特開 2024-170603 免疫チェックポイント阻害療法からの利益を予測する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024170603

(43)【公開日】2024-12-10

(54)【発明の名称】免疫チェックポイント阻害療法からの利益を予測する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20241203BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024155455

(22)【出願日】2024-09-10

(62)【分割の表示】P 2021536739の分割

【原出願日】2019-12-20

(31)【優先権主張番号】10201811546W

(32)【優先日】2018-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG

(71)【出願人】

【識別番号】503231882

【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ

(71)【出願人】

【識別番号】521272517

【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティー ホスピタル （シンガポール） ピーティーイー エルティーディー

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＨＯＳＰＩＴＡＬ （ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ） ＰＴＥ ＬＴＤ

(71)【出願人】

【識別番号】506009947

【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティ オブ シンガポール

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】タン パトリック

(72)【発明者】

【氏名】スンダル ラガフ

(72)【発明者】

【氏名】ファン キーギョン

(72)【発明者】

【氏名】カムラ アディティ

(72)【発明者】

【氏名】ゴケ ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】デミルシオル デニズ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】免疫療法又は免疫チェックポイント阻害（ＩＣＩ）療法への患者の応答を予測するための、代替プロモーターの利用に基づいた代替方法を提供する。
【解決手段】ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとしてがん患者を同定する方法であって、患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ、１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ、代替プロモーター使用スコア（ＡＰＢスコア）を計算するステップ、及びＡＰＢスコアを使用して免疫チェックポイント阻害療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして患者を同定するステップを含む、方法とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫チェックポイント阻害（ＩＣＩ）療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして、がんに罹患している患者を同定する方法であって、
ａ）前記患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された前記１又は２以上の事前選択マーカーの前記発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）前記代替プロモーター使用スコアを使用して、ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして前記患者を同定するステップ；
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年１２月２１日に出願されたシンガポール出願番号１０２０１８１１５４６Ｗの優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、一般に、がんの分野に関する。特に、本発明は、免疫チェックポイント阻害療法について患者を選択するための方法の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

がんの様々な治療法の中で、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＩ，immune checkpointinhibition）は、いくつかの腫瘍タイプにおいて重要なブレークスルーをもたらした。ＩＣＩ療法では、ペムブロリズマブ及びニボルマブなどの免疫チェックポイント阻害剤が免疫チェックポイント受容体ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用を遮断し、負の共刺激シグナルを低減し、Ｔエフェクター細胞機能を増大させて抗腫瘍応答を誘発する。

【0004】

ある特定の腫瘍タイプにおいて利益を受けているものの、特に固形上皮腫瘍において成功しないことが、いくつかの最近のＩＣＩ第III相試験でも証明されている。ＩＣＩ療法
への応答は、少数の患者のみで観察される。したがって、免疫療法への患者の応答を予測できる強固なバイオマーカーが必要である。現在、最も開発されているＩＣＩバイオマーカーは、ＰＤ－Ｌ１発現、マイクロサテライト不安定性、及び腫瘍変異量（tumour mutationburden）である。これらのバイオマーカーは、ＩＣＩ療法に応答する患者を同定することを目的とした陽性予測バイオマーカーである。しかしながら、これらのバイオマーカーを取り巻く論争が起きており、バイオマーカー陰性集団におけるＩＣＩ応答が観察されている。これらの観察結果は、免疫療法に耐性がある可能性が高い腫瘍を同定できる、ＩＣＩ療法の陰性予測バイオマーカーの補完的な要件を強調する。しかしながら、ＩＣＩの陰性予測バイオマーカーは十分に説明されていないままである。

【0005】

プロモーターは、転写開始部位（ＴＳＳ，transcription start site）の上流のゲノムシス調節要素であり、転写を開始する機能を有する。プロモーター活性はエピジェネティックに調節され、ヒトの全遺伝子の半分を超えるものが複数のプロモーターを有しており、正常な生物学的機能又は疾患状態の結果として選択的に活性化することができる。代替プロモーターの使用により、別個の５’非翻訳領域（ＵＴＲ，untranslated region）と
第１エクソンとが産生され、ｍＲＮＡ及びタンパク質のアイソフォームの多様性を増強することができる。がんにおいては、代替プロモーターが発がん性を有するがん特異的アイソフォームを生成する可能性がある。最近の研究では、腫瘍が代替プロモーターを免疫編集及び回避のメカニズムとして利用している可能性が示されている。したがって、エピジェネティックに駆動される代替プロモーターの利用は、ＩＣＩ療法に対する耐性の潜在的なメカニズムである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、免疫療法又はＩＣＩ療法への患者の応答を予測するために、代替プロモーターの利用に基づいた代替方法を開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

概要
一態様では、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＩ）療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして、がんに罹患している患者を同定する方法であって、
ａ）患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカー（preselectedmarker）の発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）代替プロモーター使用スコアを使用して、ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして患者を同定するステップ
を含む、方法が提供される。

【0008】

別の態様では、がんに罹患している患者の予後を決定する方法であって、
ａ）患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）代替プロモーター使用スコアを使用して、患者の予後を決定するステップ
を含む、方法が提供される。

【0009】

別の態様では、がんに罹患している患者をＩＣＩ療法から除外するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、１又は２以上の参照サンプルの代替プロモーター使用スコアを超える代替プロモーター使用スコアであり、代替プロモーター使用スコアが、各代替プロモーター部位で差次的に発現される代替プロモーターの合計である、バイオマーカーが提供される。

【0010】

定義
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、メジャープロモーター、マイナープロモーター、又は代替プロモーターであってもよい。メジャープロモーターは、遺伝子の転写に最も頻繁に使用されるプロモーターである。

【0011】

本明細書で使用される場合、「代替のプロモーター（alternatepromoter）」及び「代
替プロモーター（alternative promoter）」という用語は、メジャープロモーター又はマイナープロモーターよりも代替転写開始部位で遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。

【0012】

本明細書で使用される「獲得プロモーター（gained promoter）」という用語は、非が
ん性生物学的サンプルと比較して、がん性生物学的サンプルにおいて、獲得されるか、又は増大した活性を持つプロモーターを指す。獲得プロモーターは、非がん性生物学的サンプルには存在しないがん性生物学的サンプル中のプロモーターであり得る。獲得プロモーターは、非がん性生物学的サンプル中のプロモーターと比較して、増大したプロモーター活性を持つがん性生物学的サンプル中のプロモーターであり得る。

【0013】

本明細書で使用される「喪失プロモーター（lost promoter）」という用語は、非がん
性生物学的サンプルと比較して、がん性生物学的サンプルにおいて喪失されたか、又は低下した活性を持つプロモーターを指す。喪失プロモーターは、非がん性生物学的サンプルには存在するが、がん性生物学的サンプルには存在しないプロモーターであり得る。喪失プロモーターは、非がん性生物学的サンプル中のプロモーターと比較して低下したプロモ
ーター活性を有するがん性生物学的サンプル中のプロモーターであり得る。

