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特開2024-172618配列決定によるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオフターゲット検出（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024172618
(43)【公開日】2024-12-12
(54)【発明の名称】配列決定によるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオフターゲット検出（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ）
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6809 20180101AFI20241205BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20241205BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241205BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241205BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241205BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6809 Z
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023090453
(22)【出願日】2023-05-31
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516314125
【氏名又は名称】ヴィリニュス・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｖｉｌｎｉｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ミンダウガス ザレンバ
(72)【発明者】
【氏名】パウリウス トリウシス
(72)【発明者】
【氏名】タウトヴィダス カルヴェリス
(72)【発明者】
【氏名】ギエドリウス サスナウスカス
(72)【発明者】
【氏名】トーマス シンクナス
(72)【発明者】
【氏名】アルギルダス グリバウスカス
(72)【発明者】
【氏名】アルーナス シランスカス
(72)【発明者】
【氏名】エヴェリナ ザゴルスカイテ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA12
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR62
4B063QR90
4B063QS25
4B063QS36
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼによってヒトゲノムＤＮＡ試料から生じたｉｎ ｖｉｔｒｏ二本鎖切断（ＤＳＢ）を検出する方法を提供する。
【解決手段】ＤＮＡにおける二本鎖切断を検出するための方法であって、前記方法が、切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階；ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに捕捉する段階；前記ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合していない非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤を添加する段階；ＰＣＲライブラリーの増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階を備える、方法とする。
【選択図】図１
【解決手段】ＤＮＡにおける二本鎖切断を検出するための方法であって、前記方法が、切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階；ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに捕捉する段階；前記ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合していない非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤を添加する段階；ＰＣＲライブラリーの増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階を備える、方法とする。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＮＡにおける二本鎖切断を検出するための方法であって、前記ＤＮＡの切断がプログラム可能なヌクレアーゼによって誘導され、前記方法が、
切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階、ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む；
ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、前記ライゲーションされたＤＮＡをインキュベートする段階；
ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに捕捉する段階；
前記ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合していない非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加する段階；
ＰＣＲライブラリーの増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；
前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び
前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階
を備える、方法。
切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階、ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む；
ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、前記ライゲーションされたＤＮＡをインキュベートする段階；
ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに捕捉する段階；
前記ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合していない非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加する段階；
ＰＣＲライブラリーの増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；
前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び
前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階
を備える、方法。
【請求項2】
前記ＤＮＡが、ｄｓＤＮＡ：合成ゲノムＤＮＡ、目的の細胞型由来のｇＤＮＡ、又はプラスミドＤＮＡのうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡが、細菌、哺乳動物、植物、酵母又は真菌細胞から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
二本鎖切断誘導物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
二本鎖切断誘導物質が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
二本鎖切断誘導物質が、操作Ｃａｓ９バリアント及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記アダプターが、次世代シーケンシングプライマー配列又はランダム化ＤＮＡバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記非ビオチン化鎖合成プライマーが、次世代シーケンシングプライマー配列、ランダム化ＤＮＡバーコード又は固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
ＤＮＡにおける二本鎖切断を検出するための方法であって、前記ＤＮＡの切断がプログラム可能なヌクレアーゼによって誘導され、前記方法が、
切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階、ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む；
ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、前記ライゲーションされたＤＮＡをインキュベートする段階；
ＤＮＡを約１００～５００ｂｐの平均長に断片化するのに必要な条件下で、ＤＮａｓｅ Ｉを用いてＤＮＡを断片化する段階；
ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉する段階；
非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加する段階；
約１０～５０ｎｔの平均長のポリＣ尾部を生成するのに必要な条件下で、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）を用いて３'ＤＮＡ末端にポリＣ尾部を付加する段階；
ＰＣＲライブラリーの増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；
前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び
前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階
を備える、方法。
切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階、ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む；
ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、前記ライゲーションされたＤＮＡをインキュベートする段階；
ＤＮＡを約１００～５００ｂｐの平均長に断片化するのに必要な条件下で、ＤＮａｓｅ Ｉを用いてＤＮＡを断片化する段階；
ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉する段階；
非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加する段階；
約１０～５０ｎｔの平均長のポリＣ尾部を生成するのに必要な条件下で、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）を用いて３'ＤＮＡ末端にポリＣ尾部を付加する段階；
ＰＣＲライブラリーの増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；
前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び
前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階
を備える、方法。
【請求項10】
前記ＤＮＡが、ｄｓＤＮＡ：合成ゲノムＤＮＡ、目的の細胞型由来のｇＤＮＡ、又はプラスミドＤＮＡのうちの１つである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＤＮＡが、細菌、哺乳動物、植物、酵母又は真菌細胞から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
二本鎖切断誘導物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
二本鎖切断誘導物質が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
二本鎖切断誘導物質が、操作Ｃａｓ９バリアント及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記アダプターが、次世代シーケンシングプライマー配列又はランダム化ＤＮＡバーコードを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記非ビオチン化鎖合成プライマーが、次世代シーケンシングプライマー配列、ランダム化ＤＮＡバーコード又は固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示の分野は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のゲノム編集ヌクレアーゼによって生じた二本鎖切断を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム編集技術の首尾よい開発は、プログラム可能なヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ等）を使用して誘導された二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）を検出及び定量する基礎研究のためだけでなく、特にＣａｓ９に基づく技術をゲノム編集及び操作にとってより安全なものにするための臨床応用のためにも重要である。これらのヌクレアーゼは、標的部位に類似しているＤＮＡ部位を切断し、結果として、細胞死又は癌細胞への形質転換を引き起こす染色体再配列又は変異をもたらす傾向がある。ＤＳＢ検出のための最新技術の方法は、適切なレベルの感度を欠いており、実験的に複雑で、長期に及び、費用がかかる。ゲノム編集技術をより安全なものにするために、選択されたヌクレアーゼの特異性及び適切性を評価するための、ＤＳＢ検出のための高感度かつより使いやすいｉｎ ｖｉｔｒｏ法を利用することが極めて重要である。
【0003】
本明細書において、本発明者らは、簡素で低予算の実験室及び企業により好適な、急速で費用効率が高く、かつ使いやすい方法（配列決定によるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオフターゲット検出（ＣＲＩＳＰＲ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、又はＣＲＯＦＴ－ｓｅｑ）を提示する。先行文献（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ）にはＣＬＥＡＶＥ－Ｓｅｑ法が記載されているが、類似した段階：ｄｓＤＮＡ末端の脱リン酸化、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＲＮＰ）複合体によるＤＮＡ切断、ビオチン化アダプターライゲーション、ストレプトアビジンビーズを用いるアフィニティ精製、非ビオチン化ＤＮＡ鎖の合成、ＤＮＡライブラリー増幅がＣＲＯＦＴ－ｓｅｑに含まれる。しかしながら、ＣＲＯＦＴ－ｓｅｑでは、固有のビオチン化アダプター設計及び方法段階条件及び組成のために、ＤＳＢ検出は、ＣＬＥＡＶＥ－ｓｅｑ及び他のｉｎ ｖｉｔｒｏ法と比較してより容易、より迅速かつより安価である。本発明の詳細な利点は、明細書、図面及び特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
【発明の概要】
【0004】
本明細書において提供される教示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のゲノム編集ヌクレアーゼを使用して生じたＤＳＢの検出のための、高感度で、急速でかつ費用効率が高い、バイアスのないｉｎ ｖｉｔｒｏ法（代替的な段階のバリエーションを含む）の開発及び改善に基づいている。
