特開 2024-170509 癌を患っている被験者における、ＣＤ８陽性Ｔ細胞依存性免疫応答を増強させるための方法及び医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024170509

(43)【公開日】2024-12-10

(54)【発明の名称】癌を患っている被験者における、ＣＤ８陽性Ｔ細胞依存性免疫応答を増強させるための方法及び医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20241203BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241203BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241203BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241203BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20241203BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241203BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241203BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241203BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241203BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241203BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241203BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241203BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241203BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20241203BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20241203BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20241203BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20241203BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P35/00 ZNA

A61P43/00 111

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61P43/00 121

A61K45/06

A61K35/17

C07K16/28

C07K16/46

C12N15/09 110

C12N15/09 100

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N5/10

C12N5/0783

C12N5/0789

G01N33/574 A

G01N33/48 M

A61P35/00

A61K45/00 ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024151582

(22)【出願日】2024-09-03

(62)【分割の表示】P 2021539056の分割

【原出願日】2020-01-02

(31)【優先権主張番号】19305003.6

(32)【優先日】2019-01-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＳＰＡＮ

(71)【出願人】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】591140123

【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ

(71)【出願人】

【識別番号】515028470

【氏名又は名称】フォンダシオン・イマジネ

【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＴＩＯＮ ＩＭＡＧＩＮＥ

(71)【出願人】

【識別番号】595040744

【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(71)【出願人】

【識別番号】520053762

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ

(71)【出願人】

【識別番号】520179305

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ パリ－サクレー

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ－ＳＡＣＬＡＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】エルミーヌ，オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】ロシニョール，ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】ベレイド－シューケア，ザキア

(72)【発明者】

【氏名】フーケ，ギュメット

(72)【発明者】

【氏名】クロヌ，ルシル

(72)【発明者】

【氏名】デュシオ，ミッシェル

(72)【発明者】

【氏名】リグノー－ブリカール，レイチェル

(72)【発明者】

【氏名】コマン，テレザ

(72)【発明者】

【氏名】ギエム，フラヴィア

(72)【発明者】

【氏名】ルペルティエ，イヴ

(72)【発明者】

【氏名】ルナン，アメデ

(72)【発明者】

【氏名】ミルピエ，ピエール

(57)【要約】      （修正有）

【課題】癌を患っている患者における、ＣＤ８陽性Ｔ細胞依存性免疫応答を増強させるための方法及び医薬組成物を提供する。
【解決手段】治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、癌を患っている患者における腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の量を増加させる方法とする。免疫チェックポイント阻害剤とＮＲＰ－１阻害剤の治療に有効な組合せを患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法であって、該組合せの投与により、該免疫チェックポイント阻害剤の単独投与と比較して増強された治療有効性が得られる、方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、癌を患っている患者における腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の量を増加させる方法。

【請求項2】

前記ＮＲＰ－１阻害剤が、ＮＲＰ－１に対する結合親和性を有する抗体、特にＮＲＰ－１のドメインｃに結合する抗体、セマフォリン３Ａに結合するＮＲＰ－１の領域に対する結合親和性を有する抗体、又は配列番号１の１位のアミノ酸残基から２８０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列に対する結合親和性を有する抗体である、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記抗体が、ＮＲＰ－１に対するＶＥＧＦの結合を阻害しない、請求項２記載の方法。

【請求項4】

前記抗ＮＲＰ－１抗体が、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む、請求項２記載の方法。

【請求項5】

前記抗ＮＲＰ－１抗体が、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列及び／又は配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２記載の方法。

【請求項6】

前記抗ＮＲＰ－１抗体が、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む抗体と、ＮＲＰ－１アイソフォームに対する結合に関して交差競合する、請求項２記載の方法。

【請求項7】

前記ＮＲＰ－１阻害剤が、ＮＲＰ－１のドメインｃを含むポリペプチド；ＮＲＰ－１の膜貫通ドメインを含むポリペプチド；又は、配列番号１の１位のアミノ酸残基から２８０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる、請求項１記載の方法。

【請求項8】

前記ＮＲＰ－１阻害剤が、ＮＲＰ－１発現阻害剤である、請求項１記載の方法。

【請求項9】

治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法。

【請求項10】

ｉ）患者から得られた腫瘍組織試料中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を定量すること、ｉｉ）工程ｉ）で定量された密度を、所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、請求項６記載の方法。

【請求項11】

処置レジメンの一部として患者に投与される免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強させるための方法であって、該免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、薬学的有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、方法。

【請求項12】

免疫チェックポイント阻害剤とＮＲＰ－１阻害剤の治療に有効な組合せを患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法であって、該組合せの投与により、該免疫チェックポイント阻害剤の単独投与と比較して増強された治療有効性が得られる、方法。

【請求項13】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択された抗体である、請求項９記載の方法。

【請求項14】

前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１３記載の方法。

【請求項15】

ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とＮＲＰ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む、多重特異的抗体の治療有効量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法。

【請求項16】

前記多重特異的抗体が二重特異的抗体である、請求項１１記載の方法。

【請求項17】

癌ワクチンと組み合わせて治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法。

【請求項18】

癌を患っている患者が、免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成するかどうかを予測する方法であって、ｉ）患者由来の腫瘍試料中のＮＲＰ－１又はセマフォリン３Ａの発現レベルを決定すること、及びｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが、所定の基準値より低い場合、患者は、該免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成すると結論付けること、又は、工程ｉ）で決定された発現レベルが、所定の基準値より高い場合、患者は、該免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成しないと結論付けることを含む、方法。

【請求項19】

ＣＤ８の発現レベルを決定することを更に含む、請求項１３記載の方法。

【請求項20】

ｉ）患者から得られた腫瘍組織試料中のＮＲＰ－１又はセマフォリン３Ａの発現レベルを決定すること、及びｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが、所定の基準値より低い場合、患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法。

【請求項21】

ＰＤ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とＮＲＰ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む、多重特異的抗体。

【請求項22】

二重特異的抗体である、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項23】

以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）と、
以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）と
を含む、ＮＲＰ－１に特異的に結合する第一結合部位を含む、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項24】

配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と配列番号１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む、ＮＲＰ－１に特異的に結合する第一結合部位を含む、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項25】

ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１１のＶＨドメインと配列番号１２のＶＬドメインとを含む、第二結合部位を含む、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項26】

ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１５のＶＨドメインと配列番号１６のＶＬドメインとを含む、第二の結合部位を含む、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項27】

－ ＮＲＰ－１に特異的に結合し、かつ配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と配列番号１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む、第一結合部位、及び
－ ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１１のＶＨドメインと配列番号１２のＶＬドメインとを含む、第二結合部位
を含む、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項28】

－ ＮＲＰ－１に特異的に結合し、かつ配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と配列番号１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む、第一結合部位、及び
－ ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１５のＶＨドメインと配列番号１６のＶＬドメインとを含む、第二結合部位
を含む、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項29】

癌の処置に使用するための、請求項１７記載の多重特異的抗体。

【請求項30】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように設計されている細胞集団であって、該細胞におけるＮＲＰ－１の発現が抑制されている、細胞集団。

【請求項31】

前記細胞が、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、又はＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＴ細胞、及び幹細胞からなる群より選択される、請求項２１記載の細胞集団。

【請求項32】

少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質の発現も抑制されている、請求項２１記載の細胞集団。

【請求項33】

ｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞内に導入すること、及びｉｉ）該細胞を、エンドヌクレアーゼ系と接触させて、ＮＲＰ－１の発現を抑制させることからなる工程を含む、ＣＡＲを発現する細胞を製造する方法。

【請求項34】

ｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞内に導入すること、並びにｉｉ）該細胞を、Ｃａｓタンパク質と、及びＮＲＰ－１遺伝子に標的化する配列とＣａｓタンパク質に結合することのできる配列とを含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）とに接触させることからなる工程を含む、請求項２４記載の方法。

【請求項35】

前記細胞を、免疫チェックポイントタンパク質（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４など）をコードする遺伝子に標的化する配列を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子に接触させることを更に含む、請求項２５記載の方法。

【請求項36】

治療有効量の請求項２１記載のＴ細胞集団を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野：
本発明は、癌を患っている患者における、ＣＤ８陽性Ｔ細胞依存性免疫応答を増強させるための方法及び医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景：
免疫系が癌を検出し排除できることが初めて１００年以上前に提唱された。それ以来、腫瘍関連抗原に対して反応性であるＴ細胞が、多くの様々な種類の癌を有する患者の血液中に検出され、このことは、癌と戦う上での免疫系の役割を示唆する。自然免疫及び獲得免疫は、腫瘍細胞の場合のように「改変された」細胞と正常な細胞を区別する、リンパ球及びナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞を維持する。しかしながら、殆どの場合、腫瘍細胞は免疫による認識及び破壊を回避することができる。腫瘍の回避機序は、数多くあるが、共抑制分子の免疫抑制作用が、新規な癌の処置を想像するのに最も魅力的な機序として、ここ十年の間に出現した。リンパ球の活性化は実際に、Ｂ７/ＣＤ２８スーパーファミリー（免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーとしても知られる）及びＴＮＦ（腫瘍壊死因子）/ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）スーパーファミリーに属している、共刺激分子及び共抑制分子の両方によって調節されている。これらのシグナル間のバランスが、リンパ球の活性化を決定し、結果として免疫応答を調節する。これらの共刺激分子及び共抑制分子は、「免疫チェックポイント」と呼ばれる。近年最も注目を集めている免疫チェックポイントは、プログラム化細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）である。ＰＤ－１を阻害するモノクロール抗体、例えばニボルマブ及びペンブロリズマブは実際に、有意な有効性を実証し、すでに承認され、将来、大ヒットすると予想される。しかしながら、これらの薬物によって提唱されるかなりの進歩にも関わらず、幾人かの患者は応答せず、したがって、新規な治療選択肢を提供するために、前記の耐性の機序を同定する必要がある。

【0003】

ニューロフィリン－１（ＮＲＰ－１）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーの様々なメンバーに対する共受容体として作用する、膜貫通糖タンパク質である。クラス３セマフォリン、形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＰＤＧＦ）などの多くの他の細胞外リガンドに結合しその活性を調節する能力は、様々な生理学的及び病理学的プロセスにおけるＮＲＰ－１の関与を示唆している。実際に、この共受容体は、軸索誘導、血管新生、腫瘍進行に関与している。本発明者ら及び他者らは、自然免疫及び獲得免疫の両方におけるＮｒｐ１の関与を示したが、抗腫瘍性細胞障害性Ｔ細胞におけるＮＲＰ－１の影響は、これまで研究されてこなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

発明の概要：
特許請求の範囲によって定義されているように、本発明は、癌を患っている患者における、ＣＤ８陽性Ｔ細胞依存性免疫応答を増強させるための方法及び医薬組成物に関する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の詳細な説明：
本発明者らは、今回、ＮＲＰ－１が、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は細胞障害性Ｔ細胞）によって発現され、ＰＤ－１と共局在し、該細胞上でＰＤ－１と複合体を形成することを実証した。細胞障害性Ｔ細胞におけるＮＲＰ－１の発現の欠失により、動物においてより顕著な抗腫瘍応答がもたらされた。更に、動物におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞上でのＮＲＰ１の欠失と抗ＰＤ１阻害剤の組合せにより、相乗的な抗腫瘍効果がもたらされた。最後に、コンピューター分析は、患者におけるＮＲＰ－１の発現低下は、抗ＰＤ１阻害剤を用いて処置された患者におけるより良好な応答に関連することを示す。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】 腫瘍浸潤性テトラマーＨ２ｋｂ/ＳＩＩＮＦＥＫＬマウスのＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮｒｐ１の発現。Ｂ１６Ｆ１０－オボアルブミン腫瘍細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ/６マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍の注射から７日後及び１４日後、マウスを、ポリＩＣ／オボアルブミンの組合せを用いて皮下に免疫化した。腫瘍を、注射から２１日後に収集し、腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、テトラマーＨ２ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ、抗ＣＤ８抗体、及び抗Ｎｒｐ１抗体を使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。データは、フローサイトメトリーグラフに、抗ＣＤ８抗体及びテトラマーＨ２ｋｂ－オボアルブミンを用いて提示されている。テトラマーＨ２ｋｂ－オボアルブミン陽性集団が、最頻値に正規化されたＮｒｐ１発現に関してヒストグラムに提示されている。データは、３回の独立した実験の代表である。

【図2】６日目、８日目、１５日目及び３０日目における、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）アームストロング株（ｎ＝１６）、ＬＣＭＶクローン１３株（ｎ＝１６）、又は対照のナイーブＣＤ４４^ｌｏｗＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｎ＝４）を用いたインビボでのマウスの感染による、Ｈ２－Ｄｂ ＧＰ３３特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＲＰ１の発現プロファイル。トランスクリプトミクス分析のデータは、Doering et al. Immunity, 2012から入手可能であった。Ｐ値は、二次元分散分析（ｐ＝０．０００８）によって決定された。

【図3】 抗腫瘍免疫応答モデルにおける、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍体積の追跡。ＣＤ８陽性Ｎｒｐ１ノックアウト（ＫＯ）マウス又はＣＤ８ＣＲＥ（野生型）マウスは、０日目に右脇腹に１００万個のＢ１６Ｆ１０の投与を受け、続いて、マウス１匹あたり４０μgのポリＩＣ及び４００μgのオボアルブミンを皮下注射される、ポリＩＣ/オボアルブミンを用いての免疫化を７日目及び１４日目に行なった。データは、注射から０日目、８日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に腫瘍体積の平均値＋/－平均値の標準誤差として提示される。データは、３回の独立した実験の代表である。

【図4】オボアルブミン及びポリＩＣを用いて免疫化された又は免疫化されていない（対照）、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウト（ＫＯ）マウス及び対照（野生型、ＷＴ）マウスから、フローサイトメトリーによって免疫化後１４日目に評価された、４つの異なるマウス群のＢ１６－オボアルブミン腫瘍における、テトラマー/ＰＥ－Ｈ２ＫｂオボアルブミンＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球の比率。データは、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球テトラマー陽性の比率の平均値±平均値の標準誤差として提示される。Ｐ値は、スチューデントＴ検定によって決定された。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。データは、３回の独立した実験の代表である。

【図5】活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と、細胞トレーサーバイオレットで標識されたＡ２０細胞との間の同種異系シナプスモデルにおける、ＮＲＰ１の発現（ピクセル強度の平均値／ＭＰＩ）のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍによる定量。ＮＲＰ１の発現を、シナプス接合部（ファロイジンで高度に標識される帯域）における活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞において分析した。データは、ＭＰＩの平均値±平均値の標準誤差として提示される。Ｐ値（ｐ＜０．０００１）は、ウィルコクソンの符号付き順位検定によって決定された。データは、２つのシナプスモデルに由来する４回の独立した実験の代表である。

【図6】ＰＤ１は、活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞との間のシナプス内に動員される。活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と同種異系Ａ２０腫瘍細胞との間のシナプスモデルにおけるＰＤ１発現（ピクセル強度の平均値/ＭＰＩ）のＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍによる分析：ＰＤ１の発現は、活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞（Ａ２０）との間のファロイジンの高い領域において分析された。データは、ＭＰＩの平均値±平均値の標準誤差として提示される。Ｐ値は、スチューデントＴ検定によって決定された。データは、５回の実験の代表である。

【図7】ヒトＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球におけるＮＲＰ１及びＰＤ１の発現のフローサイトメトリーによる分析。データは、ヒト子宮癌、腎臓癌、及び卵巣癌における３回の独立した実験の代表である。

【図8】ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウス（ＫＯ）又は対照（ＷＴ）に由来する活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と、同種異系Ａ２０腫瘍細胞との間の、シナプス接合部（ファロイジンで高度に標識される帯域）におけるＰＤ１発現（ＭＰＩ）のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍによる定量。データは、ＭＰＩの平均値±平均値の標準誤差として提示される。Ｐ値（ｐ＜０．０００１）は、マンホイットニー検定によって決定された。データは、２回の独立した実験の代表である。

【図9】ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウス（ＫＯ）又は対照マウス（ＷＴ）に由来する活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と、細胞トレーサーバイオレットで標識されたＡ２０腫瘍細胞との間の、シナプス接合部（ファロイジンで高度に標識される帯域）におけるリン酸化ＺＡＰ７０の量（ピクセル強度の平均値/ＭＰＩ）のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍによる定量。データは、ＭＰＩの平均値±平均値の標準誤差として提示される。Ｐ値（ｐ＜０．０００１）は、マンホイットニー検定によって決定された。データは、３回の独立した実験の代表である。

【図10】ＮＲＰ１発現による、ヒトＰＤ１陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球における、リン酸化ＺＡＰ７０のフローサイトメトリーによる分析。データは、ヒト子宮癌における１回の実験の代表である。

【図11】抗ＰＤ１抗体の存在下又は非存在下における、ブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）スーパー抗原の濃度（０、１、１０、又は１００ng/mL）に対する、ＮＲＰ１ハプロ不全を有する患者（患者）又は対照（Ｎ＝５）に由来するＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＣＤ２５の発現のフローサイトメトリー分析。活性化は、７２時間の間に行なわれた。データは、ＣＤ２５の発現の平均値％±平均値の標準誤差として提示される。ヒト抗ＰＤ１抗体（ペンブロリズマブ、メルク社）。

【図12】抗ＰＤ１抗体の存在下又は非存在下における、ブドウ球菌腸毒素Ｂスーパー抗原の濃度（０、１、１０、又は１００ng/mL）に対する、ＮＲＰ１ハプロ不全を有する患者（患者）又は対照（Ｎ＝５）に由来する分裂したＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率のフローサイトメトリー分析。活性化は、７２時間の間に行なわれた。データは、平均値±平均値の標準誤差として提示される。ヒト抗ＰＤ１抗体（ペンブロリズマブ、メルク社）。

【図13】ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウト（ＫＯ）マウス及び対照（ＷＴ）マウスに、オボアルブミン及びポリＩＣを用いて事前に免疫化し、そしてインビボで抗ＰＤ１抗体を用いて処置したか又は処置しなかった。免疫化後５０日目までの、全生存率を評価した。データは、平均値±平均値の標準誤差として、及びカプランマイヤー曲線として提示される。Ｐ値はログランク検定によって決定された。データは、５回の実験の代表である。バイオＸセル社のマウス抗ＰＤ１抗体（Ｊ４３クローン）。

【図14】抗ＰＤ１抗体による処置前に、腫瘍において評価されたＮＲＰ１のＲＮＡの発現（低い又は高い発現）に従って、抗ＰＤ１抗体を用いて処置された転移性黒色腫患者の全生存率の分析。転移性黒色腫の腫瘍のトランスクリプトーム分析のデータは、Hugo et al. Cell, 2016から入手可能であった。データは、カプランマイヤー曲線として提示される。Ｐ値（ｐ＝０．０３）は、ログランク検定によって決定された（ｎ＝２５人の患者）。

【図15】治療を開始する前に免疫組織化学的検査によって評価された、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球におけるＮＲＰ１の発現（ＮＲＰ１^{－/ｌｏｗ}をＮＲＰ１^{＋/ｈｉｇｈ}と比較）に従って、抗ＰＤ－１抗体を用いて処置され、少なくとも部分的な応答を達成した、転移性黒色腫患者の無再発生存率の分析。ブラインド分析を実施することにより、ＮＲＰ１の発現を評価した。データは、カプランマイヤー曲線として提示される。Ｐ値（Ｐ＝０．０４２）は、ログランク検定（ｎ＝１５人の患者）によって決定された。

【図16】腫瘍細胞（ラージ細胞）を含むシナプスにおける、ヒト活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるリン酸化ＺＡＰ７０の量（ピクセル強度の平均値/ＭＰＩ）のＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍによる定量。データは、ＭＰＩの平均値±平均値の標準誤差として提示される。Ｐ値は、マンホイットニー検定によって決定された。ヒト抗ＮＲＰ１抗体（ＡＦ３８７０、Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ヒト抗ＰＤ－１抗体（ペンブロリズマブ、メルク社）。

【発明を実施するための形態】

【0007】

主な定義：
本明細書において使用する「Ｔ細胞」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす免疫系の重要な成分を示す。Ｔ細胞は、通常のリンパ球として知られている。なぜなら、それらは、主要組織適合性複合体分子による提示又は拘束により、それらのＴＣＲ（抗原に対するＴ細胞受容体）を用いて抗原を認識するからである。ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、γδＴ細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの、各々明確に異なる機能を有するＴ細胞のいくつかのサブセットが存在する。

