特開 2024-174969 ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する方法及び薬剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024174969

(43)【公開日】2024-12-17

(54)【発明の名称】ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する方法及び薬剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/48 20060101AFI20241210BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20241210BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20241210BHJP

   C07K 14/745 20060101ALN20241210BHJP

【ＦＩ】

A61K38/48 100

A61P43/00 111

A61P25/28 ZNA

A61P25/16

A61P25/02

A61P25/28

C07K14/745

【審査請求】有

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024154130

(22)【出願日】2024-09-06

(62)【分割の表示】P 2022557661の分割

【原出願日】2021-03-24

(31)【優先権主張番号】202010212897.X

(32)【優先日】2020-03-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】518217305

【氏名又は名称】タレンゲン インターナショナル リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＴＡＬＥＮＧＥＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110003007

【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】李 季男

(57)【要約】      （修正有）

【課題】被験者に治療有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分を投与することを含む、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する医薬組成物を提供する。
【解決手段】ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進するための、プラスミノーゲンを含む医薬組成物であって、前記プラスミノーゲンが特定の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、かつ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質分解活性を有する、医薬組成物による。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進するための、プラスミノーゲンを含む医薬組成物であって、前記プラスミノーゲンが配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、かつ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質分解活性を有する、医薬組成物。

【請求項2】

前記プラスミノーゲンが、ヒトアミロイドＡβ４０、ヒトアミロイドＡβ４２、α－シヌクレイン、Ｔａｕタンパク質、ＳＯＤ－１タンパク質、ポリグルタミン、ニューロセリンプロテアーゼ阻害剤（ＮＳＰ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子、α１－アンチトリプシン、パーキンタンパク質、クリスタリン、トランスサイレチン、短鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ変異体、低密度リポタンパク質受容体、ハンチンチン、ニューロフィラメントタンパク質、末梢タンパク質、α－インターネキシン、膵島アミロイドポリペプチド、β２－ミクログロブリン、血清アミロイドＡタンパク質、免疫グロブリン軽鎖、ヒトリゾチーム、α－ラクトアルブミン、プロサイモシンα、アポリポプロテインＥ、及びアポリポプロテインＪから選択される１つまたは複数のミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記プラスミノーゲンが成熟ＢＤＮＦへのＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進するか、または成熟ＮＧＦへのＰｒｏ－ＮＧＦの切断を促進する、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進し、ミスフォールドタンパク質および／またはその凝集体によって引き起こされる疾患を予防及び治療するために、被験者に有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分または関連化合物、例えば、プラスミノーゲン、を投与することを含む、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質のミスフォールディングまたはその重合体によって引き起こされる疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、およびプリオン様疾患［クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｋｏｂ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＪＤ）、ゲルストマン症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＧＳＳ）、びまん性または家族性致死性不眠症（Ｆａｔａｌ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｏｒ ｆａｍｉｌｉａｌ ｉｓｏｍｎｉａ）およびクール（Ｋｕｒｕ）］などを含む。病因は異なるが、それぞれに選択的な病変部位があり、疾患遺伝子の位置も異なるが、共通の病理学的特徴を有し、すなわち、特定の領域におけるニューロンの変性、死、および変異タンパク質の凝集によって形成されるニューロン内封入体、例えば、アルツハイマー病患者の脳における老人斑や神経もつれ、パーキンソン病患者のドーパミン作動性ニューロンに残る好酸球性レビー（Ｌｅｗｙ）小体、筋萎縮性側索硬化症の患者の脊髄および脳幹ニューロンのブニナ（Ｂｕｎｉｎａ）小体など、ポリグルタミン病患者の関与するニューロンの核内封入体などを有する。現在の研究では、これらのニューロンの変性、死、および封入体形成が、ミスフォールドタンパク質によって形成された凝集体と密接に関連していることを示唆していると考えられている。