【0005】
ｄｓＤＮＡにおける、プログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）によって誘導された、二本鎖切断の検出のための方法であって；切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションし（ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む）、ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、試料をインキュベートし；任意選択で、ＤＮＡを約１００～５００ｂｐの平均長に断片化するのに必要な条件下で、ＤＮａｓｅ Ｉを用いてＤＮＡを断片化し；ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉し；非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加し；任意選択で、約１０～５０ｎｔの平均長のポリＣ尾部を生成するのに必要な条件下で、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）を用いて３'ＤＮＡ末端にポリＣ尾部を付加し；ＰＣＲライブラリー増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成し；前記ライブラリーを増幅し、プールし、精製し；それらのライブラリーを配列決定する、方法が本明細書において提供される。
【0006】
いくつかの実施形態において、方法は、ｄｓＤＮＡ：合成ゲノムＤＮＡ、目的の細胞型由来のｇＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含むことができる。
【0007】
いくつかの実施形態において、ＤＳＢ誘導物質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼからなる群から選択される。
【0008】
いくつかの実施形態において、ＤＳＢ誘導物質は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。
【0009】
いくつかの実施形態において、ＤＳＢ誘導物質は、操作Ｃａｓ９バリアント及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記アダプターは、次世代シーケンシングプライマー配列、ランダム化ＤＮＡバーコードを含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記非ビオチン化鎖合成プライマーは、次世代シーケンシングプライマー配列、ランダム化ＤＮＡバーコード又は固有分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＵＭＩ）を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡは、哺乳動物、細菌、植物、酵母又は真菌細胞（例えば、ｇＤＮＡ）から単離される。
【0013】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは合成である。
【0014】
本明細書で提供される方法は、ゲノム編集ヌクレアーゼによって誘導された二本鎖切断を検出する能力を改善する。また、これは、他のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏオフターゲット検出法に対する利点を有する。例えば、本方法はｉｎ ｖｉｔｒｏであり、ｉｎ ｖｉｖｏ法と異なり、オフターゲット検出は、クロマチン状態又は操作ヌクレアーゼ及びその成分の細胞へのトランスフェクション及び発現に依存しない。更に、本方法は、磁気ビーズを用いる連続ライブラリー精製段階を必要としない。
【0015】
本明細書で特定の用語及び参考文献と共に記載される方法は、本発明の関連分野の当業者によって理解されるだろう。当技術分野で公知の方法及び材料の詳細に関する形態の様々な変更は、ここにおいて、方法の範囲から逸脱することなく行うことができる。例えば、特定のＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する、以下に記載される例が存在してもよく、種々の生物由来の他のＣａｓ９ヌクレアーゼが適用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】方法の概略的なスキームを示す。
【図2】方法の詳細な図を示す。
【図3】ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１を使用したＦＡＮＣＦオフターゲット検出の選択された結果を示す。
【図4】ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２を使用したＦＡＮＣＦオフターゲット検出の選択された結果を示す。
【図5】ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１を使用したＶＥＧＦＡ１オフターゲット検出の選択された結果を示す。
【図6】ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２を使用したＶＥＧＦＡ１オフターゲット検出の選択された結果を示す。
【図7】ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１を使用したＸＲＣＣ５オフターゲット検出の選択された結果を示す。
【図8】ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２を使用したＸＲＣＣ５オフターゲット検出の選択された結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のプログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼは、個別化医療における大きな可能性を有し、科学界に広範囲にわたる関心をもたらした。これらの酵素は、正確な遺伝子変異をゲノムＤＮＡに急速かつ的確に与える。これは、誘導されたＤＮＡ切断を真核細胞が相同組換えによって的確に修復できるために可能である。しかしながら、種々のオフターゲット部位において意図されない切断が起こる場合があり、低頻度切断でさえ、不要な、又は有害でさえある遺伝子変異を引き起こし得る。今日まで、様々な細胞培養に基づく方法及び無細胞方法が、ゲノム編集ヌクレアーゼによって生じたオフターゲット切断部位を検出するために開発されている。細胞培養に基づく方法は、例えば、遺伝子編集前後の全ゲノムを配列決定するＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、全ゲノム配列決定）、二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｄｓＯＤＮ）のＤＳＢへの組み込みに依存するＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＳＢｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、配列決定によって可能となった、ゲノムワイドな、バイアスのないＤＳＢ同定）、ビオチン化アダプターによってｉｎ ｓｉｔｕでＤＳＢを捕捉するＢＬＥＳＳ（ｂｒｅａｋｓ ｌａｂｅｌｉｎｇ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｎ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｎｄ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ストレプトアビジン及び次世代シーケンシングによる切断標識、濃縮）、ＩＤＬＶのＤＳＢへの組み込みに依存するＩＤＬＶ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター）、及びＤＮＡ修復タンパク質ＭＲＥ１１を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＤＳＢを同定するＤＩＳＣＯＶＥＲ－Ｓｅｑ（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃａｓ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ｉｎ ｓｉｔｕのＣａｓオフターゲットの発見及び配列決定による確認）である（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０２３）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）。これらの方法は、細胞におけるオフターゲット事象を直接的に示すことができるが、高い偽陰性率、ｄｓＯＤＮの低い組み込み、低感度を含むいくつかの制限があり、試料調製時にのみＤＳＢを検出し、クロマチン状況に依存し、かつ高額である。
【0018】
他方、無細胞方法は、精製されたゲノムＤＮＡを使用し、細胞トランスフェクション効率、クロマチン構造、ＤＮＡ修復機構を含む、細胞に基づく制限に依存せず、ヌクレアーゼ、ゲノムＤＮＡ濃度及び切断時間を変更することが容易であるため、細胞に基づく方法に対する利点を有する。今日までに、多くの記載されている無細胞ゲノムワイドオフターゲット同定アッセイ、例えば、全ての遊離ＤＮＡ末端への配列決定用アダプターライゲーションに依存するＤｉｇｅｎｏｍｅ－Ｓｅｑ（ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、消化ゲノム配列決定）、修復されたＤＮＡ末端を、ビオチン化アダプターを用いて捕捉するＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｇｇｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｎｄｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、配列決定によるタグ付きゲノムＤＮＡ末端の選択的濃縮及び同定）、ゲノムＤＮＡの環状化に依存するＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、配列決定による切断作用のｉｎ ｖｉｔｒｏ報告のための環状化）、ＰＣＲ増幅段階を伴わないＤＮＡへの配列決定用アダプターライゲーションに依存するＲＧＥＮ－Ｓｅｑ（ＰＣＲ－ｆｒｅｅ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ＰＣＲフリー次世代シーケンシング法）、及びヌクレアーゼを用いたＤＮＡ切断及び平滑末端アダプターライゲーション前の遊離ＤＮＡ末端の脱リン酸化に依存するＣＬＥＡＶＥ－Ｓｅｑが存在する（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０２３）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）。これらの方法は、細胞に基づく方法よりも遥かに多くの潜在的なオフターゲット部位を検出することができるが、いくつかの制限が存在する。例えば、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－Ｓｅｑは、高いバックグラウンドのランダム剪断ＤＮＡが配列決定されるため、試料１つ当たり大量のリード（４億超のリード）を必要とする。ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ、ＲＧＥＮ－Ｓｅｑ及びＣＬＥＡＶＥ－Ｓｅｑは、感度が不十分で、低い検証率を示す。にもかかわらず、これらの方法は、労働集約的であり、時間がかかり、かつ高額である。また、これらの方法は、通例、ＤＮＡ剪断及び磁気ビーズを用いる多くのＤＮＡ精製段階を必要とする。
【0019】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼによってヒトゲノムＤＮＡに誘導されたオフターゲット部位の高感度検出を実現する、２つのバージョンを有する新規無細胞方法であるＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ（配列決定によるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオフターゲット検出）が本明細書に記載される（図２）。ＣＬＥＡＶＥ－Ｓｅｑ法（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，６７２９、２０１９年５月１０日に出願された米国特許出願公開第２０２１０１４７９０９Ａ１号）と同様に、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑは、ヌクレアーゼ酵素を用いる消化前の、後にアダプターライゲーションを妨げるランダム切断ＤＮＡ末端の脱リン酸化に基づく。これは、リン酸を含有する遊離ＤＮＡ末端を著しく減少させるホスファターゼを用いてゲノムＤＮＡを処理することによって達成される。次いで、ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ等のゲノム編集ヌクレアーゼを用いて処理され、大半の場合、５'リン酸基を有する平滑末端の末端を有する切断産物が生じる（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（３９）：Ｅ２５７９－８６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－２１）。次いで、切断産物は、非リン酸化アダプター（一方が平滑末端であり、他方が５'ビオチンを有する粘着末端である）に選択的にライゲーションされ得る。その後、ライゲーションされていないアダプターは、ライゲーションされていないアダプターのＤＮＡ鎖が分離し、一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼを用いて除去される最適な条件で除去される。これは、他のｉｎ ｖｉｔｒｏオフターゲット検出法において一般的な磁気ビーズを使用するアダプター除去のあらゆる必要性を排除する。これはまた、残留しているライゲーションされていないアダプターから生じ得る高いバックグラウンドノイズを除去する。あるいは、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２では、アダプター除去中に、ライゲーションされたＤＮＡは、必要とされる条件下において、デオキシリボヌクレアーゼを用いて１００～５００ｂｐの断片にされ得、これは更なる段階のために必要である。次の段階では、ビオチン化アダプターを有するライゲーションされたＤＮＡ切断産物は、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して精製される。磁気ビーズへのＤＮＡ固定化は、非常に最小限のＤＮＡ喪失で、更なる適用のための任意の望ましいバッファー組成への変更を容易に可能にする。ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ又はＳＩＴＥ－Ｓｅｑ等の他のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、バッファー組成を変更するために連続ビーズ精製段階を使用するが、この場合、ＤＮＡは著しく喪失し、また、これは時間がかかる（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，６７２９、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，６００－６０６）。次の段階では、非ビオチン化ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ鎖を分離するために必要な条件下で（すなわち、ＮａＯＨを用いて）除去される。これは、不要かつ更なる段階において干渉し得るＤＮＡの除去を可能にする。あるいは、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２では、相補鎖除去後、１０～５０ｎｔ長のポリＣ尾部が末端デオキシヌクレオチド転移酵素によってｓｓＤＮＡの３'末端に付加される。次いで、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑの両方のバージョン由来の固定化ｓｓＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる非ビオチン化鎖合成のために使用される。加えて、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１では、非ビオチン化鎖合成プライマーは、ＰＣＲ重複の正確なバイオインフォマティクス的同定を可能にする固有分子識別子（ＵＭＩ）として使用され得る１２Ｎヌクレオチド配列（ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである）を含有する。次いで、結果として得られたＤＮＡは、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズから放出され、ハイスループット配列決定のためにＰＣＲによって増幅される。ＤＮＡにおける二本鎖切断を検出するための方法であって、前記ＤＮＡの切断がプログラム可能なヌクレアーゼによって誘導され、前記方法が、