【0014】

がんの文脈における「免疫療法」という用語は、がんを治療するための免疫系の調節を伴う治療の一形態を指す。免疫系の調節は、免疫系の活性化又は不活性化を伴う可能性がある。これは、抗体、サイトカイン、及びワクチンなどの免疫系の成分の使用を伴い得る。

【0015】

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害療法」という用語は、免疫系の主要な調節因子を標的とするがん免疫療法の一形態を指す。あるタイプのがん細胞及び免疫細胞によって作られたある特定のタンパク質は、免疫応答の抑制に役立ち、Ｔ細胞ががん細胞を死滅させるのを抑えることができる。ある特定のがん細胞は、これらのタンパク質を使用して免疫監視を回避する。「免疫チェックポイント阻害療法」という用語は、これらのタンパク質を遮断する因子の使用を含む療法を指し、免疫系機能を回復して、Ｔ細胞が効果的な抗腫瘍応答を開始できるようにする。

【0016】

本出願の目的のための「予後」という用語は、臨床状態又は疾患の予想される経過及び転帰の予測を指す。「予後」という用語は、状態の経過又は転帰を１００％の精度で予測する能力を指すものではない。その代わり、「予後」という用語は、所定の状態を示す対象において、所定の状態を示さない個体と比較した場合に、ある特定の経過又は転帰が生じる確率を指す。「予後」は、１又は２以上の臨床転帰、例えば、対象における疾患の進行速度、疾患の重症度、生存率、生存時間、転移の可能性、疾患の再発の可能性、又は治療的介入への応答などに関してなされる可能性がある。

【0017】

本出願の目的のための「エピジェネティック」という用語は、個体のＤＮＡ配列を変更することなく遺伝子発現を調節する変化を指す。エピジェネティックな変化の例は、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾及びＲＮＡ関連サイレンシングである。エピジェネティックな変化は、遺伝子発現の制御を介して疾患発症に重要な役割を果たす。

【0018】

本明細書の文脈における「バイオマーカー」という用語は、生物学的状態又は疾患の測定可能な指標を指す。バイオマーカーには、体の組織や体液で測定できる物質、構造、又はプロセスが含まれるが、これらに限定されない。

【0019】

本明細書で使用される場合、「代替のプロモーター使用スコア（alternate promoter usagescore）」及び「代替プロモーター使用スコア（alternative promoter usagescore）」という用語は、代替プロモーター利用の尺度を指す。スコアは、「ＡＰ」スコア又は「ＡＰＢ」スコアとして表すことができる。ＡＰ_高及びＡＰ_低の文脈における「ＡＰ」という用語は、代替のプロモーター利用を指す。ＡＰ_高スコアは代替プロモーター利用率が高いことを示し、ＡＰ_低スコアは代替プロモーター利用率が低いことを示す。ＡＰＢ_高及びＡＰＢ_低の文脈での「ＡＰＢ」という用語は、代替のプロモーター利用負担を指す。ＡＰＢ_高スコアは代替プロモーター利用率が高いことを示し、ＡＰＢ_低スコアは代替プロモーター利用率が低いことを示す。

【図面の簡単な説明】

【0020】

本発明は、非限定的な例及び添付の図面と併せて考慮される場合、詳細な説明を参照することで、よりよく理解されるであろう。

【図1】３３の腫瘍タイプにわたる代替のプロモーター利用負担（ＡＰＢスコア）を示す図である。ＡＰＢスコアは、３３の腫瘍タイプにわたる１０，３９３サンプルで計算された。各ポイントは、サンプルのＡＰＢスコアを表す（ｙ軸）。腫瘍タイプはｘ軸上で、それぞれの腫瘍タイプのＡＰＢスコアの中央値が最も低いものから最も高いものの順序となっている。赤い横棒は腫瘍の中央値ＡＰＢスコアであり、緑の横棒は対応する正常組織の中央値ＡＰＢスコアを表す（少なくとも１０個の正常サンプルが分析に利用できる場合のみを条件として）。８０センタイルカットオフが示されているが、これは、サンプルをＡＰＢ_高グループ及びＡＰＢ_低グループに二分するための最も理想的なカットポイントであることが見出されたためである。

【図2A】～

【図2C】胃がんにおける代替のプロモーターの利用を示す図である（発見コホート、n=24）。特に、（Ａ）は、ニボルマブ又はペムブロリズマブで治療された患者の発見コホートにおける、代替のプロモーター利用のヒートマップを示している。全ての腫瘍の中央値レベルと比較して４倍より高い発現レベルを有する転写物、及び以前に同定された獲得代替プロモーター部位へのマッピングは、獲得代替プロモーター（ヒートマップにおいて赤色で記す）とみなされた。全ての腫瘍の中央値レベルと比較して４倍より低い発現レベルを有する転写物、及び以前に同定された喪失代替プロモーター部位へのマッピングは、喪失代替プロモーター（ヒートマップにおいて青色で記す）とみなされた。（Ｂ）は、ＡＰ_{高（ｄｉｓｃ）}グループ対ＡＰ_{低（ｄｉｓｃ）}グループの間のＴ細胞免疫相関との関連を示す。ＡＰ_{高（ｄｉｓｃ）}グループを赤色、ＡＰ_{低（ｄｉｓｃ）}グループのものを青色で示す。Ｔ細胞マーカーＣＤ８Ａ（P=0.059）及びＴ細胞細胞溶解マーカーＧＺＭＡ（P=0.025）及びＰＲＦ１（P=0.011）の発現が図示される。ＡＰ_{高（ｄｉｓｃ）}グループは、免疫マーカーのより低い発現を示す。（Ｃ）は、発見コホートにおけるＡＰ_高グループ対ＡＰ_低グループを比較した無増悪生存期間のカプランマイヤー曲線を示す。

【図3A】～

【図3D】胃がんにおける代替のプロモーター利用を示す図である（ペムブロリズマブ試験コホート、n=37）。特に、（Ａ）は代替のプロモーター利用のヒートマップを示す。全ての腫瘍の中央値レベルと比較して４倍より高い発現レベルを有する転写物、及び以前に同定された獲得代替プロモーター部位へのマッピングは、獲得代替プロモーター（ヒートマップにおいて赤色で記す）とみなされた。全ての腫瘍の中央値レベルと比較して０．２５倍より低い発現レベル有する転写物、及び以前に同定された喪失代替プロモーター部位へのマッピングは、喪失代替プロモーター（ヒートマップにおいて青色で記す）とみなされた。（Ｂ）は代替プロモーター利用スコアのグラフを示す。代替プロモーター利用スコアは、各サンプル中の獲得及び喪失代替プロモーターの合計として計算される。高い代替のプロモーター利用は、６６センタイルを超えるものとして定義された。（Ｃ）は、ＡＰ_高グループ対ＡＰ_低グループの間のＴ細胞免疫相関との関連を示す。ＡＰ_高グループを赤色、ＡＰ_低グループのものを青色で示す。Ｔ細胞マーカーＣＤ８Ａ（P=0.0037）及びＴ細胞細胞溶解マーカーＧＺＭＡ（P=0.0055）及びＰＲＦ１（P=0.016）の発現が図示される。ＡＰ_高グループは、免疫マーカーのより低い発現を示す。（Ｄ）は、ＡＰ_高（赤）及びＡＰ_低（青）サブグループに従ったペムブロリズマブへの応答のウォーターフォールプロットである。Ｙ軸は、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準に従って評価された最大腫瘍減少の百分率を表す。

