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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024175019
(43)【公開日】2024-12-17
(54)【発明の名称】ノロウイルス結合ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20241210BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241210BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241210BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241210BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241210BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20241210BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241210BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C12N15/11 Z
C12M1/34 A
G01N33/569 L
G01N33/53 D
C07K7/06
C07K16/10
C12N15/13
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024158747
(22)【出願日】2024-09-13
(62)【分割の表示】P 2020093741の分割
【原出願日】2020-05-28
(31)【優先権主張番号】P 2019100756
(32)【優先日】2019-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 淑貴
(72)【発明者】
【氏名】森本 拓也
(72)【発明者】
【氏名】熊地 重文
(72)【発明者】
【氏名】根本 直人
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ノロウイルスの検出や感染制御に有用な、ノロウイルスに特異的に結合するペプチドを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２８、２１及び１４から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
【請求項2】
請求項１の配列番号２８、２１及び１４から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
【請求項3】
配列番号２８、２１及び１４から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端にシステイン残基が付加したものである、請求項２記載のノロウイルス結合ペプチド。
【請求項4】
配列番号２８、２１及び１４から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端に付加したシステイン残基がジスルフィド結合し環を形成してなる、請求項３記載のノロウイルス結合ペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項記載のペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に１～２０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項記載のノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項記載のノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ノロウイルスに親和性を有するノロウイルス結合ペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
ノロウイルスは従来ＳＲＳＶ（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉ
ｒｕｓ：小型球形ウイルス）と呼ばれており、また、ＮＬＶ（Ｎｏｒｗａｌｋ－ｌｉｋｅ
ｖｉｒｕｓ：ノーウォーク関連ウイルス）ともいわれるウイルスであり、その遺伝子型
によりＧＩ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩ）からＧＶ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ Ｖ）まで５つに分
類され、このうちヒトに感染するのはＧＩ，ＧＩＩ，ＧＩＶである。ノロウイルスはヒト
の腸管細胞内で増殖し、下痢、嘔吐、腹痛、吐き気、発熱等の症状を伴う食中毒の原因と
なるウイルスであり、主な感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、
近年ではウイルス保菌者の排泄物等によるヒトからヒトへの感染も多くなっている。
ｒｕｓ：小型球形ウイルス）と呼ばれており、また、ＮＬＶ（Ｎｏｒｗａｌｋ－ｌｉｋｅ
ｖｉｒｕｓ：ノーウォーク関連ウイルス）ともいわれるウイルスであり、その遺伝子型
によりＧＩ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩ）からＧＶ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ Ｖ）まで５つに分
類され、このうちヒトに感染するのはＧＩ，ＧＩＩ，ＧＩＶである。ノロウイルスはヒト
の腸管細胞内で増殖し、下痢、嘔吐、腹痛、吐き気、発熱等の症状を伴う食中毒の原因と
なるウイルスであり、主な感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、
近年ではウイルス保菌者の排泄物等によるヒトからヒトへの感染も多くなっている。
【0003】
現在、ノロウイルスの検出には、電子顕微鏡による観察の他、抗体を用いる方法、ノロ
ウイルスＲＮＡの増幅産物量を測定する方法が存在する。また、最近では、ノロウイルス
に対して親和性を有し、ノロウイルスの検出に有用な１８アミノ酸からなるポリペプチド
も見出されているが、その結合力はこれまでに報告されているノロウイルス抗体と比べて
低いことが報告されている（非特許文献１）。
ウイルスＲＮＡの増幅産物量を測定する方法が存在する。また、最近では、ノロウイルス
に対して親和性を有し、ノロウイルスの検出に有用な１８アミノ酸からなるポリペプチド
も見出されているが、その結合力はこれまでに報告されているノロウイルス抗体と比べて
低いことが報告されている（非特許文献１）。
【0004】
しかしながら、ＲＮＡを検出する方法は逆転写や増幅工程が必要であり、操作が煩雑で
時間とコストがかかる。また、抗体においては、特異性が低い場合があること、動物や培
養細胞を用いて作製・生産するために、品質が安定しない、コストがかかる、という問題
が存在する。
したがって、より有効で、簡便なノロウイルスの特異的検出法、並びにノロウイルス感
染の予防及び治療法の開発が求められている。
時間とコストがかかる。また、抗体においては、特異性が低い場合があること、動物や培
養細胞を用いて作製・生産するために、品質が安定しない、コストがかかる、という問題
が存在する。
したがって、より有効で、簡便なノロウイルスの特異的検出法、並びにノロウイルス感
染の予防及び治療法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｈｙｅ Ｊｉｎ Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ８７（２０１７）１６４－１７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ノロウイルスの特異的検出や感染制御に有用な、ノロウイルスに特異的に結
合するペプチドを提供することに関する。
合するペプチドを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の発明者は、１０１４オーダーのｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリを作製
し、これからｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、ノロウイルスと特異的に結合するペプチ
ドを取得することに成功し、本発明を完成した。
し、これからｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、ノロウイルスと特異的に結合するペプチ
ドを取得することに成功し、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明は以下の１）～４）に係るものである。
１）配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス
結合ペプチド。
２）配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のい
ずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペ
プチド。
３）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
４）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット
。
１）配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス
結合ペプチド。
２）配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のい
ずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペ
プチド。
３）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
４）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット
。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ノロウイルスと親和性が高いノロウイルス結合ペプチドが提供される
。本発明のペプチドによれば、ノロウイルスを特異的に高感度で検出することができ、ま
たノロウイルスのヒトへの感染を制御できると考えられる。
。本発明のペプチドによれば、ノロウイルスを特異的に高感度で検出することができ、ま
たノロウイルスのヒトへの感染を制御できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＶＬＰｓの作製フローを示す模式図。
【図2】ノロウイルス結合ペプチドのスクリーニングの概略を示す模式図。
【図3】ｍＲＮＡ－リンカー連結体を示す模式図（Ａ：セレクション用、Ｂ：解析用）。
【図4】ＥＬＩＳＡによる相互作用の評価結果。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明のノロウイルス結合ペプチドは、配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのア
ミノ酸配列からなる、６アミノ酸で構成されるペプチドである（表１６）。
当該ペプチドは、１０１４オーダーのｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリからｃＤ
ＮＡディスプレイ法を用いて、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてスクリ
ーニングされたものであり、ノロウイルスと特異的に結合する能力を持ったノロウイルス
結合のペプチドアプタマーである。当該ペプチドは、疎水性アミノ酸が３４．４％、親水
性アミノ酸が６５．６％からなるライブラリ配列から構成された６アミノ酸である。本発
明のノロウイルス結合ペプチドは、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてス
クリーニングされたノロウイルス結合ペプチドのうち出現頻度が高いものであり（実施例