切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階、ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む；
ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、前記ライゲーションされたＤＮＡをインキュベートする段階；
ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに捕捉する段階；
前記ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合していない非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加する段階；
ＰＣＲライブラリー増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；
前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び
前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階
を備える、方法。
切断ＤＮＡ末端にアダプターをライゲーションする段階、ここで、アダプターは、前記ライゲーションされたＤＮＡを精製するためのビオチンを含む；
ライゲーションされていない前記アダプターを、エキソヌクレアーゼＩを用いて除去するのに十分な条件下で、前記ライゲーションされたＤＮＡをインキュベートする段階；
ライゲーションされたＤＮＡをストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに捕捉する段階；
前記ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合していない非ビオチン化ＤＮＡ鎖を除去することが可能な薬剤（例えばＮａＯＨ）を添加する段階；
ＰＣＲライブラリー増幅及び配列決定における使用に適合性の非ビオチン化鎖合成プライマーを使用して相補鎖を合成する段階；
前記ＰＣＲライブラリーを増幅し、プールし、精製する段階；及び
前記ＰＣＲライブラリーを配列決定する段階
を備える、方法。
【0020】
ＳｐＣａｓ９を使用したＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑの検証結果は、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑによって同定された上位５％のオフターゲット部位（リード数が、リストの最上位のオフターゲット部位のリード数の５％閾値を超えるオフターゲットを含む）の２０％超がｉｎ ｖｉｖｏにおいても編集されたことを示した（図３～８）。しかしながら、検証されたオフターゲット部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑを用いて同定されたオフターゲット部位のリード数と常に相関するわけではなかった。種々の遺伝子位置は、クロマチンアクセシビリティ、ＤＮＡ修復、又は細胞における種々の濃度のＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ等の様々な因子による影響を受けるため、この現象は、他のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ又はＳＩＴＥ－Ｓｅｑオフターゲット法においても観察される。しかしながら、特異的ＤＳＢヌクレアーゼ又はｓｇＲＮＡの検証率は、将来のゲノム編集に対するそれらの適切性を示し得る。
【0021】
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ法は、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ段階のそれぞれに対して試験及び最適化されている、公知の組成を有する個々の酵素、試薬及びバッファーを使用する。これは、専売かつ開示されていない組成を有する市販のキットと比較して、試料１つ当たりの価格及び方法全体を実行するための時間を著しく減少させる。また、方法は、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，６７２９）又はＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，６００－６０６）のような磁気ビーズを用いるＤＮＡライブラリー精製段階を必要とせず、それを自動化に非常に好適なものにする。治療の観点では、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑは、およそ１０倍多い検出されたオフターゲット部位のリードを生成するため、ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ又はＳＩＴＥ－Ｓｅｑ等の他の高感度のｉｎ ｖｉｔｒｏオフターゲット検出法よりも優れている。更に、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑは、わずか１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して実行することができ、これにより、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑは、ＤＮＡ単離物が非常に低い収量をもたらす場合に様々な細胞及び組織においてオフターゲット部位を検出するための効果的な手段となる。低費用、時間効率がよいこと、高感度及び快適な自動化の可能性は、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑを、ゲノム編集ヌクレアーゼのオフターゲット部位を同定する強力かつ魅力的な手段にする。
【0022】
「ゲノム編集ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、生物のゲノムにおける標的配列中に二本鎖切断を生じる任意の組成物を指す。ゲノム編集ヌクレアーゼは、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（３）：１１５６－６０）、メガヌクレアーゼ（米国特許出願第２３３２号及びＢＢ１９９０号）、ＴＡＬＥＮ（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６（２）：７５７－６１）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ １５７，１２６２－１２７８）等のエンドヌクレアーゼを含むタンパク質であり得る。
【0023】
配列番号１は、ＦＡＮＣＦ遺伝子における標的化部位であるＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ ＲＮＡの配列である。
５'－ＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣ＋Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＥＺスキャフォールド－３'
５'－ＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣ＋Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＥＺスキャフォールド－３'
【0024】
配列番号２は、ＶＥＧＦＡ１遺伝子における標的化部位であるＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ ＲＮＡの配列である。
５'－ＧＧＧＵＧＧＧＧＧＧＡＧＵＵＵＧＣＵＣＣ＋Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＥＺスキャフォールド－３'
５'－ＧＧＧＵＧＧＧＧＧＧＡＧＵＵＵＧＣＵＣＣ＋Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＥＺスキャフォールド－３'
【0025】
配列番号３は、ＸＲＣＣ５遺伝子における標的化部位であるＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ ＲＮＡの配列である。
５'－ＧＧＵＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＡＵＡＧ＋Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＥＺスキャフォールド－３'
５'－ＧＧＵＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＡＵＡＧ＋Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＥＺスキャフォールド－３'
【0026】
配列番号４は、アダプターのビオチン化上鎖ＤＮＡ配列の配列である。
５'－ビオチン－ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３'
５'－ビオチン－ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３'
【0027】
配列番号５は、アダプターの下鎖ＤＮＡの配列である。
５'－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＧ－３'
５'－ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＧ－３'
【0028】
配列番号６は、３'末端に１２Ｎ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴのいずれかである）ヌクレオチドを含有する、非ビオチン化鎖合成のためのＮＮＮオリゴヌクレオチドの配列である。
５'－ＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'
５'－ＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'
【0029】
配列番号７は、３'末端に１２Ｇヌクレオチド及び１Ｈ（ＨはＡ、Ｃ又はＴのいずれかである）ヌクレオチドを含有する、非ビオチン化鎖合成のためのＧＧＧオリゴヌクレオチドの配列である。
５'－ＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＨ－３'
５'－ＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＨ－３'
【0030】
配列番号８は、ｑＰＣＲのためのフォワードＤＮＡ鎖オリゴヌクレオチドの配列である。ＮはＡ、Ｃ又はＴのいずれかである。
５'－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３'
５'－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３'
【0031】
配列番号９は、ｑＰＣＲのためのリバースＤＮＡ鎖オリゴヌクレオチドの配列である。
５'－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ－３'
５'－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ－３'
【0032】
配列番号１０は、８Ｎ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴのいずれかである）ヌクレオチドを含有するフォワードＤＮＡ鎖インデックスオリゴヌクレオチドの配列である。
５'－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３'
５'－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３'
【0033】
配列番号１１は、８Ｎ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴのいずれかである）ヌクレオチドを含有するリバースＤＮＡ鎖インデックスオリゴヌクレオチドの配列である。
５'－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ－３'
（本発明の実施形態）
５'－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ－３'
（本発明の実施形態）
【0034】
例示の目的でのみ提供され、本発明の範囲を限定することを全く意図していない以下の例に本発明を更に記載する。
【0035】
以下の例では、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９をＤＳＢ剤として利用した。
【0036】
（細胞培養及びトランスフェクション）
野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＤＭＥＭ培地において、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。全ての細胞を８０％未満の集密度に維持した。細胞を、トランスフェクションの１日前に、１２ウェルプレートに、１ウェル当たり、５００μＬの培養培地中およそ２５０，０００個播種した。全てのトランスフェクションは、３．６μＬ／１．４μｇ／１８０μＬ（ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／Ｃａｓ９のみ又はＣａｓ９及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミド／ＤＭＥＭ培地の容量）で実行した。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの３日後に回収した。ゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴゲノムＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製し、Ｑｕｂｉｔ４．０蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。
野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＤＭＥＭ培地において、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。全ての細胞を８０％未満の集密度に維持した。細胞を、トランスフェクションの１日前に、１２ウェルプレートに、１ウェル当たり、５００μＬの培養培地中およそ２５０，０００個播種した。全てのトランスフェクションは、３．６μＬ／１．４μｇ／１８０μＬ（ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／Ｃａｓ９のみ又はＣａｓ９及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミド／ＤＭＥＭ培地の容量）で実行した。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの３日後に回収した。ゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴゲノムＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製し、Ｑｕｂｉｔ４．０蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。
