉｖ）ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体タンパク質との組み合わせにおけるインビトロ効力
の保持、（ｖ）セリンキシロシル化又はセリンキシロシル化の可能性の欠如、並びに（ｖ
ｉ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５変異体タンパク質の特性（例えば、インビボ安定性、インビボ
効力（すなわち、ＧＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変
異体タンパク質が、それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）受容体に対す
るアゴニスト活性を有することができるかどうか））のうちの少なくとも１つに基づいて
選択され得る。
【0084】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の第５の構成要素を構成するＧＤＦ１５又はＧＤ
Ｆ１５変異体タンパク質は、天然のＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）を活性化するのに十分な
相同性及び機能性を有するタンパク質を包含することが意図される。ＧＤＦ１５又はＧＤ
Ｆ１５変異体タンパク質は、脳幹中のＧＦＲＡＬに結合することができ、その結果、天然
ＧＤＦ１５がこれらのニューロンにおいてＧＦＲＡＬに結合するときと同じシグナル伝達
経路を生じさせ、食物摂取に対する同じ影響を呈するように設計される。
Ｆ１５変異体タンパク質は、天然のＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）を活性化するのに十分な
相同性及び機能性を有するタンパク質を包含することが意図される。ＧＤＦ１５又はＧＤ
Ｆ１５変異体タンパク質は、脳幹中のＧＦＲＡＬに結合することができ、その結果、天然
ＧＤＦ１５がこれらのニューロンにおいてＧＦＲＡＬに結合するときと同じシグナル伝達
経路を生じさせ、食物摂取に対する同じ影響を呈するように設計される。
【0085】
【表5】
【0086】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
本明細書では、前述のように第１、第２、第３、第４、及び第５の構成要素を含むＧＬ
Ｐ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供される。第１の構成要素は、ＧＬＰ１又はＧＬＰ
１変異体ペプチドであり、第２の構成要素は第１のリンカーペプチドであり、第３の構成
要素は血清アルブミンタンパク質であり、第４の構成要素は第２のリンカーペプチドであ
り、第５の構成要素はＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質である。ＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合タンパク質は、表６に提供される配列のうちの１つを含み得る。ＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合タンパク質は、表６に提供される配列のうちの１つと少なくとも８５％、
８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質は、以下の基準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ
）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化の欠如、（ｖ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質の物理的特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、Ｇ
ＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、
それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒに対するアゴニスト活性を有することができるか
どうか））、並びに（ｖｉ）インビボにおける二重アゴニズム薬理学の所望のバランスの
うちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
本明細書では、前述のように第１、第２、第３、第４、及び第５の構成要素を含むＧＬ
Ｐ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が提供される。第１の構成要素は、ＧＬＰ１又はＧＬＰ
１変異体ペプチドであり、第２の構成要素は第１のリンカーペプチドであり、第３の構成
要素は血清アルブミンタンパク質であり、第４の構成要素は第２のリンカーペプチドであ
り、第５の構成要素はＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質である。ＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合タンパク質は、表６に提供される配列のうちの１つを含み得る。ＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合タンパク質は、表６に提供される配列のうちの１つと少なくとも８５％、
８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含み得る。ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質は、以下の基準：（ｉ）発現収率及び純度、（ｉｉ）インビトロ効力、（ｉｉｉ
）インビトロ安定性、（ｉｖ）セリンキシロシル化の欠如、（ｖ）ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質の物理的特性（例えば、インビボ安定性及びインビボ効力（すなわち、Ｇ
ＬＰ１又はＧＬＰ１変異体ペプチド及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質が、
それぞれ、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒに対するアゴニスト活性を有することができるか
どうか））、並びに（ｖｉ）インビボにおける二重アゴニズム薬理学の所望のバランスの
うちの少なくとも１つに基づいて選択され得る。
【0087】
一分子中に二重薬理学を送達する融合タンパク質治療にとって、両方のアゴニストが意
図される投与量で治療範囲にあるように、それぞれの部分の薬物動態／薬力学（ＰＫ／Ｐ
Ｄ）特性を適切に調整することが重要である。ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプ
チド配列、第１のリンカーペプチド配列、血清アルブミンタンパク質配列、第２のリンカ
ーペプチド配列、及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質配列の様々な組み合わ
せを含む様々なグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５
）融合タンパク質の広範な研究は、ＧＬＰ１アゴニスト及びＧＤＦ１５アゴニストの両方
の最適なバランス用量を送達する固有の特性を有する新規分子の発見をもたらした。これ
らの新規ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、特異的用量範囲で使用される場合、Ｈ
ＳＡ－ＧＤＦ１５としてインビボでＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）を会合するのに有効であ
ることが実証された（実施例１１を参照のこと）。更に、同じ用量範囲で使用されるＧＬ
Ｐ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（実施例１１を参照のこと）は、ＧＬＰ １部分の曝露
量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにもかかわらず、副作用もなく、デュラグルチ
ド（ＧＬＰ１－Ｆｃ）としてＧＬＰ１Ｒを会合するのに予想外に有効であった。ＨＳＡ－
ＧＤＦ１５との融合としてのＧＬＰ１ペプチドの送達は、ＧＬＰ１部分のインビボ効力を
予想外に変更したが、新規なグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５
（ＧＤＦ１５）融合タンパク質が両方のアゴニストの最適なバランスを有することを可能
にした。
図される投与量で治療範囲にあるように、それぞれの部分の薬物動態／薬力学（ＰＫ／Ｐ
Ｄ）特性を適切に調整することが重要である。ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプ
チド配列、第１のリンカーペプチド配列、血清アルブミンタンパク質配列、第２のリンカ
ーペプチド配列、及びＧＤＦ１５又はＧＤＦ１５変異体タンパク質配列の様々な組み合わ
せを含む様々なグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５
）融合タンパク質の広範な研究は、ＧＬＰ１アゴニスト及びＧＤＦ１５アゴニストの両方
の最適なバランス用量を送達する固有の特性を有する新規分子の発見をもたらした。これ
らの新規ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、特異的用量範囲で使用される場合、Ｈ
ＳＡ－ＧＤＦ１５としてインビボでＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）を会合するのに有効であ
ることが実証された（実施例１１を参照のこと）。更に、同じ用量範囲で使用されるＧＬ
Ｐ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（実施例１１を参照のこと）は、ＧＬＰ １部分の曝露
量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにもかかわらず、副作用もなく、デュラグルチ
ド（ＧＬＰ１－Ｆｃ）としてＧＬＰ１Ｒを会合するのに予想外に有効であった。ＨＳＡ－
ＧＤＦ１５との融合としてのＧＬＰ１ペプチドの送達は、ＧＬＰ１部分のインビボ効力を
予想外に変更したが、新規なグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）－増殖分化因子１５
（ＧＤＦ１５）融合タンパク質が両方のアゴニストの最適なバランスを有することを可能
にした。
【0088】
【表6-1】
【0089】
【表6-2】
【0090】
【表6-3】
【0091】
【表6-4】
【0092】
【表6-5】
【0093】
【表6-6】
【0094】
【表6-7】
【0095】
【表6-8】
【0096】
【表6-9】
【0097】
【表6-10】
【0098】
【表6-11】
【0099】
【表6-12】
【0100】
【表6-13】
【0101】
【表6-14】
【0102】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド及びベクター
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
をコードする単離核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク
質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができること
が、当業者には理解されよう。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配
列を、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は当業者には理解
されるであろう。
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
をコードする単離核酸に関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク
質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができること
が、当業者には理解されよう。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配
列を、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は当業者には理解
されるであろう。
【0103】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸
を含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベク
ターなどの、本開示の観点から当業者に公知の任意のベクターも使用することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベ
クターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハ
ンサー、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するため
の任意のエレメントを含むことができる。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は再
形成可能なプロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベク
ターが当技術分野において知られており、細胞内で融合タンパク質を生成するために、本
明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用し
て、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。
を含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベク
ターなどの、本開示の観点から当業者に公知の任意のベクターも使用することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベ
クターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハ
ンサー、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するため
の任意のエレメントを含むことができる。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は再
形成可能なプロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベク
ターが当技術分野において知られており、細胞内で融合タンパク質を生成するために、本
明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用し
て、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。
【0104】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸
を含む宿主細胞に関する。本開示の観点から、当業者に知られている任意の宿主細胞を、
本発明の融合タンパク質の組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では
、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１又はＢＬ２１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１
細胞、又はＨＥＫ２９３細胞である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、
組換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる、化学的ト
ランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によっ
て宿主細胞に形質転換される。
を含む宿主細胞に関する。本開示の観点から、当業者に知られている任意の宿主細胞を、
本発明の融合タンパク質の組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では
、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１又はＢＬ２１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１
細胞、又はＨＥＫ２９３細胞である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、
組換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる、化学的ト
ランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によっ
て宿主細胞に形質転換される。
【0105】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を生成する条件下で融合タ
ンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から（例え
ば、上清から）融合タンパク質を回収することと、を含む、本発明の融合タンパク質を生
成する方法に関する。発現された融合タンパク質は、当該技術分野において既知の従来技
術に従って、また、本明細書に記載されるように、細胞から採取し、精製することができ
る。
ンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から（例え
ば、上清から）融合タンパク質を回収することと、を含む、本発明の融合タンパク質を生
成する方法に関する。発現された融合タンパク質は、当該技術分野において既知の従来技
術に従って、また、本明細書に記載されるように、細胞から採取し、精製することができ
る。
【0106】
医薬組成物
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び
／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、並びに医薬上許容できる担体を含む
医薬組成物に関する。本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、医薬上許容で
きる担体と一緒に本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合ポリヌクレオチドを含む生成物を意味する。本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、並びにそれらを
含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造にも有用である。
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び
／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、並びに医薬上許容できる担体を含む
医薬組成物に関する。本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、医薬上許容で
きる担体と一緒に本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合ポリヌクレオチドを含む生成物を意味する。本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、並びにそれらを
含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造にも有用である。
【0107】
本明細書で使用するとき、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッ
ファ、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体
、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又
は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で
使用するとき、用語「医薬上許容できる担体」は、本発明による組成物の効果にも本発明
による組成物の生物活性にも干渉しない無毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本
開示を考慮して、ペプチド医薬組成物での使用に好適な医薬上許容できる任意の担体を本
発明で使用することができる。
ファ、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体
、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野で周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又
は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で
使用するとき、用語「医薬上許容できる担体」は、本発明による組成物の効果にも本発明
による組成物の生物活性にも干渉しない無毒性材料を指す。特定の実施形態によれば、本
開示を考慮して、ペプチド医薬組成物での使用に好適な医薬上許容できる任意の担体を本
発明で使用することができる。
【0108】
本発明において使用するための医薬上許容できる酸性／アニオン性の塩としては、酢酸
塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カ
ルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシ
ル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グル
タミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化
水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラク
トビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、
メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン
酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、
塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸
塩、及びトリエチオジドが挙げられるが、これらに限定されない。また、有機酸又は無機
酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メ
タンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２－ナフタレンスルホン酸、
ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸又はトリフルオ
ロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カ
ルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシ
ル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グル
タミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化
水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラク
トビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、
メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン
酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、
塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸
塩、及びトリエチオジドが挙げられるが、これらに限定されない。また、有機酸又は無機
酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メ
タンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２－ナフタレンスルホン酸、
ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸又はトリフルオ
ロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0109】
薬学的に許容され得る塩基性／カチオン性の塩としては、アルミニウム、２－アミノ－
２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、トロメタン、又は「ＴＲＩＳ」としても知られる）、アンモニア、ベンザチン
、ｔ－ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロへキシルアミン、
ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ－リシン、マグネシウム、メグル
ミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、ナ
トリウム、トリエタノールアミン、又は亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、トロメタン、又は「ＴＲＩＳ」としても知られる）、アンモニア、ベンザチン
、ｔ－ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロへキシルアミン、
ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ－リシン、マグネシウム、メグル
ミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、ナ
トリウム、トリエタノールアミン、又は亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
【0110】
本発明のいくつかの実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、約
０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの
量で本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
ポリヌクレオチドを含む医薬製剤が提供される。医薬製剤は、約３．０～約１０、例えば
、約３～約７、又は約５～約９のｐＨを有し得る。製剤は更に、緩衝系、防腐剤（複数可
）、等張化剤（複数可）、キレート剤（複数可）、安定化剤（複数可）、及び界面活性剤
（複数可）からなる群から選択される、少なくとも１つの成分を含み得る。
０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの
量で本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
ポリヌクレオチドを含む医薬製剤が提供される。医薬製剤は、約３．０～約１０、例えば
、約３～約７、又は約５～約９のｐＨを有し得る。製剤は更に、緩衝系、防腐剤（複数可
）、等張化剤（複数可）、キレート剤（複数可）、安定化剤（複数可）、及び界面活性剤
（複数可）からなる群から選択される、少なくとも１つの成分を含み得る。
【0111】
医薬上許容できる担体を有する医薬的活性成分の製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例え
ば２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、
当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、
溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１つ以上の医薬上許
容できる担体が、本発明の医薬組成物の製剤化において使用され得る。
：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例え
ば２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、
当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、
溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１つ以上の医薬上許
容できる担体が、本発明の医薬組成物の製剤化において使用され得る。
【0112】
本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水
性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マ
イクロエマルジョン、ゲルなどを含んでいてよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも
５０％ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
又は少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。
性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、マ
イクロエマルジョン、ゲルなどを含んでいてよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも
５０％ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
又は少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。
【0113】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば、注射器又は注入ポンプ
）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射によると、例えば、
皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達され得る。
）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射によると、例えば、
皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達され得る。
【0114】
別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができる
か、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／若しくは希釈剤を添加する、凍結乾燥又
は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤及び／又はコーティング錠剤など
