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特開2024-173752抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴデグレーダー抗体－薬物コンジュゲート
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024173752
(43)【公開日】2024-12-12
(54)【発明の名称】抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴデグレーダー抗体－薬物コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20241205BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241205BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241205BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241205BHJP
C07D 487/16 20060101ALI20241205BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241205BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
A61P35/02
A61K47/68
A61K39/395 N
A61K39/395 T
C07D487/16
A61K39/395 L
C07K16/30
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024084583
(22)【出願日】2024-05-24
(31)【優先権主張番号】63/505,672
(32)【優先日】2023-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/584,449
(32)【優先日】2023-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512212195
【氏名又は名称】アッヴィ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ブランコ，ミラン
(72)【発明者】
【氏名】コーエン，ダニエル・ティー
(72)【発明者】
【氏名】ファーベル，エミリー・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】ハーラン，ジョン・イー
(72)【発明者】
【氏名】レイブン，マシュー・エム
(72)【発明者】
【氏名】シェン，ユー
(72)【発明者】
【氏名】シェパード，ジョージ・エス
(72)【発明者】
【氏名】ワン，レー
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，シンシン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE59
4C076FF70
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA21
4C085AA26
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045FA83
4H045GA21
(57)【要約】
【課題】急性骨髄性白血病の処置においてなどの、治療目的で使用することができる抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを提供すること。
【解決手段】本開示は、抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー抗体－薬物コンジュゲートを、そのような抗体－薬物コンジュゲートを使用する組成物及び方法を含めて提供する。
【選択図】図１
【解決手段】本開示は、抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー抗体－薬物コンジュゲートを、そのような抗体－薬物コンジュゲートを使用する組成物及び方法を含めて提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の構造：
を含む抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー（ＢＥＴｄ）抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
ｎが１～１０の整数であり、
ｍＡｂ１が、
ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【化1】
ｎが１～１０の整数であり、
ｍＡｂ１が、
ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項2】
ｍＡｂ１が、
配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び
配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び
配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項3】
ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項4】
ｎが約２である、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項5】
配列番号９又は配列番号１０の２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、請求項４に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項6】
ｍＡｂ１が、
配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項7】
ｎが約２である、請求項６に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項8】
配列番号９の２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、請求項７に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項9】
ｍＡｂ１が、
配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項10】
ｎが約２である、請求項９に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項11】
配列番号９の２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、請求項１０に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項12】
以下の構造：
を含む抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー（ＢＥＴｄ）抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
ｎが約２であり、ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【化2】
ｎが約２であり、ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項13】
２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、請求項１２に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ。
【請求項14】
式（ＩＩＩ）：
の化合物。
【化3】
【請求項15】
請求項１～１３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含み、薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項16】
急性骨髄性白血病を処置する方法であって、請求項１～１３に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの治療有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項17】
急性骨髄性白血病を処置する方法であって、請求項１５に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項18】
以下の構造：
を含む抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー（ＢＥＴｄ）抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物であって、
ｎが約２であり、ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ組成物。
【化4】
ｎが約２であり、ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ組成物。
【請求項19】
２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、請求項１８に記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ組成物。
【請求項20】
抗ヒトＣＤ３３抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、抗体がＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
ポリヌクレオチド。
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
ポリヌクレオチド。
【請求項21】
以下の構造：
を含む抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー（ＢＥＴｄ）抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するための方法であって、
ｎが１～１０の整数であり、ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体であり、
前記方法が、前記抗体を過剰な還元剤で還元するステップ及び次に抗体を過剰な薬物－リンカーでコンジュゲートするステップを含む、方法。
【化5】
ｎが１～１０の整数であり、ｍＡｂ１が、
配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体であり、
前記方法が、前記抗体を過剰な還元剤で還元するステップ及び次に抗体を過剰な薬物－リンカーでコンジュゲートするステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー抗体－薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
がん遺伝子の転写上方調節は多くの腫瘍の進行の背後にある推進力である。ブロモ－及びエキストラターミナルドメイン（ＢＥＴ）モチーフを含有するタンパク質は、がんの領域での発癌ネットワークの重要な活性化因子である。複数のＢＥＴブロモドメイン阻害剤（ＢＥＴｉ）は臨床開発まで進展してきたが、主に血小板減少症及び有害な胃腸作用などのオンターゲット用量制限毒性のために、ＢＥＴｉの有望な臨床的活性は骨髄増殖性腫瘍においてのみ観察された。
【0003】
デグレーダーは、内在性タンパク質分解機構を用いて目的の標的を分解する二機能性分子である。ＢＥＴ分解は、アセチル化ヒストンとのブロモドメイン相互作用をＢＥＴｉにより遮断する／阻害することとは機構的に異なるコア転写伸長複合体の阻害を誘発する。
【0004】
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、化学リンカーにより細胞毒性薬にコンジュゲートされた抗体を含むクラスの治療薬を表す。ＡＤＣの治療概念は、抗体の結合能力を薬物と組み合わせることであり、抗体は、腫瘍細胞において過剰発現されている又は増幅されている標的表面抗原を含む、標的表面抗原への結合によって薬物を腫瘍細胞に送達するのに使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病において発現される膜貫通型タンパク質である。ＣＤ３３を標的にするＡＤＣがＡＭＬを処置するのに使用されてきた。したがって、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの必要性が存在し、特に、急性骨髄性白血病の処置においてなどの、治療目的で使用することができる抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
（発明の要旨）
本開示は、ヒトＣＤ３３に特異的に結合するＡＤＣを提供する。
本開示は、ヒトＣＤ３３に特異的に結合するＡＤＣを提供する。
【0007】
第１の態様は、以下の構造：
【0008】
【化1】
ｎが１～１０の整数であり、ｍＡｂ１が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0009】
別の態様は、ｍＡｂ１が、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、第１の態様の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0010】
別の態様は、ｍＡｂ１が、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、第１の又は第２の態様の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0011】
別の態様は、ｎが約２である、第１から第３の態様までの抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0012】
別の態様は、配列番号９又は配列番号１０の２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、第１から第３の態様までの抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0013】
別の態様は、以下の構造：
【0014】
【化2】
ｎが約２であり、ｍＡｂ１が、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0015】
別の態様は、２９６Ｃがコンジュゲーションの部位である、第６の態様の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含む。
【0016】
別の態様は、式（ＩＩＩ）：
【0017】
【化3】
【0018】
別の態様は、第１から第７までの態様のいずれかの抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを含み、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物を含む。
【0019】
別の態様は、急性骨髄性白血病を処置する方法であって、第１から第７までの態様のいずれかに記載の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法を含む。
【0020】
別の態様は、急性骨髄性白血病を処置する方法であって、第９の態様の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法を含む。
【0021】
別の態様は、抗ヒトＣＤ３３抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、抗体がＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
ポリヌクレオチドを含む。
ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ－Ｌ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する、
ポリヌクレオチドを含む。
【0022】
別の態様は、式（Ｉ）の構造を含む抗ヒトＣＤ３３ ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー（ＢＥＴｄ）抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するための方法であって、ｎが１～１０の整数であり、ｍＡｂ１が、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体であり、方法が、抗体を過剰な還元剤で還元するステップ及び次に抗体を過剰な薬物－リンカーでコンジュゲートするステップを含む、方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
ブロモ－及びエキストラターミナルドメインデグレーダー（ＢＥＴｄ）並びにＢＥＴｄを含む抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの実施形態が本明細書で開示される。ある特定の実施形態は、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを合成するのに有用なリンカー－薬物、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを作製する方法及び抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを使用する方法も含む。
【0025】
１．１．ＢＥＴデグレーダー（構造式ＩＩ）
ＢＥＴタンパク質は、細胞増殖及び分化中にブロモドメインとアセチル化ヒストンの間のエピジェネティック相互作用を通して遺伝子転写を調節するのに決定的な役割を果たしている。式（ＩＩ）に記載のＢＥＴデグレーダー薬物（ＢＥＴｄ薬物）が本明細書で提示され、この薬物は、抗ヒトＣＤ３３抗体へのコンジュゲーションによる細胞への標的化された送達を意図しうる。
ＢＥＴタンパク質は、細胞増殖及び分化中にブロモドメインとアセチル化ヒストンの間のエピジェネティック相互作用を通して遺伝子転写を調節するのに決定的な役割を果たしている。式（ＩＩ）に記載のＢＥＴデグレーダー薬物（ＢＥＴｄ薬物）が本明細書で提示され、この薬物は、抗ヒトＣＤ３３抗体へのコンジュゲーションによる細胞への標的化された送達を意図しうる。
【0026】
【化4】
【0027】
実施形態では、ＢＥＴｄ薬物は、式（ＩＩ）に記載の化合物である。実施形態では、ＢＥＴｄ薬物は、Ｎ－［（３－｛２－［（１０－アミノ－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミドである。
【0028】
１．２．ＢＥＴｄリンカー薬物（構造式ＩＩＩ）
ある特定の実施形態では、ＢＥＴｄリンカー薬物は式（ＩＩＩ）：
ある特定の実施形態では、ＢＥＴｄリンカー薬物は式（ＩＩＩ）：
【0029】
【化5】
【0030】
実施形態では、ＢＥＴｄリンカー薬物は、Ｎ－［（３－｛２－［（１０－｛［Ｎ－（｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセチル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル］アミノ｝－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミドである。
【0031】
１．３．抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ
本明細書に記載されるＢＥＴデグレーダーを抗ヒトＣＤ３３抗体にコンジュゲートして、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを形成することができる。ＡＤＣは、１つ以上の薬物部分（複数可）を、ＣＤ３３発現腫瘍などの標的組織に選択的に送達する。したがって、実施形態では、本開示は、急性骨髄性白血病の処置における治療的使用のための抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを提供する。
本明細書に記載されるＢＥＴデグレーダーを抗ヒトＣＤ３３抗体にコンジュゲートして、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを形成することができる。ＡＤＣは、１つ以上の薬物部分（複数可）を、ＣＤ３３発現腫瘍などの標的組織に選択的に送達する。したがって、実施形態では、本開示は、急性骨髄性白血病の処置における治療的使用のための抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣを提供する。
【0032】
本明細書に記載される抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの実施形態では、ＢＥＴｄ薬物はリンカー部分を経て抗ヒトＣＤ３３抗体にコンジュゲートされる。実施形態では、リンカー部分は、１つの位置ではＢＥＴｄ薬物への共有結合を、別の場所では抗ヒトＣＤ３３抗体への共有結合を形成することにより、ＢＥＴｄ薬物を抗ヒトＣＤ３３抗体に連結させる。共有結合は、リンカー上の官能基とＢＥＴｄ薬物及び抗ヒトＣＤ３３抗体上の官能基の間の反応により形成される。ある特定の実施形態では、本開示の抗ヒトＣＤ３３ ＡＤＣは、式（ＩＩＩ）のＢＥＴｄリンカー薬物にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３３抗体で構成されている。
【0033】
１．３．１．抗体ｍＡｂ１
ある特定の実施形態では、ｍＡｂ１は、ＣＤ３３の細胞外ドメインを標的にして、ＣＤ３３結合を生じるヒト化組換えＩｇＧ１であり、これは抗ヒトＣＤ３３抗体と呼ばれることもある。
ある特定の実施形態では、ｍＡｂ１は、ＣＤ３３の細胞外ドメインを標的にして、ＣＤ３３結合を生じるヒト化組換えＩｇＧ１であり、これは抗ヒトＣＤ３３抗体と呼ばれることもある。
【0034】
ある特定の実施形態では、ｍＡｂ１は、当技術分野で開発されたルールに従って及び／又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定される可変領域及びＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。
【0035】
これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．２００１年及びＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．２０００年に記載されている。例えば、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２により提供されるスキームのうちの１つ（本明細書では「Ｋａｂａｔ」と呼ばれる。）に従って又はＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）（本明細書では「ＡｂＭ」と呼ばれる）に従って同定しうる。ＡｂＭは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎにより維持されている。）のＡｂｙｓｉｓデータベースから入手可能である。
【0036】
実施形態では、ｍＡｂ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含む。
【0037】
実施形態では、ｍＡｂ１は、配列番号７のアミノ酸配列：
【0038】
【化6】
及び配列番号８のアミノ酸配列：
【0039】
【化7】
【0040】
【化8】
【0041】
【化9】
【0042】
【化10】
【0043】
実施形態では、ｍＡｂ１の重鎖は以下のヌクレオチド配列（配列番号１２として開示される全長配列）：
【0044】
【化11】
【0045】
実施形態では、ｍＡｂ１の軽鎖は以下のヌクレオチド配列（配列番号１３として開示される全長配列）：
ａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｃｇｔｇｃｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｃｇｇｃｔｃｇｃｇａｔｇｃｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃａｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｔａｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｃｔｔｇｔｃｇｇｇｃｇａｇｔｃａｇｇａｔａｔｔａｇｃａａｔｔｔｃｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇａａａｇｔｃｃｃｔａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｔａｔａｃａｔｃｃａａｃｔｔｇｃａａａｇｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｔｇａａｇａｔｇｔｔｇｃａａｃｔｔａｔｔａｃｔｇｃｃａａｃａｇｔａｔｇａｃｇａｇａｇｃｃｃｔｃｃｃａｃｔｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔｔｇａ（配列番号１３）
によりコードされる。
ａｔｇｇａｃａｔｇｃｇｃｇｔｇｃｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｃｇｇｃｔｃｇｃｇａｔｇｃｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃａｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｔａｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｃｃａｔｃａｃｔｔｇｔｃｇｇｇｃｇａｇｔｃａｇｇａｔａｔｔａｇｃａａｔｔｔｃｔｔａａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇａａａｇｔｃｃｃｔａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｔａｔａｃａｔｃｃａａｃｔｔｇｃａａａｇｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｔｇａａｇａｔｇｔｔｇｃａａｃｔｔａｔｔａｃｔｇｃｃａａｃａｇｔａｔｇａｃｇａｇａｇｃｃｃｔｃｃｃａｃｔｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔｔｇａ（配列番号１３）
によりコードされる。
【0046】
１．３．２．連結された薬物の数
本明細書で開示されるＡＤＣは、抗体の立体配置及び少なくとも部分的にコンジュゲーションを引き起こすのに使用される方法に応じて、種々の化学量論的モル比で抗体部分に連結される薬物分子を含む。
本明細書で開示されるＡＤＣは、抗体の立体配置及び少なくとも部分的にコンジュゲーションを引き起こすのに使用される方法に応じて、種々の化学量論的モル比で抗体部分に連結される薬物分子を含む。
【0047】
用語「薬物負荷（ｄｒｕｇ ｌｏａｄ）」又は「薬物負荷（ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ）」とは、個々のＡＤＣ分子中の抗体あたりの薬物分子の数のことである。抗ヒトＣＤ３３抗体に連結されたＢＥＴｄ薬物の数は変動可能であり、抗ヒトＣＤ３３抗体上の利用可能な結合部位の数により制限される。本明細書で開示される抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣについて想定されるように、リンカーは、単一のＢＥＴｄ薬物を抗ヒトＣＤ３３抗体に連結して、抗ヒトＣＤ３３ ＡＤＣを構成する。抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣが使用及び／又は貯蔵条件下で容認できないレベルの凝集を見せない限りは、１０までのｎを有する抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ（すなわち、式（Ｉ））が想定される。一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、１～１０の範囲のｎを有する。実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択されるｎを有する。実施形態では、ｎは２、４、６、８又は１０である。実施形態では、ｎは２である。実施形態では、ｎは４である。実施形態では、ｎは６である。実施形態では、薬物負荷は、１薬物分子、２薬物分子、３薬物分子、４薬物分子、５薬物分子、６薬物分子、７薬物分子、８薬物分子、９薬物分子又は１０薬物分子を含みうる。
【0048】
ＡＤＣの優勢種が２のｎを有し、組成物が２又は約２の薬物－抗体比（ＤＡＲ）を有する抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ組成物を作製するコンジュゲーション法が本明細書で提供される。ＤＡＲは組成物中でそれぞれの抗体に連結された薬物の平均数である。コンジュゲーションの他の方法は、当技術分野で公知であり、異なる数のコンジュゲート薬物（例えば、１、２、３、４、５、６又は７のｎを有する）を有するＡＤＣ及び異なるＤＡＲ（例えば、１、２、３又は約１、約２、若しくは約３のＤＡＲ）の組成物を作製するのに利用することができる。
【0049】
１．３．３．例示的抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ
実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、切断可能なアラニン－アラニン（ａａ）リンカーを通してＢＥＴｄ薬物にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３３抗体を含み、抗ヒトＣＤ３３抗体はｍＡｂ１のＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。実施形態では、リンカーは、ＡＤＣの抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ抗体由来の還元システインのスルフヒドリルへのコンジュゲーションのためのマレイミド官能基を含む。
実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、切断可能なアラニン－アラニン（ａａ）リンカーを通してＢＥＴｄ薬物にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ３３抗体を含み、抗ヒトＣＤ３３抗体はｍＡｂ１のＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。実施形態では、リンカーは、ＡＤＣの抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ抗体由来の還元システインのスルフヒドリルへのコンジュゲーションのためのマレイミド官能基を含む。
【0050】
実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、抗体ｍＡｂ１のＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ヒトＣＤ３３抗体を含み、これは抗ヒトＣＤ３３抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基で形成された連鎖を介してリンカー－薬物ＬＤ１（式（ＩＩＩ））にコンジュゲートされている。実施形態では、抗ヒトＣＤ３３抗体は、抗体ｍＡｂ１の可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖領域配列を含む。実施形態では、抗ヒトＣＤ３３抗体は、抗体ｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
【0051】
実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、以下の式（ＩＶ）：
【0052】
【化12】
ｎは１～１０の整数であり、ｍＡｂ１は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体ｍＡｂ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体Ａｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体へのリンカー－薬物のコンジュゲーションは、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基で形成された連鎖を介する。実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の値を有する。実施形態では、ｎは２、４、６、８又は１０の値を有する。実施形態では、ｎは２である。
【0053】
ある特定の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、抗体ｍＡｂ１のＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ヒトＣＤ３３抗体を含み、これは抗ヒトＣＤ３３抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基で形成された連鎖を介してリンカー－薬物ＬＤ１（式（ＩＩＩ））にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３抗体は、抗体ｍＡｂ１の可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖領域配列を含む。一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３抗体は、抗体ｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
【0054】
一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、以下の構造式（Ｖ）：
【0055】
【化13】
ｎは１～１０の整数であり、ｍＡｂ１は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体ｍＡｂ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体Ａｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体へのリンカー－薬物のコンジュゲーションは、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基で形成された連鎖を介する。実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の値を有する。実施形態では、ｎは２、４、６、８又は１０の値を有する。実施形態では、ｎは２である。
【0056】
ある特定の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、抗体ｍＡｂ１のＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ヒトＣＤ３３抗体を含み、これは抗ヒトＣＤ３３抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基で形成された連鎖を介してリンカー－薬物ＬＤ１（式（ＩＩＩ））にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３抗体は、抗体ｍＡｂ１の可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖領域配列を含む。一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３抗体は、抗体ｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
【0057】
一部の実施形態では、抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣは、以下の式（ＶＩ）：
【0058】
【化14】
ｎは１～１０の整数であり、ｍＡｂ１は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体ｍＡｂ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体Ａｂは、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒトＣＤ３３抗体である。実施形態では、抗体へのリンカー－薬物のコンジュゲーションは、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基で形成された連鎖を介する。実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の値を有する。実施形態では、ｎは２、４、６、８又は１０の値を有する。実施形態では、ｎは２である。
【0059】
本開示の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの実施形態は、対象への投与に適した組成物として提供しうる。一部の実施形態では、組成物は、本開示の抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【0060】
１．４．使用方法
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するための方法であって、本明細書で開示される抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法の実施形態が本明細書で提供される。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するための方法であって、本明細書で開示される抗ヒトＣＤ３３ ＢＥＴｄ ＡＤＣの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法の実施形態が本明細書で提供される。
