特開 2024-17227 神経突起伸長促進剤およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024017227

(43)【公開日】2024-02-08

(54)【発明の名称】神経突起伸長促進剤およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/085 20060101AFI20240201BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240201BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240201BHJP

   A61K 36/9068 20060101ALI20240201BHJP

【ＦＩ】

A61K31/085

A61P25/00

A61P25/28

A61P25/16

A61K36/9068

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022119734

(22)【出願日】2022-07-27

(71)【出願人】

【識別番号】591193037

【氏名又は名称】辻製油株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(74)【代理人】

【識別番号】100174090

【弁理士】

【氏名又は名称】和気 光

(74)【代理人】

【識別番号】100205383

【弁理士】

【氏名又は名称】寺本 諭史

(74)【代理人】

【識別番号】100224661

【弁理士】

【氏名又は名称】牧内 直征

(74)【代理人】

【識別番号】100100251

【弁理士】

【氏名又は名称】和気 操

(72)【発明者】

【氏名】籠谷 和弘

(72)【発明者】

【氏名】辻 威彦

(72)【発明者】

【氏名】島田 康人

(72)【発明者】

【氏名】太田 瑞穂

(72)【発明者】

【氏名】臧 黎清

(72)【発明者】

【氏名】勝崎 裕隆

(72)【発明者】

【氏名】西村 訓弘

【テーマコード（参考）】

4C088

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C088AB81

4C088AC11

4C088BA08

4C088CA09

4C088MA02

4C088NA14

4C088ZA02

4C088ZA16

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA27

4C206KA01

4C206KA17

4C206KA18

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA02

4C206ZA16

(57)【要約】

【課題】神経変性疾患の予防および／または治療などに有効となり得る新規な神経突起伸長促進剤およびその製造方法を提供する。
【解決手段】本神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオールを有効成分として含有し、該６－ジンゲルジオールは、側鎖のＣ３およびＣ５の位置における立体異性体である、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体を含み、更に、神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオール以外に、ショウガに含まれる成分を含む。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

６－ジンゲルジオールを有効成分として含有することを特徴とする神経突起伸長促進剤。

【請求項2】

前記神経突起伸長促進剤は、前記６－ジンゲルジオール以外に、ショウガに含まれる成分を含むことを特徴とする請求項１記載の神経突起伸長促進剤。

【請求項3】

前記神経突起伸長促進剤に含まれる前記６－ジンゲルジオールが、ショウガ抽出物由来であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の神経突起伸長促進剤。

【請求項4】

前記６－ジンゲルジオールは、側鎖のＣ３およびＣ５の位置における立体異性体である、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体を含むことを特徴とする請求項１または請求項２記載の神経突起伸長促進剤。

【請求項5】

神経突起伸長促進剤の製造方法であって、
前記神経突起伸長促進剤が、ショウガ抽出物由来である６－ジンゲルジオールを有効成分として含有し、前記６－ジンゲルジオールは、ノルマルヘキサンを用いてショウガ抽出物を抽出した後、該ショウガ抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、アセトンとエタノールの混合溶媒で溶出して得られることを特徴とする神経突起伸長促進剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経突起伸長促進剤およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などに代表される神経変性疾患は、系統的な神経細胞の変性、脱落に基づく神経回路網の破綻により引き起こされる病態とされている。神経変性疾患の原因である神経変性死のメカニズムには多くの分子群が複雑に関与しており、未だ未解明な部分も多い。

【0003】

例えば、アルツハイマー病は、脳の中にアミロイドβという蛋白質が溜まり、正常な脳の神経細胞を壊して脳を萎縮させる病気である。現状行われているアルツハイマー病の治療は、症状を改善させる対症療法的な位置付けに留まっており、原因自体を取り除く原因療法までには至っていない。