【0003】

近年、研究により、細胞内でミスフォールドされたタンパク質は、熱ショックタンパク質などの分子シャペロンによってリフォールディングされる可能性があり、ユビキチン－プロテアソームシステム（Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ ＤＣ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎ－ｅｒａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４３（７１１３）：７８０－７８６）によっても分解される可能性があることが確認されている。ミスフォールドタンパク質が分解能力を超えて過剰生産されるか、またはプロテアソーム機能自体が損なわれると、ミスフォールドタンパク質とその凝集体は、選択的に媒介され主にＫ－６３様式で結合したポリユビキチン鎖によってユビキチン化し、ユビキチン化タンパク質およびそれらの凝集体はヒストンデアセチラーゼ６（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ６，ＨＤＡＣ６）（微小管関連α－チューブリンデアセチラーゼ）と相互作用し、微小管に沿ってＨＤＡＣ６によって媒介されるダイニンモーターの逆行性輸送が、微小管組織の中心付近にある封入タンパク質凝集体に到達し、このプロセスはタンパク質凝集体経路と呼ばれる。研究によると、タンパク質凝集体の形成は、対応する疾患に対する保護メカニズムである可能性があり、その役割は、潜在的に細胞毒性のあるミスフォールドタンパク質とその凝集体を動員してタンパク質凝集体を形成し、細胞毒性効果を軽減することである可能性がある。

【0004】

アルツハイマー病とタンパク質凝集体 アルツハイマー病は、広範な細胞外Ａβプラークと細胞内ニューロン線維もつれの形成によって特徴付けられる（Ｂｒａａｋ Ｈ、Ｂｒａａｋ Ｅ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ、１９９８、５３：１２７－１４０）。多くの研究結果は、アルツハイマー病と凝集体経路との間に一定の関連性があることを示している。

【0005】

パーキンソン病は、ドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失とレビー小体の出現を主な特徴とする一般的な神経変性疾患である（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ＭＧ，Ｓｃｈｍｉｄｔ ＭＬ，Ｌｅｅ ＶＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８８（６６４５）：８３９－８４０）。この疾患は、封入体の形成に関連している。散発性パーキンソン病のレビー小体の主要なタンパク質成分はα－シヌクレインである。

【0006】

ポリグルタミン病は、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症３型、歯状核赤核球淡蒼球ルイ体萎縮症など、グルタミンをコードするＣＡＧ配列の異常な反復によって引き起こされる遅発性の進行性の神経変性疾患である。ハンチントン病では、ハンチントンタンパク質のエクソン１のポリグルタミン分岐が３７個の中断されていないグルタミンを超えると疾患を引き起こす。

【0007】

筋萎縮性側索硬化症患者の主な病理学的特徴は、ブニナ小体、ｓｋｅｉｎ様封入体、レビー小体様封入体の形成であり（Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ，Ｔａｋａｔａｍａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ，２０１１，３０２（１／２）：１４－１８）、その具体的な形成メカニズムはまだ不明である。

【0008】

さらに、以下の疾患は、以下のミスフォールド／ミスコンフォメーション／異常に凝集したタンパク質に関連していることが文献で報告されている：嚢胞性線維症と嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ， ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、肺気腫脹および肝障害とα１－アンチトリプシン（α１－ａｎｔｉｔｒｙｓｐｉｎ）、パーキンソン病とパーキンタンパク質、白内障とクリスタリン（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）、家族性アミロイドーシスとトランスサイレチン（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、短鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＳＣＡＤ）欠損症と短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼバリアント（ＳＣＡＤ ｖａｒｉａｎｔ）、家族性高コレステロール血症と低密度リポタンパク質受容体（Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ハンチントンとハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症とニューロフィラメントタンパク質（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症と末梢タンパク質（ペリフェリン，Ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）、運動ニューロン疾患とα－インターネキシン（α－Ｉｎｔｅｒｎｅｘｉｎ）、糖尿病と膵島アミロイドポリペプチド（Ｉｓｌｅｔ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、透析関連アミロイドーシスとβ２－ミクログロブリン（β２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、アミロイドーシスと血清アミロイドＡタンパク質（Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、アミロイドーシスと免疫グロブリン軽鎖（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎｓ）、アミロイドーシス関連ヒト疾患とヒトリゾチーム（Ｈｕｍａｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、アミロイドーシスとα－ラクトアルブミン（α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、アミロイドーシスとアポリポプロテインＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ）、アミロイドーシスとアポリポプロテインＪ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ）。

【0009】

現在、ミスフォールドタンパク質のリフォールディングまたはプロテアソーム分解を促進することは、依然として神経変性疾患の治療に適した方法であり、神経変性疾患の臨床治療に効果的な方法を提供する関連薬を見つける必要がある。