【0008】

本明細書において使用する「ＣＤ８陽性Ｔ細胞」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、それらの表面上にＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを指す。それらはＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞障害性Ｔ細胞として機能する。「ＣＤ８陽性Ｔ細胞」はまた、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔキラー細胞、細胞障害性Ｔ細胞、又はキラーＴ細胞とも呼ばれる。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束性相互作用に関連した認識要素である。本明細書において使用する「腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞」という用語は、血流から去り、腫瘍内に遊走した、患者のＣＤ８陽性Ｔ細胞のプールを指す。

【0009】

本明細書において使用する「ＣＤ４陽性Ｔ細胞」（ヘルパーＴ細胞又はＴＨ細胞とも呼ばれる）という用語は、それらの表面上にＣＤ４糖タンパク質を発現し、Ｂ細胞から形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞障害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化をはじめとする、免疫学的プロセスにおける他の白血球を補助するＴ細胞を指す。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、それらが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるペプチド抗原を、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示された場合に活性化状態となる。一旦活性化されると、それらは急速に分裂し、活発な免疫応答を調節又は補助するサイトカインを分泌する。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、ＴＦＨ（濾胞性ヘルパーＴ細胞）、又はＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）をはじめとする、いくつかのサブタイプの中の１つへと分化して、異なる種類の免疫応答を促進することができる。抗原提示細胞からのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定のサブタイプへと方向づける。ＣＤ４の他に、当技術分野において公知であるヘルパーＴ細胞の表面バイオマーカーとしては、ＣＸＣＲ３（Ｔｈ１）、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２（Ｔｈ２）、ＣＣＲ６（Ｔｈ１７）、ＣＸＣＲ５（Ｔｆｈ）並びにサブタイプ特異的なサイトカインの発現及び転写因子（Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＥＯＭＥＳ、ＲＯＲγＴ、ＢＣＬ６、及びＦｏｘＰ３を含む）が挙げられる。

【0010】

本明細書において使用する「ガンマデルタＴ細胞」という用語は当技術分野においけるその一般的な意味を有する。ガンマデルタＴ細胞は通常、健康な個体（ヒト、サル）における末梢血リンパ球の１～５％を占める。それらは、防御性免疫応答の開始に関与し、それらは、抗原提示細胞のＭＨＣ分子による提示を全く受けることなく、抗原との直接的な相互作用によってそれらの抗原性リガンドを認識することが示された。ガンマ９デルタ２Ｔ細胞（時に、ガンマ２デルタ２Ｔ細胞とも呼ばれる）は、可変ドメインＶγ９とＶδ２とを有するＴ細胞受容体を有するガンマデルタＴ細胞である。それらはヒト血液中のガンマデルタＴ細胞の大半を形成する。活性化されると、ガンマデルタＴ細胞は、強力でＭＨＣ拘束性ではない細胞障害活性を発揮し、特に、様々な種類の細胞、特に病原細胞の死滅に効果的である。これらは、ウイルス（Poccia et al., J. Leukocyte Biology, 1997, 62: 1-5）に、又は他の細胞内寄生虫、例えばマイコバクテリア（Constant et al., Infection and Immunity, December 1995, vol. 63, no. 12: 4628-4633）若しくは原虫（Behr et al., Infection and Immunity, 1996, vol. 64, no. 8: 2892-2896）に感染した細胞であってもよい。それらはまた、癌細胞（Poccia et al., J. Immunol., 159: 6009-6015; Fournie and Bonneville, Res. Immunol., 66th Forum in Immunology, 147: 338-347）であってもよい。それ故、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで該細胞の活性を調節できることは、感染症（特にウイルス性疾患又は寄生虫性疾患）、癌、アレルギー、及び更には自己免疫障害及び／又は炎症障害などの様々な病態の処置における、新規で有効な治療アプローチを提供する。

【0011】

本明細書において使用する「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＴリンパ球を指す。ＣＡＲ Ｔ細胞の定義は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、並びに、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞などをはじめとする全てのクラス及びサブクラスのＴリンパ球を包含する。遺伝子的に改変されたＴリンパ球は、遺伝子的に改変されたＴ細胞を使用した処置を受けるであろう被験者「に由来」若しくは「から得られ」ても、又は、それらは異なる被験者「に由来」若しくは「から得られ」てもよい。

【0012】

本明細書において使用する「キメラ抗原受容体」又は代替的には「ＣＡＲ」という用語は、１セットのポリペプチド、典型的には最も簡単な実施態様では２セットのポリペプチドを指し、これは免疫エフェクター細胞にある場合、該細胞に標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性、及び細胞内シグナルの発生をもたらす。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、並びに、以下に定義されているような刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含んでいる細胞質内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、互いに連続している。いくつかの実施態様では、ポリペプチドのセットは、二量体化スイッチを含み、これは二量体化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる。いくつかの実施態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に会合したゼータ鎖である。いくつかの実施態様では、細胞質内シグナル伝達ドメインは更に、以下に定義されているような少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的なシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施態様では、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２８から選択される。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、及び、１つの刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含んでいる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、及び、１つの共刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインと１つの刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインとを含んでいる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインと１つの刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインとを含んでいる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインと１つの刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインとを含んでいる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意選択のリーダー配列を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは更に、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここでのリーダー配列は、細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化の最中に、抗原結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）から場合により切断される。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータに融合したモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとエンドドメインの融合物を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又はＯＸ４０などの更なる共刺激シグナル伝達用のドメインを含む。いくつかの実施態様では、共刺激分子、イメージング用（例えば、陽電子放出断層撮影用）のレポーター遺伝子、プロドラッグが添加されるとＴ細胞を条件付きで切除する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体をはじめとする、分子を、ＣＡＲと共発現させてもよい。

【0013】

本明細書において使用する「ＮＲＰ－１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ニューロフィリン－１を指す。ＮＲＰ－１の例示的なヒト核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０２４６２８．２によって示され、ヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０１９７９９．１によって示される。特に、ＮＲＰ－１のヒトアミノ酸配列は、配列番号１によって示される。ＮＲＰ－１の基本構造は、５つのドメイン、すなわち、３つの細胞外ドメイン（ａ１ａ２、ｂ１、ｂ２及びｃ）、１つの膜貫通ドメイン、及び１つの細胞質内ドメイン（配列番号１）を含む。セマフォリン３Ａに結合するａ１ａ２ドメインは、配列番号１の１位のアミノ酸残基から２８０位のアミノ酸残基の範囲である。

【0014】

【化1】

【0015】

本明細書において使用する「ＮＲＰ－１の機能的等価体」は、セマフォリン３Ａに結合し、それにより、ＮＲＰ－１とセマフォリン３Ａの相互作用を妨げることのできる、ポリペプチドである。「機能的等価体」という用語は、ＮＲＰ－１の断片、突然変異体、及びムテインを含む。したがって、「機能的に等価」という用語は、タンパク質類似体が例えば、セマフォリン３Ａに対する結合能を保持するように、アミノ酸配列を改変させることによって、例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、又は付加によって、得られたＮＲＰ－１の任意の等価体を含む。アミノ酸の置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によってなされ得る。本明細書において使用する「機能的に等価な断片」という用語はまた、ＮＲＰ－１の任意の断片又は断片の集合体も意味し得る。

【0016】

本明細書において使用する「ＮＲＰ－１阻害剤」という用語は、ＮＲＰ－１の機能及び／又は発現を阻害することのできる、化合物、物質、又は組成物を指す。例えば、該阻害剤は、ＮＲＰ－１の発現若しくは活性を阻害することができるか、ＮＲＰ－１を調節若しくは遮断することができるか、又はシグナル伝達経路を遮断することができる。特に、ＮＲＰ－１阻害剤は、ＮＲＰ－１とその対、特にセマフォリン－３Ａとの間の相互作用を阻害する。特に、ＮＲＰ－１の阻害剤は、ＮＲＰ－１とＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）との間の相互作用を阻害しない。

【0017】

本明細書において使用する「セマフォリン－３Ａ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトにおいてＳＥＭＡ３Ａ遺伝子によってコードされているタンパク質であるセマフォリン－３Ａを指す。該用語はまた、ＣＯＬＬ１、ＨＨ１６、Ｈｓｅｍａ－１、Ｈｓｅｍａ－ＩＩＩ、ＳＥＭＡ１、ＳＥＭＡＤ、ＳＥＭＡＩＩＩ、ＳＥＭＡＬ、ＳｅｍＤ、及びｃｏｌｌ－１としても知られている。ＳＥＭＡ３Ａ遺伝子は、セマフォリンファミリーのメンバーであり、免疫グロブリン様Ｃ２型（免疫グロブリン様）ドメイン、ＰＳＩドメイン、及びＳｅｍａドメインを有するタンパク質をコードしている。ＮＲＰ－１の例示的なヒト核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６０８０．２によって示され、ヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６０７１．１によって示される。特に、セマフォリン３Ａのヒトアミノ酸配列は、配列番号２によって示される。

【0018】

【化2】

【0019】

本明細書において使用する「リンカー」という用語は、本発明のポリペプチドと免疫グロブリン配列部分とを連結する、少なくとも１アミノ酸の配列を指す。このようなリンカーは、立体障害を防ぐのに有用であり得る。いくつかの実施態様では、該リンカーは、４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０アミノ酸残基を有する。１つの有用なリンカー配列群は、国際公開公報第９６/３４１０３号及び国際公開公報第９４/０４６７８号に記載のような重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、ポリ－アラニンリンカー配列である。

【0020】

本明細書において使用する「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、シグナルを上昇させるか（刺激性チェックポイント分子）又はシグナルを低下させる（抑制性チェックポイント分子）のいずれかである、Ｔ細胞によって発現される分子を指す。免疫チェックポイント分子は、当技術分野において、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１依存性経路に類似した免疫チェックポイント経路を構成すると認識されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264; Mellman et al., 2011. Nature 480:480- 489参照）。抑制性チェックポイント分子の例としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７７、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３及びＶＩＳＴＡが挙げられる。アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）は、癌療法における重要なチェックポイントとして捉えられる。なぜなら、腫瘍微小環境は、比較的高いレベルのアデノシンを有し、これにより、Ａ２ＡＲの活性化を通した、負の免疫フィードバックループに至るからである。Ｂ７－Ｈ３は、ＣＤ２７６とも呼ばれているが、これは当初、共刺激分子であると理解されていたが、現在では共抑制性であると捉えられている。Ｂ７－Ｈ４は、ＶＴＣＮ１とも呼ばれているが、これは腫瘍細胞及び腫瘍関連マクロファージによって発現され、腫瘍回避において役割を果たしている。Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）は、ＣＤ２７２とも呼ばれているが、これはＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）のリガンドである。ＢＴＬＡの細胞表面発現は、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞のナイーブ細胞表現型からエフェクター細胞表現型への分化中に次第にダウンレギュレートされるが、腫瘍特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、高いレベルのＢＴＬＡを発現している。ＣＴＬＡ－４（細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、ＣＤ１５２とも呼ばれているが、これは、制御性Ｔ細胞上に過剰発現され、Ｔ細胞の増殖を制御するように作用する。ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）は、関連した免疫抑制性酵素であるトリプトファン異化酵素である。別の重要な分子は、ＴＤＯ（トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ）である。ＩＤＯは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を抑制し、制御性Ｔ細胞及び骨髄由来サプレッサー細胞を生成及び活性化し、腫瘍の血管新生を促進することが知られている。ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）は、ナチュラルキラー細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に対する受容体である。ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子－３）は、制御性Ｔ細胞に対する作用並びにＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する直接作用によって、免疫応答を抑制するように働く。ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３の略）は、活性化されたヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞上に発現し、Ｔｈ１及びＴｈ１７サイトカインを調節する。ＴＩＭ－３は、そのリガンドであるガレクチン－９と相互作用する時に細胞死をトリガーすることによって、Ｔｈ１/Ｔｃ１の機能の負の調節因子として作用する。ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサーの略）は主に、造血細胞上に発現し、よって、腫瘍内の白血球上におけるＶＩＳＴＡの一貫した発現は、ＶＩＳＴＡによる遮断が、幅広い固形腫瘍に対して有効となることを可能にし得る。本明細書において使用する「ＰＤ－１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プログラム化細胞死タンパク質１（ＣＤ２７９としても知られる）を指す。ＰＤ－１は、免疫チェックポイントとして作用し、そのリガンドの１つであるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２と結合すると、Ｔ細胞の活性化を阻害する。

【0021】

本明細書において使用する「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、免疫抑制チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物を指す。阻害は、機能の低減及び完全な遮断を含む。好ましい免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。多くの免疫チェックポイント阻害剤が公知であり、これらの公知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤から類推して、代替的な免疫チェックポイント阻害剤を（近い）将来開発することができる。免疫チェックポイント阻害剤は、ペプチド、抗体、核酸分子、及び低分子を含む。特に、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、患者におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞、特に患者の腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖、遊走、存続性、及び／又は細胞障害活性を増強させるために投与される。免疫チェックポイント阻害剤がＣＤ８陽性Ｔ細胞の殺滅活性を増強する能力は、当技術分野において周知である任意のアッセイによって決定され得る。典型的には、該アッセイは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、標的細胞（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識及び／又は溶解される標的細胞）と接触させる、インビトロアッセイである。例えば、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、同じエフェクター細胞：標的細胞の比で、ＣＤ８陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞株を、本発明の免疫チェックポイント阻害剤と接触させて得られた、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による比溶解を、２０％超、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又はそれ以上の比溶解だけ増加させる能力について選択され得る。古典的な細胞障害活性アッセイについてのプロトコールの例は慣用的である。したがって、「免疫チェックポイントの効力を増強させること」という表現は、ＮＲＰ－１阻害剤が、免疫チェックポイント阻害剤の能力を高めて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖、遊走、存続性、及び／又は細胞障害活性を増強させることができることを指す。

【0022】

したがって、本明細書において使用する「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、タンデム抗体ダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ（二本鎖Ｆｖ）、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、鎖状抗体、ミニ抗体、ディアボディーズ、二重特異的抗体断片、ビボディ、トリボディ（それぞれ二重特異的又は三重特異的なｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合物）；ｓｃ－ディアボディ；κ（λ）ボディーズ（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ抗体（二重特異的Ｔ細胞誘導抗体、Ｔ細胞を誘引するｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ）；ＤＶＤ－Ｉｇ（デュアル可変ドメイン抗体、二重特異的フォーマット）；ＳＩＰ（小型免疫タンパク質、一種のミニ抗体）；ＳＭＩＰ（「小型モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ－Ｆｃダイマー）；ＤＡＲＴ（二本鎖安定化ディアボディ「デュアル親和性再標的化」）；１つ以上のＣＤＲを含む小型抗体模倣体などを含む、抗体断片を含む。様々な抗体をベースとした構築物及び断片を調製及び使用するための技術は当技術分野において周知である（Kabat et al., 1991参照、参照により本明細書に具体的に援用される）。ディアボディーズは特に、欧州特許第４０４，０９７号及び国際公開公報第９３/１１１６１号に更に記載され；一方、鎖状抗体は、Zapata et al. (1995)に更に記載されている。抗体は、慣用的な技術を使用して断片化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。結果として得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理して、ジスルフィド橋を還元することにより、Ｆａｂ’断片を生成することができる。パパインによる消化により、Ｆａｂ断片が形成され得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体、タンデム抗体、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニ抗体、ディアボディーズ、二重特異的抗体断片、及び他の断片も、組換え技術によって合成されても、又は、化学合成されてもよい。抗体断片を生成するための技術は、当技術分野において周知であり、記載されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001 ; Reiter et al., 1996；及びYoung et al., 1995はそれぞれ、有効な抗体断片の生成を更に記載及び可能としている。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、一本鎖抗体である。本明細書において使用する「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然的には軽鎖を欠失しているラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体は、「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明のために、上記に引用されている先行技術、並びに、欧州特許第０３６８６８４号、Ward et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6）、 Holt et al.、Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；及び国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号も参照されたい。

【0023】

げっ歯類及び霊長類の天然抗体では、２本の重鎖が互いにジスルフィド結合によって連結され、各々の重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖には２種類存在する：ラムダ（λ）及びカッパ（κ）。抗体分子の機能的活性を決定する、主に５つの重鎖のクラス（又はアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は、個別の配列ドメインを含有している。典型的なＩｇＧ抗体では、軽鎖は、２つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、まとめてＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動、補体との結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖と１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から作られる。時に、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、抗体結合部位に関与し得るか、又は、全体的なドメイン構造に影響を及ぼし得、したがって結合部位に影響を及ぼし得る。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は各々、それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、及びＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを有する。それ故、抗原結合部位は、典型的には、重鎖及び軽鎖の各々のＶ領域に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖及び重鎖の可変領域は典型的には、以下の配列の４つのフレームワーク領域及び３つのＣＤＲを含む：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。抗体可変ドメイン内の残基は、通常、Kabat et al.によって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Kabat et al., 1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健福祉省、国立衛生研究所、米国（Kabat et al., 1992、本明細書において以後は「Kabat et al.」）に示されている。Ｋａｂａｔ残基の呼称は常に、配列番号の配列のアミノ酸残基の直線的な番号付けに直接対応するとは限らない。実際の直線的なアミノ酸配列は、厳密なＫａｂａｔの番号付けにおけるよりも、構造成分（フレームワーク領域であれ、又は基本的な可変ドメイン構造の相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ）の短縮又はそれへの挿入に対応する、より少ない又は追加されたアミノ酸を含有し得る。所与の抗体についての残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列内の相同性残基を、「標準的な」Ｋａｂａｔで番号付けされた配列とアラインさせることによって決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによると、残基３１～３５（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び残基９５～１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによると、残基２４～３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び残基８９～９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する。本明細書において以後記載されている抗体についてのＣＤＲは、www.bioinf.org.ukのＣＤＲ発見アルゴリズムを使用して決定されている。抗体のページ内の「配列を見つけるためにどのようにしてＣＤＲを決定するか（How to identify the CDRs by looking at a sequence）」と題した章を参照されたい。

【0024】

本明細書において使用する「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然的には軽鎖を欠失しているラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体は、「ナノボディ（登録商標）」でもある。

【0025】

本明細書において使用する「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む、融合タンパク質を指し、ここで、軽鎖及び重鎖の可変領域は、例えば合成リンカー、例えば短い可動性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ここでのｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持している。特記されない限り、本明細書において使用するｓｃＦｖは、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端について、いずれかの順序で、ＶＬ可変領域及びＶＨ可変領域を有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るか、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。

【0026】

本明細書において使用する「二重特異的抗体」という用語は、２つの標的分子に対して特異性を含む抗体、すなわち、少なくとも２つの異なるエピトープ、典型的には重なっていないエピトープに対して特異性を有する抗体を意味する。本明細書において使用する「完全なヒト」という用語は、免疫グロブリン、例えば抗体又は抗体断片を指し、ここでの完全分子は、ヒト起源であるか、又は、ヒト形態の抗体若しくは免疫グロブリンに対して同一であるアミノ酸配列からなる。

【0027】

本明細書において使用する「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくつかの、大半の、又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換されている、抗体を説明する。

【0028】

本明細書において使用する「交差競合」という用語は、抗原の特定の領域に結合する能力を共有しているモノクローナル抗体を指す。本開示では、「交差競合」するモノクローナル抗体は、標準的な競合結合アッセイにおいて、抗原に対する別のモノクローナル抗体の結合を妨害する能力を有する。このようなモノクローナル抗体は、限定しない理論によると、それが競合する抗体と同じ、又は関連した、又は近くの（例えば構造的に類似した又は空間的に近い）エピトープに結合し得る。抗体Ａが、抗体Ｂの結合を、該抗体の１つを欠失した陽性対照と比較して、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、より特定すると少なくとも８０％減少させる場合（及びその逆の場合も同様に）に、交差競合が存在する。当業者は理解しているように、競合は、様々なアッセイの設定で評価され得る。１つの適切なアッセイは、ビアコア技術の使用（例えば、ビアコア３０００機器（ビアコア、ウプサラ、スウェーデン）を使用することによる）を含み、これは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定することができる。交差競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づいたアプローチを使用する。更に、それらの交差競合に基づいて抗体を「ビニングする」ためのハイスループットプロセスが、国際特許出願第ＷＯ２００３/４８７３１号に記載されている。

