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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024172548
(43)【公開日】2024-12-12
(54)【発明の名称】デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系
(51)【国際特許分類】
C12N 15/70 20060101AFI20241205BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241205BHJP
【ＦＩ】
C12N15/70 Z
C12N1/21 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023090336
(22)【出願日】2023-05-31
(71)【出願人】
【識別番号】501061319
【氏名又は名称】学校法人 東洋大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(72)【発明者】
【氏名】鳴海 一成
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA56
(57)【要約】
【課題】
デイノコッカス・グランディスに対して発現プラスミドを安定的に導入および保持することができる、デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明により、主に、デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３または内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３および９１，２９１ｂｐの内在性プラスミドを除去することで改変したデイノコッカス・グランディス宿主細胞；デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；およびデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミドを含む宿主ベクター系が提供される。
【選択図】 なし
デイノコッカス・グランディスに対して発現プラスミドを安定的に導入および保持することができる、デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明により、主に、デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３または内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３および９１，２９１ｂｐの内在性プラスミドを除去することで改変したデイノコッカス・グランディス宿主細胞；デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；およびデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミドを含む宿主ベクター系が提供される。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デイノコッカス・グランディスの形質転換のための方法であって、以下の：
（１）デイノコッカス・グランディスから内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３または内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３および９１，２９１ｂｐの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬを除去して、遺伝子組換え微生物宿主細胞を得ること；
（２）以下のシャトルベクタープラスミドを構築すること：
ａ．上記（１）で除去されたｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；
ｂ．デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；または
ｃ．上記ａのシャトルベクタープラスミドおよび上記ｂのシャトルベクタープラスミドであって、ただしそれら２つのシャトルベクタープラスミドは、互いに異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記シャトルベクタープラスミド；
（３）以下の発現プラスミドを構築すること：
ａ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ａで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；
ｂ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｂで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；または
ｃ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｃで構築した各々のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし各々のシャトルベクタープラスミドに挿入される目的遺伝子が互いに異なる、前記発現プラスミド；
（４）上記（３）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５）上記（４）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、前記方法。
（１）デイノコッカス・グランディスから内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３または内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３および９１，２９１ｂｐの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬを除去して、遺伝子組換え微生物宿主細胞を得ること；
（２）以下のシャトルベクタープラスミドを構築すること：
ａ．上記（１）で除去されたｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；
ｂ．デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；または
ｃ．上記ａのシャトルベクタープラスミドおよび上記ｂのシャトルベクタープラスミドであって、ただしそれら２つのシャトルベクタープラスミドは、互いに異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記シャトルベクタープラスミド；
（３）以下の発現プラスミドを構築すること：
ａ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ａで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；
ｂ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｂで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；または
ｃ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｃで構築した各々のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし各々のシャトルベクタープラスミドに挿入される目的遺伝子が互いに異なる、前記発現プラスミド；
（４）上記（３）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５）上記（４）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記ａのシャトルベクタープラスミドに含まれるｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域が、ｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐに相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｂのシャトルベクタープラスミドに含まれるデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域が、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐに相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記（２）のシャトルベクタープラスミドが、さらにスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
さらに、
（３’）宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし該目的遺伝子が前記ａ’～ｃ’の目的遺伝子のいずれとも異なり、且つ、該シャトルベクタープラスミドが前記ａ’～ｃ’に含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域とは異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記発現プラスミドを構築すること；
（４’）上記（３’）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５’）上記（４’）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
（３’）宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし該目的遺伝子が前記ａ’～ｃ’の目的遺伝子のいずれとも異なり、且つ、該シャトルベクタープラスミドが前記ａ’～ｃ’に含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域とは異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記発現プラスミドを構築すること；
（４’）上記（３’）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５’）上記（４’）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記（３’）のシャトルベクタープラスミドが、さらにスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐ領域、大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコンであるｐ１５Ａ ｏｒｉ領域およびスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクタープラスミド。
【請求項8】
前記抗生物質耐性遺伝子が、大腸菌ベクターｐＧＢＭ５由来のストレプトマイシン耐性遺伝子であるａａｄ遺伝子である、請求項７に記載のシャトルベクタープラスミド。
【請求項9】
デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐ領域、大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコンであるｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域およびスクリーニングマーカーとしての第２の抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクタープラスミド。
【請求項10】
前記第２の抗生物質耐性遺伝子が、大腸菌ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であるｃａｔ遺伝子である、請求項９に記載のシャトルベクタープラスミド。
【請求項11】
請求項７または８に記載のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を挿入した、発現プラスミド。
【請求項12】
請求項９または１０に記載のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を挿入した、発現プラスミド。
【請求項13】
請求項１１に記載の発現プラスミドが請求項１に記載の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されている、形質転換体。
【請求項14】
請求項１２に記載の発現プラスミドが請求項１に記載の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されている、形質転換体。
【請求項15】
請求項１１に記載の発現プラスミドおよび請求項１２に記載の発現プラスミドであって、ただし各々の発現プラスミドには互いに異なる目的遺伝子が挿入されている前記発現プラスミドが、請求項１に記載の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されており、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
【請求項16】
請求項１３に記載の形質転換体に対して第２の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第２の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第２の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐ１５Ａ ｏｒｉ領域ではなく、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
【請求項17】
請求項１４に記載の形質転換体に対して第２の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第２の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第２の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域ではなく、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
【請求項18】
請求項１５に記載の形質転換体に対して第３の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第３の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第３の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐ１５Ａ ｏｒｉ領域でもｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域でもなく、それにより３種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、デイノコッカス・グランディス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）の形質転換の方法に関する。特に、外来プラスミドを導入するために改変されたデイノコッカス・グランディスの利用に関する。また、デイノコッカス・グランディスと大腸菌のシャトルベクタープラスミド、当該シャトルベクタープラスミドを利用した目的遺伝子の発現プラスミドおよび当該発現プラスミドを導入した形質転換体に関する。
【背景技術】
【0002】
生物の放射線耐性は、生物の種によって大きく異なる。これまでに、放射線に極めて強い抵抗性を持つ細菌群が知られており、それらは放射線抵抗性細菌と呼ばれている。これらの放射線抵抗性細菌に、難分解性の物質や有害な物質などを除去する機能を持つ遺伝子や、元素の細胞内取り込みに関わる遺伝子を遺伝子工学的手法により導入したり高発現させることができれば、放射性核種で汚染された廃棄物中に含まれる難分解性の物質や有害な物質を除去したり、放射性物質で汚染された土壌や河川から放射性核種を除去したりすることが可能となる。したがって、放射線抵抗性細菌の遺伝子工学的手法による形質転換は、放射性物質除去関連のバイオレメディエーション技術として非常に有用である。
【0003】
放射線抵抗性細菌の中で最も研究が盛んであり、遺伝子工学的手法が使用できる細菌は、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌である。デイノコッカス属細菌の放射線耐性は、大腸菌の約１００倍以上で、ヒトの細胞の約１０００倍以上であることが知られている。デイノコッカス属細菌の中で、特に研究報告が多いものはデイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）である。デイノコッカス・ラジオデュランスは、生育至適温度が３０℃の中温菌であり、通常、四連球菌の形態をとる。この細菌は、ポリプロイド（細胞あたり４～１０コピーのゲノム）であり、高い自然形質転換能を持つことが知られている。デイノコッカス属細菌が示す強い放射線抵抗性は、主に、その極めて高いＤＮＡ修復能力によるものと考えられている。
【0004】
現在までに、デイノコッカス・ラジオデュランスを用いたバイオレメディエーション技術の例として、デイノコッカス・ラジオデュランスの染色体上でシュードモナス・プチダ由来のトルエンジオキシゲナーゼ遺伝子を発現させ、難分解性のトルエンをより分解しやすい物質に変換した例（非特許文献１）；デイノコッカス・ラジオデュランスの染色体上で大腸菌由来の２価水銀イオン還元遺伝子を発現させ、２価水銀イオンをより毒性の低い揮発性金属水銀に還元した例（非特許文献２）；デイノコッカス・ラジオデュランスを宿主として、サルモネラ・エンテリカ・タイフィ由来の非特異的酸性フォスファターゼ遺伝子またはスフィンゴモナス属細菌由来のアルカリフォスファターゼ遺伝子をプラスミド上で発現させ、硝酸ウラニル溶液からウランを沈殿させた例（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）；放射能環境におけるセルロース系廃棄物のバイオレメディエーションに資することを目的として、デイノコッカス・ラジオデュランスを宿主として、バチルス・プミルス由来のエンドグルカナーゼ遺伝子をプラスミド上で発現させた例（非特許文献６）；デイノコッカス・ラジオデュランスを宿主として、フィトケラチンアナログをコードする合成遺伝子またはシネココッカス属細菌由来のメタロチオネイン遺伝子をプラスミド上で発現させ、カドミウム蓄積能を向上させた例（非特許文献７）；および、デイノコッカス・ラジオデュランスを宿主として、ロドシュードモナス・パルストリスあるいはノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス由来のニッケル／コバルトトランスポーター遺伝子をプラスミド上で発現させ、放射能汚染水からの放射性コバルトの除去効率を向上させた例（非特許文献８）がある。また、デイノコッカス・ジオサーマリスを宿主として、大腸菌由来の２価水銀イオン還元遺伝子をプラスミド上で発現させ、２価水銀イオンをより毒性の低い揮発性金属水銀に還元した例がある（非特許文献９）。