【0061】
用語「対象」とは、本明細書で使用される場合、ヒトのことである。用語「ヒト」、「患者」及び「対象」は本明細書では互換的に使用される。
【0062】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書で使用される場合、疾患及び／又はその付随する症状を軽減する又は抑制する方法のことである。
【0063】
語句「治療有効量」とは、特定の対象又は対象集団での処置のために投与された場合、処置されている状態又は障害の症状のうちの１つ以上をある程度軽減するのに十分な量のことである。
【実施例0064】
以下の実施例は、本明細書に記載される実施形態のある特定の特長及び特性を強調する。
【0065】
略語
ＡＰＣＩは大気圧化学イオン化；ＤＣＩは脱離化学イオン化；ＤＣＩは脱離化学イオン化；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド；ＥＳＩはエレクトロスプレーイオン化；ＨＡＴＵは１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）；ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィー；ＭＳは質量スペクトル；ｍ／ｚは質量電荷比；ＮＭＲは核磁気共鳴；ｐｐｍは１００万分の１；及びｐｓｉはポンド毎平方インチを表す。
ＡＰＣＩは大気圧化学イオン化；ＤＣＩは脱離化学イオン化；ＤＣＩは脱離化学イオン化；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド；ＥＳＩはエレクトロスプレーイオン化；ＨＡＴＵは１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）；ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィー；ＭＳは質量スペクトル；ｍ／ｚは質量電荷比；ＮＭＲは核磁気共鳴；ｐｐｍは１００万分の１；及びｐｓｉはポンド毎平方インチを表す。
【0066】
分取ＨＰＬＣ条件－方法Ａ
試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）分取カラム（１０μｍ、Ｃ１８（２）、２５０ｍｍ×５０ｍｍ、１００Å）を使用する分取ＨＰＬＣにより１００ｍＬ／分の流速で精製され、０．１％のトリフルオロ酢酸／水中２０～１００％アセトニトリルで３０分間かけて溶出させた。産物含有画分は収集されて凍結乾燥され、所望の物質を得た。
試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）分取カラム（１０μｍ、Ｃ１８（２）、２５０ｍｍ×５０ｍｍ、１００Å）を使用する分取ＨＰＬＣにより１００ｍＬ／分の流速で精製され、０．１％のトリフルオロ酢酸／水中２０～１００％アセトニトリルで３０分間かけて溶出させた。産物含有画分は収集されて凍結乾燥され、所望の物質を得た。
【0067】
［実施例１］ ＢＥＴｄ１
【0068】
【化15】
【0069】
【化16】
【0070】
［実施例１－１］
（Ｅ）－２－（５－ブロモ－２－メトキシ－３－ニトロピリジン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエテン－１－アミン
５－ブロモ－２－メトキシ－４－メチル－３－ニトロピリジン（１５．０ｇ、６０．７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）に溶解し、リチウムメタノレート（６．０７ｍＬ、６．０７ｍｍｏｌ、メタノール中１Ｍ）を添加した。反応混合物は１００℃で加熱した。この混合物に、１，１－ジメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン（６４．５ｍＬ、４８６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。反応混合物を９５℃で１６時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、水を添加した（３００ｍＬ、発熱性）。得られた沈殿物を減圧濾過により収集し、水で洗浄し、乾燥させて表題の化合物を得た（１３．９ｇ、収率７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．２５ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．９１ （ｓ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３０２．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
（Ｅ）－２－（５－ブロモ－２－メトキシ－３－ニトロピリジン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエテン－１－アミン
５－ブロモ－２－メトキシ－４－メチル－３－ニトロピリジン（１５．０ｇ、６０．７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）に溶解し、リチウムメタノレート（６．０７ｍＬ、６．０７ｍｍｏｌ、メタノール中１Ｍ）を添加した。反応混合物は１００℃で加熱した。この混合物に、１，１－ジメトキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタンアミン（６４．５ｍＬ、４８６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。反応混合物を９５℃で１６時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、水を添加した（３００ｍＬ、発熱性）。得られた沈殿物を減圧濾過により収集し、水で洗浄し、乾燥させて表題の化合物を得た（１３．９ｇ、収率７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．２５ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．９１ （ｓ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３０２．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0071】
［実施例１－２］
４－ブロモ－７－メトキシ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン
実施例１－１（１３．９ｇ、４５．８ｍｍｏｌ）及び酢酸エチル（１５０ｍＬ）を、ステンレス鋼製圧力ボトル中のＲａｎｅｙ（登録商標）－ニッケル２８００（エタノールで前洗浄）、水スラリー（６．９０ｇ、１１８ｍｍｏｌ）に添加し、Ｈ２の３０ｐｓｉ及び周囲温度で３０分間攪拌した。反応混合物を濾過し、濃縮した。残渣はジクロロメタンを用いてすりつぶされ、濾過されて表題の化合物を得た（５．８２ｇ）。母液は濃縮され、残渣はジクロロメタンを用いてすりつぶされ、濾過されて表題の化合物をさらに１．６３ｇ得た（全部で７．４５ｇ、収率７２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．１５ （ｓ， １Ｈ）， ７．７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．９， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２２７．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
４－ブロモ－７－メトキシ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン
実施例１－１（１３．９ｇ、４５．８ｍｍｏｌ）及び酢酸エチル（１５０ｍＬ）を、ステンレス鋼製圧力ボトル中のＲａｎｅｙ（登録商標）－ニッケル２８００（エタノールで前洗浄）、水スラリー（６．９０ｇ、１１８ｍｍｏｌ）に添加し、Ｈ２の３０ｐｓｉ及び周囲温度で３０分間攪拌した。反応混合物を濾過し、濃縮した。残渣はジクロロメタンを用いてすりつぶされ、濾過されて表題の化合物を得た（５．８２ｇ）。母液は濃縮され、残渣はジクロロメタンを用いてすりつぶされ、濾過されて表題の化合物をさらに１．６３ｇ得た（全部で７．４５ｇ、収率７２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．１５ （ｓ， １Ｈ）， ７．７６ （ｓ， １Ｈ）， ７．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．９， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２２７．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0072】
［実施例１－３］
４－ブロモ－７－メトキシ－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２３５ｍＬ）中の実施例１－２（７．４２ｇ、３２．７ｍｍｏｌ）の溶液を周囲温度で攪拌した。水素化ナトリウム（１．１８ｇ、１．９６ｇの油中６０％分散液、４９．０ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、反応混合物を１０分間攪拌した。次に、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（９．３５ｇ、４９．０ｍｍｏｌ）を分割添加し、混合物を窒素下、周囲温度で１６時間攪拌した。反応混合物を水で慎重にクエンチし、ブフナー漏斗上で吸引濾過し、水で洗浄した。次に、収集及び真空オーブン中、５０℃で乾燥させた後、表題の化合物が生成した（１２．４ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．１８ （ｄ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．００ （ｓ， １Ｈ）， ７．９０ - ７．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５０ - ７．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＡＰＣＩ＋） ｍ／ｚ ３８３．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
４－ブロモ－７－メトキシ－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２３５ｍＬ）中の実施例１－２（７．４２ｇ、３２．７ｍｍｏｌ）の溶液を周囲温度で攪拌した。水素化ナトリウム（１．１８ｇ、１．９６ｇの油中６０％分散液、４９．０ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、反応混合物を１０分間攪拌した。次に、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（９．３５ｇ、４９．０ｍｍｏｌ）を分割添加し、混合物を窒素下、周囲温度で１６時間攪拌した。反応混合物を水で慎重にクエンチし、ブフナー漏斗上で吸引濾過し、水で洗浄した。次に、収集及び真空オーブン中、５０℃で乾燥させた後、表題の化合物が生成した（１２．４ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．１８ （ｄ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．００ （ｓ， １Ｈ）， ７．９０ - ７．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５０ - ７．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＡＰＣＩ＋） ｍ／ｚ ３８３．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0073】
［実施例１－４］
エチル４－ブロモ－７－メトキシ－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中の実施例１－３（１２ｇ、３２ｍｍｏｌ）の溶液に、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ、１．９５Ｍ、２４．３ｍＬ、４７．２ｍｍｏｌ）を－７０℃、滴下し、混合物を－７０℃～－５０℃で４５分間攪拌し、続いてエチルカルボノクロリデート（５．１２ｇ、４７．２ｍｍｏｌ）を滴下した。１．５時間後、反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチした。揮発物を減圧下で取り除き、残渣を酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で抽出した。複合有機画分を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗い表題化合物が得られ、これをジクロロメタンとメタノール（１：１０）ですりつぶして表題化合物を得た（１３ｇ、収率９１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．１７ - ８．０８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２５ （ｓ， １Ｈ）， ４．３９ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， １．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４５４．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
エチル４－ブロモ－７－メトキシ－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中の実施例１－３（１２ｇ、３２ｍｍｏｌ）の溶液に、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ、１．９５Ｍ、２４．３ｍＬ、４７．２ｍｍｏｌ）を－７０℃、滴下し、混合物を－７０℃～－５０℃で４５分間攪拌し、続いてエチルカルボノクロリデート（５．１２ｇ、４７．２ｍｍｏｌ）を滴下した。１．５時間後、反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチした。揮発物を減圧下で取り除き、残渣を酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で抽出した。複合有機画分を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗い表題化合物が得られ、これをジクロロメタンとメタノール（１：１０）ですりつぶして表題化合物を得た（１３ｇ、収率９１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．１７ - ８．０８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２５ （ｓ， １Ｈ）， ４．３９ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， １．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４５４．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0074】
［実施例１－５］
エチル４－ブロモ－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
クロロトリメチルシラン（１０．４３ｇ、９６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（４００ｍＬ）中実施例１－４（２９ｇ、６４ｍｍｏｌ）とヨウ化ナトリウム（１４．３８ｇ、９６ｍｍｏｌ）の混合物に滴下した。得られた混合物は周囲温度で１時間攪拌され、その後水（０．５７６ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を６５℃で３時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、濾過した。沈殿物をジクロロメタンに溶解し、濾過し、濃縮し、石油エーテル及びジクロロメタンで洗浄して表題の化合物を得た（２７．９ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １１．７６ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ - ８．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５０ - ７．４３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ４．３５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， １．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４４０．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
エチル４－ブロモ－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
クロロトリメチルシラン（１０．４３ｇ、９６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（４００ｍＬ）中実施例１－４（２９ｇ、６４ｍｍｏｌ）とヨウ化ナトリウム（１４．３８ｇ、９６ｍｍｏｌ）の混合物に滴下した。得られた混合物は周囲温度で１時間攪拌され、その後水（０．５７６ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を６５℃で３時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、濾過した。沈殿物をジクロロメタンに溶解し、濾過し、濃縮し、石油エーテル及びジクロロメタンで洗浄して表題の化合物を得た（２７．９ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １１．７６ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ - ８．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５０ - ７．４３ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， １Ｈ）， ４．３５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， １．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４４０．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0075】
［実施例１－６］
エチル４－ブロモ－６－メチル－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ヨードメタン（３．２０ｍＬ、５１．１ｍｍｏｌ）を、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中実施例１－５（１８．７２ｇ、４２．６ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（１６．６６ｇ、５１．１ｍｍｏｌ）の混合物に滴下した。反応混合物を周囲温度で７２時間攪拌した。水を添加し（５００ｍＬ）、沈殿物を濾過により収集した。収集した物質を水で洗浄して、５５℃、真空下一晩乾燥させて表題の化合物を得た（１７．９ｇ、収率９０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０２ （ｓ， １Ｈ）， ４．３７ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， １．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４５４．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
エチル４－ブロモ－６－メチル－１－（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ヨードメタン（３．２０ｍＬ、５１．１ｍｍｏｌ）を、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中実施例１－５（１８．７２ｇ、４２．６ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（１６．６６ｇ、５１．１ｍｍｏｌ）の混合物に滴下した。反応混合物を周囲温度で７２時間攪拌した。水を添加し（５００ｍＬ）、沈殿物を濾過により収集した。収集した物質を水で洗浄して、５５℃、真空下一晩乾燥させて表題の化合物を得た（１７．９ｇ、収率９０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０２ （ｓ， １Ｈ）， ４．３７ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， １．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４５４．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0076】
［実施例１－７］
４－ブロモ－６－メチル－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボン酸
ジオキサン（４００ｍＬ）中実施例１－６（３５ｇ、８０ｍｍｏｌ）の溶液を、１．０Ｍの水酸化ナトリウム溶液（１５９ｍＬ、３１９ｍｍｏｌ）で処理して、混合物を８０℃で４時間攪拌した。反応混合物を２ＮのＨＣｌでｐＨ１に調整した。沈殿物を濾過により収集し、水（５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて表題の化合物を得た（２０．８ｇ、７７ｍｍｏｌ、収率９６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １３．１７ （ｓ， １Ｈ）， １２．９９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６０ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｓ， １Ｈ）， ３．４９ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ＋） ｍ／ｚ ２７０．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
４－ブロモ－６－メチル－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボン酸
ジオキサン（４００ｍＬ）中実施例１－６（３５ｇ、８０ｍｍｏｌ）の溶液を、１．０Ｍの水酸化ナトリウム溶液（１５９ｍＬ、３１９ｍｍｏｌ）で処理して、混合物を８０℃で４時間攪拌した。反応混合物を２ＮのＨＣｌでｐＨ１に調整した。沈殿物を濾過により収集し、水（５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて表題の化合物を得た（２０．８ｇ、７７ｍｍｏｌ、収率９６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １３．１７ （ｓ， １Ｈ）， １２．９９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６０ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｓ， １Ｈ）， ３．４９ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ＋） ｍ／ｚ ２７０．９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0077】
［実施例１－８］
ｔｅｒｔ－ブチル４－ブロモ－６－メチル－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ジオキサン（２００ｍＬ）中実施例１－７（１０ｇ、３６．９ｍｍｏｌ）に、（Ｅ）－ｔｅｒｔ－ブチルＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルバムイミド酸（１４．７８ｇ、７３．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を密封して１１０℃で１８時間加熱した。次に、別のバッチの（Ｅ）－ｔｅｒｔ－ブチルＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルバムイミド酸（１４．７８ｇ、７３．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１１０℃で２４時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（６００ｍＬ）と水（１００ｍＬ）の間で分配した。水層を酢酸エチル（２００ｍＬ）で再び抽出した。複合有機層を飽和水性塩化ナトリウム（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中２５％～６０％の酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（１１．７ｇ、収率９０％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １３．０９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ６．７５ （ｓ， １Ｈ）， ３．５１ （ｓ， ３Ｈ）， １．５５ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３２７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル４－ブロモ－６－メチル－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ジオキサン（２００ｍＬ）中実施例１－７（１０ｇ、３６．９ｍｍｏｌ）に、（Ｅ）－ｔｅｒｔ－ブチルＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルバムイミド酸（１４．７８ｇ、７３．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を密封して１１０℃で１８時間加熱した。次に、別のバッチの（Ｅ）－ｔｅｒｔ－ブチルＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルバムイミド酸（１４．７８ｇ、７３．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１１０℃で２４時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（６００ｍＬ）と水（１００ｍＬ）の間で分配した。水層を酢酸エチル（２００ｍＬ）で再び抽出した。複合有機層を飽和水性塩化ナトリウム（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中２５％～６０％の酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（１１．７ｇ、収率９０％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １３．０９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ６．７５ （ｓ， １Ｈ）， ３．５１ （ｓ， ３Ｈ）， １．５５ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３２７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0078】
［実施例１－９］
ｔｅｒｔ－ブチル６－メチル－７－オキソ－４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ジオキサン（１５０ｍＬ）中実施例１－８（９．７ｇ、２８ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（８．２９ｇ、８４ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシル（２’，４’，６’－トリイソプロピル－［１，１’－ビフェニル］－２－イル）ホスフィン（０．５３７ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．２５８ｇ、０．２８２ｍｍｏｌ）及び４，４，４’，４’，５，５，５’，５’－オクタメチル－２，２’－ビ（１，３，２－ジオキサボロラン）（２１．４６ｇ、８４ｍｍｏｌ）の混合物からガスを抜き、窒素を数回充填して戻した。反応混合物を、８０℃で１６時間加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、珪藻土のパッドを通して濾過した。パッドを酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗い物質を石油エーテルで洗浄して表題の化合物を得た（９．０ｇ、収率７９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．５３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３ （ｓ， １Ｈ）， ７．００ （ｓ， １Ｈ）， ３．５１ （ｓ， ３Ｈ）， １．５１ （ｓ， ９Ｈ）， １．２７ （ｓ， １２Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３７５．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル６－メチル－７－オキソ－４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ジオキサン（１５０ｍＬ）中実施例１－８（９．７ｇ、２８ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（８．２９ｇ、８４ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシル（２’，４’，６’－トリイソプロピル－［１，１’－ビフェニル］－２－イル）ホスフィン（０．５３７ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．２５８ｇ、０．２８２ｍｍｏｌ）及び４，４，４’，４’，５，５，５’，５’－オクタメチル－２，２’－ビ（１，３，２－ジオキサボロラン）（２１．４６ｇ、８４ｍｍｏｌ）の混合物からガスを抜き、窒素を数回充填して戻した。反応混合物を、８０℃で１６時間加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、珪藻土のパッドを通して濾過した。パッドを酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗い物質を石油エーテルで洗浄して表題の化合物を得た（９．０ｇ、収率７９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．５３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５３ （ｓ， １Ｈ）， ７．００ （ｓ， １Ｈ）， ３．５１ （ｓ， ３Ｈ）， １．５１ （ｓ， ９Ｈ）， １．２７ （ｓ， １２Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３７５．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0079】
［実施例１－１０］
２－ブロモ－４－ニトロ－Ｎ－フェニルアニリン
２－ブロモ－１－フルオロ－４－ニトロベンゼン（３０．０ｇ、１３６ｍｍｏｌ）、アニリン（２５．４ｇ、２７３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４７．６ｍＬ、２７３ｍｍｏｌ）の混合物を還流下１４０℃で１２時間攪拌した。周囲温度まで冷却後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを減圧下で取り除いた。残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物を水性２Ｎ ＨＣｌ（２００ｍＬ）及び飽和水性塩化ナトリウム（５００ｍＬ）で順次洗浄し、その後無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。冷メタノール（１００ｍＬ）で洗浄後表題の化合物が得られた（２５．５ｇ、収率６３．３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．４７ （ｓ， １ Ｈ）， ８．３９ （ｄ， Ｊ ＝２．６５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ８．０５ （ｄｄ， Ｊ ＝９．２６， ２．６５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３９ － ７．５１ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．３２ （ｄ， Ｊ ＝７．５０ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．１８ － ７．２６ （ｍ， １ Ｈ）， ７．０２ （ｄ， Ｊ ＝９．２６ Ｈｚ， １ Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２９３．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
２－ブロモ－４－ニトロ－Ｎ－フェニルアニリン
２－ブロモ－１－フルオロ－４－ニトロベンゼン（３０．０ｇ、１３６ｍｍｏｌ）、アニリン（２５．４ｇ、２７３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４７．６ｍＬ、２７３ｍｍｏｌ）の混合物を還流下１４０℃で１２時間攪拌した。周囲温度まで冷却後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを減圧下で取り除いた。残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。得られた混合物を水性２Ｎ ＨＣｌ（２００ｍＬ）及び飽和水性塩化ナトリウム（５００ｍＬ）で順次洗浄し、その後無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。冷メタノール（１００ｍＬ）で洗浄後表題の化合物が得られた（２５．５ｇ、収率６３．３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．４７ （ｓ， １ Ｈ）， ８．３９ （ｄ， Ｊ ＝２．６５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ８．０５ （ｄｄ， Ｊ ＝９．２６， ２．６５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３９ － ７．５１ （ｍ， ２ Ｈ）， ７．３２ （ｄ， Ｊ ＝７．５０ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．１８ － ７．２６ （ｍ， １ Ｈ）， ７．０２ （ｄ， Ｊ ＝９．２６ Ｈｚ， １ Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２９３．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0080】
［実施例１－１１］
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－アニリノ－５－ニトロフェニル）－６－メチル－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ジオキサン（２４ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中実施例１－１０（１．１５ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）、実施例１－９（１．７６２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）、１，３，５，７－テトラメチル－６－フェニル－２，４，８－トリオキサ－６－ホスファアダマンタン（０．１３４ｇ、０．４５９ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．１０８ｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）及びリン酸カリウム（０．８３３ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）の混合物からガス抜きし、窒素を数回充填して戻した。反応混合物を６０℃で１６時間加熱した。反応混合物を水と酢酸エチルの間で分配し、濾過した。濾液を分離した。水層を追加の酢酸エチルで３回抽出した。複合有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で脱水させ、濾過し、濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル中５％のメタノールで溶出させた）により精製され、表題の化合物の第２のバッチを得た。全表題の化合物は１．７９ｇ単離された（収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．７２ （ｓ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．１， ２．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４４ （ｓ， １Ｈ）， ７．３６ - ７．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２２ - ７．１４ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１２ - ７．０５ （ｍ， １Ｈ）， ６．５５ （ｓ， １Ｈ）， ３．５６ （ｓ， ３Ｈ）， １．４４ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４６１．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－アニリノ－５－ニトロフェニル）－６－メチル－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジン－２－カルボキシレート