【0004】

一方、神経変性疾患の治療においては、原因を取り除くことに加えて、神経回路網を再構築することも重要とされている。例えば、アルツハイマー病では、変性を免れて生き残っている神経細胞や部分変性した神経細胞を活性化して、神経突起を伸長させ、シナプスを回復できれば、神経機能を回復できるといわれている。ここで、神経細胞（ニューロン）は、核のある細胞体と、細胞体から伸びた神経突起で構成される。神経突起には、細胞体から木の枝のように分岐した樹状突起と、細胞体から通常１本だけ延びる突起である軸索とがある。樹状突起は、他の細胞からの情報を神経細胞が受け取る部分であり、軸索は、神経細胞が受けた情報を他の細胞へと出力する部分である。樹状突起で受け取った情報は細胞体に集約され、軸索を介して他の細胞へ神経伝達物資を放出することで情報が伝達される。

【0005】

そのため、神経変性疾患の治療や予防のための薬剤開発では、神経細胞の神経突起の伸長に着目した研究が行われている。例えば、特許文献１には、構成脂肪酸の少なくとも一つ以上が不飽和脂肪酸であるホスファチジン酸を有効成分とする神経突起伸長促進剤が記載されている。また、特許文献２には、シキミ酸またはその塩を含む神経突起伸張剤が記載されている。

【0006】

ところで、ショウガは、世界中で香辛料および民間薬として広く用いられている。漢方では生姜（ショウキョウ）と呼ばれ、新陳代謝機能向上の効能があるとされ、嘔吐、鎮痛、食欲増進などに用いられている。ショウガに含まれる成分の薬理活性については、これまで種々の研究が行われている。例えば、特許文献３では、ショウガの辛み成分である６－ジンゲロールおよび６－ショウガオールを含む、ショウガの抽出物が骨形成促進作用および骨吸収抑制作用を有することが報告されている。

【0007】

しかしながら、ショウガに含まれる特定の成分の神経突起伸長促進作用に関する報告はなされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００９－２８０５２４号公報

【特許文献2】特開２０１８－０３５０７８号公報

【特許文献3】特開２０１４－４３４１６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、新規な神経突起伸長促進剤およびその製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオール（６－ｇｉｎｇｅｒｄｉｏｌ）を有効成分として含有することを特徴とする。

【0011】

上記神経突起伸長促進剤は、上記６－ジンゲルジオール以外に、ショウガに含まれる成分を含むことを特徴とする。

【0012】

上記神経突起伸長促進剤に含まれる上記６－ジンゲルジオールが、ショウガ抽出物由来であることを特徴とする。更に、上記６－ジンゲルジオール以外に、ショウガに含まれる成分もショウガ抽出物由来であることを特徴とする。

【0013】

上記６－ジンゲルジオールは、側鎖のＣ３およびＣ５の位置における立体異性体（ジアステレオマー）である、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体を含むことを特徴とする。

【0014】

本発明の神経突起伸長促進剤の製造方法は、上記神経突起伸長促進剤が、ショウガ抽出物由来である６－ジンゲルジオールを有効成分として含有し、上記６－ジンゲルジオールは、ノルマルヘキサンを用いてショウガ抽出物を抽出した後、該ショウガ抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、アセトンとエタノールの混合溶媒で溶出して得られることを特徴とする。

【発明の効果】

【0015】

本発明の神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオールを有効成分として含有するので、優れた神経突起の伸長促進作用を示し、例えば、神経変性疾患の予防および／または治療に有効である。また、６－ジンゲルジオールは、ショウガに含まれる成分であることから生体に対する安全性が高く、上記神経突起伸長促進剤は安全性に優れる。

【0016】

本発明の神経突起伸長促進剤の製造方法は、神経突起伸長促進剤が、ショウガ由来である６－ジンゲルジオールを有効成分として含有し、６－ジンゲルジオールは、ノルマルヘキサンを用いてショウガ抽出物を抽出した後、該ショウガ抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、アセトンとエタノールの混合溶媒で溶出して得られるので、簡易な操作で得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ショウガ搾り滓のノルマルヘキサン抽出物のＨＰＬＣである。