【0005】
デイノコッカス属細菌に関する遺伝子工学的手法に関連して、これまでにデイノコッカス・ラジオデュランスあるいはデイノコッカス・ジオサーマリス（Ｄ．ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）を宿主として外来遺伝子を発現させるためのプラスミドベクターは、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来プラスミドｐＵＥ１０のレプリコンと大腸菌ベクターを用いて開発されたデイノコッカス・ラジオデュランス－大腸菌シャトルベクターｐＩ３およびその派生プラスミドに限られており（非特許文献１０、非特許文献１１）、ｐＩ３系以外のレプリコンを持つプラスミドベクターを用いて外来遺伝子を発現させた例はない。
【0006】
また、デイノコッカス属細菌のＤＮＡ修復遺伝子の機能解析の過程で、ｐＩ３系プラスミドが、デイノコッカス・デザーティ（Ｄ．ｄｅｓｅｒｔｉ）でも複製できることが報告されているが（非特許文献１２）、現在までにデイノコッカス・デザーティを用いたバイオレメディエーションの研究例は報告されていない。また、デイノコッカス・デザーティで複製可能なプラスミドベクターは、ｐＩ３系プラスミドに限られており、ｐＩ３系以外のレプリコンを持つプラスミドベクターを用いてデイノコッカス・デザーティを形質転換した例はない。
【0007】
また、デイノコッカス・グランディスを宿主として遺伝子を発現させるためのプラスミドベクターｐＺＴ１５およびその派生プラスミドが開発されており（特許文献１、非特許文献１３を参照。）、デイノコッカス・グランディスのｒｏｄＺ遺伝子欠失株を宿主として、プラスミド上でデイノコッカス・グランディスのｒｏｄＺ遺伝子を発現させ、相補株を作製した例があるが（非特許文献１４）、現在までにデイノコッカス・グランディスを用いたバイオレメディエーションの研究例は報告されていない。また、ｐＺＴ１５系プラスミド以外のレプリコンを持つプラスミドがデイノコッカス・グランディスで複製できることを示した例はない。
【0008】
デイノコッカス・グランディスの標準株（ＡＴＣＣ４３６７２）のゲノムは、３，２４１，５０２ｂｐの染色体、３８９，５６７ｂｐのプラスミド（ｐＤＥＧＲ－１）、３７３，９１５ｂｐのプラスミド（ｐＤＥＧＲ－２）、９１，２９１ｂｐのプラスミド（いずれの先行技術文献もこのプラスミドの特定の名称を記載していないため、本明細書では「ｐＤＥＧＲ－ＰＬ」と呼ぶ。）および８，０５５ｂｐのプラスミド（ｐＤＥＧＲ－３）を持つと報告されており、これらのゲノム配列情報はＤＮＡデータベースで公開されている（非特許文献１５、非特許文献１６）。これまでに、デイノコッカス・グランディスのこれらのプラスミドをベクター化した例はない。
【0009】
前述のとおり、デイノコッカス属細菌は放射線抵抗性細菌であり、極めて高いＤＮＡ修復能力を持つ。したがって、複数のプラスミド上に同じ塩基配列を持つＤＮＡ領域が存在すると、相同組換え修復タンパク質群の働きによってプラスミド間の相同組換え反応が高頻度で起こり、複数のプラスミドを安定に菌体内に保持することが極めて難しい。
【0010】
別の問題として、一般に、プラスミドベクターに安定的に組込むことのできるＤＮＡ断片のサイズは１０ｋｂｐ程度までとされている。すなわち、サイズが大きなＤＮＡ断片を組込んだ発現プラスミドは宿主細胞内で不安定になると考えられている。したがって、特に複数の遺伝子で宿主細胞を形質転換する場合には、１種類のプラスミドに組込む遺伝子の総サイズを減少できるように、複数種類のプラスミドベクターを使用することが望ましい。しかしながら、デイノコッカス・グランディスで使用可能な公知のプラスミドベクターのレパートリーは、あまり多くない。加えて、前述のとおり、複数種類のプラスミドベクターを用いる場合、それらの間の相同組換え反応も抑制しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】特許第３８４５６９７号明細書
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：９２９－９３３，１９９８
【非特許文献2】Ｂｒｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：８５－９０，２０００
【非特許文献3】Ａｐｐｕｋｕｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２：７８７３－７８７８，２００６
【非特許文献4】Ａｐｐｕｋｕｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５４：２８５－２９０，２０１１
【非特許文献5】Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈａｚａｒｄ．Ｍａｔｅｒ．，２６２：８５３－８６１，２０１３
【非特許文献6】Ｔｅｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，３ Ｂｉｏｔｅｃｈ，４：５７－６５，２０１４
【非特許文献7】Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ ａｎｄ Ａｒｃｈａｎａ，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ，２７：４７１－４８２，２０１４
【非特許文献8】Ｇｏｇａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９９：９２０３－９２１３，２０１５
【非特許文献9】Ｂｒｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６９：４５７５－４５８２，２００３
【非特許文献10】Ｍａｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ，Ｐｌａｓｍｉｄ，２８：２５８－２６１，１９９２
【非特許文献11】Ｍｅｉｍａ ａｎｄ Ｌｉｄｓｔｒｏｍ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：３８５６－３８６７，２０００
【非特許文献12】Ｄｕｌｅｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４：１９４－２０８，２００９
【非特許文献13】Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，６２：１－９，２００９
【非特許文献14】Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１６４：１３６１－１３７１，２０１８
【非特許文献15】Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．，４：ｅ０１６３１－１５，２０１６
【非特許文献16】Ｓｈｉｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓｏｕｒ．Ａｎｎｏｕｎｃ．，８：ｅ０１２２６－１９，２０１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
したがって、本発明は、デイノコッカス・グランディスに対して発現プラスミドを安定的に導入および保持することができる、デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系を提供することを課題とする。
【0014】
また、本発明の別の追加的課題は、複数種類のプラスミドベクターを使用することができる、デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
上記課題を解決するために、本発明者は、デイノコッカス・グランディスの標準株（ＡＴＣＣ４３６７２）の内在性プラスミドを除去（本明細書において、プラスミドに関する場合、用語「除去」と「欠失」は互いに同じ意味を有するものとして用いられる。）することで改変したデイノコッカス・グランディスを宿主細胞として用いることで、当該内在性プラスミドと導入した発現プラスミドとの間の相同組換えを防止することができることを想起した。そこで、当該内在性プラスミドとしてｐＤＥＧＲ－３を除去することを試みたが、当業者が用いる典型的なプラスミド除去法（例えば、Ｔｒｅｖｏｒｓ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３２：１４９－１５７，１９８６を参照）によってはそれを除去することはできなかった。そのような技術的困難性に直面した本発明者は、後述する特別な方法を見出すことによりｐＤＥＧＲ－３を除去することを試み、当該内在性プラスミドを除去することに成功した。
【0016】
また、本発明者は、デイノコッカス・グランディスの標準株内に存在する９１，２９１ｂｐのサイズを有する内在性プラスミドも除去した。内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬは、ｐＤＥＧＲ－３よりも比較的容易に除去することができた。
【0017】
さらに、本発明者は、上記のようにして改変されたデイノコッカス・グランディス宿主細胞において利用可能なシャトルベクタープラスミド（本明細書において、用語「シャトルベクタープラスミド」、「シャトルベクター」、「シャトルプラスミド」および「プラスミドベクター」は、特に断りのないかぎり互いに同じ意味を有するものとして用いられる。）を構築した。具体的に、本発明の改変デイノコッカス・グランディス宿主細胞からは内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３が除去されていることから、当該ｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミドを構築した。そして、本発明者は、当該シャトルベクタープラスミドに基づく発現プラスミドが、本発明の改変デイノコッカス・グランディス宿主細胞内で安定に保持されることを実証した。
【0018】
さらに、本発明者は、本発明の改変デイノコッカス・グランディス宿主細胞で利用可能な別のシャトルベクタープラスミドも構築した。具体的に、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐ領域および、前記のｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミドに使用した大腸菌由来プラスミドの複製開始領域とは別の複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミドを構築した。そのようにして、シャトルベクタープラスミド間の相同組換えの可能性が最小化されることで、それら２つのシャトルベクタープラスミドに基づく発現プラスミドの双方が、本発明の改変デイノコッカス・グランディス宿主細胞内で安定に保持された。よって、本発明の第１の態様によれば、以下の方法が提供される。
＜１＞ デイノコッカス・グランディスの形質転換のための方法であって、以下の：
（１）デイノコッカス・グランディスから内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３または内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３および９１，２９１ｂｐの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬを除去して、遺伝子組換え微生物宿主細胞を得ること；
（２）以下のシャトルベクタープラスミドを構築すること：
ａ．上記（１）で除去されたｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；
ｂ．デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；または
ｃ．上記ａのシャトルベクタープラスミドおよび上記ｂのシャトルベクタープラスミドであって、ただしそれら２つのシャトルベクタープラスミドは、互いに異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記シャトルベクタープラスミド；
（３）以下の発現プラスミドを構築すること：
ａ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ａで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；
ｂ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｂで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；または
ｃ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｃで構築した各々のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし各々のシャトルベクタープラスミドに挿入される目的遺伝子が互いに異なる、前記発現プラスミド；
（４）上記（３）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５）上記（４）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、前記方法。
＜１＞ デイノコッカス・グランディスの形質転換のための方法であって、以下の：
（１）デイノコッカス・グランディスから内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３または内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３および９１，２９１ｂｐの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬを除去して、遺伝子組換え微生物宿主細胞を得ること；
（２）以下のシャトルベクタープラスミドを構築すること：
ａ．上記（１）で除去されたｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；
ｂ．デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域および大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含むシャトルベクタープラスミド；または
ｃ．上記ａのシャトルベクタープラスミドおよび上記ｂのシャトルベクタープラスミドであって、ただしそれら２つのシャトルベクタープラスミドは、互いに異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記シャトルベクタープラスミド；
（３）以下の発現プラスミドを構築すること：
ａ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ａで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；
ｂ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｂで構築したシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミド；または
ｃ’．宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、上記ｃで構築した各々のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし各々のシャトルベクタープラスミドに挿入される目的遺伝子が互いに異なる、前記発現プラスミド；
（４）上記（３）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５）上記（４）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、前記方法。
【0019】
また、本発明の第１の態様には、以下の好適な実施形態が含まれる。
＜２＞ 前記ａのシャトルベクタープラスミドに含まれるｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域が、ｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐに相当する、上記＜１＞の方法。
＜３＞ 前記ｂのシャトルベクタープラスミドに含まれるデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域が、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐに相当する、上記＜１＞の方法。
＜４＞ 前記（２）のシャトルベクタープラスミドが、さらにスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、上記＜１＞の方法。
＜２＞ 前記ａのシャトルベクタープラスミドに含まれるｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域が、ｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐに相当する、上記＜１＞の方法。
＜３＞ 前記ｂのシャトルベクタープラスミドに含まれるデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域が、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐに相当する、上記＜１＞の方法。
＜４＞ 前記（２）のシャトルベクタープラスミドが、さらにスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、上記＜１＞の方法。