【発明の概要】

【0010】

本発明は研究によって、プラスミノーゲンがアルツハイマー病患者の記憶機能の回復を促進し、認知能力を改善し、アルツハイマー病の様々な臨床症状及び徴候を有意に軽減及び緩和し、アルツハイマー病を予防及び治療できることを発見した。

【0011】

具体的には、本発明は下記のことに係る。

【0012】

１、一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物を被験者に投与することを含む、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する方法に関する。

【0013】

一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物の、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する薬剤の調製における使用に関する。

【0014】

一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物を含む、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する薬剤または医薬組成物に関する。

【0015】

２、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、項１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0016】

３、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、項１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0017】

４、前記化合物が、ヒトアミロイドＡβ４０、ヒトアミロイドＡβ４２、α－シヌクレイン、Ｔａｕタンパク質、ＳＯＤ－１タンパク質、ポリグルタミン、ニューロセリンプロテアーゼ阻害剤（Ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ，ＮＳＰ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ，ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、α１－アンチトリプシン（α１－ａｎｔｉｔｒｙｓｐｉｎ）、パーキンタンパク質、クリスタリン（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）、トランスサイレチン（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、短鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ変異体（ＳＣＡＤ ｖａｒｉａｎｔ）、低密度リポタンパク質受容体（Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、ニューロフィラメントタンパク質（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、末梢タンパク質（Ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）、α－インターネキシン（α－Ｉｎｔｅｒｎｅｘｉｎ）、膵島アミロイドポリペプチド（Ｉｓｌｅｔ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、β２－ミクログロブリン（β２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、血清アミロイドＡタンパク質（Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、免疫グロブリン軽鎖（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎｓ）、ヒトリゾチーム（Ｈｕｍａｎ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、プロサイモシンα（Ｐｒｏｔｈｙｍｏｓｉｎ α）、アポリポプロテインＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ）、及びアポリポプロテインＪ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ）から選択される１つまたは複数のミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する、項１～３のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0018】

一部の実施形態では、前記化合物は、脳組織中の、ヒトアミロイドＡβ４０、ヒトアミロイドＡβ４２、α－シヌクレイン、Ｔａｕタンパク質、ＳＯＤ－１タンパク質およびポリグルタミンからなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質の分解を促進する。

【0019】

５、前記化合物が成熟ＢＤＮＦへのＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進するか、または成熟ＮＧＦへのＰｒｏ－ＮＧＦの切断を促進する、項１～３のいずれか一項記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。一部の実施形態では、前記化合物は成熟ＢＤＮＦへの脳組織のＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進するか、または成熟ＮＧＦへの脳組織のＰｒｏ－ＮＧＦの切断を促進する。

【0020】

６、前記化合物がプラスミノーゲンである、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0021】

７、前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0022】

８、前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0023】

９、前記プラスミノーゲンが、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0024】

１０、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択されるものである、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0025】

１１、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0026】

１２、前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、項１～１１のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0027】

１３、前記他の治療方法が、細胞療法（幹細胞療法を含む）、支持療法、及び物理的療法を含む、項１２に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0028】

１４、前記１つまたは複数の他の薬剤が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、またはパーキンソン病の治療のための薬剤である、項１２に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0029】

１５、前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）、及び筋肉内に投与される、項１～１４のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。

【0030】

また、本発明は下記のことに係る。
１、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物を被験者に投与することを含む、ミスフォールドタンパク質によって引き起こされる疾患（まとめてミスフォールドタンパク質疾患とも呼ばれる）を予防または治療する方法。
２、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、項１に記載の方法。
３、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、項１に記載の方法。
４、前記ミスフォールドタンパク質によって引き起こされる疾患（まとめてミスフォールドタンパク質疾患とも呼ばれる）が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症およびポリグルタミン病、ゲルストマン症候群、びまん性または致命的な家族性不眠症、クールー病、嚢胞性線維症、肝障害、白内障、家族性アミロイドーシス、短鎖アシル－ＣｏＡ脱水素酵素（ＳＣＡＤ）欠損症、家族性高コレステロール血症、運動ニューロン疾患、糖尿病、透析関連アミロイドーシス、およびアミロイドーシス関連のヒト疾患を含む、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５、前記ポリグルタミン病が、ハンチントン病、３型脊髄小脳失調症、及び歯状赤血球症レビー小体萎縮症を含む、項１～３のいずれか一項記載の方法。
６、前記化合物がプラスミノーゲンである、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
７、前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
８、前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
９、前記プラスミノーゲンが、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
１０、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択されるものである、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
１１、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
１２、前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３、前記他の治療方法が、細胞療法（幹細胞療法を含む）、支持療法、及び物理的療法を含む、項１２に記載の方法。
１４、前記他の薬剤が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、またはハンチントン病の治療のためのその他の薬剤である、項１２に記載の方法。
１５、前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）、及び筋肉内に投与される、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【0031】