の錠剤、並びにカプセル剤（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる
。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成用
の粉末の形態であってもよい。
か、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／若しくは希釈剤を添加する、凍結乾燥又
は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤及び／又はコーティング錠剤など
の錠剤、並びにカプセル剤（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる
。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ、又は再構成用
の粉末の形態であってもよい。
【0115】
剤形は即時放出であってもよく、その場合、当該剤形は、水溶性若しくは分散性担体を
含んでいてよく、又は遅延放出、持続放出、若しくは調節放出であってもよく、その場合
、当該剤形は、胃腸管における剤形の溶解速度を制御する非水溶性ポリマーを含んでいて
よい。
含んでいてよく、又は遅延放出、持続放出、若しくは調節放出であってもよく、その場合
、当該剤形は、胃腸管における剤形の溶解速度を制御する非水溶性ポリマーを含んでいて
よい。
【0116】
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、頬内、又は舌下に送達され得る。
【0117】
水性製剤のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐ
Ｈは約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約
７．０である。
Ｈは約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約
７．０である。
【0118】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例として
は、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フ
マル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢
酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸
塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、及びこれらの
混合物が挙げられる。緩衝液は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０
ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これ
らの具体的な緩衝剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
は、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フ
マル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢
酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸
塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、及びこれらの
混合物が挙げられる。緩衝液は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０
ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これ
らの具体的な緩衝剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【0119】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は防腐剤を含む。防腐剤の非限定的な例として
は、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒ
ドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロ
ルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキ
シベンゾエート、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２－フ
ェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシベンゾエート、
デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は
、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍ
ｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各１つを含
む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
は、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒ
ドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロ
ルフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキ
シベンゾエート、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２－フ
ェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシベンゾエート、
デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は
、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍ
ｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各１つを含
む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【0120】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。本実施形態の非限定的な例
としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、
リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アル
ジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，
３－プロパンジオール、及び１，３－ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（
例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては
、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノー
ス、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デ
キストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰ
ＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム
を含む、単糖類、二糖類、若しくは多糖類、又は水溶性グルカンであり得る。等張剤の別
の例は、糖アルコールであり、用語「糖アルコール」は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有
するＣ（４～８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マ
ンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトー
ル、及びアラビトールが挙げられる。本段落に列記される各等張剤を含む医薬組成物は、
本発明の代替実施形態を構成する。等張剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／
ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し
得る。これらの具体的な等張剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構
成する。
としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、
リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アル
ジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，
３－プロパンジオール、及び１，３－ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（
例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては
、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノー
ス、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デ
キストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰ
ＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム
を含む、単糖類、二糖類、若しくは多糖類、又は水溶性グルカンであり得る。等張剤の別
の例は、糖アルコールであり、用語「糖アルコール」は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有
するＣ（４～８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マ
ンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトー
ル、及びアラビトールが挙げられる。本段落に列記される各等張剤を含む医薬組成物は、
本発明の代替実施形態を構成する。等張剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／
ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し
得る。これらの具体的な等張剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構
成する。
【0121】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な
例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及
びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ
／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在
し得る。これらの具体的なキレート剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形
態を構成する。
例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及
びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ
／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在
し得る。これらの具体的なキレート剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形
態を構成する。
【0122】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例として
は、１つ以上の凝集阻害剤、１つ又は２つ以上の酸化阻害剤、１つ又は２つ以上の界面活
性剤、及び／又は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
は、１つ以上の凝集阻害剤、１つ又は２つ以上の酸化阻害剤、１つ又は２つ以上の界面活
性剤、及び／又は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【0123】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ－
／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、及び
ＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリド
ン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール）、又はチ
オグリコール酸である。安定剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５
０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これ
らの具体的な安定剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、及び
ＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリド
ン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール）、又はチ
オグリコール酸である。安定剤は、個々に又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約５
０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これ
らの具体的な安定剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【0124】
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の界面活性剤、好ましくは界面
活性剤、少なくとも１つの界面活性剤、又は２つの異なる界面活性剤を含む。「界面活性
剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意
の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界
面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双性界面活性剤からなる群から選択され得
る。界面活性剤は、個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃
度で存在し得る。これらの具体的な界面活性剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代
替実施形態を構成する。
活性剤、少なくとも１つの界面活性剤、又は２つの異なる界面活性剤を含む。「界面活性
剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意
の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界
面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双性界面活性剤からなる群から選択され得
る。界面活性剤は、個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃
度で存在し得る。これらの具体的な界面活性剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代
替実施形態を構成する。
【0125】
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば
、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、
個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。こ
れらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態
を構成する。
、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、
個々に又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。こ
れらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態
を構成する。
【0126】
本発明の医薬組成物は、組成物の保管中のポリペプチド凝集体の形成を減少させるのに
十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、１つ又は２つ以上
のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシ
ン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど）、又はこれらのアナログを指す
。任意のアミノ酸は、その遊離塩基形態又はその塩形態のいずれかで存在し得る。アミノ
酸塩基の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、又はこれらの混合物）が存在し得る。ア
ミノ酸塩基は、個々に又は他のアミノ酸塩基と組み合わせて、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約
５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。こ
れらの具体的なアミノ酸塩基の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成
する。
十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、１つ又は２つ以上
のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシ
ン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど）、又はこれらのアナログを指す
。任意のアミノ酸は、その遊離塩基形態又はその塩形態のいずれかで存在し得る。アミノ
酸塩基の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、又はこれらの混合物）が存在し得る。ア
ミノ酸塩基は、個々に又は他のアミノ酸塩基と組み合わせて、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約
５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。こ
れらの具体的なアミノ酸塩基の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成
する。
【0127】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポ
リヌクレオチドの医薬上許容できる塩としては、無機又は有機の酸又は塩基から形成され
る、従来の非毒性の塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例とし
ては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、樟脳酸
塩、ドデシル硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸
塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩及び酒石酸
塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩など
のアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシク
ロヘキシルアミノ塩などの有機塩基との塩、並びにアルギニンなどのアミノ酸との塩が挙
げられる。更に、塩基性の窒素含有基は、例えばハロゲン化アルキルによって第四級化さ
れていてもよい。
リヌクレオチドの医薬上許容できる塩としては、無機又は有機の酸又は塩基から形成され
る、従来の非毒性の塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例とし
ては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、樟脳酸
塩、ドデシル硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸
塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩及び酒石酸
塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩など
のアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシク
ロヘキシルアミノ塩などの有機塩基との塩、並びにアルギニンなどのアミノ酸との塩が挙
げられる。更に、塩基性の窒素含有基は、例えばハロゲン化アルキルによって第四級化さ
れていてもよい。
【0128】
本発明の医薬組成物は、その意図する目的を実現する任意の手段によって投与すること
ができる。例としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、口内又は眼内
投与が挙げられる。経口経路により投与してもよい。非経口投与に適する製剤としては、
水溶性形態の活性コンジュゲートの水溶液、例えば、水溶性の塩、酸性溶液、アルカリ性
溶液、デキストロース水溶液、等張炭水化物溶液、及びシクロデキストリン包接錯体が挙
げられる。
ができる。例としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、口内又は眼内
投与が挙げられる。経口経路により投与してもよい。非経口投与に適する製剤としては、
水溶性形態の活性コンジュゲートの水溶液、例えば、水溶性の塩、酸性溶液、アルカリ性
溶液、デキストロース水溶液、等張炭水化物溶液、及びシクロデキストリン包接錯体が挙
げられる。
【0129】
本発明はまた、医薬上許容できる担体を本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドのいずれかと混合することを含む
、医薬組成物の作製方法も包含する。加えて、本発明は、１つ以上の医薬上許容できる担
体を本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
ポリヌクレオチドのいずれかと混合することによって作製される医薬組成物を含む。
及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドのいずれかと混合することを含む
、医薬組成物の作製方法も包含する。加えて、本発明は、１つ以上の医薬上許容できる担
体を本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
ポリヌクレオチドのいずれかと混合することによって作製される医薬組成物を含む。
【0130】
更に、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合ポリヌクレオチドは、１つ以上の結晶多形又は非晶質結晶形を有していてもよく、こ
れも本発明の範囲に含まれることが意図される。加えて、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タン
パク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドは、例えば水（すなわち、
水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。本明細書で使用されるとき
、用語「溶媒和物」は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ
１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと１つ以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。
この物理的会合は、水素結合など、イオン結合及び共有結合の度合いの変化を伴う。特定
の場合では、例えば１つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に組み込まれているとき
、この溶媒和物を単離することができるようになる。用語「溶媒和物」は、溶液相溶媒和
物と、単離可能な溶媒和物の両方を包含するものとする。好適な溶媒和物の非限定的な例
としては、エタノレート、メタノレートなどが挙げられる。
融合ポリヌクレオチドは、１つ以上の結晶多形又は非晶質結晶形を有していてもよく、こ
れも本発明の範囲に含まれることが意図される。加えて、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タン
パク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドは、例えば水（すなわち、
水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。本明細書で使用されるとき
、用語「溶媒和物」は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ
１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと１つ以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。
この物理的会合は、水素結合など、イオン結合及び共有結合の度合いの変化を伴う。特定
の場合では、例えば１つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に組み込まれているとき
、この溶媒和物を単離することができるようになる。用語「溶媒和物」は、溶液相溶媒和
物と、単離可能な溶媒和物の両方を包含するものとする。好適な溶媒和物の非限定的な例
としては、エタノレート、メタノレートなどが挙げられる。
【0131】
本発明の範囲には、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１
－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドの結晶多形及び溶媒和物が含まれるものとする。ゆえ
に、本発明の治療方法における用語「投与」には、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、あるいは具体的に開示
されていなくとも、明らかに本発明の範囲内に含まれるであろう多形体又はその溶媒和物
を用いて、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を治療する、寛解させる、又は予防
する手段が含まれる。
－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドの結晶多形及び溶媒和物が含まれるものとする。ゆえ
に、本発明の治療方法における用語「投与」には、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、あるいは具体的に開示
されていなくとも、明らかに本発明の範囲内に含まれるであろう多形体又はその溶媒和物
を用いて、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を治療する、寛解させる、又は予防
する手段が含まれる。
【0132】
別の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドに関する。
５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドに関する。
【0133】
本発明は、その範囲内に、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧ
ＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドのプロドラッグを含む。一般に、このようなプ
ロドラッグは、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合ポリヌクレオチドの機能性誘導体であり、これは、必要なＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドにインビボで容易に変換
可能である。したがって、本発明の治療方法における用語「投与」には、本明細書に記載
される様々な障害の、具体的に開示されたＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又
はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドによる治療か、又は具体的に開示されてい
なくとも、患者への投与後にインビボで特定のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び
／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドに変換されるＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドによる治療が含まれ
るものとする。好適なプロドラッグ誘導体の選択及び調製に関する従来の手順は、例えば
、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，１９８５）に記載されている。
ＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドのプロドラッグを含む。一般に、このようなプ
ロドラッグは、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合ポリヌクレオチドの機能性誘導体であり、これは、必要なＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドにインビボで容易に変換
可能である。したがって、本発明の治療方法における用語「投与」には、本明細書に記載
される様々な障害の、具体的に開示されたＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又
はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドによる治療か、又は具体的に開示されてい
なくとも、患者への投与後にインビボで特定のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び