【0020】
さらに、デイノコッカス・グランディス宿主細胞での遺伝子発現に利用可能なプラスミドベクターとしてｐＺＴ１５およびその派生プラスミドが知られている（特許文献１、非特許文献１３を参照。）。本発明者は、当該公知のプラスミドベクターが、前記２つの本発明のシャトルベクタープラスミドのいずれとも干渉することなく、本発明の改変デイノコッカス・グランディス宿主細胞内で安定に共存できることを実証した。よって、本発明の第１の態様には、以下の実施形態も含まれる。
＜５＞ さらに、
（３’）宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし該目的遺伝子が前記ａ’～ｃ’の目的遺伝子のいずれとも異なり、且つ、該シャトルベクタープラスミドが前記ａ’～ｃ’に含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域とは異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記発現プラスミドを構築すること；
（４’）上記（３’）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５’）上記（４’）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、上記＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞ 前記（３’）のシャトルベクタープラスミドが、さらにスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、上記＜５＞の方法。
＜５＞ さらに、
（３’）宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入した発現プラスミドであって、ただし該目的遺伝子が前記ａ’～ｃ’の目的遺伝子のいずれとも異なり、且つ、該シャトルベクタープラスミドが前記ａ’～ｃ’に含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域とは異なる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を含む、前記発現プラスミドを構築すること；
（４’）上記（３’）で構築した発現プラスミドを大腸菌に導入して増幅させること；および
（５’）上記（４’）で増幅させた発現プラスミドにより上記（１）の宿主細胞を形質転換すること、
を含む、上記＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞ 前記（３’）のシャトルベクタープラスミドが、さらにスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、上記＜５＞の方法。
【0021】
さらに、本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様による方法に使用するのに適した以下のシャトルベクタープラスミドが提供される。
＜７＞ デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐ領域、大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコンであるｐ１５Ａ ｏｒｉ領域およびスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクタープラスミド。
＜８＞ 前記抗生物質耐性遺伝子が、大腸菌ベクターｐＧＢＭ５由来のストレプトマイシン耐性遺伝子であるａａｄ遺伝子である、上記＜７＞のシャトルベクタープラスミド。
＜９＞ デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐ領域、大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコンであるｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域およびスクリーニングマーカーとしての第２の抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクタープラスミド。
＜１０＞ 前記第２の抗生物質耐性遺伝子が、大腸菌ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であるｃａｔ遺伝子である、上記＜９＞のシャトルベクタープラスミド。
＜７＞ デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐ領域、大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコンであるｐ１５Ａ ｏｒｉ領域およびスクリーニングマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクタープラスミド。
＜８＞ 前記抗生物質耐性遺伝子が、大腸菌ベクターｐＧＢＭ５由来のストレプトマイシン耐性遺伝子であるａａｄ遺伝子である、上記＜７＞のシャトルベクタープラスミド。
＜９＞ デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐ領域、大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコンであるｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域およびスクリーニングマーカーとしての第２の抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクタープラスミド。
＜１０＞ 前記第２の抗生物質耐性遺伝子が、大腸菌ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であるｃａｔ遺伝子である、上記＜９＞のシャトルベクタープラスミド。
【0022】
さらに、本発明の第３の態様によれば、本発明の第２の態様によるシャトルベクタープラスミドに基づく以下の発現プラスミドが提供される。
＜１１＞ 上記＜７＞または＜８＞のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を挿入した、発現プラスミド。
＜１２＞ 上記＜９＞または＜１０＞のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を挿入した、発現プラスミド。
＜１１＞ 上記＜７＞または＜８＞のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を挿入した、発現プラスミド。
＜１２＞ 上記＜９＞または＜１０＞のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに宿主細胞内で発現させるための１つ以上の目的遺伝子を挿入した、発現プラスミド。
【0023】
さらに、本発明の第４の態様によれば、本発明の第１の態様による方法により得られる以下の形質転換体が提供される。
＜１３＞ 上記＜１１＞の発現プラスミドが上記＜１＞の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されている、形質転換体。
＜１４＞ 上記＜１２＞の発現プラスミドが上記＜１＞の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されている、形質転換体。
＜１５＞ 上記＜１１＞の発現プラスミドおよび上記＜１２＞の発現プラスミドであって、ただし各々の発現プラスミドには互いに異なる目的遺伝子が挿入されている前記発現プラスミドが上記＜１＞の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されており、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１６＞ 上記＜１３＞の形質転換体に対して第２の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第２の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第２の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐ１５Ａ ｏｒｉ領域ではなく、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１７＞ 上記＜１４＞の形質転換体に対して第２の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第２の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第２の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域ではなく、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１８＞ 上記＜１５＞の形質転換体に対して第３の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第３の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第３の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐ１５Ａ ｏｒｉ領域でもｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域でもなく、それにより３種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１３＞ 上記＜１１＞の発現プラスミドが上記＜１＞の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されている、形質転換体。
＜１４＞ 上記＜１２＞の発現プラスミドが上記＜１＞の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されている、形質転換体。
＜１５＞ 上記＜１１＞の発現プラスミドおよび上記＜１２＞の発現プラスミドであって、ただし各々の発現プラスミドには互いに異なる目的遺伝子が挿入されている前記発現プラスミドが上記＜１＞の遺伝子組換え微生物宿主細胞に導入されており、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１６＞ 上記＜１３＞の形質転換体に対して第２の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第２の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第２の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐ１５Ａ ｏｒｉ領域ではなく、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１７＞ 上記＜１４＞の形質転換体に対して第２の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第２の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第２の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域ではなく、それにより２種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
＜１８＞ 上記＜１５＞の形質転換体に対して第３の発現プラスミドがさらに導入され、ただし該第３の発現プラスミドはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入された第３の１つ以上の目的遺伝子を含み、且つ、該シャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はｐ１５Ａ ｏｒｉ領域でもｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域でもなく、それにより３種類のプラスミド上の異なる遺伝子の発現が可能な、形質転換体。
【発明の効果】
【0024】
本発明によれば、デイノコッカス・グランディスに対して発現プラスミドを安定的に導入および保持することができる、デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系が提供される。また、本発明の追加的な効果として、複数種類のプラスミドベクターを使用することができる、デイノコッカス・グランディス宿主ベクター系が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】図１は、デイノコッカス・グランディス標準株（ＡＴＣＣ４３６７２）のコロニーから抽出したプラスミドのアガロース電気泳動像である。レーン１～１０は４０℃での培養を経て取得したコロニー由来の抽出液、レーン１１は４０℃での培養を経ていないコントロール由来の抽出液をそれぞれ示しており、レーン１～１１すべてにおいて８，０５５ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３が見られた。
【図2】図２は、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子、ＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子およびＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子に由来するＰＣＲ増幅産物の有無を、アガロースゲル電気泳動によって確認した結果を示す。この図のｐＤＥＧＲ－ＰＬのプラスミドマップ上において、ＡはＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子領域のＰＣＲ増幅部位、ＢはＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子領域のＰＣＲ増幅部位、ＣはＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子領域のＰＣＲ増幅部位を示す。また、この図のアガロース電気泳動像において、Ｍは市販の直鎖状ＤＮＡ分子サイズマーカーを示す。レーン１～５はコントロールとして４０℃での培養を経ていないデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２から調製したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行ったものであり、レーン６～１０は４０℃での培養を経て取得したコロニー由来のゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応を行ったものをそれぞれ示している。また、レーン１と６は染色体に存在するグルタミン合成酵素遺伝子領域（７２３ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン２と７はプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子領域（６２３ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン３と８はプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子領域（６５９ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン４と９はプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子領域（６８７ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン５と１０はプラスミドｐＤＥＧＲ－３に存在するＤＥＩＧＲ＿５００００７遺伝子領域（７５０ｂｐ）のＰＣＲ産物をそれぞれ示す。これらの結果から、４０℃での培養を経たデイノコッカス・グランディスではプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬが欠失しているが、プラスミドｐＤＥＧＲ－３が保持されていることが示された。
【図3】図３は、プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬが欠失しているが、プラスミドｐＤＥＧＲ－３が保持されていることが示されたデイノコッカス・グランディス（ＴＹ１株）からプラスミドｐＤＥＧＲ－３を欠失させた結果を示すアガロース電気泳動像である。レーン１はデイノコッカス・グランディスＴＹ１株から抽出したプラスミド、レーン２はデイノコッカス・グランディスＴＹ１Ｎｌｕｃ株から抽出したプラスミド、レーン３と４は５ｎｇ／μｌのノボビオシンを含むＴＧＹ培地中で４０℃培養を行った菌液から取得したコロニー由来の抽出液、レーン５と６は５ｎｇ／μｌのリファンピシンを含むＴＧＹ培地中で４０℃培養を行った菌液から取得したコロニー由来の抽出液をそれぞれ示しており、レーン１では８，０５５ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３、レーン２ではＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の代わりにＮｌｕｃおよびストレプトマイシン耐性遺伝子（ａａｄ）を含む８，９６１ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３Δ８ＬＡが見られたのに対して、レーン３～６にはプラスミドが見られなかった。これらの結果から、ＴＹ１株に存在するプラスミドｐＤＥＧＲ－３が欠失しているデイノコッカス・グランディス（ＴＹ３株）が得られたことが示された。