本願の上記いずれか１つの実施形態において、前記プラスミノゲンが配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有し得る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換され、かつ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質である。

【0032】

一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲンフラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。

【0033】

一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。

【0034】

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、前述の方法で使用するプラスミノーゲンとを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、（ｉ）前述の方法で使用するプラスミノーゲン、及び（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための部材（ｍｅａｎｓ）を含む、予防または治療キットであり得る。いくつかの実施形態では、前記部材は注射器またはバイアルである。いくつかの実施形態では、前記キットは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するためのラベルまたはプロトコルをさらに含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、前記製品は、ラベルを含む容器と、（ｉ）前述の方法で使用するためのプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲンを含む医薬組成物とを含み、前記ラベルは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する。

【0036】

いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む１つまたは複数の追加の部材または容器をさらに含む。

【0037】

前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所にて投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下投与によってプラスミノーゲンを投与することで治療する。前記方法のいくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ^２、１～２００ｍｇ／ｃｍ^２、１～１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与し、好ましくは一回以上繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。

【0038】

本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】図１Ａ～Ｄは、マウスの脳ホモジネートにおける組み換えヒトα－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図、Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれα－シヌクレイン、重合体ａ、重合体ｂのバンドスキャンの定量分析結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ、ｂの量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ及びｂの量は溶媒対照群よりも有意に低かった（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、組み換えヒトα－シヌクレイン及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。

【図2】図２Ａ～Ｃは、マウスの脳ホモジネート中の組換えヒトα-シヌクレインに対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。Ａはウェスタンブロット図、Ｂ及びＣはそれぞれα－シヌクレイン及び重合体のバンドスキャンの定量分析結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量は溶媒対照群よりも有意に低かった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、組み換えヒトα－シヌクレイン及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。

【図3】図３Ａ～Ｄは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃはプラスミノーゲン投与群、Ｄは平均光学密度の定量解析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの黒質には少量のα－シヌクレインしかなく、溶媒群のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は、ブランク対照群のマウスよりも有意に高かく（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は溶媒群よりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα－シヌクレインの発現を低下させ、神経損傷変性を改善できることを示している。

【図4】図４Ａ～Ｂは、ＰＢＳ緩衝系において、ヒトアミロイドＡβ４０に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、ＢはインビトロでのＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、溶媒対照群のＡβ４０量を１００％として定義し、変化がなく、プラスミノーゲン投与群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、プラスミノーゲン＋ｔＰＡ群では、すなわちプラスミノーゲンとｔＰＡを同時に添加した場合、Ａβ４０のインビトロ分解は明らかであり、溶媒対照群と比較して有意な差があった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンがＰＢＳ緩衝系でヒトアミロイドＡβ４０の分解を促進できることを示している。

【図5】図５Ａ～Ｂは、ウサギ脳脊髄液中のヒトアミロイドＡβ４０に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の図であり、ＢはＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、溶媒対照群のＡβ４０の量を１００％と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン投与群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にＡβ４０が部分的に分解され、７４．８１％に分解された。これは、プラスミノーゲンがウサギの脳脊髄液中のヒトアミロイドＡβ４０の分解を促進できることを示している。

【図6】図６Ａ～Ｂは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおけるヒトアミロイドＡβ４０に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の図であり、ＢはインビトロでのＡβ４０溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のアミロイドＡβ４０の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を示す）；正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のヒトアミロイドＡβ４０の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（Ｐ＝０．００１）。これは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲンがヒトアミロイドＡβ４０の分解を効果的に促進できることを示している。

【図7】図７Ａ～Ｂは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおけるヒトアミロイドＡβ４２に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥであり、ＢはインビトロでのＡβ４２及びその重合体の溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のヒトアミロイドＡβ４２の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その重合体ａ、ｂ、及びｃの量はいずれも溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０．０５；＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）；正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のアミロイドＡβ４２の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ、ｂ、及びｃの量はいずれも溶媒群より低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲンがヒトアミロイドＡβ４２及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。