／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドに変換されるＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドによる治療が含まれ
るものとする。好適なプロドラッグ誘導体の選択及び調製に関する従来の手順は、例えば
、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，１９８５）に記載されている。
【0134】
本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポ
リヌクレオチドを調製する過程のいずれかの間、関連する分子のいずれかにおける感受性
基又は反応性基を保護することが必要である及び／又は望ましい場合がある。これは、Ｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ
．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３、及びＴ．Ｗ．Ｇｒ
ｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏ
ｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１（
それらのそれぞれは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる
。）に記載されるものなど、従来の保護基の手段によって達成され得る。保護基は、好都
合な後続段階において、当該技術分野で既知の方法を用いて除去することができる。
リヌクレオチドを調製する過程のいずれかの間、関連する分子のいずれかにおける感受性
基又は反応性基を保護することが必要である及び／又は望ましい場合がある。これは、Ｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ
．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３、及びＴ．Ｗ．Ｇｒ
ｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏ
ｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１（
それらのそれぞれは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる
。）に記載されるものなど、従来の保護基の手段によって達成され得る。保護基は、好都
合な後続段階において、当該技術分野で既知の方法を用いて除去することができる。
【0135】
使用方法
本発明は、ＧＤＦ１５受容体（ＧＤＦ１５Ｆ、ＧＦＲＡＬ）媒介症候群及び／又はＧＬ
Ｐ１受容体媒介症候群、障害、又は疾患を予防する、治療する、又は寛解させることを、
それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物
を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を目的とする。
本発明は、ＧＤＦ１５受容体（ＧＤＦ１５Ｆ、ＧＦＲＡＬ）媒介症候群及び／又はＧＬ
Ｐ１受容体媒介症候群、障害、又は疾患を予防する、治療する、又は寛解させることを、
それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物
を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を目的とする。
【0136】
本発明は、障害、疾患、若しくは病態、又は当該障害、疾患、若しくは病態のうちの任
意の１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させること
を、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤ
Ｆ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組
成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供する。
意の１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させること
を、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤ
Ｆ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組
成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供する。
【0137】
特定の実施形態によると、疾患障害、又は病態は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタ
ボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（
例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高イン
スリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症
、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及
び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾
患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、湿疹、睡眠時無呼
吸症、変形性関節症、多嚢胞性卵巣症候群、慢性腎臓病、うつ病、及び／又は癌からなる
群から選択される。
ボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（
例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高イン
スリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症
、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及
び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾
患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、湿疹、睡眠時無呼
吸症、変形性関節症、多嚢胞性卵巣症候群、慢性腎臓病、うつ病、及び／又は癌からなる
群から選択される。
【0138】
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ
、又はそれ以上を実現するのに十分である治療量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害、
若しくは病態、又はそれに関連する症状の重症度を低減する、又は寛解させること、（ｉ
ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること
、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止
すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮
を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進
行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連す
る症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそ
れに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、
障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、
（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率
を高めること、（ｉｖ）対象において治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関
連する症状を阻止又は低減させること、（ｘｉｉ）別の治療の予防効果若しくは治療効果
（複数可）を強化又は改善すること、及び／又は（ｘｉｉｉ）治療される疾患、障害又は
病態を有する対象の生活の質を改善すること。
、又はそれ以上を実現するのに十分である治療量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害、
若しくは病態、又はそれに関連する症状の重症度を低減する、又は寛解させること、（ｉ
ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること
、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止
すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮
を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進
行又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連す
る症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそ
れに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、
障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、
（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率
を高めること、（ｉｖ）対象において治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関
連する症状を阻止又は低減させること、（ｘｉｉ）別の治療の予防効果若しくは治療効果
（複数可）を強化又は改善すること、及び／又は（ｘｉｉｉ）治療される疾患、障害又は
病態を有する対象の生活の質を改善すること。
【0139】
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の
生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物である
か、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、な
どの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために
最適に漸増される。
生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物である
か、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、な
どの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために
最適に漸増される。
【0140】
本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及
び「治療（treatment）」という用語は全て、疾患、障害、又は病態に関連する少なくと
も１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象にお
いて必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治
療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」はまた、疾
患、障害、又は病態を退縮させる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅ら
せることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する
（treating）」、及び「治療（treatment）」は、疾患、障害、若しくは病態に関連する
１つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実
施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再
発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、
疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療
する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指
す。
び「治療（treatment）」という用語は全て、疾患、障害、又は病態に関連する少なくと
も１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象にお
いて必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。用語「治
療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」はまた、疾
患、障害、又は病態を退縮させる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅ら
せることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する
（treating）」、及び「治療（treatment）」は、疾患、障害、若しくは病態に関連する
１つ以上の症状の緩和、進行若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実
施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再
発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、
疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療
する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指
す。
【0141】
一実施形態では、本発明は、肥満、又は肥満の任意の１つ以上の症状を予防する、治療
する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象において行
う方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必要とす
る対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象の体重は、本明細書に記載
の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレ
オチド、医薬組成物、形態、又は薬剤のいずれかの投与前の対象の体重に対して、又は本
明細書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合ポリヌクレオチド、医薬組成物、形態、薬剤、又は組み合わせのいずれも受けていない
対照対象と比較して、例えば、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．５％、約
０．５％～約１％、約１％～約５％、約２％～約３％、約５％～約１０％、約１０％～約
１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約
３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％低減される
。
する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象において行
う方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必要とす
る対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象の体重は、本明細書に記載
の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレ
オチド、医薬組成物、形態、又は薬剤のいずれかの投与前の対象の体重に対して、又は本
明細書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合ポリヌクレオチド、医薬組成物、形態、薬剤、又は組み合わせのいずれも受けていない
対照対象と比較して、例えば、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．５％、約
０．５％～約１％、約１％～約５％、約２％～約３％、約５％～約１０％、約１０％～約
１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約
３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％低減される
。
【0142】
いくつかの実施形態では、体重の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間
、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ
月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、
約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間
、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される
。
、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ
月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、
約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間
、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される
。
【0143】
本発明は、症候群、障害、若しくは疾患、又は当該症候群、障害、若しくは疾患のうち
のいずれか１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させ
ることを、それを必要とする対象において行う方法を提供し、当該症候群、障害、又は疾
患は、肥満、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンド
ロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリ
ン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異
常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール
及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、
骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎
（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、この方法は、有効量の本発
明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド
、及び／又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
のいずれか１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させ
ることを、それを必要とする対象において行う方法を提供し、当該症候群、障害、又は疾
患は、肥満、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンド
ロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリ
ン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異
常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール
及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、
骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎
（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、この方法は、有効量の本発
明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド
、及び／又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0144】
本明細書で使用される場合、メタボリックシンドロームは、高血糖（例えば、高空腹時
血糖）、高血圧、異常コレステロールレベル（例えば、低ＨＤＬレベル）、異常トリグリ
セリドレベル（例えば、高トリグリセリド）、太いウエストライン（すなわち、腹囲）、
腹部領域の脂肪の増加、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高いＣ反応性タンパク質レベル
（すなわち、前炎症状態）、及び血漿プラスミノゲン活性化因子阻害剤－１及びフィブリ
ノーゲンレベル（すなわち、血栓状態）の任意の１つ又は２つ以上を有する対象を指す。
血糖）、高血圧、異常コレステロールレベル（例えば、低ＨＤＬレベル）、異常トリグリ
セリドレベル（例えば、高トリグリセリド）、太いウエストライン（すなわち、腹囲）、
腹部領域の脂肪の増加、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高いＣ反応性タンパク質レベル
（すなわち、前炎症状態）、及び血漿プラスミノゲン活性化因子阻害剤－１及びフィブリ
ノーゲンレベル（すなわち、血栓状態）の任意の１つ又は２つ以上を有する対象を指す。
【0145】
本発明は、食物摂取を低減することを、それを必要とする対象において行う方法を提供
し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与
することを含む。いくつかの実施形態では、対象の食物摂取は、本明細書に記載の本発明
のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、
医薬組成物、形態、又は薬剤のいずれかの投与前の対象の食物摂取に対して、又は本明細
書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポ
リヌクレオチド、医薬組成物、形態、薬剤、又は組み合わせのいずれも受けていない対照
対象と比較して、例えば、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．５％、約０．
５％～約１％、約１％～約５％、約２％～約３％、約５％～約１０％、約１０％～約１５
％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５
％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％低減される。
し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与
することを含む。いくつかの実施形態では、対象の食物摂取は、本明細書に記載の本発明
のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、
医薬組成物、形態、又は薬剤のいずれかの投与前の対象の食物摂取に対して、又は本明細
書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポ
リヌクレオチド、医薬組成物、形態、薬剤、又は組み合わせのいずれも受けていない対照
対象と比較して、例えば、約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．５％、約０．
５％～約１％、約１％～約５％、約２％～約３％、約５％～約１０％、約１０％～約１５
％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５
％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％低減される。
【0146】
いくつかの実施形態では、食物摂取の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ
月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約
８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年
間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６
年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持さ
れる。
月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約
８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年
間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６
年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持さ
れる。
【0147】
本発明は、糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）を低減することを、それを必要とする対象にお
いて行う方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必
要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象のＡ１Ｃは、本明細
書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポ
リヌクレオチド、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の
Ａ１Ｃに対して、又は本明細書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせ
のいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．００１％～約０．０１％、
約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．２％、約０．２％～約０．３％、約０．
３％～約０．４％、約０．４％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％
、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約
４％～約５％、約５％～約６％、約６％～約７％、約７％～約８％、約８％～約９％、又
は約９％～約１０％低減される。
いて行う方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必
要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象のＡ１Ｃは、本明細
書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポ
リヌクレオチド、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の
Ａ１Ｃに対して、又は本明細書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせ
のいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．００１％～約０．０１％、
約０．０１％～約０．１％、約０．１％～約０．２％、約０．２％～約０．３％、約０．
３％～約０．４％、約０．４％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％
、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約
４％～約５％、約５％～約６％、約６％～約７％、約７％～約８％、約８％～約９％、又
は約９％～約１０％低減される。
【0148】
他の実施形態では、空腹時血糖レベルを低減することを、それを必要とする対象におい
て行う方法が提供され、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必
要とする対象に投与することを含む。空腹時血糖レベルは、本明細書に記載の本発明のＧ
ＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、組成
物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の空腹時血糖レベルに対
して、又は本明細書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも
受けていない対照対象と比較して、約１４０～約１５０ｍｇ／ｄＬ未満、約１４０～約１
３０ｍｇ／ｄＬ未満、約１３０～約１２０ｍｇ／ｄＬ未満、約１２０～約１１０ｍｇ／ｄ
Ｌ未満、約１１０～約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約１００～約９０ｍｇ／ｄＬ未満、又は約
９０～約８０ｍｇ／ｄＬ未満まで低減され得る。
て行う方法が提供され、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必
要とする対象に投与することを含む。空腹時血糖レベルは、本明細書に記載の本発明のＧ
ＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、組成
物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の空腹時血糖レベルに対
して、又は本明細書に記載の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも
受けていない対照対象と比較して、約１４０～約１５０ｍｇ／ｄＬ未満、約１４０～約１
３０ｍｇ／ｄＬ未満、約１３０～約１２０ｍｇ／ｄＬ未満、約１２０～約１１０ｍｇ／ｄ
Ｌ未満、約１１０～約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約１００～約９０ｍｇ／ｄＬ未満、又は約
９０～約８０ｍｇ／ｄＬ未満まで低減され得る。
【0149】
本発明は、ＧＬＰ１受容体活性及びＧＤＦ１５受容体活性を調節することを、それを必
要とする対象において行う方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤ
Ｆ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組
成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「調