ジオキサン（２４ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中実施例１－１０（１．１５ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）、実施例１－９（１．７６２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）、１，３，５，７－テトラメチル－６－フェニル－２，４，８－トリオキサ－６－ホスファアダマンタン（０．１３４ｇ、０．４５９ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．１０８ｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）及びリン酸カリウム（０．８３３ｇ、３．９２ｍｍｏｌ）の混合物からガス抜きし、窒素を数回充填して戻した。反応混合物を６０℃で１６時間加熱した。反応混合物を水と酢酸エチルの間で分配し、濾過した。濾液を分離した。水層を追加の酢酸エチルで３回抽出した。複合有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で脱水させ、濾過し、濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル中５％のメタノールで溶出させた）により精製され、表題の化合物の第２のバッチを得た。全表題の化合物は１．７９ｇ単離された（収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．７２ （ｓ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．１， ２．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４４ （ｓ， １Ｈ）， ７．３６ - ７．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２２ - ７．１４ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１２ - ７．０５ （ｍ， １Ｈ）， ６．５５ （ｓ， １Ｈ）， ３．５６ （ｓ， ３Ｈ）， １．４４ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４６１．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0081】
［実施例１－１２］
ｔｅｒｔ－ブチル２－メチル－１０－ニトロ－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボキシレート
酢酸（１００ｍＬ）中実施例１－１１（５．２ｇ、１１．２９ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１．０１７ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で２時間攪拌した。追加のパラホルムアルデヒド（０．６７８ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃でさらに３時間攪拌した。反応混合物を水（約１００ｍＬ）で希釈し、沈殿物を濾過により収集し、ヘキサンで洗浄して表題の化合物を得た（５．３ｇ、収率８２％）。ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）ｍ／ｚ ４７３．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル２－メチル－１０－ニトロ－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボキシレート
酢酸（１００ｍＬ）中実施例１－１１（５．２ｇ、１１．２９ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１．０１７ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で２時間攪拌した。追加のパラホルムアルデヒド（０．６７８ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃でさらに３時間攪拌した。反応混合物を水（約１００ｍＬ）で希釈し、沈殿物を濾過により収集し、ヘキサンで洗浄して表題の化合物を得た（５．３ｇ、収率８２％）。ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）ｍ／ｚ ４７３．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【0082】
［実施例１－１３］
２－メチル－１０－ニトロ－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボン酸
トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ、１３０ｍｍｏｌ）を周囲温度でジクロロメタン（２０ｍＬ）中実施例１－１２（２．６ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた混合物を周囲温度で４時間攪拌した。揮発物を減圧下で取り除いた。水（８０ｍＬ）ですりつぶし、濾過し、高真空下で乾燥した後、表題の化合物（２．３０ｇ、収率９９％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６，７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４１７．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
２－メチル－１０－ニトロ－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボン酸
トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ、１３０ｍｍｏｌ）を周囲温度でジクロロメタン（２０ｍＬ）中実施例１－１２（２．６ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた混合物を周囲温度で４時間攪拌した。揮発物を減圧下で取り除いた。水（８０ｍＬ）ですりつぶし、濾過し、高真空下で乾燥した後、表題の化合物（２．３０ｇ、収率９９％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６，７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４１７．３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0083】
【化17】
【0084】
［実施例１－１４］
（｛２－［（プロプ－２－エン－１－イル）オキシ］エトキシ｝メチル）ベンゼン
６０％水素化ナトリウム（７．８８ｇ、１９７ｍｍｏｌ）及び３－ブロモプロプ－１－エン（１７．１ｍＬ、１９７ｍｍｏｌ）を０℃で、テトラヒドロフラン（１６０ｍＬ）中２－（ベンジルオキシ）エタノール（２３．３ｍＬ、１６４ｍｍｏｌ）の溶液に慎重に添加した。反応混合物を周囲温度で４時間攪拌し、水でクエンチし、酢酸エチルで分配した。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濾過して濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～１０％の酢酸エチル）により精製され、表題の化合物を得た（２７．４ｇ、収率８７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．３８ - ７．２２ （ｍ， ５Ｈ）， ５．８６ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １７．３， １０．５， ５．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２３ （ｄｑ， Ｊ ＝ １７．３， １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１６ - ５．０８ （ｍ， １Ｈ）， ４．４７ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９４ （ｄｔ， Ｊ ＝ ５．３， １．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５９ - ３．４９ （ｍ， ４Ｈ）．
（｛２－［（プロプ－２－エン－１－イル）オキシ］エトキシ｝メチル）ベンゼン
６０％水素化ナトリウム（７．８８ｇ、１９７ｍｍｏｌ）及び３－ブロモプロプ－１－エン（１７．１ｍＬ、１９７ｍｍｏｌ）を０℃で、テトラヒドロフラン（１６０ｍＬ）中２－（ベンジルオキシ）エタノール（２３．３ｍＬ、１６４ｍｍｏｌ）の溶液に慎重に添加した。反応混合物を周囲温度で４時間攪拌し、水でクエンチし、酢酸エチルで分配した。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濾過して濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～１０％の酢酸エチル）により精製され、表題の化合物を得た（２７．４ｇ、収率８７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．３８ - ７．２２ （ｍ， ５Ｈ）， ５．８６ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １７．３， １０．５， ５．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２３ （ｄｑ， Ｊ ＝ １７．３， １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１６ - ５．０８ （ｍ， １Ｈ）， ４．４７ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９４ （ｄｔ， Ｊ ＝ ５．３， １．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５９ - ３．４９ （ｍ， ４Ｈ）．
【0085】
［実施例１－１５］
３－［２－（ベンジルオキシ）エトキシ］プロパン－１－オール
ボラン－メチルスルフィド複合体（１３．５ｍＬ、１４３ｍｍｏｌ）を０℃で、トルエン（１４０ｍＬ）中実施例１－１４（２７．４ｇ、１４３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を周囲温度で３時間攪拌し、０℃でメタノール（１４０ｍＬ）、続いて３０％の過酸化水素（１９．３９ｇ、１７１ｍｍｏｌ）、続いて２Ｍの水性水酸化ナトリウム（１７８ｍＬ、３５６ｍｍｏｌ）を用いて慎重にクエンチした。反応混合物を周囲温度で２時間攪拌し、次に、酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を１０％の水性亜硫酸水素ナトリウム及び飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１０～４０％の酢酸エチル）により精製され、表題の化合物を得た（１３．８ｇ、収率４６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．３４ （ｄｔ， Ｊ ＝ ６．７， １．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３４ - ７．２６ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２９ - ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ４．４７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．３７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ - ３．４０ （ｍ， ８Ｈ）， １．６３ （ｐ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）．
３－［２－（ベンジルオキシ）エトキシ］プロパン－１－オール
ボラン－メチルスルフィド複合体（１３．５ｍＬ、１４３ｍｍｏｌ）を０℃で、トルエン（１４０ｍＬ）中実施例１－１４（２７．４ｇ、１４３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を周囲温度で３時間攪拌し、０℃でメタノール（１４０ｍＬ）、続いて３０％の過酸化水素（１９．３９ｇ、１７１ｍｍｏｌ）、続いて２Ｍの水性水酸化ナトリウム（１７８ｍＬ、３５６ｍｍｏｌ）を用いて慎重にクエンチした。反応混合物を周囲温度で２時間攪拌し、次に、酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を１０％の水性亜硫酸水素ナトリウム及び飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１０～４０％の酢酸エチル）により精製され、表題の化合物を得た（１３．８ｇ、収率４６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．３４ （ｄｔ， Ｊ ＝ ６．７， １．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３４ - ７．２６ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２９ - ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ４．４７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．３７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ - ３．４０ （ｍ， ８Ｈ）， １．６３ （ｐ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）．
【0086】
［実施例１－１６］
ｔｅｒｔ－ブチル｛３－［２－（ベンジルオキシ）エトキシ］プロポキシ｝アセテート
ジクロロメタン（４７．０ｍＬ）中実施例１－１５（８．９ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１６．５１ｇ、８５ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（１１．７６ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）及び１０Ｍの水性水酸化ナトリウム（４６．６ｍＬ、４６６ｍｍｏｌ）の混合物を８時間激しく攪拌した。追加のブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１６．５１ｇ、８５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４８時間攪拌した。混合物を減圧下で濃縮してジクロロメタンを取り除き、それぞれ２００ｍＬの酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を１００ｍＬの飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１２０ｇカラム、ヘプタン中５～１００％酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（９．１ｇ、収率５６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４７ （ｓ， ９Ｈ）， １．８８-１．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７-３．６３ （ｍ， ８Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５７ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２７-７．３５ （ｍ， ５Ｈ）．
ｔｅｒｔ－ブチル｛３－［２－（ベンジルオキシ）エトキシ］プロポキシ｝アセテート
ジクロロメタン（４７．０ｍＬ）中実施例１－１５（８．９ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１６．５１ｇ、８５ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムクロリド（１１．７６ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）及び１０Ｍの水性水酸化ナトリウム（４６．６ｍＬ、４６６ｍｍｏｌ）の混合物を８時間激しく攪拌した。追加のブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１６．５１ｇ、８５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４８時間攪拌した。混合物を減圧下で濃縮してジクロロメタンを取り除き、それぞれ２００ｍＬの酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を１００ｍＬの飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１２０ｇカラム、ヘプタン中５～１００％酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（９．１ｇ、収率５６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４７ （ｓ， ９Ｈ）， １．８８-１．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７-３．６３ （ｍ， ８Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５７ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２７-７．３５ （ｍ， ５Ｈ）．
【0087】
［実施例１－１７］
ｔｅｒｔ－ブチル［３－（２－ヒドロキシエトキシ）プロポキシ］アセテート
メタノール（１００ｍＬ）中実施例１－１６（１１．７３ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）を、アルゴンを流した２５０ｍＬのステンレス鋼圧力ビン中の１０％Ｐｄ／Ｃ、ドライ（２．３０ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）に添加した。反応器をアルゴンで一掃し、２０ｐｓｉの水素下、１８時間外部加熱なしで標準速度で振盪した。混合物はポリプロピレン膜を通して濾過され、濾液を減圧下で濃縮して表題の化合物を得た（８．４９ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．８７-１．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３６ （ｂｒ， １Ｈ）， ３．５６-３．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０-３．６４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７２-３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ２Ｈ）．
ｔｅｒｔ－ブチル［３－（２－ヒドロキシエトキシ）プロポキシ］アセテート
メタノール（１００ｍＬ）中実施例１－１６（１１．７３ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）を、アルゴンを流した２５０ｍＬのステンレス鋼圧力ビン中の１０％Ｐｄ／Ｃ、ドライ（２．３０ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）に添加した。反応器をアルゴンで一掃し、２０ｐｓｉの水素下、１８時間外部加熱なしで標準速度で振盪した。混合物はポリプロピレン膜を通して濾過され、濾液を減圧下で濃縮して表題の化合物を得た（８．４９ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．８７-１．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３６ （ｂｒ， １Ｈ）， ３．５６-３．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０-３．６４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７２-３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ２Ｈ）．
【0088】
［実施例１－１８］
ｔｅｒｔ－ブチル（３－｛２－［（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）オキシ］エトキシ｝プロポキシ）アセテート
ピリジン（１２ｍＬ）中実施例１－１７（４．８５ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（４．３４ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間攪拌し、次に、酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を、冷水性１ＭのＨＣｌ、続いて飽和水性塩化ナトリウムで順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～６０％の酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（５．８８ｇ、収率６８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．７８-１．８５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４９-３．５６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１５ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）．
ｔｅｒｔ－ブチル（３－｛２－［（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）オキシ］エトキシ｝プロポキシ）アセテート
ピリジン（１２ｍＬ）中実施例１－１７（４．８５ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（４．３４ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間攪拌し、次に、酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を、冷水性１ＭのＨＣｌ、続いて飽和水性塩化ナトリウムで順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～６０％の酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（５．８８ｇ、収率６８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．７８-１．８５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４９-３．５６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１５ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）．
【0089】
［実施例１－１９］
ｔｅｒｔ－ブチル［３－（２－アジドエトキシ）プロポキシ］アセテート
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中実施例１－１８（５．８８ｇ、１５．１４ｍｍｏｌ）及びアジ化ナトリウム（１．１８１ｇ、１８．１６ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で３時間攪拌し、冷却し、酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～５０％の酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（３．６ｇ、収率８９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．８９-１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５９-３．６４ （ｍ， ６Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ２Ｈ）．
ｔｅｒｔ－ブチル［３－（２－アジドエトキシ）プロポキシ］アセテート
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中実施例１－１８（５．８８ｇ、１５．１４ｍｍｏｌ）及びアジ化ナトリウム（１．１８１ｇ、１８．１６ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で３時間攪拌し、冷却し、酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～５０％の酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（３．６ｇ、収率８９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．８９-１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５９-３．６４ （ｍ， ６Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ２Ｈ）．
【0090】
［実施例１－２０］
ｔｅｒｔ－ブチル［３－（２－アミノエトキシ）プロポキシ］アセテート
テトラヒドロフラン（３６ｍＬ）／水（１．１ｍＬ）中実施例１－１９（３．２ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（４．８６ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）の混合物を周囲温度で５時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン中１～１０％のメタノール／３％のアンモニア）による精製により表題の化合物が得られた（２．５ｇ、収率８７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．８７-１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４５-３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９５ （ｓ， ２Ｈ）．
ｔｅｒｔ－ブチル［３－（２－アミノエトキシ）プロポキシ］アセテート
テトラヒドロフラン（３６ｍＬ）／水（１．１ｍＬ）中実施例１－１９（３．２ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（４．８６ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）の混合物を周囲温度で５時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン中１～１０％のメタノール／３％のアンモニア）による精製により表題の化合物が得られた（２．５ｇ、収率８７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．８７-１．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４５-３．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９５ （ｓ， ２Ｈ）．
【0091】
［実施例１－２１］
ｔｅｒｔ－ブチル１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３－オキソ－２，７，１１－トリオキサ－４－アザトリデカン－１３－ｏａｔｅ
Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（０．５６ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（９ｍＬ）中実施例１－２０（０．５００ｇ、２．１４３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を０℃まで冷却し、９－フルオレニルメチルクロロホルメート（０．６１ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３．０ｍＬ）中の溶液として滴下した。氷水浴を外し、反応混合物を周囲温度で４８時間攪拌した。混合物を飽和水性塩化アンモニウムでクエンチし、層を分離した。水層をジクロロメタンで抽出した。複合有機層を飽和水性炭酸水素ナトリウム及び飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させて、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中０～５０％の酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（０．６４ｇ、収率６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．８５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．５， ０．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｔｔ， Ｊ ＝ ７．５， １．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ - ７．２２ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｄｔ， Ｊ ＝ １６．１， ６．５ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．３３ （ｓ， １Ｈ）， ３．０９ （ｑ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ （ｐ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３７ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４７８．１ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３－オキソ－２，７，１１－トリオキサ－４－アザトリデカン－１３－ｏａｔｅ
Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（０．５６ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（９ｍＬ）中実施例１－２０（０．５００ｇ、２．１４３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を０℃まで冷却し、９－フルオレニルメチルクロロホルメート（０．６１ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３．０ｍＬ）中の溶液として滴下した。氷水浴を外し、反応混合物を周囲温度で４８時間攪拌した。混合物を飽和水性塩化アンモニウムでクエンチし、層を分離した。水層をジクロロメタンで抽出した。複合有機層を飽和水性炭酸水素ナトリウム及び飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させて、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中０～５０％の酢酸エチル）による精製により表題の化合物が得られた（０．６４ｇ、収率６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．８５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．５， ０．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｔｔ， Ｊ ＝ ７．５， １．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ - ７．２２ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｄｔ， Ｊ ＝ １６．１， ６．５ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．３３ （ｓ， １Ｈ）， ３．０９ （ｑ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ （ｐ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３７ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４７８．１ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0092】
［実施例１－２２］
１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３－オキソ－２，７，１１－トリオキサ－４－アザトリデカン－１３－ｏｉｃ酸
ギ酸（１４ｍＬ）中実施例１－２１（０．６４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を６０℃で２時間加熱した。揮発物を減圧下で取り除き、残渣をトルエン（３×２５ｍＬ）と共沸させて表題の化合物を得た（０．５５ｇ、収率９８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．５７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．５， １．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ - ７．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５ （ｄ， Ｊ ＝ １２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４３ - ３．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ３．０９ （ｑ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７０ （ｐ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４００．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３－オキソ－２，７，１１－トリオキサ－４－アザトリデカン－１３－ｏｉｃ酸
ギ酸（１４ｍＬ）中実施例１－２１（０．６４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を６０℃で２時間加熱した。揮発物を減圧下で取り除き、残渣をトルエン（３×２５ｍＬ）と共沸させて表題の化合物を得た（０．５５ｇ、収率９８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．５７ （ｓ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．５， １．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ - ７．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５ （ｄ， Ｊ ＝ １２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４３ - ３．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ３．０９ （ｑ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７０ （ｐ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４００．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0093】
【化18】
【0094】
［実施例１－２３］