【図4】図４は、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２のｐＤＥＧＲのレプリコンを含むシャトルベクターｐＧＲＣ５のマップを示す。図４において、ｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐはデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の８，０５５ｂｐプラスミドのレプリコン、ｐ１５Ａ ｏｒｉは大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ａａｄは大腸菌ベクターｐＧＢＭ５由来のストレプトマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【図5】図５は、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンを含むシャトルベクターｐＲＡＤＮ８のマップを示す。図５において、ｐＵＥ１０ ｒｅｐはデイノコッカス・ラジオデュュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコン、ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐは大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ｃａｔは大腸菌ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【図6】図６は、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドひとつであるｐＺＴ２９を基にして構築されたシャトルベクターｐＺＴ２９Ｈのマップを示す。図６において、ｐＵＥ３０ ｒｅｐはデイノコッカス・ラジオプグナンスＡＴＣＣ１９１７２のプラスミドｐＵＥ３０由来のレプリコン、ｐＵＣ１９ ｏｒｉは大腸菌ベクターｐＵＣ１９由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ｈｙｇは大腸菌ベクターｐＤＲ２由来のハイグロマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【図7】図７は、シャトルベクターｐＧＲＣ５、シャトルベクターｐＲＡＤＮ８およびシャトルベクターｐＺＴ２９Ｈをデイノコッカス・グランディスＴＹ３株に導入した形質転換体内での、それらのプラスミドの保持を示すアガロース電気泳動像である。レーン１はデイノコッカス・グランディスＴＹ１株から抽出したプラスミドｐＤＥＲＧ－３（８，０５５ｂｐ）、レーン２はデイノコッカス・グランディスＴＹ３株由来の抽出液である。レーン３はｐＧＲＣ５（３，９０８ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン４はｐＺＴ２９Ｈを導入した形質転換体（ｐＺＴ２９Ｈの単量体に由来する４，６０１ｂｐの位置とｐＺＴ２９Ｈの２量体に由来する９，２０２ｂｐの位置にバンドが見られる。）、レーン５はｐＲＡＤＮ８を導入した形質転換体（ｐＲＡＮＤ８の単量体に由来する６，０４６ｂｐの位置とｐＲＡＮＤ８の２量体に由来する１２，０９２ｂｐの位置にバンドが見られる。）、レーン６は２種類のプラスミドｐＧＲＣ５とｐＺＴ２９Ｈを同時に含む形質転換体、レーン７は２種類のプラスミドｐＺＴ２９ＨとｐＲＡＤＮ８を同時に含む形質転換体、レーン８は２種類のプラスミドｐＲＡＤＮ８とｐＧＲＣ５を同時に含む形質転換体、レーン９は３種類のプラスミドｐＧＲＣ５とｐＺＴ２９ＨとｐＲＡＤＮ８を同時に含む形質転換体、レーンＭは市販のスーパーコイルＤＮＡサイズマーカーをそれぞれ示している。また、矢印はプラスミド抽出液に混在しているゲノムＤＮＡを示している。これらの結果から、プラスミドｐＧＲＣ５、ｐＺＴ２９ＨおよびｐＲＡＮＤ８は、デイノコッカス・グランディスＴＹ３株で共存できることが示された。
【発明を実施するための形態】
【0026】
デイノコッカス・グランディス宿主細胞
本発明では、デイノコッカス・グランディスの野生株から内在性プラスミドを除去（欠失）することにより改変された細胞が、形質転換のための宿主として用いられる。本明細書において使用される「内在性プラスミド」という用語は、野生株に存在するプラスミドを意味する。また、本明細書において使用される「野生株」という用語は、天然に存在する細菌株や天然界から分離された細菌株のみならず、本発明の改変以外のいかなる改変（遺伝的であるか非遺伝的であるかにかかわらず）を受けた細菌株も含む。本発明において使用できる野生株の例としては、デイノコッカス・グランディスの標準株（ＡＴＣＣ４３６７２）を挙げることができる。この株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
本発明では、デイノコッカス・グランディスの野生株から内在性プラスミドを除去（欠失）することにより改変された細胞が、形質転換のための宿主として用いられる。本明細書において使用される「内在性プラスミド」という用語は、野生株に存在するプラスミドを意味する。また、本明細書において使用される「野生株」という用語は、天然に存在する細菌株や天然界から分離された細菌株のみならず、本発明の改変以外のいかなる改変（遺伝的であるか非遺伝的であるかにかかわらず）を受けた細菌株も含む。本発明において使用できる野生株の例としては、デイノコッカス・グランディスの標準株（ＡＴＣＣ４３６７２）を挙げることができる。この株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【0027】
デイノコッカス・グランディスの標準株（ＡＴＣＣ４３６７２）のゲノムは３，２４１，５０２ｂｐの染色体、並びに３８９，５６７ｂｐのプラスミド（ｐＤＥＧＲ－１）、３７３，９１５ｂｐのプラスミド（ｐＤＥＧＲ－２）、９１，２９１ｂｐのプラスミドおよび８，０５５ｂｐのプラスミド（ｐＤＥＧＲ－３）の４つのプラスミドを持つと報告されており、これらのゲノム配列情報はＤＮＡデータベースで公開されている（非特許文献１５：Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．，４：ｅ０１６３１－１５，２０１６、および非特許文献１６：Ｓｈｉｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓｏｕｒ．Ａｎｎｏｕｎｃ．，８：ｅ０１２２６－１９，２０１９）。なお、それらの文献やデータベースにおいて９１，２９１ｂｐのプラスミドには特定の名称が付されていないため、本明細書ではこのプラスミドを「ｐＤＥＧＲ－ＰＬ」と呼ぶ。また、ｐＤＥＧＲ－ＰＬおよびｐＤＥＧＲ－３の配列情報は、それぞれ、＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００６＞および＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７＞として登録されている。
【0028】
本発明によれば、デイノコッカス・グランディスの野生株からｐＤＥＧＲ－３またはｐＤＥＧＲ－３およびｐＤＥＧＲ－ＰＬの２つのプラスミドが除去される。
【0029】
微生物からプラスミドを欠失させるための様々な方法が知られている（Ｔｒｅｖｏｒｓ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３２：１４９－１５７，１９８６を参照）。プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬは、そのような既知の方法によって欠失させ得る。例えば、後述する実施例のように、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２株を許容高温度で繰り返し培養することによって、当該プラスミドを欠失させることができる。
【0030】
しかしながら、もう１種類のプラスミドｐＤＥＧＲ－３を除去することは容易ではなく、プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬの場合と同様の方法では欠失させることはできなかった。そこで、後述の実施例のように、本発明者は、プラスミドｐＤＥＧＲ－３にマーカー遺伝子を挿入した上で許容高温度での繰り返し培養を行うというような、２重の選択圧を微生物に負荷することにより、デイノコッカス・グランディスからプラスミドｐＤＥＧＲ－３が欠失した菌株を作出することに成功した。
【0031】
上記のようにして作出したデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２のプラスミドｐＤＥＧＲ－３およびプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬが欠失した菌株（ＴＹ３株）は、２０２３年４月１２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８８０として、ブダペスト条約に基づいた国際寄託がされている。
【0032】
シャトルベクタープラスミド
前述のとおり、デイノコッカス属細菌は極めて高いＤＮＡ修復能力を持つため、複数のプラスミド上に同じ塩基配列を持つＤＮＡ領域が存在すると、相同組換え修復タンパク質群の働きによってプラスミド間の相同組換え反応が高頻度で起こる。このために、デイノコッカス属細菌を宿主とした場合には、複数のプラスミドを安定に菌体内に保持することが極めて難しい。よって、本発明は、本発明のデイノコッカス・グランディス宿主細胞に安定的に保持され得るシャトルベクタープラスミドも提供する。具体的に、本発明者は、塩基配列の相同性によるプラスミドの不安定化を回避するために、異なる塩基配列を持つ３種類の大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域と、異なる塩基配列を持つ３種類のデイノコッカス属細菌由来のプラスミドの複製開始領域を連結した形のシャトルベクタープラスミドを構築した。
前述のとおり、デイノコッカス属細菌は極めて高いＤＮＡ修復能力を持つため、複数のプラスミド上に同じ塩基配列を持つＤＮＡ領域が存在すると、相同組換え修復タンパク質群の働きによってプラスミド間の相同組換え反応が高頻度で起こる。このために、デイノコッカス属細菌を宿主とした場合には、複数のプラスミドを安定に菌体内に保持することが極めて難しい。よって、本発明は、本発明のデイノコッカス・グランディス宿主細胞に安定的に保持され得るシャトルベクタープラスミドも提供する。具体的に、本発明者は、塩基配列の相同性によるプラスミドの不安定化を回避するために、異なる塩基配列を持つ３種類の大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域と、異なる塩基配列を持つ３種類のデイノコッカス属細菌由来のプラスミドの複製開始領域を連結した形のシャトルベクタープラスミドを構築した。
【0033】
本発明によるシャトルベクタープラスミドの１つは、デイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を含む。すなわち、本発明ではデイノコッカス・グランディスからプラスミドｐＤＥＧＲ－３を除去した宿主細胞が用いられるので、当該プラスミドｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を有利に利用できるようになった。このシャトルベクタープラスミドはまた、当然に、デイノコッカス・グランディスからプラスミドｐＤＥＧＲ－３およびプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬを除去した宿主細胞にも使用することができる。本発明によるシャトルベクタープラスミドにおけるデイノコッカス・グランディスの内在性プラスミドｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域としては、ｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコンであるｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐに相当する領域を挙げることができる。
【0034】
本発明によるシャトルベクタープラスミドは、大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域も含む。そのような複製開始領域は、大腸菌由来のプラスミドに存在するいずれの複製開始配列を含んでいてもよい。したがって、本発明のシャトルベクタープラスミドの具体的な例としては、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２プラスミドｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコン（ｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐ）および大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコン（ｐ１５Ａ ｏｒｉ）を含むシャトルプラスミドを挙げることができる。
【0035】
本発明の好適な実施形態の１つにおいて、前記のシャトルプラスミドに対して抗生物質耐性遺伝子がスクリーニングマーカーとして付加される。そうすることで、培養培地への抗生物質の添加による菌体内でのプラスミドの存在、菌体からのプラスミドの抽出・精製、形質転換による菌体へのプラスミドの導入を確実にすることができる。そのような抗生物質耐性遺伝子の非限定的な例としては、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子をあげることができる。したがって、本発明のシャトルベクタープラスミドの好適な具体例としては、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２プラスミドｐＤＥＧＲ－３由来のレプリコン（ｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐ）、大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコン（ｐ１５Ａ ｏｒｉ）および大腸菌プラスミドｐＧＢＭ５由来のストレプトマイシン耐性遺伝子（ａａｄ）を有するシャトルプラスミドを挙げることができる。
【0036】
本発明による別のシャトルベクタープラスミドは、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域を含む。当該デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域の例としては、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐに相当する領域を挙げることができる。本発明者は、そのような複製開始領域を有するシャトルベクタープラスミドも本発明のデイノコッカス・グランディス宿主細胞内に安定的に保持されることを実験的に確認した。さらに特筆すべきことに、本発明者は、当該シャトルベクタープラスミドが、本発明の他のシャトルベクターのいずれとも（すなわち、プラスミドｐＤＥＧＲ－３の複製開始領域を有するベクタープラスミドおよび／またはデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドと）お互いに干渉せずに、本発明のデイノコッカス・グランディス宿主細胞の中で共存できることを実験的に証明した。すなわち、本明細書の実施例で用いた３種類の大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域はお互いに干渉せずに大腸菌の中で共存できることが知られているが、３種類のデイノコッカス属細菌由来のプラスミドの複製開始領域がお互いに干渉するかどうかはまったく不明であった。本発明において、異なる塩基配列を持つ３種類のデイノコッカス属細菌由来のプラスミドの複製開始領域を連結した形の３種類のシャトルベクタープラスミドが、本発明のデイノコッカス・グランディス宿主細胞の中でお互いに干渉せずに外来遺伝子を菌体内で発現させることができたのは、驚くべきことであった。
【0037】
本発明による別のシャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域も、大腸菌由来のプラスミドに存在するいずれの複製開始配列を含んでいてもよい。ただし、本発明のデイノコッカス・グランディスに対して１種以上の本発明のシャトルベクタープラスミドを導入する場合、各々のシャトルベクタープラスミドに含まれる大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域が互いに異なるべきである。したがって、本発明による別のシャトルベクタープラスミドの具体的な例としては、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンであるｐＵＥ１０ ｒｅｐ領域および大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコンであるｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ領域を含むシャトルプラスミドを挙げることができる。
【0038】
本発明による別のシャトルベクタープラスミドに対しても抗生物質耐性遺伝子をスクリーニングマーカーとして付加することが好ましい。ただし、本発明のデイノコッカス・グランディスに対して１種以上の本発明のシャトルベクタープラスミドを導入する場合、各々のシャトルベクタープラスミドに含まれる抗生物質耐性遺伝子は互いに異なるべきである。したがって、本発明による別のシャトルベクタープラスミドの好適な具体的な例としては、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコン（ｐＵＥ１０ ｒｅｐ）、大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコン（ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ）および大腸菌ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を有するシャトルプラスミドを挙げることができる。
【0039】
上記の抗生物質耐性遺伝子に関連して、本明細書の実施例として記載した３種類のシャトルベクタープラスミド（以下、「３種類のシャトルベクター」という。）のそれぞれは、異なる抗生物質耐性遺伝子をそれらのスクリーニングマーカーとして使用している。しかしながら、それらの抗生物質耐性遺伝子はいずれも、それらの配列の上流領域に配置されたデイノコッカス・ラジオデュランス由来のカタラーゼ遺伝子のプロモーター（ｋａｔＡ－ｐ）によって発現制御されていることに留意すべきである。すなわち、このプロモーター領域は３種類のシャトルベクターで同じ塩基配列となっている。しかしながら、発明者は、デイノコッカス属細菌に関するこれまでの長年にわたる研究経験から、プロモーター領域のサイズが１５０塩基対未満であれば、デイノコッカス属細菌では相同組換え反応が起こらないことを見出していた（未発表）。よって、本発明者は、３種類のシャトルベクターが本発明のデイノコッカス・グランディス宿主内に共存した場合でさえも、それらの安定性がカタラーゼ遺伝子プロモーターによりもたらされる塩基配列相同性の影響を受けないことを経験的に予測可能であった。そして、本発明では、プラスミド間で重複する領域のサイズが１５０塩基対未満であれば、デイノコッカス属細菌では相同組換え反応が起こらないことが改めて確認された。しかしながら、所望により、各々の抗生物質耐性遺伝子に対して異なるプロモーターを用いることもできる。なお、デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株由来のプラスミドの複製開始領域を含む本発明による別のシャトルベクタープラスミドは、デイノコッカス・グランディスの野生株（たとえば、ＡＴＣＣ４３６７２株など）を宿主として使用した場合にも利用できることを当業者は容易に理解できる。