節する」とは、受容体活性を増加又は減少させることを指す。
要とする対象において行う方法を提供し、この方法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤ
Ｆ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組
成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「調
節する」とは、受容体活性を増加又は減少させることを指す。
【0150】
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び
／若しくはＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、又はその形態、組成物、若しく
は薬剤は、それを必要とする対象に、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５
回、１日６回、１日７回、又は１日８回投与される。他の実施形態では、有効量の本発明
のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／若しくはＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌ
クレオチド、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、それを必要とする対象に、２日に
１回、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、１ヶ月に２回、
１ヶ月に３回、又は１ヶ月に４回投与される。
／若しくはＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、又はその形態、組成物、若しく
は薬剤は、それを必要とする対象に、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５
回、１日６回、１日７回、又は１日８回投与される。他の実施形態では、有効量の本発明
のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／若しくはＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌ
クレオチド、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、それを必要とする対象に、２日に
１回、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、１ヶ月に２回、
１ヶ月に３回、又は１ヶ月に４回投与される。
【0151】
本発明の別の実施形態は、疾患、障害、若しくは症候群、又は当該疾患、障害、若しく
は症候群のいずれかの１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又
は寛解させることを、それを必要とする対象において行う方法を含み、この方法は、併用
療法で、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与すること
を含む。特定の実施形態では、併用治療薬は、第２の治療薬である。特定の実施形態では
、併用療法は、外科療法である。
は症候群のいずれかの１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又
は寛解させることを、それを必要とする対象において行う方法を含み、この方法は、併用
療法で、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与すること
を含む。特定の実施形態では、併用治療薬は、第２の治療薬である。特定の実施形態では
、併用療法は、外科療法である。
【0152】
本明細書で使用するとき、用語「併用される」は、対象への２つ以上の治療薬の投与と
の関連において、複数の治療薬の使用を指す。
の関連において、複数の治療薬の使用を指す。
【0153】
本明細書で使用されるとき、併用療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
タンパク質及び／若しくはＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、又はその形態、
組成物、若しくは薬剤と同時に、１つ以上の追加の治療薬又は１つ以上の外科療法を、そ
れを必要とする対象に施すことを指す。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療
薬又は外科療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧ
ＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと同日に施され得、他の実施形態では、１つ以
上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと同じ週又は同じ月に施され得
る。
タンパク質及び／若しくはＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、又はその形態、
組成物、若しくは薬剤と同時に、１つ以上の追加の治療薬又は１つ以上の外科療法を、そ
れを必要とする対象に施すことを指す。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療
薬又は外科療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧ
ＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと同日に施され得、他の実施形態では、１つ以
上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと同じ週又は同じ月に施され得
る。
【0154】
本発明はまた、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを、併用療
法を用いて予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを
必要とする対象において行うことも企図し、当該併用療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１
－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は
医薬組成物を、以下の治療薬のうちの任意の１つ以上と組み合わせて、それを必要とする
対象に投与することを含む：ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４）阻害剤（例え
ば、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチンなど）；ＧＬ
Ｐ１受容体アゴニスト（例えば、エキセナチド及びリキシセナチドなどの、短時間作用型
ＧＬＰ１受容体アゴニスト；リラグルチドなどの中間作用型ＧＬＰ１受容体アゴニスト；
長期放出型エキセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドなどの長時間作用型ＧＬＰ１
受容体アゴニスト）；ナトリウム－グルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ－２）阻害剤（例
えば、カナグリフォジン、ダパグリフォジン、エンパグリフォジンなど）；胆汁酸封鎖剤
（例えば、コレセベラムなど）；ドーパミン受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチ
ン急速放出）；ビグアニド（例えば、メトホルミンなど）；インスリン；オキシントモジ
ュリン；スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリ
ブリド、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリソキセピド、グリクロピラミド、トラ
ザミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、カブタミドなど）；及びチアゾリジンジオン
（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリ
タゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、トログリタゾンなど）。い
くつかの実施形態では、追加の治療薬（複数可）の用量は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと組み合わせて
与えられる場合に低減される。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと組み合わせて使
用される場合、追加の治療薬（複数可）は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い
用量で使用され得る。
法を用いて予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを
必要とする対象において行うことも企図し、当該併用療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１
－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は
医薬組成物を、以下の治療薬のうちの任意の１つ以上と組み合わせて、それを必要とする
対象に投与することを含む：ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４）阻害剤（例え
ば、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチンなど）；ＧＬ
Ｐ１受容体アゴニスト（例えば、エキセナチド及びリキシセナチドなどの、短時間作用型
ＧＬＰ１受容体アゴニスト；リラグルチドなどの中間作用型ＧＬＰ１受容体アゴニスト；
長期放出型エキセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドなどの長時間作用型ＧＬＰ１
受容体アゴニスト）；ナトリウム－グルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ－２）阻害剤（例
えば、カナグリフォジン、ダパグリフォジン、エンパグリフォジンなど）；胆汁酸封鎖剤
（例えば、コレセベラムなど）；ドーパミン受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチ
ン急速放出）；ビグアニド（例えば、メトホルミンなど）；インスリン；オキシントモジ
ュリン；スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリ
ブリド、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリソキセピド、グリクロピラミド、トラ
ザミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、カブタミドなど）；及びチアゾリジンジオン
（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリ
タゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、トログリタゾンなど）。い
くつかの実施形態では、追加の治療薬（複数可）の用量は、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと組み合わせて
与えられる場合に低減される。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと組み合わせて使
用される場合、追加の治療薬（複数可）は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い
用量で使用され得る。
【0155】
本発明は、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを、併用療法を
用いて予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要
とする対象において行うことを企図し、当該併用療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬
組成物を、外科療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。特定
の実施形態では、外科療法は、肥満手術（例えば、Ｒｏｕｘ－ｅｎ－Ｙ胃バイパス手術な
どの胃バイパス手術；スリーブ胃切除術；調節可能な胃バンド手術；十二指腸スイッチを
伴う胆すい消化回避術；胃内バルーン；胃縫縮術、及びこれらの組み合わせ）であり得る
。
用いて予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要
とする対象において行うことを企図し、当該併用療法は、有効量の本発明のＧＬＰ１－Ｇ
ＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチド、及び／又は医薬
組成物を、外科療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。特定
の実施形態では、外科療法は、肥満手術（例えば、Ｒｏｕｘ－ｅｎ－Ｙ胃バイパス手術な
どの胃バイパス手術；スリーブ胃切除術；調節可能な胃バンド手術；十二指腸スイッチを
伴う胆すい消化回避術；胃内バルーン；胃縫縮術、及びこれらの組み合わせ）であり得る
。
【0156】
１つ以上の追加の治療薬又は外科療法が、有効量の本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合
タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと同日に投与される実
施形態では、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ
１５融合ポリヌクレオチドは、追加の治療薬又は外科療法の前、後、又は同時に投与され
得る。用語「併用される」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。
例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療
薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時
間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、
３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例え
ば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６
時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５
週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合ポリヌクレオチドと同日に投与される実
施形態では、本発明のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質及び／又はＧＬＰ１－ＧＤＦ
１５融合ポリヌクレオチドは、追加の治療薬又は外科療法の前、後、又は同時に投与され
得る。用語「併用される」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。
例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療
薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時
間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、
３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例え
ば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６
時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５
週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
【0157】
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態１は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖文化因子１５（ＧＤＦ１
５）融合タンパク質であり、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチド
、第１のリンカーペプチド、血清アルブミンタンパク質、第２のリンカーペプチド、及び
ＧＤＦ１５タンパク質を含む。
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態１は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖文化因子１５（ＧＤＦ１
５）融合タンパク質であり、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチド
、第１のリンカーペプチド、血清アルブミンタンパク質、第２のリンカーペプチド、及び
ＧＤＦ１５タンパク質を含む。
【0158】
実施形態２は、ＧＬＰ１ペプチドが、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含む、実施形態１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質である。
酸配列を含む、実施形態１に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質である。
【0159】
実施形態３は、第１のリンカーペプチドが、配列番号５～２５からなる群から選択され
るアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
である。
るアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
である。
【0160】
実施形態４は、血清アルブミンタンパク質が、配列番号２６又は配列番号２７から選択
されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質である。
されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１
５融合タンパク質である。
【0161】
実施形態５は、第２のリンカーペプチドが、配列番号２８～３０からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質である。
れるアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質である。
【0162】
実施形態６は、ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号３１又は配列番号３２から選択され
るアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合タンパク質である。
るアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融
合タンパク質である。
【0163】
実施形態７は、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が、配列番号３３～７４及び８４
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質で
ある。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質で
ある。
【0164】
実施形態８は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タン
パク質をコードする単離核酸である。
パク質をコードする単離核酸である。
【0165】
実施形態９は、実施形態８に記載の単離核酸を含むベクターである。
【0166】
請求項１０は、実施形態８に記載の単離核酸又は請求項９に記載のベクターを含む宿主
細胞である。
細胞である。
【0167】
実施形態１１は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質と、医薬上許容できる担体と、を含む医薬組成物である。
ンパク質と、医薬上許容できる担体と、を含む医薬組成物である。
【0168】
実施形態１２は、肥満を治療又は予防することを、それを必要とする対象において行う
方法であって、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投
与することを含む、方法である。
方法であって、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投
与することを含む、方法である。
【0169】
実施形態１３は、有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによっ
て、医薬組成物の投与前の対象の体重と比較して、約５％～約１０％、約１０％～約１５
％、約１５％～約２０％、又は約２０％～約２５％体重を減少させる、実施形態１２に記
載の方法である。
て、医薬組成物の投与前の対象の体重と比較して、約５％～約１０％、約１０％～約１５
％、約１５％～約２０％、又は約２０％～約２５％体重を減少させる、実施形態１２に記
載の方法である。
【0170】
実施例１４は、疾患又は障害を治療又は予防することを、それを必要とする対象におい
て行う方法であって、当該疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリック
シンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグ
リセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム
性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂
質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎
症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）
、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、この方法は、有効量の実施形態１１に記
載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。
て行う方法であって、当該疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリック
シンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグ
リセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム
性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂
質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎
症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）
、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、この方法は、有効量の実施形態１１に記
載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。
【0171】
実施形態１５は、当該疾患又は障害が肥満である、実施形態１４に記載の方法である。
【0172】
実施形態１６は、当該疾患又は障害がＩ型糖尿病である、実施形態１４に記載の方法で
ある。
ある。
【0173】
実施形態１７は、当該疾患又は障害がＩＩ型糖尿病である、実施形態１４に記載の方法
である。
である。
【0174】
実施形態１８は、当該疾患又は障害がメタボリックシンドロームである、実施形態１４
に記載の方法である。
に記載の方法である。
【0175】
実施形態１９は、当該疾患又は障害が腎疾患である、実施形態１４に記載の方法である
。
。
【0176】
実施形態２０は、当該疾患又は障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である
、実施形態１４に記載の方法である。
、実施形態１４に記載の方法である。
【0177】
実施形態２１は、当該疾患又は障害が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であ
る、実施形態１４に記載の方法である。
る、実施形態１４に記載の方法である。
【0178】
実施形態２２は、食物摂取を低減することを、それを必要とする対象において行う方法
であって、この方法は、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする
対象に投与することを含む、方法である。
であって、この方法は、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それを必要とする
対象に投与することを含む、方法である。
【0179】
実施形態２３は、有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによっ
て、医薬組成物の投与前の対象の食物摂取と比較して、約５％～約１０％、約１０％～約
１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約
３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％食物摂取を
減少させる、実施形態２２に記載の方法である。
て、医薬組成物の投与前の対象の食物摂取と比較して、約５％～約１０％、約１０％～約
１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約
３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、又は約４５％～約５０％食物摂取を
減少させる、実施形態２２に記載の方法である。
【0180】
実施形態２４は、ＧＬＰ１受容体活性を調節することを、それを必要とする対象におい
て行う方法であって、この方法は、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それを
必要とする対象に投与することを含む、方法である。
て行う方法であって、この方法は、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それを
必要とする対象に投与することを含む、方法である。
【0181】
実施形態２５は、ＧＤＦ１５受容体活性を調節することを、それを必要とする対象にお
いて行う方法であって、この方法は、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それ
を必要とする対象に投与することを含む、方法である。
いて行う方法であって、この方法は、有効量の実施形態１１に記載の医薬組成物を、それ
を必要とする対象に投与することを含む、方法である。
【0182】
実施形態２６は、医薬組成物が注射により投与される、実施形態１１～２５のいずれか
１つに記載の方法である。
１つに記載の方法である。
【0183】
実施形態２７は、注射が、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達される、実施形態
２６に記載の方法である。
２６に記載の方法である。
【0184】
実施形態２８は、医薬組成物が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、実施形態１
１～２７のいずれか１つに記載の方法である。
１～２７のいずれか１つに記載の方法である。
【0185】
実施形態２９は、医薬組成物が、それを必要とする対象に、毎日、毎週、又は毎月投与
される、実施形態１１～２８のいずれか１つに記載の方法である。
される、実施形態１１～２８のいずれか１つに記載の方法である。
【0186】
実施形態３０は、医薬組成物が、１日に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与
される、実施形態２９に記載の方法である。
される、実施形態２９に記載の方法である。
【0187】
実施形態３１は、医薬組成物が、週に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与さ
れる、実施形態２９に記載の方法である。
れる、実施形態２９に記載の方法である。
【0188】
実施形態３２は、医薬組成物が、１ヶ月に１回、２回、３回、又は４回投与される、実
施形態２９に記載の方法である。
施形態２９に記載の方法である。
【0189】
実施形態３３は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質、実施形態８の単離核酸、及び／又は実施形態９のベクターを含むキットである
。
ンパク質、実施形態８の単離核酸、及び／又は実施形態９のベクターを含むキットである
。
【0190】
実施形態３４は、キットが注射用デバイスを更に含む、実施形態３３に記載のキットで
ある。
ある。
【0191】
実施形態３５は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質含む医薬組成物を生成する方法であって、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
を医薬上許容できる担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法である。
ンパク質含む医薬組成物を生成する方法であって、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
を医薬上許容できる担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法である。
【0192】
実施形態３６は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タ
ンパク質を生成する方法であって、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする核
酸を含む細胞を、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する条件下で培養すること
と、細胞又は細胞培養物からＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を回収することと、を
含む、方法である。
ンパク質を生成する方法であって、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする核
酸を含む細胞を、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する条件下で培養すること