ｔｅｒｔ－ブチル［（１Ｒ）－１－（４－ブロモフェニル）－２－ヒドロキシエチル］カルバメート
ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（９．６５ｍＬ、４１．６ｍｍｏｌ）及び飽和水性炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）を、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中（２Ｒ）－２－アミノ－２－（４－ブロモフェニル）エタン－１－オールハイドロクロライド（１０ｇ、３９．６ｍｍｏｌ）の溶液に２０℃で添加した。混合物を２０℃で３時間攪拌し、水（１５０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。複合有機層を塩水（１００ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させた。溶液を濾過し濃縮して表題の化合物を得た（１２ｇ、収率９１％）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ ３３８．７（Ｍ＋Ｎａ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル［（１Ｒ）－１－（４－ブロモフェニル）－２－ヒドロキシエチル］カルバメート
ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（９．６５ｍＬ、４１．６ｍｍｏｌ）及び飽和水性炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）を、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中（２Ｒ）－２－アミノ－２－（４－ブロモフェニル）エタン－１－オールハイドロクロライド（１０ｇ、３９．６ｍｍｏｌ）の溶液に２０℃で添加した。混合物を２０℃で３時間攪拌し、水（１５０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。複合有機層を塩水（１００ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させた。溶液を濾過し濃縮して表題の化合物を得た（１２ｇ、収率９１％）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ ３３８．７（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【0095】
［実施例１－２４］
ｔｅｒｔ－ブチル［（１Ｒ）－１－（４－ブロモフェニル）－２－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝エチル］カルバメート
ｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン（７．１５ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１８０ｍＬ）中実施例１－２３（１２ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液に２０℃で添加し、次に、イミダゾール（６．４６ｇ、９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で８時間攪拌し、飽和水性ＮＨ４Ｃｌ（３００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３００ｍＬ）で抽出した。複合有機相を塩水（１５０ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、減圧中で濃縮した。残渣は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝５０：１）により精製され、表題の化合物を得た（１５ｇ、収率８７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．６３－４．６０ （ｍ， １Ｈ）， ３．７０－３．６５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）， ０．８６ （ｓ， ９Ｈ）， ０．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ４５２．７ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル［（１Ｒ）－１－（４－ブロモフェニル）－２－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝エチル］カルバメート
ｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン（７．１５ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１８０ｍＬ）中実施例１－２３（１２ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液に２０℃で添加し、次に、イミダゾール（６．４６ｇ、９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で８時間攪拌し、飽和水性ＮＨ４Ｃｌ（３００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３００ｍＬ）で抽出した。複合有機相を塩水（１５０ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、減圧中で濃縮した。残渣は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル／酢酸エチル＝５０：１）により精製され、表題の化合物を得た（１５ｇ、収率８７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．６３－４．６０ （ｍ， １Ｈ）， ３．７０－３．６５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）， ０．８６ （ｓ， ９Ｈ）， ０．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ ４５２．７ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0096】
［実施例１－２５］
ｔｅｒｔ－ブチル｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝カルバメート
炭酸カリウム（４．８２ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．２０９ｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスホニウムテトラフルオロボレート（０．６８４ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）及びピバル酸（０．７１２ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）を、磁気攪拌棒を備えたスクリューキャップバイアル中に置いた。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（７７．５ｍＬ）を添加した。実施例１－２４（１０．０ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）及び４－メチルチアゾール（２．７５ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素で３分間通気した。次に、反応混合物を１００℃で１６時間激しく攪拌した。その後、溶液を周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（１５０ｍＬ×２）で希釈し、塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。粗生成物をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解し、その後、テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニウムを添加した。混合物を３時間攪拌し、酢酸エチル（１５０ｍＬ×２）で希釈し、飽和塩化アンモニウム（１００ｍＬ×５）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させて、濾過し濃縮した。この物質はフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル＝１／１０）により精製され、表題の化合物を得た（７．０ｇ、収率８６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９９ （ｓ， １Ｈ）， ７．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５７－４．５５ （ｍ， １Ｈ）， ３．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）， １．３７ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ３３５．７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝カルバメート
炭酸カリウム（４．８２ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．２０９ｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスホニウムテトラフルオロボレート（０．６８４ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）及びピバル酸（０．７１２ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）を、磁気攪拌棒を備えたスクリューキャップバイアル中に置いた。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（７７．５ｍＬ）を添加した。実施例１－２４（１０．０ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）及び４－メチルチアゾール（２．７５ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素で３分間通気した。次に、反応混合物を１００℃で１６時間激しく攪拌した。その後、溶液を周囲温度まで冷却し、酢酸エチル（１５０ｍＬ×２）で希釈し、塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。粗生成物をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解し、その後、テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニウムを添加した。混合物を３時間攪拌し、酢酸エチル（１５０ｍＬ×２）で希釈し、飽和塩化アンモニウム（１００ｍＬ×５）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させて、濾過し濃縮した。この物質はフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル＝１／１０）により精製され、表題の化合物を得た（７．０ｇ、収率８６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９９ （ｓ， １Ｈ）， ７．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５７－４．５５ （ｍ， １Ｈ）， ３．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）， １．３７ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ３３５．７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0097】
［実施例１－２６］
（２Ｒ）－２－アミノ－２－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エタン－１－オールハイドロクロライド
１，４－ジオキサン（１２０ｍＬ）中実施例１－２５（６．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）及び４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（４０ｍＬ）の溶液を２０℃で１６時間攪拌した。揮発物を減圧下で取り除いて表題の化合物を得た（４．８ｇ、収率９４％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ２３５．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
（２Ｒ）－２－アミノ－２－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エタン－１－オールハイドロクロライド
１，４－ジオキサン（１２０ｍＬ）中実施例１－２５（６．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）及び４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（４０ｍＬ）の溶液を２０℃で１６時間攪拌した。揮発物を減圧下で取り除いて表題の化合物を得た（４．８ｇ、収率９４％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ２３５．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【0098】
【化19】
【0099】
［実施例１－２７］
メチルＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリネート
１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（４１．６ｇ、１０９ｍｍｏｌ、ＨＡＴＵ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２３０ｍＬ）中Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリン（２３ｇ、９９ｍｍｏｌ）、メチル（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリネートハイドロクロライド（１８．０６ｇ、９９ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６０．８ｍＬ、３４８ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で１６時間攪拌した。反応混合物を水（５００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（１０００ｍＬ）で抽出した。複合有機層を５％のクエン酸（３００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３００ｍＬ×２）及び塩水（３００ｍＬ×４）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させた。有機溶液を濾過し、濃縮して表題の化合物を得た（３５ｇ、収率９３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ６．５８ （ｄ， Ｊ＝９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２８ （ｄ， Ｊ＝３．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４８－４．３４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２２ （ｄ， Ｊ＝９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７９－３．５９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２２－２．１０ （ｍ， １Ｈ）， ２．０２－１．８８ （ｍ， １Ｈ）， １．４４ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９９ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ３８１．７ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
メチルＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリネート
１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（４１．６ｇ、１０９ｍｍｏｌ、ＨＡＴＵ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２３０ｍＬ）中Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリン（２３ｇ、９９ｍｍｏｌ）、メチル（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリネートハイドロクロライド（１８．０６ｇ、９９ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６０．８ｍＬ、３４８ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で１６時間攪拌した。反応混合物を水（５００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（１０００ｍＬ）で抽出した。複合有機層を５％のクエン酸（３００ｍＬ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３００ｍＬ×２）及び塩水（３００ｍＬ×４）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させた。有機溶液を濾過し、濃縮して表題の化合物を得た（３５ｇ、収率９３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ６．５８ （ｄ， Ｊ＝９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２８ （ｄ， Ｊ＝３．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４８－４．３４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２２ （ｄ， Ｊ＝９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７９－３．５９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２２－２．１０ （ｍ， １Ｈ）， ２．０２－１．８８ （ｍ， １Ｈ）， １．４４ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９９ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ３８１．７ （Ｍ＋Ｎａ）＋．
【0100】
［実施例１－２８］
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）中実施例１－２７（１０ｇ、２８ｍｍｏｌ）及び水酸化リチウム水和物（５．８５ｇ、１３９ｍｍｏｌ）の混合物を２０℃で４時間攪拌した。混合物を１Ｎの塩酸でｐＨ＝４まで中和した。得られた懸濁液を濾過し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、濾過し、ハウスバキューム下、周囲温度で乾燥させて表題の化合物を得た（８．８ｇ、収率８７％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３６７．１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）中実施例１－２７（１０ｇ、２８ｍｍｏｌ）及び水酸化リチウム水和物（５．８５ｇ、１３９ｍｍｏｌ）の混合物を２０℃で４時間攪拌した。混合物を１Ｎの塩酸でｐＨ＝４まで中和した。得られた懸濁液を濾過し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、濾過し、ハウスバキューム下、周囲温度で乾燥させて表題の化合物を得た（８．８ｇ、収率８７％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３６７．１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【0101】
［実施例１－２９］
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（６．６８ｇ、１７．６ｍｍｏｌ、ＨＡＴＵ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６０ｍＬ）中実施例１－２８（５．５ｇ、１６ｍｍｏｌ）、実施例１－２６（４．３２ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９．７６ｍＬ、５５．９ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で５時間攪拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）で希釈し、次に酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。複合有機画分を塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、連続シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝２０／１）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－Ｃ１８カートリッジ、４０～６０μｍ、６０Å）（Ｈ２Ｏ（０．０１％のＮＨ４ＨＣＯ３）（Ａ）／メタノール（Ｂ）、０分～３５分でＢの５～６０％の勾配、次に３５分～５６分でＢの６０～８０％の勾配）により精製され、表題の化合物を得た（６．９４ｇ、収率７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ （ｓ， ４Ｈ）， ５．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２１－５．１６ （ｍ， １Ｈ）， ４．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４９ （ｂｒｓ， １Ｈ）， ４．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９－３．９１ （ｍ， １Ｈ）， ３．８９－３．８１ （ｍ， １Ｈ）， ３．７４－３．６７ （ｍ， １Ｈ）， ３．６５－３．５８ （ｍ， １Ｈ）， ３．５０－３．４７ （ｍ， １Ｈ）， ２．５２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４－２．２４ （ｍ， １Ｈ）， ２．２０－２．１０ （ｍ， １Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．０４ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ５６０．８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（６．６８ｇ、１７．６ｍｍｏｌ、ＨＡＴＵ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６０ｍＬ）中実施例１－２８（５．５ｇ、１６ｍｍｏｌ）、実施例１－２６（４．３２ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９．７６ｍＬ、５５．９ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で５時間攪拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）で希釈し、次に酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。複合有機画分を塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、連続シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝２０／１）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－Ｃ１８カートリッジ、４０～６０μｍ、６０Å）（Ｈ２Ｏ（０．０１％のＮＨ４ＨＣＯ３）（Ａ）／メタノール（Ｂ）、０分～３５分でＢの５～６０％の勾配、次に３５分～５６分でＢの６０～８０％の勾配）により精製され、表題の化合物を得た（６．９４ｇ、収率７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ８．６８ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ （ｓ， ４Ｈ）， ５．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２１－５．１６ （ｍ， １Ｈ）， ４．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４９ （ｂｒｓ， １Ｈ）， ４．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９－３．９１ （ｍ， １Ｈ）， ３．８９－３．８１ （ｍ， １Ｈ）， ３．７４－３．６７ （ｍ， １Ｈ）， ３．６５－３．５８ （ｍ， １Ｈ）， ３．５０－３．４７ （ｍ， １Ｈ）， ２．５２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４－２．２４ （ｍ， １Ｈ）， ２．２０－２．１０ （ｍ， １Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．０４ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ５６０．８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0102】
［実施例１－３０］
３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミドトリフルオロ酢酸
攪拌棒付きの丸底フラスコに、実施例１－２９（１７６ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）、２，２，２－トリフルオロ酢酸（１．０ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（４．０ｍＬ）を投入した。溶液を周囲温度で９０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、３部のトルエンで追跡し、その後一晩真空乾燥した。表題の化合物は、定量的収量を想定して精製せずに繰り越した。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．４５ - ７．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３０ - ７．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２４ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １３．１， ７．５， ５．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６９ - ４．５２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０２ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９１ （ｑ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， １０．９， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６９ - ３．５４ （ｍ， １Ｈ）， ３．５４ - ３．４６ （ｍ， １Ｈ）， ２．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１７ - ２．０３ （ｍ， １Ｈ）， １．０１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４６１．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミドトリフルオロ酢酸
攪拌棒付きの丸底フラスコに、実施例１－２９（１７６ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）、２，２，２－トリフルオロ酢酸（１．０ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（４．０ｍＬ）を投入した。溶液を周囲温度で９０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、３部のトルエンで追跡し、その後一晩真空乾燥した。表題の化合物は、定量的収量を想定して精製せずに繰り越した。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．４５ - ７．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３０ - ７．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２４ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １３．１， ７．５， ５．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６９ - ４．５２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０２ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９１ （ｑ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， １０．９， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６９ - ３．５４ （ｍ， １Ｈ）， ３．５４ - ３．４６ （ｍ， １Ｈ）， ２．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１７ - ２．０３ （ｍ， １Ｈ）， １．０１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４６１．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0103】
［実施例１－３１］
Ｎ－［１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，１３－ジオキソ－２，７，１１－トリオキサ－４－アザトリデカン－１３－イル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
攪拌棒付きのフラスコに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（９．３９ｍＬ）中実施例１－２２（０．７５９ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）及び２－（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（０．９２８ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を投入して無色の溶液を得た。実施例１－３０（１．００２ｇ、１．８７８ｍｍｏｌ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（９．３９ｍＬ）中の溶液として添加された。Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（２．６０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で１．５時間攪拌した。反応混合物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）と塩水（１００ｍＬ）の間で分配した。水層を追加の酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。複合有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、濃縮した。残渣は４０ｇのＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ（登録商標）シリカカートリッジ上でクロマトグラフィーにかけ、１０～１００％の３：１の酢酸エチル：エタノール／ヘプタンで溶出させ表題の化合物を得た（１．４２２ｇ、９０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９４ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４４ - ７．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．５， ３．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， ５．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８２ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．３， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．４， ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５５ - ４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ - ４．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．９２ - ３．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｑ， Ｊ ＝ ５．１， ４．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ - ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４６ - ３．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１１ （ｑ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１１ - １．９８ （ｍ， １Ｈ）， １．７６ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．７， ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．９１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ８４２．６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ－［１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，１３－ジオキソ－２，７，１１－トリオキサ－４－アザトリデカン－１３－イル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