において出現頻度６回以上）、出現頻度がより高い、配列番号１～１０１（出現頻度８回
以上）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好まし
く、配列番号１～５２（出現頻度１０回以上）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列から
なるノロウイルス結合ペプチドがより好ましく、配列番号１～２８（出現頻度１２回以上
）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドがさらに好ま
しい。また、配列番号１～１２、１４～１７、１９、２１及び２８から選ばれるいずれか
のアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドがさらに好ましく、配列番号１、４、
１４、１５、１７、２１及び２８から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイ
ルス結合ペプチドがよりさらに好ましい。
ミノ酸配列からなる、６アミノ酸で構成されるペプチドである（表１６）。
当該ペプチドは、１０１４オーダーのｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリからｃＤ
ＮＡディスプレイ法を用いて、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてスクリ
ーニングされたものであり、ノロウイルスと特異的に結合する能力を持ったノロウイルス
結合のペプチドアプタマーである。当該ペプチドは、疎水性アミノ酸が３４．４％、親水
性アミノ酸が６５．６％からなるライブラリ配列から構成された６アミノ酸である。本発
明のノロウイルス結合ペプチドは、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてス
クリーニングされたノロウイルス結合ペプチドのうち出現頻度が高いものであり（実施例
において出現頻度６回以上）、出現頻度がより高い、配列番号１～１０１（出現頻度８回
以上）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好まし
く、配列番号１～５２（出現頻度１０回以上）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列から
なるノロウイルス結合ペプチドがより好ましく、配列番号１～２８（出現頻度１２回以上
）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドがさらに好ま
しい。また、配列番号１～１２、１４～１７、１９、２１及び２８から選ばれるいずれか
のアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドがさらに好ましく、配列番号１、４、
１４、１５、１７、２１及び２８から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイ
ルス結合ペプチドがよりさらに好ましい。
【0012】
本発明のペプチドには、一態様として、配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのア
ミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸
配列からなるものが包含される。そして、両末端にシステイン残基を有するペプチドは、
当該システイン残基がジスルフィド結合し、環状ペプチドを形成することができる。
ミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸
配列からなるものが包含される。そして、両末端にシステイン残基を有するペプチドは、
当該システイン残基がジスルフィド結合し、環状ペプチドを形成することができる。
【0013】
また、本発明のペプチドには、別の一態様として、ノロウイルスとの特異的結合能力が
保持される限りにおいて、上記の配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配
列、又は当該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付
加したアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれか又は両方に、さらに
１～２０個の任意のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列からなるものが包含される。
保持される限りにおいて、上記の配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配
列、又は当該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付
加したアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれか又は両方に、さらに
１～２０個の任意のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列からなるものが包含される。
【0014】
ヒトに感染するノロウイルスに属するウイルスは、現在、Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ Ｉ（Ｇ
Ｉ）とＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＩ（ＧＩＩ）、及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＶ（ＧＩＶ）
の３つの遺伝子群に分類され、感染が報告される事例の９割以上はＧＩＩ群である。また
、各遺伝子型に対応した血清型があると考えられている。本発明においてノロウイルスに
は、斯かるノロウイルスに属するウイルスが包含される。また、ノロウイルスゲノムの構
造蛋白質領域をバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞で発現させると、ウイルス粒子と
酷似した中空ウイルス粒子（ＶＬＰｓ）を作出できる。ＶＬＰｓは構造がノロウイルスそ
のものであり、ウイルス粒子と同等の抗原性を有するが、内部にゲノムＲＮＡを持たず、
中空で感染性はない。したがって、本発明においてノロウイルスには、斯かるＶＬＰｓも
包含される。
ＶＬＰｓとしては、ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ４４７４
５６）、ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＪＸ４５９９０８．１）
、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＦ００６２６５），ＧＩＩ．２ Ｅ
ｈｉｍｅ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＬＣ１４５８０８）、ＧＩＩ．１７ Ｋａｗａｓａ
ｋｉ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ９８３２１８）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株
（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ１９６２８６．１）等のノロウイルスゲノムを用いて作成
したＶＬＰｓが挙げられる。
Ｉ）とＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＩ（ＧＩＩ）、及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＶ（ＧＩＶ）
の３つの遺伝子群に分類され、感染が報告される事例の９割以上はＧＩＩ群である。また
、各遺伝子型に対応した血清型があると考えられている。本発明においてノロウイルスに
は、斯かるノロウイルスに属するウイルスが包含される。また、ノロウイルスゲノムの構
造蛋白質領域をバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞で発現させると、ウイルス粒子と
酷似した中空ウイルス粒子（ＶＬＰｓ）を作出できる。ＶＬＰｓは構造がノロウイルスそ
のものであり、ウイルス粒子と同等の抗原性を有するが、内部にゲノムＲＮＡを持たず、
中空で感染性はない。したがって、本発明においてノロウイルスには、斯かるＶＬＰｓも
包含される。
ＶＬＰｓとしては、ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ４４７４
５６）、ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＪＸ４５９９０８．１）
、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＦ００６２６５），ＧＩＩ．２ Ｅ
ｈｉｍｅ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＬＣ１４５８０８）、ＧＩＩ．１７ Ｋａｗａｓａ
ｋｉ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ９８３２１８）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株
（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ１９６２８６．１）等のノロウイルスゲノムを用いて作成
したＶＬＰｓが挙げられる。
【0015】
本発明のペプチドは、ノロウイルス（中空ウイルス粒子；ＶＬＰｓ）を標的分子として
、当該分野で公知の試験管内進化法、例えばｃＤＮＡディスプレイ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ｖｏｌ３７, Ｎｏ.１６, ｅ１０８（２００９））を用い
て作製することができる。すなわち、ｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリ（ペプチド
－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ結合体のライブラリ）を作製し、これを、ｃＤＮＡディ
スプレイ法を用いて試験管内選別することにより作製することができる。
具体的には、以下のａ）～ｃ）の工程により製造できる（図２参照）。
ａ）所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片（コンストラクト）の
準備工程
ｂ）前記工程で準備されたコンストラクトを使用し、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いて
ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをインビトロで作製するｃＤＮＡディスプレイ
作製工程
ｃ）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイをＶＬＰｓと混合させ、ＶＬＰｓと結合
したｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイをスクリーニン
グする選択工程
、当該分野で公知の試験管内進化法、例えばｃＤＮＡディスプレイ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ｖｏｌ３７, Ｎｏ.１６, ｅ１０８（２００９））を用い
て作製することができる。すなわち、ｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリ（ペプチド
－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ結合体のライブラリ）を作製し、これを、ｃＤＮＡディ
スプレイ法を用いて試験管内選別することにより作製することができる。
具体的には、以下のａ）～ｃ）の工程により製造できる（図２参照）。
ａ）所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片（コンストラクト）の
準備工程