【図8】図８Ａ～Ｂは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおけるヒトアミロイドＡβ４２に対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。Ａはウェスタンブロット図であり、ＢはインビトロでのＡβ４２及びその重合体の溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のヒトアミロイドＡβ４２の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その重合体の量はいずれも溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）；正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のアミロイドＡβ４２の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体の量はいずれも溶媒群より低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、アルツハイマー病モデル及び正常マウス脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲンがヒトアミロイドＡβ４２及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。

【図9】図９Ａ～Ｂは、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロット画像であり、ＢはＴａｕタンパク質バンドの光学密度の定量分析結果である。その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜００５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。

【図10】図１０Ａ～Ｂは、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートにおけるＴａｕタンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロット画像であり、ＢはＴａｕタンパク質バンドの光学密度の定量分析結果である。その結果、アルツハイマーマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＴａｕタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は統計的に有意であった（＊はＰ＜００５、＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートのＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示唆している。

【図11】図１１は、プラスミノーゲンを２８日間投与したアルツハイマー病マウスの脳組織における異なる分子量のＴａｕタンパク質のウエスタンブロット検出結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートに一定のレベルの異なる分子量のＴａｕタンパク質があり、投与群のマウスの脳組織における各分子量のＴａｕタンパク質及び総Ｔａｕタンパク質のレベルは溶媒群のマウスよりも有意に低く、２つの群の３５ｋｄ、３５～４０ｋｄ、４０ｋｄ、５４ｋｄの分子量Ｔａｕタンパク質レベル及び総Ｔａｕタンパク質レベルの統計分析Ｐ値は、０．１７４、０．０４０６、０．０５２、０．０６７、及び０．０５５であった。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマーモデルマウスの脳組織においてＴａｕタンパク質の分解を促進できることを示している。

【図12】図１２Ａ～Ｂは、正常マウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像であり、ＢはＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるバンドの定量解析結果である。その結果、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。

【図13】図１３Ａ～Ｂは、正常マウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ-ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図であり、Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ-ＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。

【図14】図１４Ａ～Ｂは、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネート中の組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像、ＢはＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの定量分析の結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。

【図15】図１５Ａ～Ｃは、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ-ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ-ＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウェスタンブロットにおけるＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差が有意であり（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。

【図16】図１６Ａ～Ｂは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像であり、ＢはＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるＰｒｏ－ＢＤＮＦバンドの定量解析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。

【図17】図１７Ａ～Ｃは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ-ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図であり、Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ-ＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウェスタンブロットにおけるＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。

【図18】図１８Ａ～Ｄは、プラスミノーゲンを３５日間投与した統合失調症モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの海馬が一定レベルのＢＤＮＦを発現し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦのレベルが向上し、プラスミノーゲン投与群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現レベルは溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意に近かった（Ｐ＝０.０９５）。これは、プラスミノーゲンが統合失調症モデルマウスの海馬でＢＤＮＦの発現レベルを向上させることができることを示唆している。

【図19】図１９Ａ～Ｄは、プラスミノーゲンを２８日間投与したアルツハイマー病モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒群であり、Ｃは投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの海馬が一定レベルのＢＤＮＦを発現し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は、ブランク対照群よりも有意に低く、投与群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦの発現は溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でＢＤＮＦの発現を促進できることを示している。

【図20】図２０Ａ～Ｂは、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスの代表的な脳組織ウエスタンブロット検出結果及びＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦの光学密度（ＯＤ）比の定量分析の結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳組織には一定のＮＧＦ／ＰｒｏＮＧＦ比があり、投与群のマウスの脳組織のＮＧＦ／ＰｒｏＮＧＦ比は溶媒群マウスより有意に高く、統計学的差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、ＳＭＡモデルマウスの脳組織においてＰｒｏＮＧＦからＮＧＦへの変換を促進し、成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。

【図21】図２１Ａ～Ｃは、正常マウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウェスタンブロットの画像であり、ＢはウェスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウエスタンブロットにおけるＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、正常マウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。

【図22】図２２Ａ～Ｃは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウェスタンブロットの画像であり、ＢはウェスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウエスタンブロットにおけるＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。