攪拌棒付きのフラスコに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（９．３９ｍＬ）中実施例１－２２（０．７５９ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）及び２－（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（０．９２８ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を投入して無色の溶液を得た。実施例１－３０（１．００２ｇ、１．８７８ｍｍｏｌ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（９．３９ｍＬ）中の溶液として添加された。Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（２．６０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で１．５時間攪拌した。反応混合物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）と塩水（１００ｍＬ）の間で分配した。水層を追加の酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。複合有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、濃縮した。残渣は４０ｇのＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ（登録商標）シリカカートリッジ上でクロマトグラフィーにかけ、１０～１００％の３：１の酢酸エチル：エタノール／ヘプタンで溶出させ表題の化合物を得た（１．４２２ｇ、９０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９４ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６， １．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４４ - ７．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．５， ３．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， ５．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８２ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．３， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．４， ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５５ - ４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ - ４．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．９２ - ３．８２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｑ， Ｊ ＝ ５．１， ４．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ - ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４６ - ３．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１１ （ｑ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ２Ｈ）， ２．１１ - １．９８ （ｍ， １Ｈ）， １．７６ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．７， ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．９１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ８４２．６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0104】
［実施例１－３２］
Ｎ－｛［３－（２－アミノエトキシ）プロポキシ］アセチル｝－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
攪拌棒付きの１００ｍＬフラスコに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１７ｍＬ）中実施例１－３１（１．４２ｇ、１．６８６ｍｍｏｌ）の溶液を投入し、これをジエチルアミン（０．２６ｍＬ、２．５１０ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。揮発物を減圧下で取り除き、残渣は、２０ｇのＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ（登録商標）シリカカートリッジ上にロードし、０～２０％アンモニア飽和メタノール／ジクロロメタンの勾配で溶出させ、表題の化合物を得た（０．６８３ｇ、６５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４５ - ７．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８７ - ４．７７ （ｍ， １Ｈ）， ４．５４ - ４．４２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０６ （ｍ， １Ｈ）， ３．９５ - ３．８２ （ｍ， １Ｈ）， ３．６４ - ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４０－３．１６ （ｍ， １３Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４２ （ｓ， １Ｈ）， ２．０３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １０．２， ７．８， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．８１ - １．７０ （ｍ， １Ｈ）， ０．９１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６２０．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ－｛［３－（２－アミノエトキシ）プロポキシ］アセチル｝－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
攪拌棒付きの１００ｍＬフラスコに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１７ｍＬ）中実施例１－３１（１．４２ｇ、１．６８６ｍｍｏｌ）の溶液を投入し、これをジエチルアミン（０．２６ｍＬ、２．５１０ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。揮発物を減圧下で取り除き、残渣は、２０ｇのＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ（登録商標）シリカカートリッジ上にロードし、０～２０％アンモニア飽和メタノール／ジクロロメタンの勾配で溶出させ、表題の化合物を得た（０．６８３ｇ、６５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４５ - ７．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８７ - ４．７７ （ｍ， １Ｈ）， ４．５４ - ４．４２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０６ （ｍ， １Ｈ）， ３．９５ - ３．８２ （ｍ， １Ｈ）， ３．６４ - ３．４７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４０－３．１６ （ｍ， １３Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４２ （ｓ， １Ｈ）， ２．０３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １０．２， ７．８， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．８１ - １．７０ （ｍ， １Ｈ）， ０．９１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６２０．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0105】
［実施例１－３３］
３－メチル－Ｎ－［（３－｛２－［（２－メチル－１０－ニトロ－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．６ｍＬ）中実施例１－１３（１５３ｍｇ、０．３６７ｍｍｏｌ）、実施例１－３２（２６３ｍｇ、０．４２４ｍｍｏｌ）、（（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）オキシ）トリ（ピロリジン－１－イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（２３１ｍｇ、０．４４３ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（０．２５０μＬ、１．４３μｍｏｌ）の混合物を周囲温度で９０分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して、濃縮し、表題の化合物を得た（０．３６９ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９４ （ｓ， １Ｈ）， ８．７０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．４３ （ｍ， １Ｈ）， ８．３６ （ｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９３ （ｍ， １Ｈ）， ７．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ - ７．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ７．０２ - ６．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４９ - ６．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．８２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．４， ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５４ - ４．３５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９０ - ３．８１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．６１ - ３．４５ （ｍ， １０Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ - １．９８ （ｍ， １Ｈ）， １．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ １０１８．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
３－メチル－Ｎ－［（３－｛２－［（２－メチル－１０－ニトロ－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．６ｍＬ）中実施例１－１３（１５３ｍｇ、０．３６７ｍｍｏｌ）、実施例１－３２（２６３ｍｇ、０．４２４ｍｍｏｌ）、（（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）オキシ）トリ（ピロリジン－１－イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（２３１ｍｇ、０．４４３ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（０．２５０μＬ、１．４３μｍｏｌ）の混合物を周囲温度で９０分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して、濃縮し、表題の化合物を得た（０．３６９ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ８．９４ （ｓ， １Ｈ）， ８．７０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．４３ （ｍ， １Ｈ）， ８．３６ （ｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９３ （ｍ， １Ｈ）， ７．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ - ７．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ７．０２ - ６．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４９ - ６．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．８２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．４， ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５４ - ４．３５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９０ - ３．８１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．６１ - ３．４５ （ｍ， １０Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ - １．９８ （ｍ， １Ｈ）， １．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ １０１８．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0106】
［実施例１－３４］
Ｎ－［（３－｛２－［（１０－アミノ－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
テトラヒドロフラン（８．００ｍＬ）、エタノール（８．００ｍＬ）及び水（１．６ｍＬ）中実施例１－３３（３６９ｍｇ、０．３６２ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（１０７ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）及び鉄粉、１０ミクロン未満（２９２ｍｇ、５．２３ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で１５０分間加熱した。周囲温度まで冷却後、反応混合物を珪藻土のパッドを通して濾過し、フィルターパッドを５％のメタノール／ジクロロメタンで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣は４ｇのシリカカートリッジ上でクロマトグラフィーにかけ、０～１０％のアンモニア飽和メタノール／ジクロロメタンで溶出させ、表題の化合物を得た（２１８ｍｇ、６１％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．１３ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３２ （ｍ， １Ｈ）， ６．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．５， ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．８４ （ｄ， Ｊ ＝ １６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ３．６， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８３ （ｑ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６２ － ３．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４４ （ｍ， １Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７６ （ｍ， １Ｈ）， ０．９２ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ９８８．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
Ｎ－［（３－｛２－［（１０－アミノ－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
テトラヒドロフラン（８．００ｍＬ）、エタノール（８．００ｍＬ）及び水（１．６ｍＬ）中実施例１－３３（３６９ｍｇ、０．３６２ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（１０７ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）及び鉄粉、１０ミクロン未満（２９２ｍｇ、５．２３ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で１５０分間加熱した。周囲温度まで冷却後、反応混合物を珪藻土のパッドを通して濾過し、フィルターパッドを５％のメタノール／ジクロロメタンで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣は４ｇのシリカカートリッジ上でクロマトグラフィーにかけ、０～１０％のアンモニア飽和メタノール／ジクロロメタンで溶出させ、表題の化合物を得た（２１８ｍｇ、６１％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．１３ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３２ （ｍ， １Ｈ）， ６．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．５， ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．６０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．８４ （ｄ， Ｊ ＝ １６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ３．６， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８３ （ｑ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６２ － ３．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４４ （ｍ， １Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７６ （ｍ， １Ｈ）， ０．９２ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ９８８．４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0107】
［実施例２］ＬＤ１
【0108】
【化20】
【0109】
【化21】
【0110】
［実施例２－１］
２，５－ジオキソピロリジン－１－イルＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アラニネート
ジクロロメタン（５００ｍＬ）中１－ヒドロキシピロリジン－２，５－ジオン（３３．５ｇ、２９１ｍｍｏｌ）及びＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アラニン（５０．０ｇ、２６４ｍｍｏｌ）の混合物を０℃まで冷却した。Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（６０．０ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。反応混合物を、２５℃で約１６時間攪拌し、濾過し、追加のジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し表題の化合物を得た（５４ｇ、収率７１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｐ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７８ （ｓ， ４Ｈ）， １．３７ （ｓ， １２Ｈ）．
２，５－ジオキソピロリジン－１－イルＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アラニネート
ジクロロメタン（５００ｍＬ）中１－ヒドロキシピロリジン－２，５－ジオン（３３．５ｇ、２９１ｍｍｏｌ）及びＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アラニン（５０．０ｇ、２６４ｍｍｏｌ）の混合物を０℃まで冷却した。Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（６０．０ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。反応混合物を、２５℃で約１６時間攪拌し、濾過し、追加のジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し表題の化合物を得た（５４ｇ、収率７１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｐ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７８ （ｓ， ４Ｈ）， １．３７ （ｓ， １２Ｈ）．
【0111】
［実施例２－２］
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニン
水（１５０ｍＬ）中Ｌ－アラニン（６．２２ｇ、６９．９ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（１１．７４ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を、１，２－ジメトキシエタン（１５０ｍＬ）中実施例２－１（２０．０ｇ、６９．９ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を２５℃で約１６時間攪拌した。揮発性溶剤を減圧下で取り除いた。残りの溶液のｐＨは、水性クエン酸で１に調整した。沈殿物を濾過により収集し、追加の水で洗浄して乾燥させ表題の化合物を得た（１６ｇ、収率８８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２０ （ｐ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９ － ３．８９ （ｍ， １Ｈ）， １．３７ （ｓ， ９Ｈ）， １．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニン
水（１５０ｍＬ）中Ｌ－アラニン（６．２２ｇ、６９．９ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（１１．７４ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を、１，２－ジメトキシエタン（１５０ｍＬ）中実施例２－１（２０．０ｇ、６９．９ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を２５℃で約１６時間攪拌した。揮発性溶剤を減圧下で取り除いた。残りの溶液のｐＨは、水性クエン酸で１に調整した。沈殿物を濾過により収集し、追加の水で洗浄して乾燥させ表題の化合物を得た（１６ｇ、収率８８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ ７．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２０ （ｐ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９ － ３．８９ （ｍ， １Ｈ）， １．３７ （ｓ， ９Ｈ）， １．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
【0112】
【化22】
【0113】
［実施例２－３］
（３Ｒ，７ａＳ）－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
トルエン（３００ｍＬ）中（Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン（２５ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（２５．５ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及びｐ－トルエンスルホン酸一水和物（０．５０ｇ、０．００２６ｍｍｏｌ）の混合物を、乾燥管下のディーンスタークトラップを使用して還流下１６時間加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、溶剤を不溶性物質からデカントした。溶剤混合物を飽和水性炭酸水素ナトリウム混合物及び飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、３５／６５ ヘプタン／酢酸エチル）により精製され表題の化合物を得た（３５．３ｇ、収率８０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．４７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３ - ７．３４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３８ - ７．２６ （ｍ， １Ｈ）， ６．３６ （ｓ， １Ｈ）， ４．２５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ７．７， ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．８３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １７．４， １０．１， ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １７．４， １０．０， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４０ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．７， １０．３， ７．５， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９６ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １３．５， ９．５， ５．４ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２０４．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
（３Ｒ，７ａＳ）－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
トルエン（３００ｍＬ）中（Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン（２５ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（２５．５ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及びｐ－トルエンスルホン酸一水和物（０．５０ｇ、０．００２６ｍｍｏｌ）の混合物を、乾燥管下のディーンスタークトラップを使用して還流下１６時間加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、溶剤を不溶性物質からデカントした。溶剤混合物を飽和水性炭酸水素ナトリウム混合物及び飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、３５／６５ ヘプタン／酢酸エチル）により精製され表題の化合物を得た（３５．３ｇ、収率８０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．４７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， １．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３ - ７．３４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３８ - ７．２６ （ｍ， １Ｈ）， ６．３６ （ｓ， １Ｈ）， ４．２５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．０， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．８， ７．７， ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．８３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １７．４， １０．１， ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １７．４， １０．０， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４０ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．７， １０．３， ７．５， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９６ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １３．５， ９．５， ５．４ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２０４．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0114】
［実施例２－４］
（３Ｒ，６Ｒ，７ａＳ）－６－ブロモ－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
窒素下－７７℃まで冷却したテトラヒドロフラン（６７０ｍＬ）中実施例２－３（４４．６ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の混合物に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ヘキサン中１．０Ｍ、２５０ｍＬ）を、内部温度を－７３℃未満に保ちつつ、液滴で４０分かけて添加した。反応混合物を－７７℃で２時間攪拌し、その後臭素（１２．５ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を、内部温度を－６４℃未満に保ちつつ、液滴で２０分かけて添加した。反応混合物を、－７７℃で７５分間攪拌し、その後、－７７℃反応混合物に、冷１０％の水性チオ硫酸ナトリウム（１５０ｍＬ）の添加によりクエンチした。反応混合物を周囲温度まで温め、半飽和水性塩化アンモニウム混合物と酢酸エチルの間で分配した。層を分離し、有機層を水と飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０／２０、７５／２５及び７０／３０ ヘプタン／酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され表題の化合物を得た（１９．３ｇ、３１．２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．３２ （ｍ， ５Ｈ）， ６．３３ （ｓ， １Ｈ）， ４．５３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．９， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４８ - ４．３７ （ｍ， １Ｈ）， ４．３０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．４， ０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １４．６， ６．２， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５０ （ｄｔ， Ｊ ＝ １４．７， ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２９９．０ ａｎｄ ３０１．０ （Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
（３Ｒ，６Ｒ，７ａＳ）－６－ブロモ－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
窒素下－７７℃まで冷却したテトラヒドロフラン（６７０ｍＬ）中実施例２－３（４４．６ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の混合物に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ヘキサン中１．０Ｍ、２５０ｍＬ）を、内部温度を－７３℃未満に保ちつつ、液滴で４０分かけて添加した。反応混合物を－７７℃で２時間攪拌し、その後臭素（１２．５ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を、内部温度を－６４℃未満に保ちつつ、液滴で２０分かけて添加した。反応混合物を、－７７℃で７５分間攪拌し、その後、－７７℃反応混合物に、冷１０％の水性チオ硫酸ナトリウム（１５０ｍＬ）の添加によりクエンチした。反応混合物を周囲温度まで温め、半飽和水性塩化アンモニウム混合物と酢酸エチルの間で分配した。層を分離し、有機層を水と飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、８０／２０、７５／２５及び７０／３０ ヘプタン／酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され表題の化合物を得た（１９．３ｇ、３１．２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．３２ （ｍ， ５Ｈ）， ６．３３ （ｓ， １Ｈ）， ４．５３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．９， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４８ - ４．３７ （ｍ， １Ｈ）， ４．３０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．４， ０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １４．６， ６．２， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５０ （ｄｔ， Ｊ ＝ １４．７， ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２９９．０ ａｎｄ ３０１．０ （Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
【0115】
［実施例２－５］
（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－アジド－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中実施例２－４（１９．３ｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）の混合物に、アジ化ナトリウム（１３．５ｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２．５時間で６０℃まで加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、水（５００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）の間で分配した。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製され、７８／２２ ヘプタン／酢酸エチルで溶出させて、表題の化合物を得た（１３．５ｇ、８１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５ - ７．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ６．３８ （ｓ， １Ｈ）， ４．５６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．５， ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．９， ７．５， ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７８ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．０， ８．５， ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．０， １０．４， ７．４ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２６２．０ （Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－アジド－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中実施例２－４（１９．３ｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）の混合物に、アジ化ナトリウム（１３．５ｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２．５時間で６０℃まで加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、水（５００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）の間で分配した。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製され、７８／２２ ヘプタン／酢酸エチルで溶出させて、表題の化合物を得た（１３．５ｇ、８１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５ - ７．３２ （ｍ， ３Ｈ）， ６．３８ （ｓ， １Ｈ）， ４．５６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．５， ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．９， ７．５， ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７８ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．０， ８．５， ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．０， １０．４， ７．４ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２６２．０ （Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ）＋．