と、細胞又は細胞培養物からＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を回収することと、を
含む、方法である。
【実施例0193】
実施例１：ＧＬＰ１及びＧＤＦ１５アゴニストの組み合わせ
ＧＬＰ１及びＧＤＦ１５アゴニストを組み合わせた潜在的な相加的体重減少効果を、食
餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスで試験した。リラグルチド、ＧＬＰ１アゴニストを単独で
、又はＨＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号８１）分子と組み合わせて８日間投与した。ＨＳＡ
－ＧＤＦ１５を２日毎に与える一方、リラグルチドを毎日皮下投与した。体重減少は、こ
れらの独立した機構を組み合わせたときの相加性の可能性を実証するいずれかの単一薬剤
と比較して、両方のアゴニストを受容した動物においてより大きかった（図１）。
ＧＬＰ１及びＧＤＦ１５アゴニストを組み合わせた潜在的な相加的体重減少効果を、食
餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスで試験した。リラグルチド、ＧＬＰ１アゴニストを単独で
、又はＨＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号８１）分子と組み合わせて８日間投与した。ＨＳＡ
－ＧＤＦ１５を２日毎に与える一方、リラグルチドを毎日皮下投与した。体重減少は、こ
れらの独立した機構を組み合わせたときの相加性の可能性を実証するいずれかの単一薬剤
と比較して、両方のアゴニストを受容した動物においてより大きかった（図１）。
【0194】
実施例２：ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の設計
ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプチド、血清アルブミンタンパク質、及びＧＤ
Ｆ１５タンパク質又はＧＤＦ１５変異体タンパク質からなる組換え融合タンパク質を以下
のように設計した：ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプチドを、ＧＬＰ１ペプチド
又はＧＬＰ１変異体ペプチドのＣ末端にある第１のリンカーペプチドを介して、ヒト血清
アルブミンのＮ末端に結合した。ヒト血清アルブミンを、Ｃ末端で、第２のリンカーペプ
チドを介してＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体のＮ末端に結合する
。この設計は、ＧＤＦ１５二量体化界面を乱さないようにし、天然の鎖間ジスルフィドの
形成を可能にし、約１７０ＫＤａのホモ二量体をもたらすことを目的としている。分子全
体が組換えによって作製されるように設計されており、１つの遺伝子のみを必要とした（
図３）。
ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプチド、血清アルブミンタンパク質、及びＧＤ
Ｆ１５タンパク質又はＧＤＦ１５変異体タンパク質からなる組換え融合タンパク質を以下
のように設計した：ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプチドを、ＧＬＰ１ペプチド
又はＧＬＰ１変異体ペプチドのＣ末端にある第１のリンカーペプチドを介して、ヒト血清
アルブミンのＮ末端に結合した。ヒト血清アルブミンを、Ｃ末端で、第２のリンカーペプ
チドを介してＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体のＮ末端に結合する
。この設計は、ＧＤＦ１５二量体化界面を乱さないようにし、天然の鎖間ジスルフィドの
形成を可能にし、約１７０ＫＤａのホモ二量体をもたらすことを目的としている。分子全
体が組換えによって作製されるように設計されており、１つの遺伝子のみを必要とした（
図３）。
【0195】
ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１変異体ペプチドとしては、変異を有するヒトＧＬＰ１（
７－３６）ペプチド、又はヒトＧＬＰ１受容体をアゴナイズするアメリカドクトカゲ由来
の毒ペプチド、エキセンディン４（９－３９）のいずれかが挙げられる。配列番号１は、
（Ａ８Ｓ、Ａ３０Ｅ）変異を含有し（変異位置の番号付けは、融合タンパク質の開始から
ではなく、表１のＧＬＰ１ペプチド変異を指す）、配列番号２は、ヒトＧＬＰ１ペプチド
（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１２７５ ９８－１２７）由来の（Ａ８Ｇ、Ｇ２２Ｅ、Ｒ３
６Ｇ）変異を含有する。配列番号３は、エキセンディン４ペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ
－Ｐ２６３４９ ４８－８６）を含有する。
７－３６）ペプチド、又はヒトＧＬＰ１受容体をアゴナイズするアメリカドクトカゲ由来
の毒ペプチド、エキセンディン４（９－３９）のいずれかが挙げられる。配列番号１は、
（Ａ８Ｓ、Ａ３０Ｅ）変異を含有し（変異位置の番号付けは、融合タンパク質の開始から
ではなく、表１のＧＬＰ１ペプチド変異を指す）、配列番号２は、ヒトＧＬＰ１ペプチド
（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１２７５ ９８－１２７）由来の（Ａ８Ｇ、Ｇ２２Ｅ、Ｒ３
６Ｇ）変異を含有する。配列番号３は、エキセンディン４ペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ
－Ｐ２６３４９ ４８－８６）を含有する。
【0196】
天然ヒト血清アルブミン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６８ ２５－６０９）は、１
７分子内ジスルフィド結合を形成する３５システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）残基を含有し、唯一
の遊離システインとしてＣｙｓ－３４を残す。この遊離Ｃｙｓー３４は、複数の活性酸素
種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）を捕獲することにより、フリーラジカルスカベン
ジャーとして機能することが示されている（Ｔａｖｅｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｉｎ
ｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ，３：４（２０１３））。したがって、この遊離ＣｙｓをＳｅ
ｒに変異させて配列番号２６を作製し、化学反応性及び酸化による不均質性のリスクを最
小化した。
７分子内ジスルフィド結合を形成する３５システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）残基を含有し、唯一
の遊離システインとしてＣｙｓ－３４を残す。この遊離Ｃｙｓー３４は、複数の活性酸素
種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）を捕獲することにより、フリーラジカルスカベン
ジャーとして機能することが示されている（Ｔａｖｅｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｉｎ
ｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ，３：４（２０１３））。したがって、この遊離ＣｙｓをＳｅ
ｒに変異させて配列番号２６を作製し、化学反応性及び酸化による不均質性のリスクを最
小化した。
【0197】
成熟ＧＤＦ１５のＮ末端（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９９８８ １９７－３０８）は、
タンパク質分解責任部位（Ｒ１９８）及び脱アミド責任部位（Ｎ１９９）を含有する。し
たがって、融合タンパク質は、それらの責任部位が欠失したＧＤＦ１５（２０１～３０８
）（配列番号３１）を含有する。
タンパク質分解責任部位（Ｒ１９８）及び脱アミド責任部位（Ｎ１９９）を含有する。し
たがって、融合タンパク質は、それらの責任部位が欠失したＧＤＦ１５（２０１～３０８
）（配列番号３１）を含有する。
【0198】
実施例３：発現及び精製方法
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－第１のリンカー－血清アルブミン（
例えば、ＨＳＡ、ＧＳＡ）タンパク質、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ、ＧＳＡ）－第
２のリンカー－ＧＤＦ１５タンパク質、及び／又は上記実施例で利用されるＧＤＦ１５タ
ンパク質を、ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２７）又はＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）（Ｔｈｅｒ
ｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１２７；Ｗａｌｔｈａｍ
，ＭＡ）のいずれかで発現させた。ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）での発現のために
、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードしているプラスミドを、製造元の推奨に
従って一過性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトした。簡潔に述べる
と、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、３７℃、８％ＣＯ２及び１２５ＲＰＭに設定した振盪イン
キュベータ内で、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ）中の懸濁液中に維持した。トランスフェクションの日に、１ｍＬ当たり
２．５×１０６細胞に希釈することができるように細胞を継代し、細胞生存率を９５％以
上に維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２
９３トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞１ｍＬ毎に１マイクログラムのプラ
スミドＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ（商標）ＳＦＭ複合体化培地に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃ
ｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を、１：２．６の比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し
、これもＯｐｔｉＭＥＭ（商標）に希釈し、室温で５分間インキュベートさせた。希釈し
たＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を２０分間合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成さ
せ、次いで、細胞に添加した。一晩インキュベートした後、Ｅｘｐｉ２９３（商標）フィ
ード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３エンハンサーを細胞に添加した。細
胞を３７℃で４日間振盪しながら培養した後で、培養上清を採取した。
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、ＧＬＰ１－第１のリンカー－血清アルブミン（
例えば、ＨＳＡ、ＧＳＡ）タンパク質、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ、ＧＳＡ）－第
２のリンカー－ＧＤＦ１５タンパク質、及び／又は上記実施例で利用されるＧＤＦ１５タ
ンパク質を、ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２７）又はＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）（Ｔｈｅｒ
ｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１２７；Ｗａｌｔｈａｍ
，ＭＡ）のいずれかで発現させた。ＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）での発現のために
、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードしているプラスミドを、製造元の推奨に
従って一過性トランスフェクションによって細胞にトランスフェクトした。簡潔に述べる
と、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、３７℃、８％ＣＯ２及び１２５ＲＰＭに設定した振盪イン
キュベータ内で、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ）中の懸濁液中に維持した。トランスフェクションの日に、１ｍＬ当たり
２．５×１０６細胞に希釈することができるように細胞を継代し、細胞生存率を９５％以
上に維持した。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２
９３トランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞１ｍＬ毎に１マイクログラムのプラ
スミドＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ（商標）ＳＦＭ複合体化培地に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃ
ｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を、１：２．６の比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し
、これもＯｐｔｉＭＥＭ（商標）に希釈し、室温で５分間インキュベートさせた。希釈し
たＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を２０分間合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成さ
せ、次いで、細胞に添加した。一晩インキュベートした後、Ｅｘｐｉ２９３（商標）フィ
ード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３エンハンサーを細胞に添加した。細
胞を３７℃で４日間振盪しながら培養した後で、培養上清を採取した。
【0199】
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ＣＯ２及び１２５ＲＰＭに設定した
振盪インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の懸濁液中に維持した。トランスフェクションの日に、１ｍ
Ｌ当たり６．０×１０６細胞に希釈することができるように細胞を継代し、細胞生存率を
９８％以上に維持する。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（
商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞の１ｍＬ毎に、１マイクロ
グラムのプラスミドＤＮＡを使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体形成培地に希
釈する。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を１：３の比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ
：試薬）で使用し、これもＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈する。希釈したＤＮＡ及びトラ
ンスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞
に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉ
Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサーを細胞に添加した。細胞を３２℃で５日
間振盪しながら培養した後、培養上清を採取した。
振盪インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の懸濁液中に維持した。トランスフェクションの日に、１ｍ
Ｌ当たり６．０×１０６細胞に希釈することができるように細胞を継代し、細胞生存率を
９８％以上に維持する。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（
商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞の１ｍＬ毎に、１マイクロ
グラムのプラスミドＤＮＡを使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体形成培地に希
釈する。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を１：３の比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ
：試薬）で使用し、これもＯｐｔｉＰＲＯ（商標）に希釈する。希釈したＤＮＡ及びトラ
ンスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞
に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉ
Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサーを細胞に添加した。細胞を３２℃で５日
間振盪しながら培養した後、培養上清を採取した。
【0200】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を、単段階親和性捕獲、又は親和性捕獲の後に調
製用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）研磨工程を用いる２段階過程のいずれか
によって、採取した培養上清から精製した。一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉＣＨ
Ｏ（商標）細胞からの細胞上清を、樹脂１ｍＬ当たりタンパク質１０ｍｇの適当な容量で
、予め平衡化した（ｄＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨＳＡ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカラム
（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ提供のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ
Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ）にロードした。ロー
ド後、カラムを最大１２カラム体積（ＣＶ）のｄＰＢＳ ｐＨ ７．２で洗浄し、続いて
、３ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム中１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄することによ
って、非結合のタンパク質や不純物を除去した。カラムに結合したＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質を、最大１０ＣＶの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５を用いて、１０
％（体積で）の１Ｍトリス（未滴定）を含有する分留管に溶出した。ピーク画分をプール
し、０．２μｍ膜で濾過した後、緩衝液をｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）に交換するか、又は４
℃でＳＥＣ工程に進むかのいずれかを行った。
製用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）研磨工程を用いる２段階過程のいずれか
によって、採取した培養上清から精製した。一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉＣＨ
Ｏ（商標）細胞からの細胞上清を、樹脂１ｍＬ当たりタンパク質１０ｍｇの適当な容量で
、予め平衡化した（ｄＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨＳＡ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカラム
（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ提供のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ
Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘ）にロードした。ロー
ド後、カラムを最大１２カラム体積（ＣＶ）のｄＰＢＳ ｐＨ ７．２で洗浄し、続いて
、３ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム中１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄することによ
って、非結合のタンパク質や不純物を除去した。カラムに結合したＧＬＰ１－ＧＤＦ１５
融合タンパク質を、最大１０ＣＶの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５を用いて、１０
％（体積で）の１Ｍトリス（未滴定）を含有する分留管に溶出した。ピーク画分をプール
し、０．２μｍ膜で濾過した後、緩衝液をｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）に交換するか、又は４
℃でＳＥＣ工程に進むかのいずれかを行った。
【0201】
ＳＥＣ工程では、捕獲工程で得たタンパク質を適当な体積まで濃縮した後、２６／６０
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌ
ｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）にロードした。高い純度でＳＥＣカラムから
溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定された）をプールした。（いずれ
かの方法で得た）タンパク質の濃度を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＴＭ分光光
度計において２８０ｎｍの吸光度で測定した。精製したタンパク質の質を、ＳＤＳ－ＰＡ
ＧＥ、及び分析用サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ ｓｙ
ｓｔｅｍ社）によって評価した。内毒素レベルを、ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（
登録商標）－Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ；Ｅａｓｔ Ｆａｌｍ
ｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて測定した。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌ
ｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）にロードした。高い純度でＳＥＣカラムから
溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定された）をプールした。（いずれ
かの方法で得た）タンパク質の濃度を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＴＭ分光光
度計において２８０ｎｍの吸光度で測定した。精製したタンパク質の質を、ＳＤＳ－ＰＡ
ＧＥ、及び分析用サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ ｓｙ
ｓｔｅｍ社）によって評価した。内毒素レベルを、ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（
登録商標）－Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ；Ｅａｓｔ Ｆａｌｍ
ｏｕｔｈ，ＭＡ）を用いて測定した。
【0202】
実施例４：１分子上のＧＬＰ１及びＧＤＦ１５の両アゴニストの送達による二重標的会
合及び相加効果
１分子上にＧＬＰ１及びＧＤＦ１５の両アゴニストを送達することによって相加効果を
得る可能性を、ゴリラ血清アルブミン（ＧＳＡ）とのアゴニストの融合を８日間投与した
ＤＩＯマウスの体重減少を評価することによって試験した。ＧＳＡは、これらのツール分
子中のＨＳＡの代用物として使用した。マウスは、８ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ１－ＧＳＡ
－ＧＤＦ１５（配列番号７２）、ＧＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（Ｉ８９Ｒ）（配列番号
７３、Ｉ８９Ｒ変異はＧＤＦ１５活性を消失させる）、ＧＬＰ１（９－３６）－ＧＳＡ－
ＧＤＦ１５（配列番号７４、又はＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７５）の皮下投与を受け
、後者の２つはいずれも、分解したＧＬＰ１を再現するように設計された。２つの追加の
動物群を対照及び基準とし、一方の群には、溶媒のみを与え、別の群には、ＧＬＰ１アゴ
ニストのデュラグルチドを投与した。ＧＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７２）を
投与されたマウスは、ＧＬＰ１（９－３６）－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７４）、Ｇ
ＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（Ｉ８９Ｒ）（配列番号７３）、及びＧＳＡ－ＧＤＦ１５（
配列番号７５）を投与されたマウスより大きく体重が減少し、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＦＲＡＬ
の両方が単一分子によりアゴナイズされ、結果として相加効果が得られ得るという概念の
証明をもたらした（図２）。
合及び相加効果
１分子上にＧＬＰ１及びＧＤＦ１５の両アゴニストを送達することによって相加効果を
得る可能性を、ゴリラ血清アルブミン（ＧＳＡ）とのアゴニストの融合を８日間投与した
ＤＩＯマウスの体重減少を評価することによって試験した。ＧＳＡは、これらのツール分
子中のＨＳＡの代用物として使用した。マウスは、８ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ１－ＧＳＡ
－ＧＤＦ１５（配列番号７２）、ＧＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（Ｉ８９Ｒ）（配列番号
７３、Ｉ８９Ｒ変異はＧＤＦ１５活性を消失させる）、ＧＬＰ１（９－３６）－ＧＳＡ－
ＧＤＦ１５（配列番号７４、又はＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７５）の皮下投与を受け
、後者の２つはいずれも、分解したＧＬＰ１を再現するように設計された。２つの追加の
動物群を対照及び基準とし、一方の群には、溶媒のみを与え、別の群には、ＧＬＰ１アゴ
ニストのデュラグルチドを投与した。ＧＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７２）を
投与されたマウスは、ＧＬＰ１（９－３６）－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（配列番号７４）、Ｇ
ＬＰ１－ＧＳＡ－ＧＤＦ１５（Ｉ８９Ｒ）（配列番号７３）、及びＧＳＡ－ＧＤＦ１５（
配列番号７５）を投与されたマウスより大きく体重が減少し、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＦＲＡＬ
の両方が単一分子によりアゴナイズされ、結果として相加効果が得られ得るという概念の
証明をもたらした（図２）。
【0203】
実施例５：インビトロヒトＧＬＰ１Ｒ効力、エクスビボヒト、及びインビボマウス血漿
安定性に対するＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体及び第１のリンカーペプチ
ドの効果
異なるＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体及び異なる第１のリンカーペプチ
ドは、ｈＧＬＰ１過剰発現ＨＥＫ細胞中の環状アデノシンモノリン酸（ｃＡＭＰ）レベル
を測定するアッセイにおいて、インビトロｈＧＬＰ１受容体効力に対して異なる効果を有
する。キットの指示書に従って、Ｌａｎｃｅ競合ｃＡＭＰイムノアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した細胞内ｃＡＭＰ生成を測定する細胞ベ
ースのアッセイにおいて、インビトロＧＬＰ１Ｒ効力について融合をスクリーニングした
。マウス又はヒトＧＬＰ１Ｒを安定的に発現するクローンＨＥＫ２９３細胞をアッセイで
使用した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて化合物ＥＣ５０値を計算した
。一般に、ＧＬＰ１変異体（配列番号１）は、インビトロｈＧＬＰ１Ｒアッセイにおいて
、他の２つのＧＬＰ１変異体（配列番号２及び配列番号３）よりも効力がない。
安定性に対するＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体及び第１のリンカーペプチ
ドの効果
異なるＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体及び異なる第１のリンカーペプチ
ドは、ｈＧＬＰ１過剰発現ＨＥＫ細胞中の環状アデノシンモノリン酸（ｃＡＭＰ）レベル
を測定するアッセイにおいて、インビトロｈＧＬＰ１受容体効力に対して異なる効果を有
する。キットの指示書に従って、Ｌａｎｃｅ競合ｃＡＭＰイムノアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した細胞内ｃＡＭＰ生成を測定する細胞ベ
ースのアッセイにおいて、インビトロＧＬＰ１Ｒ効力について融合をスクリーニングした
。マウス又はヒトＧＬＰ１Ｒを安定的に発現するクローンＨＥＫ２９３細胞をアッセイで
使用した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて化合物ＥＣ５０値を計算した
。一般に、ＧＬＰ１変異体（配列番号１）は、インビトロｈＧＬＰ１Ｒアッセイにおいて
、他の２つのＧＬＰ１変異体（配列番号２及び配列番号３）よりも効力がない。