【図23】図２３Ａ～Ｂは、正常マウスの脳ホモジネートにおける組換えＳＯＤ－１タンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、ＢはインビトロでのＳＯＤ－１タンパク質溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、正常マウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＳＯＤ－１量が低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ＳＯＤ－１タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。

【図24】図２４Ａ～Ｂは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脳ホモジネートにおける組換えＳＯＤ－１タンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、ＢはインビトロでのＳＯＤ－１タンパク質溶解の定量的スキャン分析の結果である。その結果、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＳＯＤ－１タンパク質の量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、ＡＬＳモデルマウスの脳ホモジネートにおいて、ＳＯＤ－１タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。

【図25】図２５Ａ～Ｂは、正常マウスの脳ホモジネートにおける組換えＳＯＤ－１タンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウェスタンブロットの画像であり、ＢはウェスタンブロットにおけるＳＯＤ－１タンパク質のバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、正常マウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＳＯＤ－１タンパク質の量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ＳＯＤ－１タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。

【図26】図２６Ａ～Ｂは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脳ホモジネートにおける組換えＳＯＤ－１タンパク質に対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。その結果、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のＳＯＤ－１タンパク質の量が有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスの脳ホモジネートにおいて、ＳＯＤ－１タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。

【発明の詳細な説明】

【0040】

「タンパク質フォールディング」とは、リボソーム上での合成と同時にまたは合成後に、熱力学および速度論の原理に従って、または分子シャペロンの補助で、ポリペプチド鎖がコイル状に巻かれ、特定の機能的な三次元構造または立体配座を形成するプロセスである。正しくフォールディングされたタンパク質は正常に機能するが、ミスフォールディングされたタンパク質は疾患を引き起こす可能性がある。

【0041】

線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線溶系とも呼ばれ、線維素溶解（線溶）の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（ＰＬＧ）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、及び線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されて線維素溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、及びα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合することによってｔ－ＰＡを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンが挙げられる。

【0042】

本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。

【0043】

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。

【0044】

本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質をカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。

【0045】

本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。

【0046】

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「類縁体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を与える化合物を含む。

【0047】

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン変異体及び類縁体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。

【0048】

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類縁体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ与えるかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、ザイモグラフィー（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）及びＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５-３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９-７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２-８。

【0049】

本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノーゲン活性化経路の成分」はプラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト全長プラスミノーゲン、またはそのプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した保存的突然変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるようなアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲンの保存的置換変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンまたはその保存的変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンまたはその保存的変異体である。

【0050】

「プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ、サルプラーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、及びスタフィロキナーゼが挙げられる。

【0051】

本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗薬」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレートするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメイン及び／または活性ドメインをブロックする化合物である。

【0052】

プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰｓ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡｓ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡｓ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。

【0053】

プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡｓによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって連結された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたプラスミノゲンは３８ｋＤａのフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン(Angiostatin)と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。

【0054】

プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらの成分はラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含むいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解する。そのため、プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子であることを提唱することがある。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。インビトロで、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。

【0055】

「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。

【0056】

「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）として計算すれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。

【0057】

Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは天然のフルサイズのヒトプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。生体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノーゲンの７６－７７番目のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２－Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有しない（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）。δ－プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許出願において、マイクロプラスミノーゲンの配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。

【0058】

全長プラスミノーゲンの構造は、Ａｉｓｉｎａらの論文にも記載されている（Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５）。Ａｉｓｉｎａらの前記文章によれば、プラスミノーゲンにはＫｒｉｎｇｌｅ １、２、３、４、５ドメインとセリンプロテアーゼドメイン（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）が含まれ、Ｋｒｉｎｇｌｅｓは、プラスミノーゲンが低分子量及び高分子量のリガンドに結合する役割（すなわち、リジン結合活性）を担っており、その結果、プラスミノーゲンがよりオープンな構成に変換され、より活性化しやすくなり、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、残基Ｖａｌ５６２－Ａｓｎ７９１であり、ｔＰＡとＵＰＡはプラスミノーゲンのＡｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２位活性化結合を特異的に切断し、それによってプラスミノーゲンがプラスミンを形成できる。したがって、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を付与する領域である。

【0059】

本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。

【0060】

本願において、前記プラスミノーゲンの「不足」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。前記プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。