【図2】画分１～画分７の神経突起の伸長促進作用の評価結果である。

【図3】画分６Ａ～６Ｄの神経突起の伸長促進作用の評価結果である。

【図4】画分６ＢのＨＰＬＣである。

【図5】画分６ＢのＬＣ／ＭＳ分析結果を示す図である。

【図6】６－ジンゲルジオールのＬＣ／ＭＳ分析結果を示す図である。

【図7】６－ジンゲルジオールの神経突起の伸長促進作用の評価結果である。

【図8】Ｍａｐ２タンパク質の検出画像を示す図である。

【図9】ゼブラフィッシュの学習試験における試験装置の概要図である。

【図10】ゼブラフィッシュの学習試験における回避率の評価結果である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明者らは、これまでにショウガに含まれる成分についての研究を行っている。今回、神経細胞の神経突起の伸長促進作用について鋭意検討を行ったところ、ショウガに含まれる成分として希少な成分である６－ジンゲルジオールを含有する画分が、顕著な伸長促進作用を有することを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。

【0019】

本発明の神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオールを有効成分として含む。本発明において、神経突起伸長促進剤とは、神経細胞の神経突起の伸長を促進する剤である。なお、神経突起は、軸索と樹状突起を包括する概念であり、神経突起伸長促進剤は、軸索および／または樹状突起を伸長させる作用を有する。

【0020】

６－ジンゲルジオールは、下記の式（１）で表される化合物である。

【0021】

【化1】

【0022】

上記の式（１）に示すように、６－ジンゲルジオールは、側鎖のＣ３およびＣ５の位置に水酸基を有している。６－ジンゲルジオールは、Ｃ３およびＣ５の位置における立体異性体として、（３Ｒ，５Ｓ）体、（３Ｓ，５Ｓ）体、（３Ｒ，５Ｒ）体、（３Ｓ，５Ｒ）体がある。本発明において、６－ジンゲルジオールは、これらの立体異性体を包括する概念である。

【0023】

６－ジンゲルジオールは、化学合成によって得ることができる。例えば、６－ジンゲロール（６－ｇｉｎｇｅｒｏｌ）を出発原料として、６－ジンゲロールの側鎖のＣ３のカルボニル基を還元することで６－ジンゲルジオールを得ることができる。

【0024】

また、６－ジンゲルジオールは、天然物から抽出して分離する方法（抽出法）によっても得ることができる。６－ジンゲルジオールを天然物から抽出する場合には、それらを含有する植物の全体または一部分（例えば、全草、葉、根、根茎、茎、根皮、もしくは花）をそのまま用いて、または簡単に加工処理（例えば、乾燥、切断、もしくは粉末化）したもの（例えば、生薬）を用いて抽出する。

【0025】

本発明では、天然物として、熱帯アジアを原産とするショウガ科の多年草であるショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）の根茎を用いることができる。抽出物を得るための原料としては、生鮮ショウガ、乾燥ショウガ、およびこれらの加工品が挙げられるが、６－ジンゲルジオールは乾燥させると生成が阻害されやすい（乾燥させると６－ジンゲロールが脱水して６－ショウガオールが生成される）ことから、原料としては生鮮ショウガを用いることが好ましい。例えば、飲料などに利用するための搾汁液を搾汁された搾り滓を好ましく利用できる。特に、この搾り滓は未利用資源として廃棄されていたものであり、その有効利用が図れる。

【0026】

ショウガの抽出方法としては、有機溶媒抽出、有機溶媒と水との混合溶媒抽出、超臨界抽出が挙げられる。有機溶媒としては、亜酸化窒素、アセトン、エタノール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸エチル、酢酸メチル、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，２－テトラフルオロエタン、１，１，２－トリクロロエテン、二酸化炭素、１－ブタノール、２－ブタノール、ブタン、１－プロパノール、２－プロパノール、プロパン、プロピレングリコール、ノルマルヘキサン、水、メタノールなどが挙げられる。これらの中で抽出溶媒として油脂食品製造への使用が認められているノルマルヘキサンがショウガ搾り滓から後述する低温抽出に用いる溶媒として好ましい。