【0204】
ヒト血漿におけるエックスビボ安定性を評価した。簡潔に言えば、新鮮な非凍結ヒト血
漿を遠心分離によってヘパリン添加血から生成した。融合タンパク質を、静かに混合しな
がら、この基質中で、０、４、２４、４８、７２、及び９６時間、３７℃でインキュベー
トした。ヒト血漿中の融合分子のＧＬＰ１領域の経時的な安定性を、免疫親和性捕獲－ト
リプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によってモニタリングした。選択されたトリプシン
ペプチド、すなわちＨＳＥ（ＨＳＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ）（配列番号７
６）、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及
びＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）は、ＧＬＰ１ペプチド又は
ＧＬＰ１変異体ペプチド（配列番号１、２、及び３）のＮ末端にそれぞれ位置する。これ
らの選択されたトリプシンペプチドを、抗ＧＤＦ１５免疫親和性捕獲及びトリプシン消化
後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりモニタリングし、Ｎ末端を含有する無傷のＧＬＰ１を有する
融合分子の濃度の代理尺度とした。この方法により、試験した全ての分子は、ヒト血漿中
の適度なＧＬＰ１の経時的安定性を示した。
漿を遠心分離によってヘパリン添加血から生成した。融合タンパク質を、静かに混合しな
がら、この基質中で、０、４、２４、４８、７２、及び９６時間、３７℃でインキュベー
トした。ヒト血漿中の融合分子のＧＬＰ１領域の経時的な安定性を、免疫親和性捕獲－ト
リプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によってモニタリングした。選択されたトリプシン
ペプチド、すなわちＨＳＥ（ＨＳＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ）（配列番号７
６）、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及
びＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）は、ＧＬＰ１ペプチド又は
ＧＬＰ１変異体ペプチド（配列番号１、２、及び３）のＮ末端にそれぞれ位置する。これ
らの選択されたトリプシンペプチドを、抗ＧＤＦ１５免疫親和性捕獲及びトリプシン消化
後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりモニタリングし、Ｎ末端を含有する無傷のＧＬＰ１を有する
融合分子の濃度の代理尺度とした。この方法により、試験した全ての分子は、ヒト血漿中
の適度なＧＬＰ１の経時的安定性を示した。
【0205】
マウスにおけるインビボ安定性を評価した。融合タンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７中２ｍ
ｇ／ｋｇの用量で雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下投与した。血液試料を、投与後０、４
、２４及び４８時間でプロテアーゼ阻害剤を有するＫ３Ｅ Ｓａｒｓｔｅｄｔ血液採取管
に採取した。血漿を遠心分離により調製した。マウスにおけるインビボでの融合タンパク
質のＧＬＰ１領域の経時的な安定性を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／
ＭＳ分析によってモニタリングした。選択されたトリプシンペプチド、すなわちＨＳＥ（
ＨＳＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ）（配列番号７６）、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧ
ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦ
ＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）は、融合タンパク質を含有する配列番号１、２、及び３
のＮ末端にそれぞれ位置する。これらの選択されたトリプシンペプチドを、抗ＧＤＦ１５
免疫親和性捕獲及びトリプシン消化後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりモニタリングし、Ｎ末端
を含有する無傷のＧＬＰ１を有する融合タンパク質の濃度の代理尺度とした。この方法に
より、試験した全ての分子は、マウスにおけるインビボでの適度なＧＬＰ１の経時的安定
性を示した。
ｇ／ｋｇの用量で雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下投与した。血液試料を、投与後０、４
、２４及び４８時間でプロテアーゼ阻害剤を有するＫ３Ｅ Ｓａｒｓｔｅｄｔ血液採取管
に採取した。血漿を遠心分離により調製した。マウスにおけるインビボでの融合タンパク
質のＧＬＰ１領域の経時的な安定性を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／
ＭＳ分析によってモニタリングした。選択されたトリプシンペプチド、すなわちＨＳＥ（
ＨＳＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ）（配列番号７６）、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧ
ＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦ
ＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）は、融合タンパク質を含有する配列番号１、２、及び３
のＮ末端にそれぞれ位置する。これらの選択されたトリプシンペプチドを、抗ＧＤＦ１５
免疫親和性捕獲及びトリプシン消化後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりモニタリングし、Ｎ末端
を含有する無傷のＧＬＰ１を有する融合タンパク質の濃度の代理尺度とした。この方法に
より、試験した全ての分子は、マウスにおけるインビボでの適度なＧＬＰ１の経時的安定
性を示した。
【0206】
表７は、指示されたＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質について、ＧＬＰ１Ｒ過剰発
現細胞のｃＡＭＰレベルを測定したインビトロＧＬＰ１受容体効力、いずれも質量分析に
よって評価したエクスビボヒト血漿安定性及びインビボマウス血漿安定性の結果を提供す
る。
現細胞のｃＡＭＰレベルを測定したインビトロＧＬＰ１受容体効力、いずれも質量分析に
よって評価したエクスビボヒト血漿安定性及びインビボマウス血漿安定性の結果を提供す
る。
【0207】
【表7】
【0208】
実施例６：第１及び第２のリンカーペプチド中のセリン残基を除去することによるＯ－
結合型キシロシル化の除去
キシロースグリカンがグリシシン－セリンリンカーに付着することが報告されているこ
とから（Ｓｐａｈｒ ｅｔ．ａｌ，ｍＡｂｓ ６（４）：９０４－９１４）、グリシシン
－セリンリンカーを含有する分子のＯ－結合型キシロースレベルを試験した。簡潔に述べ
ると、試料は、変性のためにｐＨ８．０で緩衝されたグアニジン－ＨＣｌに希釈し、続い
て還元のためにＤＴＴを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって調製し
た。還元後、試料を、新たに調製されたヨードアセトアミドを使用して暗所にて室温で６
０分間アルキル化した。次いで、ＤＴＴを試料に添加して、未反応のヨードアセトアミド
をキレート化した。次に、試料を５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０中で
、製造元のプロトコルに従ってＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを使用し
て脱塩し、３７℃で４時間、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。消化後、消化反
応をクエンチするため、ＴＦＡをそれぞれの試料に添加した。消化した試料を４℃に保ち
、２４時間以内にＬＣ／ＭＳに注入した。
結合型キシロシル化の除去
キシロースグリカンがグリシシン－セリンリンカーに付着することが報告されているこ
とから（Ｓｐａｈｒ ｅｔ．ａｌ，ｍＡｂｓ ６（４）：９０４－９１４）、グリシシン
－セリンリンカーを含有する分子のＯ－結合型キシロースレベルを試験した。簡潔に述べ
ると、試料は、変性のためにｐＨ８．０で緩衝されたグアニジン－ＨＣｌに希釈し、続い
て還元のためにＤＴＴを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって調製し
た。還元後、試料を、新たに調製されたヨードアセトアミドを使用して暗所にて室温で６
０分間アルキル化した。次いで、ＤＴＴを試料に添加して、未反応のヨードアセトアミド
をキレート化した。次に、試料を５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０中で
、製造元のプロトコルに従ってＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを使用し
て脱塩し、３７℃で４時間、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。消化後、消化反
応をクエンチするため、ＴＦＡをそれぞれの試料に添加した。消化した試料を４℃に保ち
、２４時間以内にＬＣ／ＭＳに注入した。
【0209】
消化した試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９０ ＵＨＰＬＣ（Ａｇｉ
ｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、０．１ｍＬ／分の流量でＡｇｉｌｅ
ｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ Ｍｉｃｒｏ Ｂｏｒｅ Ｒａｐ
ｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎに注入した。カラム温度を６５℃で維持した
。質量分析グレードＨＰＬＣ溶媒（０．１％ギ酸及びＢ：０．１％ギ酸中１００％ＡＣＮ
）をＶＷＲから購入した。タンパク質分解ペプチドを、０．１％ＦＡ中２％から４０％ま
でＡＣＮの５０分間の勾配を用いてカラムから溶出した。３．５ｋＶの噴霧電圧、２０の
シースガス、７の補助ガス、２９９℃のイオン移動管、及び１００℃の蒸発器を用いて、
加熱した電子スプレーイオン化プローブ（ＨＥＳＩ）を介してカラム溶出液をＴｈｅｒｍ
ｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に導入した。
ｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、０．１ｍＬ／分の流量でＡｇｉｌｅ
ｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ Ｍｉｃｒｏ Ｂｏｒｅ Ｒａｐ
ｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎに注入した。カラム温度を６５℃で維持した
。質量分析グレードＨＰＬＣ溶媒（０．１％ギ酸及びＢ：０．１％ギ酸中１００％ＡＣＮ
）をＶＷＲから購入した。タンパク質分解ペプチドを、０．１％ＦＡ中２％から４０％ま
でＡＣＮの５０分間の勾配を用いてカラムから溶出した。３．５ｋＶの噴霧電圧、２０の
シースガス、７の補助ガス、２９９℃のイオン移動管、及び１００℃の蒸発器を用いて、
加熱した電子スプレーイオン化プローブ（ＨＥＳＩ）を介してカラム溶出液をＴｈｅｒｍ
ｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に導入した。
【0210】
上位２データ依存実験を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出、７０，０００分解能、質量範囲１５
０～２０００ｍ／ｚ、ＡＧＣターゲット１．０ｅ６、最大注入時間５０ｍｓ、１マイクロ
スキャン、正極性に設定されたプリカーサスキャンを用いて実施した。プリカーサの決定
基準は、モノアイソトピックプリカーサ選択であり、ペプチド、電荷状態：２～７、ダイ
ナミックエクスクルージョン：６．０秒、及びプリカーサ強度閾値５ｅ４であった。プリ
カーサペプチドを１．６ｍ／ｚの単離幅を有する四重極によって単離し、衝突セルに送っ
た。衝突エネルギー２８は、ペプチドの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）をもたらした。
次いで、これらのフラグメントを、質量測定のためにオービトラップに移した。オービト
ラップ設定は、１７，５００分解能、２００～２０００ｍ／ｚ範囲、ＡＧＣターゲット５
ｅ５、最大注入時間１００ｍｓ、１マイクロスキャン、及び重心モードで獲得されたスペ
クトルであった。
０～２０００ｍ／ｚ、ＡＧＣターゲット１．０ｅ６、最大注入時間５０ｍｓ、１マイクロ
スキャン、正極性に設定されたプリカーサスキャンを用いて実施した。プリカーサの決定
基準は、モノアイソトピックプリカーサ選択であり、ペプチド、電荷状態：２～７、ダイ
ナミックエクスクルージョン：６．０秒、及びプリカーサ強度閾値５ｅ４であった。プリ
カーサペプチドを１．６ｍ／ｚの単離幅を有する四重極によって単離し、衝突セルに送っ
た。衝突エネルギー２８は、ペプチドの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）をもたらした。
次いで、これらのフラグメントを、質量測定のためにオービトラップに移した。オービト
ラップ設定は、１７，５００分解能、２００～２０００ｍ／ｚ範囲、ＡＧＣターゲット５
ｅ５、最大注入時間１００ｍｓ、１マイクロスキャン、及び重心モードで獲得されたスペ
クトルであった。
【0211】
ペプチドマッピングデータは、Ｂｙｏｎｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎ
ｃ）検索アルゴリズムを使用して処理される。コアキシロースグリコソアミノグリカンの
カスタムライブラリ及びそれらの単同位体質量を、Ｓｅｒ特異的修飾として検索パラメー
タに追加した。修飾及び非修飾ペプチド種の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）領域に
基づいて定量化するために、Ｂｙｏｏｎｉｃ検索結果をＢｙｏｌｏｇｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ）にインポートした。
ｃ）検索アルゴリズムを使用して処理される。コアキシロースグリコソアミノグリカンの
カスタムライブラリ及びそれらの単同位体質量を、Ｓｅｒ特異的修飾として検索パラメー
タに追加した。修飾及び非修飾ペプチド種の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）領域に
基づいて定量化するために、Ｂｙｏｏｎｉｃ検索結果をＢｙｏｌｏｇｉｃ（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ）にインポートした。
【0212】
Ｇ４Ｓの第１及び第２のリンカーペプチドを含有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパ
ク質は、第１及び第２のリンカーペプチドのセリン残基上に、様々なレベルのＯ－結合型
キシロシル化を示した。表８は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞から一時的に発現した３つのかかる
分子の結果を示す。キシロースのレベルはタンパク質状況依存であり、ＧＬＰ１ペプチド
又はＧＬＰ１ペプチド変異体をＨＳＡタンパク質に結合する第１のリンカーペプチドにお
いて「検出されず」から１％の範囲であり、ＨＳＡタンパク質をＧＤＦ１５タンパク質又
はＧＤＦ１５タンパク質変異体に結合する第２のリンカーペプチドにおいて１１．６１％
～５６．２％の範囲であった。リンカーペプチドに対する潜在的なＯ－結合型キシロシル
化リスクを回避するために、第１及び／又は第２のリンカーペプチド中にセリン残基を含
有しないＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を設計し、生成した。これらのＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＡＰ反復、Ｇ４Ａ反復又はポリグリシン反復を含むリンカ
ーを含有していた。
ク質は、第１及び第２のリンカーペプチドのセリン残基上に、様々なレベルのＯ－結合型
キシロシル化を示した。表８は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞から一時的に発現した３つのかかる
分子の結果を示す。キシロースのレベルはタンパク質状況依存であり、ＧＬＰ１ペプチド
又はＧＬＰ１ペプチド変異体をＨＳＡタンパク質に結合する第１のリンカーペプチドにお
いて「検出されず」から１％の範囲であり、ＨＳＡタンパク質をＧＤＦ１５タンパク質又
はＧＤＦ１５タンパク質変異体に結合する第２のリンカーペプチドにおいて１１．６１％
～５６．２％の範囲であった。リンカーペプチドに対する潜在的なＯ－結合型キシロシル
化リスクを回避するために、第１及び／又は第２のリンカーペプチド中にセリン残基を含
有しないＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を設計し、生成した。これらのＧＬＰ１－
ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＡＰ反復、Ｇ４Ａ反復又はポリグリシン反復を含むリンカ
ーを含有していた。
【0213】
【表8】
【0214】
実施例７：ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒに対するインビトロ効力
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のインビトロ活性を、細胞系アッセイにおけるＧ
ＬＰ１Ｒ効力及びＧＤＦ１５Ｒ効力の両方について試験した。ＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ
）活性を、ヒト又はカニクイザルＧＦＲＡＬのいずれかを過剰発現させるために安定的に
トランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＡＳヒト神経芽腫細胞中のリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４
７３）レベルを測定することによって決定した。様々な濃度の融合分子を有するＧＦＲＡ
Ｌ発現細胞を処理した後のＡＫＴのリン酸化を、製造元の指示に従ってＰｈｏｓｐｈｏ－
ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）Ａｓｓａｙキット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｂｅｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用
して測定した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用い化合物ＥＣ５０値を計算した。表
９で試験したＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＥＣ５０が４．６～６．９ｎＭの
範囲で、ＧＤＦ１５Ｒと同様の効力を有する。
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のインビトロ活性を、細胞系アッセイにおけるＧ
ＬＰ１Ｒ効力及びＧＤＦ１５Ｒ効力の両方について試験した。ＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ
）活性を、ヒト又はカニクイザルＧＦＲＡＬのいずれかを過剰発現させるために安定的に
トランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＡＳヒト神経芽腫細胞中のリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４
７３）レベルを測定することによって決定した。様々な濃度の融合分子を有するＧＦＲＡ
Ｌ発現細胞を処理した後のＡＫＴのリン酸化を、製造元の指示に従ってＰｈｏｓｐｈｏ－
ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）Ａｓｓａｙキット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｂｅｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用
して測定した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用い化合物ＥＣ５０値を計算した。表
９で試験したＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＥＣ５０が４．６～６．９ｎＭの
範囲で、ＧＤＦ１５Ｒと同様の効力を有する。
【0215】
融合体のＧＬＰ１Ｒの効力を、ヒト、マウス、又はカニクイザルＧＬＰ１Ｒを過剰発現
するために安定的にトランスフェクトされたクローンＨＥＫ２９３細胞中のｃＡＭＰレベ
ルを測定することによって決定した。細胞を様々な濃度の融合分子で処理した後の細胞内
ｃＡＭＰ生成を、キットの指示書に従って、Ｌａｎｃｅ競合ｃＡＭＰイムノアッセイ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して測
定した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用い化合物ＥＣ５０値を計算した。
するために安定的にトランスフェクトされたクローンＨＥＫ２９３細胞中のｃＡＭＰレベ
ルを測定することによって決定した。細胞を様々な濃度の融合分子で処理した後の細胞内
ｃＡＭＰ生成を、キットの指示書に従って、Ｌａｎｃｅ競合ｃＡＭＰイムノアッセイ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して測
定した。得られたデータを使用して、Ｐｒｉｓｍ統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用い化合物ＥＣ５０値を計算した。
【0216】
ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体をＨＳＡタンパク質に結合する第１のリ
ンカーペプチド中のセリン残基をアラニンに置き換えるか又は除去した（Ｇ４ＳからＧ４
Ａ又は同様の長さを有するポリＧリンカーに切り替える）場合、ＧＬＰ１活性は、ヒト又
はマウスＧＬＰ１Ｒアッセイで試験したときに影響を受けなかった。加えて、ＨＳＡタン
パク質をＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体に結合する第２のリンカ
ーペプチドを、ＧＳ－８ｘ（Ｇ４Ｓ）からＧＡ－８ｘ（Ｇ４Ａ）又は１０ｘ（ＡＰ）に変
更しても、ＧＬＰ１Ｒ効力に影響を与えなかった。加えて、第１のリンカー（５Ｘ（Ｇ４
Ａ）、８Ｘ（Ｇ４Ａ）、５Ｘ（ＡＰ）、１０Ｘ（ＡＰ）、２０Ｘ（ＡＰ）、２５Ｘ（ＡＰ
））の反復数を増加させた融合タンパク質を作製し、ヒトＧＬＰ１Ｒアッセイで試験した
。結果は、これらの融合タンパク質が、様々な効力を有するＧＬＰ１Ｒシグナル伝達を活
性化することを実証した。
ンカーペプチド中のセリン残基をアラニンに置き換えるか又は除去した（Ｇ４ＳからＧ４
Ａ又は同様の長さを有するポリＧリンカーに切り替える）場合、ＧＬＰ１活性は、ヒト又
はマウスＧＬＰ１Ｒアッセイで試験したときに影響を受けなかった。加えて、ＨＳＡタン
パク質をＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体に結合する第２のリンカ
ーペプチドを、ＧＳ－８ｘ（Ｇ４Ｓ）からＧＡ－８ｘ（Ｇ４Ａ）又は１０ｘ（ＡＰ）に変
更しても、ＧＬＰ１Ｒ効力に影響を与えなかった。加えて、第１のリンカー（５Ｘ（Ｇ４
Ａ）、８Ｘ（Ｇ４Ａ）、５Ｘ（ＡＰ）、１０Ｘ（ＡＰ）、２０Ｘ（ＡＰ）、２５Ｘ（ＡＰ
））の反復数を増加させた融合タンパク質を作製し、ヒトＧＬＰ１Ｒアッセイで試験した
。結果は、これらの融合タンパク質が、様々な効力を有するＧＬＰ１Ｒシグナル伝達を活
性化することを実証した。
【0217】
【表9】
【0218】
【表10】
【0219】
実施例８：タンパク質純度及び安定性に対する第１及び第２のリンカーペプチドの効果
サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して、主種、並び
に凝集体を表す高分子量（ＨＭＷ）種とフラグメントを表す低分子量（ＬＭＷ）種との両
方の割合を定量化することによって、分子の純度及び安定性を調べた。簡潔に言えば、タ
ンパク質純度を決定するために、２０μｇのタンパク質を１ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２（
Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０－１３６）移動相を有するＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅ
ｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｇ３ＳＷＸＬ（カタログ番号２００２６）カラムに注入した。
タンパク質種を、室温にて１ｍＬ／分の流量で溶出し、ＵＶ－２８０ｎｍ吸光度値を、可
変波長検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＨＰＬＣシステムを使
用してモニタリングした。タンパク質安定性を決定するために、１００μｇのタンパク質
を、０．２Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０移動相を有するＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ
ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｇ３ＳＷＸＬ（カタログ番号２００２６）カラムに注入した。タ
ンパク質種を、室温にて０．７ｍＬ／分の流量で溶出し、ＵＶ－２８０ｎｍ吸光度値を、
可変波長検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＨＰＬＣシステムを
使用してモニタリングした。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いてデータを解析し
た。
サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して、主種、並び
に凝集体を表す高分子量（ＨＭＷ）種とフラグメントを表す低分子量（ＬＭＷ）種との両
方の割合を定量化することによって、分子の純度及び安定性を調べた。簡潔に言えば、タ
ンパク質純度を決定するために、２０μｇのタンパク質を１ｘ ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２（
Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０－１３６）移動相を有するＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅ
ｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｇ３ＳＷＸＬ（カタログ番号２００２６）カラムに注入した。
タンパク質種を、室温にて１ｍＬ／分の流量で溶出し、ＵＶ－２８０ｎｍ吸光度値を、可
変波長検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＨＰＬＣシステムを使
用してモニタリングした。タンパク質安定性を決定するために、１００μｇのタンパク質
を、０．２Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０移動相を有するＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ
ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｇ３ＳＷＸＬ（カタログ番号２００２６）カラムに注入した。タ
ンパク質種を、室温にて０．７ｍＬ／分の流量で溶出し、ＵＶ－２８０ｎｍ吸光度値を、
可変波長検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＨＰＬＣシステムを
使用してモニタリングした。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いてデータを解析し
た。
【0220】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性発現から
作製し、実施例２に記載の方法に従って親和性捕獲により精製した場合、１０ｘ（ＡＰ）
第２のリンカーペプチド（配列番号２８）（ＨＳＡタンパク質をＧＤＦ１５タンパク質又
はＧＤＦ１５タンパク質変異体に結合する）を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質は、ＧＡ－８ｘ（Ｇ４Ａ）第２のリンカーペプチド（配列番号２９）を含有する分子と
比較して、低分子量（ＬＭＷ）種の割合が低くなった（表１０）。精製中に研磨工程によ
ってＬＭＷ種を除去したところ、得られた最終ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、
ＳＥ－ＨＰＬＣによる純度が９７％超であった。
作製し、実施例２に記載の方法に従って親和性捕獲により精製した場合、１０ｘ（ＡＰ）
第２のリンカーペプチド（配列番号２８）（ＨＳＡタンパク質をＧＤＦ１５タンパク質又
はＧＤＦ１５タンパク質変異体に結合する）を有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質は、ＧＡ－８ｘ（Ｇ４Ａ）第２のリンカーペプチド（配列番号２９）を含有する分子と
比較して、低分子量（ＬＭＷ）種の割合が低くなった（表１０）。精製中に研磨工程によ
ってＬＭＷ種を除去したところ、得られた最終ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、
ＳＥ－ＨＰＬＣによる純度が９７％超であった。
【0221】
これらのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の安定性を、規定のストレス条件下で試
験した。化学的誘導酸化ストレスを強制するために、試料を最終濃度０．１％の過酸化水
素に曝露し、暗所で６時間インキュベートした後、カタラーゼを添加して反応を停止させ
た。金属誘導酸化条件では、最終濃度の３０μＭの第一鉄を試料に添加した。暗所で２週
間インキュベートした後、ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。低ｐＨでの安定性を試
験するために、試料を５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ３．５の緩衝液に透析し、６時間保持し、０
．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に透析した。熱応力下で試料の安定性を試験するた