【0029】

「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する、天然化合物又は合成化合物を指す。

【0030】

「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。いくつかの、例えばデオキシリボヌクレアーゼＩは、ＤＮＡを比較的非特異的に（配列に関係なく）切断し、一方、多くの、典型的には制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素と呼ばれるものは、非常に特定のヌクレオチド配列でしか切断しない。エンドヌクレアーゼに基づいたゲノム不活化の背後にある機序は一般的に、ＤＮＡの一本鎖又は二本鎖の切断という第一工程を必要とし、これはその後、ＤＮＡ修復のための２つの明確に異なる細胞性機序（エラーを起こしがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度の相同組換え修復（ＨＤＲ））をトリガーし得、これがＤＮＡの不活化に活用され得る。ＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼ（例えば細菌メガヌクレアーゼ）であっても、又は、それは人工的に作製されてもよい（例えば、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は、とりわけジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））。

【0031】

いくつかの実施態様では、本発明のＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮである。本明細書において使用する「ＴＡＬＥＮ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、これは、標的遺伝子を編集するために使用することのできる人工的なヌクレアーゼである、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクター（「ＴＡＬＥ」）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば１つ以上のＴＡＬＥ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＴＡＬＥをＤＮＡ修飾ドメイン、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合することによって人工的に作製される。転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように設計されていてもよい（Zhang (2011), Nature Biotech. 29: 149-153）。操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的である制限酵素を作製することができる。その後、これらを細胞内に導入することができ、ここでそれらはゲノム編集のために使用することができる（Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; and Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501）。ＴＡＬＥは、キサントモナス属（Xanthomonas）によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目と１３番目のアミノ酸を除いて、反復している高度に保存された３３～３４アミノ酸配列を含有している。これらの２つの位置は非常に変動し、特定のヌクレオチドの認識と強い相関を示す。したがって、それらは、所望のＤＮＡ配列に結合するように設計されていてもよい（Zhang (2011), Nature Biotech. 29: 149-153）。ＴＡＬＥＮを作製するために、ＴＡＬＥタンパク質を、ヌクレアーゼ（Ｎ）、例えば野生型又は突然変異型のＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合させる。ＴＡＬＥＮにおいてそれを使用するために、ＦｏｋＩに対していくつかの突然変異が行なわれた；これらは、例えば、切断特異性又は活性を向上させる（Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; and Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96）。ＦｏｋＩドメインは、適切な方向及び間隔で、標的ゲノム内の部位に結合する独特なＤＮＡドメインを有する２つの構築物を必要とする、二量体として機能する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数と、２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基の数の両方が、高いレベルの活性を達成するための重要なパラメーターであるようである（Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8）。ＴＡＬＥＮは、細胞内の、標的核酸に、例えば遺伝子内の部位に二本鎖切断を生じるために使用され得る。修復機序が非相同末端結合を介して切断を不適切に修復すると、突然変異が切断部位に導入される場合がある（Huertas, P., Nat. Struct. Mol. Biol. (2010) 17: 11-16）。例えば、不適切な修復は、フレームシフト突然変異を導入する場合がある。あるいは、外来ＤＮＡが、外来ＤＮＡ配列及び染色体配列に応じて、ＴＡＬＥＮと共に細胞内に導入される場合があり；このプロセスを使用して、相同組換え修復経路を介して標的遺伝子を改変することができ、例えば、標的遺伝子内の欠陥を修正し、よって、修復された標的遺伝子の発現を引き起こすことができるか、又は例えば、このような欠陥を野生型遺伝子に導入して、よって標的遺伝子の発現を低減させることができる。

【0032】

いくつかの実施態様では、本発明のＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ＺＦＮである。本明細書において使用する「ＺＦＮ」すなわち「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、標的遺伝子を編集するために使用することのできる人工的ヌクレアーゼであるジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合した、ＤＮＡ改変ドメイン、例えばヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のジンクフィンガーを含む（Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；及びKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160）。ジンクフィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含み得、約３ｂｐの配列を認識することができる。特異性が既知である様々なジンクフィンガーを組み合わせて、多重フィンガーポリペプチドを作製することができ、これは約６、９、１２、１５、又は１８ｂｐの配列を認識する。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッドシステム及びツーハイブリッドシステム、並びに哺乳動物細胞をはじめとする、様々な選択技術及びモジュラーアセンブリ技術を、特定の配列を認識するジンクフィンガー（及びその組合せ）を作製するために利用可能である。ジンクフィンガーは、予め決定された核酸配列に結合するように設計されていてもよい。予め決定された核酸配列に結合するようにジンクフィンガーを操作する基準は、当技術分野において公知である（Sera (2002), Biochemistry, 41:7074-7081; Liu (2008) Bioinformatics, 24:1850-1857）。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン又は他の二量体ヌクレアーゼドメインを使用したＺＦＮは、二量体として機能する。したがって、非回文構造のＤＮＡ部位に標的化するために、一対のＺＦＮが必要とされる。２つの個々のＺＦＮは、ＤＮＡの反対の鎖に結合しなければならず、それらのヌクレアーゼは適切な間隔を空けていなければならない（Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5）。また、ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ内の二本鎖切断を引き起こすことができ、これは不適切に修復された場合、例えば非相同末端結合を介して、フレームシフト突然変異を引き起こす場合があり、これにより、細胞内の標的遺伝子の発現は低減する。

【0033】

いくつかの実施態様では、本発明のＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。本明細書において使用する「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、短い反復塩基配列を含有している原核生物ＤＮＡのセグメントである、関連しているクラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列を指す。細菌ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子、及び接合性プラスミド）に対する、ＲＮＡ誘導型適応免疫系をコードしている。３種類（Ｉ～ＶＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行する可動因子に対して相補的な配列であるスペーサーを含有している。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写及びプロセシングされて、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）となる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９及びＣｐｆ１は、ＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ系に属し、標的ＤＮＡを切断する強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０ヌクレオチドの独特な標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含む成熟ｃｒＲＮＡ（クリスパーＲＮＡ）、及び、リボヌクレアーゼＩＩＩによって補助されるｃｒＲＮＡ前駆体のプロセシングのためのガイドとしての役目を果たすトランス活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によって誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補的配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的塩基対形成を介して、ＤＮＡに標的化するようにＣａｓ９に指令する。Ｃａｓ９は、切断部位（ＰＡＭから３番目又は４番目のヌクレオチド）を特定するために、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサーモチーフ（ＰＡＭ）を認識する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現させても、又は合成ステムループを介して、人工的に融合させたスモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと操作して、天然ｃｒＲＮＡ/ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣してもよい。このようなｓｇＲＮＡ、例えば小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、合成されても、又は直接的なＲＮＡのトランスフェクションのためにインビトロで転写されても、又は、Ｕ６若しくはＨ１により促進されるＲＮＡ発現ベクターから発現させてもよい。

【0034】

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型化膿性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス、Streptococcus pyrogenes）配列と同一なヌクレオチド配列を有していてもよい。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種、例えば他のストレプトコッカス種、例えばサーモフィルス；緑膿菌、大腸菌（Escherichia coli）、又は他のシークエンスされた細菌ゲノム及び古細菌、又は他の原核微生物に由来する配列であってもよい。あるいは、野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスのＣａｓ９配列は改変されていてもよい。核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的な発現のためにコドンが最適化されていてもよく、すなわち「ヒト化」されていてもよい。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１ ＧＬ６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１ ＧＬ６６９１９３７６１；又はＫＭ０９９２３３．１ ＧＬ６６９１９３７６５に列挙されている発現ベクターのいずれかによってコードされているＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であってもよい。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、市販されているベクター、例えばアドジーン社（ケンブリッジ、ＭＡ州）のｐＸ３３０、ｐＸ２６０、又はｐＭＪ９２０内に含まれている配列であってもよい。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１ ＧＬ６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１；ＧＬ６６９１９３７６１；若しくはＫＭ０９９２３３．１ ＧＬ６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列のいずれかの変異体若しくは断片であるアミノ酸配列、又はｐＸ３３０、ｐＸ２６０、若しくはｐＭＪ９２０（アドジーン社、ケンブリッジ、ＭＡ州）のＣａｓ９アミノ酸配列を有していてもよい。

【0035】

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである。本明細書において使用する「Ｃｐｆ１タンパク質」という用語は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系に由来するＣｐｆ１野生型タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質の改変形、Ｃｐｆ１タンパク質の変異体、Ｃｐｆ１のオルソログ、及びその組合せを指す。ｃｐｆ１遺伝子は、Ｃａｓ９のそれぞれのドメインに対して相同であるが、Ｃａｓ９タンパク質に存在しているＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠失している、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有する、Ｃｐｆ１タンパク質をコードしている。Ｖ型系は、パルキュバクテリア（Parcubacteria）細菌ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）、ラクノスピラ（Lachnospiraceae）細菌ＭＣ２０１７（Ｌｂ３ Ｃｐｆ１）、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Butyrivibrio proteoclasticus）（ＢｐＣｐｆ１）、ペレグリニバクテリア（Peregrinibacteria）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）、アシダミノコッカス（Acidaminococcus）属ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）（ＰｍＣｐｆ１）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）（ＰｃＣｐｆ１）、プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）（ＰｄＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Moraxella bovoculi）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、スミセラ（Smithella）属ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）（ＬｉＣｐｆ１）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Franciscella novicida）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノプラスマ・テルミツム（Candidatus methanoplasma termitum）（ＣＭｔＣｐｆ１）、及びユーバクテリウム・エリジェンス（Eubacterium eligens）（ＥｅＣｐｆ１）をはじめとする、いくつかの細菌において同定されている。近年、Ｃｐｆ１はまた、リボヌクレアーゼ活性も有し、かつクリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）前駆体のプロセシングにも関与することが実証された（Fonfara, I., et al., “The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA,” Nature 28; 532(7600):517-21 (2016)）。

【0036】

本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患するリスクがあるか又は疾患に罹患していることが疑われる患者、並びに病気であるか又は疾患若しくは医学的状態を患っていると診断された患者の処置を含む、予防的処置又は防止的処置並びに治癒的処置又は疾患修飾処置の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有するか又は最終的に障害を獲得する可能性がある患者に、障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいはこのような処置を行なわなかった場合に予想される生存期間を超えて患者の生存期間を延長するために投与され得る。「治療レジメン」は病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含み得る。「誘導レジメン」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に高いレベルの薬物を患者に提供することである。誘導レジメンは、医師が維持レジメン中に使用するであろう用量よりも高い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメン中に薬物を投与するであろう頻度よりも高い頻度で薬物を投与すること、又はその両方を含み得る、「負荷レジメン」を（部分的に又は全体的に）使用し得る。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中の患者の維持のために、例えば患者を長い期間にわたり（数か月間又は数年間）寛解状態に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続療法（例えば、薬物を規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などで投与）又は間欠的な療法（例えば断続的な処置、間欠的な処置、再発時の処置、又は特定の予め決定された基準［例えば、疼痛、疾患の徴候など］の達成時の処置）を使用し得る。

【0037】

本明細書において使用する「癌」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有するが、固形腫瘍及び血液由来の腫瘍に限定されない。癌という用語は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液、及び脈管の疾患を含む。「癌」という用語は更に、原発性癌及び転移性癌の両方を包含する。本発明の方法及び組成物によって処置され得る癌の例としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、大腸、食道、消化管、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮の癌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。更に、癌は、特に以下の組織学的型であり得るが、これらに限定されない：悪性腫瘍；癌；未分化癌；巨細胞紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平細胞癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープの腺癌；家族性大腸ポリポーシスの腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；塩基好性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭型及び濾胞型腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳腺ページェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質性腫瘍；悪性莢膜腫；悪性顆粒膜細胞腫；及び悪性セルトリ間質細胞腫瘍；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性悪性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；包巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；悪性奇形種；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経髄腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞性悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉症；他の特定されていない非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；及び有毛細胞白血病。

【0038】

本明細書において使用する「腫瘍組織試料」という用語は、患者に由来する任意の組織腫瘍試料を意味する。該組織試料は、インビトロでの評価の目的のために得られる。いくつかの実施態様では、腫瘍試料は、患者から切除された腫瘍から得られてもよい。いくつかの実施態様では、腫瘍試料は、患者の原発性腫瘍で行なわれた生検から得られても、又は、患者の原発性腫瘍から遠い転移性腫瘍において行なわれた生検から得られてもよい。例えば、結腸直腸癌に罹患した患者の腸で行なわれた内視鏡生検。いくつかの実施態様では、腫瘍組織試料は、（ｉ）全体の原発性腫瘍（まるごと）、（ｉｉ）腫瘍の中心の組織試料、（ｉｉｉ）腫瘍を直接囲んでいる組織の組織試料（この組織は、より具体的には腫瘍の「浸潤マージン」と命名され得る）、（ｉｖ）腫瘍と近接しているリンパ島、（ｖ）腫瘍の最も近くに位置するリンパ節、（ｖｉ）（例えば、処置後の患者の経過観察のために）手術前に収集された腫瘍組織試料、及び（ｖｉｉ）遠隔転移を包含する。本明細書において使用する「浸潤マージン」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍を囲んでいる細胞環境を指す。いくつかの実施態様では、腫瘍組織試料は、それが腫瘍の中心に由来するか、腫瘍の浸潤マージンに由来するか、又は最も近いリンパ節に由来するかに関係なく、１つ又はいくつかの生物学的マーカーの更なる定量のための、特に組織学的方法又は免疫組織化学的方法を通した、フローサイトメトリー法を通した、及び、ゲノム分析及びプロテオミクス分析をはじめとする遺伝子又はタンパク質の発現分析法を通した定量のための、手術による腫瘍切除後又は生検のための組織試料の収集後を含む、腫瘍中心から取り出されたか、又は腫瘍を囲んでいる浸潤マージンから取り出された、組織片又は組織薄片を包含する。腫瘍組織試料を、勿論、様々な周知の収集後の分取技術及び保存技術（例えば、固定、保存、凍結など）にかけることができる。試料は、新鮮であっても、凍結されていても、固定されていても（例えば、ホルマリン固定）、又は包埋されていてもよい（例えばパラフィン包埋）。

【0039】

本明細書において使用する、癌に関する「増強された治療有効性」という表現は、癌細胞又は固形腫瘍の増殖の緩徐化又は縮小、癌細胞の総数又は全腫瘍量の減少を指す。それ故、「改善された治療転帰」又は「増強された治療有効性」は、例えば、減少した腫瘍サイズ、腫瘍進行までの時間の延長、延長された無進行生存期間、延長された全生存期間、延長された寿命、又は生活の質の向上をはじめとする、任意の臨床的に許容される基準に従って、患者の状態の改善があることを意味する。特に、「改善された」又は「増強された」は、治療転帰又は有効性の任意の臨床的に許容される指標の１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、又は１００％を超える改善又は増強を指す。本明細書において使用する、免疫チェックポイント阻害剤をＮＲＰ－１阻害剤と共に含む組合せ組成物の活性及び／又は有効性を、免疫チェックポイント阻害剤のみの活性及び／又は有効性と比較する状況で使用される場合の「と比較して」という表現は、当業者によると同等であることが知られている量を使用した比較を指す。

【0040】

本明細書において使用するように、本明細書において使用する「共投与」という用語は、ＮＲＰ－１阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤の組合せを、同じ患者に投与するプロセスを意味する。ＮＲＰ－１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与されても、実質的に同時に投与されても、又は順次投与されてもよい。投与が順次行なわれる場合、ＮＲＰ－１阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤より前に投与される。ＮＲＰ－１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同じビヒクルを用いて投与される必要はない。ＮＲＰ－１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、１回以上投与されてもよく、組合せの各成分の投与回数は、同じであっても異なっていてもよい。更に、ＮＲＰ－１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される必要はない。

【0041】

使用されているような「組合せ」及び「併用療法」という用語は同義語であり、同時に、別々に、又は順次投与される、少なくとも２つの化合物の投与を含む、処置を指す。本明細書において使用するように、本明細書において使用する「共投与」という用語は、少なくとも２つの化合物の組合せが同じ患者に投与されるプロセスを意味する。少なくとも２つの化合物は、同時に投与されても、実質的に同時に投与されても、又は順次投与されてもよい。少なくとも２つの化合物は、異なるビヒクル又は組成物を用いて、別々に投与されてもよい。少なくとも２つの化合物はまた、同じビヒクル又は組成物（例えば医薬組成物）で投与されてもよい。少なくとも２つの化合物は、１回以上投与されてもよく、組合せの各成分の投与回数は同じであっても異なっていてもよい。

【0042】

本明細書において使用する「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を達成するのに必要とされる用量及び期間において、有効な量を指す。治療有効量の活性物質は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を活性物質が惹起する能力などの、要因に応じて変更され得る。治療有効量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性作用又は有害作用より、治療的に有益な効果の方が上回る量である。活性物質についての有効な用量及び用量レジメンは、処置される予定の疾患又は容態に依存し、これは当業者によって決定され得る。当技術分野における通常の技能を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方し得る。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するに必要とされるよりも低いレベルで、医薬組成物に使用される活性物質の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の用量レジメンに従って治療効果を生じるに有効である最も低い用量である、化合物の量であろう。このような有効な用量は一般的に、上記の要因に依存するだろう。例えば、治療に使用するための治療有効量は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定され得る。典型的には、化合物の癌抑制能は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価され得る。治療有効量の治療用化合物は、患者において腫瘍サイズを低減させ得るか、又はさもなくば症状を寛解し得る。当業者は、患者の体格、患者の症状の重症度、及び選択される具体的な組成物又は投与経路などのこのような要因に基づいて、このような量を決定することができるだろう。本発明の阻害剤の治療有効量の例示的な非制限的な範囲は、約０．１～１００mg/kg、例えば約０．１～５０mg/kg、例えば約０．１～２０mg/kg、例えば約０．１～１０mg/kg、例えば約０．５、例えば約０．３、約１、約３mg/kg、約５mg/kg、又は約８mg/kgである。本発明の阻害剤の治療有効量の例示的な非制限的な範囲は、０．０２～１００mg/kg、例えば約０．０２～３０mg/kg、例えば約０．０５～１０mg/kg、又は０．１～３mg/kg、例えば約０．５～２mg/kgである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であり得、例えば、標的部位の近くに投与され得る。上記の処置法及び使用法における用量レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）を与えるように調整される。例えば、１回のボーラスが投与されても、数回に分割された用量が経時的に投与されても、又は、用量は、治療状況の緊急性によって指示される通りに、比例的に減少若しくは増加させてもよい。いくつかの実施態様では、処置の有効性は、治療中に、例えば所定の時点にモニタリングされる。いくつかの実施態様では、有効性は、疾患領域の可視化によって、又は本明細書に更に記載されている他の診断法によって、例えば、標識された本発明の阻害剤、断片、又は本発明の阻害剤に由来するミニ抗体を使用した、例えば１回以上のＰＥＴ－ＣＴ（陽電子放射断層撮影・コンピューター断層撮影）走査を実施することによって、モニタリングされてもよい。所望であれば、医薬組成物の有効な１日量が、１日を通して適切な間隔で、場合により単位用量剤形で、２回、３回、４回、５回、６回、又はそれ以上の分割用量として投与されてもよい。いくつかの実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、長い期間にわたる、例えば２４時間以上にわたる、緩徐な連続注入によって投与されることにより、あらゆる望ましくない副作用を最小限とする。本発明の阻害剤の有効用量はまた、週１回、２週間に１回、又は３週間に１回の投薬期間を使用して投与されてもよい。投薬期間は、例えば８週間、１２週間、又は臨床的進展が確立されるまでに限定され得る。非制限的な例として、本発明による処置は、本発明の阻害剤の１日量として、約０．１～１００mg/kgの量で、例えば、１日あたり０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００mg/kgの量で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日目の少なくとも１日に、又は代替的には、処置開始後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０週目の中の少なくとも１週に、又はその任意の組合せに、２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎に１回量若しくは分割用量を、又はその任意の組合せを使用して、提供され得る。

【0043】

本明細書において使用する「癌ワクチン」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、少なくとも１つの癌抗原に対する能動免疫を誘導することのできる組成物を指す。癌ワクチンにより、抗体が産生され得るか、又は単に特定の細胞、特に抗原提示細胞、Ｔリンパ球（特にＣＤ８陽性Ｔ細胞）及びＢリンパ球が活性化され得る。癌ワクチンは、予防目的又は治療目的又はその両方のための組成物であり得る。