【0040】
本発明のデイノコッカス・グランディス宿主内で好適に使用し得る他のシャトルベクタープラスミドは、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択されるシャトルベクタープラスミドである。本明細書において、ｐＺＴ１５系のプラスミドは、デイノコッカス・ラジオプグナンス（Ｄ．ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）ＡＴＣＣ１９１７２株由来の内在性プラスミドｐＵＥ３０の複製に関与するｐＵＥ３０断片をデイノコッカス属細菌内での複製開始領域として使用し、且つ大腸菌由来のプラスミドの複製開始領域を有するシャトルベクタープラスミドと定義される。ｐＺＴ１５系のプラスミドのいくつかは公知であり、本発明でも利用可能である。ｐＺＴ１５系のプラスミドの例としては、文献に記載されているｐＺＴ１５、ｐＺＴ１７、ｐＺＴ２３、ｐＺＴ２７、ｐＺＴ２９およびｐＺＴ９０が挙げられる（特許第３８４５６９７号明細書（特許文献１）およびＳａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，６２：１－９，２００９（非特許文献１３）を参照。）。それらのいずれもが本発明のデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドとして用いることができる。また、それらの誘導体、典型的には、文献に記載のシャトルベクターに用いられている大腸菌の複製開始領域とは異なる大腸菌の複製開始領域および／または文献に記載のシャトルベクターに用いられている抗生物質耐性遺伝子とは異なる抗生物質耐性遺伝子を有するシャトルベクターも、本発明において使用可能である。したがって、本発明のデイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドには、ｐＺＴ１５、ｐＺＴ１７、ｐＺＴ２３、ｐＺＴ２７、ｐＺＴ２９およびｐＺＴ９０に含まれる大腸菌の複製開始領域とは異なる大腸菌の複製開始領域および／または抗生物質耐性遺伝子とは異なる抗生物質耐性遺伝子を有するシャトルベクタープラスミドが含まれる。なお、デイノコッカス／大腸菌シャトルベクターｐＺＴ１５系のプラスミドから選択される本発明の他のシャトルベクタープラスミドは、デイノコッカス・グランディスの野生株（たとえば、ＡＴＣＣ４３６７２株など）を宿主として使用した場合にも利用できることを当業者は容易に理解できる。
【0041】
本発明によるシャトルベクタープラスミドはマルチクローニングサイトを有することが好ましい。マルチクローニングサイトには、例えばＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩなどの制限酵素認識部位が含まれてよい。そのようなマルチクローニングサイトを有する本発明のシャトルベクタープラスミドは、当業者に周知の方法によって作製することができる。
【0042】
発現プラスミド
本発明は、１つ以上の目的遺伝子を本発明によるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入することにより構築した発現プラスミドを使用する。本明細書において使用する「目的遺伝子」との用語は、発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味する。当該目的遺伝子は、宿主微生物とは異なる生物由来の遺伝子であってもよいし、あるいは宿主微生物と同じ株、種または属の微生物由来の遺伝子であって、本発明の宿主細胞において発現の増強が望まれる遺伝子であってもよい。
本発明は、１つ以上の目的遺伝子を本発明によるシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入することにより構築した発現プラスミドを使用する。本明細書において使用する「目的遺伝子」との用語は、発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味する。当該目的遺伝子は、宿主微生物とは異なる生物由来の遺伝子であってもよいし、あるいは宿主微生物と同じ株、種または属の微生物由来の遺伝子であって、本発明の宿主細胞において発現の増強が望まれる遺伝子であってもよい。
【0043】
当該目的遺伝子は、「発現カセット」として本発明のシャトルベクタープラスミドのクローニングサイトに挿入することができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に「発現可能に導入」される。
【0044】
プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。本発明の発現プラスミドにおいて好適に使用できるプロモーターの非限定的な例として、デイノコッカス・ラジオデュランスのｇｒｏＥＳ遺伝子のプロモーター並びにデイノコッカス・ラジオデュランスで遺伝子を高発現させることが知られているＤＲ１２６１、ｒｐｍＢおよびｄｎａＫ遺伝子のプロモーターなどを挙げることができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８５：ｅ０１３５６－１９，２０１９を参照。）。また、本発明の発現プラスミドにおいて好適に使用できる他のプロモーターとしては、ｐｐｒＡ、ｄｄｒＡ、ｄｄｒＢ、ｇｙｒＢ遺伝子などの上流に存在し、放射線乾燥応答モチーフと呼ばれるオペレーター配列を近傍に持つプロモーターを挙げることができる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８：２１－３３，２００４を参照。）。これらのプロモーターの下流に発現させたい遺伝子を配置することで、紫外線、マイトマイシンＣ、メチルメタンスルホン酸、臭化エチジウムなどを形質転換体の培養培地に添加することにより遺伝子発現を誘導調節することが可能となる（Ｎａｒａｓｉｍｈａ ａｎｄ Ｂａｓｕ，Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ．，４６：１０，２０２１を参照。）。
【0045】
本発明のシャトルベクタープラスミドには複数個の遺伝子を挿入することもできる。高発現プロモーターを２箇所に配置し、それぞれのプロモーターの下流に別々の遺伝子を挿入することができるようなデュアル発現ベクターがすでに開発されている（Ｎｏｖｙ ｅｔ ａｌ．，ｉｎＮｏｖａｔｉｏｎｓ，１５：２－６，２００２およびＭｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，１６：ｅ０２５８５５３，２０２１を参照。）。本発明の各々のシャトルベクタープラスミドの２箇所以上に高発現プロモーターを配置することで、より多くの遺伝子群の発現が可能となる。
【0046】
増幅および形質転換
本発明の発現プラスミドは大腸菌で増幅することができる。通常の分子生物学的研究に使用されている大腸菌株のいずれも、本発明の発現プラスミドを増幅するための宿主細胞として使用することができる。例えば、大腸菌宿主としては大腸菌Ｋ１２株またはＢ株由来の菌株などを例示できるが、それらに限定されない。
本発明の発現プラスミドは大腸菌で増幅することができる。通常の分子生物学的研究に使用されている大腸菌株のいずれも、本発明の発現プラスミドを増幅するための宿主細胞として使用することができる。例えば、大腸菌宿主としては大腸菌Ｋ１２株またはＢ株由来の菌株などを例示できるが、それらに限定されない。
【0047】
本発明の発現プラスミドを宿主微生物細胞に導入するために、共沈殿法やエレクトロポレーションなどの慣用のトランスフェクション法が利用され得る。それらの例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【0048】
上記のようにして本発明の発現プラスミドが導入された大腸菌は、その生育に適した条件下で培養される。各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。培地は、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。また、培地は、増幅すべき発現プラスミドに含まれるスクリーニングマーカー（抗生物質耐性遺伝子）に対応する抗生物質を含有する。培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。大腸菌の好適な培養温度は、通常、２５℃～３７℃の範囲である。大腸菌の培養は、生育中の適切な酸素濃度を確保するために、振盪または攪拌下で実施することが好ましい。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。培地に添加した抗生物質に耐性を示す形質転換体株の中から、所望の発現プラスミドを持つ株を選択して本発明の発現プラスミドを回収することができる。
【0049】
回収された発現プラスミドは、本発明の改変デイノコッカス・グランディス宿主細胞の形質転換に用いることができる。前述の共沈殿法やエレクトロポレーションなどの慣用のトランスフェクション法が、本発明の発現プラスミドをデイノコッカス・グランディス宿主細胞に導入するためにも利用できる。
【0050】
形質転換体の応用
本発明によるデイノコッカス・グランディス形質転換体の応用の例は、宿主の放射線耐性を利用して放射性物質除去関連のバイオレメディエーションを実現させることを含む。特に、本発明によれば複数のバイオレメディエーション関連の外来遺伝子をデイノコッカス・グランディスで発現させることが可能となる。例えば、複数のバイオレメディエーション関連の外来遺伝子（例として、シュードモナス・プチダ由来のトルエンジオキシゲナーゼ遺伝子、大腸菌由来の２価水銀イオン還元遺伝子、サルモネラ・エンテリカ・タイフィ由来の非特異的酸性フォスファターゼ遺伝子、スフィンゴモナス属細菌由来のアルカリフォスファターゼ遺伝子、バチルス・プミルス由来のエンドグルカナーゼ遺伝子、シネココッカス属細菌由来のメタロチオネイン遺伝子、ロドシュードモナス・パルストリスあるいはノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス由来のニッケル／コバルトトランスポーター遺伝子など）をデイノコッカス・グランディスで発現させることが可能となり、宿主の放射線耐性を利用して、放射性物質除去関連のバイオレメディエーションを実現させることができる。
本発明によるデイノコッカス・グランディス形質転換体の応用の例は、宿主の放射線耐性を利用して放射性物質除去関連のバイオレメディエーションを実現させることを含む。特に、本発明によれば複数のバイオレメディエーション関連の外来遺伝子をデイノコッカス・グランディスで発現させることが可能となる。例えば、複数のバイオレメディエーション関連の外来遺伝子（例として、シュードモナス・プチダ由来のトルエンジオキシゲナーゼ遺伝子、大腸菌由来の２価水銀イオン還元遺伝子、サルモネラ・エンテリカ・タイフィ由来の非特異的酸性フォスファターゼ遺伝子、スフィンゴモナス属細菌由来のアルカリフォスファターゼ遺伝子、バチルス・プミルス由来のエンドグルカナーゼ遺伝子、シネココッカス属細菌由来のメタロチオネイン遺伝子、ロドシュードモナス・パルストリスあるいはノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス由来のニッケル／コバルトトランスポーター遺伝子など）をデイノコッカス・グランディスで発現させることが可能となり、宿主の放射線耐性を利用して、放射性物質除去関連のバイオレメディエーションを実現させることができる。
【0051】
本発明によるデイノコッカス・グランディス形質転換体の応用は、必ずしもデイノコッカス属細菌の放射線抵抗性という特性に関係していなくてもよい。したがって、本発明によるデイノコッカス・グランディス形質転換体の他の応用の例は、デイノコッカス属細菌の他のバイオレメディエーションへの適用や、当該細菌のその他の産業上有用な遺伝資源としての利用を含み得る。これまでに、デイノコッカス属細菌が、活性酸素除去作用の高い抗酸化成分デイノキサンチンを生産する能力（Ｌｅｍｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ，５３：９１９－９２６，１９９７）、都市大気汚染物質である多環芳香族炭化水素を分解する能力（Ｗａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３：２６５－２７２，２００７）、海洋汚染物質である酢酸エチルを分解する能力（Ｋｏｎｇｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２８６：２２７－２３５，２００８）、健康寿命伸長効果の高いポリアミンを生産する能力（Ｈａｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，極限環境微生物学会誌，８：５９－６８，２００９）、内分泌撹乱物質であるフタル酸ジブチルを分解する能力（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，７８：３４２３４６，２０１０）、食品の腐敗防止、細菌感染防止、バイオレメディエーションに活用できるクオラムクエンチング酵素を生産する能力（Ｋｅｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｊ．，５：１－３，２０１１）、水産動物への使用が禁止されているマラカイトグリーンを分解する能力（Ｌｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１４４：２７５－２８０，２０１３）、内分泌撹乱物質である１７β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌを分解する能力（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，３ Ｂｉｏｔｅｃｈ，８：４３３，２０１８）、イネの重金属毒性を緩和する能力（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｐｏｌｌｕｔ．，２８４：１１７１２７，２０２１）、人体に対して非常に有害なヒ素（Ｖ）イオンを還元して毒性を軽減する能力（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｐｏｌｌｕｔ．，３１２：１２００４０，２０２２）を有することが報告されている。
【0052】
上記の、活性酸素除去作用の高い抗酸化成分デイノキサンチンの生産；都市大気汚染物質である多環芳香族炭化水素の分解；海洋汚染物質である酢酸エチルの分解；健康寿命伸長効果の高いポリアミンの生産；内分泌撹乱物質であるフタル酸ジブチルの分解；食品の腐敗防止、細菌感染防止、バイオレメディエーションに活用できるクオラムクエンチング酵素の生産；水産動物への使用が禁止されているマラカイトグリーンの分解；内分泌撹乱物質である１７β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌの分解；イネの重金属毒性の緩和；および人体に対して非常に有害なヒ素（Ｖ）イオンの還元による毒性の軽減などに関連するデイノコッカス属細菌由来の遺伝子群を本発明の発現プラスミドに導入し、デイノコッカス・グランディスを形質転換することで、有害物質分解能や有用物質生産能が強化された宿主を効率的に作出することができるので、バイオレメディエーション分野に加えて、アンチエイジング関連の化粧品・健康食品（例えば、国際公開第ＷＯ２０２２／０５０５５９号を参照。）製造分野への貢献が期待できる。
【0053】
とりわけ、有害物質分解能や有用物質生産能といった有用形質の発現には、複数種類の遺伝子が関わる場合が多いため、これらの有用形質の発現に関わるデイノコッカス属細菌由来の遺伝子群を本発明の発現プラスミドに導入し、デイノコッカス・グランディスを形質転換することで、有害物質分解能や有用物質生産能が強化された宿主を効率的に作出することができる。
【0054】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。本発明は、当該実施例に限定されない。
【実施例0055】
実施例１：デイノコッカス・グランディスのプラスミド欠失株ＴＹ１の作製
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２を、ＴＧＹ培地（バクトトリプトン０．５％、酵母エキス０．３％、グルコース０．１％）中４０℃で４８時間振とう培養した菌液を、ＴＧＹ寒天培地（バクトトリプトン０．５％、酵母エキス０．３％、グルコース０．１％、バクトアガー１．５％）に播種し、３０℃で４８時間静置培養した。ＴＧＹ寒天培地に生育したコロニーをランダムに１０個釣菌し、１ｍｌのＴＧＹ培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した。培養菌液にグリセロールを添加して作製したグリセロールストックを－８０℃で保存した。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２を、ＴＧＹ培地（バクトトリプトン０．５％、酵母エキス０．３％、グルコース０．１％）中４０℃で４８時間振とう培養した菌液を、ＴＧＹ寒天培地（バクトトリプトン０．５％、酵母エキス０．３％、グルコース０．１％、バクトアガー１．５％）に播種し、３０℃で４８時間静置培養した。ＴＧＹ寒天培地に生育したコロニーをランダムに１０個釣菌し、１ｍｌのＴＧＹ培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した。培養菌液にグリセロールを添加して作製したグリセロールストックを－８０℃で保存した。
【0056】
少量のグリセロールストックを４ｍｌのＴＧＹＭ培地（ＴＧＹ培地＋７０μＭ 塩化マンガン）に植菌し、３０℃で２４時間培養した菌体から定法（非特許文献１３を参照。）を用いてプラスミドを抽出した。また、コントロールとして、３０℃で培養し、４０℃での培養を経ていないデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２からも同様の方法でプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動で解析して、プラスミドｐＤＥＧＲ－３が菌体に保持されているかどうか確認した。