めに、分子量カットオフ３０ＫＤａｌを有する超遠心濾過器を使用して約１０ｍｇ／ｍＬ
に濃縮し、ＰＢＳ中に４０℃で２週間保持した。上記の化学的又は金属誘導酸化、並びに
低ｐＨ条件又は熱応力条件を受けるこれらの試料を、室温で２０分間にわたり、１ｍＬ／
分の流量で分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＯＳＯＨカラム）下で分析した。シグ
ナルはＵＶ－２８０ｎｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣシステム）で収集され、デー
タ分析はＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行われる。
験した。化学的誘導酸化ストレスを強制するために、試料を最終濃度０．１％の過酸化水
素に曝露し、暗所で６時間インキュベートした後、カタラーゼを添加して反応を停止させ
た。金属誘導酸化条件では、最終濃度の３０μＭの第一鉄を試料に添加した。暗所で２週
間インキュベートした後、ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。低ｐＨでの安定性を試
験するために、試料を５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ３．５の緩衝液に透析し、６時間保持し、０
．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に透析した。熱応力下で試料の安定性を試験するた
めに、分子量カットオフ３０ＫＤａｌを有する超遠心濾過器を使用して約１０ｍｇ／ｍＬ
に濃縮し、ＰＢＳ中に４０℃で２週間保持した。上記の化学的又は金属誘導酸化、並びに
低ｐＨ条件又は熱応力条件を受けるこれらの試料を、室温で２０分間にわたり、１ｍＬ／
分の流量で分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＯＳＯＨカラム）下で分析した。シグ
ナルはＵＶ－２８０ｎｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣシステム）で収集され、デー
タ分析はＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行われる。
【0222】
表１１は、熱応力（４０℃で２週間）下でのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の安
定性に対する第２のリンカーの影響を示す。１０ｘ（ＡＰ）第２のリンカーペプチド（配
列番号２８）を含有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＡ－８ｘ（Ｇ４Ａ）
第２のリンカーペプチド（配列番号２９）を含有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質と比較して、形成されるＬＭＷ種のレベルが低くなり、ＡＰ第２のリンカーペプチドが
、Ｇ４Ａ第２のリンカーペプチドと比較してより熱的に安定していることを示した。他の
試験されたストレス条件（低ｐＨ、金属又は化学誘導酸化）下では、試料のＬＭＷ種のレ
ベルは、非ストレス試料と同様に最小レベルのままである。
定性に対する第２のリンカーの影響を示す。１０ｘ（ＡＰ）第２のリンカーペプチド（配
列番号２８）を含有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＡ－８ｘ（Ｇ４Ａ）
第２のリンカーペプチド（配列番号２９）を含有するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク
質と比較して、形成されるＬＭＷ種のレベルが低くなり、ＡＰ第２のリンカーペプチドが
、Ｇ４Ａ第２のリンカーペプチドと比較してより熱的に安定していることを示した。他の
試験されたストレス条件（低ｐＨ、金属又は化学誘導酸化）下では、試料のＬＭＷ種のレ
ベルは、非ストレス試料と同様に最小レベルのままである。
【0223】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施して、ＧＬＰ１－ＨＳＡ－ＧＤＦ１５タンパク質の
熱安定性を決定した。自動ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ器具を
使用して、ＰＢＳ ｐＨ７．４緩衝液中約０．５～１ｍｇ／ｍＬで試料を評価した。熱ス
キャンは、１℃／分の加熱速度で、２５℃～９５℃に及ぶ。１５分のプレスキャン時間及
び１０秒のフィルタリング期間を実行毎に使用した。Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウェアパッケ
ージ内の非２状態フィッティング関数を使用してデータを処理した。ＤＳＣの結果は、こ
れらのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド
変異体を含有しないＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質と同様に、６３～７２℃の範囲の
融解温度（Ｔｍ）（表１２）を有することを実証した。
熱安定性を決定した。自動ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ器具を
使用して、ＰＢＳ ｐＨ７．４緩衝液中約０．５～１ｍｇ／ｍＬで試料を評価した。熱ス
キャンは、１℃／分の加熱速度で、２５℃～９５℃に及ぶ。１５分のプレスキャン時間及
び１０秒のフィルタリング期間を実行毎に使用した。Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウェアパッケ
ージ内の非２状態フィッティング関数を使用してデータを処理した。ＤＳＣの結果は、こ
れらのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド
変異体を含有しないＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合タンパク質と同様に、６３～７２℃の範囲の
融解温度（Ｔｍ）（表１２）を有することを実証した。
【0224】
【表11】
【0225】
【表12】
【0226】
【表13】
【0227】
実施例９：エクスビボヒト血漿検査
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の安定性を、ヒト血漿中にてエクスビボで評価し
た。簡潔に言えば、新鮮な非凍結ヒト血漿を遠心分離によってヘパリン添加血から生成し
た。融合タンパク質を、静かに混合しながらこの基質中で、０、４、２４、４８、７２、
及び９６時間、３７℃でインキュベートした。ヒト血漿中の融合分子の経時的な濃度を、
抗ＧＤＦ１５抗体による免疫親和性捕獲、及び抗ＨＳＡ抗体（「全体形式」）又は抗ＧＬ
Ｐ１ Ｎ末端特異性抗体（「ＧＬＰ１活性形式」）のいずれかによる免疫検出によってモ
ニタリングした。表１３及び１４は、これら２つのイムノアッセイの結果を示す。
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の安定性を、ヒト血漿中にてエクスビボで評価し
た。簡潔に言えば、新鮮な非凍結ヒト血漿を遠心分離によってヘパリン添加血から生成し
た。融合タンパク質を、静かに混合しながらこの基質中で、０、４、２４、４８、７２、
及び９６時間、３７℃でインキュベートした。ヒト血漿中の融合分子の経時的な濃度を、
抗ＧＤＦ１５抗体による免疫親和性捕獲、及び抗ＨＳＡ抗体（「全体形式」）又は抗ＧＬ
Ｐ１ Ｎ末端特異性抗体（「ＧＬＰ１活性形式」）のいずれかによる免疫検出によってモ
ニタリングした。表１３及び１４は、これら２つのイムノアッセイの結果を示す。
【0228】
【表14】
【0229】
【表15】
【0230】
実施例１０：複数種における薬物動態
マウスにおける薬物動態
配列番号５０、４５、４６、及び４４に由来するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
を、ＰＢＳ、ｐＨ７中、５ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ用量で雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに
投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血漿を処理して、薬剤濃度を４日間
にわたって測定した。ＩＶ及びＳＣ投与後の血漿中の被検質の濃度も免疫親和性捕獲－ト
リプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって測定した。選択されたトリプシンペプチド
、すなわち、ＡＬＶ（ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）（配列番号７９）
、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨ
ＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）、並びにＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳ
ＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫ）（配列番号８０）は、ＨＳＡタンパク質のＮ末端、ＧＬＰ１ペプ
チド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端、及びＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タ
ンパク質変異体のＣ末端の付近にそれぞれ位置する。これらの代理ペプチドをモニタリン
グすることにより、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のそれぞれの領域（ＧＬＰ１、
ＨＳＡ、ＧＤＦ１５）の薬物動態評価を可能にした。血漿中薬物濃度－時間プロファイル
を表１５～２２に要約する。
マウスにおける薬物動態
配列番号５０、４５、４６、及び４４に由来するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質
を、ＰＢＳ、ｐＨ７中、５ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ用量で雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに
投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血漿を処理して、薬剤濃度を４日間
にわたって測定した。ＩＶ及びＳＣ投与後の血漿中の被検質の濃度も免疫親和性捕獲－ト
リプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって測定した。選択されたトリプシンペプチド
、すなわち、ＡＬＶ（ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）（配列番号７９）
、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨ
ＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）、並びにＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳ
ＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫ）（配列番号８０）は、ＨＳＡタンパク質のＮ末端、ＧＬＰ１ペプ
チド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端、及びＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タ
ンパク質変異体のＣ末端の付近にそれぞれ位置する。これらの代理ペプチドをモニタリン
グすることにより、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のそれぞれの領域（ＧＬＰ１、
ＨＳＡ、ＧＤＦ１５）の薬物動態評価を可能にした。血漿中薬物濃度－時間プロファイル
を表１５～２２に要約する。
【0231】
【表16】
【0232】
【表17】
【0233】
【表18】
【0234】
【表19】
【0235】
【表20】
【0236】
【表21】
【0237】
【表22】
【0238】
【表23】
【0239】
表１５～２２のデータを使用したノンコンパートメント薬物動態分析（ＮＣＡ）により
、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで試験された４つのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のＳＣ
及びＩＶ投与後、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体について１４～２３時間
、ＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体について２２～４９時間、及び
ＨＳＡタンパク質について２２～４７時間の末端半減期が明らかとなった（表２３）。
、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで試験された４つのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のＳＣ
及びＩＶ投与後、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体について１４～２３時間
、ＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体について２２～４９時間、及び
ＨＳＡタンパク質について２２～４７時間の末端半減期が明らかとなった（表２３）。
【0240】
【表24】
【0241】
サルにおける薬物動態
配列番号３３、５０、４５、４６、及び４４に由来するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タン
パク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｋｇ ＳＣの用量でナイーブ型雄性カニクイ
ザル（Macaca fascicularis）に投与した。血液試料を採取し、血漿を処理し、イムノア
ッセイバイオアナリシスを用いて薬物濃度を２１日目まで測定した。イムノアッセイ方法
には、抗ＧＤＦ１５捕獲抗体、及び無傷のＧＬＰ１を認識する抗体（「活性」）又はＨＳ
Ａを認識する抗体（「全体」）のいずれかによる検出が含まれた。血漿中薬剤濃度－時間
プロファイルを表２４及び２５に要約する。
配列番号３３、５０、４５、４６、及び４４に由来するＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タン
パク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７中、０．５ｍｇ／ｋｇ ＳＣの用量でナイーブ型雄性カニクイ
ザル（Macaca fascicularis）に投与した。血液試料を採取し、血漿を処理し、イムノア
ッセイバイオアナリシスを用いて薬物濃度を２１日目まで測定した。イムノアッセイ方法
には、抗ＧＤＦ１５捕獲抗体、及び無傷のＧＬＰ１を認識する抗体（「活性」）又はＨＳ
Ａを認識する抗体（「全体」）のいずれかによる検出が含まれた。血漿中薬剤濃度－時間
プロファイルを表２４及び２５に要約する。
【0242】
【表25】
【0243】
【表26】
【0244】
表２４及び２５のデータの薬物動態分析により、ＳＣ投与後のカニクイザル内の活性分
子について２～３日間、及び全体分子について５～８日間の末端半減期が明らかになった
（表２６）。
子について２～３日間、及び全体分子について５～８日間の末端半減期が明らかになった
（表２６）。
【0245】
【表27】
【0246】
実施例１１：ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のインビボ効力
Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスにおける食物摂取の評価：この実験の目的は、Ｃ５７ＢＬ／
６マウスにおける食物摂取の阻害に対する配列番号５０、３３、４９、４５、４６、及び
４４に対応する分子のインビボ薬物動態効果を実証することであった。２４時間の食物摂
取を、４：００～５：００ｐｍのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（試験物品）又は
対照（ＰＢＳ溶媒又はデュラグルチド）の皮下投与の前後に測定した。ケージ毎の食物重
量の変化を２４時間毎に記録した。結果は、投与２４時間前と比較した食物摂取の変化率
として表され、検査で使用されるそれぞれの試験物品の循環濃度に部分的に依存する（図
４）。試験物品の循環濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
によって投与から２４時間後に測定した。選択されたトリプシンペプチド、すなわち、Ｈ
ＳＡタンパク質のＮ末端、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端、及び
ＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体のＣ末端の付近にそれぞれ位置す
るＡＬＶ（ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）（配列番号７９）、ＨＧＥ－
１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨＧＥ－２（
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）、並びにＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤ
ＤＬＬＡＫ）（配列番号８０）をモニタリングした。ＶＶＳペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬ
ＨＱＤＷＬＮＧＫ）（配列番号８２）は、デュラグルチドのＦｃ部分に位置する。これら
の代理ペプチドをモニタリングすることにより、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の
それぞれの領域（ＧＬＰ１、ＨＳＡ、ＧＤＦ１５）の薬物動態評価を可能にした。血漿中
薬物濃度を図５に示す。結果は、配列番号５０、３３、４９、４５、４６、及び４４のＣ
５７ＢＬ／６マウスへの皮下投与が、溶媒投与動物と比較して食物摂取を著しく阻害した
ことを示した。
Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスにおける食物摂取の評価：この実験の目的は、Ｃ５７ＢＬ／
６マウスにおける食物摂取の阻害に対する配列番号５０、３３、４９、４５、４６、及び
４４に対応する分子のインビボ薬物動態効果を実証することであった。２４時間の食物摂
取を、４：００～５：００ｐｍのＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質（試験物品）又は
対照（ＰＢＳ溶媒又はデュラグルチド）の皮下投与の前後に測定した。ケージ毎の食物重
量の変化を２４時間毎に記録した。結果は、投与２４時間前と比較した食物摂取の変化率
として表され、検査で使用されるそれぞれの試験物品の循環濃度に部分的に依存する（図
４）。試験物品の循環濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
によって投与から２４時間後に測定した。選択されたトリプシンペプチド、すなわち、Ｈ
ＳＡタンパク質のＮ末端、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端、及び
ＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体のＣ末端の付近にそれぞれ位置す
るＡＬＶ（ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）（配列番号７９）、ＨＧＥ－
１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨＧＥ－２（
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）、並びにＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤ
ＤＬＬＡＫ）（配列番号８０）をモニタリングした。ＶＶＳペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬ
ＨＱＤＷＬＮＧＫ）（配列番号８２）は、デュラグルチドのＦｃ部分に位置する。これら
の代理ペプチドをモニタリングすることにより、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の
それぞれの領域（ＧＬＰ１、ＨＳＡ、ＧＤＦ１５）の薬物動態評価を可能にした。血漿中
薬物濃度を図５に示す。結果は、配列番号５０、３３、４９、４５、４６、及び４４のＣ
５７ＢＬ／６マウスへの皮下投与が、溶媒投与動物と比較して食物摂取を著しく阻害した
ことを示した。
【0247】
ＧＦＲＡＬノックアウトマウスにおけるＧＬＰ１Ｒ媒介性食物摂取効果の評価：Ｃ５７
ＢＬ／６マウスにおける食物摂取の阻害は、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）
の両方の会合の結果である。食物摂取に対する配列番号５０、３３、４５、４６、及び４
４のＧＬＰ１Ｒ特異的効果を決定するために、ＧＦＲＡＬを欠損したマウスを使用した。
これらの実験の目的は、融合タンパク質がマウスにおけるＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合に有効
であると予測される用量で投与されたときに、融合タンパク質によるＧＬＰ１Ｒの会合の
程度を決定することであった（図１及び図２並びに米国特許出願公開第２０１７０３２７
５６０（Ａ１）号）。２４時間の食物摂取を、４：００～５：００ｐｍのＧＬＰ１－ＧＤ
Ｆ１５融合タンパク質（試験物品：３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）又は対照（ＰＢＳ溶媒又
はデュラグルチド）の皮下投与の前後に測定した。ケージ毎の食物重量の変化を２４時間
毎に記録した。無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を含有する融合分子
の循環濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析と、ＧＬＰ１ペ
プチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端付近に位置するトリプシンペプチド、ＨＧＥ
－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）又はＨＧＥ－２（
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）の選択的モニタリングと、によって投与２
４時間後に決定した。結果は、ＨＧＥペプチド（無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペ
プチド変異体）の血漿中濃度に対する食物摂取量の変化率としてグラフ化される（図６、
図７、及び図８）。結果は、配列番号５０、３３、４５、４６、及び４４を有する融合タ
ンパク質の送達が、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５に対して有効であることが以前に実証された用量
でＧＬＰ１Ｒの会合をもたらしたことを示した。驚くべきことに、ＧＬＰ１Ｒの会合は、
ＧＬＰ１部分の曝露量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにもかかわらず、Ｆｃ－Ｇ
ＬＰ１アゴニストと同様に所望の薬物動態応答を誘発した。融合タンパク質のＧＬＰ１構
成要素が、インビボでデュラグルチドと同程度の効力であったならば、ＧＬＰ１Ｒの会合
は、所望されるよりもはるかに高くなり、悪心及び嘔吐などのヒトにおいて予測される有
害事象を引き起こす可能性があった。したがって、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５との融合としての
ＧＬＰ１ペプチドの送達は、２つのアゴニストの所望のバランスを実現するように、ＧＬ
Ｐ１Ｒのインビボ効力に影響を与える。
ＢＬ／６マウスにおける食物摂取の阻害は、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＤＦ１５Ｒ（ＧＦＲＡＬ）
の両方の会合の結果である。食物摂取に対する配列番号５０、３３、４５、４６、及び４
４のＧＬＰ１Ｒ特異的効果を決定するために、ＧＦＲＡＬを欠損したマウスを使用した。
これらの実験の目的は、融合タンパク質がマウスにおけるＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合に有効
であると予測される用量で投与されたときに、融合タンパク質によるＧＬＰ１Ｒの会合の
程度を決定することであった（図１及び図２並びに米国特許出願公開第２０１７０３２７
５６０（Ａ１）号）。２４時間の食物摂取を、４：００～５：００ｐｍのＧＬＰ１－ＧＤ
Ｆ１５融合タンパク質（試験物品：３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）又は対照（ＰＢＳ溶媒又
はデュラグルチド）の皮下投与の前後に測定した。ケージ毎の食物重量の変化を２４時間
毎に記録した。無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体を含有する融合分子
の循環濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析と、ＧＬＰ１ペ
プチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端付近に位置するトリプシンペプチド、ＨＧＥ
－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）又はＨＧＥ－２（
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）の選択的モニタリングと、によって投与２
４時間後に決定した。結果は、ＨＧＥペプチド（無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペ
プチド変異体）の血漿中濃度に対する食物摂取量の変化率としてグラフ化される（図６、
図７、及び図８）。結果は、配列番号５０、３３、４５、４６、及び４４を有する融合タ
ンパク質の送達が、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５に対して有効であることが以前に実証された用量
でＧＬＰ１Ｒの会合をもたらしたことを示した。驚くべきことに、ＧＬＰ１Ｒの会合は、
ＧＬＰ１部分の曝露量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにもかかわらず、Ｆｃ－Ｇ
ＬＰ１アゴニストと同様に所望の薬物動態応答を誘発した。融合タンパク質のＧＬＰ１構
成要素が、インビボでデュラグルチドと同程度の効力であったならば、ＧＬＰ１Ｒの会合
は、所望されるよりもはるかに高くなり、悪心及び嘔吐などのヒトにおいて予測される有
害事象を引き起こす可能性があった。したがって、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５との融合としての
ＧＬＰ１ペプチドの送達は、２つのアゴニストの所望のバランスを実現するように、ＧＬ
Ｐ１Ｒのインビボ効力に影響を与える。
【0248】
絶食させたＤＩＯマウスにおけるＧＬＰ１Ｒ媒介性耐糖能の評価：膵臓内のＧＬＰ１Ｒ
アゴニズムは、インスリン分泌の増強及びグルコース摂取の増加をもたらし、食餌誘導性
肥満マウスにおける腹腔内グルコース負荷試験を使用して測定することができる。これら
の実験の目的は、融合タンパク質がマウスにおけるＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合に有効である
と予測される用量で投与されたときに、融合タンパク質によるＧＬＰ１Ｒの会合の程度を
決定することであった（図１及び図２並びに米国特許出願公開第２０１７０３２７５６０
（Ａ１）号）。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、肥満を誘発するために、６週齢から２０週
齢で投与を開始するまで、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｄ１２４９２に維持した。給餌
された血糖及び体重測定値を使用して、マウスを投与群に無作為化した。４：００ｐｍに
、マウスを水の飲める清潔なケージに移し、食品を検査の持続時間にわたって保持した。
対照（ＰＢＳ溶媒及びデュラグルチド）及び試験物品（配列番号：３３、５０、４９、４
５、４６、４４、及び３６）（１、３、及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、食品除去時に皮下
投与した。投与１７時間後、ベースラインのグルコースを収集し、体重１ｋｇ当たり１ｇ
のグルコースを腹腔内に投与した。グルコース急速投与後１０、３０、４５、６０、及び
１２０分の時点で、血糖を測定した。無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異
体を含有する融合分子の循環血漿中濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－Ｍ
Ｓ／ＭＳ分析と、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端付近に位置する
トリプシンペプチド、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列
番号７７）又はＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）の選択的モニ
タリングと、によって、１２０分時点直後に決定した。グルコースを時間の関数としてグ
ラフ化し、ベースライングルコース濃度（デルタＡＵＣ）に正規化した後の曲線下面積を
、動物毎に計算した。結果は、ＨＧＥペプチド（無傷のＧＬＰ１アゴニスト）の血漿中濃
度に対するデルタＡＵＣ（溶媒処理と比較）の変化率としてグラフ化される（図９、図１
０、図１１、及び図１２）。結果は、配列番号３３、５０、４９、４５、４６、４４、及
び３６を有する融合タンパク質の送達が、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５に対して有効であることが
以前に実証された用量でＧＬＰ１Ｒの会合をもたらしたことを示した。驚くべきことに、
ＧＬＰ１Ｒの会合は、ＧＬＰ１部分の曝露量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにも
かかわらず、Ｆｃ－ＧＬＰ１アゴニストと同様に所望の薬物動態応答を誘発した。融合タ
ンパク質のＧＬＰ１構成要素が、インビボでデュラグルチドと同程度の効力であったなら
ば、ＧＬＰ１Ｒの会合は、所望されるよりもはるかに高くなり、悪心及び嘔吐などのヒト
において予測される有害事象を引き起こす可能性があった。したがって、ＨＳＡ－ＧＤＦ