【図4A】～

【図4C】代替のプロモーター利用に基づく生存曲線を示す図である。特に、（Ａ）は、ＡＰ_高グループ対ＡＰ_低グループを比較した無増悪生存期間のカプランマイヤー曲線を示す。（Ｂ）は、ｘ軸が各患者のペムブロリズマブ療法の期間を表すスイマープロットを示す。ＡＰ_高（赤）及びＡＰ_低（青）のサブグループが図示される。（Ｃ）は、ＡＰ_高グループ対ＡＰ_低グループで分割されたＴＣＧＡサブタイプを比較した無増悪生存期間のカプランマイヤー曲線を示す。

【図5-1】～

【図5-2】ＡＰＢスコアアルゴリズムのバイオインフォマティクスワークフローを示す図である。胃がん（２７３２領域）において同定された体細胞プロモーター領域（獲得及び喪失）は、ＴＣＧＡ（１１３，０７６プロモーター）からの汎がん分析で同定された全てのプロモーターに対してマッピングされる。全体で、４６７２個のプロモーターが選択され、相対的プロモーター活性がＡＰＢスコアの計算に使用された。腫瘍は、ＡＰＢスコアの８０センタイルでＡＰＢ_高及びＡＰＢ_低に二分される。

【図6A】～

【図6B】ＡＰＢスコアグループと細胞溶解性Ｔ細胞活性のマーカーの相関関係を示す図である。特に、（Ａ）は、ＡＰＢ_高グループ対ＡＰＢ_低グループ（全ての腫瘍サンプル、汎がん）の間とＴ細胞免疫相関の関連を示している。腫瘍は、ＡＰＢスコアの８０センタイルでＡＰＢ_高とＡＰＢ_低に二分された。ＡＰＢ_高グループを赤色、ＡＰＢ_低グループのものを青色で示す。Ｔ細胞マーカーＣＤ８Ａ及びＴ細胞細胞溶解マーカーＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の発現を図示する。ＡＰＢ_高グループは、免疫マーカーのより低い発現を示す（ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ、及びＰＲＦ１についてのウィルコクソン検定 p<0.0001（^＊＊＊））。（Ｂ）は、ＡＰＢ_高グループ対ＡＰＢ_低グループの間とＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ、及びＰＲＦ１との関連を、選択された腫瘍タイプ：膀胱がん（ＢＬＣＡ，bladder cancer）、乳がん（ＢＲＣＡ，breast cancer）、子宮頸部扁平上皮癌（ＣＥＳＣ，cervical squamous cell carcinoma）、食道がん（ＥＳＣＡ，esophagealcarcinoma）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ，head and neck squamous cell carcinoma）、肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ，liver hepatocellular carcinoma）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ，lungsquamous cell carcinoma）、卵巣がん（ＯＶ，ovarian cancer）及び胃腺癌（ＳＴＡＤ，stomach adenocarincoma）について示す。ＡＰＢ_高グループを赤色、ＡＰＢ_低グループのものを青色で記す。（^＊＊＊＝p<0.0001、^＊＊＝p<0.001、^＊＝p<0.01、ＮＳ＝p>0.05、ウィルコクソン検定）。

【図7】免疫遺伝子を強調するＡＰＢスコアグループにおける差次的遺伝子発現を示す図である。ＡＰＢ_高及びＡＰＢ_低と相関する免疫遺伝子のこのボルケーノプロットでは、ｘ軸はＡＰＢ_高とＡＰＢ_低との間の遺伝子発現（ＲＳＥＭ）のｌｏｇ_２倍変化（ｌｏｇ_２ＦＣ）である。ｙ軸は－log₁₀調整ｐ値の結果である（ボンフェローニ補正）。ｌｏｇ_２ＦＣ＞１及び調整ｐ値＜０．０５として定義される重要な遺伝子は、赤い点で表される。上位の遺伝子（ｌｏｇ_２ＦＣ＞１．３及び－ｌｏｇ_１０調整ｐ値＞２００）が標識される。

【図8】ＡＰＢスコアグループと他の免疫相関との関連を示す図である。特に、図は、ＡＰＢ_高及びＡＰＢ_低と相関するＰａｎＣａｎＡｔｌａｓにおける約２０，０００個の遺伝子のボルケーノプロットを示す。ｘ軸は、ＡＰＢ_高とＡＰＢ_低との間の遺伝子発現（ＲＳＥＭ）のlog₂倍変化（ｌｏｇ_２ＦＣ）である。ｙ軸は－log₁₀調整ｐ値の結果である（ボンフェローニ補正）。免疫遺伝子は赤い点で表される。全体的な遺伝子発現の均等な分割が、両方のグループ間で見られ、ＡＰＢ_高グループは免疫遺伝子の過少発現の偏りが見られる。

【図9】リンパ球浸潤シグネチャースコアとＡＰＢスコアの相関関係を示す図である。リンパ球浸潤シグネチャーは、ＡＰＢスコアグループによって二分される。ＡＰＢ_低グループは、ＡＰＢ_高と比較して統計的により高いスコアを持つ（ウィルコクソン検定 p<0.0001）。

【図10】ＩＦＮ－γ応答シグネチャーとＡＰＢスコアの相関関係を示す図である。ＡＰＢスコアグループによって二分されることにより定義されたＩＦＮ－γ応答シグネチャー。ＡＰＢ_低グループは、ＡＰＢ_高と比較して統計的により高いスコアを持つ（ウィルコクソン検定 p<0.0001）。

【図11】ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ、ＰＲＦ１との相関により選択された１９個の腫瘍タイプにおける、ＡＰＢスコアとペムブロリズマブの客観的応答率（ＯＲＲ，objective response rate）の相関を示す図である。公開された試験において説明されるように、ｘ軸は腫瘍タイプ毎の中央値ＡＰＢスコアであり、ｙ軸は単剤ペムブロリズマブを用いた腫瘍タイプのＯＲＲである。円のサイズは、ＯＲＲ評価のために選択された臨床試験で治療された患者数に対応する。円の色は、ＡＰＢスコアの評価に使用されるＴＣＧＡコホート内のサンプル数に対応している。ＣＯＡＤには、ＣＯＡＤ及び結腸直腸がん（ＲＥＡＤ，colon and rectal cancer）の両方が含まれる。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＩ）療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして、がんに罹患している患者を同定する方法であって、
ａ）患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）代替プロモーター使用スコアを使用して、ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして患者を同定するステップ
を含む、方法を指す。