【0037】
（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑライブラリー調製（概略））
ＦＡＮＣＦ、ＶＥＧＦＡ１及びＸＲＣＣ５ ｓｇＲＮＡを用いるか又はｓｇＲＮＡを用いないＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ（バージョン１及び２）実験を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の精製したゲノムＤＮＡ又は市販のヒトゲノムＤＮＡ（ｒｏｃｈｅ）に対して実行した。ゲノムＤＮＡを、感熱性アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応を、１００ｎＭのＳｐＣａｓ９、１００ｎＭの市販のｓｇＲＮＡ及び１μｇのヒトゲノムＤＮＡを含有する４０μｌの反応容量中で実行した。消化産物を、ビオチン化アダプターにライゲーションし、エキソヌクレアーゼＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び加えてＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合のみ）を用いて処理した。ライゲーションされたＤＮＡ産物を、ストレプトアビジンコーティングＭｙＯｎｅ Ｃ１磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に固定化した。相補的なＤＮＡ鎖を、ＮａＯＨを用いて除去し、加えてポリＣ尾部を、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＤＮＡの３'末端に付加した（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合のみ）。非ビオチン化ＤＮＡ鎖を、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成した。次いで、ＤＮＡを磁気ビーズから切り離し、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲによって増幅した。完成したライブラリーを、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって定量し、１００ｂｐのペアエンドリードを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５５０又は２０００プラットフォーム上で配列決定した。ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑライブラリー構築の詳細なプロトコルは、実施例６で提供される。
ＦＡＮＣＦ、ＶＥＧＦＡ１及びＸＲＣＣ５ ｓｇＲＮＡを用いるか又はｓｇＲＮＡを用いないＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ（バージョン１及び２）実験を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の精製したゲノムＤＮＡ又は市販のヒトゲノムＤＮＡ（ｒｏｃｈｅ）に対して実行した。ゲノムＤＮＡを、感熱性アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて処理した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応を、１００ｎＭのＳｐＣａｓ９、１００ｎＭの市販のｓｇＲＮＡ及び１μｇのヒトゲノムＤＮＡを含有する４０μｌの反応容量中で実行した。消化産物を、ビオチン化アダプターにライゲーションし、エキソヌクレアーゼＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び加えてＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合のみ）を用いて処理した。ライゲーションされたＤＮＡ産物を、ストレプトアビジンコーティングＭｙＯｎｅ Ｃ１磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に固定化した。相補的なＤＮＡ鎖を、ＮａＯＨを用いて除去し、加えてポリＣ尾部を、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＤＮＡの３'末端に付加した（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合のみ）。非ビオチン化ＤＮＡ鎖を、ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成した。次いで、ＤＮＡを磁気ビーズから切り離し、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲによって増幅した。完成したライブラリーを、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって定量し、１００ｂｐのペアエンドリードを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５５０又は２０００プラットフォーム上で配列決定した。ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑライブラリー構築の詳細なプロトコルは、実施例６で提供される。
【0038】
（ｒｈＡｍｐＳｅｑディープシーケンシング）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、上に記載したようなＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした。各ｓｇＲＮＡに関するオフターゲットリストをＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑによって同定し、最上位のオフターゲット部位リード深度から計算した上位５％のオフターゲットを検証のために選択した（図３～８）。合計で２１２のオフターゲット部位（オンターゲット部位を含む）を、３つの標的部位（ＦＡＮＣＦ、ＶＥＧＦＡ１及びＸＲＣＣ５）に対して選択した。ＰＣＲ ｒｈＡｍｐＳｅｑプライマーを全２１２の部位に対して首尾よく設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）に注文した。製造業者のプロトコルに従って、ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＰＣＲライブラリーを、ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＣＲＩＳＰＲライブラリーキット（ＩＤＴ）を使用して、２５ｎｇの精製されたＨＥＫ２９３ＴゲノムＤＮＡ重複から増幅した。結果として得られたＰＣＲ産物を、異なるｓｇＲＮＡを使用したトランスフェクションに対応する異なるライブラリーにプールし、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて精製した。結果として得られたｒｈＡｍｐＳｅｑライブラリーを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量及び解析し、ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００配列決定装置において３０００００超の平均リード深度で配列決定した。配列決定データは、ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＣＲＩＳＰＲ解析ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｒｈａｍｐｓｅｑ－ｃｒｉｓｐｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌ）を用いて解析する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、上に記載したようなＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした。各ｓｇＲＮＡに関するオフターゲットリストをＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑによって同定し、最上位のオフターゲット部位リード深度から計算した上位５％のオフターゲットを検証のために選択した（図３～８）。合計で２１２のオフターゲット部位（オンターゲット部位を含む）を、３つの標的部位（ＦＡＮＣＦ、ＶＥＧＦＡ１及びＸＲＣＣ５）に対して選択した。ＰＣＲ ｒｈＡｍｐＳｅｑプライマーを全２１２の部位に対して首尾よく設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）に注文した。製造業者のプロトコルに従って、ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＰＣＲライブラリーを、ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＣＲＩＳＰＲライブラリーキット（ＩＤＴ）を使用して、２５ｎｇの精製されたＨＥＫ２９３ＴゲノムＤＮＡ重複から増幅した。結果として得られたＰＣＲ産物を、異なるｓｇＲＮＡを使用したトランスフェクションに対応する異なるライブラリーにプールし、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて精製した。結果として得られたｒｈＡｍｐＳｅｑライブラリーを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて定量及び解析し、ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００配列決定装置において３０００００超の平均リード深度で配列決定した。配列決定データは、ｒｈＡｍｐＳｅｑ ＣＲＩＳＰＲ解析ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｒｈａｍｐｓｅｑ－ｃｒｉｓｐｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌ）を用いて解析する。
【0039】
（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑデータ解析）
解析は、初期データとして使用した両端リードを用いて開始した。残留アダプター配列及び低品質リードの除去を、デフォルトパラメータ及び方法において特定された適切なアダプターペアを利用するＡｄａｐｔｅｒ Ｒｅｍｏｖａｌを使用して実行した。不純物を除去したリードを、ＢＷＡ－ＭＥＭを使用してゲノムに対してアラインメントし、続いてＳａｍｔｏｏｌｓを用いて選別及び索引付けを行った。アラインメントファイル作成及び操作を、デフォルトオプションを使用して実行した。各切断部位検索実験に対して、３つの標的及び３つの対照試料が存在した。初めに、６つの試料のそれぞれを、「ｆｉｎｄ－ｃｌｅａｖａｇｅ－ｐａｔｔｅｒｎｓ．ｊｌ」スクリプト（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｇｒｙｂａｕｓｋａｓ／ｃｒｏｆｔ－ｓｅｑ－ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して独立的に解析した。このスクリプトは、４ｂｐ長のリーディングフレームを利用して、アラインメントしたＲ１リードにおけるリード開始位置を検索する。リーディングフレーム範囲内のリード開始点の数が２０よりも多いか又はそれに等しい場合、その領域を更なる解析に含める。含められた領域のそれぞれから、フォワード及びリバースリード方向の存在、又は存在しない場合は、最も多いリード開始点を有する位置に基づいて、切断位置を選択する。その後、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（パッケージ「ＢｉｏＪｕｌｉａ／ＢｉｏＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．ｊｌ」において得られる）を使用して、選択した切断位置から標的配列を検索し、配列に最良の潜在的なアラインメント位置をＢＥＤフォーマットファイルに記録する。６つの試料全てを個々に解析した後、「ｃｏｍｂｉｎｅ－ｃｌｅａｖａｇｅ－ｐａｔｔｅｒｎｓ．ｊｌ」スクリプトを使用して結果を組み合わせた。標的及び対照試料は別々に組み合わせた。この組み合わせプロセスの目的は、同定された切断部位がそのそれぞれの試料群において一貫して見出されるかどうかを判定することであった。標的及び対照試料の両方について、３つの試料全てに正確な切断位置が存在する場合、切断部位が見出されると考えられる。組み合わせた後、対照試料に見出された切断部位を標的試料から除外した。組み合わせ段階と同じスクリプトを使用して演繹プロセスを実行した。潜在的なオン／オフターゲット領域の最終的なリストは、ＢＥＤフォーマットファイルで出力する。
解析は、初期データとして使用した両端リードを用いて開始した。残留アダプター配列及び低品質リードの除去を、デフォルトパラメータ及び方法において特定された適切なアダプターペアを利用するＡｄａｐｔｅｒ Ｒｅｍｏｖａｌを使用して実行した。不純物を除去したリードを、ＢＷＡ－ＭＥＭを使用してゲノムに対してアラインメントし、続いてＳａｍｔｏｏｌｓを用いて選別及び索引付けを行った。アラインメントファイル作成及び操作を、デフォルトオプションを使用して実行した。各切断部位検索実験に対して、３つの標的及び３つの対照試料が存在した。初めに、６つの試料のそれぞれを、「ｆｉｎｄ－ｃｌｅａｖａｇｅ－ｐａｔｔｅｒｎｓ．ｊｌ」スクリプト（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｇｒｙｂａｕｓｋａｓ／ｃｒｏｆｔ－ｓｅｑ－ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して独立的に解析した。このスクリプトは、４ｂｐ長のリーディングフレームを利用して、アラインメントしたＲ１リードにおけるリード開始位置を検索する。リーディングフレーム範囲内のリード開始点の数が２０よりも多いか又はそれに等しい場合、その領域を更なる解析に含める。含められた領域のそれぞれから、フォワード及びリバースリード方向の存在、又は存在しない場合は、最も多いリード開始点を有する位置に基づいて、切断位置を選択する。その後、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（パッケージ「ＢｉｏＪｕｌｉａ／ＢｉｏＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．ｊｌ」において得られる）を使用して、選択した切断位置から標的配列を検索し、配列に最良の潜在的なアラインメント位置をＢＥＤフォーマットファイルに記録する。６つの試料全てを個々に解析した後、「ｃｏｍｂｉｎｅ－ｃｌｅａｖａｇｅ－ｐａｔｔｅｒｎｓ．ｊｌ」スクリプトを使用して結果を組み合わせた。標的及び対照試料は別々に組み合わせた。この組み合わせプロセスの目的は、同定された切断部位がそのそれぞれの試料群において一貫して見出されるかどうかを判定することであった。標的及び対照試料の両方について、３つの試料全てに正確な切断位置が存在する場合、切断部位が見出されると考えられる。組み合わせた後、対照試料に見出された切断部位を標的試料から除外した。組み合わせ段階と同じスクリプトを使用して演繹プロセスを実行した。潜在的なオン／オフターゲット領域の最終的なリストは、ＢＥＤフォーマットファイルで出力する。
【0040】
（実施例１．二本鎖切断の同定及び特性評価のための方法（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ））