ｂ）前記工程で準備されたコンストラクトを使用し、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いて
ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをインビトロで作製するｃＤＮＡディスプレイ
作製工程
ｃ）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイをＶＬＰｓと混合させ、ＶＬＰｓと結合
したｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイをスクリーニン
グする選択工程
【0016】
ａ．コンストラクトの準備工程
ノロウイルス結合ペプチドの作製用コンストラクトとして、５’側から３’側に向かっ
て、プライマー領域と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域
とを含む、所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片が構築される。こ
こで、プライマー領域として使用するＤＮＡ配列は、市販されている一般的なものを使用
することができる。また、プロモーター領域としては、Ｔ７、ＳＰ６等を使用することが
できる。非翻訳領域としては、Ω配列等を使用することができる。
ノロウイルス結合ペプチドの作製用コンストラクトとして、５’側から３’側に向かっ
て、プライマー領域と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域
とを含む、所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片が構築される。こ
こで、プライマー領域として使用するＤＮＡ配列は、市販されている一般的なものを使用
することができる。また、プロモーター領域としては、Ｔ７、ＳＰ６等を使用することが
できる。非翻訳領域としては、Ω配列等を使用することができる。
【0017】
ランダム領域は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン
、フェニルアラニン、トリプトファンからなる疎水性アミノ酸が３４．４％、グリシン、
セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システインからなる極性ア
ミノ酸が３１．３％、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる塩基性アミノ酸が１５．
６％、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる酸性アミノ酸が６．３％となるようにＤＮ
Ａが構成されている。
、フェニルアラニン、トリプトファンからなる疎水性アミノ酸が３４．４％、グリシン、
セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システインからなる極性ア
ミノ酸が３１．３％、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる塩基性アミノ酸が１５．
６％、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる酸性アミノ酸が６．３％となるようにＤＮ
Ａが構成されている。
【0018】
ｂ．ｃＤＮＡディスプレイ作製工程
ｃＤＮＡディスプレイの作製は、図２に示すように、（ｂ１）ｍＲＮＡ調製工程と；（
ｂ２）リンカー－ｍＲＮＡ連結体形成工程と；（ｂ３）ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連
結体形成工程と；（ｂ４）粒子結合工程と；（ｂ５）ｃＤＮＡディスプレイ形成工程と；
（ｂ６）ペプチドの架橋工程と；（ｂ７）ｃＤＮＡディスプレイ遊離工程を備える。
ｃＤＮＡディスプレイの作製は、図２に示すように、（ｂ１）ｍＲＮＡ調製工程と；（
ｂ２）リンカー－ｍＲＮＡ連結体形成工程と；（ｂ３）ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連
結体形成工程と；（ｂ４）粒子結合工程と；（ｂ５）ｃＤＮＡディスプレイ形成工程と；
（ｂ６）ペプチドの架橋工程と；（ｂ７）ｃＤＮＡディスプレイ遊離工程を備える。
【0019】
（ｂ１）ｍＲＮＡ調製工程では、前記のコンストラクトから転写によってｍＲＮＡを調
製する。そして、（ｂ２）前記ｍＲＮＡ調製工程で得られたｍＲＮＡを、ピューロマイシ
ンを結合させたリンカーに結合させて、リンカー－ｍＲＮＡ連結体を形成する。
次に、（ｂ３）無細胞翻訳系により翻訳された前記ｍＲＮＡ配列に対応するアミノ酸配
列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結
体を形成する。
次いで、（ｂ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られたペプチド－リンカ
ー－ｍＲＮＡ連結体を、磁性粒子に結合させる。
続いて、（ｂ５）前記磁性粒子と結合したペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体のｍＲ
ＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを形成させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを得る
（「ｃＤＮＡディスプレイ」）。
次に、（ｂ６）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイにおけるペプチドのランダム
領域のＮ末端とＣ末端にあるシステインに対して架橋反応を施して架橋する。
次に、（ｂ７）複合体遊離工程において、前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイを
前記磁性粒子から遊離させ、必要に応じて精製が行われる。
製する。そして、（ｂ２）前記ｍＲＮＡ調製工程で得られたｍＲＮＡを、ピューロマイシ
ンを結合させたリンカーに結合させて、リンカー－ｍＲＮＡ連結体を形成する。
次に、（ｂ３）無細胞翻訳系により翻訳された前記ｍＲＮＡ配列に対応するアミノ酸配
列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結
体を形成する。
次いで、（ｂ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られたペプチド－リンカ
ー－ｍＲＮＡ連結体を、磁性粒子に結合させる。
続いて、（ｂ５）前記磁性粒子と結合したペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体のｍＲ
ＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを形成させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを得る
（「ｃＤＮＡディスプレイ」）。
次に、（ｂ６）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイにおけるペプチドのランダム
領域のＮ末端とＣ末端にあるシステインに対して架橋反応を施して架橋する。
次に、（ｂ７）複合体遊離工程において、前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイを
前記磁性粒子から遊離させ、必要に応じて精製が行われる。
【0020】
ｃ．ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイの選択工程
ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイの選択は、（ｃ１）溶液添加工程と、（ｃ２）分離
工程と；（ｃ３）回収工程とを備える。
（ｃ１）溶液添加工程では、ＶＬＰｓ溶液に、ｃＤＮＡディスプレイ含有溶液が添加さ
れる。引き続き、（ｃ２）分離工程で、ＶＬＰｓとｃＤＮＡディスプレイ溶液との混合液
を、例えば１３０，０００×ｇで５分間遠心してＶＬＰｓを沈殿させることで、ＶＬＰｓ
と結合しなかったｃＤＮＡディスプレイと分離される。その後、（ｃ３）回収工程で、Ｖ
ＬＰｓに結合したｃＤＮＡディスプレイがＶＬＰｓごと回収される。
ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイの選択は、（ｃ１）溶液添加工程と、（ｃ２）分離
工程と；（ｃ３）回収工程とを備える。
（ｃ１）溶液添加工程では、ＶＬＰｓ溶液に、ｃＤＮＡディスプレイ含有溶液が添加さ
れる。引き続き、（ｃ２）分離工程で、ＶＬＰｓとｃＤＮＡディスプレイ溶液との混合液
を、例えば１３０，０００×ｇで５分間遠心してＶＬＰｓを沈殿させることで、ＶＬＰｓ
と結合しなかったｃＤＮＡディスプレイと分離される。その後、（ｃ３）回収工程で、Ｖ
ＬＰｓに結合したｃＤＮＡディスプレイがＶＬＰｓごと回収される。
【0021】
本発明のペプチドは、以上のようにして、所定のＤＮＡライブラリから試験管内選別可
能である。
また、本発明のペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリ
ッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のペプチドの製造方法によって製造す
ることができる。
能である。
また、本発明のペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリ
ッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のペプチドの製造方法によって製造す
ることができる。
【0022】
本発明のペプチドは、ノロウイルスに特異的に結合することから、これを、ノロウイル
スを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることによって、サン
プル中にノロウイルスが存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
すなわち、例えば、ＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイにおける抗ノロウイルス抗体に代
えて、本発明のペプチドを用いて試料中のノロウイルスを検出することができる。
検出薬として用いる場合、本発明のペプチドは、検出可能に標識され得る。ペプチドの
標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素の他、放射性物質
、蛍光物質、発光物質等が用いられる。その他、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子を
用いることもできる。また、イムノアッセイでは、本発明のペプチドをビオチンで標識し
、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる
。
スを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることによって、サン
プル中にノロウイルスが存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
すなわち、例えば、ＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイにおける抗ノロウイルス抗体に代
えて、本発明のペプチドを用いて試料中のノロウイルスを検出することができる。
検出薬として用いる場合、本発明のペプチドは、検出可能に標識され得る。ペプチドの
標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素の他、放射性物質
、蛍光物質、発光物質等が用いられる。その他、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子を
用いることもできる。また、イムノアッセイでは、本発明のペプチドをビオチンで標識し
、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる
。
【0023】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測
定することができる点で好ましい。本発明のペプチドを用い、ＥＬＩＳＡ法によってノロ