【0027】

上記抽出法において、６－ジンゲルジオールは、固相吸着剤などによってショウガ抽出物から分離されることが好ましい。固相吸着剤としては、シリカゲルが好ましく、一般に市販されているものを用いることができる。また、シリカゲルの平均粒子径は、例えば５μｍ～５００μｍを用いることができる。

【0028】

シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行う場合、溶出溶媒には、溶媒同士が分離せず、かつシリカゲルに非可逆的に吸着されない溶媒ならば、いずれも使用できる。溶出溶媒として、例えば、ノルマルヘキサン、アセトン、エタノール、エチルメチルケトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、シクロヘキサンなどを用いることができる。溶出溶媒には１種のみを用いてもよく、また２種以上を混合した混合溶媒として用いてもよい。

【0029】

ショウガ抽出物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって６－ジンゲルジオールを分離する手順の一例を以下に示す。ショウガ抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した後、まず、ノルマルヘキサンのみ（ノルマルヘキサン１００％）で所定時間溶出させる。その後、ノルマルヘキサンとアセトンからなる混合溶媒（混合溶媒の割合は体積比で、例えばノルマルヘキサン：アセトン＝（９８：２～７０：３０）であり、ノルマルヘキサン：アセトン＝（９８：２～８０：２０）が好ましく、（９８：２～８５：１５）がより好ましい）で所定時間溶出させる。そして、アセトンとエタノールからなる混合溶媒（混合溶媒の割合は体積比で、例えばアセトン：エタノール＝（８０：２０～２０：８０）であり、アセトン：エタノール＝（７０：３０～３０：７０）が好ましい）で所定時間溶出させることで、６－ジンゲルジオールを得ることができる。

【0030】

混合溶媒を用いた溶出では、高極性側の溶媒の割合を段階的または連続的に増やすグラジエント溶出を行ってもよい。上記のように、溶出溶媒の極性を段階的または連続的に上げていくことで、ショウガ抽出物に含まれる主な成分（各種ジンゲロール、各種ショウガオール、テルペン類化合物など）と６－ジンゲルジオールを分離して得ることができる。６－ジンゲルジオールは、これらの主な成分に比べて高極性の化合物である。

【0031】

なお、抽出法で６－ジンゲルジオールを得る場合、６－ジンゲルジオールとして、単離または精製された状態でないもの（粗抽出物）を用いてもよい。

【0032】

本発明の神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオール以外に、ショウガに含まれる成分を含んでいてもよい。６－ジンゲルジオール以外のショウガに含まれる成分としては、例えば、６－ジンゲロール、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、６－ジンゲルジオンなどが挙げられる。これらの成分は、ショウガ由来成分であってもよい。例えば、６－ジンゲルジオールを抽出法によって得る場合、本発明の神経突起伸長促進剤には、６－ジンゲルジオールに加え、他のショウガ由来成分が含まれ得る。

【0033】

一方、神経細胞へのダメージなどの観点から、神経突起伸長促進剤は、ショウガに含まれる成分としてショウガオール類（例えば、６－ショウガオール）は含まないことが好ましい。ショウガオール類には、６－ショウガオール、８－ショウガオール、１０－ショウガオールが含まれる。

【0034】

神経突起伸長促進剤の一形態として、６－ジンゲルジオールは、側鎖のＣ３およびＣ５の位置における立体異性体である、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体を含む。この形態において、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体の合計モル％は、６－ジンゲルジオールの総モル数（１００モル％）に対して、５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、８０モル％以上であることがさらに好ましい。

【0035】

また、神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオールとして、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体のうち、一方の立体異性体を含むようにしてもよい。