【0022】

がん性生物学的サンプルは、新鮮な、凍結された、固定された、又は保存されたサンプルであり得ることが、当業者には一般的に理解されるであろう。

【0023】

一実施形態では、がんに罹患している患者は、ＩＣＩ療法を受けたか、又は受けている。好ましい実施形態では、がんに罹患している患者は、ＩＣＩ療法を受けていない。

【0024】

がん性生物学的サンプルは、癌腫、肉腫、及び黒色腫を含むがこれらに限定されない、１又は２以上のがんと診断された患者から採取してもよい。生物学的サンプルは、細胞、組織、又は体液のサンプルであり得る。

【0025】

いくつかの実施形態では、がん性生物学的サンプルは、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、乳房浸潤癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、胆管癌、結腸腺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、多形神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、腎臓嫌色素性細胞、腎臓腎明細胞癌、腎臓腎乳頭細胞癌、急性骨髄性白血病、脳低悪性度神経膠腫、肝臓肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性嚢胞腺癌、膵臓腺癌、褐色細胞腫及び傍神経節腫、前立腺腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃腺癌、精巣胚細胞腫、甲状腺癌、胸腺腫、子宮体部子宮内膜癌、子宮癌肉腫、ブドウ膜黒色腫、肛門がん並びにそれらの組合せを含むがこれらに限定されない１又は２以上のがんに罹患している患者から採取することができる。

【0026】

一実施形態では、がんは固形がんである。別の実施形態では、固形がんは胃腸がんである。さらに別の実施形態では、胃腸がんは胃がんである。さらに別の実施形態では、胃がんは、染色体的に不安定な（ＣＩＮ，chromosomally unstable）及び／又はゲノム的に安定な（ＧＳ，genomicallystable）サブタイプのものである。さらに別の実施形態では、胃がんは転移性胃がんである。

【0027】

いくつかの実施形態では、事前選択マーカーは、１又は２以上の核酸分子である。核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びゲノムＤＮＡからなる群から選択される。事前選択マーカーは、１若しくは２以上の遺伝子又は１若しくは２以上の転写物であり得る。いくつかの実施形態では、事前選択マーカーは、１又は２以上のペプチドである。別の実施形態では、ペプチドは、翻訳後修飾されたペプチドである。

【0028】

一実施形態では、事前選択マーカーは、がん性生物学的サンプル中の体細胞プロモーター領域に関連するマーカーである。好ましい実施形態では、がん性生物学的サンプルは胃がんサンプルである。

【0029】

本明細書に記載のがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルは、全トランスクリプトーム配列決定（ＷＴＳ，whole transcriptome sequencing）、ナノストリング分析、ＲＮＡ配列決定、及びそれらの組合せからなる群から選択される方法を使用して測定され得る。

【0030】

代替プロモーターの使用が、異なる転写開始部位での転写の開始を可能にすることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、代替プロモーターの使用は、遺伝子発現レベルの変化及び／又は変化したｍＲＮＡ転写物及びタンパク質アイソフォームの産生の発生を含む、様々な方法での遺伝子発現に影響を及ぼし得る。

【0031】

一実施形態では、がん性生物学的サンプル中の１又は２以上の前記事前選択マーカーの発現レベルを、１又は２以上の参照サンプル中の前記１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルと比較することによって、本明細書に記載の差次的に発現される代替プロモーターを同定して、がん性生物学的サンプルと１又は２以上の参照サンプルとの間の事前選択マーカーの発現レベルの増加又は減少を決定する。１若しくは２以上の遺伝子、転写物又はペプチドであり得る事前選択マーカーの発現レベルが、プロモーターによって調節され得、したがってプロモーターの活性の指標となることは、当業者に理解されるであろう。

【0032】

がん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを、１又は２以上の参照サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルと比較することによって、差次的に発現される代替プロモーターを同定することができる。

【0033】

一実施形態では、獲得プロモーターについて、１又は２以上の参照サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルと比較した、がん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルの増加は、差次的に発現される代替プロモーターを示す。

【0034】

別の実施形態では、喪失プロモーターについて、１又は２以上の参照サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルと比較した、がん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルの減少は、差次的に発現される代替プロモーターを示す。

【0035】

差次的に発現される代替プロモーターは、様々な方法で同定され得る。一実施形態では、本明細書に記載の差次的に発現される代替プロモーターは、腫瘍サンプルのパネル内のプロモーターの転写物の中央値発現レベルと比較した場合、転写物の発現レベルで少なくとも４倍の増加を伴う獲得プロモーターによって同定される。別の実施形態では、本明細書に記載の差次的に発現される代替プロモーターは、腫瘍サンプルのパネル内のプロモーターの転写物の中央値発現レベルと比較した場合、転写物の発現レベルで０．２５倍未満であるか又は少なくとも４倍の低減である、喪失プロモーターによって同定される。一実施形態では、各プロモーターの転写物の中央値発現レベルは、腫瘍サンプルのパネル内の全てのサンプルにわたるプロモーターの中央値発現レベルである。

【0036】

別の実施形態では、本明細書に記載の差次的に発現される代替プロモーターは、腫瘍サンプルのパネルの中央値プロモーター活性よりも大きい相対的プロモーター活性を有する獲得プロモーターによって同定される。別の実施形態では、本明細書に記載される差次的に発現される代替プロモーターは、腫瘍サンプルのパネルの中央値プロモーター活性よりも低い相対的プロモーター活性を有する喪失プロモーターによって同定される。一実施形態では、各プロモーターの転写物の中央値発現レベルは、腫瘍サンプルのパネル内の全て
のサンプルにわたるプロモーターの中央値発現レベルである。

【0037】

一実施形態では、獲得プロモーターは、非がん性生物学的サンプルと比較して、がん性生物学的サンプルにおいて獲得されたか、又は増加した活性を有するプロモーターである。獲得プロモーターは、非がん性生物学的サンプルに存在しないがん性生物学的サンプル中のプロモーターであるか、又は非がん性生物学的サンプル中のプロモーターと比較して、増加したプロモーター活性を有するがん性生物学的サンプル中のプロモーターであってもよい。

【0038】

別の実施形態では、喪失プロモーターは、非がん性生物学的サンプルと比較して、がん性生物学的サンプルにおいて喪失されたか、又は低下した活性を有するプロモーターである。喪失プロモーターは、非がん性生物学的サンプルには存在するが、がん性生物学的サンプルには存在しないプロモーターであるか、又は非がん性生物学的サンプルのプロモーターと比較して、低下したプロモーター活性を有するがん性生物学的サンプル中のプロモーターであってもよい。

【0039】

本明細書に記載される差次的に発現される代替プロモーターの同定の後、代替プロモーター使用スコアがその後、計算される。一実施形態では、代替プロモーター使用スコアは、ＡＰスコアであってもよい。別の実施形態では、代替プロモーター使用スコアは、ＡＰＢスコアであってもよい。代替プロモーター使用スコアは、本明細書に記載される差次的に発現される代替プロモーターの合計を決定することによって計算されてもよい。

【0040】

代替プロモーター使用スコアは、ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして、がんに罹患している患者を同定する方法において使用されてもよい。ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして、がんに罹患している患者を同定する方法は、本明細書に記載の代替プロモーター使用スコアを参照スコアと比較して、ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして患者を同定するステップをさらに含んでもよい。