ウイルスを検出する場合、例えば、固相担体にノロウイルスを固定化し、そこへ予めビオ
チン標識したペプチドを結合させる。洗浄後、アビジン修飾した酵素をビオチンに結合さ
せ、その後酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ノロウイルスを検
出することができる。または本発明のペプチドを固相化し、そこへノロウイルスを結合さ
せる。洗浄後、酵素標識した抗ノロウイルス抗体または、抗ノロウイルス抗体及び酵素標
識した二次抗体を結合させた後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する事により
、ノロウイルスを検出することが出来る。
酵素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合、p-ニトロフェニルリン酸（
ＮＰＰ）等を用いることができ、ペルオキシターゼの場合は、３、３’、５，５’－テト
ラメチルベンジジン等を用いることができる。また、固相担体としては、ポリスチレン、
ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、
セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイク
ロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる
。本発明のペプチド等の前記固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれ
らの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
定することができる点で好ましい。本発明のペプチドを用い、ＥＬＩＳＡ法によってノロ
ウイルスを検出する場合、例えば、固相担体にノロウイルスを固定化し、そこへ予めビオ
チン標識したペプチドを結合させる。洗浄後、アビジン修飾した酵素をビオチンに結合さ
せ、その後酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ノロウイルスを検
出することができる。または本発明のペプチドを固相化し、そこへノロウイルスを結合さ
せる。洗浄後、酵素標識した抗ノロウイルス抗体または、抗ノロウイルス抗体及び酵素標
識した二次抗体を結合させた後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する事により
、ノロウイルスを検出することが出来る。
酵素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合、p-ニトロフェニルリン酸（
ＮＰＰ）等を用いることができ、ペルオキシターゼの場合は、３、３’、５，５’－テト
ラメチルベンジジン等を用いることができる。また、固相担体としては、ポリスチレン、
ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、
セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイク
ロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる
。本発明のペプチド等の前記固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれ
らの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
【0024】
本発明のペプチドは、ノロウイルス検出用キットの構成成分となり得る。当該検出キッ
トは、本発明のペプチドの他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝
液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットの対象となるサンプルとしては、例えば、ノロウイルスを含むか又は含
む可能性があるものであれば特に限定されないが、例えば患者より採取された糞便や吐し
ゃ物等の臨床材料や、分離されたウイルス培養液及び、カキ等の食品や上下水道水等を挙
げることができる。
トは、本発明のペプチドの他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝
液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットの対象となるサンプルとしては、例えば、ノロウイルスを含むか又は含
む可能性があるものであれば特に限定されないが、例えば患者より採取された糞便や吐し
ゃ物等の臨床材料や、分離されたウイルス培養液及び、カキ等の食品や上下水道水等を挙
げることができる。
【0025】
また、本発明のペプチドは、ノロウイルスのカプシドタンパク質等に特異的に結合し、
ウイルスの細胞への結合を阻害することが考えられる。したがって、本発明のペプチドは
、抗ノロウイルス製剤として、またノロウイルスの予防用または治療用の医薬として利用
することも可能である。
本発明のペプチドを医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれで
もよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いるこ
とができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸
入による投与も可能である。
ウイルスの細胞への結合を阻害することが考えられる。したがって、本発明のペプチドは
、抗ノロウイルス製剤として、またノロウイルスの予防用または治療用の医薬として利用
することも可能である。
本発明のペプチドを医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれで
もよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いるこ
とができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸
入による投与も可能である。
【0026】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイル
ス結合ペプチド。
＜２＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の
いずれか又は両方にシステイン残基が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合
ペプチド。
＜３＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に
システイン残基が結合したものである、＜２＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜４＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのＮ
末端及びＣ末端に結合したシステイン残基がジスルフィド結合し環を形成してなる、＜３
＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれかのペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に
１～２０個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの
検出方法。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス
検出キット。
＜８＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１～1０
１から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス
結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜９＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１～５２
から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結
合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１０＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、１～２８から選
ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプ
チド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１１＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１～１
２、１４～１７、１９、２１及び２８から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞
～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット
。
＜１２＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１、４
、１４、１５、１７、２１及び２８から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～
＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイル
ス結合ペプチド。
＜２＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の
いずれか又は両方にシステイン残基が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合
ペプチド。
＜３＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に
システイン残基が結合したものである、＜２＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜４＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのＮ
末端及びＣ末端に結合したシステイン残基がジスルフィド結合し環を形成してなる、＜３
＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれかのペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に
１～２０個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの
検出方法。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス
検出キット。
＜８＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１～1０
１から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス
結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜９＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１～５２
から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結
合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１０＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、１～２８から選
ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプ
チド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１１＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１～１
２、１４～１７、１９、２１及び２８から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞
～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット
。
＜１２＞配列番号１～２６９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１、４
、１４、１５、１７、２１及び２８から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である＜１＞～
＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
【実施例0027】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
参考例 ＶＬＰｓの作製
（１）ｐＤＥＳＴ８へのＶＰ１、ＶＰ２遺伝子の導入
ノロウイルス（以下、ＮｏＶと略す場合がある） ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株 （Ｇｅ
ｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＢ４４７４５６）、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ
．ＫＦ００６２６５）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ
１９６２８６．１）の構造タンパク質領域であるＶＰ１，ＶＰ２領域をコードするＤＮＡ
については株式会社ファスマックにて人工合成を委託し、ｐＵＣＦａプラスミドのｌａｃ
Ｚα領域である５’－ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴ／ＡＴＣＡ
ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＡＡＧ－３’(配列番号２７０)のスラッシュをク
ローニングサイトとして目的遺伝子を導入した。ＧＩＩ．４について、合成したｐＵＣ－
Ｓａｇａ１(図１)ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（５’－ＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴ
ＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡ－３’：配列番号２７１）及びプライマー
２（５’－ＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ－３’：配
列番号２７２）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。ＧＩＩ．３につい
ては合成したｐＵＣ－ＴＣＨのＤＮＡを鋳型として、プライマー３（５’－ＡＴＣＡＣＡ
ＡＧＴＴＴＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡ－３’：配列番号２７３）及びプ
ライマー４（５’－ＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡ－
３’：配列番号２７４）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。また、ｐ
ＤＥＳＴ８プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、プライマー５（５’－Ａ
ＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡ－３’：配列番号２７５）及
びプライマー６（５’－ＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴ
－３’：配列番号２７６）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ｂ）を得た。得られ
たＰＣＲ断片Ａ及び断片Ｂを混合し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて反応を行い、得られたＤＮＡ（図１－Ｃ）１ｎｇを用いて
、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、１００
μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有したＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコロニ
ーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩ
Ａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてプラスミ
ドの抽出を行った。得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドは、ＤＮＡシークエンサーを用
いて配列の決定を行い、目的の配列が挿入されていることの確認を行った。
ＧＩＩ．１７についてはＶＰ１領域の開始コドンから４塩基上流にａｔｔＬ１配列（５
’－ｃｃｃｃａａａｔａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｔｔｇａｃｔｇａｔａｇｔｇａｃｃｔｇ
ｔｔｃｇｔｔｇｃａａｃａａａｔｔｇａｔｇａｇｃａａｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔａａｔｇ
ｃｃａａｃｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔ－３’：配列番号２７７）を、ま
たＶＰ２領域の終止コドンから５５塩基下流にポリアデニンを３０配列と、続いてａｔｔ
Ｌ２配列(５’－ａｇｃｔｔａｃｃｃａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔａｃａａａｇｔｔｇｇｃａ
ｔｔａｔａａｇａａａｇｃａｔｔｇｃｔｔａｔｃａａｔｔｔｇｔｔｇｃａａｃｇａａｃａ
ｇｇｔｃａｃｔａｔｃａｇｔｃａａａａｔａａａａｔｃａｔｔａｔｔｔｇ－３’：配列番
号２７８)を導入した配列を人工合成し、得られたｐＵＣ－Ｓａｉｔａｍａと、ｐＤＥＳ
Ｔ８とを等量混合し、表１の通り混合し２５℃で１時間反応させた。反応後、１μＬのｐ
ｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ製）を加え３７℃で１０分反応させた。反応液１
ｎｇを用いて、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転
換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコ
ロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞から
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて精製
し、ＧＩＩ．１７をコードしたｐＤＥＳＴ８を得た。
参考例 ＶＬＰｓの作製
（１）ｐＤＥＳＴ８へのＶＰ１、ＶＰ２遺伝子の導入
ノロウイルス（以下、ＮｏＶと略す場合がある） ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株 （Ｇｅ
ｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＢ４４７４５６）、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ
．ＫＦ００６２６５）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ
１９６２８６．１）の構造タンパク質領域であるＶＰ１，ＶＰ２領域をコードするＤＮＡ
については株式会社ファスマックにて人工合成を委託し、ｐＵＣＦａプラスミドのｌａｃ
Ｚα領域である５’－ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴ／ＡＴＣＡ
ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＡＡＧ－３’(配列番号２７０)のスラッシュをク
ローニングサイトとして目的遺伝子を導入した。ＧＩＩ．４について、合成したｐＵＣ－
Ｓａｇａ１(図１)ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（５’－ＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴ
ＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡ－３’：配列番号２７１）及びプライマー
２（５’－ＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ－３’：配
列番号２７２）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。ＧＩＩ．３につい
ては合成したｐＵＣ－ＴＣＨのＤＮＡを鋳型として、プライマー３（５’－ＡＴＣＡＣＡ
ＡＧＴＴＴＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡ－３’：配列番号２７３）及びプ
ライマー４（５’－ＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡ－
３’：配列番号２７４）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。また、ｐ
ＤＥＳＴ８プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、プライマー５（５’－Ａ
ＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡ－３’：配列番号２７５）及
びプライマー６（５’－ＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴ
－３’：配列番号２７６）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ｂ）を得た。得られ
たＰＣＲ断片Ａ及び断片Ｂを混合し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて反応を行い、得られたＤＮＡ（図１－Ｃ）１ｎｇを用いて
、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、１００
μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有したＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコロニ
ーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩ
Ａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてプラスミ
ドの抽出を行った。得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドは、ＤＮＡシークエンサーを用
いて配列の決定を行い、目的の配列が挿入されていることの確認を行った。
ＧＩＩ．１７についてはＶＰ１領域の開始コドンから４塩基上流にａｔｔＬ１配列（５
’－ｃｃｃｃａａａｔａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｔｔｇａｃｔｇａｔａｇｔｇａｃｃｔｇ
ｔｔｃｇｔｔｇｃａａｃａａａｔｔｇａｔｇａｇｃａａｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔａａｔｇ
ｃｃａａｃｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔ－３’：配列番号２７７）を、ま
たＶＰ２領域の終止コドンから５５塩基下流にポリアデニンを３０配列と、続いてａｔｔ
Ｌ２配列(５’－ａｇｃｔｔａｃｃｃａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔａｃａａａｇｔｔｇｇｃａ
ｔｔａｔａａｇａａａｇｃａｔｔｇｃｔｔａｔｃａａｔｔｔｇｔｔｇｃａａｃｇａａｃａ