この実施例において、本発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの切断部位を見出すための詳細なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ（バージョン１及び２）アッセイを記載する。別段の指示がない場合、この実施例の各段階はＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１及び２の両方で実行される。単離及び精製したＨＥＫ２９３Ｔ（細胞培養及びトランスフェクションを参照されたい）又は市販のヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）等のＤＮＡ試料を、ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を伴うか又は伴わないＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて切断した。他の実施形態において、異なる操作されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡを切断してもよい。
この実施例において、本発明者らは、ヒトゲノムＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの切断部位を見出すための詳細なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ（バージョン１及び２）アッセイを記載する。別段の指示がない場合、この実施例の各段階はＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１及び２の両方で実行される。単離及び精製したＨＥＫ２９３Ｔ（細胞培養及びトランスフェクションを参照されたい）又は市販のヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）等のＤＮＡ試料を、ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を伴うか又は伴わないＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて切断した。他の実施形態において、異なる操作されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡを切断してもよい。
【0041】
（１．ＦａｓｔＡＰを用いるゲノムＤＮＡの処理）
０．０１～１μｇのヒトゲノムＤＮＡを、２０μｌの１×ＦａｓｔＡＰバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（３７℃でｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中２単位の感熱性アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で１０分間処理し、続いて８０℃で１０分間酵素を不活性化した。ホスファターゼの添加は、アダプターがライゲーションし得るランダム切断ＤＮＡ末端におけるリン酸の存在を低減させる。
０．０１～１μｇのヒトゲノムＤＮＡを、２０μｌの１×ＦａｓｔＡＰバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（３７℃でｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中２単位の感熱性アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で１０分間処理し、続いて８０℃で１０分間酵素を不活性化した。ホスファターゼの添加は、アダプターがライゲーションし得るランダム切断ＤＮＡ末端におけるリン酸の存在を低減させる。
【0042】
（２．ＲＮＰ複合体を用いるＦａｓｔＡＰ処理ｇＤＮＡの消化）
Ｃａｓ９及び種々のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（配列番号１～３）を１：２のモル比で、１×ＳＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（３７℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＤＴＴ）中で混合することによって、触媒的に活性なＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで構築し、３７℃で３０分間プレインキュベートした。最終ＲＮＰ濃度は２０～２０００ｎＭで変動した。一態様において、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡの相対濃度は、Ｃａｓ９が２００ｎＭ及びｓｇＲＮＡが４００ｎＭであった。
Ｃａｓ９及び種々のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（配列番号１～３）を１：２のモル比で、１×ＳＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（３７℃でｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＤＴＴ）中で混合することによって、触媒的に活性なＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで構築し、３７℃で３０分間プレインキュベートした。最終ＲＮＰ濃度は２０～２０００ｎＭで変動した。一態様において、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡの相対濃度は、Ｃａｓ９が２００ｎＭ及びｓｇＲＮＡが４００ｎＭであった。
【0043】
それぞれのＲＮＰ複合体（２０μｌ）を、脱リン酸化ヒトｇＤＮＡの反応２０μｌと混合した。反応を３７℃で６０分間インキュベートし、続いて８０℃で２０分間酵素を不活性化した。
【0044】
（３．アダプターライゲーション）
Ｃａｓ９を用いたＤＮＡ切断後、大半の場合、平滑末端の末端を有する産物が生じる（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（３９）：Ｅ２５７９－８６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－２１）。この実施例では、非リン酸化アダプター（一方が平滑末端であり、他方が５'ビオチンを有する粘着末端である）を使用して、切断産物の平滑末端化末端に選択的にライゲーションする。
Ｃａｓ９を用いたＤＮＡ切断後、大半の場合、平滑末端の末端を有する産物が生じる（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（３９）：Ｅ２５７９－８６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－２１）。この実施例では、非リン酸化アダプター（一方が平滑末端であり、他方が５'ビオチンを有する粘着末端である）を使用して、切断産物の平滑末端化末端に選択的にライゲーションする。
【0045】
２０μＭのビオチン化アダプター上鎖（配列番号４）を２０μＭのアダプター下鎖（配列番号５）と混合して、アダプターを０．２×バッファーＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で構築した。反応混合物を９５℃で５分間インキュベートすることによってアダプターオリゴをアニーリングし、２５℃までゆっくりと（－０．１℃／５秒）冷却した。
【0046】
アダプターライゲーション反応を以下の通りに調製した：４０μｌの切断されたｇＤＮＡを４０μｌの２×ライゲーション反応ミックス（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（３７℃でｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、２００ｎＭアダプター、及び２０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））と混合した。ライゲーション反応を２２℃で１５分間インキュベートし、続いて８０℃で１０分間酵素を不活性化した。
【0047】
（４．アダプター除去）
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１の場合、アダプターを、１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（２０Ｕ）をライゲーション反応ミックスに添加することによって除去し、３７℃で１５分間インキュベートした。反応を、３０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって停止した。
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１の場合、アダプターを、１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（２０Ｕ）をライゲーション反応ミックスに添加することによって除去し、３７℃で１５分間インキュベートした。反応を、３０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって停止した。
【0048】
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合、ライゲーションされていないアダプターを、１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（２０Ｕ）をライゲーション反応ミックスに添加することによって除去し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、０．００１Ｕ ＤＮａｓｅ Ｉを添加し、３７℃で更に１０分間インキュベートした。反応を、３０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって停止した。
【0049】
（５．ストレプトアビジンビーズを用いるアフィニティ精製）
この段階では、ビオチン化アダプターを有するライゲーションされたＤＮＡ切断産物を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して精製した。
この段階では、ビオチン化アダプターを有するライゲーションされたＤＮＡ切断産物を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して精製した。
【0050】
結合及びビーズ洗浄のための、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する及び含有しない２×結合及び洗浄（Ｂ＆Ｗ）バッファーを以下の通りに調製した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（３７℃でｐＨ８．０）、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び必要な場合、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０。
【0051】
ストレプトアビジンコーティングＭｙＯｎｅ Ｃ１磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４℃の保管庫から取り出し、穏やかな反転によって混合した。１容量（反応当たり５μｌ）のＭｙＯｎｅ Ｃ１ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、１容量（５μｌ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有２×Ｂ＆Ｗバッファーと混合した。洗浄したビーズ混合物を磁気スタンドに置き、およそ１分間ペレット化した。上清を除去した。洗浄したビーズを８５μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有２×Ｂ＆Ｗバッファーに再懸濁し、そこに８５μｌのアダプターライゲーションＤＮＡ（アダプター除去段階後）を添加した。
【0052】
ビーズ／ＤＮＡ混合物を室温（約２２℃）で１５分間インキュベートした。試料を適合性磁気スタンドに置いた。ビーズを１分間ペレット化し、上清を除去した。ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを添加することによって１回目の洗浄に供し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。混合試料を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化し、上清を除去した。２回目のビーズ洗浄を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて、１回目の洗浄と同様に実行した。３回目のビーズ洗浄を、ｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを用いて、１回目の洗浄と同様に実行した。固定化された、ライゲーションされたＤＮＡ断片を有する洗浄したビーズを、相補鎖除去段階において更に処理した。
【0053】
（６．相補鎖除去）
０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液を以下の通りに調製した：必要な量のＮａＯＨ（Ｒｏｔｈ）をｍｉｌｉＱ水に溶解した。
０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液を以下の通りに調製した：必要な量のＮａＯＨ（Ｒｏｔｈ）をｍｉｌｉＱ水に溶解した。
【0054】
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１の場合、固定化された、ライゲーションされたＤＮＡ断片を有する洗浄したビーズを、４０μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液に再懸濁し、混合し、室温で１０分間インキュベートした。試料を適合性磁気スタンドに置いた。ビーズを１分間ペレット化し、上清を除去した。ビーズを、４０μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加することによって１回目の洗浄に供し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。混合試料を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化し、上清を除去した。２回目のビーズ洗浄を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて、１回目の洗浄と同様に実行した。３回目のビーズ洗浄を、１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを用いて、１回目の洗浄と同様に実行した。洗浄したビーズを、磁気スタンドから取り出し、３０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーに再懸濁し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。
【0055】