【0036】

本発明の神経突起伸長促進剤は、例えば、上述した抽出法の手順に従って製造することができる。具体的には、ショウガの根茎より得られたショウガ抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで溶出・分離し、所定の画分を濃縮して溶媒を除去することで得られる。得られた分画物は、そのまま用いることができる。また、適宜な溶媒に希釈して用いてもよく、さらに、吸着素材を用いて粉末状へ加工したり、ペースト状にして用いてもよい。

【0037】

本発明の神経突起伸長促進剤は、医薬品もしくは食品として、または医薬品もしくは食品に配合する素材として使用可能である。食品としては、神経変性疾患、認知症などの予防・改善や、記憶力の改善、学習機能の改善などを謳った、または表示した保健機能食品（特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品）などとして使用可能である。

【0038】

本発明の神経突起伸長促進剤を食品として用いる場合の形態としては、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料などの各種食品などが挙げられる。種々の形態の食品を調製するには、本発明の神経突起伸長促進剤を単独で、または他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤などと適宜組み合わせて用いることができる。

【0039】

後述の実施例で示すように、６－ジンゲルジオールは神経突起の伸長促進作用を有することから、薬剤として有用である。具体的には、アルツハイマー病や、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の予防・治療剤として使用され得る。

【0040】

６－ジンゲルジオールを有効成分とする薬剤は、その使用目的に合わせて投与方法、剤型、投与量などを適宜決定することができる。薬剤の剤型としては、特に限定されないが、例えば、液剤、ローション剤、乳剤、軟膏剤、クリーム剤などの外用剤、錠剤、液剤、粉末剤などの経口剤、注射剤などが挙げられる。上記薬剤は、製剤の分野で一般的に用いられている公知の製造方法により製造される。上記薬剤には、必要に応じて、製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、甘味剤、懸濁化剤、乳化剤、保存剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、粘稠剤、安定剤などの添加剤を適宜、配合させることができる。

【0041】

また、本発明の神経突起伸長促進剤は、神経細胞の分化用試薬としても使用できる。後述の実施例で示すように、ラット副腎髄質褐色腫由来ＰＣ１２細胞の神経細胞への分化には、ＮＧＦ（神経成長因子）を加えずに、神経突起伸長促進剤を使用することで効果的に分化を促進することができる。

【実施例0042】

ショウガ原料として、搾汁液を搾汁されたショウガの搾り滓（含水率約７５質量％）を準備した。この搾り滓６０ｋｇを－１０℃以下に冷凍した。この冷凍原料を、体積で約２倍量のノルマルヘキサン（抽出溶媒）を加え、攪拌して破砕を行った後、０℃以下で１５分間浸漬した。その後、ノルマルヘキサン溶液（層）を回収し、これを遠心薄膜濃縮装置および減圧蒸留装置を用いて、室温以下の温度でノルマルヘキサンを除去した。得られたショウガ抽出物は、ショウガをすりおろした後の爽やかな香気と、ショウガ特有の辛み成分とを有する褐色透明な油溶性液体であった。

【0043】

得られたショウガ抽出物の成分を高速液体クロマトグラフィー（以下、高速液体クロマトグラムを含めて、ＨＰＬＣという）法により分析した。ＨＰＬＣの測定条件は、カラムがＷａｋｏｓｉｌ ｌｌ－５Ｃ１８ＨＧ φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍであり、移動相が含水アセトニトリルであり、３０体積％アセトニトリルから９０体積％アセトニトリルグラジエント（０－２０分）、さらに９０体積％アセトニトリルから３０体積％アセトニトリルグラジエント（２０－４０分）であり、検出器は２２８ｎｍの紫外吸光度検出器（カラム温度４０℃）を用いた。移動相の流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。上記ＨＰＬＣの結果を図１に示す。

【0044】

図１に示すように、上記ショウガ抽出物には、主な成分として、辛み成分である６－ジンゲロール、モノテルペンであるネラール、ネラールの異性体であるゲラニアール、８－ジンゲロール、６－ショウガオール、１０－ジンゲロール、ジンギベレンなどが含まれている。なお、これらの成分がショウガ抽出物中の成分の大半を占めている。