ｇｇｔｃａｃｔａｔｃａｇｔｃａａａａｔａａａａｔｃａｔｔａｔｔｔｇ－３’：配列番
号２７８)を導入した配列を人工合成し、得られたｐＵＣ－Ｓａｉｔａｍａと、ｐＤＥＳ
Ｔ８とを等量混合し、表１の通り混合し２５℃で１時間反応させた。反応後、１μＬのｐ
ｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ製）を加え３７℃で１０分反応させた。反応液１
ｎｇを用いて、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転
換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコ
ロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞から
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて精製
し、ＧＩＩ．１７をコードしたｐＤＥＳＴ８を得た。
【0028】
【表1】
【0029】
（２）ｂＭＯＮ１４２７２ Ｂａｃｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）へのＶＰ１、ＶＰ
２遺伝子の導入
得られたプラスミドは製品添付のプロトコルに従い下記の方法でＢａｃｍｉｄへの導入
を行った（図１－Ｄ）。
得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドとＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂａ
ｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、ＮｏＶ ＶＰ
１，ＶＰ２領域をｂＭＯＮ１４２７２ ｂａｃｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）へ導入
した（図１－Ｄ）。ｂａｃｍｉｄへの遺伝子導入の有無は４０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ（ｉ
ｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ： Ｗａ
ｋｏ製），１００ μｇ／ｍＬ Ｘ－Ｇａｌ （５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３
－ｉｎｄｏｌｙｌ β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：Ｗａｋｏ製）、５０
μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリ
ン含有ＬＢ培地にて選択を行い（ｂＭＯＮ１４２７２にカナマイシン耐性遺伝子、ＤＨ１
０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ内に存在するヘルパープラスミドにテトラサイ
クリン耐性遺伝子、ｐＤＥＳＴのｂａｃｍｉｄへ挿入される領域にゲンタマイシン耐性遺
伝子がそれぞれコードされている）、さらにカラーセレクションで目的部位への断片挿入
を確認した。得られた白色コロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲン
タマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細
胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い
てｂａｃｍｉｄの抽出を行った。抽出したDNA溶液の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒ
ｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にて確認した。
２遺伝子の導入
得られたプラスミドは製品添付のプロトコルに従い下記の方法でＢａｃｍｉｄへの導入
を行った（図１－Ｄ）。
得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドとＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂａ
ｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、ＮｏＶ ＶＰ
１，ＶＰ２領域をｂＭＯＮ１４２７２ ｂａｃｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）へ導入
した（図１－Ｄ）。ｂａｃｍｉｄへの遺伝子導入の有無は４０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ（ｉ
ｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ： Ｗａ
ｋｏ製），１００ μｇ／ｍＬ Ｘ－Ｇａｌ （５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３
－ｉｎｄｏｌｙｌ β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：Ｗａｋｏ製）、５０
μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリ
ン含有ＬＢ培地にて選択を行い（ｂＭＯＮ１４２７２にカナマイシン耐性遺伝子、ＤＨ１
０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ内に存在するヘルパープラスミドにテトラサイ
クリン耐性遺伝子、ｐＤＥＳＴのｂａｃｍｉｄへ挿入される領域にゲンタマイシン耐性遺
伝子がそれぞれコードされている）、さらにカラーセレクションで目的部位への断片挿入
を確認した。得られた白色コロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲン
タマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細
胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い
てｂａｃｍｉｄの抽出を行った。抽出したDNA溶液の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒ
ｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にて確認した。
【0030】
（３）ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２導入Ｂａｃｍｉｄのトランスフェクションによる組み換え
バキュロウイルス（ｒＢＶ）の生産
ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２遺伝子を導入したｂａｃｍｉｄを、Ｌｉｐｏｆｅｃｃｔａｍｉ
ｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ＆ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
製）を用い、添付のプロトコルに従い、Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にトラン
スフェクションした（図１－Ｅ）。トランスフェクションした細胞はＳｆ９００ＩＩＩ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７℃で１週間培養した。培養後培地を遠心し、
上清を回収してＮｏＶ遺伝子を有する組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を得た。
バキュロウイルス（ｒＢＶ）の生産
ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２遺伝子を導入したｂａｃｍｉｄを、Ｌｉｐｏｆｅｃｃｔａｍｉ
ｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ＆ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
製）を用い、添付のプロトコルに従い、Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にトラン
スフェクションした（図１－Ｅ）。トランスフェクションした細胞はＳｆ９００ＩＩＩ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７℃で１週間培養した。培養後培地を遠心し、
上清を回収してＮｏＶ遺伝子を有する組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を得た。
【0031】
（４）ｒＢＶ感染によるＮｏＶ ＶＬＰの生産
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）１．０×１０７ ｃｅｌｌｓ／
ｆｌａｓｋに対し、ＭＯＩ＝２になるよう１．０×１０７ ｐｆｕ／ｍＬのｒＢＶを添加
して感染させ、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７
℃で培養した（図１－Ｆ）。感染７日後に遠心によって培養上清を回収し、さらに回収
した上清を１０，０００ｘｇで１時間遠心し、バキュロウイルスをペレットダウンし、細
胞上清を回収した。更にＮｏＶ ＶＬＰを含む回収した上清を、ＳＷ３２Ｔｉローター（
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い３２，０００ｒｐｍで２時間遠心し、ＮｏＶ
ＶＬＰをペレットダウンさせた。上清を除いたペレットは１．９ｍｇのＣｓＣｌ（密度
勾配遠心用、ＷＡＫＯ製）をＥｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地に溶解させたＳＷ５５Ｔｉ（
Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い４０，０００ｒｐｍで２０時間遠心して分離
精製を行い、白色光の照射により目視で確認された画分を回収した。回収画分は再度ＳＷ
３２Ｔｉローターで３２，０００ｒｐｍで遠心しペレットダウンを行い、上清を除き、Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地５００μＬに懸濁した。ＶＬＰ濃度はｂｒａｄｆｏｒｄ法で
定量した。標準タンパク質はＢＳＡ（ＷＡＫＯ製）を用いた。
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）１．０×１０７ ｃｅｌｌｓ／
ｆｌａｓｋに対し、ＭＯＩ＝２になるよう１．０×１０７ ｐｆｕ／ｍＬのｒＢＶを添加
して感染させ、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７
℃で培養した（図１－Ｆ）。感染７日後に遠心によって培養上清を回収し、さらに回収
した上清を１０，０００ｘｇで１時間遠心し、バキュロウイルスをペレットダウンし、細
胞上清を回収した。更にＮｏＶ ＶＬＰを含む回収した上清を、ＳＷ３２Ｔｉローター（
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い３２，０００ｒｐｍで２時間遠心し、ＮｏＶ
ＶＬＰをペレットダウンさせた。上清を除いたペレットは１．９ｍｇのＣｓＣｌ（密度
勾配遠心用、ＷＡＫＯ製）をＥｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地に溶解させたＳＷ５５Ｔｉ（
Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い４０，０００ｒｐｍで２０時間遠心して分離
精製を行い、白色光の照射により目視で確認された画分を回収した。回収画分は再度ＳＷ
３２Ｔｉローターで３２，０００ｒｐｍで遠心しペレットダウンを行い、上清を除き、Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地５００μＬに懸濁した。ＶＬＰ濃度はｂｒａｄｆｏｒｄ法で
定量した。標準タンパク質はＢＳＡ（ＷＡＫＯ製）を用いた。
【0032】
実施例１ ノロウイルス結合ペプチドの製造（図２参照）
（１）ＤＮＡライブラリの作製