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合、相補鎖除去、１回目及び２回目のビーズ洗浄を、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１について記載したように実行した。３回目のビーズ洗浄を、１×ＦａｓｔＡＰバッファーを添加することによって実行し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。混合試料を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化し、上清を除去した。洗浄したビーズを、磁気スタンドから取り出し、３０μｌの１×ＦａｓｔＡＰバッファーに再懸濁した。ここで、追加の段階６．１（ポリＣ尾部付加）を実行した。３０μｌの洗浄したビーズ溶液を、１μｌの１０×ＦａｓｔＡＰバッファー、２μｌの１０ｍＭ ｄＣＴＰ及び６．５μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏと混合した。反応を、０．５μｌのＴｄＴ（１０Ｕ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて開始し、３７℃で１５分間インキュベートした。試料を適合性磁気スタンドに置いた。ビーズを１分間ペレット化し、上清を除去した。ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを添加することによって１回目の洗浄に供し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。混合試料を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化し、上清を除去した。２回目のビーズ洗浄を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて、１回目の洗浄と同様に実行した。３回目のビーズ洗浄を、１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを用いて、１回目の洗浄と同様に実行した。洗浄したビーズを、磁気スタンドから取り出し、３０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーに再懸濁し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。
【0056】
（７．非ビオチン化鎖の合成）
５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００溶液を以下の通りに調製した：必要な量のＰＥＧ８０００（Ｒｏｔｈ）をｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに溶解した。
５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００溶液を以下の通りに調製した：必要な量のＰＥＧ８０００（Ｒｏｔｈ）をｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに溶解した。
【0057】
段階６からの再懸濁したビーズ（３０μｌ）を、４μｌの５×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファー、８μｌの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１．２５μｌの１０μＭ ＮＮＮオリゴヌクレオチド（配列番号６）（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン１の場合）又は１．２５μｌの１０μＭ ＧＧＧオリゴヌクレオチド（配列番号７）（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑバージョン２の場合）、及び２．３μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏと混合した。
【0058】
ボルテックスすることによって反応ミックスを混合し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いる遠心分離によってビーズを回収した。反応をサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において９８℃で１分間インキュベートし、２５℃までゆっくりと（－０．５℃／秒）冷却した。反応を２５℃で３０分間更にインキュベートした。次いで、３．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各試料に添加し、ピペッティングによって混合した。反応を、１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各反応に添加することによって開始し、ピペッティングによって混合し、２５℃で１５分間インキュベートした。
【0059】
（８．ＤＮＡ放出）
直前の段階からの試料を適合性磁気スタンドに置いた。ビーズを１分間ペレット化し、上清を除去した。ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを添加することによって１回目の洗浄に供し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。混合試料を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化し、上清を除去した。２回目のビーズ洗浄を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて同様に実行した。３回目のビーズ洗浄を、ｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを用いて同様に実行した。洗浄したビーズを、磁気スタンドから取り出し、４０μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁した。反応をサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において７０℃で５分間インキュベートして、ビーズからＤＮＡを放出した。次いで、反応を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化した。ＤＮＡを含む上清を新しいチューブに移し、ビーズを廃棄した。
直前の段階からの試料を適合性磁気スタンドに置いた。ビーズを１分間ペレット化し、上清を除去した。ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを添加することによって１回目の洗浄に供し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。混合試料を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化し、上清を除去した。２回目のビーズ洗浄を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて同様に実行した。３回目のビーズ洗浄を、ｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを用いて同様に実行した。洗浄したビーズを、磁気スタンドから取り出し、４０μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁した。反応をサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において７０℃で５分間インキュベートして、ビーズからＤＮＡを放出した。次いで、反応を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化した。ＤＮＡを含む上清を新しいチューブに移し、ビーズを廃棄した。
【0060】
（実施例２．ｑＰＣＲ）
この実施例では、ＤＮＡ放出段階由来のＤＮＡ断片を増幅して、ライブラリー増幅及びバーコード化のためのサイクル数を決定した。サイクル数は、以下の通りに決定する：最初に、蛍光がプラトーに達した最大の蛍光値を決定した。次いで、最大の蛍光の５０％に達するサイクル数を計算した。ライブラリー増幅及びインデックスＰＣＲについて、対応するサイクル数を使用する。
この実施例では、ＤＮＡ放出段階由来のＤＮＡ断片を増幅して、ライブラリー増幅及びバーコード化のためのサイクル数を決定した。サイクル数は、以下の通りに決定する：最初に、蛍光がプラトーに達した最大の蛍光値を決定した。次いで、最大の蛍光の５０％に達するサイクル数を計算した。ライブラリー増幅及びインデックスＰＣＲについて、対応するサイクル数を使用する。
【0061】
１５μｌの定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）を以下の通りに構築した：８．５μｌの上清（ＤＮＡ放出段階由来）、３μｌの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．７５μｌの１０μＭ ｑＰＣＲフォワードプライマー（配列番号８）、０．７５μｌの１０μＭ ｑＰＣＲリバースプライマー（配列番号９）、０．３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１５μｌの１００×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１５μｌのＰｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（０．３Ｕ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１．４μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏ。ｑＰＣＲ反応混合物を、以下のプログラムを有するＭＩＣ ｑＰＣＲサイクラー（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に入れた：
１．９８℃で３０秒間
２．９８℃で１０秒間
３．６０℃で１０秒間
４．７２℃で３０秒間
段階２～４を合計で４０回繰り返した
５．７２℃で２分間
１．９８℃で３０秒間
２．９８℃で１０秒間
３．６０℃で１０秒間
４．７２℃で３０秒間
段階２～４を合計で４０回繰り返した
５．７２℃で２分間
【0062】
（実施例３．ライブラリー増幅及びバーコード化）
３μＭのインデックスプライマーミックスを以下の通りに調製した：１．５μｌの１００μＭインデックス用フォワードプライマー（配列番号１０）、１．５μｌの１００μＭインデックス用リバースプライマー（配列番号１１）、４７μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏ。種々のインデックス配列を有するプライマーミックスを、９６ウェルプレートに等分し、ライブラリーバーコード化のために使用した。
３μＭのインデックスプライマーミックスを以下の通りに調製した：１．５μｌの１００μＭインデックス用フォワードプライマー（配列番号１０）、１．５μｌの１００μＭインデックス用リバースプライマー（配列番号１１）、４７μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏ。種々のインデックス配列を有するプライマーミックスを、９６ウェルプレートに等分し、ライブラリーバーコード化のために使用した。
【0063】
３０μｌのインデックスＰＣＲ反応を以下の通りに構築した：１７μｌの上清（ＤＮＡ放出段階由来）、６μｌの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５μｌの３μＭインデックス用プライマーミックス（配列番号１０～１１）、０．６μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．３μｌのＰｈｕｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（０．６Ｕ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１．１μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏ。インデックスＰＣＲ反応混合物を、以下のプログラムを有するサーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れた：
１．９８℃で３０秒間
２．９８℃で１０秒間
３．６０℃で１０秒間
４．７２℃で３０秒間
段階２～４をＮ回繰り返した（サイクル数は実施例５で決定する）
５．７２℃で２分間
６．４℃で保持
インデックスＰＣＲ段階由来の試料を、合計で１８０～４２０μｌの別々のプールにプールした。
１．９８℃で３０秒間
２．９８℃で１０秒間
３．６０℃で１０秒間
４．７２℃で３０秒間
段階２～４をＮ回繰り返した（サイクル数は実施例５で決定する）
５．７２℃で２分間
６．４℃で保持
インデックスＰＣＲ段階由来の試料を、合計で１８０～４２０μｌの別々のプールにプールした。
【0064】
（実施例４．ライブラリープール不純物除去）
この実施例では、磁気ビーズ付き精製モジュール（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用して、プールした試料の不純物を室温で除去した。
この実施例では、磁気ビーズ付き精製モジュール（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用して、プールした試料の不純物を室温で除去した。
【0065】
磁気ビーズ付き精製モジュールを４℃の保管庫から取り出し、室温で３０分間平衡化させてから使用した。モジュールの精製ビーズ（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｅａｄ：ＰＢ）を再懸濁した後、それらを反応に添加した。１倍容量の精製ビーズ（ＰＢ）を、１倍容量のプールした試料に添加し、ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、混合し、遠心分離によって回収した。反応混合物を５分間インキュベートした。次いで、反応を磁気スタンドに置き、１～２分間、又は上清が透明になるまでビーズを集めた。上清を除去した。ビーズを、１倍容量の溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ：ＥＢ）に再懸濁し、磁気スタンドから取り出し、２分間インキュベートした。１倍容量の精製溶液（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＰＳ）を再懸濁したビーズに添加して、ライブラリーを再沈殿させた。ミニ遠心分離／ボルテックス装置（Ｂｉｏｓａｎ）を用いて、徹底的に混合し、遠心分離によって回収した。反応を５分間インキュベートした。次いで、反応を磁気スタンドに戻し、１～２分間、又は上清が透明になるまでビーズを集めた。上清を除去し、ビーズを、新たに調製した５００μｌの８０％エタノールを用いて３０秒間２回洗浄した。チューブを磁気スタンドに静置し、５～１０分間、微量のエタノールを蒸発させた。反応を磁気スタンドから取り出し、ビーズを５０又は１００μｌの容量のｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁し、２分間インキュベートした。反応を磁気スタンドに戻し、１～２分間、又は上清が透明になるまでビーズを集めた。上清を新しいチューブに移し、任意選択で、ライブラリー定量及び配列決定前に－２０℃で保管した。
【0066】
（実施例５．ライブラリー定量及び品質管理）
ライブラリー定量を、Ｑｕｂｉｔ４．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。ライブラリー品質管理のために、１μｌのライブラリー（実施例４の）をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡチップに搭載し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて解析した。
ライブラリー定量を、Ｑｕｂｉｔ４．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。ライブラリー品質管理のために、１μｌのライブラリー（実施例４の）をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡチップに搭載し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて解析した。
【0067】
（実施例６．ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ法のプロトコル）
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって生じた二本鎖切断の同定及び特性評価に対するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのための２つのバージョンのＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑプロトコル（ｖ１及びｖ２）を記載する。