１５との融合としてのＧＬＰ１ペプチドの送達は、２つのアゴニストの所望のバランスを
実現するように、ＧＬＰ１Ｒのインビボ効力に影響を与える。
アゴニズムは、インスリン分泌の増強及びグルコース摂取の増加をもたらし、食餌誘導性
肥満マウスにおける腹腔内グルコース負荷試験を使用して測定することができる。これら
の実験の目的は、融合タンパク質がマウスにおけるＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合に有効である
と予測される用量で投与されたときに、融合タンパク質によるＧＬＰ１Ｒの会合の程度を
決定することであった（図１及び図２並びに米国特許出願公開第２０１７０３２７５６０
（Ａ１）号）。雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、肥満を誘発するために、６週齢から２０週
齢で投与を開始するまで、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｄ１２４９２に維持した。給餌
された血糖及び体重測定値を使用して、マウスを投与群に無作為化した。４：００ｐｍに
、マウスを水の飲める清潔なケージに移し、食品を検査の持続時間にわたって保持した。
対照（ＰＢＳ溶媒及びデュラグルチド）及び試験物品（配列番号：３３、５０、４９、４
５、４６、４４、及び３６）（１、３、及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、食品除去時に皮下
投与した。投与１７時間後、ベースラインのグルコースを収集し、体重１ｋｇ当たり１ｇ
のグルコースを腹腔内に投与した。グルコース急速投与後１０、３０、４５、６０、及び
１２０分の時点で、血糖を測定した。無傷のＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異
体を含有する融合分子の循環血漿中濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－Ｍ
Ｓ／ＭＳ分析と、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端付近に位置する
トリプシンペプチド、ＨＧＥ－１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列
番号７７）又はＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）の選択的モニ
タリングと、によって、１２０分時点直後に決定した。グルコースを時間の関数としてグ
ラフ化し、ベースライングルコース濃度（デルタＡＵＣ）に正規化した後の曲線下面積を
、動物毎に計算した。結果は、ＨＧＥペプチド（無傷のＧＬＰ１アゴニスト）の血漿中濃
度に対するデルタＡＵＣ（溶媒処理と比較）の変化率としてグラフ化される（図９、図１
０、図１１、及び図１２）。結果は、配列番号３３、５０、４９、４５、４６、４４、及
び３６を有する融合タンパク質の送達が、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５に対して有効であることが
以前に実証された用量でＧＬＰ１Ｒの会合をもたらしたことを示した。驚くべきことに、
ＧＬＰ１Ｒの会合は、ＧＬＰ１部分の曝露量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにも
かかわらず、Ｆｃ－ＧＬＰ１アゴニストと同様に所望の薬物動態応答を誘発した。融合タ
ンパク質のＧＬＰ１構成要素が、インビボでデュラグルチドと同程度の効力であったなら
ば、ＧＬＰ１Ｒの会合は、所望されるよりもはるかに高くなり、悪心及び嘔吐などのヒト
において予測される有害事象を引き起こす可能性があった。したがって、ＨＳＡ－ＧＤＦ
１５との融合としてのＧＬＰ１ペプチドの送達は、２つのアゴニストの所望のバランスを
実現するように、ＧＬＰ１Ｒのインビボ効力に影響を与える。
【0249】
段階的グルコース注入による霊長類におけるＧＬＰ１Ｒ会合の評価：非ヒト霊長類にお
ける静脈内の段階的グルコース注入（ＧＧＩ）時のインスリン分泌を使用して、配列番号
４５及び４４のＧＬＰ１Ｒ会合を評価した。これらの実験の目的は、融合タンパク質が非
ヒト霊長類におけるＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合に有効であると予測される用量で投与された
ときに、融合タンパク質によるＧＬＰ１Ｒの会合の程度を決定することであった（Ｍｕｌ
ｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７及び米国特許出願公開第２０１７０３２７５６０（
Ａ１）号）。ＧＧＩ手順は、ベースライン及び投与応答を２回のＧＧＩ手順の間の１４日
の回復期間と比較するために、１６時間の一晩絶食後に鎮静させたカニクイザルにおいて
実施した。１日目、食物の除去直後に動物に溶媒を投与した。２日目、動物に麻酔をかけ
、１０分開けて採取した２つの血液試料でベースラインを確立した。ＧＧＩ１を、０分に
８ｍｇ／ｋｇ／分のグルコース注入量で開始し、続いて１２、１６及び２４ｍｇ／ｋｇ／
分の注入を行った。それぞれの注入量を４０分間にわたって投与した。グルコース、イン
スリン、及びＣペプチドの測定のために血液試料を２０分間隔で採取し、結果を時間の関
数としてグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）をそれぞれの動物で測定した検体毎に決定し
た。次いで、動物を、ＧＧＩ１からのベースラインインスリン分泌量（ＩＳＲ）に基づい
て、試験物品投与群に無作為化した。１５日目、動物に、様々な用量濃度（０．１～１．
１ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質及び０．０１６～０．１のデュラグルチド）で試験物品を
投与してから、一晩絶食させた。２日目の説明と同様に、２回目のＧＧＩ（ＧＧＩ２）を
１６日目に実施した。無傷なＧＬＰ１ペプチド又はペプチド変異体を有する試験物品をモ
ニタリングするように特異的に設計されたイムノアッセイによって、グルコース注入前の
時点０に採取した血漿試料について化合物曝露を評価した。図１３のデータは、無傷のＧ
ＬＰ１を有する試験物品の血漿中濃度に対する、ベースラインと比較したグルコースＡＵ
Ｃに正規化されたＩＳＲ ＡＵＣの投与誘導倍率変化として報告されている。デュラグル
チドを、Ｆｃ－ＧＬＰ１アゴニスト基準として使用した。結果は、配列番号４５及び４４
を有する融合タンパク質の送達が、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５に対して有効であることが以前に
実証された用量でＧＬＰ１Ｒの会合をもたらしたことを示した。驚くべきことに、ＧＬＰ
１Ｒの会合は、ＧＬＰ１部分の曝露量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにもかかわ
らず、Ｆｃ－ＧＬＰ１アゴニストと同様に所望の薬物動態応答を誘発した。融合タンパク
質のＧＬＰ１構成要素が、インビボでデュラグルチドと同程度の効力であったならば、Ｇ
ＬＰ１Ｒの会合は、所望されるよりもはるかに高くなり、悪心及び嘔吐などのヒトにおい
て予測される有害事象を引き起こす可能性があった。したがって、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５と
の融合としてのＧＬＰ１ペプチドの送達は、２つのアゴニストの所望のバランスを実現す
るように、ＧＬＰ１Ｒのインビボ効力に影響を与える。
ける静脈内の段階的グルコース注入（ＧＧＩ）時のインスリン分泌を使用して、配列番号
４５及び４４のＧＬＰ１Ｒ会合を評価した。これらの実験の目的は、融合タンパク質が非
ヒト霊長類におけるＨＳＡ－ＧＤＦ１５融合に有効であると予測される用量で投与された
ときに、融合タンパク質によるＧＬＰ１Ｒの会合の程度を決定することであった（Ｍｕｌ
ｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７及び米国特許出願公開第２０１７０３２７５６０（
Ａ１）号）。ＧＧＩ手順は、ベースライン及び投与応答を２回のＧＧＩ手順の間の１４日
の回復期間と比較するために、１６時間の一晩絶食後に鎮静させたカニクイザルにおいて
実施した。１日目、食物の除去直後に動物に溶媒を投与した。２日目、動物に麻酔をかけ
、１０分開けて採取した２つの血液試料でベースラインを確立した。ＧＧＩ１を、０分に
８ｍｇ／ｋｇ／分のグルコース注入量で開始し、続いて１２、１６及び２４ｍｇ／ｋｇ／
分の注入を行った。それぞれの注入量を４０分間にわたって投与した。グルコース、イン
スリン、及びＣペプチドの測定のために血液試料を２０分間隔で採取し、結果を時間の関
数としてグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）をそれぞれの動物で測定した検体毎に決定し
た。次いで、動物を、ＧＧＩ１からのベースラインインスリン分泌量（ＩＳＲ）に基づい
て、試験物品投与群に無作為化した。１５日目、動物に、様々な用量濃度（０．１～１．
１ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質及び０．０１６～０．１のデュラグルチド）で試験物品を
投与してから、一晩絶食させた。２日目の説明と同様に、２回目のＧＧＩ（ＧＧＩ２）を
１６日目に実施した。無傷なＧＬＰ１ペプチド又はペプチド変異体を有する試験物品をモ
ニタリングするように特異的に設計されたイムノアッセイによって、グルコース注入前の
時点０に採取した血漿試料について化合物曝露を評価した。図１３のデータは、無傷のＧ
ＬＰ１を有する試験物品の血漿中濃度に対する、ベースラインと比較したグルコースＡＵ
Ｃに正規化されたＩＳＲ ＡＵＣの投与誘導倍率変化として報告されている。デュラグル
チドを、Ｆｃ－ＧＬＰ１アゴニスト基準として使用した。結果は、配列番号４５及び４４
を有する融合タンパク質の送達が、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５に対して有効であることが以前に
実証された用量でＧＬＰ１Ｒの会合をもたらしたことを示した。驚くべきことに、ＧＬＰ
１Ｒの会合は、ＧＬＰ１部分の曝露量がデュラグルチドの１０～３０倍であるにもかかわ
らず、Ｆｃ－ＧＬＰ１アゴニストと同様に所望の薬物動態応答を誘発した。融合タンパク
質のＧＬＰ１構成要素が、インビボでデュラグルチドと同程度の効力であったならば、Ｇ
ＬＰ１Ｒの会合は、所望されるよりもはるかに高くなり、悪心及び嘔吐などのヒトにおい
て予測される有害事象を引き起こす可能性があった。したがって、ＨＳＡ－ＧＤＦ１５と
の融合としてのＧＬＰ１ペプチドの送達は、２つのアゴニストの所望のバランスを実現す
るように、ＧＬＰ１Ｒのインビボ効力に影響を与える。
【0250】
図６～図１３に示される結果は、前臨床種におけるＧＬＰ１のインビボ活性又は効力が
、デュラグルチドのＦｃ融合ＧＬＰ１ペプチドと比較して、ホモ二量体ＧＬＰ１－ＧＤＦ
１５二重アゴニストにおいて低下することを実証している。これにより、１分子上の両ア
ゴニスト（ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体及びＧＤＦ１５タンパク質又は
ＧＤＦ１５タンパク質変異体）のバランスが可能になり、したがって、予想される治療範
囲内でのＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体曝露も達成する有効濃度
でのＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体の送達が可能になる。
、デュラグルチドのＦｃ融合ＧＬＰ１ペプチドと比較して、ホモ二量体ＧＬＰ１－ＧＤＦ
１５二重アゴニストにおいて低下することを実証している。これにより、１分子上の両ア
ゴニスト（ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体及びＧＤＦ１５タンパク質又は
ＧＤＦ１５タンパク質変異体）のバランスが可能になり、したがって、予想される治療範
囲内でのＧＤＦ１５タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体曝露も達成する有効濃度
でのＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体の送達が可能になる。
【0251】
マウスにおける反復投与後のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の体重減少有効性の
評価：ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が体重減少を引き起こす能力を食餌誘導性肥
満マウスで試験した。マウスに、様々な濃度の試験物品（配列番号４５及び４４）、デュ
ラグルチド又は溶媒対照を毎日７日間皮下投与した。検査全体を通して体重をモニタリン
グした。図１４は、０日目（第１の用量の直前）に対する体重の経時的な変化率を示す。
試験物品の循環濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によっ
て７日間の投与後に測定した。選択されたトリプシンペプチド、すなわち、ＨＳＡタンパ
ク質のＮ末端、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端、及びＧＤＦ１５
タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体のＣ末端の付近にそれぞれ位置するＡＬＶ（
ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）（配列番号７９）、ＨＧＥ－１（ＨＧＥ
ＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴ
ＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）、並びにＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫ
）（配列番号８０）をモニタリングした。ＶＶＳペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫ）（配列番号８２）は、デュラグルチドのＦｃ部分に位置する。これらの代理ペプ
チドをモニタリングすることにより、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のそれぞれの
領域（ＧＬＰ１、ＨＳＡ、ＧＤＦ１５）の薬物動態評価を可能にした。血漿中薬物濃度を
図１５に示す。結果は、配列番号４５及び４４の反復投与が、食餌誘導性肥満マウスにお
ける体重減少を濃度依存的にもたらすことを示した。
評価：ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が体重減少を引き起こす能力を食餌誘導性肥
満マウスで試験した。マウスに、様々な濃度の試験物品（配列番号４５及び４４）、デュ
ラグルチド又は溶媒対照を毎日７日間皮下投与した。検査全体を通して体重をモニタリン
グした。図１４は、０日目（第１の用量の直前）に対する体重の経時的な変化率を示す。
試験物品の循環濃度を、免疫親和性捕獲－トリプシン消化－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によっ
て７日間の投与後に測定した。選択されたトリプシンペプチド、すなわち、ＨＳＡタンパ
ク質のＮ末端、ＧＬＰ１ペプチド又はＧＬＰ１ペプチド変異体のＮ末端、及びＧＤＦ１５
タンパク質又はＧＤＦ１５タンパク質変異体のＣ末端の付近にそれぞれ位置するＡＬＶ（
ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）（配列番号７９）、ＨＧＥ－１（ＨＧＥ
ＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ）（配列番号７７）、及びＨＧＥ－２（ＨＧＥＧＴ
ＦＴＳＤＬＳＫ）（配列番号７８）、並びにＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫ
）（配列番号８０）をモニタリングした。ＶＶＳペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫ）（配列番号８２）は、デュラグルチドのＦｃ部分に位置する。これらの代理ペプ
チドをモニタリングすることにより、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質のそれぞれの
領域（ＧＬＰ１、ＨＳＡ、ＧＤＦ１５）の薬物動態評価を可能にした。血漿中薬物濃度を
図１５に示す。結果は、配列番号４５及び４４の反復投与が、食餌誘導性肥満マウスにお
ける体重減少を濃度依存的にもたらすことを示した。
【0252】
非ヒト霊長類におけるＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の食物摂取効果の評価。
【0253】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の食物摂取を減少させる能力を、自然発症肥満カ
ニクイザルで試験した。対象に、様々な濃度の、活性ＧＬＰ１部分を有する及び有しない
試験物品（それぞれ配列番号４４及び８３、ＧＤＦ１５ペプチドに融合したＡＰ１０リン
カーに融合したＨＳＡペプチドを含む配列番号８３は、米国特許第１０，３３６，８１２
号に以前に開示されている）又は溶媒を４週間の期間にわたってＱＷで皮下投与した。投
与前及び検査全体を通して食物摂取をモニタリングした。ベースラインでの及び試験物品
のそれぞれの投与後の食物摂取の３日間の変化率を図１６に示す。試験中のカニクイザル
血漿中の配列番号４４及び８３の濃度を、「全体」分子（ＨＳＡ検出）及び「活性」ＧＬ
Ｐ１部分（Ｎ末端ＧＬＰ１ペプチド検出）を検出するための２つの別個のイムノアッセイ
法を用いて決定した。血漿中薬物濃度を図１７及び図１８に示す。結果は、配列番号４４
及び８３の投与が、自然発症肥満非ヒト霊長類において食物摂取を低減することを示した
。
ニクイザルで試験した。対象に、様々な濃度の、活性ＧＬＰ１部分を有する及び有しない
試験物品（それぞれ配列番号４４及び８３、ＧＤＦ１５ペプチドに融合したＡＰ１０リン
カーに融合したＨＳＡペプチドを含む配列番号８３は、米国特許第１０，３３６，８１２
号に以前に開示されている）又は溶媒を４週間の期間にわたってＱＷで皮下投与した。投
与前及び検査全体を通して食物摂取をモニタリングした。ベースラインでの及び試験物品
のそれぞれの投与後の食物摂取の３日間の変化率を図１６に示す。試験中のカニクイザル
血漿中の配列番号４４及び８３の濃度を、「全体」分子（ＨＳＡ検出）及び「活性」ＧＬ
Ｐ１部分（Ｎ末端ＧＬＰ１ペプチド検出）を検出するための２つの別個のイムノアッセイ
法を用いて決定した。血漿中薬物濃度を図１７及び図１８に示す。結果は、配列番号４４
及び８３の投与が、自然発症肥満非ヒト霊長類において食物摂取を低減することを示した
。
【0254】
非ヒト霊長類における２１日間の用量漸増後のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の
食物摂取及び体重効果の評価。
食物摂取及び体重効果の評価。
【0255】
ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質の食物摂取を減少させ、体重減少を引き起こす能
力を、自然発症肥満カニクイザルで試験した。対象に、活性ＧＤＦ１５及びＧＬＰ１の両
方、活性ＧＤＦ１５のみ、又は活性ＧＬＰ１部分のみを含有する試験物品（それぞれ配列
番号４４、８３、８４；配列番号８４は、Ｉ８９Ｒ変異を有するＧＤＦ１５ペプチドに融
合したＡＰ１０リンカーペプチドに融合したＡＰ５リンカーペプチドに融合したＧＬＰ１
ペプチドを含む；Ｉ８９Ｒ変異を有するＧＤＦ１５ペプチドは、米国特許第１０，３３６
，８１２号に以前に開示されている）を２１日間の期間にわたって３日おきに皮下投与し
た。０日目に与えられた初期用量は０．７ｎｍｏｌ／ｋｇであり、最大２０ｎｍｏｌ／ｋ
ｇまでそれぞれの投与で漸増させた。投与前、２１日間の投与期間中、及び試験物品の洗
い出し中の毎日の食物摂取量を図１９に示す。検査全体を通して体重をモニタリングした
。図２０は、ベースラインに対する体重の経時的な変化率を示す。試験中のカニクイザル
血漿中の試験物品の濃度を、「全体」分子（ＨＳＡ検出；配列番号４４、８３、８４）及
び「活性」ＧＬＰ１部分（Ｎ末端ＧＬＰ１ペプチド検出；配列番号４４及び８４のみの場
合）を検出するために２つの別個のイムノアッセイ法を用いて測定した。血漿中薬物濃度
を図２１及び図２２に示す。結果は、配列番号４４、８３、８４の反復投与が、自然発症
肥満の非ヒト霊長類における食物摂取及びその後の体重減少の低減をもたらすことを示し
た。
力を、自然発症肥満カニクイザルで試験した。対象に、活性ＧＤＦ１５及びＧＬＰ１の両
方、活性ＧＤＦ１５のみ、又は活性ＧＬＰ１部分のみを含有する試験物品（それぞれ配列
番号４４、８３、８４；配列番号８４は、Ｉ８９Ｒ変異を有するＧＤＦ１５ペプチドに融
合したＡＰ１０リンカーペプチドに融合したＡＰ５リンカーペプチドに融合したＧＬＰ１
ペプチドを含む；Ｉ８９Ｒ変異を有するＧＤＦ１５ペプチドは、米国特許第１０，３３６
，８１２号に以前に開示されている）を２１日間の期間にわたって３日おきに皮下投与し
た。０日目に与えられた初期用量は０．７ｎｍｏｌ／ｋｇであり、最大２０ｎｍｏｌ／ｋ
ｇまでそれぞれの投与で漸増させた。投与前、２１日間の投与期間中、及び試験物品の洗
い出し中の毎日の食物摂取量を図１９に示す。検査全体を通して体重をモニタリングした
。図２０は、ベースラインに対する体重の経時的な変化率を示す。試験中のカニクイザル
血漿中の試験物品の濃度を、「全体」分子（ＨＳＡ検出；配列番号４４、８３、８４）及
び「活性」ＧＬＰ１部分（Ｎ末端ＧＬＰ１ペプチド検出；配列番号４４及び８４のみの場
合）を検出するために２つの別個のイムノアッセイ法を用いて測定した。血漿中薬物濃度
を図２１及び図２２に示す。結果は、配列番号４４、８３、８４の反復投与が、自然発症
肥満の非ヒト霊長類における食物摂取及びその後の体重減少の低減をもたらすことを示し
た。
【0256】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができ
ることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限さ
れず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを
意図するものと理解される。
ることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限さ
れず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを
意図するものと理解される。
【0257】
引用した全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
［１］ グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチドと、第１のリンカーペプチドと、血清アルブミンタンパク質と、第２のリンカーペプチドと、ＧＤＦ１５タンパク質と、を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［２］ ＧＬＰ１ペプチドが、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［３］ 前記第１のリンカーペプチドが、配列番号５～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［４］ 前記血清アルブミンタンパク質が、配列番号２６又は配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［５］ 前記第２のリンカーペプチドが、配列番号２８～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［６］ 前記ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号３１又は配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［７］ 前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が、配列番号３３～７４及び８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［８］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする、単離核酸。
［９］ 上記［８］に記載の単離核酸を含む、ベクター。
［１０］ 上記［８］に記載の単離核酸又は上記［９］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［１１］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質と、医薬上許容できる担体と、を含む、医薬組成物。
［１２］ 疾患又は障害を治療又は予防することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１３］ 食物摂取を低減することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１４］ ＧＬＰ１受容体活性を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１５］ ＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）活性を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１６］ 前記医薬組成物が注射により投与される、上記［１２］に記載の方法。
［１７］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、上記［８］に記載の単離核酸、及び／又は上記［９］に記載のベクターを含む、キット。
［１８］ 前記キットが注射用デバイスを更に含む、上記［１７］に記載のキット。
［１９］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を含む医薬組成物を生成する方法であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を医薬上許容できる担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、方法。
［２０］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する方法であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成するための条件下で前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、前記細胞又は培養物から前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
［１］ グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）／増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質は、ＧＬＰ１ペプチドと、第１のリンカーペプチドと、血清アルブミンタンパク質と、第２のリンカーペプチドと、ＧＤＦ１５タンパク質と、を含む、ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［２］ ＧＬＰ１ペプチドが、配列番号１～４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［３］ 前記第１のリンカーペプチドが、配列番号５～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［４］ 前記血清アルブミンタンパク質が、配列番号２６又は配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［５］ 前記第２のリンカーペプチドが、配列番号２８～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［６］ 前記ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号３１又は配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［７］ 前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質が、配列番号３３～７４及び８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質。
［８］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする、単離核酸。
［９］ 上記［８］に記載の単離核酸を含む、ベクター。
［１０］ 上記［８］に記載の単離核酸又は上記［９］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［１１］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質と、医薬上許容できる担体と、を含む、医薬組成物。
［１２］ 疾患又は障害を治療又は予防することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１３］ 食物摂取を低減することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１４］ ＧＬＰ１受容体活性を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１５］ ＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）活性を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法は、有効量の上記［１１］に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
［１６］ 前記医薬組成物が注射により投与される、上記［１２］に記載の方法。
［１７］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質、上記［８］に記載の単離核酸、及び／又は上記［９］に記載のベクターを含む、キット。
［１８］ 前記キットが注射用デバイスを更に含む、上記［１７］に記載のキット。
［１９］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を含む医薬組成物を生成する方法であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を医薬上許容できる担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、方法。
［２０］ 上記［１］に記載のＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成する方法であって、前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成するための条件下で前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することと、前記細胞又は培養物から前記ＧＬＰ１－ＧＤＦ１５融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。