ペプチドライブラリは、長さ１０アミノ酸のものとなるようにＤＮＡライブラリをデザ
インした。
(ＤＮＡライブラリの塩基配列)
５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧ
ＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡ
ＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＧ
ＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧ
ＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号２７９）
（１）ＤＮＡライブラリの作製
ペプチドライブラリは、長さ１０アミノ酸のものとなるようにＤＮＡライブラリをデザ
インした。
(ＤＮＡライブラリの塩基配列)
５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧ
ＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡ
ＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＧ
ＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧ
ＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号２７９）
【0033】
【表2】
【0034】
上記ＤＮＡライブラリは、Ｔ７－ＰＲＯ－Ω領域（配列番号２８０）、ランダム領域（
配列番号２８１）及びＨｉｓ－Ｙｔａｇ領域（配列番号２８２）という３種類のＤＮＡ配
列断片を、伸長ＰＣＲによって結合することで作製した。このライブラリはランダム領域
のＮ末端とＣ末端にシステインが出現するよう設計している。ランダム領域、Ｈｉｓ－Ｙ
ｔａｇ領域及びＴ７－ＰＲＯ－Ω領域は、つくばオリゴサービス（株）に、それぞれＤＮ
Ａ合成を依頼して入手した。これらを用いて下記伸長ＰＣＲを行ない、上記のＤＮＡライ
ブラリを作製した。
配列番号２８１）及びＨｉｓ－Ｙｔａｇ領域（配列番号２８２）という３種類のＤＮＡ配
列断片を、伸長ＰＣＲによって結合することで作製した。このライブラリはランダム領域
のＮ末端とＣ末端にシステインが出現するよう設計している。ランダム領域、Ｈｉｓ－Ｙ
ｔａｇ領域及びＴ７－ＰＲＯ－Ω領域は、つくばオリゴサービス（株）に、それぞれＤＮ
Ａ合成を依頼して入手した。これらを用いて下記伸長ＰＣＲを行ない、上記のＤＮＡライ
ブラリを作製した。
【0035】
[配列番号２８０]
５’ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧ
ＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡ
ＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
３’
５’ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧ
ＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡ
ＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
３’
【0036】
[配列番号２８１]
５’－ＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ
ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣ
Ａ－３’
５’－ＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ
ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣ
Ａ－３’
【0037】
上記配列中の、ＡＴＣＧ以外の塩基の出現頻度の割合（Ａ：Ｔ：Ｇ：Ｃ）は以下の通り
である。
Ｎ： Ａ＝０．２５，Ｔ＝０．２５，Ｇ＝０．２５，Ｃ＝０．２５
Ｋ： Ａ＝０，Ｔ＝０．５，Ｇ＝０．５，Ｃ＝０
である。
Ｎ： Ａ＝０．２５，Ｔ＝０．２５，Ｇ＝０．２５，Ｃ＝０．２５
Ｋ： Ａ＝０，Ｔ＝０．５，Ｇ＝０．５，Ｃ＝０
【0038】
[配列番号２８２]
５’ ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣ ３’
５’ ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧ
ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣ ３’
【0039】
合成１段階目の伸長ＰＣＲは、下記表３に示す組成の反応液を超純水で５０μＬに調製
し、ランダム領域とＨｉｓ－Ｙｔａｇ領域が結合したＤＮＡ断片を以下のＰＣＲプログラ
ムで増幅させた。ＰＣＲプログラムは、（ａ）９６℃（２分）、（ｂ）９４℃（２０秒）
、（ｃ）６９℃（５秒）、（ｄ）７２℃（２０秒）、及び（ｅ）７２℃（２分）とし、ス
テップ（ｂ）～（ｄ）を５サイクル行った。
し、ランダム領域とＨｉｓ－Ｙｔａｇ領域が結合したＤＮＡ断片を以下のＰＣＲプログラ
ムで増幅させた。ＰＣＲプログラムは、（ａ）９６℃（２分）、（ｂ）９４℃（２０秒）
、（ｃ）６９℃（５秒）、（ｄ）７２℃（２０秒）、及び（ｅ）７２℃（２分）とし、ス
テップ（ｂ）～（ｄ）を５サイクル行った。
【0040】
【表3】
【0041】
２段階目伸長ＰＣＲは、下記表４に示す組成の反応液を超純水で５０μＬに調製し、以
下のＰＣＲプログラムでＴ７－ＰＲＯ－ＳＤ領域を伸長させることで、ＤＮＡライブラリ
を増幅させた。ＰＣＲプログラムは、（ａ）９６℃（２分）、（ｂ）９４℃（２０秒）、
（ｃ）５９℃（５秒）、（ｄ）７２℃（３０秒）及び（ｅ）７２℃（２分）とし、ステッ
プ（ｂ）～（ｄ）を１５サイクル行った。その後、Ｐｏｌｙ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇ
ｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）によりＤＮＡライブラリを精製した
。
下のＰＣＲプログラムでＴ７－ＰＲＯ－ＳＤ領域を伸長させることで、ＤＮＡライブラリ
を増幅させた。ＰＣＲプログラムは、（ａ）９６℃（２分）、（ｂ）９４℃（２０秒）、
（ｃ）５９℃（５秒）、（ｄ）７２℃（３０秒）及び（ｅ）７２℃（２分）とし、ステッ
プ（ｂ）～（ｄ）を１５サイクル行った。その後、Ｐｏｌｙ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇ
ｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）によりＤＮＡライブラリを精製した
。
【0042】
【表4】
【0043】
（２）ＤＮＡライブラリの転写
ＤＮＡライブラリの転写はＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ -Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用し、付属するプロ
トコルに従い行った。反応スケールは、１μｇのＤＮＡライブラリを使用して２０μＬで
行った。転写反応により得られたｍＲＮＡは、Ａｆｔｅｒ Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ
ＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔ （Ｆａｖｏｇｅｎ製）を使用して精製した。
ＤＮＡライブラリの転写はＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ -Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用し、付属するプロ
トコルに従い行った。反応スケールは、１μｇのＤＮＡライブラリを使用して２０μＬで
行った。転写反応により得られたｍＲＮＡは、Ａｆｔｅｒ Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒ
ＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔ （Ｆａｖｏｇｅｎ製）を使用して精製した。
【0044】
次いで、得られたｍＲＮＡと後述するピューロマイシンリンカーとのライゲーションを
、以下のようにして行った（図３（Ａ））。まず、ピューロマイシンリンカー及びｍＲＮ
Ａを各２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を４μＬ、１Ｍ Ｎ
ａＣｌを４μＬ混合し、超純水で２０μＬにメスアップした。反応液を９０℃で２分及び
７０℃で１分インキュベートした後、４℃まで降温させた後２５℃で１時間アニーリング
させた。その後、ＣＬ－１０００ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒを
用いて、波長３６５ｎｍの紫外光を４０５ｍＪ／ｃｍ２の条件で照射してピューロマイシ
ンリンカーと架橋を行った。
、以下のようにして行った（図３（Ａ））。まず、ピューロマイシンリンカー及びｍＲＮ
Ａを各２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を４μＬ、１Ｍ Ｎ
ａＣｌを４μＬ混合し、超純水で２０μＬにメスアップした。反応液を９０℃で２分及び
７０℃で１分インキュベートした後、４℃まで降温させた後２５℃で１時間アニーリング
させた。その後、ＣＬ－１０００ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒを
用いて、波長３６５ｎｍの紫外光を４０５ｍＪ／ｃｍ２の条件で照射してピューロマイシ
ンリンカーと架橋を行った。
【0045】
＜ピューロマイシンリンカーのＤＮＡ＞
ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１（図３（Ａ））は、２つのセグメント（ピューロマ
イシンセグメント（ＰＳ）と短いビオチンセグメント（ＳＢＳ））をＥＭＣＳ（Ｎ－（６
－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド：同仁化学製）を用いて、化学架橋させ
て合成した。リンカーは文献（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｙ., Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ., Ｆｕｊｉｍ
ｏｔｏ Ｋ., Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ．． （２０１５） Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｎｖＫ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ. Ｊ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ. ２１２，１７４－８０.）に記載のものを用いた。
ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１（図３（Ａ））は、２つのセグメント（ピューロマ
イシンセグメント（ＰＳ）と短いビオチンセグメント（ＳＢＳ））をＥＭＣＳ（Ｎ－（６
－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド：同仁化学製）を用いて、化学架橋させ
て合成した。リンカーは文献（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｙ., Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ., Ｆｕｊｉｍ
ｏｔｏ Ｋ., Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ．． （２０１５） Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｎｖＫ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ. Ｊ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ. ２１２，１７４－８０.）に記載のものを用いた。