【0116】
［実施例２－６］
（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－アミノ－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）中実施例２－５（１３．５ｇ、０．５５３ｍｍｏｌ）の混合物に、ポリマー担持トリフェニルホスフィン（５５ｇ、３ｍｍｏｌ ＰＰｈ３／ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ ＃３６６４５５）を添加した。反応混合物を周囲温度で一晩機械的に攪拌した。反応混合物は珪藻土を通して濾過し、酢酸エチル及びトルエンで順次溶出させた。濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過した。濾液を濃縮して表題の化合物を得て、この化合物をさらに精製することなくその後のステップに使用した（１１．３ｇ、収率９４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５２ - ７．２１ （ｍ， ５Ｈ）， ６．３４ （ｓ， １Ｈ）， ４．２８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１０ - ３．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．８８ - ２．７７ （ｍ， １Ｈ）， １．６９ - １．５６ （ｍ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２１９．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－アミノ－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）中実施例２－５（１３．５ｇ、０．５５３ｍｍｏｌ）の混合物に、ポリマー担持トリフェニルホスフィン（５５ｇ、３ｍｍｏｌ ＰＰｈ３／ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ ＃３６６４５５）を添加した。反応混合物を周囲温度で一晩機械的に攪拌した。反応混合物は珪藻土を通して濾過し、酢酸エチル及びトルエンで順次溶出させた。濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過した。濾液を濃縮して表題の化合物を得て、この化合物をさらに精製することなくその後のステップに使用した（１１．３ｇ、収率９４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５２ - ７．２１ （ｍ， ５Ｈ）， ６．３４ （ｓ， １Ｈ）， ４．２８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１０ - ３．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．８８ - ２．７７ （ｍ， １Ｈ）， １．６９ - １．５６ （ｍ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ２１９．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0117】
［実施例２－７］
（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－（ジベンジルアミノ）－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中実施例２－６（１１．３ｇ、０．０５１８ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸カリウム（７．０ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（４．２ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）及びベンジルブロミド（１４．５ｍＬ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌し、その後水と酢酸エチルの間で分配した。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１０％～１５％酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され、ヘプタンで滴定して風乾し、表題の化合物を得た（１４．３ｇ、収率６９．３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．３９ （ｍ， ５Ｈ）， ７．４３ - ７．２２ （ｍ， ９Ｈ）， ４．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１１ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．３， ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ （ｓ， １Ｈ）， ４．０４ （ｓ， １Ｈ）， ３．９２ （ｑｄ， Ｊ ＝ ７．４， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７４ （ｄ， Ｊ ＝ １３．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５３ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ８．６， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９２ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．８， １１．３， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ３９９．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
（３Ｒ，６Ｓ，７ａＳ）－６－（ジベンジルアミノ）－３－フェニルテトラヒドロ－３Ｈ，５Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３］オキサゾール－５－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中実施例２－６（１１．３ｇ、０．０５１８ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸カリウム（７．０ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（４．２ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）及びベンジルブロミド（１４．５ｍＬ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌し、その後水と酢酸エチルの間で分配した。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１０％～１５％酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され、ヘプタンで滴定して風乾し、表題の化合物を得た（１４．３ｇ、収率６９．３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．３９ （ｍ， ５Ｈ）， ７．４３ - ７．２２ （ｍ， ９Ｈ）， ４．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１１ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．３， ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ （ｓ， １Ｈ）， ４．０４ （ｓ， １Ｈ）， ３．９２ （ｑｄ， Ｊ ＝ ７．４， ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７４ （ｄ， Ｊ ＝ １３．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５３ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ８．６， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９２ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．８， １１．３， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ３９９．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0118】
［実施例２－８］
（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン
テトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）中実施例２－７（１３ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の混合物に、パラ－トルエンスルホン酸一水和物（１２．４ｇ、０．０６５２ｍｍｏｌ）及び水（５０ｍＬ）を添加し、反応混合物を６日間で６５℃まで加熱した。反応混合物を、周囲温度まで冷却し、飽和水性炭酸水素ナトリウム及び酢酸エチルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘプタン（１５０ｍＬ）ですりつぶし、風乾して表題の化合物を得た（９．３ｇ、収率９２）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．２７ - ７．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１０ （ｓ， １Ｈ）， ３．９０ （ｄ， Ｊ ＝ １３．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７７ - ３．５１ （ｍ， ６Ｈ）， ３．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．０， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１４ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．６， ８．９， ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， １０．４， ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ３１１．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－５－（ヒドロキシメチル）ピロリジン－２－オン
テトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）中実施例２－７（１３ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の混合物に、パラ－トルエンスルホン酸一水和物（１２．４ｇ、０．０６５２ｍｍｏｌ）及び水（５０ｍＬ）を添加し、反応混合物を６日間で６５℃まで加熱した。反応混合物を、周囲温度まで冷却し、飽和水性炭酸水素ナトリウム及び酢酸エチルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過して、減圧下で濃縮した。残渣を、ヘプタン（１５０ｍＬ）ですりつぶし、風乾して表題の化合物を得た（９．３ｇ、収率９２）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．２７ - ７．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１０ （ｓ， １Ｈ）， ３．９０ （ｄ， Ｊ ＝ １３．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７７ - ３．５１ （ｍ， ６Ｈ）， ３．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．０， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１４ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．６， ８．９， ６．９ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， １０．４， ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ３１１．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0119】
［実施例２－９］
（３Ｓ，５Ｓ）－５－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－（ジベンジルアミノ）ピロリジン－２－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中実施例２－８（９．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）及び１Ｈ－イミダゾール（２．２ｇ、３２ｍｍｏｌ）の混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルクロロジメチルシラン（１１．２ｍＬ、３２．２ｍｍｏｌ、トルエン中５０重量％）を添加し、反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物を水とエチルエーテルの間で分配した。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層をジエチルエーテルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中３５％の酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（１２．７７ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．４３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３７ - ７．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２９ - ７．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ６．００ （ｓ， １Ｈ）， ４．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７５ - ３．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５６ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １０．７， ７．０， ５．２， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４１ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．１， ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１９ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， ９．２， ６．８， ０．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， １０．５， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．３０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ４．０， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９８ - ０．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ０．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ４２５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
（３Ｓ，５Ｓ）－５－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－（ジベンジルアミノ）ピロリジン－２－オン
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中実施例２－８（９．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）及び１Ｈ－イミダゾール（２．２ｇ、３２ｍｍｏｌ）の混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルクロロジメチルシラン（１１．２ｍＬ、３２．２ｍｍｏｌ、トルエン中５０重量％）を添加し、反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物を水とエチルエーテルの間で分配した。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層をジエチルエーテルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中３５％の酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（１２．７７ｇ、収率９９％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．４３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３７ - ７．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２９ - ７．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ６．００ （ｓ， １Ｈ）， ４．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７５ - ３．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５６ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １０．７， ７．０， ５．２， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４１ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．１， ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１９ （ｄｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， ９．２， ６．８， ０．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， １０．５， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．３０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ４．０， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９８ - ０．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ０．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ４２５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0120】
［実施例２－１０］
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－５－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－（ジベンジルアミノ）－２－オキソピロリジン－１－イル］アセテート
窒素下０℃で攪拌しながらテトラヒドロフラン（４５ｍＬ）中実施例２－９（４．５０ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）の混合物に、９５％の水素化ナトリウム（０．３２ｇ、１２．６７ｍｍｏｌ）を２つに分けて添加した。冷却した混合物を４０分間攪拌し、次に、ｔｅｒｔ－ブチル２－ブロモ酢酸（４．２２ｇ、２１．７ｍｍｏｌ、３．２ｍＬ）を添加した。反応混合物を周囲温度まで温め、一晩攪拌した。反応混合物を、水及び酢酸エチルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～１２％の酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（５．３ｇ、収率９４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．４６ - ７．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．３６ （ｄ， Ｊ ＝ １７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８５ - ３．５０ （ｍ， ７Ｈ）， ２．１１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．８， ９．３， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）， ０．８３ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ５３９．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－５－（｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－３－（ジベンジルアミノ）－２－オキソピロリジン－１－イル］アセテート
窒素下０℃で攪拌しながらテトラヒドロフラン（４５ｍＬ）中実施例２－９（４．５０ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）の混合物に、９５％の水素化ナトリウム（０．３２ｇ、１２．６７ｍｍｏｌ）を２つに分けて添加した。冷却した混合物を４０分間攪拌し、次に、ｔｅｒｔ－ブチル２－ブロモ酢酸（４．２２ｇ、２１．７ｍｍｏｌ、３．２ｍＬ）を添加した。反応混合物を周囲温度まで温め、一晩攪拌した。反応混合物を、水及び酢酸エチルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中５～１２％の酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（５．３ｇ、収率９４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．４６ - ７．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．３６ （ｄ， Ｊ ＝ １７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８５ - ３．５０ （ｍ， ７Ｈ）， ２．１１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．８， ９．３， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４２ （ｓ， ９Ｈ）， ０．８３ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ５３９．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0121】
［実施例２－１１］
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－５－（ヒドロキシメチル）－２－オキソピロリジン－１－イル］アセテート
テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中実施例２－１０（５．３ｇ、９．８ｍｍｏｌ）の混合物に、フッ化テトラブチルアンモニウム（１１ｍＬ、１１ｍｍｏｌ、９５／５ テトラヒドロフラン／水中１．０Ｍ）を添加した。反応混合物を周囲温度で１時間攪拌し、次に、飽和水性塩化アンモニウム混合物、水及び酢酸エチルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中３５％の酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（４．１７３ｇ、収率１００％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．４１ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３６ - ７．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２８ - ７．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９６ （ｄ， Ｊ ＝ １３．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７８ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６１ （ｄ， Ｊ ＝ １０．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ - ３．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ ８．４， ７．５， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．１， ９．９， ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１２ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．１， ９．６， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， １．５１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ４２５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－５－（ヒドロキシメチル）－２－オキソピロリジン－１－イル］アセテート
テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中実施例２－１０（５．３ｇ、９．８ｍｍｏｌ）の混合物に、フッ化テトラブチルアンモニウム（１１ｍＬ、１１ｍｍｏｌ、９５／５ テトラヒドロフラン／水中１．０Ｍ）を添加した。反応混合物を周囲温度で１時間攪拌し、次に、飽和水性塩化アンモニウム混合物、水及び酢酸エチルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層を酢酸エチルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中３５％の酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（４．１７３ｇ、収率１００％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．５０ - ７．４１ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３６ - ７．２８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２８ - ７．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９６ （ｄ， Ｊ ＝ １３．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７８ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６１ （ｄ， Ｊ ＝ １０．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ - ３．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ ８．４， ７．５， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．１， ９．９， ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１２ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．１， ９．６， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， １．５１ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＤＣＩ） ｍ／ｚ ４２５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0122】
［実施例２－１２］
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中実施例２－１１（４．７ｇ、１１ｍｍｏｌ）の混合物に、ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）－２，２－ジメチルブチルエテンスルホン酸（１４．５ｇ、３２．５ｍｍｏｌ、Ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年、５（１）、１３２～１３８頁、Ｓ．Ｓｅｅｂｕｒｇｅｒら、に記載される通りに調製された。）の混合物を添加した。炭酸カリウム（２．６０ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）及び水（０．０２８ｇ、１．６ｍｍｏｌ、０．０２８ｍＬ）を添加し、反応混合物を窒素下６０℃で１日加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、次に、飽和水性塩化ナトリウム混合物、水及びジエチルエーテルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層をジエチルエーテルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１５～２５％の酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（５．３ｇ、収率５５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．７１ - ７．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３ （ｔｄｔ， Ｊ ＝ ６．０， ４．３， １．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３５ - ７．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７ - ７．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．２０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．３ Ｈｚ， ０Ｈ）， ４．００ - ３．８８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８８ - ３．７７ （ｍ， １Ｈ）， ３．８０ - ３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ - ３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１８ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， ９．３， ７．２ Ｈｚ， ０Ｈ）， １．６９ - １．５５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４４ （ｓ， ４Ｈ）， １．０５ （ｓ， ４Ｈ）， ０．９６ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ８７１．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（ジベンジルアミノ）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中実施例２－１１（４．７ｇ、１１ｍｍｏｌ）の混合物に、ジメチルスルホキシド（１４ｍＬ）中４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）－２，２－ジメチルブチルエテンスルホン酸（１４．５ｇ、３２．５ｍｍｏｌ、Ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年、５（１）、１３２～１３８頁、Ｓ．Ｓｅｅｂｕｒｇｅｒら、に記載される通りに調製された。）の混合物を添加した。炭酸カリウム（２．６０ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）及び水（０．０２８ｇ、１．６ｍｍｏｌ、０．０２８ｍＬ）を添加し、反応混合物を窒素下６０℃で１日加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、次に、飽和水性塩化ナトリウム混合物、水及びジエチルエーテルの添加によりクエンチした。層を分離し、有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。複合水層をジエチルエーテルで逆抽出した。複合有機層を無水硫酸ナトリウム上で脱水させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１５～２５％の酢酸エチルの勾配で溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（５．３ｇ、収率５５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．７１ - ７．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３ （ｔｄｔ， Ｊ ＝ ６．０， ４．３， １．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３５ - ７．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７ - ７．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．２０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．３ Ｈｚ， ０Ｈ）， ４．００ - ３．８８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８８ - ３．７７ （ｍ， １Ｈ）， ３．８０ - ３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ - ３．４８ （ｍ， １Ｈ）， ３．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１８ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， ９．３， ７．２ Ｈｚ， ０Ｈ）， １．６９ - １．５５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４４ （ｓ， ４Ｈ）， １．０５ （ｓ， ４Ｈ）， ０．９６ （ｓ， ３Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ８７１．２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0123】
［実施例２－１３］
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－アミノ－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