【0044】

本明細書において使用する「抗原」という用語は、処理されＭＨＣ分子によって提示されると、抗体と、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、特異的に結合することのできる分子を指す。本明細書において使用する「抗原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原は更に、免疫系によって認識されることができるか、並びに／あるいは、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、これにより、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球は活性化される。抗原は、１つ以上のエピトープ又は抗原性部位（Ｂエピトープ及びＴエピトープ）を有していてもよい。本明細書において使用する「癌抗原」という用語は、腫瘍組織に特徴的である抗原を指す。癌抗原の例としては、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ－２/ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１～４、６及び１２、ＭＵＣ関連タンパク質（ムチン）（ＭＵＣ－１、ＭＵＣ－２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＣＯ－ＭＡＲＴ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ、Ｐｍｅｌ １７（ｇｐｌ００）、ＧｎＴ－ＶイントロンＶ配列（Ｎ－アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β－カテニン、ＭＵＭ－１－Ｂ（黒色腫の遍在性突然変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２～１０、Ｃ－ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２/ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプシュタインバーウイルス核抗原）１～６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ－２、並びにＫｉ－６７が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、該抗原は、白血病及びリンパ腫、神経学的腫瘍、例えば星状細胞腫又は神経膠芽腫、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、消化管腫瘍、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、泌尿生殖器腫瘍、例えば子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、又は陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、又は、口唇癌、鼻咽頭癌、咽頭癌及び口腔癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、胆道系癌、喉頭癌、肺癌及び気管支癌、膀胱癌、腎臓癌、脳癌、及び神経系の他の部分の癌、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及び白血病に由来する抗原を含んでいる、腫瘍関連抗原から選択される。

【0045】

本明細書において使用する「免疫アジュバント」とう用語は、被験者又は動物に投与されると、抗原に対する免疫応答を誘導及び／又は増強することのできる化合物を指す。それはまた、特定の抗原に対する特定の免疫応答の質を加速、延長、又は増強するように一般的に作用する、物質を意味するものである。

【0046】

本明細書において使用する本開示の文脈における「応答者」という用語は、応答を達成するであろう患者、すなわち、癌が根治、退縮、又は改善される患者を指す。本発明によると、「非応答者」という用語はまた、安定化した癌を有する患者も含む。

【0047】

腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の量を増加させる方法：
本発明の第一の目的は、治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、癌を患っている患者における腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の量を増加させる方法に関する。

【0048】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、ＮＲＰ－１に対する結合親和性を有する抗体である。

【0049】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、ＮＲＰ－１の細胞外ドメインに対する抗体である。

【0050】

いくつかの実施態様では、前記抗体により、細胞障害性Ｔ細胞にＮＲＲＰ－１が内部移行する。

【0051】

いくつかの実施態様では、前記抗体は、ＮＲＰ－１のドメインｃに結合する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、セマフォリン３Ａに対するＮＲＰ－１の結合を阻害することができる。

【0052】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、セマフォリン３Ａに結合するＮＲＰ－１の領域に対する結合親和性を有する抗体である。

【0053】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、配列番号１の１位のアミノ酸残基から２８０位のアミノ酸残基までの範囲のアミノ酸配列に対する結合親和性を有する抗体である。

【0054】

いくつかの実施態様では、前記抗体は、ＮＲＰ－１に対するＶＥＧＦの結合を阻害しない。

【0055】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、セマフォリン３Ａに対する結合親和性を有する抗体である。

【0056】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、ＮＲＰ－１に結合するセマフォリン３Ａのドメインに対する結合親和性を有する抗体である。

【0057】

いくつかの実施態様では、前記抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化法としては、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第５，８５９，２０５号に記載されている方法が挙げられるがこれらに限定されず、これらは参照によりここに援用される。

【0058】

いくつかの実施態様では、前記抗体は完全ヒト抗体である。完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子座の大部分について遺伝子組換えされたマウスを免疫化することによって調製され得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号、及びその中に引用されている参考文献を参照されたい（これらの内容は参照により本明細書に援用される）。

【0059】

いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、一本鎖抗体である。

【0060】

いくつかの実施態様では、前記抗体は、Mol. Biol. (2007) 366, 815-829及び米国特許出願第８３７８０８０Ｂ１号に記載の抗ＮＲＰ１抗体ＹＷ６４．３から誘導される。特に、本発明に記載の抗ＮＲＰ－１抗体は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む。

【0061】

いくつかの実施態様では、抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。

【0062】

【化3】

【0063】

いくつかの実施態様では、本発明の抗ＮＲＰ－１抗体は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む抗体と、ＮＲＰ－１アイソフォームに対する結合に関して交差競合する。

【0064】

いくつかの実施態様では、前記抗体は、ヒト重鎖定常領域配列を含むが、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を誘導しないだろう。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することのできるＦｃドメインを含まない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを欠失している（例えばＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを欠失している）か、又は、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ディアボディ、一本鎖抗体断片、又は複数の異なる抗体断片を含んでいる多重特異的抗体からなるか又は含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、毒性部分に連結されていない。いくつかの実施態様では、該抗体が、Ｃ２ｑへの結合の変化、及び／又は低減若しくは消失した補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を示すように、アミノ酸残基から選択された１つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換してもよい。このアプローチは、dusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号に更に詳述されている。

【0065】

いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１阻害剤は、それぞれＮＲＦＰ－１の機能的等価体を含んでいるポリペプチドである。例えば、機能的等価体は、セマフォリン３Ａに結合し、かつＮＲＰ－１の細胞外ドメインの全部又は一部を含むことにより、セマフォリン３Ａを捕捉することができる可溶性受容体を形成する、分子を含む。典型的には、機能的等価体は、対応するタンパク質に対して少なくとも８０％相同である。

【0066】

いくつかの実施態様では、機能的等価体は、任意の慣用的な分析アルゴリズムによって評価したところ、少なくとも９０％相同である。したがって、本発明は、セマフォリン３Ａに対するＮＲＰ－１の結合を阻害することのできるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、ＮＲＰ－１の細胞外ドメインの少なくとも一部（この部分はセマフォリン３Ａに結合する）の配列に相当する配列を有する連続的アミノ酸を含む。

【0067】

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、ＮＲＰ－１の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様では、該ポリペプチドは、ＮＲＰ－１のドメインｃを含むアミノ酸配列を含む。

【0068】

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、ＮＲＰ－１の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列を含む。

【0069】

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、配列番号１の１位のアミノ酸残基から２８０位のアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列を含む。

【0070】

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合する部分は含まない。

【0071】

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、ＮＲＰ－１の機能的等価体を含み、これは免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）と融合することによりイムノアドヘシンを形成する。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の価値ある化学的及び生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジドメイン及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された、所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築されることができるので、目的の結合特異性は、完全なヒト成分を使用して達成され得る。免疫グロブリン配列は、典型的にであって必ずしもではないが、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができるが、典型的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得ることができる。いくつかの実施態様では、イムノアドヘシンのＰＤ－１又はＮＲＰ－１の機能的等価体と免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーによって連結されている。

【0072】

いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１阻害剤は、ＮＲＰ－１発現阻害剤である。

【0073】

いくつかの実施態様では、前記の遺伝子発現阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はリボザイムである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む）は、ＮＲＰ－１ｍＲＮＡに結合し、よって、タンパク質の翻訳を妨げるか、又はｍＲＮＡの分解を増加させ、よって細胞内のＮＲＰ－１のレベルを減少させ、よって活性を減少させることによって、ＮＲＰ－１ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用するだろう。例えば、少なくとも約１５塩基であり、ＮＲＰ－１をコードしているｍＲＮＡ転写物配列の特有の領域に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、慣用的なホスホジエステル技術によって合成することができる。その配列が既知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号参照）。低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明に使用するための発現阻害剤としても機能し得る。ＮＲＰ－１の遺伝子発現は、患者又は細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させ、これによりＮＲＰ－１の遺伝子発現は特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉ）ことによって、低減させることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びリボザイムは、インビボで単独で送達されても、又はベクターと併用して送達されてもよい。その最も広義な意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸の、細胞への、典型的にはＮＲＰ－１を発現している細胞への導入を促進することのできる、任意のビヒクルである。典型的には、該ベクターは、ベクターの非存在下において生じるであろう分解の程度と比較して、低減した分解度で、核酸を細胞に輸送する。一般的には、本発明において有用なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドの挿入若しくは組込みによって操作されたウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクル、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスベクターが、好ましい種類のベクターであり、これは以下のウイルスに由来する核酸配列を含むがこれらに限定されない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプシュタインバーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターも容易に使用することができる。

【0074】

いくつかの実施態様では、発現阻害剤はエンドヌクレアーゼである。

【0075】

特定の実施態様では、前記エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓである。

【0076】

いくつかの実施態様では、前記エンドヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）に由来する、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系は、米国特許出願第８６９７３５９Ｂ１号及び米国特許出願第２０１４／００６８７９７号に記載されている。いくつかの実施態様では、該エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１であり、これは、Zetsche et al.（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13）においてつい最近特徴付けられたプレボテラ及びフランシセラに由来するＣＲＩＳＰＲ１（Ｃｐｆ１）である。

【0077】

治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法：
本発明の更なる目的は、薬学的有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関する。

【0078】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、Mol. Biol. (2007) 366, 815-829及び米国特許出願第８３７８０８０Ｂ１号に記載の抗ＮＲＰ１抗体ＹＷ６４．３に由来する、抗ＮＲＰ－１抗体である。特に、該抗ＮＲＰ－１抗体は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む。

【0079】

いくつかの実施態様では、前記抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、該抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、該抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。

【0080】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む抗体と、ＮＲＰ－１アイソフォームに対する結合に関して交差競合する、抗ＮＲＰ－１抗体である。

【0081】

特に、本発明の方法は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の低度の腫瘍浸潤によって特徴付けられる癌の処置に特に適している。典型的には、前記のＣＤ８陽性Ｔ細胞の腫瘍浸潤は、当技術分野における任意の慣用的な方法によって決定される。例えば、前記の決定は、患者から得られた腫瘍試料中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を定量することを含む。

【0082】

いくつかの実施態様では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度の定量は、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によって決定される。例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度の定量は、腫瘍組織試料を、該細胞の細胞表面マーカーに特異的な結合対（例えば抗体）と接触させることによって行なわれる。典型的には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度の定量は、腫瘍組織試料を、ＣＤ８に特異的な結合対（例えば抗体）と接触させることによって行なわれる。典型的には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度は、組織試料の表面積１単位あたりに計数される、これらの細胞の数として、例えば、腫瘍組織試料の表面積１cm^２又は１mm^２あたりに計数される細胞数として表現される。いくつかの実施態様では、細胞密度はまた、試料１容量単位あたりの細胞数として、例えば、腫瘍組織試料１cm^３あたりの細胞数として表現されてもよい。いくつかの実施態様では、細胞密度はまた、全細胞（１００％と設定）あたりの特定の細胞の比率からなり得る。免疫組織化学的検査は典型的には、以下の工程：ｉ）腫瘍組織試料をホルマリンで固定すること、ｉｉ）該腫瘍組織試料をパラフィンに包埋すること、ｉｉｉ）該腫瘍組織試料を染色のために切片に切断すること、ｉｖ）該切片を、マーカーに特異的な結合対と共にインキュベートすること、ｖ）該切片を濯ぐこと、ｖｉ）該切片を、典型的にはビオチニル化されている二次抗体と共にインキュベートすること、及びｖｉｉ）抗原－抗体複合体を典型的にはアビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体を用いて顕現させること、を含む。したがって、腫瘍組織試料をまず、結合対と共にインキュベートする。洗浄後、目的のマーカーに結合した標識された抗体を、標識された抗体によって生じる標識の種類（例えば放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識）に応じて、適切な技術によって顕現させる。あるいは、本発明の方法は、増幅系（染色シグナルを強化するための）と酵素分子とに結合させた、二次抗体を使用してもよい。このような結合した二次抗体は、例えばダコ社、EnVisionシステムから市販されている。対比染色、例えばヘマトキシリン及びエオシン、ＤＡＰＩ、ヘキストなどを使用してもよい。他の染色法も、自動化、半自動化、又は手動のシステムをはじめとする、当業者には明らかであろうような、任意の適切な方法又はシステムを使用して成し遂げられ得る。例えば、１つ以上の標識を、抗体に付着させることができ、これにより、標的タンパク質（すなわちマーカー）の検出が可能となる。例示的な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、リガンド、化学発光剤、酵素、及びその組合せが挙げられる。いくつかの実施態様では、標識は、量子ドットである。一次及び／又は二次アフィニティリガンドにコンジュゲートさせることのできる標識の非限定的な例としては、蛍光色素又は金属（例えばフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団色素（例えばロドプシン）、化学発光化合物（例えばルミナール、イミダゾール）及び生物発光タンパク質（例えばルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えばビオチン）が挙げられる。多種多様な他の有用な蛍光剤及び発色団が、Stryer L (1968) Science 162:526-533及びBrand L and Gohlke J R (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。アフィニティリガンドもまた、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、又は^１２５Ｉ）及び粒子（例えば金）を用いて標識することができる。様々な種類の標識を、様々な化学反応、例えばアミン反応又はチオール反応を使用して、アフィニティリガンドにコンジュゲートさせることができる。しかしながら、アミン及びチオール以外の他の反応性基、例えば、アルデヒド、カルボン酸、及びグルタミンも使用することができる。目的のタンパク質を検出するための、様々な酵素染色法が、当技術分野において公知である。例えば、酵素相互作用を、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又は異なる色素原、例えばジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、又はファーストレッドを使用して可視化することができる。他の例では、抗体をペプチド又はタンパク質にコンジュゲートさせることができ、これを標識された結合対又は抗体を介して検出することができる。間接的免疫組織化学的アッセイでは、第一の結合対の結合を検出するのに、それは標識されていないので、二次抗体又は二次結合対が必要である。結果として得られた染色された標本を各々、検出可能なシグナルを見て、染色デジタル画像などの画像を取得するためのシステムを使用して、イメージングする。画像取得のための方法は、当業者には周知である。例えば、一旦試料が染色されると、任意の光学的又は非光学的イメージング装置、例えば直立又は倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型又はトンネル型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及び赤外線画像検出器を使用して、染色又はバイオマーカー標識を検出することができる。いくつかの例では、画像はデジタルで取得することができる。その後、得られた画像は、試料中のマーカーの量を定量的に又は半定量的に決定するために使用することができる。免疫組織化学的検査に使用するのに適した、様々な自動化試料処理、走査、及び分析システムが、当技術分野において利用可能である。このようなシステムは、自動化染色及び顕微鏡走査、コンピューター計算された画像分析、連続切片の比較（試料の方向及びサイズの変動について、制御するために）、デジタルレポートの作成、並びに試料のアーカイビング及び追跡（組織切片が上に置かれているスライドなど）を含み得る。従来の光学顕微鏡をデジタル画像処理システムと組み合わせて、免疫染色された試料をはじめとする細胞及び組織上での定量分析を行なう、細胞イメージングシステムは市販されている。例えば、ＣＡＳ－２００システム（ベクトン・ディッキンソン社）を参照。特に、検出は、手作業で行なわれても、又は、コンピュータープロセッサ及びソフトウェアを含む画像処理技術によって行なわれてもよい。例えば、このようなソフトウェアを使用して、画像を、当業者には公知の手順（例えば、公開されている米国特許公開公報第２０１００１３６５４９号参照）を使用して、構成し、校正し、正規化し、及び／又は、例えば染色の質若しくは染色の強度を含む要因に基づいて検証し得る。画像を、定量的に又は半定量的に分析することができ、試料の染色強度に基づいてスコア化することができる。定量的又は半定量的組織化学検査法は、組織化学検査を受けた試料を走査及びスコア化して、特定のバイオマーカー（すなわちマーカー）の存在を同定及び定量する方法を指す。定量的又は半定量的方法は、染色密度若しくは染色の量を検出するためのイメージングソフトウェア、又はヒト裸眼によって染色を検出する方法（ここでは訓練された操作者が結果を数値で順位付けする）を使用し得る。例えば、画像を、ピクセルカウントアルゴリズム（例えば、Aperioスペクトルソフトウェア、自動定量分析プラットフォーム（AQUA（登録商標）プラットフォーム）、及び染色度を測定又は定量又は半定量する他の標準的な方法を使用して、定量分析することができる；例えば、米国特許第８，０２３，７１４号；米国特許第７，２５７，２６８号；米国特許第７，２１９，０１６号；米国特許第７，６４６，９０５号；公開されている米国特許公開公報第２０１００１３６５４９号及び第２０１１０１１１４３５号；Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327; Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328を参照されたい。全染色領域の合計に対する強力な陽性の染色（例えば茶色の染色）の比を計算し、スコア化することができる。検出されたバイオマーカー（すなわちマーカー）の量を定量し、陽性ピクセル及び／又はスコアの比率として示す。例えば、量は、陽性ピクセルの比率として定量してもよい。いくつかの例では、量は、染色された面積の比率、例えば、陽性ピクセルの比率として定量される。例えば、試料は、全染色面積と比較して、少なくとも、又はおよそ少なくとも、又はおよそ０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上の陽性ピクセルを有し得る。いくつかの実施態様では、試料の組織化学的染色の強度又は量の数値による表示であり、そして試料中に存在する標的バイオマーカー（例えばマーカー）の量を示す、スコアが試料に付けられる。吸光度又は面積率の数値に、例えば整数の尺度の、換算されたスコアが与えられ得る。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｉ）マーカーと選択的に相互作用することのできる結合対（例えば上記のような抗体）を使用することによって、自動スライド染色システムによって得られた１つ以上の免疫染色された組織切片の薄片を準備すること、ｉｉ）高解像度スキャンキャプチャーによって工程ａ．のスライドのデジタル化を進めること、ｉｉｉ）デジタル写真上で組織切片の薄片を検出すること、ｉｖ）同じ表面積を有する均一に分布した単位を有する、サイズ参照グリッドを準備すること（該グリッドは、分析しようとする組織切片のサイズに合わせている）、及びｖ）各単位内の染色された細胞の強度を検出、定量、及び測定すること（これにより、各単位の染色された細胞の数又は密度が評価される）からなる工程を含む。

【0083】

いくつかの実施態様では、全腫瘍組織試料中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞密度が決定されるか、腫瘍組織試料の浸潤マージン若しくは中心におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞密度が決定されるか、又は、腫瘍組織試料の中心及び浸潤マージンの両方におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞密度が決定される。

【0084】

したがって、本発明の更なる目的は、ｉ）患者から得られた腫瘍組織試料中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を定量すること、ｉｉ）工程ｉ）で定量された密度を、所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関する。

【0085】

典型的には、所定の基準値は、患者の生存期間と相関する。当業者は、全生存期間が一般的に、特定の期間の間、特定の種類の癌を生き延びた人々の比率に基づき、かつ該比率として表現されることを認識しているだろう。癌の統計は、５年全生存率を使用することが多い。一般的には、全生存率は、癌生存者が５年目に依然として処置を受けているか、又は癌がなくなっているか（寛解を達成したか）は明記しない。無病生存率（ＤＦＳ）は、より具体的な情報を与え、寛解を達成した特定の癌を有する人々の数である。また、無進行生存（ＰＦＳ）率（依然として癌を有しているが、それらの疾患は進行していない人々の数）は、処置を用いて幾分かの成功を収めた可能性があるが、癌は完全には消失していない人々を含む。本明細書において使用する「短い生存期間」という表現は、患者が、前記の癌を患っている患者の一般集団において観察される中央値（又は平均値）よりも短いであろう生存期間を有するであろうことを示す。患者が短い生存期間を有するであろう場合、患者は「悪い予後」を有するであろうことを意味する。逆に、「長い生存期間」という表現は、患者が、前記の癌を患っている患者の一般集団において観察される中央値（又は平均値）よりも長いであろう生存期間を有するであろうことを示す。患者が長い生存期間を有するであろう場合、患者は「良好な予後」を有するであろうことを意味する。