【0061】

当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションをとるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションに維持する重要なエピトープを含み、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。

【0062】

「プラスミノーゲン活性フラグメント」とは、基質のターゲット配列中のリジンに結合する活性（リジン結合活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解機能を発揮する活性（タンパク質加水分解活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解活性とリジン結合活性との両方を有するフラグメントを指す。本発明のプラスミノーゲンに関する技術構成は、プラスミノーゲンをプラスミノーゲン活性フラグメントに置き換える技術構成を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むか、またはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインからなる。いくつかの実施形態では、、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、配列１４を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインもしくはその保存的置換変異体を含むか、またはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインまたはその保存的置換変異体からなる。いくつかの実施形態では、本発明のプラスミノーゲンは、上記のプラスミノーゲンの活性フラグメントを含むタンパク質を含む。

【0063】

現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は組織プラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）を含む。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。

【0064】

「オーソログまたはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含み、直系遺伝子ともいう。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンのオーソログまたはオルソログを含む。

【0065】

「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの所定のアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸で親タンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然または親タンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。

【0066】

「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になるまで精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造され、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。

【0067】

用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するあるいは有しない）を含む融合物；等々である。

【0068】

参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的としたアライメントは本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。

【0069】

ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのある％のアミノ酸配列同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００

【0070】

ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムによって得られるものである。

【0071】

本文において使用されているように、用語の「治療」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状の発生、発症を完全または一部予防すること、あるいは疾患及び／またはその症状を一部または完全軽減すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状の減退または消失を引き起こすこと。

【0072】

用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。

【0073】

「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。

【0074】

本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。

【0075】

標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に連結させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。

【0076】

適切な発現ベクターは通常宿主体内において遊離体または宿主染色体ＤＮＡの組み込む部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。

【0077】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）はターゲット抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β－ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じてオペレーター遺伝子配列において、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列などを有してもよい。

【0078】

その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターには特にアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素由来のプロモーターを含む。

【0079】

微生物以外に、哺乳動物細胞（例えばインビトロ細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明の抗－Ｔａｕ抗体（例えばかかる目的抗－Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）の発現及び生成に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。

【0080】

一旦（化学または組み換え的に）合成されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、かかる抗体以外の大分子などである。

【0081】

薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ-クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0082】

本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。

【0083】

本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0084】

体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。

【0085】

本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成することであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。

【0086】

投与及び使用量
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。

【0087】

胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。

【0088】

医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。

【0089】

製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。

【実施例0090】

以下の実施例で使用されるヒトプラスミノーゲンは、ヒトドナーの血漿に由来し、以下の文書：ＫｅｎｎｅｔｈＣ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｌｏｕｉｓ Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｄａｖｉｄ Ｅｌｗｙｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｒｔｈｅｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５，２４０（１）：５４１－５５０；Ｓｕｍｍａｒｉａ Ｌ，Ｓｐｉｔｚ Ｆ，Ａｒｚａｄｏｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｇｌｕ－ ａｎｄ Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７６ Ｊｕｎ ２５；２５１（１２）：３６９３－９；ＨＡＧＡＮ ＪＪ，ＡＢＬＯＮＤＩ ＦＢ，ＤＥ ＲＥＮＺＯ ＥＣ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９６０ Ａｐｒ；２３５：１００５－１０に記載された方法に基づき、プロセスを最適化し、ヒトドナー血漿から精製して得られた。ここでプラスミノーゲン単体は９８％を上回った。

【実施例0091】

実施例１は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトα－シヌクレインの分解を促進することに関するものである。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン）溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した^［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清（脳組織ホモジネート）を取り、ＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ α－シヌクレイン溶液（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７８４０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１.５ｍＬ α－シヌクレイン溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
パーキンソン病は、現在、中脳黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの欠如及びレビー小体の出現によって引き起こされると考えられている。α－シヌクレインは、１４０アミノ酸残基から構成されるニューロンタンパク質であり、神経細胞の損傷を引き起こし、中枢神経系の神経変性のプロセスに関与する可能性がある。研究では、神経細胞のレビー小体と神経シナプス内で凝集したα－シヌクレインは、パーキンソン病における脳病変の特徴であることが明らかになった^［２］。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ、ｂの量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ及びｂの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図１）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα－シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。