【0045】

次に、上記ショウガ抽出物中の各成分を分離するため、シリカゲルオープンカラム（相互理化学硝子製作所製、φ２０×３００ｍｍ）による分取を行った。溶出液としては、最初にノルマルヘキサン単独からスタートし、その後、ノルマルヘキサンおよびアセトンの混合溶媒に変更し、アセトン比率を徐々に高め混合溶媒の極性を上げていき、更に、アセトンおよびエタノールの混合溶媒で溶出した後、最終的にエタノール単独でショウガ抽出物を溶出した。溶出溶媒ごとに採取して、合計で７画分を分取した。溶出条件の詳細を表１に示す。

【0046】

【表1】

【0047】

上記ショウガ抽出物（ＧＨＥ）をノルマルヘキサンにて平衡化したシリカゲルカラムに供した。表１に示すように、ノルマルヘキサン単独で溶出させて画分１を採取し、ノルマルヘキサン：アセトン＝（９６：４）で溶出させて画分２を採取し、ノルマルヘキサン：アセトン＝（９３：７）で溶出させて画分３を採取し、ノルマルヘキサン：アセトン＝（８８：１２）で溶出させて画分４を採取し、ノルマルヘキサン：アセトン＝（８５：１５）で溶出させて画分５を採取し、アセトン：エタノール＝（５０：５０）で溶出させて画分６を採取し、エタノール単独で溶出させて画分７を採取した。得られた各画分を、それぞれ濃縮して試験用分画物を得た。

【0048】

上記で得られた各分画物（画分１～画分７）を用いて、神経細胞のモデルとされる副腎髄質褐色腫由来ＰＣ１２細胞に処理を行い、神経突起の伸長を評価した。

【0049】

＜ラット副腎髄質褐色腫由来ＰＣ１２細胞の培養＞
ＰＣ１２細胞は、コラーゲンＩＶ（コーニング社製）をコーティングした８ウェルマルチウェルプレート（ｉｂｉｄｉ社製）にて培養した。前培養は１０％馬血清・５％仔牛血清・５０単位／ｍＬペニシリン・５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で２４時間培養した。神経細胞への分化誘導は、１％馬血清・５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に置換することにより開始した。ショウガ抽出物から得たそれぞれの画分を誘導開始時に培地に懸濁し投与した。各画分を１０ｕｇ／ｍＬの終濃度で加え、３７℃、５％ＣＯ_２下で７日間培養を行った。なお、陽性コントロールとしてはＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）刺激を行った。

【0050】

＜神経突起伸長を認めたＰＣ１２細胞の数の計測＞
神経突起がその細胞長より長くなったものを神経細胞への分化が誘導されたと判断した（参考文献：ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１１、６（１１）、ｅ２８２８０）。実際の測定は、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフト（アメリカ国立衛生研究所）を用いて行った。撮影した視野における全細胞数に対する神経突起進展を認めた細胞数の割合（％）で、分化誘導の程度を算出した。図２（ａ）に各画分の撮影画像を示し、図２（ｂ）に各画分において神経突起進展を認めた細胞数の割合を示す。

【0051】

図２に示すように、画分６（アセトン：エタノール＝（５０：５０）で溶出したもの）に、神経突起の伸長促進作用が確認された。一方、残りの画分では、神経突起の伸長促進作用は確認されなかった。なお、陽性コントロールであるＮＧＦ刺激の場合、神経突起の伸長が認められた。

【0052】

次に、画分６の更なる分析を行った。画分６を細分画するべく、アセトン：エタノール＝（５０：５０）で溶出した順に、画分６Ａ、画分６Ｂ、画分６Ｃ、画分６Ｄを得た。これらの各画分を、それぞれ濃縮して試験用分画物を得た。