【0041】

一実施形態では、参照スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの中央値、三分位値、又は四分位値でのスコアである。別の実施形態では、参照スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０パーセンタイルのスコアである。好ましい実施形態では、参照スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの６６又は８０パーセンタイルのスコアであってもよい。

【0042】

好ましい実施形態では、参照スコアは絶対スコアである。絶対スコアは、患者の代替プロモータースコアと比較される固定及び非可変スコアである。

【0043】

一実施形態では、参照スコアと比較して増加した代替プロモーター使用スコアは、ＩＣＩ療法から利益を受けないものとして患者を同定する。一実施形態では、増加した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの６６パーセンタイルを超えるスコアである。別の実施形態では、増加した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの８０パーセンタイルを超えるスコアである。

【0044】

別の実施形態では、参照スコアと比較して減少した代替プロモーター使用スコアは、患者をＩＣＩ療法から利益を受けるものとして同定する。一実施形態では、減少した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの６６パーセンタイル未満のスコアである。一実施形態では、減少した代替プロモータ
ー使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの８０パーセンタイル未満のスコアである。

【0045】

一態様では、本発明は、ＩＣＩ療法を受けているか、又は受けた患者の予後を決定する方法であって、
ａ）患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）代替プロモーター使用スコアを使用して、患者の予後を決定するステップ
を含む、方法を提供する。

【0046】

一実施形態では、本明細書に記載のＩＣＩ療法を受けているか、又は受けた患者の予後を決定する方法は、本明細書に記載の代替プロモーター使用スコアを参照スコアと比較して、患者の予後を決定するステップをさらに含み、参照スコアと比較して増加した代替プロモーター使用スコアが、より悪い予後を示す。

【0047】

一実施形態では、増加した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの６６パーセンタイルを超えるスコアである。別の実施形態では、増加した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの８０パーセンタイルを超えるスコアである。

【0048】

別の実施形態では、本明細書に記載のＩＣＩ療法を受けているか、又は受けた患者の予後を決定する方法は、本明細書に記載の代替プロモーター使用スコアを参照スコアと比較して、患者の予後を決定するステップをさらに含み、参照スコアと比較して減少した代替プロモーター使用スコアが、より良好な予後を示す。

【0049】

一実施形態では、減少した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの６６パーセンタイル未満のスコアである。別の実施形態では、減少した代替プロモーター使用スコアは、１又は２以上の参照サンプルからの代替プロモーター使用スコアの８０パーセンタイル未満のスコアである。

【0050】

別の態様では、本発明は、がんに罹患している患者をＩＣＩ療法から除外するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、１又は２以上の参照サンプルの代替プロモーター使用スコアを超える代替プロモーター使用スコアであり、代替プロモーター使用スコアが、各代替プロモーター部位で差次的に発現される代替プロモーターの合計である、バイオマーカーを提供する。

【0051】

一実施形態では、本発明は、ＩＣＩ療法についてがんに罹患している患者を除外するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、１又は２以上の参照サンプルの代替プロモーター使用スコアの６６パーセンタイルを超える代替プロモーター使用スコアであり、代替プロモーター使用スコアが、各代替プロモーター部位で差次的に発現される代替プロモーターの合計である、バイオマーカーを提供する。

【0052】

別の実施形態では、本発明は、ＩＣＩ療法についてがんに罹患している患者を選択するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、１又は２以上の参照サンプルの代替プロモーター使用スコアの６６パーセンタイル未満の代替プロモーター使用スコアであり、代替プロモーター使用スコアが、各代替プロモーター部位で差次的に発現される代替プロモーターの合計である、バイオマーカーを提供する。

【0053】

別の態様では、本発明は、がんに罹患している患者をＩＣＩ療法から除外するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、１又は２以上の参照サンプルの代替プロモーター使用スコアの８０パーセンタイルを超える代替プロモーター使用スコアであり、代替プロモーター使用スコアが、各代替プロモーター部位で差次的に発現される代替プロモーターの合計である、バイオマーカーを提供する。

【0054】

別の実施形態では、本発明は、ＩＣＩ療法についてがんに罹患している患者を選択するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、１又は２以上の参照サンプルの代替プロモーター使用スコアの８０パーセンタイル未満の代替プロモーター使用スコアであり、代替プロモーター使用スコアが、各代替プロモーター部位で差次的に発現される代替プロモーターの合計である、バイオマーカーを提供する。

【0055】

１又は２以上の参照サンプルは、１又は２以上の異なる患者から得られた１又は２以上の腫瘍サンプル、１又は２以上の異なる患者から得られた１又は２以上の非がん性サンプル、同じ患者から得られた１又は２以上の非がん性サンプル及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。一実施形態では、同じ患者から得られた１又は２以上の非がん性サンプルは、がん性組織に隣接する組織である。これらの参照サンプルの複数の組合せが、本発明の方法において使用され得ることは、当業者により理解されるであろう。

【0056】

別の態様では、本発明は、がんに罹患している患者を、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）療法を用いて治療するべきでないか否かを決定する方法であって、
ａ）患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）代替プロモーター使用スコアを使用して、ＩＣＩ療法から利益を受けないものとして患者を同定するステップ；
ｅ）患者がＩＣＩ療法から利益を受けないものと同定された場合、代替療法を用いて前記患者を治療するステップ
を含む、方法を指す。

【0057】

別の態様では、本発明は、がんに罹患している患者を治療する方法であって、
ａ）患者から得られたがん性生物学的サンプル中の１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルを測定するステップ；
ｂ）ステップ（ａ）で測定された１又は２以上の事前選択マーカーの発現レベルに基づいて、差次的に発現される代替プロモーターを同定するステップ；
ｃ）代替プロモーター使用スコアを計算するステップ；
ｄ）代替プロモーター使用スコアを使用して、ＩＣＩ療法から利益を受けるか、又は利益を受けないものとして患者を同定するステップ；
ｅ）ステップ（ｄ）に従ってＩＣＩ療法から利益を受けるものと同定された患者を、免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療するか、又はステップ（ｄ）に従ってＩＣＩ療法から利益を受けないものと同定された患者を、代替療法を用いて治療するステップ
を含む、方法を指す。

【0058】

一実施形態では、ＩＣＩ療法は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、シンチリマブ、カムレリズマブ及びチスレリズマブを含み得るが、これらに限定されない。

【0059】

別の実施形態では、代替療法は、がんを治療するために適したＩＣＩ療法以外の任意の療法である。例えば、代替療法には、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、外科手術、ホルモン療法、及び標的療法が含まれ得る。標的療法には、腫瘍増殖及び進行に必要な特異的分子を妨害する薬物の使用が含まれる。代替療法には、ＩＣＩ療法を受けている患者におけるＩＣＩ療法を中止することもまた含まれ得る。