【0086】

いくつかの実施態様では、所定の数値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に、又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者によって認識されているであろうように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて自由に選択されてもよい。例えば、適切に寄託された歴史的患者試料の細胞密度の遡及的測定を、所定の基準値の確立に使用してもよい。試験の関数及びベネフィット／リスクのバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って、最適な感度及び特異度が得られるように、閾値は決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（及びまた閾値）は、実験データに基づいた受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic）（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、リファレンス群におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を定量した後、試験される予定の試料において測定された密度の統計学的処理のためのアルゴリズム分析を使用し、これにより、試料の分類について有意性を有する分類標準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名は、受信者動作特性（receiver operator characteristic）曲線であり、これは、受信者操作特性（receiver operation characteristic）曲線としても知られている。それは主に、生化学的臨床診断試験のために使用される。ＲＯＣ曲線は、真の陽性率（感度）及び偽の陽性率（１－特異度）の連続変数を反映する総合的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法を用いて感度と特異度の間の関係を明らかとする。一連の様々なカットオフ値（閾値又は臨界値、すなわち、診断試験の正常な結果と異常な結果との間の境界値）が、一連の感度及び特異度の数値を計算するための連続変数として設定される。次いで、曲線を描くために、感度は縦軸座標として使用され、特異度は横軸座標として使用される。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きくなればなるほど、診断の正確度は高くなる。ＲＯＣ曲線上で、座標図の左端上に最も近い点は、高い感度と高い特異度の数値の両方を有する、臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０～０．５である。ＡＵＣ＞０．５の場合、診断結果は、ＡＵＣが１に近づくにつれてより良好となる。ＡＵＣが０．５～０．７の場合、正確度は低い。ＡＵＣが０．７～０．９の場合、正確度は中等度である。ＡＵＣが０．９より高い場合、正確度は極めて高い。このアルゴリズム法は、好ましくはコンピューターを用いて実施される。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描写のために使用し得る：例えば、ＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医学統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ－ＲＯＣ．ＡＳ、ＧＢ ＳＴＡＴ ＶＩ０．０（ダイナミック・マイクロシステムズ社、シルバースプリング、メリーランド州、米国）など。

【0087】

いくつかの実施態様では、所定の基準値は、ａ）目的の癌を患っている患者から腫瘍組織試料の収集物を準備する工程；ｂ）工程ａ）で準備された各腫瘍組織試料について、対応する患者についての実際の臨床転帰に関する情報（すなわち、無病生存期間（ＤＦＳ）及び／又は全生存期間（ＯＳ））を提供する工程；ｃ）一連の任意の定量値を提供する工程；ｄ）工程ａ）で準備された収集物に含有されている各腫瘍組織試料について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を定量する工程；ｅ）工程ｃ）で提供された１つの具体的な任意の定量値で、該腫瘍組織試料を、それぞれ２つの群に分類する工程；（ｉ）第一の群は、前記の一連の定量値に含まれる前記の任意の定量値よりも低いレベルの定量値を示す、腫瘍組織試料を含んでいる；（ｉｉ）第二の群は、前記の一連の定量値に含まれる前記の任意の定量値よりも高いレベルの定量値を示す、腫瘍組織試料を含んでいる；それによって、前記の具体的な定量値に関して、２つの群の腫瘍組織試料が得られ、ここでの各群の腫瘍組織試料は、別々に数えられる；ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と、（ｉｉ）工程ｆ）で提供された第一の群及び第二の群に含まれる腫瘍組織試料の由来する患者の実際の臨床転帰との間の、統計学的有意性を計算する工程；ｇ）工程ｄ）で提供されたあらゆる任意の定量値が試験されるまで、工程ｆ）及びｇ）を反復する工程；ｈ）前記の所定の基準値を、任意の定量値（最も高い統計学的有意性（最も有意）は工程ｇ）で計算されている）からなるとして設定する工程を含む、方法を実施することによって決定される。例えば、１００人の患者の１００個の腫瘍組織試料について、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度が評価された。１００個の試料は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度に従って順位付けされる。試料１は最も高い密度を有し、試料１００は最も低い密度を有する。最初のグループ分けは２つの部分集合を与える：片方の側には試料番号１、他方の側には９９個の他の試料。次のグループ分けは片方の側に試料１及び２、他方の側に９８個の残りの試料を与えるなど、最後のグループ分けまで続く：片方の側には試料１～９９、他方の側では試料番号１００である。対応する癌患者についての実際の臨床転帰に関する情報に従って、２つの部分集合の９９個のグループのそれぞれについてカプランマイヤー曲線を作成する。また、９９個のグループのそれぞれについて、両方の部分集合間のｐ値を計算した。最小ｐ値の基準に基づいた識別が最強となるように所定の基準値を選択する。換言すれば、ｐ値が最小である両方の部分集合間の境界に対応するＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を、所定の基準値と考える。所定の基準値は、細胞密度の中央値では必ずしもないことを留意すべきである。したがって、いくつかの実施態様では、所定の基準値はこのように、患者についての無病生存期間と全生存期間に関して、悪い予後と良い予後との識別を可能とする。実際に、たった１つの任意の定量値についてだけでなく、一連の連続的な任意の定量値について、高い統計学的有意性の数値（例えば低いＰ値）が一般的に得られる。したがって、本発明の１つの代替的な実施態様において、確定した所定の基準値を使用する代わりに、一連の数値が提供される。それ故、最小の統計学的に有意な数値（有意な最小の閾値、例えばＰ値の最大閾値）が任意に設定され、工程ｇ）で計算された統計学的に有意な数値がより高い（より有意、例えばより低いＰ値）、一連の複数の任意の定量値が保持され、よって一連の定量値が提供される。この定量値の範囲は、上記のような「カットオフ」値を含む。例えば、「カットオフ」値のこの特定の実施態様によると、転帰は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の密度を、同定された数値の範囲と比較することによって決定され得る。いくつかの実施態様では、カットオフ値はこのように、例えば、最も高い統計学的に有意な数値が見られる（例えば、一般的に最小ｐ値が見られる）定量値に中心が置かれている、一連の定量値からなる。

【0088】

処置レジメンの一部として患者に投与された、免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強させるための方法：
本発明の更なる目的は、処置レジメンの一部として患者に投与された、免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強させるための方法に関し、該方法は、薬学的に有効な量のＮＲＰ－１阻害剤を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む。

【0089】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、Mol. Biol. (2007) 366, 815-829及び米国特許出願第８３７８０８０Ｂ１号に記載の抗ＮＲＰ１抗体ＹＷ６４．３に由来する抗ＮＲＰ－１抗体である。特に、該抗ＮＲＰ－１抗体は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む。

【0090】

いくつかの実施態様では、前記抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、該抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、該抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。

【0091】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む抗体と、ＮＲＰ－１アイソフォームに対する結合に関して交差競合する、抗ＮＲＰ－１抗体である。

【0092】

いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択された抗体である。

【0093】

抗ＣＴＬＡ－４抗体の例は、米国特許第５，８１１，０９７号；第５，８１１，０９７号；第５，８５５，８８７号；第６，０５１，２２７号；第６，２０７,１５７号；第６，６８２，７３６号；第６，９８４，７２０号；及び第７，６０５，２３８号に記載されている。１つの抗ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６）である。いくつかの実施態様では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－Ｄ０１０としても知られる）であり、これはＣＴＬＡ－４に結合する完全ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体である。

【0094】

他の免疫チェックポイント阻害剤としては、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）阻害剤、例えばＩＭＰ３２１、可溶性免疫グロブリン融合タンパク質（Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211）が挙げられる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、Ｂ７阻害剤、例えばＢ７－Ｈ３阻害剤及びＢ７－Ｈ４阻害剤が挙げられる。特に、抗Ｂ７－Ｈ３抗体であるＭＧＡ２７１（Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834）。ＴＩＭ（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）阻害剤も含まれる（Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86 and Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94）。本明細書において使用する「ＴＩＭ－３」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３を指す。ＴＩＭ－３の天然リガンドはガレクチン９（Ｇａｌ９）である。したがって、本明細書において使用する「ＴＩＭ－３阻害剤」という用語は、ＴＩＭ－３の機能を阻害することのできる化合物、物質、又は組成物を指す。例えば、該阻害剤は、ＴＩＭ－３の発現若しくは活性を阻害することができ、ＴＩＭ－３のシグナル伝達経路を調節若しくは遮断することができ、及び／又は、ガレクチン－９に対するＴＩＭ－３の結合を遮断することができる。ＴＩＭ－３に対する特異性を有する抗体は当技術分野において周知であり、典型的には、国際公開公報第２０１１１５５６０７号、第２０１３００６４９０号及び第２０１０１１７０５７号に記載の抗体である。

【0095】

いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＩＤＯ（インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ）阻害剤である。ＩＤＯ阻害剤の例は、国際公開公報第２０１４１５０６７７号に記載されている。ＩＤＯ阻害剤の例としては、１－メチル－トリプトファン（ＩＭＴ）、β－（３－ベンゾフラニル）－アラニン、β－（３－ベンゾ（ｂ）チエニル）－アラニン）、６－ニトロ－トリプトファン、６－フルオロ－トリプトファン、４－メチル－トリプトファン、５－メチルトリプトファン、６－メチル－トリプトファン、５－メトキシ－トリプトファン、５－ヒドロキシ－トリプトファン、インドール３－カルビノール、３，３’－ジインドリルメタン、没食子酸エピガロカテキン、５－ブロモ－４－クロロ－インドキシル１，３－ジアセタート、９－ビニルカルバゾール、アセメタシン、５－ブロモ－トリプトファン、５－ブロモインドキシルジアセタート、３－アミノ－ナフトエ酸、ピロリジンジチオカルバメート、４－フェニルイミダゾール、ブラシニン誘導体、チオヒダントイン誘導体、β－カルボリン誘導体又はブラシレキシン誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ＩＤＯ阻害剤は、１－メチル－トリプトファン、β－（３－ベンゾフラニル）－アラニン、６－ニトロ－Ｌ－トリプトファン、３－アミノ－ナフトエ酸、及びβ－［３－ベンゾ（ｂ）チエニル］－アラニン、又はその誘導体若しくはプロドラッグから選択される。

【0096】

いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。したがって、本明細書において使用する「ＰＤ－１阻害剤」という用語は、ＰＤ－１の機能を阻害することができる化合物、物質、又は組成物を指す。例えば、該阻害剤は、ＰＤ－１の発現若しくは活性を阻害することができ、ＰＤ－１のシグナル伝達経路を調節若しくは遮断することができ、及び／又は、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に対するＰＤ－１の結合を遮断することができる。

【0097】

いくつかの実施態様では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１の細胞外ドメインに対する抗体である。いくつかの実施態様では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインに対する抗体である。ＰＤ－１抗体及びＰＤ－Ｌ１抗体の例は、米国特許第７，４８８，８０２号；第７，９４３，７４３号；第８，００８，４４９号；第８，１６８，７５７号；第８，２１７,１４９号、及びＰＣＴ公開特許出願番号：国際公開公報第０３０４２４０２号、国際公開公報第２００８１５６７１２号、国際公開公報第２０１００８９４１１号、国際公開公報第２０１００３６９５９号、国際公開公報第２０１１０６６３４２号、国際公開公報第２０１１１５９８７７号、国際公開公報第２０１１０８２４００号、及び国際公開公報第２０１１１６１６９９号に記載されている。いくつかの実施態様では、ＰＤ－１遮断剤としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられる。いくつかの実施態様では、ＰＤ－１遮断剤としては、抗ＰＤ－１抗体及び類似した結合タンパク質、例えばニボルマブ（ＭＤＸ１１０６、ＢＭＳ９３６５５８、ＯＮＯ４５３８）、ＰＤ－１に結合し、その活性化を、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２によって遮断する、完全ヒトＩｇＧ４抗体；ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５又はＳＣＨ９００４７５）、ＰＤ－１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体；ＰＤ－１に結合するＣＴ－０１１ヒト化抗体；ＡＭＰ－２２４はＢ７－ＤＣの融合タンパク質である；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）の遮断のためのＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５－０１）が挙げられる。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、国際公開公報第２０１６０２０８５６号及びFenwick, Craig, et al. 「Tumor suppression of novel anti-PD-1 antibodies mediated through CD28 costimulatory pathway.」 Journal of Experimental Medicine (2019): jem-20182359に開示されているような抗ＰＤ１抗体Ｇｅｐｉ１３５ｃである。

【0098】

いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブのＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１１のＶＨドメイン及び配列番号１２のＶＬドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１３の重鎖及び／又は配列番号１４の軽鎖を含む。

【0099】

【化4】

【0100】

いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブのＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１５のＶＨドメイン及び配列番号１６のＶＬドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１７の重鎖及び／又は配列番号１８の軽鎖を含む。

【0101】

【化5】

【0102】

いくつかの実施態様では、ＰＤ－１阻害剤は、低分子又はペプチド又はペプチド誘導体、例えば米国特許第８，９０７，０５３号；第９，０９６，６４２号；及び第９，０４４，４４２号、及び米国特許出願公開公報第２０１５／００８７５８１号に記載のもの；１，２，４オキサジアゾール化合物及び誘導体、例えば米国特許出願公開公報第２０１５／００７３０２４号に記載のもの；環式ペプチド模倣化合物及び誘導体、例えば米国特許出願公開公報第２０１５／００７３０４２号に記載のもの；環式化合物及び誘導体、例えば米国特許出願公開公報第２０１５／０１２５４９１号に記載のもの；１，３，４オキサジアゾール及び１，３，４チアジアゾール化合物及び誘導体、例えば国際特許出願公開公報の国際公開公報第２０１５／０３３３０１号に記載のもの；ペプチド系化合物及び誘導体、例えば国際特許出願公開公報の国際公開公報第２０１５／０３６９２７号及び国際公開公報第２０１５／０４４９０号に記載のもの；又は大環状ペプチド系化合物及び誘導体、例えば米国特許出願公開公報第２０１４／０２９４８９８号に記載のものであり；これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0103】

ＮＲＰ－１阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤の治療に有効な組合せを患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法：
本発明の更なる目的は、ＮＲＰ－１阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤の治療に有効な組合せを患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関し、ここで、組合せの投与により、免疫チェックポイント阻害剤単独の投与と比べて増強した治療有効性が得られる。

【0104】

免疫チェックポイント分子に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位と、ＮＲＰ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む、多重特異的抗体：
本発明の更なる目的は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位と、ＮＲＰ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む、多重特異的抗体に関する。

【0105】

多重特異的抗体は典型的には、国際公開公報第２０１１１５９８７７号に記載されている。本発明によると、本発明の多重特異的抗体は、免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ－１）の細胞外ドメイン及びＮＲＰ－１の細胞外ドメインに結合する。本発明の多重特異的抗体分子のための例示的な型式としては、（ｉ）化学的ヘテロコンジュゲーションによって架橋された２つの抗体、一方はＰＤ－１に対する特異性を有し、他方はＮＲＰ－１に対する特異性を有する；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域、例えば、エキストラペプチドリンカーによって直列に連結された２つのｓｃＦｖを含む、一本鎖抗体；（ｉｖ）デュアル可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ここでの各々の軽鎖及び重鎖は、短いペプチド結合を通して直列に２つの可変ドメインを含有している（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig^TM) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（ｖ）化学的に連結された二重特異的（Ｆａｂ’）２断片；（ｖｉ）２つの一本鎖ディアボディの融合により、各標的抗原に対する２つの結合部位を有する四価の二重特異的抗体を生じる、Ｔａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）ｓｃＦｖとディアボディの組合せにより、多価分子を生じる、フレキシボディ（flexibody）；（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼＡの「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドック及びロック」分子、これはＦａｂに適用されると、１つの異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一なＦａｂ断片からなる三価の二重特異的な結合タンパク質を生じることができる；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂアームの両端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子；並びに（ｘ）ディアボディが挙げられるがこれらに限定されない。二重特異的抗体の別の例示的な型式は、ヘテロ二量体化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。このような分子は、公知の技術、例えば、トリオマブ（Triomab）／クアドローマ（Quadroma）（トリオンファーマ社／フレゼニウス・バイオテク社）、ノブ・イントゥ・ホール（Knob-into-Hole）（ジェネンテック社）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（ロシュ社）及びエレクトロスタティカリー・マッチド（electrostatically-matched）（アムジェン社）、ＬＵＺ－Ｙ（ジェネンテック社）、鎖交換操作されたドメインボディ（ＳＥＥＤボディ）（ＥＭＤセローノ社）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（メルス社）、及びデュオボディ（ジェンマブ社）の技術として知られている技術を使用して調製することができる。いくつかの実施態様では、二重特異的抗体は、制御されたＦａｂアームの交換を介して、典型的にはデュオボディ技術を使用して得られるか又は得ることができる。制御されたＦａｂアーム交換によって二重特異的抗体をインビトロで生成するための方法が、国際公開公報第２００８１１９３５３号及び国際公開公報第２０１１１３１７４６号（両方共にジェンマブ社による）に記載されている。国際公開公報第２００８１１９３５３号に記載された１つの例示的な方法では、二重特異的抗体は、還元条件下でのインキュベーション時に、ＩｇＧ４様のＣＨ３領域を両方共が含む２つの単一特異的抗体間の「Ｆａｂアーム」又は「分子の半分」の交換（重鎖と付着した軽鎖の取り替え）によって形成される。生じた生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異的抗体である。国際公開公報第２０１１１３１７４６号に記載の別の例示的な方法では、本発明の二重特異的抗体は、以下の工程を含む方法によって調製され、ここで第一及び第二の抗体の少なくとも一方は本発明の抗体である：ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第一抗体を準備する工程、該Ｆｃ領域は第一のＣＨ３領域を含む；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第二の抗体を準備する工程、該Ｆｃ領域は第二のＣＨ３領域を含み；ここで第一及び第二のＣＨ３領域の配列は異なり、前記の第一のＣＨ３領域と第二のＣＨ３領域の間のヘテロ二量体相互作用は、前記の第一及び第二のＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用よりも強力なものである；ｃ）前記の第一の抗体を、還元条件下で前記の第二の抗体と一緒にインキュベートする工程；及びｄ）前記の二重特異的抗体を得る工程、ここで第一の抗体は本発明の抗体であり、第二の抗体は異なる結合特異性を有するか、又はその逆である。還元条件は、例えば、２－メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンから例えば選択された還元剤を加えることによって提供され得る。工程ｄ）は更に、例えば還元剤の除去によって、例えば、脱塩によって、非還元性又はより低い還元性となるように条件を回復することを含み得る。好ましくは、第一及び第二のＣＨ３領域の配列は異なり、ほんの僅かのかなり保存的な非対称的な突然変異を含み、よって前記の第一のＣＨ３領域と第二のＣＨ３領域との間のヘテロ二量体相互作用は、前記の第一及び第二のＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用より強力である。これらの相互作用に関するより多くの詳細及びどのようにして成し遂げられ得るかは、国際公開公報第２０１１１３１７４６号に提供され、これはその全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの他の実施態様では、本発明の二重特異的抗体は、各々が可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む２本の重鎖を含んでいる、クラスＩｇＧ４の対称な二重特異的抗体であり、ここで、各々の重鎖において：軽鎖内のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成しているＣＨ１ドメイン内のシステインは、別のアミノ酸で置換され；場合により、ヒンジ領域上部に位置するアミノ酸の１つ以上が、システインで置換され、ここでの各重鎖の定常領域の配列は、類似しているか又は同一であり、各々の重鎖における可変領域は異なる。前記の二重特異的型式の抗体は、国際特許出願の国際公開公報第２０１３１２４４５０号に記載されている。いくつかの実施態様では、本発明の二重特異的抗体は、各々が少なくとも１つの可変領域、１つのヒンジ領域及び１つのＣＨ１ドメインを含んでいる、２本の重鎖又は重鎖断片を含んでいる非対称な抗体であり、ここでの第一の重鎖又はその断片はクラスＩｇＧ４であり、かつａ）ＣＨ１ドメイン内の、Ｋａｂａｔによる番号付け体系に従って番号付けされた、１２７位の鎖間システインが、別のアミノ酸で置換され；及びｂ）場合によりヒンジ領域上部に位置するアミノ酸の１つ以上がシステインで置換され、ここでの第二の重鎖又はその断片は、鎖の一部又は全部が、可変領域外の少なくとも領域（例えば定常領域）内に前記の第一の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする。前記の二重特異的型式の抗体は、国際特許出願の国際公開公報第第２０１３１２４４５１号に記載されている。

【0106】

いくつかの実施態様では、本発明の多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）は、ＮＲＰ－１に特異的に結合し、かつ以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに、以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）を含む、第一の結合部位を含む。