【0053】

上記で得られた各分画物（画分６Ａ～画分６Ｄ）を用いて、神経突起の伸長促進作用を評価した。ＰＣ１２細胞の培養および神経突起伸長を認めたＰＣ１２細胞の割合の算出は、上述の方法で実施した。図３（ａ）に各画分の撮影画像を示し、図３（ｂ）に各画分において神経突起進展を認めた細胞数の割合を示す。

【0054】

図３に示すように、画分６Ｂのみに神経突起の伸長促進作用が顕著に認められた。

【0055】

神経突起の伸長が促進されるメカニズムには、ＮＧＦ受容体を介した経路や細胞内ｃＡＭＰ増加によるＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＡあるいはＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃの活性化、そして最終的には転写制御因子であるサイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化による活性化を介した神経細胞特異的遺伝子群の発現誘導が知られている（上記参考文献参照）。図３の結果は、画分６Ｂに含まれる成分が、このような因子を活性化することで、神経突起の伸長促進作用を示したと考えられる。

【0056】

また、画分６Ｂの収率は、シリカゲルカラムに供したショウガ抽出物の量に対して約７％であった。更に、画分６Ｂから活性炭処理を行った画分は、１／１０以下であり、この脱色処理した画分６Ｂの収率は全体に対して約０．４％であった。

【0057】

図４に示すように、画分６ＢのＨＰＬＣにおいて、ＲＴ１５－１６ｍｉｎ付近とＲＴ２９－３０ｍｉｎ付近に特異的なピークＰａ、Ｐｂが検出された。一方、他の画分には、これらのピークが検出されなかった。画分６Ｂに含まれる特異なピークの成分の同定を行ったところ、ピークＰａが６－ジンゲルジオールであり、ピークＰｂが１０－ショウガオールであることが分かった。なお、画分６Ｂの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析では、クルクミンより極性が低い化合物が含まれることを確認しており、当該化合物がラジカル消去能を有する抗酸化化合物であったことから、これが１０－ショウガオールであると考えられる。

【0058】

画分６Ｂについて、下記の条件でＬＣ／ＭＳ分析を行った。
＜液体クロマトグラフィー条件＞
分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１００Ｖ（２ｍｍ ｉ．ｄ．×７５ｍｍ、３μｍ）
カラム温度：４０℃
移動相 ：含水メタノール（１０体積％メタノールから１００体積％メタノールグラジエント（０－１０分）
流速 ：０．２ｍＬ/ｍｉｎ
検出波長 ：２１０ｎｍ、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ

【0059】

図５に示すように、画分６Ｂに含まれる６－ジンゲルジオールは、（３Ｒ，５Ｓ）体および（３Ｓ，５Ｓ）体の混合物であり、ＲＴ８．９７のピークが（３Ｒ，５Ｓ）体、ＲＴ９．１３のピークが（３Ｓ，５Ｓ）体であった。この分析結果は、６－ジンゲロールより化学合成で調製した６－ジンゲルジオールとの結果（図６参照）と一致した。

【0060】

また、化学合成した６－ジンゲルジオールおよび６－ジンゲロールを用いて、ＰＣ１２細胞における神経突起の伸長について、上記と同様に評価した。これらの化合物を、それぞれ１０ｕｇ／ｍＬの終濃度で加え、３７℃、５％ＣＯ_２下で７日間培養を行った。培養後のＰＣ１２細胞の撮影画像を図７に示す。図７より、６－ジンゲルジオールでは、多くの細胞で神経突起の伸長が確認された。一方、６－ジンゲロールでは、神経突起の伸長促進作用は確認されなかった。

【0061】

上記の試験結果より、ショウガに含まれる成分の中で希少成分である６－ジンゲルジオールが神経細胞の伸長促進作用を示すことが分かった。

【0062】

＜免疫蛍光染色法によるＭａｐ２タンパク質の検出＞
続いて、ＰＣ１２細胞を用いた上記試験において、ＰＣ１２細胞が神経細胞に分化したことを確認するべく、Ｍａｐ２タンパク質の検出を行った。Ｍａｐ２タンパク質は、脊椎動物の神経細胞に多く存在する、構造安定性を制御する微小管関連タンパク質である。成熟した神経細胞では、樹状突起と細胞体に特異的に局在することから、これらのマーカーとして使用されている。