【0060】

本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は複数の要素、制限又は複数の制限の非存在下で、適切に実践することができる。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、広範で限定されないように読まれる。さらに、本明細書で
用いられる用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語や表現の使用において、図示及び説明された特徴の任意の等価物又はその一部を除外する意図はないが、特許請求された発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明を、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書に開示され、本明細書に具体化される本発明の修正及び変形は、当業者が頼りとすることができ、そのような修正及び変形は、本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。

【0061】

本発明は、本明細書において広範及び一般的に記載されている。一般的な開示の範囲に入る各々のより狭い種及び亜属系列もまた、本発明の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書に特定的に記載されているか否かに関わらず、属から任意の主題を除去する但し書き又は否定的限定を伴う本発明の一般的な説明が含まれる。

【0062】

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例の範囲内である。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、本発明が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても説明されることを認識するであろう。

【0063】

実験の部
本発明の非限定的な例及び比較例は、特定の実施例を参照することによってさらに詳細に説明されるが、これらは、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0064】

材料及び方法
この研究においては、腫瘍バイオマーカーの検証のためのＲＥＭＡＲＫ基準に従った。

【0065】

臨床コホート
発見コホート
韓国のソウルのサムスン医療センターでニボルマブ又はペムブロリズマブ治療を用いて治療された転移性胃がんの継続患者がこのコホートに含まれた。ＩＣＩは、少なくとも１つの細胞毒性レジメンに失敗した患者の救済治療として投与された。ニボルマブ３ｍｇ／ｋｇは、２週間毎に１時間の注入として投与され、ペムブロリズマブ２００ｍｇは、疾患が進行するか、又は毒性が許容できなくなるまで、３週間毎に３０分の静脈内注入として投与された。倫理的承認を得て、全ての患者から書面によるインフォームドコンセントが提供された後に、原発腫瘍からのアーカイブ腫瘍組織標本が収集され、将来を見越して生存データを追跡した。

【0066】

ペムブロリズマブ試験コホート
白金／フルオロピリミジンを含む少なくとも１つの系統の化学療法に失敗し、組織学的に証明された転移性及び／又は再発性胃腺癌を有する患者が、この研究に登録された。試
験はヘルシンキ宣言と良好臨床基準ガイドライン（ClinicalTrials.gov識別子：ＮＣＴ＃０２５８９４９６）とに従って実行された。試験プロトコールは、サムスン医療センター（ソウル、韓国）の施設内審査委員会によって承認され、全ての患者は登録前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。ペムブロリズマブ２００ｍｇを、疾患の進行、許容できない毒性が記録されるまで、又は最大２４か月まで、３週間毎に３０分の静脈内注入として投与した。腫瘍応答は、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準に従って２サイクル毎に評価された。

【0067】

ナノストリング分析
ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒリポーターコードセットは、８０の再発性体細胞代替のプロモーター関連遺伝子、並びに腫瘍内細胞溶解活性（ＣＹＴ，intra-tumoural cytolytic activity）、サイトカイン、及び免疫チェックポイントに対応する免疫関連遺伝子
のために設計された。標準的及び代替のプロモーター駆動転写物の発現を測定するために、各遺伝子に対して少なくとも２つのプローブが設計された。未変更のＨ３Ｋ４ｍｅ３でマークされた５’転写物の標準プローブ、及び体細胞プロモーターの５’転写物の代替プローブ。データ分析は、ベンダー提供のｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェア（ｎＳｏｌｖｅｒ）を使用して行われた。生カウントは、各コードセットに含まれる内部陽性対照プローブの幾何学的平均を使用して正規化された。

【0068】

ＲＮＡ配列決定
腫瘍組織は、研究治療の開始前の－４２日目から１日目の間に得られた。徹底的な病理学的レビュー後、腫瘍含有量が４０％を超えると推定された場合、QIAampミニキット（Qiagen社製、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の使用説明書に従って使用して新たに得られた組織から腫瘍ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出した。濃度並びに２６０／２８０及び２６０／２３０ｎｍ比は、ND1000分光光度計（Nanodrop Technologies社製、Thermo-Fisher Scientific社製、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて測定し、その後、Qubit蛍光計（Life Technologies社製、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＤＮＡ／ＲＮＡをさらに定量化した。

【0069】

ＲＮＡトランスクリプトミック分析
ＲＮＡｓｅｑデータは、ＴｏｐＨａｔを使用してＧＥＮＣＯＤＥ ｖ１９転写物アノテーションに整列され、ＦＰＫＭ存在量測定値は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを使用して生成された。次に、転写物は全てのサンプルにわたって融合され、Ｃｕｆｆｎｏｒｍを使用して正規化された。代替プロモーター関連発現を分析するために、ＲＮＡｓｅｑリードは、エピゲノムプロファイリングによって以前に同定されたゲノム位置に対してマッピングされた。次に、これらのエピゲノムで定義されたプロモーター領域へのＲＮＡｓｅｑマッピングを定量化し、プロモーターの長さ及びライブラリーのサイズにより正規化した。最後に、各プロモーター部位での発現の倍数変化を、全ての腫瘍サンプルにわたる各腫瘍と中央値発現レベルとの間で計算した。

【0070】

ＰＤＬ１免疫組織化学分析、ＭＳＩ状態、ＥＢＶ状態、ＴＣＧＡサブタイピング及び腫瘍変異量は、転移性胃がんにおける単剤ペムブロリズマブの第ＩＩ相研究に使用される分類に基づいていた。

【0071】

統計分析
臨床病理学的特徴の組織学的細分類への関連は、フィッシャーの直接検定を使用して実行された。無増悪生存期間（ＰＦＳ，progression-free survival）は、ペムブロリズマ
ブの初回投与時から疾患の進行又は死亡時まで計算され、全生存期間（ＯＳ，overall survival）は、ペムブロリズマブ又はニボルマブの初回投与時から死亡時まで計算された。カプランマイヤー（ＫＭ，kaplan-meier）曲線及びログランク検定を生存分析に使用した。ハザード比（ＨＲ，hazard ratio）及びその９５％信頼区間（ＣＩ，confidence inter
val）は、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを使用して各分析で評価された。全ての分析は
Ｒ（３．４．１）を使用して行われた。検証コホートでは、６６パーセンタイルを超える代替のプロモーター使用スコアを有するサンプルは、高い代替のプロモーター使用率（ＡＰ_高）と定義され、残りは低い代替のプロモーター使用率（ＡＰ_低）と定義された。

【0072】

ＰＤＬ１免疫化学
ＰＤＬ１免疫組織化学は、Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDxキット（Agilent Technologies社製）を使用して実行された。ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現は、ＰＤ－Ｌ１染色細胞（腫
瘍細胞、リンパ球、マクロファージ）の数を生存腫瘍細胞の総数で割った値を１００倍した、ＣＰＳを使用して決定した。

【0073】

ＭＳＩ状態
腫瘍組織のＭＳＩ状態は、ＭＬＨ１及びＭＳＨ２のＩＨＣと、モノヌクレオチド反復を伴う５つのマーカーのＰＣＲ分析の両方によって決定された。

【0074】

ＥＢＶ状態サブタイプ
ＥＢＶ状態は、ＥＢＶにコードされた小ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）インサイツハイブリダイゼーションによって決定された。