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって生じた二本鎖切断の同定及び特性評価に対するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのための２つのバージョンのＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑプロトコル（ｖ１及びｖ２）を記載する。
【0068】
（ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑプロトコルｖ１（プロトコルｖ２の追加の段階も示す））
（アダプターのアニーリング）
アダプター（２０μＭ）を、その上鎖（配列番号４）及び下鎖（配列番号５）（１：１の比）を０．２×バッファーＧ中でアニーリングすることによって調製した。
アニーリングプログラム：９５℃で５分間、２５℃までゆっくりと（－０．１℃／５秒）冷却、４℃で保持。
（アダプターのアニーリング）
アダプター（２０μＭ）を、その上鎖（配列番号４）及び下鎖（配列番号５）（１：１の比）を０．２×バッファーＧ中でアニーリングすることによって調製した。
アニーリングプログラム：９５℃で５分間、２５℃までゆっくりと（－０．１℃／５秒）冷却、４℃で保持。
【0069】
（ＲＮＰ複合体の構築）
Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡは１：２のモル比）を１×ＳＢバッファー中で混合することによって、２×ＲＮＰ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで構築した。
インキュベーションプログラム：３７℃で３０分間、４℃で保持。
Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡは１：２のモル比）を１×ＳＢバッファー中で混合することによって、２×ＲＮＰ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで構築した。
インキュベーションプログラム：３７℃で３０分間、４℃で保持。
【0070】
（１．ＦａｓｔＡＰを用いるゲノムＤＮＡの処理）
ヒトゲノムＤＮＡを以下の通りに脱リン酸化した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから１５μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
インキュベーションプログラム：３７℃で１０分間、次いで８０℃で１０分間、４℃で保持。
ヒトゲノムＤＮＡを以下の通りに脱リン酸化した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから１５μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
【表1】
【0071】
（２．ＲＮＰ複合体を用いるＦａｓｔＡＰ処理ｇＤＮＡの消化）
２０μｌのＲＮＰ複合体（２×）を２０μｌのＦａｓｔＡＰ処理ｇＤＮＡと混合した。
インキュベーションプログラム：３７℃で６０分間、次いで８０℃で２０分間、４℃で保持。
２０μｌのＲＮＰ複合体（２×）を２０μｌのＦａｓｔＡＰ処理ｇＤＮＡと混合した。
【表2】
【0072】
（３．アダプターライゲーション）
切断したｇＤＮＡ断片をビオチン化アダプターに以下の通りにライゲーションした。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから３６μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
インキュベーションプログラム：２２℃で１５分間、次いで８０℃で１０分間、４℃で保持。
切断したｇＤＮＡ断片をビオチン化アダプターに以下の通りにライゲーションした。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから３６μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
【表3】
【0073】
（４．アダプター除去）
ライゲーションされていないアダプターを以下の通りに除去した。
インキュベーションプログラム：３７℃で１５分間、次いで５．２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを（合計約３０ｍＭのＥＤＴＡまで）添加。
プロトコルｖ２の場合：
インキュベーションプログラム：３７℃で２０分間。次いで、以下に示す通りに進む。
インキュベーションプログラム：３７℃で１０分間、次いで５．２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを（合計約３０ｍＭのＥＤＴＡまで）添加。
ライゲーションされていないアダプターを以下の通りに除去した。
【表4】
プロトコルｖ２の場合：
【表5】
【表6】
【0074】
（５．ストレプトアビジンビーズを用いるアフィニティ精製）
ＤＮＡ断片を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１）を用いて固定化及び精製した。
１．Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いるアフィニティ精製手順のための、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する及び含有しない２×結合及び洗浄（Ｂ＆Ｗ）バッファーを調製する：０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する及び含有しない、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．０）、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ。
２．Ｄｙｎａｂｅａｄｓを４℃の保管庫から取り出し、チューブを穏やかに反転させることよって混合する。
３．１容量（反応当たり５μｌ）のＤｙｎａｂｅａｄｓを、１容量（５μｌ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有２×Ｂ＆Ｗバッファーと混合する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
４．Ｄｙｎａｂｅａｄ混合物を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。上清を除去する。
５．Ｄｙｎａｂｅａｄｓを８５μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有２×Ｂ＆Ｗバッファーに再懸濁する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
６．８５μｌの調製したＤｙｎａｂｅａｄｓを８５μｌのエキソヌクレアーゼＩ処理ＤＮＡ（段階４の）と混合する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。室温（約２２℃）で１５分間インキュベートする。
７．インキュベーション後、試料を適合性磁気スタンドに置く。ビーズを１分間ペレット化する。上清を除去する。
８．ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて洗浄する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。試料を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化する。上清を除去する。
９．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いでｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを使用して段階８を繰り返す。
１０．相補鎖除去（段階６）に進む。
ＤＮＡ断片を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１）を用いて固定化及び精製した。
１．Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いるアフィニティ精製手順のための、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する及び含有しない２×結合及び洗浄（Ｂ＆Ｗ）バッファーを調製する：０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する及び含有しない、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．０）、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ。
２．Ｄｙｎａｂｅａｄｓを４℃の保管庫から取り出し、チューブを穏やかに反転させることよって混合する。
３．１容量（反応当たり５μｌ）のＤｙｎａｂｅａｄｓを、１容量（５μｌ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有２×Ｂ＆Ｗバッファーと混合する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
４．Ｄｙｎａｂｅａｄ混合物を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。上清を除去する。
５．Ｄｙｎａｂｅａｄｓを８５μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有２×Ｂ＆Ｗバッファーに再懸濁する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
６．８５μｌの調製したＤｙｎａｂｅａｄｓを８５μｌのエキソヌクレアーゼＩ処理ＤＮＡ（段階４の）と混合する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。室温（約２２℃）で１５分間インキュベートする。
７．インキュベーション後、試料を適合性磁気スタンドに置く。ビーズを１分間ペレット化する。上清を除去する。
８．ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて洗浄する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。試料を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化する。上清を除去する。
９．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いでｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを使用して段階８を繰り返す。
１０．相補鎖除去（段階６）に進む。
【0075】
（６．相補鎖除去）
非ビオチン化ＤＮＡ鎖（相補鎖）を、ＮａＯＨを使用して除去した。
１．洗浄したビーズ（段階５の）を４０μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液に再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。室温（約２２℃）で１０分間インキュベートする。
２．ビーズ混合物を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化する。ビーズを、４０μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて洗浄する。試料を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。上清を除去する。
３．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いで１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを使用して段階２を繰り返す。
４．ビーズを３０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーに再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
非ビオチン化ＤＮＡ鎖（相補鎖）を、ＮａＯＨを使用して除去した。
１．洗浄したビーズ（段階５の）を４０μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液に再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。室温（約２２℃）で１０分間インキュベートする。
２．ビーズ混合物を磁気スタンドに戻し、１分間ペレット化する。ビーズを、４０μｌの０．１２５Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて洗浄する。試料を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。上清を除去する。
３．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いで１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを使用して段階２を繰り返す。
４．ビーズを３０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーに再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
【0076】
プロトコルｖ２の場合：洗浄及び再懸濁（段階３及び４）のために、１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを使用する代わりに１×ＦａｓｔＡＰバッファーを使用する。段階６．１に進む。
【0077】
（プロトコルｖ２の場合の追加の段階）
（６．１ポリＣ付加）
ポリＣ尾部をＤＮＡの３'末端に以下の通りに付加した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから９．５μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
インキュベーションプログラム：３７℃で１５分間。次いで、以下に示すビーズ洗浄及び再懸濁に進む。
１．ビーズ混合物を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。ビーズを、４０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて洗浄する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。試料を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。上清を除去する。
２．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いで１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを使用して段階１を繰り返す。
３．ビーズを３０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーに再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
（６．１ポリＣ付加）
ポリＣ尾部をＤＮＡの３'末端に以下の通りに付加した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから９．５μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
【表7】