【0063】

画分６Ｂや６－ジンゲルジオールを用いて、上記試験の手順と同様にＰＣ１２細胞を３７℃、５％ＣＯ_２下で７日間培養し、その後、４％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定した。細胞標本をブロッキングした後、発現しているＭａｐ２タンパク質をＭａｐ２抗体で一次検出を行い、次いで二次抗体（赤紫）で検出を行った。その後、核をＤＡＰＩ（青）で対比染色を行った。抗退色剤で標本を封入した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、イメージを撮影した（図８参照）。

【0064】

その結果、ＰＣ１２細胞において、画分６Ｂと６－ジンゲルジオールがＭａｐ２タンパク質の発現を増加させており、６－ジンゲルジオールが実際に神経細胞への分化誘導を促進させることが分かった。

【0065】

＜ゼブラフィッシュを用いた学習試験＞
次に、試験動物としてゼブラフィッシュを用いて、学習試験として能動的回避試験を行った。この試験では、図９に示す試験装置を用いた。試験装置は、２つの領域Ａ１、Ａ２に区切られた水槽を有している。これら２つの領域は、通路を介してゼブラフィッシュが自由に行き来できるように構成されている。水槽の両側面には、緑色または白色に発光するＬＥＤがそれぞれ設置され、各ＬＥＤによってそれぞれの領域が点灯される。また、領域を分けて電気刺激が与えられるように構成されている。

【0066】

まず、以下の１～３の操作を「１サイクル」とした。
１．１２秒間、緑色ＬＥＤを点灯する（光刺激のみ）。
２．１２秒間、緑色ＬＥＤの点灯領域に電気刺激を加え、白色ＬＥＤ点灯領域には電気刺激ない（緑色ＬＥＤは点灯したまま）。
３．１２秒間、両方のＬＥＤを白色点灯する（光刺激のみ）。

【0067】

また、上記１サイクルを１０サイクル行って１５分のインターバル期間（無刺激の期間）をおく操作を「１トライアル」とし、これを５トライアル実施した。このように一連の操作が繰り返し行われることによって、ゼブラフィッシュが学習し、光刺激の段階で次の電気刺激（緑色）を回避できる、つまり電気刺激の前に他方の領域に移動するようになる。試験では、［（回避した回数）／（試行数）］×１００を回避率として算出し、この回避率によって学習機能を評価した。具体的には、ゼブラフィッシュ１匹当たり、計５０回の試行を行い、回避した回数を５０で割り、１００を乗算して回避率とした。試験数はｎ＝８～１０匹とした。

【0068】

６－ジンゲルジオールを１２．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷで２日おきに３回腹腔内投与し、開始日（Ｓ）および１週間後（ｄａｙ７）に上記試験を行った。開始日の回避率を１００として、１週間後の回避率を算出した。結果を図１０に示す。

【0069】

図１０に示すように、６－ジンゲルジオールを投与した場合、回避率が顕著に向上した。６－ジンゲルジオールの神経突起の伸長促進作用によって、実際にゼブラフィッシュの学習機能が向上したと考えられる。

【0070】

ここで、ゼブラフィッシュの脳は、他の脊椎動物と比べて単純であるものの、その基本構造は、非常によく似ているとされており、前脳・中脳・後脳などの区別や、後脳が一連の節の構造からなっていることなど、哺乳類とも共通した特徴を有している。今回の結果は、６－ジンゲルジオールによる学習機能の向上がヒトにも期待できることを示唆している。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明の神経突起伸長促進剤は、６－ジンゲルジオールを含有することにより神経細胞の神経突起の伸長促進作用を有するので、神経変性疾患の予防および／または治療などに有効に用いることができる。また、６－ジンゲルジオールは、ショウガに含まれる成分であることから安全性も高く、新たな神経突起伸長促進剤として有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】