【0075】

腫瘍変異量
変異負荷（Mutational load）は、全エクソーム配列決定分析から決定された。対象の
変異負荷は、全てのフィルターを通過した体細胞の非同義ＳＮＶ数として定義された。体細胞変異には、変異効果予測因子の注釈が付けられた。変異負荷は、腫瘍エクソームデータ内の非同義ＳＮＶ数として計算された。組織のＭＬ－Ｈ閾値は、上部三分位数として設定された。

【0076】

ＴＧＣＡサブタイプの定義
ＴＣＧＡによって定義された胃がんサブタイプは、ＤＮＡゲノム変化に基づいていた。これらのグループには、ＥＢＶ（＋）、ＭＳＩ－Ｈ、ＣＩＮ、及びＣＩＮを欠き、びまん性の組織学的サブタイプが非常に豊富なゲノム安定性腫瘍が含まれていた。ＣＩＮ、ＥＢＶ（－）の代理として、ＭＳＳ腫瘍は、ＣＩＮ及びそれらのＴＰ５３状態に基づいたゲノム安定に階層化された。変異シグネチャー分析は、ＲのdeconstructSigsパッケージ（ｖ
１．６．０）を使用して実行された。

【0077】

データセット
プロモーター活性は、３３個の腫瘍タイプにわたる１０３９３個のサンプル（９６６８個の腫瘍及び７２５個の正常サンプル）からなるＴＣＧＡのＰａｎＣａｎＡｔｌａｓから入手可能なＲＮＡ－Ｓｅｑデータから推測された。

【0078】

ＡＰＢスコアアルゴリズム
胃がんにおける最初のエピジェネティックプロモーター変化研究は、２７３２個の体細胞プロモーター領域（２０５３個の獲得及び６７９個の喪失）を同定し、これらのアイソフォームのトランスクリプトミック発現を使用して、ＡＰＢスコアアルゴリズムを作成した。

【0079】

ＴＣＧＡデータについては、ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ１９アノテーションを使用して、一連のプロモーターを決定した。各ＴＳＳの重複する第１エクソンを組み合わせて、一連のプロモーターを取得した。次に、各プロモーターの活性を、構成転写物の第１イントロンにアラインするジャンクションリードを使用して定量化した。次に、全ジャンクションリードカウントがデータセット全体にわたって正規化された。log₂変換された正規化されたリ
ードカウントは、さらなる下流分析のプロモーター活性に使用された。遺伝子発現の推定値は、遺伝子毎の各プロモーター活性を合計することによって取得された。次に、各プロモーター活性を遺伝子発現によって正規化して、相対プロモーター活性を取得した。合計で、１１３，０７６個のプロモーターが同定された。

【0080】

次に、胃がんで同定された体細胞プロモーター領域を、この一連の１１３，０７６個のプロモーターから選択した。４６７２個のプロモーター（獲得領域で３２６３、喪失領域で１４０９）は、胃がんで同定された２７３２個の体細胞プロモーター領域内に位置していた。これらの４６７２個のプロモーターのうち、全ての腫瘍サンプル（n=9668）にわたる全てのプロモーターの中央値相対プロモーター活性を計算した。全てのサンプルについて、ＡＰＢスコアは、相対プロモーター活性が中央値よりも大きい獲得プロモーター及び相対プロモーター活性が中央値よりも小さい喪失プロモーターの数として計算された（図１）。様々なセンタイル（centile）カットオフ（１０、２０、３０…、９０）でのＡＰ
Ｂスコアを使用して、腫瘍をＡＰＢ_高とＡＰＢ_低とに二分した。８０センタイルは、ＡＰＢ_高及びＡＰＢ_低グループとの理想的カットオフとして決定され、さらなる下流分析に使用された。正常サンプルは、正常組織を含む分析のためにコホートに加えられたのみであり、中央値スコア及びカットオフの計算には使用されなかった。

【0081】

免疫相関
ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の転写発現レベル、並びに免疫チェックポイント、様々な免疫細胞型のマーカー、適応性及び先天性免疫応答に関連する遺伝子並びに抗原を含む７００を超える遺伝子の選択が選択され、Broad GDAC FirehoseからのＴＣＧＡデータ
セットから抽出された。免疫サブタイプ、他の免疫シグネチャー、及びＴＭＢは、汎がん免疫ランドスケープ分析から抽出された。検閲データを含む無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）は、汎がん免疫ランドスケープ分析から抽出された。

【0082】

免疫チェックポイント阻害剤の臨床データ
免疫チェックポイント阻害剤を含む臨床試験からのデータは急速に拡大しており、薬物は単剤として、及び他の治療法と組み合わせて試験されている。ペムブロリズマブは依然として、臨床試験データが報告されている腫瘍タイプの最も広いスペクトルにわたって試験されている免疫チェックポイント阻害剤である。したがって、単剤ペムブロリズマブ試験の広範な文献レビューが行われ、各腫瘍タイプについて報告された最大の研究が選択された。次に、これらの試験からの客観的応答率（ＯＲＲ）を、各腫瘍タイプのＡＰＢスコアと相関させた。ＴＭＢは汎がん免疫ランドスケープ分析から抽出され、ＰＤ－Ｌ１転写物の発現はBroad GDAC Firehoseから抽出された。

【0083】

統計分析
ウィルコクソン順位和検定を使用して、ＡＰＢ_高及びＡＰＢ_低グループ間でＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の発現レベルを比較した。「Ｒｔｓｎｅ」Ｒパッケージを使用して、Ｔ－ＳＮＥプロットを生成した。ＡＰＢスコアとペムブロリズマブのＯＲＲとの相関関係にピアソンの試験を使用した。カプランマイヤー（ＫＭ）曲線及びログランク検定を生存分析に使用した。ハザード比（ＨＲ）及びその９５％信頼区間は、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを使用して各分析で評価された。Reactome PathwayDatabaseを使用して、体
細胞プロモーター遺伝子機能のネットワークマッピングを行った。Ｒ（３．５．２）を使用して、全ての分析を行った。

【0084】

ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用したプロモーター活性推定の検証
ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用したプロモーター活性推定の精度は、公開データセットで利用可能なＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ及びＣＡＧＥタグデータなどの他の「ゴールドスタンダード」測定に対するベンチマークによって検証された。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３レベルはＲ
ＮＡ－Ｓｅｑプロモーター活性と強く相関しており、エピジェネティックベース及び転写物ベースのプロモーター活性推定が一致していることを示唆している（クラスカル・ワリス p<0.001）。調査結果はＣＡＧＥ－Ｔａｇデータで確認され、より高いＣＡＧＥ－Ｔ
ａｇサポートを持つＲＮＡ－Ｓｅｑに、ユニークなプロモーターが同定された。

【0085】

本アルゴリズムはまた、ＲＮＡ－Ｓｅｑ定量化及び第１エクソンリードカウントで利用される他のバイオインフォマティック法と比較された。本アルゴリズムでは、これらのアルゴリズムと同様の結果が、高いレベルの相関で得られた（ピアソンの相関係数>0.85）
。全体として、この分析は、ＲＮＡ－Ｓｅｑデータからのプロモーター活性の定量的で堅牢で再現性のある推定が、本発明者らのアプローチにより可能であることを実証している。