【0107】

いくつかの実施態様では、本発明の多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）は、ＮＲＰ－１に特異的に結合し、かつ、配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第一の結合部位を含む。

【0108】

いくつかの実施態様では、本発明の多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）は、ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１１のＶＨドメイン及び配列番号１２のＶＬドメインを含む、第二の結合部位を含む。

【0109】

いくつかの実施態様では、本発明の多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）は、ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１５のＶＨドメイン及び配列番号１６のＶＬドメインを含む、第二の結合部位を含む。

【0110】

いくつかの実施態様では、本発明の多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）は、
－ＮＲＰ－１に特異的に結合し、かつ配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第一の結合部位、並びに
－ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１１のＶＨドメイン及び配列番号１２のＶＬドメインを含む、第二の結合部位
を含む。

【0111】

いくつかの実施態様では、本発明の多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）は、
－ＮＲＰ－１に特異的に結合し、かつ配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第一の結合部位、並びに
－ＰＤ－１に特異的に結合し、かつ配列番号１５のＶＨドメイン及び配列番号１６のＶＬドメインを含む、第二の結合部位
を含む。

【0112】

本発明の更なる目的は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位と、ＮＲＰ－１に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位とを含む、本発明の多重特異的抗体の治療有効量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関する。

【0113】

ＮＲＰ－１の発現が抑制されているＣＡＲ－Ｔ細胞：
本発明の更なる目的は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように設計されている細胞集団に関し、ここで、該細胞におけるＮＲＰ－１の発現は抑制されている。

【0114】

いくつかの実施態様では、前記細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び他の血球サブセット、例えばであって以下に限定されないが、Ｔ細胞、例えば腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞が挙げられる。適切な細胞としては、幹細胞、例えば、例を挙げると、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞も挙げられる。いくつかの実施態様では、幹細胞は、細胞トランスフェクション及び遺伝子療法用のエクスビボでの手順に使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができることであるか、又は哺乳動物（例えば細胞のドナー）に導入することができ、そこでそれらは骨髄に生着するであろうことである。インビトロでＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ）及びＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）などのサイトカインを使用して、ＣＤ３４陽性細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型へと分化させるための方法は公知である（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702（1992）参照）。

【0115】

いくつかの実施態様では、抗体又はその抗体断片を含んでいる本発明のＣＡＲ（キメラ抗原受容体）の部分は、様々な形態で存在し得、ここで抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、又は二重特異的抗体を含む、連続したポリペプチド鎖の一部として発現される（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。いくつかの実施態様では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。更なる態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。

【0116】

いくつかの実施態様では、本発明は、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原に対する特異的結合のために設計された抗原結合ドメイン（例えば抗体又は抗体断片、Ｔ細胞受容体又はＴ細胞受容体断片）を含んでいる、多くのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0117】

いくつかの実施態様では、前記細胞（例えばＴ細胞）に、ＣＡＲをコードするウイルスベクターを用いて形質導入する。いくつかの実施態様では、該ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、該ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、該細胞は、ＣＡＲを安定に発現し得る。いくつかの実施態様では、該細胞（例えばＴ細胞）は、ＣＡＲをコードする、核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。

【0118】

いくつかの実施態様では、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）は、その配列が哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、核酸分子によってコードされている。いくつかの実施態様では、本発明の全ＣＡＲ構築物は、その全配列が哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、核酸分子によってコードされている。コドン最適化は、コーディングＤＮＡにおける同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードしているコドン）の発生頻度は、異なる種において偏りがあるという発見を指す。このようなコドンの縮重は、様々なヌクレオチド配列によって同一のポリペプチドがコードされることを可能とする。様々なコドン最適化法が、当技術分野において公知であり、これには例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号及び第６，１１４，１４８号に開示されている方法が挙げられる。

【0119】

いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１の発現は、エンドヌクレアーゼを使用することによって抑制される。いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを使用することによって抑制される。真核細胞における遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は典型的には、（１）標的化配列（これはゲノムＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることができる）と、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９酵素に結合することのできる配列とを含む、ガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、及び（２）Ｃａｓ、例えばＣａｓ９タンパク質を含む。標的化配列、及び、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９酵素に結合することのできる配列は、同じ分子上に配置されても、異なる分子上に配置されてもよい。異なる分子上に配置された場合、各々は、分子が例えばハイブリダイゼーションを通して会合することを可能とするハイブリダイゼーションドメインを含む。ＮＲＰ－１を阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、当技術分野において公知の技術、例えば、米国公開公報第２０１４００６８７９７号、国際公開公報第０１５/０４８５７７号、及びCong (2013) Science 339: 819-823に記載されている技術を使用して作成され得る。ＮＲＰ－１を阻害する、当技術分野において公知である、例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許第８，８７１，４４５号；第８，８６５，４０６号；第８，７９５，９６５号；第８，７７１，９４５号；及び第８,６９７，３５９号に記載されている（その内容はその全体が参照によりここに援用される）、他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も作成され得る。ＮＲＰ－１を阻害するこのような系は、例えば、ＮＲＰ－１遺伝子配列にハイブリダイズする標的化配列を含んでいるｇＲＮＡ分子を含むようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を設計することによって作成され得る。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、ＮＲＰ－１遺伝子の１５～２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドに対して完全に相補的である標的化配列を含む。いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１遺伝子の１５～２５ヌクレオチド、例えば２０ヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、ここでの系は、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９タンパク質を含み、ＰＡＭ配列はＮＧＧを含み、ここでのＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣのいずれかであり得る）のＣａｓタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５’のすぐ近くに配置されている。

【0120】

いくつかの実施態様では、外来ＤＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするＤＮＡ）を、細胞内にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に導入することができる。

【0121】

いくつかの実施態様では、細胞をエンドヌクレアーゼ系と接触させることは、エクスビボで行なわれる。実施態様では、該細胞を、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のようなＣＡＲを発現するように改変する前、改変と同時に、又は改変した後に、接触させる。

【0122】

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４）の発現も細胞内において抑制される。

【0123】

本発明の更なる目的は、ｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞内に導入すること、及びｉｉ）該細胞をエンドヌクレアーゼ系と接触させることにより、ＮＲＰ－１の発現を抑制することからなる工程を含む、ＣＡＲを発現する細胞を製造する方法に関する。

【0124】

いくつかの実施態様では、前記方法は、ｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞内に導入すること、及びｉｉ）該細胞をＣａｓタンパク質と、及び、ＮＲＰ－１遺伝子に標的化する配列とＣａｓタンパク質に結合することのできる配列とを含んでいる少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）とに接触させることからなる工程を含む。いくつかの実施態様では、該細胞をまた、免疫チェックポイントタンパク質（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４など）をコードする遺伝子に標的化する配列を含んでいる少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子とも接触させる。

【0125】

一旦、Ｔ細胞集団が得られたら、細胞の機能を、細胞障害活性アッセイを典型的には含む、任意の標準的な方法に従って評価し得る。適切な結合対を用いて、細胞の細胞表面表現型も確認することができる。様々なサイトカインの分泌の定量も行なってもよい。試料中のサイトカインの分泌を定量するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、任意の免疫学的方法、例えばであって以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡ、多重戦略、ＥＬＩＳＰＯＴ、イムノクロマトグラフィー技術、プロテオミクス法、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、又はラジオイムノアッセイを、本発明に適用可能であり得る。

【0126】

本発明の方法によって得られたＴ細胞集団は、様々な適用を見出し得る。より特定すると、Ｔ細胞集団は、養子免疫療法に適している。養子免疫療法は、感染した細胞又は形質転換した細胞の排除が、特定のＴ細胞集団によって達成されることが実証されている、任意の疾患又は疾患状態にとって適切な処置である。本発明に従って調製されるようなＴ細胞集団を用いて処置され得る、例示的な疾患、障害、又は容態としては、例えば、感染、例えばウイルス感染、細菌感染、マイコプラズマ感染、真菌感染、及び寄生虫感染；並びに癌が挙げられる。

【0127】

本発明の更なる目的は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように設計されたＴ細胞集団の治療有効量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関し、ここで該細胞におけるＮＲＰ－１の発現は抑制されている。

【0128】

治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を癌ワクチンと組み合わせて患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法：
本発明の更なる目的は、治療有効量のＮＲＰ－１阻害剤を癌ワクチンと組み合わせて患者に投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関する。

【0129】

いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１阻害剤は、Mol. Biol. (2007) 366, 815-829及び米国特許出願第８３７８０８０Ｂ１号に記載の抗ＮＲＰ１抗体ＹＷ６４．３から誘導された、抗ＮＲＰ－１抗体である。特に、該抗ＮＲＰ－１抗体は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む。

【0130】

いくつかの実施態様では、抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＮＲＰ－１抗体は、配列番号９の軽鎖可変ドメイン配列及び配列番号１０の重鎖可変ドメイン配列を含む。

【0131】

いくつかの実施態様では、前記ＮＲＰ－１阻害剤は、
－ 以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：ＶＬ－ＣＤＲ１（RASQSISSYLA；配列番号３）、ＶＬ－ＣＤＲ２（GASSRAS；配列番号４）、及びＶＬ－ＣＤＲ３（QQYMSVPIT；配列番号５）、並びに
－ 以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：ＶＨ－ＣＤＲ１（GFSFSSEPIS；配列番号６）、ＶＨ－ＣＤＲ２（SSITGKNGYTYYADSVKG；配列番号７）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（WGKKVYGMDV；配列番号８）
を含む抗体と、ＮＲＰ－１アイソフォームに対する結合に関して交差競合する抗ＮＲＰ－１抗体である。

【0132】

様々な物質を、免疫原性型又はワクチン型の化合物又は製剤中の抗原として使用することができる。例えば、弱毒化及び不活化されたウイルス及び細菌の病原体、精製された巨大分子、多糖、トキソイド、組換え抗原、病原体由来の外来遺伝子を含有している生物、合成ペプチド、ポリ核酸、抗体、及び腫瘍細胞を使用して、本発明の癌ワクチンを調製することができる。いくつかの実施態様では、該抗原は、トランスフェクション、レンチウイルス若しくはレトロウイルスによる形質導入、ミニ遺伝子の導入、又は他の適切な手順によって細胞内に導入された、ＤＮＡ又は他の適切な核酸配列によってコードされる、タンパク質又はペプチドである。いくつかの実施態様では、該抗原は、組換えＤＮＡ技術によって、又は異なる組織若しくは細胞源からの精製によって得ることのできる、タンパク質である。典型的には、該タンパク質は、１０アミノ酸より長い、好ましくは１５アミノ酸より長い、更により好ましくは２０アミノ酸より長い長さを有し、理論的上限はない。このようなタンパク質は、天然タンパク質に限定されないが、例えば、選択されたアミノ酸配列を変化させることによって、又は異なるタンパク質の一部を融合させることによって得られた、修飾されたタンパク質又はキメラ構築物も含まれる。いくつかの実施態様では、該抗原は、合成ペプチドである。典型的には、該合成ペプチドは、３～４０アミノ酸長、好ましくは５～３０アミノ酸長、更により好ましくは８～２０アミノ酸長である。合成ペプチドは、Ｆｍｏｃ生化学手順、大規模な複数のペプチドの合成、組換えＤＮＡ技術、又は他の適切な手順によって得ることができる。このようなペプチドは、天然ペプチドに限定されないが、例えば選択されたアミノ酸配列を変化若しくは修飾することによって、又は異なるタンパク質の一部を融合させることによって得られた、修飾されたペプチド、翻訳後修飾されたペプチド、若しくはキメラペプチドも含まれる。

【0133】

いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は、選択された抗原を提示する、少なくとも１つの抗原提示細胞集団を含む。抗原提示細胞（又は刺激細胞）は典型的には、ＭＨＣクラスＩ分子又はクラスＩＩ分子をその表面上に有し、いくつかの実施態様では、抗原提示細胞それ自体は、ＭＨＣクラスＩ分子又はクラスＩＩ分子に、選択された抗原を実質的に載せることはできない。好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。適切には、樹状細胞は、目的の抗原（例えばペプチド）を瞬間適用された自己樹状細胞である。腫瘍関連抗原に由来するペプチドを瞬間適用された自己樹状細胞を使用したＴ細胞療法は、Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380及びTjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278に開示されている。したがって、いくつかの実施態様では、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有しているワクチン組成物に、１つ以上の抗原性ペプチドを瞬間適用するか又はそれを積載する。代替選択肢として、抗原提示細胞は、抗原性ペプチドをコードしている発現構築物を含む。ポリヌクレオチドは、任意の適切なポリヌクレオチドであり得、それを樹状細胞に形質導入することができ、それにより、ペプチドが提示され、免疫応答が誘導されることが好ましい。

【0134】

本発明の更なる目的は、１つ以上の癌抗原に対する免疫応答を誘導するために、免疫アジュバント（ここでの免疫アジュバントはＮＲＰ－１阻害剤である）を１つ以上の該癌抗原と一緒に含んでいる、癌ワクチンに関する。

【0135】

医薬組成物：
本発明によると、活性物質は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で患者に投与される。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを基剤とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられるがこれらに限定されない。患者への投与に使用するために、該組成物は患者への投与用に製剤化されるだろう。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、頬側に、膣内に、又は埋め込まれたレザバーを介して投与され得る。本明細書における使用としては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内への注射又は注入技術が挙げられる。本発明の組成物の無菌注射剤形は、水性又は油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当技術分野において公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射調製物はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射溶液又は懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中溶液であり得る。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁化媒体として慣用的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドをはじめとするあらゆる配合不揮発性油が使用され得る。脂肪酸、例えばオレイン酸、及びそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油又はヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチレン化形と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤（例えばカルボキシメチルセルロース）、又は薬学的に許容される剤形（例えばエマルション及び懸濁液）の製剤化に一般的に使用される類似の分散剤を含有していてもよい。薬学的に許容される固形剤、液剤、又は他の剤形の製造に一般的に使用される、他の一般的に使用される界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ）及び他の乳化剤又はバイオアベイラビリティ増強剤も、製剤化の目的に使用され得る。本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体は、乳糖及びコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的には添加される。カプセル剤形での経口投与のために有用な希釈剤としては、例えば乳糖が挙げられる。水性懸濁液が経口使用のために必要とされる場合、活性成分を乳化剤及び懸濁化剤と配合する。所望であれば、特定の甘味剤、芳香剤、又は着色剤も添加してもよい。あるいは、本発明の組成物は、直腸投与用の坐剤の剤形で投与されてもよい。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、それ故、直腸内で融解して薬物を放出する、適切な非刺激性の賦形剤と該薬剤を混合することによって調製され得る。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋、及びポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の組成物はまた、特に処置の標的が、局所適用によって容易に近づける領域又は器官を含む場合（眼、皮膚、又は下部腸管の疾患を含む）、局所的に投与されてもよい。これらの各領域又は器官のための適切な局所的製剤は容易に調製される。局所適用のために、該組成物は、１つ以上の担体に懸濁又は溶解された活性成分を含有している適切な軟膏中で製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、及び水が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、該組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解された活性成分を含有している適切なローション又はクリームで製剤化され得る。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステル蝋、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるがこれらに限定されない。下部腸管への局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）又は適切な浣腸製剤で行なわれ得る。パッチを使用してもよい。本発明の組成物はまた、鼻腔内へのエアゾール又は吸入によって投与され得る。このような組成物は、医薬製剤の分野において周知である技術に従って調製され、これは、ベンジルアルコール若しくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の慣用的な可溶化剤若しくは分散剤を使用して、食塩水中溶液として調製され得る。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００mg（１０mL）又は５００mg（５０mL）のいずれかの１回使用のバイアル中に１０mg/mLの濃度で供給され得る。製品は、静脈内投与用に、９．０mg/mLの塩化ナトリウム、７．３５mg/mLのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７mg/mLのポリソルベート８０、及び滅菌注射用水中で製剤化される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の医薬組成物における抗体の例示的な適切な用量範囲は、約１mg/m²から５００mg/m²の間であり得る。しかしながら、これらの計画は例であり、最適な計画及びレジメンは、臨床試験で決定されなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性及び耐容性を考慮しながら適応させることができる。注射用（例えば筋肉内、静脈内）の本発明の医薬組成物は、滅菌緩衝水（例えば筋肉内用では１ml）及び１ngから約１００mg、例えば約５０ngから約３０mg、又はより好ましくは約５mgから約２５mgの本発明の阻害剤を含有するように調製され得る。

【0136】

癌を患っている患者が、免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成するであろうかどうかを予測する方法：
本発明の更なる目的は、癌を患っている患者が、免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成するであろうかどうかを予測する方法であって、ｉ）患者由来の腫瘍試料中のＮＲＰ－１又はセマフォリン３Ａの発現レベルを決定すること、及びｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の基準値よりも低い場合、患者は該免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成すると結論付けること、又は、工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の基準値よりも高い場合、患者は該免疫チェックポイント阻害剤を用いて応答を達成しないと結論付けることを含む、方法に関する。

【0137】

したがって、前記方法は、応答者と非応答者を識別するのに特に適している。本発明によると、応答者は、客観的な応答を示し、それ故、該用語は、安定化した癌を有し、よって該疾患は免疫チェックポイント阻害剤を用いての処置後に進行していない患者を包含しない。非応答者又は難治性患者は、癌が、免疫チェックポイント阻害剤を用いての処置後に退縮又は改善を示さない患者を含む。典型的には、応答者又は非応答者としての患者の特徴付けは、標準又は訓練セットへの参照によって行なわれ得る。標準は、応答者若しくは非応答者であることが知られている患者のプロファイルであり得るか、又は代替的には数値であり得る。このような予め決定された標準は、任意の適切な形態で、例えば印刷されたリスト若しくは図、コンピューターソフトウェアプログラム、又は他の媒体で提供され得る。

【0138】

いくつかの実施態様では、腫瘍組織試料中のＮＲＰ－１又はセマフォリン３Ａの発現レベルは、免疫組織化学的検査によって決定される。例えば、決定は、腫瘍組織試料を、ＮＲＰ－１又はセマフォリン３Ａに特異的な結合対（例えば抗体）と接触させることによって行なわれる。

【0139】

免疫組織化学的検査は典型的には、以下の工程、すなわちｉ）腫瘍組織試料をホルマリンで固定する工程、ｉｉ）該腫瘍組織試料をパラフィンに包埋する工程、ｉｉｉ）該腫瘍組織試料を染色のために切片に切断する工程、ｉｖ）該切片を、ＮＲＰ－１タンパク質に特異的な結合対と共にインキュベートする工程、ｖ）該切片を濯ぐ工程、ｖｉ）該切片を、典型的にはビオチニル化されている二次抗体と共にインキュベートする工程、及びｖｉｉ）典型的にはアビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体を用いて該抗原－抗体複合体を顕現させる工程を含む。したがって、腫瘍組織試料をまず、ＮＲＰ－１タンパク質に対して特異性を有する結合対と共にインキュベートする。洗浄後、ＮＲＰ－１タンパク質に結合した標識された抗体を、標識された抗体によって生じる標識（例えば放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識）の種類に応じて、適切な技術によって顕現させる。複数の標識を同時に行なってもよい。あるいは、本発明の方法は、増幅系（染色シグナルを強化するための）及び酵素分子に結合させた二次抗体を使用してもよい。このような結合した二次抗体は、例えばダコ社、EnVisionシステムから市販されている。対比染色、例えばヘマトキシリン及びエオシン、ＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール）、ヘキストなどを使用してもよい。他の染色法も、自動化システム、半自動化システム、又は手動システムを含む、当業者には明らかであろうような、任意の適切な方法又はシステムを使用して成し遂げられ得る。

【0140】

したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｉ）ＮＲＰ－１と選択的に相互作用することのできる結合対を使用することによって、自動スライド染色システムによって得られた１つ以上の免疫染色された組織切片の薄片を準備すること、ｉｉ）高解像度スキャンキャプチャーによって、工程ｉ）のスライドのデジタル化を進めること、ｉｉｉ）デジタル写真上で組織切片の薄片を検出すること、ｉｖ）同じ表面積を有する均一に分布した単位を有する、サイズ参照グリッドを準備すること（該グリッドは、分析しようとする組織切片のサイズに合わせている）、並びにｖ）各単位内の染色された細胞の強度又は絶対数を検出、定量、及び測定することからなる工程を含む。