１．ビーズ混合物を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。ビーズを、４０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて洗浄する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。試料を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。上清を除去する。
２．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いで１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを使用して段階１を繰り返す。
３．ビーズを３０μｌの１×Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファーに再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。
【0078】
（７．非ビオチン化鎖合成）
非ビオチン化ＤＮＡ鎖を以下の通りに合成した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから１５．５５μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
インキュベーションプログラム：９８℃で１分間、次いで２５℃までゆっくりと（－０．５℃／秒）冷却する。反応を２５℃で３０分間更にインキュベートした。次いで、以下に示す通りに進む。
インキュベーションプログラム：２５℃で１５分間。段階８に進む。
非ビオチン化ＤＮＡ鎖を以下の通りに合成した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから１５．５５μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
【表8】
【表9】
【0079】
（８．ＤＮＡ放出）
ＤＮＡを磁気ビーズから以下の通りに放出した。
１．ビーズ混合物を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて洗浄する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。試料を磁気スタンドに入れ、１分間ペレット化する。上清を除去する。
２．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いでｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを使用して段階１を繰り返す。
３．ビーズを４０μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。７０℃で５分間インキュベートする。
４．インキュベーション後、試料を磁気スタンドに戻す。ビーズを１分間ペレット化する。上清を新しいチューブに回収する。
ＤＮＡを磁気ビーズから以下の通りに放出した。
１．ビーズ混合物を磁気スタンドに置き、１分間ペレット化する。ビーズを、５０μｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０含有１×Ｂ＆Ｗバッファーを用いて洗浄する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。試料を磁気スタンドに入れ、１分間ペレット化する。上清を除去する。
２．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有しない１×Ｂ＆Ｗを使用し、次いでｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏを使用して段階１を繰り返す。
３．ビーズを４０μｌのｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。７０℃で５分間インキュベートする。
４．インキュベーション後、試料を磁気スタンドに戻す。ビーズを１分間ペレット化する。上清を新しいチューブに回収する。
【0080】
（９．ｑＰＣＲ）
ライブラリー増幅及びバーコード化のために必要とされるサイクル数を以下の通りに決定した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから６．５μｌを個々のｑＰＣＲチューブに分注した。
ｑＰＣＲプログラム：９８℃で３０秒間、（９８℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で３０秒間）を４０サイクル、７２℃で２分間。
ライブラリー増幅及びバーコード化のために必要とされるサイクル数を以下の通りに決定した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから６．５μｌを個々のｑＰＣＲチューブに分注した。
【表10】
【0081】
（１０．ライブラリー増幅及びバーコード化）
反応を以下の通りに増幅及びバーコード化した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから８μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
ＰＣＲプログラム：９８℃で３０秒間、（９８℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で３０秒間）をＮサイクル（段階９で決定）、７２℃で２分間、４℃で保持。ＰＣＲ後、試料を、合計で１８０～４２０μｌの別々のプールにプールした。
反応を以下の通りに増幅及びバーコード化した。より多くの実験を計画した場合、マスターミックスを調製し、そこから８μｌを個々のＰＣＲチューブに分注した。
【表11】
【0082】
（１１．ライブラリープール不純物除去）
磁気ビーズ付き精製モジュール（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用して、室温（約２２℃）でＤＮＡプールを精製した。
１．磁気ビーズ付き精製モジュールを４℃の保管庫から取り出し、室温で３０分間平衡化させる。
２．モジュールの精製ビーズ（ＰＢ）を、チューブを穏やかに反転させることよって再懸濁する。
３．１倍容量の精製ビーズ（ＰＢ）を、１倍容量のプールした試料と混合する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。５分間インキュベートする。
４．インキュベーション後、試料を適合性磁気スタンドに置く。ビーズを１～２分間ペレット化する。上清を除去する。
５．ビーズを１倍容量の溶出バッファー（ＥＢ）に再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。２分間インキュベートする。
６．１倍容量の精製溶液（ＰＳ）を添加し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。５分間インキュベートする。
７．試料を磁気スタンドに戻す。ビーズを１～２分間集める。上清を除去する。
８．ビーズを、新たに調製した５００μｌの８０％エタノールを用いて３０秒間２回洗浄する。上清を除去する。
９．チューブを磁気スタンドに静置し、５～１０分間、微量のエタノールを蒸発させる。
１０．チューブを磁気スタンドから取り出し、ビーズを５０又は１００μｌの容量のｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁する。２分間インキュベートする。
１１．再懸濁したビーズを磁気スタンドに戻し、ビーズを１～２分間集める。上清を新しいチューブに回収する。
磁気ビーズ付き精製モジュール（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用して、室温（約２２℃）でＤＮＡプールを精製した。
１．磁気ビーズ付き精製モジュールを４℃の保管庫から取り出し、室温で３０分間平衡化させる。
２．モジュールの精製ビーズ（ＰＢ）を、チューブを穏やかに反転させることよって再懸濁する。
３．１倍容量の精製ビーズ（ＰＢ）を、１倍容量のプールした試料と混合する。ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。５分間インキュベートする。
４．インキュベーション後、試料を適合性磁気スタンドに置く。ビーズを１～２分間ペレット化する。上清を除去する。
５．ビーズを１倍容量の溶出バッファー（ＥＢ）に再懸濁する。試料を磁気スタンドから取り出し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。２分間インキュベートする。
６．１倍容量の精製溶液（ＰＳ）を添加し、ボルテックス及び遠心沈殿によって混合する。５分間インキュベートする。
７．試料を磁気スタンドに戻す。ビーズを１～２分間集める。上清を除去する。
８．ビーズを、新たに調製した５００μｌの８０％エタノールを用いて３０秒間２回洗浄する。上清を除去する。
９．チューブを磁気スタンドに静置し、５～１０分間、微量のエタノールを蒸発させる。
１０．チューブを磁気スタンドから取り出し、ビーズを５０又は１００μｌの容量のｍｉｌｉＱ Ｈ２Ｏに再懸濁する。２分間インキュベートする。
１１．再懸濁したビーズを磁気スタンドに戻し、ビーズを１～２分間集める。上清を新しいチューブに回収する。
【0083】
（１２．ライブラリー定量及び品質管理）
ライブラリーを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して定量する。加えて、ライブラリー品質管理を以下の通りに実行する。１μｌのライブラリー（段階１１の）をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡチップに搭載し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて、製造業者の指示に従って解析した。
ライブラリーを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して定量する。加えて、ライブラリー品質管理を以下の通りに実行する。１μｌのライブラリー（段階１１の）をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡチップに搭載し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて、製造業者の指示に従って解析した。
【0084】
（実施例７．ヒト細胞においてＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑによって同定されたオフターゲット部位のｉｎ ｖｉｖｏ検証）
ヒトゲノム編集に最も的確なＣａｓ９ガイドＲＮＡ ＲＮＰ複合体を選択するためには、ｉｎ ｖｉｔｒｏオフターゲット同定法によって同定されたオフターゲット部位が、細胞においてこれらのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって実際に編集されるかどうかを知ることが重要である。したがって、この実施例では、本発明者らは、新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ法によって同定されたオフターゲット部位のｉｎ ｖｉｖｏ検証を記載する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ及びｉｎ ｖｉｖｏ ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の両方によって同定された大半のオフターゲット部位が多くのリード数を有することはこれまでに示された（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，６７２９、２０１９年５月１０日に出願された米国特許出願公開第２０２１０１４７９０９Ａ１号）。これは、ｉｎ ｖｉｖｏで編集されるオフターゲット部位が、多くの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても効率的に切断されることを示唆する。その点で、本発明者らは、リード数に従って上位５％のリスト（リード数が、リストの最上位のオフターゲット部位のリード数の５％閾値を超えるオフターゲットを含む）に含まれる、これらの同定されたオフターゲット部位を検証することを選択した（図３～８）。これらのオフターゲット部位の大半は、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ ｖ１及びｖ２法の両方に含まれる。
ヒトゲノム編集に最も的確なＣａｓ９ガイドＲＮＡ ＲＮＰ複合体を選択するためには、ｉｎ ｖｉｔｒｏオフターゲット同定法によって同定されたオフターゲット部位が、細胞においてこれらのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって実際に編集されるかどうかを知ることが重要である。したがって、この実施例では、本発明者らは、新規ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ法によって同定されたオフターゲット部位のｉｎ ｖｉｖｏ検証を記載する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ及びｉｎ ｖｉｖｏ ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の両方によって同定された大半のオフターゲット部位が多くのリード数を有することはこれまでに示された（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，６７２９、２０１９年５月１０日に出願された米国特許出願公開第２０２１０１４７９０９Ａ１号）。これは、ｉｎ ｖｉｖｏで編集されるオフターゲット部位が、多くの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても効率的に切断されることを示唆する。その点で、本発明者らは、リード数に従って上位５％のリスト（リード数が、リストの最上位のオフターゲット部位のリード数の５％閾値を超えるオフターゲットを含む）に含まれる、これらの同定されたオフターゲット部位を検証することを選択した（図３～８）。これらのオフターゲット部位の大半は、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ ｖ１及びｖ２法の両方に含まれる。
【0085】
ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ ｖ１及びｖ２によって同定された、選択したオフターゲット部位がヒト細胞において切断され得るかどうかを判定するために、本発明者らは、ｒｈＡｍｐＳｅｑ技術（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ／ｒｈａｍｐｓｅｑ－ｃｒｉｓｐｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ－ｓｙｓｔｅｍ）を使用してディープ標的シーケンシングを実行した。ｒｈＡｍｐＳｅｑ法を使用して、本発明者らは、ＣＲＯＦＴ－Ｓｅｑ ｖ１及びｖ２の両方によって見出された、ＦＡＮＣＦ、ＶＥＧＦＡ１及びＸＲＣＣ５ ｓｇＲＮＡに対する合計で２０７のオフターゲット部位を検証した（図３～８）。そこでは、編集された細胞の百分率を、２つの陽性反応（ＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを用いて処理した細胞）及び２つの陰性反応（ＳｐＣａｓ９のみを用いて処理した細胞）の間の平均インデル頻度の差によって推定した。標的ディープシーケンシングは、同定された２０７のオフターゲット部位のうち４７（２２．７％）が細胞において０．１％超のインデル頻度で編集されていることを明らかにした。ディープ次世代シーケンシングのエラー率はおよそ０．１％であるため、０．１％未満のインデル頻度は検証が困難である。細胞におけるゲノム編集は、クロマチンアクセシビリティ、ＤＮＡ修復及び他の細胞に関連する因子による影響を受けるため、他のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ又はＳＩＴＥ－Ｓｅｑオフターゲット法においても観察されるように、ここで同定されたインデル頻度は、リード数と常に相関するわけではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【外国語明細書】