【実施例0086】

転移性胃がんにおける代替のプロモーター利用
第１のコホートは、ニボルマブ及びペムブロリズマブで治療された２４人の転移性胃がん患者からなった（２９人の対象が最初に含まれ、２４人の腫瘍サンプルがナノストリング分析のための十分な組織の品質管理に合格した）。カスタマイズされたナノストリングパネルを使用して、標準又は代替のプロモーターのいずれかに関連する転写物を測定した。差次的に発現される代替プロモーターは、全てのサンプルの中央値にわたって、発現レベルの＜０．２５ｘ倍変化（喪失体細胞プロモーターについて）又は＞４ｘ倍変化（獲得体細胞プロモーターについて）を示すプロモーター部位として定義された。このアルゴリズムを使用して、腫瘍の３分の１（８／２４）が１０％を超える部位（＞８／８０）で高い代替のプロモーター利用率を示したことが見出された。このグループはＡＰ_高と定義され、残りはＡＰ_低と定義された（図２Ａ）。

【0087】

細胞溶解性Ｔ細胞活性の測定は、ＣＤ８Ａ（ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球）、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）及びパーフォリン１（ＰＲＦ１）の発現を研究することによって以前に記載されていた。ＡＰ_低グループは、ＡＰ_高グループと比較した場合、ＧＺＭＡ（P=0.025）、ＰＲＦ１（P=0.011）、及びＣＤ８Ａ（P=0.059）の発現の有意な増加を実証し、Ａ
Ｐ_低グループにおける細胞毒性Ｔ細胞活性の増加を示唆している（図２Ｂ）。これらの発見は、早期胃がんにおいて記載された以前の結果と一致しており、転移性胃がんにおける代替のプロモーター利用もまた、抗腫瘍免疫に逆相関することを示している。特に、このコホートのサンプルサイズが小さく、治療レジメンが不均一で、試験に基づかない性質があるにもかかわらず、ＡＰ_高腫瘍の患者はＡＰ_低腫瘍の患者と比較して無増悪生存期間（ＰＦＳ）が悪い傾向があった。（１２９日対３８９日、ＨＲ １．９６ ９５％ ＣＩ：０．５５～６．９３、P=0.29、図２Ｃ）。これらの知見に基づいて、均一に治療された患者の別のコホートで、この仮説をさらに試験した。

【実施例0088】

ペムブロリズマブ治療での応答及び生存の予測因子としての代替のプロモーター利用
第２のコホートについては、前述の第ＩＩ相研究からのトランスクリプトミックデータが使用された。治療前の生検サンプルからのトランスクリプトミックデータ及びマッチした臨床データが、３７人の対象で利用可能であり、分析用に使用された。年齢の中央値は５７歳で、７３％が男性（N=27）、４人（１１％）がＥＢＶ陽性、４人がＭＳＩ（１１％）で、残りはＣＩＮ又はＧＳ ＴＣＧＡサブタイプとして定義された。治療法に対する完全又は部分的応答が、１１人の対象で見られた（３０％）。胃がんで以前に同定された２７３２個の体細胞代替のプロモーター部位を使用して［１０］、第１のコホートと同様に差次的に発現される代替プロモーターを定義した（既知の体細胞喪失プロモーターについては＜０．２５ｘ倍の変化、既知の体細胞獲得プロモーターについては＞４ｘ倍の変化）。特に、代替のプロモーター利用の評価についてＲＮＡｓｅｑとナノストリングプラット
フォームとの間の良好な一致が、以前に示されている。各サンプルで差次的に発現される部位の合計を計算して、代替のプロモーター使用スコアを定義した（図３Ａ）。スコアは３７から４２６（中央値１３６）の範囲であった（図３Ｂ）。カットオフポイントの案内のために、第１のコホートからのデータを使用し、ＡＰ_高グループを＞６６センタイル（n=13）のサンプルとして定義し、ＡＰ_低を残りのサンプルとして構成した。

【0089】

ＡＰ_高グループは、ＡＰ_低グループと比較して、年齢、性別、又は組織学的サブタイプについて、臨床病理学的特徴に統計的有意な差がなかった。ＴＣＧＡサブタイプ、変異負荷、及びＰＤＬ１ ＣＰＳスコアの間でも２つのグループ間で差異は検出されなかった（表１）。ＡＰ_低グループは、ＡＰ_高グループと比較した場合、ＣＤ８Ａ（P=0.0037）、ＧＺＭＡ（P=0.0055）、及びＰＲＦ１（P=0.016）の発現の有意な増加を実証し、ＡＰ_低グ
ループにおける細胞毒性Ｔ細胞活性の増加を示唆している（図３Ｃ）。治療法に対する部分的又は完全な応答のいずれかとして定義される客観的応答率（ＯＲＲ）は、ＡＰ_高グループと比較して、ＡＰ_低グループでより高かった（１０／２４対１／１３、P=0.03）（図３Ｄ）。注目すべきことに、ＡＰ_高グループでは、唯一の応答はＭＳＩサブタイプ腫瘍においてであった。無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値はＡＰ_高グループで５５日であったのに対し、ＡＰ_低グループでは１８０日であった（ログランクP=0.0076）（図４Ａ、５Ｂ）。ＡＰ_低グループには１７％ＥＢＶ（n=4）及び１２％ＭＳＩ（n=3）ＴＣＧＡサブタイプサンプルがあったが、ＡＰ_高グループは８％ＭＳＩ（n=1）のみがあって、ＥＢＶサン
プルはなかった（図４Ｃ）。以前に示したように、様々なＴＣＧＡサブタイプ間のＰＦＳは異なっており（P=0.0026）、ＭＳＩ及びＥＢＶサブタイプは生存期間が有意に長かった（４９１日（ＭＳＩ／ＥＢＶ）対８０日（ＣＩＮ／ＧＳ））。特に、ＣＩＮ／ＧＳサブタイプの中で、ＰＦＳはＡＰ_低グループとＡＰ_高グループとの間でも統計的に有意に異なっていた（４８日（ＣＩＮ／ＧＳ ＡＰ_高）対１６１日（ＣＩＮ／ＧＳ ＡＰ_低）、P=0.0019）（図４Ｄ）。予備的な全生存期間データに基づくと、ＡＰ_低グループで生存率が改善する傾向が見られた（３４０日対２９２日、P=0.16）。臨床病理学的及び代替のプロモーター利用の多変量解析により、ペムブロリズマブでのＰＦＳの独立予測因子としての高い代替のプロモーター利用が明らかになった（ＨＲ ０．２９、（９５％ＣＩ ０．０９９～０．８５）、P=0.024）（表２）。

【0090】

【表1】

^*3つのサンプルには、免疫組織化学によるPDL1 CPSスコアリングに使用できる組織がなく、全てがAP_低グループからのものであった。

【0091】

【表2】