【0141】

いくつかの実施態様では、前記方法は更に、ＣＤ８の発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施態様では、該方法は、腫瘍組織試料中のＣＤ８陽性ＮＲＰ－１陽性細胞の密度を決定することを含む。

【0142】

多重組織分析技術が、腫瘍組織試料中のいくつかのタンパク質（例えばＮＲＰ－１及びＣＤ８）を定量するのに特に有用である。このような技術は、たった１つの腫瘍組織試料から、少なくとも５個、又は少なくとも１０個、又はそれ以上のバイオマーカーの測定を可能とするはずである。更に、該技術にとって、バイオマーカーの場所を保存し、癌細胞内のバイオマーカーと非癌細胞内のバイオマーカーの存在を識別することができることは有利である。このような方法としては、例えば、米国特許第６，６０２，６６１号；第６，９６９，６１５号、第７，２１４，４７７号及び第７，８３８，２２２号；米国公開公報第２０１１／０３０６５１４号（参照により本明細書に援用される）；及びChung & Hewitt, Meth Mol Biol, Prot Blotting Detect, Kurlen & Scofield, eds. 536: 139-148, 2009に教義された、層状免疫組織化学的検査（Ｌ－ＩＨＣ）、層状発現走査（ＬＥＳ）、又は多重組織イムノブロット（ＭＴＩ）が挙げられ、各参考文献は、層状でブロットされた膜、紙、フィルターなどの上に８個まで、９個まで、１０個まで、１１個まで、又はそれ以上の組織切片の画像の作成が使用され得ることを教義する。Ｌ－ＩＨＣ/ＭＴＩプロセスを実施するのに有用なコーティングされた膜は、２０／２０ジーンシステムズ社（ロックビル、ＭＤ州）から入手可能である。

【0143】

いくつかの実施態様では、Ｌ－ＩＨＣ法は、新鮮であれ保存されたものであれ、様々な組織試料の中のいずれに対しても実施され得る。試料は、針生検材料を含み、これは１０％の通常の緩衝ホルマリンで固定され、病理部門で処理された。標準的な５μm厚の組織切片を、組織塊から切断して帯電スライド上に置き、これをＬ－ＩＨＣに使用した。したがって、Ｌ－ＩＨＣは、組織切片から複数の生物親和性でコーティングされた膜へと移された分子のコピーを得て、組織「画像」のコピーを実質的に作成することによって、組織切片内の複数のマーカーの試験を可能とする。パラフィン切片の場合、組織切片を、例えば、該切片をキシレン又はキシレン代替品、例えばネオクリア（登録商標）及び等級エタノール溶液に曝して、当技術分野において公知のように脱パラフィン化する。切片を、パパイン、トリプシン、プロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼを用いて処理することができる。その後、例えば、タンパク質などの組織分子を積層を通って透過させるための直径０．４μmの孔を有する、１０μm厚のコーティングされたポリマー骨格の複数のシートを含んでいる、積層膜基質を、その後、組織切片上に置く。液体及び組織の分子の移動が、膜表面に対して実質的に垂直になるように構成されている。切片、膜、間隔紙、吸収紙、おもしなどのサンドイッチ状のものを熱に曝すことにより、組織から積層膜への分子の移動を促進することができる。該組織のタンパク質の一部は、各々の生物親和性でコーティングされた積層膜（２０/２０ジーンシステムズ社、ロックビル、ＭＤ州から入手可能）上に捕捉される。したがって、各膜は１コピーの組織を含み、これに標準的なイムノブロット技術を使用して、様々なバイオマーカーに対するプローブを付けることができ、これにより、たった１つの組織切片で実施されるのと同様の１つのマーカープロファイルの無制限の増幅が可能となる。タンパク質の量は、組織からより離れている積層内の膜上ではより少ない場合があり、これは、例えば、組織試料中の分子の量が異なること、組織試料から放出される分子の移動度が異なること、膜に対する分子の結合親和性が異なること、転写時間の長さなどで生じ得るので、数値の正規化、対照の実行、組織分子の転写レベルの評価などを手順に含めることにより、膜内で、膜間（２者間）で、及び膜間（３者以上の間）で起こる変化について修正することができ、そして、膜内で、膜間（２者間）で、及び膜間（３者以上の間）で情報を直接比較することが可能となる。したがって、１つの膜あたりの全タンパク質は、例えば、タンパク質、例えばビオチニル化している入手可能な分子、例えばタンパク質を、標準的な試薬及び方法を使用して定量し、その後、膜を、当技術分野において公知であるような、標識されたアビジン又はストレプトアビジン；タンパク質染色液、例えばBlot fastStain、ポンソー赤色、ブリリアントブルー染色液などに曝すことによって、結合したビオチンを顕現させるための任意の手段を使用して決定され得る。

【0144】

いくつかの実施態様では、本発明の方法は、バイオマーカーを測定するための多重組織インプリンティング（ＭＴＩ）技術を使用し、ここで、該方法は、複数のバイオマーカー、場合によっては少なくとも６つのバイオマーカーを可能とすることによって、貴重な生検組織を節約する。

【0145】

いくつかの実施態様では、代替的な多重組織分析システムが存在し、これも本発明の一部として使用され得る。１つのこのような技術は、質量分析に基づいた選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイシステムである（OncoPlexDx社（ロックビル、ＭＤ州）から入手可能な「Liquid Tissue」）。その技術は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている。

【0146】

いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ＧＥグローバルリサーチ社（ニスカユナ、ＮＹ州）によって開発された多重免疫組織化学技術を利用した。その技術は、米国特許公開公報第２００８／０１１８９１６号及び第２００８／０１１８９３４号に記載されている。そこでは、複数の標的を含有している生物学的試料について連続分析が行なわれ、これは、蛍光プローブを試料に結合させ、その後、シグナルを検出し、次いで、プローブを不活化させ、続いてプローブを別の標的に結合させ、検出し、不活化させ、そして全ての標的が検出されるまでこのプロセスを継続する工程を含む。

【0147】

いくつかの実施態様では、多重組織イメージングを行なうことができ、蛍光（例えばフルオロフォア又は量子ドット）を使用する場合、ここではシグナルをマルチスペクトルイメージングシステムを用いて測定することができる。マルチスペクトルイメージングは、画像の各ピクセルにおける分光学的な情報が集められ、結果として得られたデータを、スペクトルイメージ処理ソフトウェアを用いて分析する技術である。例えば、該システムは、電子的に連続的に選択することのできる様々な波長で一連の画像を撮影することができ、その後、このようなデータを取り扱うために設計された分析プログラムと共に利用され得る。したがって、該システムは、色素のスペクトルが高度に重複している場合でさえ、又はそれらが同じ場所に局在している、すなわち試料中の同じ点に存在している場合でさえも、複数の色素から同時に量的情報を得ることができ、ただし、スペクトル曲線は異なる。多くの生物学的物質は自己蛍光を発するか、又は、より高いエネルギーの光によって励起された場合、より低いエネルギーの光を放出する。このシグナルは、よりコントラストの低い画像及びデータをもたらす場合がある。マルチスペクトルのイメージング能を有さない高感度カメラは、蛍光シグナルと共に自己蛍光シグナルも増加させるだけである。マルチスペクトルイメージングは、組織に由来する自己蛍光を分離、すなわち分別することができ、これにより、到達可能な信号対雑音比を高めることができる。簡潔に言えば、定量は、以下の工程によって実施され得る：ｉ）患者から得られた腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を準備する工程、ｉｉ）その後、ＴＭＡ試料を、目的のＮＲＰ－１タンパク質（群）に特異性を有する抗抗体で染色する工程、ｉｉｉ）ＴＭＡスライドを更に、上皮細胞マーカーで染色して、腫瘍及び間質の自動セグメンテーションを補助する工程、ｉｖ）その後、ＴＭＡスライドを、マルチスペクトルイメージングシステムを使用して走査する工程、ｖ）走査された画像を、強力なパターン認識アルゴリズムを通した特定の組織の検出、定量、及びセグメンテーションを可能とする、自動画像解析ソフトウェア（例えばパーキンエルマーテクノロジー社）を使用して処理する工程。機械学習アルゴリズムは、典型的には、間質から腫瘍をセグメント化し、標識された細胞を同定するために事前に訓練された。

【0148】

いくつかの実施態様では、ＮＲＰ－１の発現レベルは、ＮＲＰ－１をコードしているｍＲＮＡの量を決定することによって決定される。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、試料（例えば患者から調製された細胞又は組織）中に含有される核酸をまず標準的な方法に従って、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を使用して抽出するか、又は、製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出する。次いで、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノザンブロット分析、インサイツハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例えば逆転写ＰＣＲ）によって検出する。他の増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。

【0149】

少なくとも１０個のヌクレオチドを有しかつ本明細書の目的のｍＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしての有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に対して少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、更により好ましくは９０～９５％同一であると理解される。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの検出のために、適切な手段、例えば検出可能な標識と組み合わせて核酸を使用することが有利であろう。

【0150】

典型的には、核酸プローブは、例えば、開示されたプローブを使用した標的核酸分子の検出を可能とするための、１つ以上の標識を含む。インサイツハイブリダイゼーション手順などの様々な適用において、核酸プローブは標識（例えば検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、試料中のプローブ（特に結合した又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す、検出可能なシグナルを発生させるために使用することのできる、分子又は材料である。したがって、標識された核酸分子は、試料中の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）（これに、標識された独特な特異的な核酸分子が結合又はハイブリダイズしている）の存在又は濃度の指標を提供する。１つ以上の核酸分子（例えば開示された方法によって生成されたプローブ）に結合した標識は、直接的に又は間接的にのいずれかで検出され得る。標識は、光子（ラジオ波周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数、及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出及び／又は散乱をはじめとする任意の公知の機序又は依然として発見されていない機序によって検出することができる。検出可能な標識としては、着色した、蛍光の、リン光の、及び発光の分子及び材料、ある物質を別の物質へと変換して検出可能な差をもたらす触媒（例えば酵素）（例えば、無色物質を着色物質へと若しくはその逆へと変換することによって、又は沈降物を生成するか若しくは試料の濁度を増加させることによって）、抗体結合相互作用によって検出することのできるハプテン、並びに常磁性及び磁性の分子又は材料が挙げられる。

【0151】

検出可能な標識の特定の例としては、蛍光分子（又は蛍光色素）が挙げられる。数多くの蛍光色素が当業者には公知であり、例えばライフ・テクノロジーズ社（以前はインビトロジェン社）から選択することができ、例えばThe Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照されたい。核酸分子（例えば独特な特異的な結合領域）に付着（例えば化学的にコンジュゲート）することのできる特定のフルオロフォアの例が、Nazarenko et al.の米国特許第５，８６６，３６６号に提供され、例えば４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４－アミノ－Ｎ－[３ビニルスルホニル]フェニル]ナフタルイミド－３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジブロモピロガロール－スルホネフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸（disulfor1ic acid）；５－［ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリトリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート、及びスクシンイミジル１－ピレンブチレート；リアクティブレッド４（チバクロンブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロソール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７nmで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）、並びに、ＧＦＰ、リサミン（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７－ジクロロローダミン、及びキサンテン（Lee et al.の米国特許第５，８００，９９６号に開示されているような）及びその誘導体が挙げられる。当業者に公知である他のフルオロフォア、例えば、ライフ・テクノロジーズ社（インビトロフェン社；モレキュラープローブ（ユージーン、オレゴン州)）から入手できるもの、例えばALEXA FLUOR（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、第６，１３０，１０１号、及び第６，７１６，９７９号に記載）、BODIPYシリーズの色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号、及び第５，４３３，８９６号に記載のような）、カスケードブルー（米国特許第５，１３２，４３２号に記載のスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びマリーナブルー（米国特許第５，８３０，９１２号）も使用することができる。

【0152】

上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、蛍光ナノ粒子、例えば半導体ナノ結晶、例えばQUANTUM DOT（商標）（例えばライフ・テクノロジーズ社（QuantumDot社、インビトロジェン社のナノクリスタルテクノロジー、ユージーン、オレゴン州）から得られた；米国特許第６，８１５，０６４号；第６，６８２，５９６号；及び第６，６４９，１３８号も参照）であり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学的及び／又は電気的特性を有する顕微粒子である。半導体ナノ結晶を第一のエネルギー源を用いて照射すると、半導体ナノ結晶に使用された半導体材料のハンドギャップに相当する周波数の第二のエネルギーの放出が起こる。この放出は、特定の波長の色光又は蛍光として検出することができる。様々なスペクトル特徴を有する半導体ナノ結晶が、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。例えば、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998; Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６，２７４，３２３号に記載の技術によって様々な生物学的分子（例えばｄＮＴＰ及び／又は核酸）又は基質に結合させることのできる半導体ナノ結晶。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成が、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；第６，９１４，２５６号；第６，８５５，２０２号；第６，７０９，９２９号；第６，６８９，３３８号；第６，５００，６２２号；第６，３０６，７３６号；第６，２２５，１９８号；第６，２０７，３９２号；第６，１１４，０３８号；第６，０４８，６１６号；第５，９９０，４７９号；第５，６９０，８０７号；第５，５７１，０１８号；第５，５０５，９２８号；第５，２６２，３５７号、及び米国特許公開公報第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ公開公報第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日に公開）に開示されている。その異なるスペクトル特徴に基づいて同定可能である別の集団の半導体ナノ結晶を生成することができる。例えば、その組成、サイズ、又はサイズと組成に基づいて異なる色の光を放出する半導体ナノ結晶を生成することができる。例えば、本明細書に開示されたプローブにおける蛍光標識として適切である、サイズに基づいて異なる波長（５６５nm、６５５nm、７０５nm、又は８００nmの発光波長）で発光する量子ドットは、ライフ・テクノロジーズ社（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手可能である。追加の標識としては、例えば、放射性同位体（例えば^３Ｈ）、金属キレート、例えばＧｄ３＋のような放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート、並びにリポソームが挙げられる。核酸分子と共に使用することのできる検出可能な標識としては、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、又はβ－ラクタマーゼも挙げられる。あるいは、酵素を、金属組織検出スキームに使用することができる。例えば、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノム標的核酸配列の同定及び場所決定のための金属組織検出スキームを含む。金属組織検出法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオン及び酸化還元不活性な酵素の基質と組み合わせて使用することを含む。基質は、酵素によって酸化還元活性な物質へと変換され、酸化還元活性物質は金属イオンを還元し、それが検出可能な沈降物を形成することを引き起こす（例えば、米国特許出願公開公報第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開公報第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公開公報第２００４／０２６５９２２号を参照）。金属組織検出法はまた、酸化還元酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に使用して、ここでも検出可能な沈降物を形成することを含む。（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号参照）。

【0153】

開示された方法を使用して作製されたプローブを、核酸の検出のために、例えばインサイツハイブリダイゼーション手順に（例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）に使用することができる。

【0154】

インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は間期染色体調製物の状況の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）を含有している試料（例えばスライド上に積載されている細胞試料又は組織試料）を、標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）に特異的にハイブリダイズすることができるか又は特異的である標識されたプローブと接触させることを含む。スライドに場合により前処理をして、例えば、パラフィン、又は均一なハイブリダイゼーションを妨害する可能性のある他の材料を除去する。試料及びプローブは両方共に、二本鎖核酸を変性させるために、例えば加熱することによって処理される。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で調合される）及び試料を、ハイブリダイゼーションが起こる（典型的には平衡に到達する）ことを許容する条件下及び十分な時間かけて合わせる。染色体調製物を洗浄して過剰なプローブを除去し、染色体標的の特異的標識の検出は、標準的な技術を使用して実施される。

【0155】

例えば、ビオチニル化プローブは、フルオレセインで標識されたアビジン又はアビジン－アルカリホスファターゼを使用して検出することができる。蛍光色素の検出のために、蛍光色素を直接検出しても、又は、試料を、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートさせたアビジンと共にインキュベートしてもよい。ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要であれば、ビオチンにコンジュゲートさせたヤギ抗アビジン抗体と共にインキュベーション、洗浄、及びＦＩＴＣにコンジュゲートさせたアビジンと共に２回目のインキュベーションによって行なわれ得る。酵素活性による検出のために、試料を、例えば、ストレプトアビジンと共にインキュベートし、洗浄し、ビオチンにコンジュゲートさせたアルカリホスファターゼと共にインキュベートし、再度洗浄し、そして事前に平衡化（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液中で）させることができる。インサイツハイブリダイゼーション手順の一般的な説明については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照されたい。

【0156】

ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのための数多くの手順が当技術分野において公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号；第５，４７２，８４２号；及び第５，４２７，９３２号；及び例えばPir1kel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986；Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988；及びLichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988に記載されている。ＣＩＳＨは、例えばTanner et al., Am. .1. Pathol. 157:1467-1472, 2000及び米国特許第６，９４２，９７０号に記載されている。追加の検出法は米国特許第６，２８０，９２９号に提供されている。

【0157】

数多くの試薬及び検出スキームを、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ手順と併せて使用して、感度、分解能、又は他の所望の特性を改善させることができる。上記に考察されているように、フルオロフォア（蛍光色素及びQUANTUM DOTS（登録商標）を含む）で標識されたプローブは、ＦＩＳＨを実施した場合、直接光学的に検出することができる。あるいは、プローブを、非蛍光分子、例えばハプテン（例えば以下の非制限的な例；ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、及び様々なオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、及びその組合せ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分を用いて標識してもよい。次いで、このような非蛍光分子で標識されたプローブ（及びそれらが結合する標的核酸配列）を、試料（例えばプローブが結合する細胞試料又は組織試料）を、選択されたハプテン又はリガンドに対して特異的である標識された検出試薬、例えば抗体（又は受容体、又は他の特異的な結合対）と接触させることによって検出することができる。検出試薬は、フルオロフォア（例えばQUANTUM DOTS（登録商標））で又は別の間接的に検出可能な部分で標識されても、あるいは、フルオロフォアで標識されていてもよい１つ以上の追加の特異的な結合物質（例えば二次抗体又は特異的抗体）と接触させてもよい。

【0158】

他の例では、プローブ又は特異的結合物質（例えば抗体、例えば一次抗体、受容体、又は他の結合物質）を、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光シグナル、着色シグナル、又は別様に検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおいて検出可能な金属粒子の沈着におけるように）へと変換することができる酵素を用いて標識する。上記に示されているように、酵素を、関連したプローブ又は検出試薬へと直接的に又はリンカーを介して間接的に付着させることができる。適切な試薬（例えば結合試薬）及び化学反応（例えばリンカー及び付着化学反応）の例は、米国特許出願公開公報第２００６／０２４６５２４号；第２００６／０２４６５２３号及び第２００７／０１１７１５３号に記載されている。

【0159】

標識されたプローブ－特異的結合物質の対を適切に選択することによって、１回のアッセイ（例えば１つの細胞試料若しくは組織試料上での、又は、１つを超える細胞試料若しくは組織試料上での）で複数の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）の検出を容易にする多重検出スキームを作成することができることが当業者によって理解されるだろう。例えば、第一標的配列に対応する第一プローブを、ビオチンなどの第一のハプテンで標識し、一方で、第二標的配列に対応する第二のプローブをジニトロフェノールなどの第二のハプテンで標識してもよい。プローブに試料を曝露した後、試料を、第一の特異的な結合物質（この場合、第一のフルオロフォアで標識されたアビジン、例えば５８５nmで発光する、例えば第一のスペクトル的に明確に異なるQUANTUM DOTS（登録商標））及び第二の特異的な結合物質（この場合、第二のフルオロフォア（例えば、７０５nmで発光する、例えば第二のスペクトル的に明確に異なるQUANTUM DOTS（登録商標））で標識された抗ジニトロフェノール抗体、又は抗体断片）と接触させることによって、結合したプローブを検出することができる。追加のプローブ／結合物質の対を、他のスペクトル的に明確に異なるフルオロフォアを使用して多重検出スキームに加えることができる。直接的及び間接的（１工程、２工程、又はそれ以上）な数多くの変法を想定することができ、その中の全てが、開示されたプローブ及びアッセイの脈絡において適切である。

【0160】

プローブは典型的には、１０～１０００、例えば１０～８００、より好ましくは１５～７００、典型的には２０～５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは典型的には、増幅しようとする目的の核酸と完全に又はほぼ完全に一致するように設計された、１０～２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、それらは好ましくは高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（最も高い融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに相当する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５Mクエン塩ナトリウムである）。