実施例２－１２（０．８７３ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５ｍＬ）及びメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、炭素上水酸化パラジウム（２０重量％、０．１８ｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気（３０ｐｓｉ）下周囲温度で３０時間、その後５０℃で１時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、濾過し、濃縮して表題の化合物を得た（０．６７３ｇ、収率９７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．７２ - ７．６４ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ - ７．３５ （ｍ， ６Ｈ）， ４．３２ （ｄ， Ｊ ＝ １７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９６ - ３．７９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６２ - ３．４６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ８．７， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４９ - １．４１ （ｍ， ２Ｈ）， １．０７ （ｓ， １０Ｈ）， ０．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ， ７Ｈ）， ０．９０ （ｓ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６９１．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－アミノ－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
実施例２－１２（０．８７３ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５ｍＬ）及びメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、炭素上水酸化パラジウム（２０重量％、０．１８ｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気（３０ｐｓｉ）下周囲温度で３０時間、その後５０℃で１時間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、濾過し、濃縮して表題の化合物を得た（０．６７３ｇ、収率９７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．７２ - ７．６４ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ - ７．３５ （ｍ， ６Ｈ）， ４．３２ （ｄ， Ｊ ＝ １７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９６ - ３．７９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６２ - ３．４６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ８．７， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４９ - １．４１ （ｍ， ２Ｈ）， １．０７ （ｓ， １０Ｈ）， ０．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ， ７Ｈ）， ０．９０ （ｓ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６９１．０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0124】
［実施例２－１４］
４－｛［（３Ｓ，５Ｓ）－１－（２－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－オキソエチル）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－３－イル］アミノ｝－４－オキソブタ－２－エン酸
無水マレイン酸（０．１００ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．９０ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（０．９０ｍＬ）中実施例２－１３（０．６５ｇ、０．９４１ｍｍｏｌ）の混合物を滴下した。次に、混合物を４０℃で２時間加熱した。反応混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０．２％の酢酸を含有するジクロロメタン中１．０～２．５％のメタノールの勾配で溶出させた。）により直接精製した。表題の化合物を保有する画分を濃縮した後、トルエン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を再び濃縮して表題の化合物を得た（０．５６３ｇ、収率７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．８２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７２ - ７．６５ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ - ７．３７ （ｍ， ６Ｈ）， ７．３２ - ７．２４ （ｍ， １Ｈ）， ７．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４３ - ６．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．８， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．００ （ｓ， １Ｈ）， ３．８９ （ｔｔ， Ｊ ＝ １１．１， ５．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．２， ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．３， ４．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３９ - ３．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．６， ９．８， ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， １Ｈ）， １．７９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．６， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．０７ （ｓ， ９Ｈ）， １．００ （ｓ， ５Ｈ）， ０．９９ （ｓ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ７８７．３ （Ｍ－Ｈ）-．
４－｛［（３Ｓ，５Ｓ）－１－（２－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－オキソエチル）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－３－イル］アミノ｝－４－オキソブタ－２－エン酸
無水マレイン酸（０．１００ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．９０ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（０．９０ｍＬ）中実施例２－１３（０．６５ｇ、０．９４１ｍｍｏｌ）の混合物を滴下した。次に、混合物を４０℃で２時間加熱した。反応混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０．２％の酢酸を含有するジクロロメタン中１．０～２．５％のメタノールの勾配で溶出させた。）により直接精製した。表題の化合物を保有する画分を濃縮した後、トルエン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を再び濃縮して表題の化合物を得た（０．５６３ｇ、収率７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．８２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７２ - ７．６５ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ - ７．３７ （ｍ， ６Ｈ）， ７．３２ - ７．２４ （ｍ， １Ｈ）， ７．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４３ - ６．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．８， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．００ （ｓ， １Ｈ）， ３．８９ （ｔｔ， Ｊ ＝ １１．１， ５．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．２， ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．３， ４．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３９ - ３．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １３．６， ９．８， ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， １Ｈ）， １．７９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．６， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．０７ （ｓ， ９Ｈ）， １．００ （ｓ， ５Ｈ）， ０．９９ （ｓ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ７８７．３ （Ｍ－Ｈ）-．
【0125】
［実施例２－１５］
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
実施例２－１４（０．５６ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をトルエン（７ｍＬ）中にスラリー状にし、トリエチルアミン（０．１６ｇ、１．６ｍｍｏｌ、０．２２ｍＬ）及び硫酸ナトリウム（０．５２５ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下還流下で６時間加熱し、その後反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、酢酸エチルですすいだ。溶離液を減圧下で濃縮し、残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、４５／５５ ヘプタン／酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（０．３６３ｇ、収率６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．７２ - ７．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ - ７．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５ - ７．３６ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．６， ９．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｄ， Ｊ ＝ １７．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９ - ３．９９ （ｍ， １Ｈ）， ４．００ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９１ - ３．８４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．１， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．０， ３．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， ９．７， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， １０．６， ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６６ - １．５９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．２９ （ｓ， ２Ｈ）， １．１１ - １．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．０７ （ｓ， ９Ｈ）， １．００ （ｓ， ６Ｈ）， ０．９４ - ０．８８ （ｍ， １Ｈ）， ０．９１ - ０．８３ （ｍ， １Ｈ）， ０．８６ （ｓ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７７１．６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
ｔｅｒｔ－ブチル［（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－（８，８，１３，１３－テトラメチル－５，５－ジオキソ－１２，１２－ジフェニル－２，６，１１－トリオキサ－５λ６－チア－１２－シラテトラデカン－１－イル）ピロリジン－１－イル］アセテート
実施例２－１４（０．５６ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をトルエン（７ｍＬ）中にスラリー状にし、トリエチルアミン（０．１６ｇ、１．６ｍｍｏｌ、０．２２ｍＬ）及び硫酸ナトリウム（０．５２５ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下還流下で６時間加熱し、その後反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、酢酸エチルですすいだ。溶離液を減圧下で濃縮し、残渣は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、４５／５５ ヘプタン／酢酸エチルで溶出させた。）により精製され、表題の化合物を得た（０．３６３ｇ、収率６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．７２ - ７．６６ （ｍ， ４Ｈ）， ７．５０ - ７．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５ - ７．３６ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．６， ９．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４３ （ｄ， Ｊ ＝ １７．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９ - ３．９９ （ｍ， １Ｈ）， ４．００ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９１ - ３．８４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．１， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．０， ３．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， ９．７， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， １０．６， ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６６ - １．５９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．２９ （ｓ， ２Ｈ）， １．１１ - １．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．０７ （ｓ， ９Ｈ）， １．００ （ｓ， ６Ｈ）， ０．９４ - ０．８８ （ｍ， １Ｈ）， ０．９１ - ０．８３ （ｍ， １Ｈ）， ０．８６ （ｓ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７７１．６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【0126】
［実施例２－１６］
｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝酢酸
実施例２－１５（１．２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（２２．２ｇ、１９５ｍｍｏｌ、１５ｍＬ）に溶解し、窒素下で一晩６５～７０℃まで加熱した。トリフルオロ酢酸を減圧下で取り除いた。残渣をアセトニトリル（２．５ｍＬ）に溶解し、水中０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する５～７５％のアセトニトリルの勾配を使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）ＡＸＩＡ（商標）カラム（２５０×５０ｍｍ、１０μｍ粒子サイズ）上で調製用逆相液体クロマトグラフィーにより３０分かけて精製し、表題の化合物を得た（０．３０ｇ、収率５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， メタノール－ｄ４） δ ｐｐｍ ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．８６ （ｔ， Ｊ ＝ １０．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １７．６， ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２１．６， １７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．００ （ｄｈ， Ｊ ＝ １２．３， ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８９ - ３．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７２ - ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１５ - ３．０７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１１ - ３．０２ （ｍ， １Ｈ）， ２．６６ （ｓ， １Ｈ）， ２．５２ - ２．３９ （ｍ， １Ｈ）， ２．００ - １．８６ （ｍ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ３７５．２ （Ｍ－Ｈ）－．
｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝酢酸
実施例２－１５（１．２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（２２．２ｇ、１９５ｍｍｏｌ、１５ｍＬ）に溶解し、窒素下で一晩６５～７０℃まで加熱した。トリフルオロ酢酸を減圧下で取り除いた。残渣をアセトニトリル（２．５ｍＬ）に溶解し、水中０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する５～７５％のアセトニトリルの勾配を使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）ＡＸＩＡ（商標）カラム（２５０×５０ｍｍ、１０μｍ粒子サイズ）上で調製用逆相液体クロマトグラフィーにより３０分かけて精製し、表題の化合物を得た（０．３０ｇ、収率５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， メタノール－ｄ４） δ ｐｐｍ ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．８６ （ｔ， Ｊ ＝ １０．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １７．６， ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２１．６， １７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．００ （ｄｈ， Ｊ ＝ １２．３， ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８９ - ３．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７２ - ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１５ - ３．０７ （ｍ， １Ｈ）， ３．１１ - ３．０２ （ｍ， １Ｈ）， ２．６６ （ｓ， １Ｈ）， ２．５２ - ２．３９ （ｍ， １Ｈ）， ２．００ - １．８６ （ｍ， １Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ３７５．２ （Ｍ－Ｈ）－．
【0127】
【化23】
【0128】
［実施例２－１７］
Ｎ－（｛３－［２－（｛１０－［（Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル）アミノ］－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル｝アミノ）エトキシ］プロポキシ｝アセチル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）及びジクロロメタン（４ｍＬ）中実施例１－３４（１６４ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）、実施例２－２（６０．９ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）、１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（８６ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ、ＨＡＴＵ）及び２，６－ルチジン（６０μＬ、０．５１５ｍｍｏｌ）の混合物を周囲温度で１時間攪拌した。混合物を回転式エバポレーターにより濃縮し、次に４ｍＬのジクロロメタン中２，２，２－トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６．０ｍｍｏｌ）を用いて周囲温度で４０分間処理した。反応混合物を濃縮し、１：１のジメチルスルホキシド：メタノール（２ｍＬ）に溶解し、調製用逆相ＨＰＬＣ（方法Ａ）により精製し、表題の化合物を１６１．３ｍｇ（７２％）得た（ビストリフルオロ酢酸塩として任意に割り当てられた。）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．２７ （ｓ， １Ｈ）， １０．３５ （ｓ， １Ｈ）， ８．９９ （ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５１ - ８．３８ （ｍ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ３３．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７８ - ７．５９ （ｍ， １Ｈ）， ７．５４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７ - ７．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４３ - ６．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ５．９２ （ｄ， Ｊ ＝ １７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８６ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．４， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６２ - ４．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ - ４．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９８ - ３．８４ （ｍ， １２Ｈ）， ３．６４ - ３．５４ （ｍ， ５Ｈ）， ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）， １．８５ （ｑ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．７， ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４９ - １．３２ （ｍ， ６Ｈ）， ０．９４ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ １１２８．５ （Ｍ－Ｈ）－．
Ｎ－（｛３－［２－（｛１０－［（Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル）アミノ］－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル｝アミノ）エトキシ］プロポキシ｝アセチル）－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）及びジクロロメタン（４ｍＬ）中実施例１－３４（１６４ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）、実施例２－２（６０．９ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）、１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミニオ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（８６ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ、ＨＡＴＵ）及び２，６－ルチジン（６０μＬ、０．５１５ｍｍｏｌ）の混合物を周囲温度で１時間攪拌した。混合物を回転式エバポレーターにより濃縮し、次に４ｍＬのジクロロメタン中２，２，２－トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６．０ｍｍｏｌ）を用いて周囲温度で４０分間処理した。反応混合物を濃縮し、１：１のジメチルスルホキシド：メタノール（２ｍＬ）に溶解し、調製用逆相ＨＰＬＣ（方法Ａ）により精製し、表題の化合物を１６１．３ｍｇ（７２％）得た（ビストリフルオロ酢酸塩として任意に割り当てられた。）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．２７ （ｓ， １Ｈ）， １０．３５ （ｓ， １Ｈ）， ８．９９ （ｓ， １Ｈ）， ８．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５１ - ８．３８ （ｍ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ３３．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７８ - ７．５９ （ｍ， １Ｈ）， ７．５４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７ - ７．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４３ - ６．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ５．９２ （ｄ， Ｊ ＝ １７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８６ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．４， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６２ - ４．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ - ４．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９８ - ３．８４ （ｍ， １２Ｈ）， ３．６４ - ３．５４ （ｍ， ５Ｈ）， ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０８ （ｓ， ３Ｈ）， １．８５ （ｑ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．７， ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４９ - １．３２ （ｍ， ６Ｈ）， ０．９４ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ １１２８．５ （Ｍ－Ｈ）－．
【0129】
［実施例２－１８］
Ｎ－［（３－｛２－［（１０－｛［Ｎ－（｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセチル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル］アミノ｝－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
実施例２－１６（１０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（２０μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）及び２－（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（１１ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で組み合わせた。反応混合物を周囲温度で５分間攪拌し、次に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中実施例２－１７（３７．２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（２０μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を周囲温度で１時間攪拌し、２ｍＬの１：１のジメチルスルホキシド／メタノールで希釈し、シリンジフィルター（０．４５μｍのポリプロピレン）を通して濾過し、その後分取ＨＰＬＣ（方法Ａ、水中２０～８０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸で溶出させた。）により精製し表題の化合物を得た（１５ｍｇ、３５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．１８ （ｓ， １Ｈ）， ９．９３ （ｓ， １Ｈ）， ９．８５ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４４ － ８．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ８．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ ＝ １３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７０ （ｄ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ２７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４６ － ７．２８ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３７ （ｍ， １Ｈ）， ５．８７ （ｄ， Ｊ ＝ １７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６９ （ｍ， １Ｈ）， ４．５６ － ４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４２ － ４．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２７ － ４．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９７ － ３．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７０－３．４０ （ｂｄ， １４Ｈ）， ２．７８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９０ － １．６９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２７ － １．１９ （ｍ， ５Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ １４８６．８ （Ｍ－Ｈ）－．
Ｎ－［（３－｛２－［（１０－｛［Ｎ－（｛（３Ｓ，５Ｓ）－３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－２－オキソ－５－［（２－スルホエトキシ）メチル］ピロリジン－１－イル｝アセチル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル］アミノ｝－２－メチル－３－オキソ－７－フェニル－３，４，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－２，４，７－トリアザジベンゾ［ｃｄ，ｆ］アズレン－５－カルボニル）アミノ］エトキシ｝プロポキシ）アセチル］－３－メチル－Ｌ－バリル－（４Ｒ）－４－ヒドロキシ－Ｎ－｛（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－［４－（４－メチル－１，３－チアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－Ｌ－プロリンアミド
実施例２－１６（１０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（２０μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）及び２－（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（１１ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で組み合わせた。反応混合物を周囲温度で５分間攪拌し、次に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中実施例２－１７（３７．２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ－イソプロピルプロパン－２－アミン（２０μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を周囲温度で１時間攪拌し、２ｍＬの１：１のジメチルスルホキシド／メタノールで希釈し、シリンジフィルター（０．４５μｍのポリプロピレン）を通して濾過し、その後分取ＨＰＬＣ（方法Ａ、水中２０～８０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸で溶出させた。）により精製し表題の化合物を得た（１５ｍｇ、３５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ｐｐｍ １２．１８ （ｓ， １Ｈ）， ９．９３ （ｓ， １Ｈ）， ９．８５ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．４４ － ８．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ８．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０３ （ｄ， Ｊ ＝ １３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７０ （ｄ， Ｊ ＝ １０．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ２７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４６ － ７．２８ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３７ （ｍ， １Ｈ）， ５．８７ （ｄ， Ｊ ＝ １７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６９ （ｍ， １Ｈ）， ４．５６ － ４．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４２ － ４．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２７ － ４．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９７ － ３．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７０－３．４０ （ｂｄ， １４Ｈ）， ２．７８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．９， ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９０ － １．６９ （ｍ， ３Ｈ）， １．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２７ － １．１９ （ｍ， ５Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ １４８６．８ （Ｍ－Ｈ）－．