【0057】
抽出したプラスミドのアガロース電気泳動像を図１に示す。図１においてレーン１から１０は４０℃での培養を経て取得したコロニー由来の抽出液、レーン１１は４０℃での培養を経ていないコントロール由来の抽出液をそれぞれ示しており、レーン１から１１すべてにおいて８，０５５ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３が見られた。
【0058】
４０℃での培養を経て取得したコロニー由来のグリセロールストックを４ｍｌのＴＧＹ培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した菌体からＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（エムピーバイオメディカルズ社製）用いてゲノムＤＮＡを抽出した。また、コントロールとして、４０℃での培養を経ていないデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２からも同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の染色体に存在するグルタミン合成酵素遺伝子、プラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子、ＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子、ＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子およびプラスミドｐＤＥＧＲ－３に存在するＤＥＩＧＲ＿５００００７遺伝子に由来するＰＣＲ増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動で確認した。
【0059】
ここで、ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号１～１０）である。プライマーはＤＮＡデータベースの、
・デイノコッカス・グランディスのゲノム塩基配列
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００１）、
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００６）、および
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７）、
を参考して設計した。
・デイノコッカス・グランディスのゲノム塩基配列
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００１）、
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００６）、および
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７）、
を参考して設計した。
【0060】
グルタミン合成酵素遺伝子断片のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿１０２１８１ｖＦ：配列番号１）
ＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＴ
ＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＴ
【0061】
グルタミン合成酵素遺伝子断片のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿１０２１８１ｖＲ：配列番号２）
ＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＧＴ
ＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＧＴ
【0062】
ＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子断片のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿４０００３１ｖＦ：配列番号３）
ＣＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧ
ＣＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧ
【0063】
ＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子断片のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿４０００３１ｖＲ：配列番号４）
ＴＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣ
ＴＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣ
【0064】
ＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子断片のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿４０００８６ｖＦ：配列番号５）
ＡＴＧＡＣＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
ＡＴＧＡＣＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
【0065】
ＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子断片のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿４０００８６ｖＲ：配列番号６）
ＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴ
ＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＴＴ
【0066】
ＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子断片のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿４００１２７ｖＦ：配列番号７）
ＣＴＣＡＣＧＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡ
ＣＴＣＡＣＧＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡ
【0067】
ＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子断片のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿４００１２７ｖＲ：配列番号８）
ＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴ
ＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴ
【0068】
ＤＥＩＧＲ＿５００００７遺伝子断片のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿５００００８ｖＦ：配列番号９）
ＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＧＣ
ＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＧＣ
【0069】
ＤＥＩＧＲ＿５００００７遺伝子断片のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿５００００８ｖＲ：配列番号１０）
ＣＴＡＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣ
ＣＴＡＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣ
【0070】
結果を図２に示す。この図のｐＤＥＧＲ－ＰＬのプラスミドマップ上において、ＡはＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子領域のＰＣＲ増幅部位、ＢはＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子領域のＰＣＲ増幅部位、ＣはＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子領域のＰＣＲ増幅部位を示す。図２のアガロース電気泳動像において、Ｍは市販の直鎖状ＤＮＡ分子サイズマーカーを示す。レーン１から５は、コントロールとして、４０℃での培養を経ていないデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２から調製したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行ったものであり、レーン６から１０は、４０℃での培養を経て取得したコロニー由来のゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応を行ったものをそれぞれ示している。また、レーン１と６は染色体に存在するグルタミン合成酵素遺伝子領域（７２３ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン２と７はプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４０００３１遺伝子領域（６２３ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン３と８はプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４０００８６遺伝子領域（６５９ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン４と９はプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬに存在するＤＥＩＧＲ＿４００１２７遺伝子領域（６８７ｂｐ）のＰＣＲ産物、レーン５と１０はプラスミドｐＤＥＧＲ－３に存在するＤＥＩＧＲ＿５００００７遺伝子領域（７５０ｂｐ）のＰＣＲ産物をそれぞれ示す。コントロールで増幅が確認されたレーン２から４のＰＣＲ産物が、レーン７から９ではまったく見られなかった。これらの結果から、４０℃での培養を経たデイノコッカス・グランディスではプラスミドｐＤＥＧＲ－ＰＬが欠失しているが、プラスミドｐＤＥＧＲ－３が保持されていることが示され、これをデイノコッカス・グランディスＴＹ１株と命名した。
【0071】
実施例２：デイノコッカス・グランディスのプラスミド欠失株ＴＹ３の作製
デイノコッカス・グランディスＴＹ１株のプラスミドｐＤＥＧＲ－３の欠失株のスクリーニングを容易に行うために、ｐＤＥＧＲ－３に存在するＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子をトゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子および抗生物質ストレプトマイシン耐性遺伝子に置換したデイノコッカス・グランディスを作製した。作製方法は以下のとおりである。
デイノコッカス・グランディスＴＹ１株のプラスミドｐＤＥＧＲ－３の欠失株のスクリーニングを容易に行うために、ｐＤＥＧＲ－３に存在するＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子をトゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子および抗生物質ストレプトマイシン耐性遺伝子に置換したデイノコッカス・グランディスを作製した。作製方法は以下のとおりである。
【0072】
まず、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ損傷応答リプレッサーＤｄｒＯ遺伝子のプロモーター断片２６３ｂｐをＰＣＲ増幅した。次に、ｐＮＬ１．１［Ｎｌｕｃ］ベクター（プロメガ社製）を鋳型として、トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子断片５６４ｂｐをＰＣＲ増幅した。２６３ｂｐのＰＣＲ断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩで処理し、５６４ｂｐのＰＣＲ断片を制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで処理したものを、ストレプトマイシン耐性遺伝子供給プラスミドｐＫａｔＡＡＤ２（Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５２：３２１７－３２２６，２００６を参照。）のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部位に連結し、プラスミドｐＲＮＫＡＡＤを構築した。
【0073】
次に、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の上流７６９ｂｐおよびＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の下流７７０ｂｐをＰＣＲ増幅した断片を混合し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。また、プラスミドｐＲＮＫＡＡＤを鋳型としてＮｌｕｃおよびストレプトマイシン耐性遺伝子（ａａｄ）を含む３，０２５ｂｐの断片をｐＵＣ１９のインサートを増幅するプライマーを用いてＰＣＲ増幅したものをＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで処理した。これら３種類の制限酵素処理断片を、プラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドｐΔ５００００８ＬＡを構築した。さらに、プラスミドｐΔ５００００８ＬＡを鋳型としてｐＵＣ１９のインサートを増幅するプライマーでＰＣＲ増幅した断片を用いて、非特許文献１３に記載の方法でデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２を形質転換し、ストレプトマイシン耐性コロニーを取得し、ＴＹ１Ｎｌｕｃ株と命名した。
【0074】
ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号１１～２０）である。プライマーはＤＮＡデータベースの、
・デイノコッカス・グランディスのゲノム塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７）、
・ｐＮＬ１．１［Ｎｌｕｃ］の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＪＱ４３７３７０．１）、および
・ｐＵＣ１９の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／６６９１１７０）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
・デイノコッカス・グランディスのゲノム塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７）、
・ｐＮＬ１．１［Ｎｌｕｃ］の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＪＱ４３７３７０．１）、および
・ｐＵＣ１９の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／６６９１１７０）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
【0075】
ＤＮＡ損傷応答リプレッサーＤｄｒＯ遺伝子のプロモーター領域のフォワードプライマー（ｄｄｒＯ－ＲＤＲＭ５Ｋｐｎ：配列番号１１）
ＡＴＣＡＧＧＴＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＴＧ
ＡＴＣＡＧＧＴＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＴＧ
【0076】
ＤＮＡ損傷応答リプレッサーＤｄｒＯ遺伝子のプロモーター領域のリバースプライマー（ｄｄｒＯ－ＲＤＲＭ３Ｎｃｏ：配列番号１２）
ＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧＣＧ
ＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧＣＧ
【0077】
トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子断片のフォワードプライマー（Ｎｌｕｃ－５Ｎｃｏ：配列番号１３）
ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧ
ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧ
【0078】
トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ遺伝子断片のリバースプライマー（Ｎｌｕｃ－３Ｘｈｏ：配列番号１４）
ＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣ
ＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣ
【0079】
ＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の上流領域のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿５００００８－Ｅｃｏ５Ｆ：配列番号１５）
ＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＧＣ
ＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＧＣ
【0080】
ＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の上流領域のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿５００００８－Ｋｐｎ５Ｒ：配列番号１６）
ＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣ
ＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣ
【0081】
ＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の下流領域のフォワードプライマー（ＤＥＩＧＲ＿５００００８－Ｐｓｔ３Ｆ：配列番号１７）
ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡ
ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡ
【0082】
ＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の下流領域のリバースプライマー（ＤＥＩＧＲ＿５００００８－Ｈｉｎ３Ｒ：配列番号１８）
ＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣ
ＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣ
【0083】
ｐＵＣ１９のインサートを増幅するフォワードプライマー（ｐＫａｔ－ＦＰ：配列番号１９）
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ
【0084】
ｐＵＣ１９のインサートを増幅するプライマーリバースプライマー（ｐＫａｔ－ＲＰ：配列番号２０）
ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
【0085】
微生物のプラスミドを欠失させる方法としては高温での培養の他に、薬剤を使用する方法が知られている（Ｔｒｅｖｏｒｓ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３２：１４９－１５７，１９８６を参照。）。これを参考して、ＴＹ１Ｎｌｕｃ株を５ｎｇ／μｌのノボビオシンあるいは５ｎｇ／μｌのリファンピシンを添加したＴＧＹ培地中４０℃で４８時間振とう培養した菌液を１００倍希釈後、再度５ｎｇ／μｌのノボビオシンあるいは５ｎｇ／μｌのリファンピシンを添加したＴＧＹ培地に接種し、４０℃で７２時間振とう培養した。この培養液をＴＧＹ寒天培地に播種し、３０℃で４８時間静置培養した。ＴＧＹ寒天培地に生育したルシフェラーゼ非生産性でストレプトマイシン感受性のコロニーを２個ずつ釣菌し、１ｍｌのＴＧＹ培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した。培養菌液にグリセロールを添加して作製したグリセロールストックを－８０℃で保存した。
【0086】
実施例１と同様の操作によって、デイノコッカス・グランディスからプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、プラスミドが菌体に保持されているかどうか確認した。その結果を図３に示す。この図においてレーン１はデイノコッカス・グランディスＴＹ１株から抽出したプラスミド、レーン２はデイノコッカス・グランディスＴＹ１Ｎｌｕｃ株から抽出したプラスミド、レーン３と４は５ｎｇ／μｌのノボビオシンを含むＴＧＹ培地中で４０℃培養を行った菌液から取得したコロニー由来の抽出液、レーン５と６は５ｎｇ／μｌのリファンピシンを含むＴＧＹ培地中で４０℃培養を行った菌液から取得したコロニー由来の抽出液をそれぞれ示しており、レーン１では８，０５５ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３、レーン２ではＤＥＩＧＲ＿５００００８遺伝子の代わりにＮｌｕｃおよびストレプトマイシン耐性遺伝子（ａａｄ）を含む８，９６１ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３Δ８ＬＡが見られたのに対して、レーン３から６にはプラスミドが見られなかった。これらの結果から、得られたデイノコッカス・グランディスはＴＹ１株に存在するプラスミドｐＤＥＧＲ－３が欠失していることが示され、これをデイノコッカス・グランディスＴＹ３株と命名した。
【0087】
実施例３：デイノコッカス・グランディス－大腸菌シャトルベクターｐＧＲＣ５の構築
大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４を鋳型としてレプリコンを含む９３３ｂｐをＰＣＲ増幅し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで処理した。また、大腸菌プラスミドｐＧＢＭ５（国立遺伝学研究所から入手）由来のストレプトマイシン耐性遺伝子（ａａｄ）をデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター（ｋａｔＡ－ｐ）で発現できるプラスミドｐＫａｔＡＡＤ２をＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで処理して９８１ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＫａｔＡＡＤ２Ｌを構築した。
大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４を鋳型としてレプリコンを含む９３３ｂｐをＰＣＲ増幅し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで処理した。また、大腸菌プラスミドｐＧＢＭ５（国立遺伝学研究所から入手）由来のストレプトマイシン耐性遺伝子（ａａｄ）をデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター（ｋａｔＡ－ｐ）で発現できるプラスミドｐＫａｔＡＡＤ２をＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで処理して９８１ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＫａｔＡＡＤ２Ｌを構築した。
【0088】
次に、デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の８，０５５ｂｐのプラスミドｐＤＥＧＲ－３を鋳型としてレプリコン（ｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐ）を含む２０２２ｂｐをＰＣＲ増幅後ＫｐｎＩで処理した。この断片を、プラスミドｐＫａｔＡＡＤ２ＬのＫｐｎＩ部位に連結し、プラスミドｐＧＲＣ５を構築した。シャトルベクターｐＧＲＣ５のマップを図４に示す。図４において、ｐＤＥＧＲ－３ ｒｅｐはデイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の８，０５５ｂｐプラスミドのレプリコン、ｐ１５Ａ ｏｒｉは大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ａａｄは大腸菌ベクターｐＧＢＭ５由来のストレプトマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【0089】
ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号２１～２４）である。プライマーはＤＮＡデータベースの、
・ｐＡＣＹＣ１８４の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｘ０６４０３）、および
・デイノコッカス・グランディスのゲノム塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
・ｐＡＣＹＣ１８４の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｘ０６４０３）、および
・デイノコッカス・グランディスのゲノム塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＢＣＭＳ０１０００００７）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
【0090】
大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコンのフォワードプライマー（ｐ１５Ａ－ＦＰ＿Ｓｐｈ：配列番号２１）
ＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＧＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＧ
ＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＧＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＧ
【0091】
大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４由来のレプリコンのリバースプライマー（ｐ１５Ａ－ＲＰ＿Ｋｐｎ：配列番号２２）
ＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＡＴＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣ
ＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＡＴＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣ
【0092】
デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の８，０５５ｂｐプラスミドｐＤＥＧＲ－３のレプリコンのフォワードプライマー（ＤＥＧＲ３Ｆ１Ｋｐｎ：配列番号２３）
ＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ
ＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ
【0093】
デイノコッカス・グランディスＡＴＣＣ４３６７２の８，０５５ｂｐプラスミドｐＤＥＧＲ－３のレプリコンのリバースプライマー（ＤＥＧＲ３Ｒ１Ｋｐｎ：配列番号２４）
ＡＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＣＡＴＧ
ＡＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＣＡＴＧ
【0094】
実施例４：デイノコッカス・グランディス－大腸菌シャトルベクターｐＲＡＤＮ８の構築
デイノコッカス・ラジオデュランス－大腸菌シャトルベクターｐＩ３由来のシャトルベクターｐＲＡＤＮ１（Ｏｈｂａ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，３６３：１３３－１４１，２００５を参照。）を鋳型としてデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコン（ｐＵＥ１０ ｒｅｐ）を含む３，１６４ｂｐをＰＣＲ増幅後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶで処理した。また、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）をデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター（ｋａｔＡ－ｐ）で発現できるプラスミドｐＫａｔＣＡＴ５（非特許文献１３を参照。）をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶで処理した。これらの断片を連結し、プラスミドｐＲＡＤＮ７を構築した。
デイノコッカス・ラジオデュランス－大腸菌シャトルベクターｐＩ３由来のシャトルベクターｐＲＡＤＮ１（Ｏｈｂａ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，３６３：１３３－１４１，２００５を参照。）を鋳型としてデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコン（ｐＵＥ１０ ｒｅｐ）を含む３，１６４ｂｐをＰＣＲ増幅後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶで処理した。また、ｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）をデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター（ｋａｔＡ－ｐ）で発現できるプラスミドｐＫａｔＣＡＴ５（非特許文献１３を参照。）をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶで処理した。これらの断片を連結し、プラスミドｐＲＡＤＮ７を構築した。
【0095】
次に、大腸菌ベクターｐＧＢＭ５を鋳型としてレプリコン（ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐ）を含む１，９９７ｂｐをＰＣＲ増幅後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。また、プラスミドｐＲＡＤＮ７をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し４，０６３ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＲＡＤＮ８を構築した。シャトルベクターｐＲＡＤＮ８のマップを図５に示す。図５において、ｐＵＥ１０ ｒｅｐはデイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコン、ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ ｒｅｐは大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ｃａｔは大腸菌ベクターｐｃＤＮＡ３．１ＣＡＴ由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【0096】
ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号２５～２８）である。プライマーはＤＮＡデータベースの、
・ベクターｐＩ３の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＦ２０６７１７）、および
・プラスミドｐＳＣ１０１の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿００２０５６．１）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
・ベクターｐＩ３の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＦ２０６７１７）、および
・プラスミドｐＳＣ１０１の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿００２０５６．１）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
【0097】
デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンのフォワードプライマー（ｐＲＡＤＮ１－Ｘｈｏ－Ｆ２：配列番号２５）
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＴＣＧＣＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＡ
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＴＣＧＣＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＡ
【0098】
デイノコッカス・ラジオデュランスＳａｒｋ株プラスミドｐＵＥ１０由来のレプリコンのリバースプライマー（ｐＲＡＤＮ１－ＥｃｏＲＶ－Ｒ：配列番号２６）
ＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＧＡＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣ
ＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＧＡＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣ
【0099】
大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコンのフォワードプライマー（ｐＧＢＭ５－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｆ：配列番号２７）
ＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ
ＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ
【0100】
大腸菌ベクターｐＳＣ１０１由来のレプリコンのリバースプライマー（ｐＧＢＭ５－ＸｈｏＩ－Ｒ：配列番号２８）
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣ
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣ
【0101】
実施例５：デイノコッカス・グランディス－大腸菌シャトルベクターｐＺＴ２９Ｈの構築
特許文献１に記載のｐＺＴ１５系シャトルベクターのひとつであり非特許文献１３に記載のシャトルベクターｐＺＴ２９を、制限酵素ＫｐｎＩで処理した２，１０９ｂｐのＤＮＡ断片と、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，１６：ｅ０２５８５５３，２０２１に記載のハイグロマイシン耐性遺伝子供給プラスミドｐＫａｔＨＰＨをＫｐｎＩで処理した２，４９２ｂｐのＤＮＡ断片を連結し、シャトルベクターｐＺＴ２９Ｈを構築した。シャトルベクターｐＺＴ２９Ｈのマップを図６に示す。図６において、ｐＵＥ３０ ｒｅｐはデイノコッカス・ラジオプグナンスＡＴＣＣ１９１７２のプラスミドｐＵＥ３０由来のレプリコン、ｐＵＣ１９ ｏｒｉは大腸菌ベクターｐＵＣ１９由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ｈｙｇは大腸菌ベクターｐＤＲ２由来のハイグロマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