【0161】

上記の増幅法及び検出法に使用された核酸プライマー又はプローブは、キットとして構築されてもよい。このようなキットは、共通プライマー及び分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が起こったかどうかを決定するのに必要とされる成分を含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；正の対照配列、反応制御プライマー；並びに、特定の配列を増幅及び検出するための説明書も含み得る。

【0162】

いくつかの実施態様では、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された全ＲＮＡを準備する工程、及び、より特定すると定量又は半定量逆転写ＰＣＲを用いてＲＮＡを増幅及び特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションにかける工程を含む。

【0163】

いくつかの実施態様では、レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス、又はマイクロスフィアのサイズのビーズであり得る、基材に化学的に付着させた様々な核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ、又はシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースから構成され得る。プローブは、約１０～約６０塩基対であり得る、核酸、例えばｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを含む。レベルを決定するために、場合によりまず逆転写にかけた試験患者の試料を、標識し、そして、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に付着させたプローブ配列に対して相補的である標的核酸との間で複合体を形成するに至る。次いで、標識されたハイブリダイズした複合体を検出し、定量又は半定量することができる。標識は、様々な方法によって、例えば放射能標識又は蛍光標識を使用することによって成し遂げることができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変法が、当業者には利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説を参照）。

【0164】

いくつかの実施態様では、nCounter（登録商標）分析システムを使用して、内因性遺伝子発現を検出する。nCounter（登録商標）分析システムの基本は、アッセイしようとする各々の核酸標的に割り当てられた独特なコードである（国際特許出願公開公報第ＷＯ０８／１２４８４７号、米国特許第８，４１５，１０２号及びGeiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325；その内容は各々その全体が参照により本明細書に援用される）。コードは、アッセイしようとする各標的に対して独特なバーコードを作成する規則正しい一連の有色蛍光スポットから構成される。各々のＤＮＡ標的又はＲＮＡ標的のための１対のプローブ、すなわちビオチニル化捕捉プローブと蛍光バーコードを有するレポータープローブとを設計する。このシステムは本明細書においてナノレポーターコードシステムとも称される。各標的に対して特異的なレポーター及び捕捉プローブを合成する。レポータープローブは、第一シグナルを構成している、光を放出する１つ以上の標識モノマーが付着する少なくとも１つの第一標識付着領域；第二のシグナルを構成している、光を放出する１つ以上の標識モノマーが付着する、第一の標識付着領域と重複していない、少なくとも１つの第二の標識付着領域；及び、第一の標的特異的配列を含み得る。好ましくは、各々の配列特異的レポータープローブは、１つ以下の遺伝子にハイブリダイズすることができる標的特異的配列を含み、かつ少なくとも３つ、又は少なくとも４つの標識付着領域を場合により含み、該付着領域は、それぞれ少なくとも１つの第三のシグナル又は少なくとも１つの第四のシグナルを構成している、光を放出する１つ以上の標識モノマーを含む。捕捉プローブは、第二の標的特異的配列；及び第一の親和性タグを含み得る。いくつかの実施態様では、捕捉プローブはまた、１つ以上の標識付着領域を含み得る。好ましくは、レポータープローブの第一の標的特異的配列及び捕捉プローブの第二の標的特異的配列は、検出しようとする同じ遺伝子の異なる領域にハイブリダイズする。レポータープローブ及び捕捉プローブは全て、１つのハイブリダイゼーション混合物、すなわち「プローブライブラリー」にプールされる。１回の多重ハイブリダイゼーション反応における各標的の相対量を測定する。該方法は、腫瘍組織試料をプローブライブラリーと接触させることを含み、よって、試料中の標的の存在は、プローブ対－標的の複合体を作る。次いで、複合体を精製する。より具体的には、試料をプローブライブラリーと合わせ、溶液中でハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイゼーション後、三者間のハイブリダイズした複合体（プローブ対及び標的）を、捕捉プローブ及びレポータープローブ上に存在する普遍的な配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドに連結させた磁気ビーズを使用して２工程手順で精製する。この二重精製過程は、大過剰の標的特異的プローブを用いてハイブリダイゼーション反応を完了に導くことが可能である。なぜなら、それらは最終的に除去され、したがって、試料の結合及びイメージングに干渉しないからである。全てのハイブリダイゼーション後の工程は、カスタムリキッドハンドリングロボット（プレップステーション、ナノストリング・テクノロジー社）でロボット操作される。精製された反応液を典型的には、捕捉プローブを介して、ストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合した、試料カートリッジの個々のフローセルにプレップステーションによって沈着させ、電気泳動にかけてレポータープローブを伸長し、そして固定する。加工後、試料カートリッジを、完全自動化イメージング装置及びデータ収集装置（デジタルアナライザ、ナノストリング・テクノロジー社）に移す。各試料をイメージングし、その標的に対するコードが検出された回数を計数することによって標的のレベルを測定する。各試料について、約１０mm²の結合表面を示す典型的には６００個の視野（ＦＯＶ）がイメージングされる（１３７６×１０２４ピクセル）。典型的な画像密度は、多重化度、試料投入量、及び標的の総量に依存して、１視野あたり１００～１２００個であると計数されたレポーターである。データは、１つの標的あたり、１つの試料あたりの計数を列挙した簡単なスプレッドシート形式に出力する。このシステムをナノレポーターと共に使用することができる。ナノレポーターに関する追加の開示は、国際公開公報第０７／０７６１２９号及び国際公開公報第０７／０７６１３２号、及び米国特許公開公報第２０１０／００１５６０７号及び第２０１０／０２６１０２６号に見出すことができ、その内容はその全体が本明細書に援用される。更に、核酸プローブ及びナノレポーターという用語は、国際公開公報第２０１０／０１９８２６号及び米国特許公報第２０１０／００４７９２４号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の合理的に設計された（例えば合成配列）を含み得る。

【0165】

遺伝子の発現レベルは、絶対レベル又は正規化レベルとして表現され得る。典型的には、レベルは、その発現を、患者の癌段階を決定するのに関連のない遺伝子、例えば構成的に発現されているハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって、遺伝子の絶対レベルを修正することによって正規化される。正規化のための適切な遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子ＡＣＴＢ、リボソーム１８Ｓ遺伝子、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１及びＴＦＲＣが挙げられる。この正規化により、１つの試料中のレベルの比較、例えば、患者の試料と別の試料、又は異なる入手源に由来する試料間の比較が可能となる。

【0166】

本発明の更なる目的は、ｉ）患者から得られた腫瘍組織試料中のＮＲＰ－１又はセマフォリン３Ａの発現レベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルを、所定の基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが、所定の基準値より低い場合、患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、それを必要とする患者における癌を処置する方法に関する。

【0167】

本発明は更に、以下の図面及び実施例によって説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例0168】

概要：
プログラム化細胞死１（ＰＤ１）などの免疫チェックポイントの標的化は、疲弊したＣＤ８陽性Ｔ細胞の制御を解き、これにより、抗腫瘍免疫応答を回復することによって、癌患者における生存率を改善した^１、２。しかしながら、大半の患者は再発するか、又は、免疫チェックポイント遮断療法に対して難治性である。ニューロフィリン－１（ＮＲＰ１）は、神経系及び血管新生性胚発達に必要とされる、膜貫通糖タンパク質である^３、４。ＮＲＰ１はまた、数種類の免疫細胞にも発現され、免疫学的なシナプスの形成、活性化、及び終結に関与している^５～７。ＮＲＰ１は、マクロファージ及び制御性Ｔ細胞の活性を調節することによって、抗腫瘍免疫応答を損なう^８～１０。ここで、本発明者らは、ＮＲＰ１が、ＰＤ１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞溶解性シナプスに動員され、ＰＤ－１と相互作用してＰＤ－１の活性を増強することを示す。マウスでは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮｒｐ１の特異的な欠失は、自発的抗腫瘍免疫応答及び抗ＰＤ１抗体による抗腫瘍免疫応答を改善させる。同様に、ヒト転移性黒色腫でも、腫瘍浸潤性ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＲＰ１の発現は、抗ＰＤ１抗体で処置された患者の悪い予後を予測する。最後に、抗ＮＲＰ１抗体と抗ＰＤ１抗体の組合せは、ヒトにおいて、特にＣＤ８陽性Ｔ細胞の抗腫瘍応答において、腫瘍細胞を含むシナプスにおけるＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体のシグナル伝達を増加させることによって、相乗的である。

【0169】

結果：
ＰＤ１は、疲弊の重要な要因であるが、その発現は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞における疲弊プロファイルを誘発するのに十分ではない。例えば、ＬＣＭＶクローン１３株のマウス感染モデルの、抗原の中止後にもＰＤ１の発現を維持しつつ誘導された大半の抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞において、これらの中のごく一部のＣＤ８陽性Ｔ細胞が、新規なＬＣＭＶ抗原によるチャレンジ時に、サイトカイン産生能を保持している^１１。この観察は、更に他の対の候補の関与を示唆する。ＮＲＰ１は、自律的にシグナルを発することはできず^１２、また活性化Ｔ細胞においてシナプスレベルで発現されているので、本発明者らは、ＮＲＰ１が、ＰＤ１の抑制活性に関与している可能性があると仮説を立てた。インビトロでＮＲＰ１を、オボアルブミンペプチドによって駆動される活性化後に、マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞上に発現させ、その発現強度は、抗原の利用可能性と正に相関していた。インビボでのＣＤ８陽性Ｔ細胞上でのＮＲＰ１の発現を調べるために、本発明者らは、急性又は持続的な３つの抗原特異的な免疫化モデルを研究した。以前に報告されているように^{１３、１４}、ＮＲＰ１は、ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞上には発現されなかった（データは示されていない）。対照的に、活性化された特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、筋肉内へのアデノ随伴ウイルス－オボアルブミン（ＡＡＶ－ＯＶＡ）による免疫化後にＮＲＰ１を発現し、発現のピークは免疫化後２１日目であった。ＮＲＰ１は、マウスのＢ１６－オボアルブミン腫瘍進行モデルにおいて特異的な抗ＯＶＡ_２５７ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球によって（図１）、及び、ＬＣＭＶアームストロング株による感染と比較して、ＬＣＭＶクローン１３株によるウイルス感染の疲弊モデルにおいて、特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって（図２）、高度に発現されていた。

【0170】

インビボでＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＲＰ１の発現の役割を更に研究するために、本発明者らは、Ｎｒｐ１ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘマウスをＣＤ８Ｃｒｅ遺伝子組換えマウスと交配することによって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、Ｎｒｐ１について特異的に無効化されたマウスモデル（ＣＤ８Ｎｒｐ１ＫＯ）を作製した。定常状態では、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウスは、免疫学的表現型を全く有さず、予想された通り、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、活性化された時にＮＲＰ１を発現しなかった。抗原特異的抗腫瘍免疫応答では、腫瘍の増殖は、対照と比較して、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウスの方が有意に減少していた（図３）。したがって、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウス及び対照マウスにおける腫瘍免疫微小環境の分析は、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウスにおけるＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球の出現頻度の増加を示した（図４）。これらの結果は、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球上のＮＲＰ１の発現が、抗腫瘍免疫応答の負の調節に関与している可能性があることを示唆する。

【0171】

本発明者らは以前に、ＮＲＰ１が、Ｔ細胞と樹状細胞との間の免疫学的シナプスに関与していたと報告したので^５、その後、本発明者らは、ＮＲＰ１が、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間のシナプスに局在し得るかどうか、そしてこれにより、この特殊な状況においてＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球のエフェクター機能に関与し得るかどうかを調べた。この問題に対処するために、本発明者らは、遺伝子組み換えＴ細胞受容体ＯＴ１ Ｔ細胞と、同族抗原（ＯＶＡ_２５７）を有する腫瘍細胞（ＥＬ４－ＣＦＰ細胞）との間、及び、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウス又は同腹仔由来の活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と、同種異系腫瘍細胞（Ａ２０細胞）との間の、シナプスモデルを開発した。これらのモデルにおける、細胞コンジュゲートのイメージングフローサイトメトリー分析は、ＮＲＰ１及びＰＤ１が、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞との間のシナプスに一緒に動員されたことを示した（図５～６）。

【0172】

ＰＤ１及びＴ細胞受容体のクラスター化及び同じ場所への局在化が、疲弊シナプスを特徴付ける、ＰＤ１に対するＰＤ－Ｌ１の結合に応答した^{１５、１６}、シナプス接合部における、低レベルのリン酸化ＺＡＰ７０の誘導に重要であることが以前に報告されているので、その後、本発明者らは、ＮＲＰ１が、シナプスにおけるＰＤ１の動員及び機能に関与しているかどうかを調べた。まず、免疫蛍光法により、インビボにおいて本発明者らは、ＰＤ１及びＮＲＰ１が、マウス由来のＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球において同じ場所に局在し（データは示されていない）、ＮＲＰ１が、ヒトＰＤ１陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球上に特異的に発現されていたことを示した（図７）。ＮＲＰ１とＰＤ１との間の相互作用が、インビトロで近接ライゲーションアッセイ（デュオリンク）によって、活性化されたマウスＣＤ８陽性Ｔ細胞上に実証された（データは示されていない）。共免疫沈降実験を実施して、本発明者らは、タンパク質複合体におけるこの相互作用の追加の証拠を提供した（データは示されていない）。ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトＣＤ８陽性Ｔ細胞では、ＰＤ１は発現されていたが、腫瘍細胞を含むシナプス内のその局在は、野生型マウスに由来するＣＤ８陽性Ｔ細胞と比較して有意に減少していた（図８）。したがって、リン酸化ＺＡＰ７０は、対照と比較して、腫瘍細胞を含むシナプスにおいて、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトに由来するＣＤ８陽性Ｔ細胞の方が増加していた（図９）。要するに、本発明者らのデータは、ＮＲＰ１が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞との間のシナプスにおいて、ＰＤ１の動員及び活性を増強するＰＤ１の対であることを示唆する。

【0173】

本発明者らは次に、マウスの疲弊におけるＮＲＰ１の役割は、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞においても当てはまるかどうかを調べた。ヒト腫瘍微小環境内で、ＮＲＰ１の発現は、ＣＤ８腫瘍浸潤リンパ球上に、特に、ＰＤ１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞上に見られ、低いリン酸化ＺＡＰ７０の発現を有するＰＤ１陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球のサブセットを同定した（リン酸化ＺＡＰ７０^ｌｏｗＮＲＰ１陽性ＰＤ１陽性ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球）（図１０）。おそらく、子宮内におけるホモ接合型ＮＲＰ１の欠失の致死性により、ホモ接合型ＮＲＰ１の突然変異を有する患者はこれまで記載されてこなかった^１７。しかしながら、本発明者らは、ＮＲＰ１遺伝子を含む染色体領域（１０ｐ１１．２２）のヘテロ接合型欠失によって引き起こされる、ＮＲＰ１ハプロ不全を有する特有な患者を同定することができた^１８。ＮＲＰ１^＋/－患者のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ブドウ球菌腸毒素ｂ（ＳＥＢ）スーパー抗原によるインビトロでの活性化後に、増加した増殖能及びＣＤ２５発現能を有する（図１１～１２）。更に、患者のＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化の増加は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせると相乗的であった。

【0174】

ＰＤ１とＮＲＰ１の間のこの相乗効果に対処するために、本発明者らは、Ｂ１６－オボアルブミン腫瘍増殖マウスモデルにおいて、抗ＰＤ１抗体のインビボでの有効性を評価した。以前にこのモデルにおいて報告されているように、抗ＰＤ１抗体による処置は、野生型マウスにおいては全生存率に対する作用を全く及ぼさなかった。対照的に、マウス生存率の有意な増加が、ＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトにおいて観察され、これは、抗ＰＤ１抗体による処置時により顕著であり、このことは強力な相乗効果を示す（図１３）。

【0175】

ヒト癌におけるＮＲＰ１の役割を評価するために、本発明者らは次に、抗ＰＤ１抗体による治療を用いた臨床試験において処置された転移性黒色腫癌からのマイクロアレイデータを分析するコンピューターでの研究を実施した^１９（図１４）。本発明者らの仮説によると、治療前の腫瘍におけるＮＲＰ１の低い発現は、改善された患者の全生存率に関連していた（ｐ＝０．０４０）。ＮＲＰ１は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞以外の他の細胞にも発現されている可能性があるので、その後、本発明者らは、治療開始前のＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球上のＮＲＰ１の発現に応じて、抗ＰＤ１抗体療法で処置された、２８人の転移性黒色腫患者の転帰を調べた。本発明者の仮説に従って、本発明者らは、ＮＲＰ１^{＋/ｈｉｇｈ}ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球患者と比較して、ＮＲＰ１^{－/ｌｏｗ}ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球を有する患者において、最も高い完全奏効率（データは示されていない）及び無再発生存率の有意な増加という傾向を発見した（ｐ＝０．０４２、図１５）。要するに、本発明者らのデータは、ＮＲＰ１が、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球上のＰＤ１活性を増強することによる、新規な疲弊作用因子として考えられるべきであることを実証する。

【0176】

最後に、本発明者らは、抗ＮＲＰ１抗体と抗ＰＤ１抗体の組合せが、ヒト抗腫瘍免疫応答において相乗的であることを示した。実際に、ヒト活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞（ラージ細胞）との間のインビボでのシナプスモデルでは、該組合せは、抗ＰＤ１抗体のみと比較して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞において、リン酸化ＺＡＰ７０の発現（及びそれによりＴ細胞受容体のシグナル伝達）の増加を誘導した（図１６）。

【0177】

考察：
ＮＲＰ１はすでに、自然免疫及び獲得免疫の両方におけるブレーキとして作用することによって、腫瘍に対する免疫応答に関与していた^８～１０。免疫チェックポイント療法により、癌患者において多数の成功がもたらされた^１、２。残念なことには、大半の患者は、免疫チェックポイント阻害剤の組合せを用いてさえも、再発するか又は難治性である^２０。ヒトにおける本発明者らの観察のデータは、ＮＲＰ１の阻害が、抗ＰＤ１抗体の有効性を改善する治療戦略候補であり得ることを示唆する。安全性に関して、抗ＰＤ１抗体療法との関連を評価する、マウスにおける実験において副作用は全く報告されなかった（データは示されていない）。更に、抗ＰＤ１抗体を用いてＢ１６－オボアルブミン腫瘍細胞の治癒されたＣＤ８Ｎｒｐ１ノックアウトマウスは、自己免疫表現型又は炎症性表現型を全く示さなかった。この観察は、ＮＲＰ１の発現を減少させることのできる薬物、又は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＮＲＰ１及びＰＤ１の両方を遮断する抗体のいずれかを使用することが、安全である可能性を示す。

【0178】

ここで、本発明者らは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＮｒｐ１の特異的欠失が、Ｂ１６－オボアルブミン腫瘍を有するマウスの生存率を劇的に増強し、抗ＰＤ１抗体療法の追加による治癒の可能性を報告する。更に、本発明者らは、抗ＮＲＰ１抗体と抗ＰＤ１抗体の組合せが、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞の抗腫瘍免疫応答において相乗的であることを示した。したがって、本発明者らのデータは、ＮＲＰ１の欠失したＣＤ８陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞のみを使用して又は免疫チェックポイント阻害剤（例えば抗ＰＤ１抗体）との組合せを使用した戦略が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を向上させる方法であり得ることを示唆する。更に、本発明者らのデータは、二重特異的抗ＮＲＰ１／ＰＤ１抗体が、免疫チェックポイント阻害剤（例えば抗ＰＤ１抗体）の有効性を向上させる方法であり得ることを示唆する。

【0179】

結論付けると、本発明者らは、ＮＲＰ１を、新規な免疫チェックポイントとして同定し、これは、シナプスレベルでＰＤ－１の抑制作用を増強することによって元来の機序を通して作用し、本発明者らのデータは、治療によるＮＲＰ１のみの阻害又は免疫チェックポイント阻害剤（例えば抗ＰＤ１抗体）との組合せによる阻害が、ヒト癌における腫瘍増殖を効率的に抑制することができたことを強く示唆する。

【0180】

参考文献：
本出願全体にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の技術状況を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書により援用される。

【0181】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

2024170509000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-10-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように設計されている細胞集団であって、該細胞におけるＮＲＰ－１の発現が抑制されている、細胞集団。

【外国語明細書】