【0130】
［実施例３］ インビトロ結合アッセイ
ＴＲ－ＦＲＥＴ結合アッセイを使用して、ＢＥＴデグレーダーの結合特性を評価した。比較ＢＥＴファミリー・ブロモドメイン・インヒビター、ＭＳ４１７（（Ｚｈａｎｇ Ｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２年、第２８７巻、２８８４０～２８８５１頁）、ＣＡＳ登録番号９１６４８９－３６－６）を使用した。ＭＳ４１７を、使用のためにＡｌｅｘａ６４７で標識し、ＦＲＥＴアッセイ緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二無水物、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭのＤＬ－ジチオスレイトール）で希釈した。アッセイのための標的タンパク質はＢＲＤ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｏ６０８８５－１）ポリペプチドであった。結合アッセイの成分はＨｉｓタグ付きＢＲＤ４ブロモドメイン１（Ｋ５７－Ｅ１６８）（配列番号１８）又はＨｉｓタグ付きＢＲＤ４ブロモドメイン２（Ｅ３５２－Ｍ４５７）（配列番号１９）、ユーロピウムコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、実施例１（ＢＥＴｄ１）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲートＭＳ４１７であった。周囲温度での１時間の平衡後、ユーロピウム励起波長３４０ｎｍでＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＴＲ－ＦＲＥＴ比を決定し、Ａｌｅｘａ６４７プローブ発光を６６５ｎｍでモニターした。ＢＥＴｄ１は、ＢＲＤ４ブロモドメイン１に対して０．０１０２μＭのＩＣ５０及びＢＲＤ４ブロモドメイン２に対して０．０５０６μＭのＩＣ５０を示した。
ＴＲ－ＦＲＥＴ結合アッセイを使用して、ＢＥＴデグレーダーの結合特性を評価した。比較ＢＥＴファミリー・ブロモドメイン・インヒビター、ＭＳ４１７（（Ｚｈａｎｇ Ｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２年、第２８７巻、２８８４０～２８８５１頁）、ＣＡＳ登録番号９１６４８９－３６－６）を使用した。ＭＳ４１７を、使用のためにＡｌｅｘａ６４７で標識し、ＦＲＥＴアッセイ緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二無水物、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭのＤＬ－ジチオスレイトール）で希釈した。アッセイのための標的タンパク質はＢＲＤ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｏ６０８８５－１）ポリペプチドであった。結合アッセイの成分はＨｉｓタグ付きＢＲＤ４ブロモドメイン１（Ｋ５７－Ｅ１６８）（配列番号１８）又はＨｉｓタグ付きＢＲＤ４ブロモドメイン２（Ｅ３５２－Ｍ４５７）（配列番号１９）、ユーロピウムコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、実施例１（ＢＥＴｄ１）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲートＭＳ４１７であった。周囲温度での１時間の平衡後、ユーロピウム励起波長３４０ｎｍでＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＴＲ－ＦＲＥＴ比を決定し、Ａｌｅｘａ６４７プローブ発光を６６５ｎｍでモニターした。ＢＥＴｄ１は、ＢＲＤ４ブロモドメイン１に対して０．０１０２μＭのＩＣ５０及びＢＲＤ４ブロモドメイン２に対して０．０５０６μＭのＩＣ５０を示した。
【0131】
［実施例４］ ＣＤ３３ ｍＡｂ１
ヒトＣＤ３３タンパク質、ヒト単球、カニクイザル単球及びＣＤ３３を発現する組換えＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に結合するラット抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して単離した。ラット抗体を使用してｍＡｂ１を産生した。
ヒトＣＤ３３タンパク質、ヒト単球、カニクイザル単球及びＣＤ３３を発現する組換えＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に結合するラット抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して単離した。ラット抗体を使用してｍＡｂ１を産生した。
【0132】
ｍＡｂ１は、ＣＤ３３に結合する組換えヒト化ＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体である。ｍＡｂ１は、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖（Ｙ２９６Ｃ、Ｎ２９７Ａ）及びカッパ軽鎖定常領域と融合されたキメララット抗体のヒト化相補性決定領域からなる。
【0133】
タンパク質工学は、部位特異的コンジュゲーションのために実行された。Ｆｃ領域の重鎖のＣＨ２ドメインにおいて以下のことが見出されている。Ｙ２９６Ｃはコンジュゲーション部位であり、Ｎ２９７Ａは天然のグリコシル化部位を取り除く。グリカン（Ｎ２９７Ａ）の非存在下、システイン（Ｙ２９６Ｃ）でコンジュゲートすると、結合したリンカー－薬物を、通常グリカンが占めているポケット中に向けることができる。このポケットへのリンカー－薬物の隔離により、ＡＤＣの見かけ上の疎水性が減少し、リンカー－薬物が水性環境から遮蔽されていることを示している。得られた変異体はｍＡｂ１として選択された［突然変異：Ｇ５４Ａ ＣＤＲ－Ｈ２；Ｓ６２Ａ ＣＤＲ－Ｈ２；Ｇ２８Ｄ ＣＤＲ－Ｌ１；Ｓ９３Ｅ ＣＤＲ－Ｌ３］。抗体は、ヒトＩｇＧ１／ｋアイソタイプであり、ｚを有し、非アロタイプである。
【0134】
非コンジュゲート抗ヒトＣＤ３３抗体ｍＡｂ１の代表的なロットは、安定なＣＨＯプール発現により作製され精製された。
【0135】
ｍＡｂ１の重及び軽鎖に存在するアミノ酸の修飾又は欠失を確定するためにペプチドマッピングを実行した。変性及び還元に続いて、ｍＡｂは、リジンのＣ末端でペプチド結合を切断するタンパク質分解酵素であるＬｙｓ－Ｃを使用する消化を受けた。消化された試料は、翻訳後修飾について大きな断片をモニターするため変性条件下でオービトラップＭＳを有する還元逆相液体クロマトグラフィー－質量分析（ＲＰＬＣ－ＭＳ）を使用して分析した。
【0136】
タンパク質分解消化に続くｍＡｂ１ペプチド断片の３バッチの分析により、重鎖の２つの種が存在することが示された。定量化は、Ｃ末端リジンあり及びなしの消化されたペプチドの抽出イオンクロマトグラムのシグナル強度に基づいて実施された。配列番号９に示されるように、ｍＡｂ１の重鎖のごく僅かな割合だけ（１．７パーセント）が、Ｃ末端リジンを有する重鎖からなっていた。配列番号１０に示されるように、ｍＡｂ１中の重鎖の優勢な種がＣ末端リジンを欠いていた。配列番号１１に示されるように、ｍＡｂ１消化に続く軽鎖特異的断片は、コードされた一次アミノ酸配列から予測される通りにロットにわたり一貫していた。
【0137】
［実施例５］ ＣＤ３３発現ＨＥＫ－２９３細胞へのｍＡｂ１特異的結合
抗ヒトＣＤ３３ ｍＡｂ１の結合を確定するため、フローサイトメトリー分析を使用した。対照及びＣＤ３３発現ＨＥＫ－２９３細胞は、細胞解離緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用しておおよそ８０％コンフルエントになった場合にフラスコから収集された。細胞をＰＢＳ／１％ ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中１．５～２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。１０×濃縮の試験抗体を１０マイクロリットル添加し、プレートを４℃で２時間インキュベートした。ウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈された１：５００抗ヒトＩｇＧ Ａｂ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の５０ｍＬに再懸濁した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ／１％ホルムアルデヒドの１００ｍＬに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上で分析した。
抗ヒトＣＤ３３ ｍＡｂ１の結合を確定するため、フローサイトメトリー分析を使用した。対照及びＣＤ３３発現ＨＥＫ－２９３細胞は、細胞解離緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用しておおよそ８０％コンフルエントになった場合にフラスコから収集された。細胞をＰＢＳ／１％ ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中１．５～２．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。１０×濃縮の試験抗体を１０マイクロリットル添加し、プレートを４℃で２時間インキュベートした。ウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈された１：５００抗ヒトＩｇＧ Ａｂ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の５０ｍＬに再懸濁した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ／１％ホルムアルデヒドの１００ｍＬに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上で分析した。
【0138】
陰性対照ヒト抗ＣＭＶ ＩｇＧ ｍＡｂ２及びｍＡｂ１は、対照及びＣＤ３３発現ＨＥＫ－２９３細胞上でのＦＡＣＳ滴定実験におけるＣＤ３３特異的結合について試験された。抗ヒトＣＤ３３ ｍＡｂ１は、ＣＤ３３発現ＨＥＫ－２９３細胞に特異的に結合するが、対照ＨＥＫ－２９３細胞には結合しない。ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）を認識する対照ｍＡｂ２では結合は観察されず、このウイルスは使用されたモデルには存在しない。配列番号１４に示される重鎖配列及び配列番号１５に示される軽鎖配列を有する抗体ｍＡｂ２が試験された。
【0139】
［実施例６］ ｍＡｂ１－ＬＤ２ ＡＤＣを作製するためのコンジュゲーション手順
ｍＡｂ１は、リンカー薬物にコンジュゲートされて（実施例２－１、ＬＤ１）、式（Ｉ）の代表的なＡＤＣである、抗体－薬物コンジュゲートｍＡｂ１－ＬＤ２を形成した。
ｍＡｂ１は、リンカー薬物にコンジュゲートされて（実施例２－１、ＬＤ１）、式（Ｉ）の代表的なＡＤＣである、抗体－薬物コンジュゲートｍＡｂ１－ＬＤ２を形成した。
【0140】
実施例４由来の抗体、ｍＡｂ１は、下に記載される通りに、過剰な還元剤、４－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸（ＤｐＨＰＢＡ）で還元され、次に過剰な薬物－リンカーでコンジュゲートされた。
【0141】
反応溶液から酸素を取り除くため、反応上部空間を窒素でスイープし、溶液濃度が測定して１ｐｐｍ未満になるまで混ぜ合わせた。抗体を還元するため、ジメチルスルホキシド中２．５モル当量の４－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸（０．３ｗ／ｗ％）を添加し、４℃で一晩（１６～２４時間）混ぜ合わせた。還元抗体は実施例２－１由来のリンカー－薬物ＬＤ１（ジメチルスルホキシド中０．８ｗ／ｗ％溶液として２．０５モル当量）と反応させ、２０℃でおおよそ１時間反応させた。反応混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製した。産物画分を濃縮し、ｐＨ８．５に緩衝及びｐＨ調整して、リンカー環の開口をもたらした（２０℃で４８時間保持した。）。開環産物溶液を無菌濾過し－８０℃で保管した。
【0142】
［実施例７］ ｍＡｂ１－ＬＤ３ ＡＤＣを作製するためのコンジュゲーション手順
ｍＡｂ１をリンカー薬物（実施例２－１、ＬＤ１）にコンジュゲートして、式（ＶＩ）の代表的なＡＤＣである、抗体－薬物コンジュゲートｍＡｂ１－ＬＤ３を形成した。ＨＣ：Ｙ２９６Ｃ、Ｎ２９７Ａ突然変異を有するＣＤ３３抗体（ｍＡｂ１）を還元するため、３モル当量の４－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸を水性抗体溶液に添加し、反応混合物を穏やかにボルテックスした。反応混合物を４℃で一晩（１６～２４時間）インキュベートした。コンジュゲーション反応では、２．１～２．５モル当量のリンカー－薬物（実施例２－１、ＬＤ１）（Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中１０ｍＭの保存液として溶解させた。）を還元抗体に添加し、穏やかに混合し、続いて４℃で１時間インキュベートした。コンジュゲートを精製し、０．２μＭのフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）を通して濾過し、４℃で保管した。
ｍＡｂ１をリンカー薬物（実施例２－１、ＬＤ１）にコンジュゲートして、式（ＶＩ）の代表的なＡＤＣである、抗体－薬物コンジュゲートｍＡｂ１－ＬＤ３を形成した。ＨＣ：Ｙ２９６Ｃ、Ｎ２９７Ａ突然変異を有するＣＤ３３抗体（ｍＡｂ１）を還元するため、３モル当量の４－（ジフェニルホスフィノ）安息香酸を水性抗体溶液に添加し、反応混合物を穏やかにボルテックスした。反応混合物を４℃で一晩（１６～２４時間）インキュベートした。コンジュゲーション反応では、２．１～２．５モル当量のリンカー－薬物（実施例２－１、ＬＤ１）（Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中１０ｍＭの保存液として溶解させた。）を還元抗体に添加し、穏やかに混合し、続いて４℃で１時間インキュベートした。コンジュゲートを精製し、０．２μＭのフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）を通して濾過し、４℃で保管した。
【0143】
［実施例８］ ＤＡＲ（薬物抗体比）の特徴付け及びＡＤＣ決定の凝集のパーセンテージ
ＬＣ－ＭＳ分析ｍＡｂ１－ＬＤ２によるＤＡＲ決定：還元サブユニット分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に接続されたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｖａｎｑｕｉｓｈ ＬＣを使用して実施された。ＡＤＣは、室温で３０分間３２ｍＭ（最終濃度）のジチオスレイトールを使用して還元され、ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂポリフェニルカラム（２．１×１５０ｍｍ、２．７μｍ ｄｐ、４５０Åポアサイズ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して分離された。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ中０．０８５％のギ酸及び０．０１５％のトリフルオロ酢酸であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０８５％のギ酸及び０．０１５％のトリフルオロ酢酸であり、流速は０．４ｍＬ／分であった。抽出強度対ｍ／ｚスペクトルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｓ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してデコンボリューションされて、それぞれの還元抗体断片の質量を決定した。ＤＡＲは、強度に結合した薬物の数を掛けることにより正規化して、重鎖についての非修飾及び修飾ピークの強度を合計することによりデコンボリューションされたスペクトルから計算された。加算され、正規化された強度は強度の合計で割り、２つの重鎖についての加算結果により完全ＡＤＣについての最終平均ＤＡＲ値が得られた。Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計に接続されたＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ａｃｑｕｉｔｙを使用してネイティブインタクト分析が実施された。ＡＤＣは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨ ＳＥＣカラム（４．６×１５０ｍｍ、１．７μｍ ｄｐ、２００Åポアサイズ、Ｗａｔｅｒｓ）により分離され、１０％のイソプロパノール中１００ｍＭの酢酸アンモニウムの移動相を使用した。流速は０．２ｍＬ／分であり、質量スペクトルはＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）により得られた。抽出質量スペクトルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｓ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用して、ＤＡＲプロファイルを決定するためにデコンボリューションされた。ＤＡＲ２は優勢型のｍＡｂ１－ＬＤ２である。
ＬＣ－ＭＳ分析ｍＡｂ１－ＬＤ２によるＤＡＲ決定：還元サブユニット分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に接続されたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｖａｎｑｕｉｓｈ ＬＣを使用して実施された。ＡＤＣは、室温で３０分間３２ｍＭ（最終濃度）のジチオスレイトールを使用して還元され、ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂポリフェニルカラム（２．１×１５０ｍｍ、２．７μｍ ｄｐ、４５０Åポアサイズ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して分離された。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ中０．０８５％のギ酸及び０．０１５％のトリフルオロ酢酸であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０８５％のギ酸及び０．０１５％のトリフルオロ酢酸であり、流速は０．４ｍＬ／分であった。抽出強度対ｍ／ｚスペクトルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｓ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してデコンボリューションされて、それぞれの還元抗体断片の質量を決定した。ＤＡＲは、強度に結合した薬物の数を掛けることにより正規化して、重鎖についての非修飾及び修飾ピークの強度を合計することによりデコンボリューションされたスペクトルから計算された。加算され、正規化された強度は強度の合計で割り、２つの重鎖についての加算結果により完全ＡＤＣについての最終平均ＤＡＲ値が得られた。Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計に接続されたＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ａｃｑｕｉｔｙを使用してネイティブインタクト分析が実施された。ＡＤＣは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨ ＳＥＣカラム（４．６×１５０ｍｍ、１．７μｍ ｄｐ、２００Åポアサイズ、Ｗａｔｅｒｓ）により分離され、１０％のイソプロパノール中１００ｍＭの酢酸アンモニウムの移動相を使用した。流速は０．２ｍＬ／分であり、質量スペクトルはＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）により得られた。抽出質量スペクトルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｓ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用して、ＤＡＲプロファイルを決定するためにデコンボリューションされた。ＤＡＲ２は優勢型のｍＡｂ１－ＬＤ２である。
【0144】
ＬＣ－ＭＳ分析ｍＡｂ１－ＬＤ３によるＤＡＲ決定：Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ ６２２０ ＥＳＩ質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して分析は実施された。ＡＤＣは、２５ｍＭ（最終濃度）のＢｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ（登録商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で還元され、タンパク質Ｍｉｃｒｏｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）脱塩カートリッジ上にロードされ、周囲温度、０．２分で１０％Ｂから７５％Ｂの勾配を用いて溶出させた。移動相Ａは０．１％のギ酸を有するＨ２Ｏであり、移動相Ｂは０．１％のギ酸を有するアセトニトリルであり、流速は０．２ｍＬ／分であった。共溶出する軽及び重鎖のエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（商標）収集ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して獲得された。抽出強度対ｍ／ｚスペクトルは、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェアの最大エントロピーフィーチャーを使用してデコンボリューションされて、それぞれの還元抗体断片の質量を決定した。ＤＡＲは、強度に結合した薬物の数を掛けることにより正規化して、軽鎖及び重鎖についてのネイキッド及び修飾ピークの強度を合計することによりデコンボリューションされたスペクトルから計算された。加算され、正規化された強度は強度の合計で割り、２つの軽鎖及び２つの重鎖についての加算結果により約２の完全ＡＤＣについての最終平均ＤＡＲ値が得られた。
【0145】
［実施例９］ ＡＤＣ特徴付け
ＡＤＣの２つの代表的ロットは、選択的還元プロトコルを使用して安定なＣＨＯプール発現により産生される抗体の操作されたＹ２９６Ｃシステインでのコンジュゲーションにより作製された。これらのロットは、質量分光法による薬物－抗体比（ＤＡＲ）及びコンジュゲーションの特異性、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による凝集体含有量、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による見かけの疎水性を決定するために特徴付けられた。開始抗体ロットは大半が単量体（約９４％）であり、操作されたシステインはおおよそ９０％がシステイン又はグルタチオンで完全にキャップされていた。得られたＡＤＣは高単量体含有量（約９９％）を保持しており、優勢型としてＤＡＲ２を有した。重鎖の９５％超が重鎖当たり１分子のＬＤ２という予想される単一修飾を有することにより証明されるように、コンジュゲーションは高度に選択的であった。
ＡＤＣの２つの代表的ロットは、選択的還元プロトコルを使用して安定なＣＨＯプール発現により産生される抗体の操作されたＹ２９６Ｃシステインでのコンジュゲーションにより作製された。これらのロットは、質量分光法による薬物－抗体比（ＤＡＲ）及びコンジュゲーションの特異性、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による凝集体含有量、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による見かけの疎水性を決定するために特徴付けられた。開始抗体ロットは大半が単量体（約９４％）であり、操作されたシステインはおおよそ９０％がシステイン又はグルタチオンで完全にキャップされていた。得られたＡＤＣは高単量体含有量（約９９％）を保持しており、優勢型としてＤＡＲ２を有した。重鎖の９５％超が重鎖当たり１分子のＬＤ２という予想される単一修飾を有することにより証明されるように、コンジュゲーションは高度に選択的であった。
【0146】
ｍＡｂ１―ＬＤ２のコンジュゲーション部位の確認は、還元されアルキル化された抗体のＬｙｓ－Ｃ消化に続いて得られたペプチドの逆相ＨＰＬＣ分離により達成された。コンジュゲートされたペプチドは、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を使用して同定され、理論的モノアイソトピック分子量と比較された。重鎖断片（ＨＣ２８９－３１７）は理論的質量４８６２．２９Ｄａ及び観察された質量４８６２．３０Ｄａを有し、Ｃ２９３での予想されるコンジュゲーション部位を確認した。
【0147】
［実施例１０］ 細胞培養
以下の実施例に記載されるＡＭＬ細胞株は、はじめはＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）又はＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）から入手した。ＡＭＬ細胞株はすべてＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で培養され、解凍後２ヶ月未満の間培養液中で維持された。一次ＡＭＬ細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）＋サイトカインカクテル中で維持された。
以下の実施例に記載されるＡＭＬ細胞株は、はじめはＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）又はＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）から入手した。ＡＭＬ細胞株はすべてＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で培養され、解凍後２ヶ月未満の間培養液中で維持された。一次ＡＭＬ細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）＋サイトカインカクテル中で維持された。
【0148】
［実施例１１］ ＡＭＬ細胞株でのｍＡｂ１－ＬＤ２、ｍＡｂ１－ＬＤ３ ＡＤＣの抗増殖活性
ｍＡｂ３－ＬＤ３、ｍＡｂ１－ＬＤ２及びｍＡｂ１－ＬＤ３での処置に続く細胞増殖アッセイ
細胞は３８４ウェルプレートのそのそれぞれの培養培地中に蒔かれ、３７℃、５％のＣＯ２の雰囲気でインキュベートされた。３０ｎＭ～０．００５ｎＭに及ぶ連続的１：３希釈のＡＤＣが調製された。使用されたＡＤＣは、対照ＡＤＣを含んでおり、これはＢＥＴデグレーダーリンカー薬物ＬＤ１にコンジュゲートされた抗テタヌス毒素ｍＡｂであり、ｍＡｂ３－ＬＤ３と命名された。ｍＡｂ３は、配列番号１６で示される重鎖配列及び配列番号１７で示される軽鎖配列を有する。
ｍＡｂ３－ＬＤ３、ｍＡｂ１－ＬＤ２及びｍＡｂ１－ＬＤ３での処置に続く細胞増殖アッセイ
細胞は３８４ウェルプレートのそのそれぞれの培養培地中に蒔かれ、３７℃、５％のＣＯ２の雰囲気でインキュベートされた。３０ｎＭ～０．００５ｎＭに及ぶ連続的１：３希釈のＡＤＣが調製された。使用されたＡＤＣは、対照ＡＤＣを含んでおり、これはＢＥＴデグレーダーリンカー薬物ＬＤ１にコンジュゲートされた抗テタヌス毒素ｍＡｂであり、ｍＡｂ３－ＬＤ３と命名された。ｍＡｂ３は、配列番号１６で示される重鎖配列及び配列番号１７で示される軽鎖配列を有する。
【0149】
ｍＡｂ３－ＬＤ３に加えて、既に記載されているＡＤＣ ｍＡｂ１－ＬＤ２及びｍＡｂ１－ＬＤ３をこれらのアッセイで使用した。希釈されたＡＤＣを２４時間の培養後プレートに添加し、細胞培養物を３７℃でさらに３日間インキュベートした。Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って実施して細胞増殖を判定した。それぞれのウェルからの発光シグナルは、Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して取得され、データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用して解析された。
【0150】
【表1】
【0151】
ｍＡｂ３－ＬＤ３は、ＡＭＬ細胞株の増殖を妨げるのに大部分が不活性であったが、両方のｍＡｂ１ ＡＤＣは試験されたＡＭＬ細胞株での細胞増殖を有意に制限した。
【0152】
ｍＡｂ３－ＬＤ３、ｍＡｂ１－ＬＤ２及びｍＡｂ１－ＬＤ３により影響を受けたＢＲＤ４定量化
細胞は９６ウェルプレートのそのそれぞれの培養培地中に蒔かれ、３７℃、５％のＣＯ２の雰囲気で一晩インキュベートされた。連続的１：３希釈のＡＤＣが調製され、次の日にプレートに添加された。ＡＤＣと一緒の１８時間のインキュベーション後、細胞は凍結され、後のアッセイのために－８０℃で保管された。ＭＳＤタンパク質アッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）の日、細胞は氷上で、ウェル当たり１００μＬの溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット：Ｒｏｃｈｅ、ａｎｄ ＰＭＳＦ）を添加して溶解され、それぞれのウェル中のＢＲＤ４タンパク質の量は、ＭＳＤプレートリーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用するＭＳＤ製造業者が推奨するプロトコルに従って抗ＢＲＤ４ウサギｍＡｂ捕獲抗体（Ｆｏｒｔｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して決定され、データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用して解析された。
細胞は９６ウェルプレートのそのそれぞれの培養培地中に蒔かれ、３７℃、５％のＣＯ２の雰囲気で一晩インキュベートされた。連続的１：３希釈のＡＤＣが調製され、次の日にプレートに添加された。ＡＤＣと一緒の１８時間のインキュベーション後、細胞は凍結され、後のアッセイのために－８０℃で保管された。ＭＳＤタンパク質アッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）の日、細胞は氷上で、ウェル当たり１００μＬの溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット：Ｒｏｃｈｅ、ａｎｄ ＰＭＳＦ）を添加して溶解され、それぞれのウェル中のＢＲＤ４タンパク質の量は、ＭＳＤプレートリーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用するＭＳＤ製造業者が推奨するプロトコルに従って抗ＢＲＤ４ウサギｍＡｂ捕獲抗体（Ｆｏｒｔｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して決定され、データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用して解析された。
【0153】
【表2】
【0154】
陰性対照である抗テタヌス毒素ｍＡｂ３－ＬＤ３は、ＡＭＬ細胞株でのＢＲＤ４タンパク質に影響を及ぼすのに大部分が不活性であったが、両方のｍＡｂ１ ＡＤＣは試験されたＡＭＬ細胞株でのＢＲＤ４の存在を有意に減少させた。
【0155】
［実施例１２］ 患者由来異種移植片（「ＰＤＸ」）全身モデルでのｍＡｂ１―ＬＤ３活性
移植研究では、ＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（末梢血単核球）試料を使用して、亜致死性照射新生仔免疫不全ＣＩＥＡ－ＮＯＧマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）の肝内に接種した。１２週間後、代理マウスで生着が確認され、残りのコホートはスクリーニングされ、処置群に無作為化された。５週間の処置後、骨髄中のヒト細胞の存在は、フローサイトメトリーにより評価された。
移植研究では、ＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（末梢血単核球）試料を使用して、亜致死性照射新生仔免疫不全ＣＩＥＡ－ＮＯＧマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）の肝内に接種した。１２週間後、代理マウスで生着が確認され、残りのコホートはスクリーニングされ、処置群に無作為化された。５週間の処置後、骨髄中のヒト細胞の存在は、フローサイトメトリーにより評価された。
【0156】
ｍＡｂ１―ＬＤ３の抗増殖活性は、免疫抑制マウス中へのＰＢＭＣのＰＤＸ移植によりＡＭＬ患者単離物上で評価された。マウスは、３つの別々のコホートにおいてｍＡｂ１―ＬＤ３ ＡＤＣを投与された。それぞれのコホートでのマウスの骨髄中のヒト細胞の増殖は、陰性対照と比べた場合抑制されていることが分かった。ｍＡｂ１―ＬＤ３の結果は図１に示されている。
【0157】
［実施例１３］ ＣＤＸマウスモデルでのｍＡｂ１－ＬＤ２及びｍＡｂ１－ＬＤ３により示される有効性
移植モデル：メスＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入し、下に記載される通りに、生物発光読取り情報を有する腫瘍移植モデルに使用した。マウスは６～８週齢であり、研究開始時の体重は２１～２４グラムである。餌と水は適宜与えられ、動物施設は１２時間明期：１２時間暗期のスケジュールで保たれる。すべての動物研究は、ＡｂｂＶｉｅ動物実験委員会により確立された指針に従って行われる。
移植モデル：メスＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入し、下に記載される通りに、生物発光読取り情報を有する腫瘍移植モデルに使用した。マウスは６～８週齢であり、研究開始時の体重は２１～２４グラムである。餌と水は適宜与えられ、動物施設は１２時間明期：１２時間暗期のスケジュールで保たれる。すべての動物研究は、ＡｂｂＶｉｅ動物実験委員会により確立された指針に従って行われる。
【0158】
全身移植モデルでは、Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ安定Ｆ．ルシフェラーゼ発現細胞株は、親ＡＭＬ細胞株（ＤＳＭＺ由来のＭＯＬＭ１３、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ、並びにＴＨＰ－１及びＭＶ４－１１、両方ともＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ由来）にＲｅｄｉＦｅｃｔ Ｒｅｄ－ＦＬｕｃ－ピューロマイシン・レンチウイルス粒子（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を感染させることにより生み出され、移植パラメータについて及びシグナルの安定性について確認される安定な細胞株を作り出す。次に、マウスは、ＭＯＬＭ１３－Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ（１×１０６細胞）、ＴＨＰ１－Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ（１×１０６細胞）及びＭＶ４－１１－Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ（５×１０６細胞）を尾静脈中に培養培地の０．２ｍＬの接種菌液と一緒に静脈内に接種される。腫瘍生着を測定するため、生物発光（ＢＬＩ）シグナルを、ＬａｇｏＸ（登録商標）イメージングシステム（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）を使用してルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射の１０分後に取得する。シグナル強度は、マウスの全体像で目的の領域を調べることにより決定される。生着データは、ＬａｇｏＸ（登録商標）ソフトウェアを使用して定量化され、マウスは３×１０６シグナルで処置及び対照群に、研究群当たり９マウスで割り当てられる。腫瘍量測定は、ＢＬＩ＝（処置されたマウスＢＬＩ－サイズ一致ＢＬＩでのバックグラウンド）として、正規化されたＢＬＩ測定に基づいて評価される。マウスは、３つの異なる既定の用量で、単回腹腔内投与としてｍＡｂ１－ＬＤ２又はｍＡｂ１－ＬＤ３を投与される。ＢＬＩシグナルは、マウスの背側及び腹側位置で、少なくとも週２回モニターされる。１×１０１０ＢＬＩのＢＬＩシグナルが観察された場合、マウスは研究から外され人道的に安楽死される。ｍＡｂ１－ＬＤ３についての結果は図２に示されている。
【0159】
【表3】
【図1】
【図2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1】
【図2】
【外国語明細書】