特許文献１に記載のｐＺＴ１５系シャトルベクターのひとつであり非特許文献１３に記載のシャトルベクターｐＺＴ２９を、制限酵素ＫｐｎＩで処理した２，１０９ｂｐのＤＮＡ断片と、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，１６：ｅ０２５８５５３，２０２１に記載のハイグロマイシン耐性遺伝子供給プラスミドｐＫａｔＨＰＨをＫｐｎＩで処理した２，４９２ｂｐのＤＮＡ断片を連結し、シャトルベクターｐＺＴ２９Ｈを構築した。シャトルベクターｐＺＴ２９Ｈのマップを図６に示す。図６において、ｐＵＥ３０ ｒｅｐはデイノコッカス・ラジオプグナンスＡＴＣＣ１９１７２のプラスミドｐＵＥ３０由来のレプリコン、ｐＵＣ１９ ｏｒｉは大腸菌ベクターｐＵＣ１９由来のレプリコン、ｋａｔＡ－ｐはデイノコッカス・ラジオデュランスのカタラーゼ遺伝子プロモーター、ｈｙｇは大腸菌ベクターｐＤＲ２由来のハイグロマイシン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【0102】
実施例６：デイノコッカス・グランディス－大腸菌シャトルベクターによるデイノコッカス・グランディス形質転換株の作出
実施例３で構築したシャトルベクターｐＧＲＣ５、実施例４で構築したシャトルベクターｐＲＡＤＮ８、実施例５で構築したシャトルベクターｐＺＴ２９Ｈを、実施例２で作製したデイノコッカス・グランディスＴＹ３株に導入して形質転換体を取得した。ｐＧＲＣ５を導入した形質転換体を取得する際はストレプトマイシンを、ｐＲＡＤＮ８を導入した形質転換体を取得する際はクロラムフェニコールを、ｐＺＴ２９Ｈを導入した形質転換体を取得する際はハイグロマイシンを選択マーカーとして用いた。次に、実施例１と同様の操作によって、デイノコッカス・グランディスの形質転換体からプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、プラスミドが菌体に保持されているかどうか確認した。
実施例３で構築したシャトルベクターｐＧＲＣ５、実施例４で構築したシャトルベクターｐＲＡＤＮ８、実施例５で構築したシャトルベクターｐＺＴ２９Ｈを、実施例２で作製したデイノコッカス・グランディスＴＹ３株に導入して形質転換体を取得した。ｐＧＲＣ５を導入した形質転換体を取得する際はストレプトマイシンを、ｐＲＡＤＮ８を導入した形質転換体を取得する際はクロラムフェニコールを、ｐＺＴ２９Ｈを導入した形質転換体を取得する際はハイグロマイシンを選択マーカーとして用いた。次に、実施例１と同様の操作によって、デイノコッカス・グランディスの形質転換体からプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、プラスミドが菌体に保持されているかどうか確認した。
【0103】
その結果を図７に示す。この図においてレーン１はデイノコッカス・グランディスＴＹ１株から抽出したプラスミドｐＤＥＲＧ－３（８，０５５ｂｐ）、レーン２はデイノコッカス・グランディスＴＹ３株由来の抽出液である。レーン３はｐＧＲＣ５（３，９０８ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン４はｐＺＴ２９Ｈ（４，６０１ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン５はｐＲＡＤＮ８（６，０４６ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン６は２種類のプラスミドｐＧＲＣ５とｐＺＴ２９Ｈを同時に含む形質転換体、レーン７は２種類のプラスミドｐＺＴ２９ＨとｐＲＡＤＮ８を同時に含む形質転換体、レーン８は２種類のプラスミドｐＲＡＤＮ８とｐＧＲＣ５を同時に含む形質転換体、レーン９は３種類のプラスミドｐＧＲＣ５とｐＺＴ２９ＨとｐＲＡＤＮ８を同時に含む形質転換体、レーンＭは市販のスーパーコイルＤＮＡサイズマーカーをそれぞれ示している。また、矢印はプラスミド抽出液に混在しているゲノムＤＮＡを示している。
【0104】
レーン３、６および９には、ｐＧＲＣ５に由来する３，９０８ｂｐの位置にバンドが見られることから、ｐＧＲＣ５はデイノコッカス・グランディスＴＹ３株中で単量体としてのみ存在することが示された。レーン４ではｐＺＴ２９Ｈの単量体に由来する４，６０１ｂｐの位置とｐＺＴ２９Ｈの２量体に由来する９，２０２ｂｐの位置にバンドが見られた。レーン５ではｐＲＡＮＤ８の単量体に由来する６，０４６ｂｐの位置とｐＲＡＮＤ８の２量体に由来する１２，０９２ｂｐの位置にバンドが見られた。レーン３、４、６および９を比較すると、プラスミドｐＧＲＣ５が単独で存在する形質転換体と他のプラスミドｐＧＲＣ５やｐＺＴ２９Ｈを同時に含む形質転換体では、プラスミドｐＧＲＣ５の存在量に大きな差異がなかった。同様に、レーン４、６、７および９を比較すると、プラスミドｐＺＴ２９Ｈが単独で存在する形質転換体と他のプラスミドｐＧＲＣ５やｐＲＡＮＤ８を同時に含む形質転換体では、プラスミドｐＺＴ２９Ｈの存在量に大きな差異がなかった。一方、レーン５、７、８および９を比較すると、プラスミドｐＲＡＮＤ８が単独で存在する形質転換体よりも、他のプラスミドｐＧＲＣ５やｐＺＴ２９Ｈを同時に含む形質転換体で、プラスミドｐＲＡＮＤ８は単量体よりも２量体としてより多く存在していた。レーン８では、ゲノムＤＮＡが泳動される位置よりも異動度が少ないところに複数のバンドが見られ、これはプラスミドｐＲＡＤＮ８とｐＧＲＣ５が共存する形質転換体で、ｐＲＡＤＮ８が２量体以上の多量体を形成することに由来していると考えられた。これらの結果から、プラスミドｐＧＲＣ５、ｐＺＴ２９Ｈ、ｐＲＡＮＤ８は、デイノコッカス・グランディスＴＹ３株で共存できることが示された。
【0105】
実施例７：トビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドの構築
非特許文献１３に記載のシャトルプラスミドｐＺＴ９０は、デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーター配列をもつ発現ベクターである。ｐＺＴ９０を鋳型にしてデイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーター領域を含む１５２ｂｐをＰＣＲ増幅後、制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩで処理した。このＤＮＡ断片を、実施例２で構築したプラスミドｐＲＮＫＡＡＤのＫｐｎＩ－ＮｃｏＩ部位に挿入し、ｐＧＮＫＡＡＤを構築した。
非特許文献１３に記載のシャトルプラスミドｐＺＴ９０は、デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーター配列をもつ発現ベクターである。ｐＺＴ９０を鋳型にしてデイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーター領域を含む１５２ｂｐをＰＣＲ増幅後、制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩで処理した。このＤＮＡ断片を、実施例２で構築したプラスミドｐＲＮＫＡＡＤのＫｐｎＩ－ＮｃｏＩ部位に挿入し、ｐＧＮＫＡＡＤを構築した。
【0106】
プラスミドｐＧＮＫＡＡＤを鋳型としてデイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子を配列番号３１および３２のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した６６９ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、実施例３で構築したシャトルベクターｐＧＲＣ５の制限酵素ＢａｍＨＩ－ＰｓｔＩ部位に挿入し、ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドｐＧＲＣ５ＧＮを構築した。
【0107】
プラスミドｐＧＮＫＡＡＤを鋳型としてデイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子を配列番号３３および３４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した６６７ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、実施例４で構築したシャトルベクターｐＲＡＤＮ８の制限酵素ＳａｌＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドｐＲＡＤＮ８ＧＮを構築した。
【0108】
プラスミドｐＧＮＫＡＡＤを鋳型としてデイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子を配列番号３１および３５のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した６６９ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで処理し、実施例５で構築したシャトルベクターｐＺＴ２９Ｈの制限酵素ＢａｍＨＩ－ＸｂａＩ部位に挿入し、ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドｐＺＴ２９ＨＧＮを構築した。
【0109】
ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号２９～３５）である。プライマーは
・デイノコッカス・ラジオデュランスのゲノム塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＺ＿ＣＰ０３８６６３．１）、および
・ｐＮＬ１．１［Ｎｌｕｃ］の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＪＱ４３７３７０．１）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
・デイノコッカス・ラジオデュランスのゲノム塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＺ＿ＣＰ０３８６６３．１）、および
・ｐＮＬ１．１［Ｎｌｕｃ］の塩基配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＪＱ４３７３７０．１）、
を参考して設計した。下線は制限酵素消化部位を示す。
【0110】
プラスミドｐＺＴ９０のｇｒｏＥＳプロモーター領域のフォワードプライマー（ｇｒｏＥｐ－Ｋｐｎ－Ｆ：配列番号２９）
ＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡ
ＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡ
【0111】
プラスミドｐＺＴ９０のｇｒｏＥＳプロモーター領域のリバースプライマー（ｇｒｏＥｐ－Ｎｃｏ－Ｒ：配列番号３０）
ＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＧ
ＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＧ
【0112】
デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐＧＲＣ５あるいはｐＺＴ２９Ｈに連結するためのフォワードプライマー（ＧＮ－ＢａｍＦ：配列番号３１）
ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴ
ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴ
【0113】
デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐＧＲＣ５に連結するためのリバースプライマー（ＧＮ－ＰｓｔＲ：配列番号３２）
ＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡ
ＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡ
【0114】
デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐＲＡＤＮ８に連結するためのフォワードプライマー（ＧＮ－ＳａｌＦ：配列番号３３）
ＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴ
ＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴ
【0115】
デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐＲＡＤＮ８に連結するためのリバースプライマー（ＧＮ－ＨｉｎＲ：配列番号３４）
ＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡ
ＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡ
【0116】
デイノコッカス・ラジオデュランスｇｒｏＥＳプロモーターとトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐＺＴ２９Ｈに連結するためのリバースプライマー（ＧＮ－ＸｂａＲ：配列番号３５）
ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡ
ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡ
【0117】
実施例８：相対プラスミドコピー数の計測
実施例７で構築したトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドｐＧＲＣ５ＧＮ、ｐＺＴ２９ＨＧＮおよびｐＲＡＤＮ８ＧＮを実施例６と同様にデイノコッカス・グランディスＴＹ３株に導入し形質転換体を取得した。次に、デイノコッカス・グランディスの形質転換体からプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、プラスミドのサイズと存在様態を確認した。その結果を図８に示す。図８において、レーンＭは市販のスーパーコイルＤＮＡサイズマーカー、レーン１はｐＧＲＣ５ＧＮ（４，５４５ ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン２はｐＺＴ２９ＨＧＮ（５，２５０ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン３はｐＲＡＤＮ８ＧＮ（６，６８３ｂｐ）を導入した形質転換体をそれぞれ示している。また、矢印はプラスミド抽出液に混在しているゲノムＤＮＡを示している。
実施例７で構築したトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドｐＧＲＣ５ＧＮ、ｐＺＴ２９ＨＧＮおよびｐＲＡＤＮ８ＧＮを実施例６と同様にデイノコッカス・グランディスＴＹ３株に導入し形質転換体を取得した。次に、デイノコッカス・グランディスの形質転換体からプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、プラスミドのサイズと存在様態を確認した。その結果を図８に示す。図８において、レーンＭは市販のスーパーコイルＤＮＡサイズマーカー、レーン１はｐＧＲＣ５ＧＮ（４，５４５ ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン２はｐＺＴ２９ＨＧＮ（５，２５０ｂｐ）を導入した形質転換体、レーン３はｐＲＡＤＮ８ＧＮ（６，６８３ｂｐ）を導入した形質転換体をそれぞれ示している。また、矢印はプラスミド抽出液に混在しているゲノムＤＮＡを示している。
【0118】
レーン１には、ｐＧＲＣ５ＧＮに由来する４，５４５ｂｐの位置にバンドが見られることから、実施例６で示したｐＧＲＣ５の結果と同様に、ｐＤＥＧＲ－３のレプリコンを持つプラスミドはデイノコッカス・グランディスＴＹ３株中で単量体としてのみ存在することが示された。レーン２ではｐＺＴ２９ＨＧＮの単量体に由来する５，２５０ｂｐの位置とｐＺＴ２９Ｈの２量体に由来する１０，５００ｂｐの位置にバンドが見られた。レーン３ではｐＲＡＤＮ８ＧＮの単量体に由来する６，６８３ｂｐの位置にバンドが見られたのに加えて、プラスミドの多量体構造を示すサイズの大きなバンドが見られた。
【0119】
発現プラスミドを導入した３種類の形質転換体に含まれるトビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子の発現量を比較するために、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて形質転換体のルシフェラーゼ活性（相対発光量／形質転換体培養菌液の波長６００ｎｍでの吸光度）を測定した。その結果、ｐＧＲＣ５ＧＮを導入した形質転換体のルシフェラーゼ活性は８，８８６±１５２、ｐＺＴ２９ＨＧＮを導入した形質転換体のルシフェラーゼ活性は１２，７０６±８６、ｐＲＡＤＮ８ＧＮを導入した形質転換体のルシフェラーゼ活性は２，７９２±１０６という値を示し、この値は図８で見られた発現プラスミドのバンドの蛍光強度と比例しているものと考えられた。これらの結果から、トビオキヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子を含む３種類の発現プラスミドのデイノコッカス・グランディスＴＹ３株での遺伝子発現が示された。
【産業上の利用可能性】
【0120】
本発明は、バイオレメディエーションなどの環境産業において利用可能である。また、本発明は、化粧品・健康食品製造分野においても利用可能であり得る。
【受託番号】
【0121】
デイノコッカス・グランディスＴＹ３株（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ＴＹ３）は、２０２３年４月１２日付で、日本国、郵便番号２９２－０８１８、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８８０として、ブダペスト条約に基づいた国際寄託がされている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】