【0046】
ピューロマイシンセグメント（ＰＳ）の配列構造を以下に示す。
５’－（Ｓ）－ＴＣＴＣＴＣ（Ｆ）－（ＰＥＧ）（ＰＥＧ）－ＣＣ－（Ｐｕｒｏ）－３’
ここで、（Ｓ）は５’-チオールモディファイヤーＣ６（化合物名：Ｓ－Ｔｒｉｔｙｌ
－６－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘｙｌ－１－［（２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－
ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ製）を表し、（Ｆ）はフルオレセイン－ｄＴを表す。（Ｐｕｒｏ）はピューロマイ
シンＣＰＧ（５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－Ｎ－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔ
ｙｌ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２’－ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ－ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙ
ｌａｍｉｎｏ－ＣＰＧ、Ｇｌｅｎ ｒｅｓａｒｃｈ製）を表す。
５’－（Ｓ）－ＴＣＴＣＴＣ（Ｆ）－（ＰＥＧ）（ＰＥＧ）－ＣＣ－（Ｐｕｒｏ）－３’
ここで、（Ｓ）は５’-チオールモディファイヤーＣ６（化合物名：Ｓ－Ｔｒｉｔｙｌ
－６－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘｙｌ－１－［（２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－
ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ製）を表し、（Ｆ）はフルオレセイン－ｄＴを表す。（Ｐｕｒｏ）はピューロマイ
シンＣＰＧ（５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－Ｎ－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔ
ｙｌ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２’－ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ－ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙ
ｌａｍｉｎｏ－ＣＰＧ、Ｇｌｅｎ ｒｅｓａｒｃｈ製）を表す。
【0047】
続いて短いビオチンセグメント（ＳＢＳ）の配列構造を以下に示す。
５’（Ｂ）－ＡＡ－（ｒＧ）－ＡＡＴＴＴＣＣＡ（Ｋ）ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ｙ）
ＣＣＴ－３’（配列番号２８３）
ここで、（Ｙ）はアミノモディファイヤーＣ６ デオキシチミン（５’－Ｄｉｍｅｔｈ
ｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－５－［Ｎ－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙ
ｌ）－３－ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］－２’－ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’－［（２－
ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製)）を表し、（Ｋ）は３－Ｃｙａｎｏｖｉｎ
ｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ｃｎｖＫ） を表し、（Ｂ）は、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｔｒｉｅｔｈ
ｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＴＥＧ）, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製） を表し、（ｒＧ
）はリボグアニン（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表す。ＰＳ及びＳＢＳはつくばオ
リゴ社に合成を委託し、常法に従い合成した。
５’（Ｂ）－ＡＡ－（ｒＧ）－ＡＡＴＴＴＣＣＡ（Ｋ）ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ｙ）
ＣＣＴ－３’（配列番号２８３）
ここで、（Ｙ）はアミノモディファイヤーＣ６ デオキシチミン（５’－Ｄｉｍｅｔｈ
ｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－５－［Ｎ－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙ
ｌ）－３－ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］－２’－ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’－［（２－
ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製)）を表し、（Ｋ）は３－Ｃｙａｎｏｖｉｎ
ｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ｃｎｖＫ） を表し、（Ｂ）は、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｔｒｉｅｔｈ
ｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＴＥＧ）, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製） を表し、（ｒＧ
）はリボグアニン（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表す。ＰＳ及びＳＢＳはつくばオ
リゴ社に合成を委託し、常法に従い合成した。
【0048】
上記ＰＳの５’チオール基を、１００μＬの５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ ７．
０ ）中にて、室温で６時間、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒド
ロクロリド（ＴＣＥＰ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）で還元し
、その後、ＮＡＰ－５カラム（ＧＥヘルスケア製）で要時脱塩した。総量１０ｎｍｏｌの
ビオチンループ及び２μｍｏｌのＥＭＣＳを、１００μＬの０．２Ｍのリン酸ナトリウム
バッファー（ｐＨ７．０）に加えた。引き続き、混合物を、３７℃で３０分インキュベー
トし、４℃でエタノール沈殿を行い、過剰なＥＭＣＳを除去した。
０ ）中にて、室温で６時間、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒド
ロクロリド（ＴＣＥＰ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）で還元し
、その後、ＮＡＰ－５カラム（ＧＥヘルスケア製）で要時脱塩した。総量１０ｎｍｏｌの
ビオチンループ及び２μｍｏｌのＥＭＣＳを、１００μＬの０．２Ｍのリン酸ナトリウム
バッファー（ｐＨ７．０）に加えた。引き続き、混合物を、３７℃で３０分インキュベー
トし、４℃でエタノール沈殿を行い、過剰なＥＭＣＳを除去した。
【0049】
この沈殿を予め氷浴中で冷却しておいた７０％エタノール５００μＬで２回洗浄し、予
め冷却しておいた０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１０μＬに溶解
した。還元されたＰＳを直ちに加えて、４℃で終夜撹拌した。４ｍＭのＴＣＥＰを加えて
、１５分間３７℃でインキュベートすることにより、この反応を停止させた。その後、エ
タノール沈殿を行い、過剰なＰＳを室温で除去した。ビオチンループ及び未架橋のビオチ
ンループ－ＥＭＣＳ複合体を除去するために、沈殿を０．１ＭのＴＥＡＡ（Ｔｒｉｅｔｈ
ｙｌａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ：Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）又はリン酸バッファ
ーに溶解し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムを用いて以下の条件で精製した。
め冷却しておいた０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１０μＬに溶解
した。還元されたＰＳを直ちに加えて、４℃で終夜撹拌した。４ｍＭのＴＣＥＰを加えて
、１５分間３７℃でインキュベートすることにより、この反応を停止させた。その後、エ
タノール沈殿を行い、過剰なＰＳを室温で除去した。ビオチンループ及び未架橋のビオチ
ンループ－ＥＭＣＳ複合体を除去するために、沈殿を０．１ＭのＴＥＡＡ（Ｔｒｉｅｔｈ
ｙｌａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ：Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）又はリン酸バッファ
ーに溶解し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムを用いて以下の条件で精製した。
【0050】
カラム：ＡＲ－３００，４．６ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク製）溶媒：溶媒Ａ：０．
１ＭのＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／水（８０：２０，ｖ／ｖ）グラジエント：Ｂ
／Ａ（１５－３５％，３３分）流速：０．５ｍＬ／分 検出波長：吸光度２５４ｎｍ及び
４９０ｎｍ
１ＭのＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／水（８０：２０，ｖ／ｖ）グラジエント：Ｂ
／Ａ（１５－３５％，３３分）流速：０．５ｍＬ／分 検出波長：吸光度２５４ｎｍ及び
４９０ｎｍ
【0051】
吸光度２５４ｎｍでの最終ピークからの画分（吸光度４９０ｎｍでの単一のピークに対
応する）からの画分を集めた。乾燥後、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に
再懸濁し、保存した。以上のようにして、ピューロマイシン－リンカーＤＮＡ１を得るこ
とができた。
応する）からの画分を集めた。乾燥後、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に
再懸濁し、保存した。以上のようにして、ピューロマイシン－リンカーＤＮＡ１を得るこ
とができた。
【0052】
＜ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーＤＮＡ１との結合＞
転写により得られたｍＲＮＡ ２０ｐｍｏｌあたり、ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１
２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４μＬ、１Ｍ ＮａＣｌ
４μＬを加え、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで合計２０μＬとなるように
調製した（表５）。９０℃で１ｍｉｎインキュベートした後に７０℃で１ｍｉｎインキュ
ベートし、０．０４℃／ｓのスピードで２５℃まで温度を下げた。紫外線（３６５ｎｍ）
を４０５ｍｊ照射し、ｃｎｖＫとｍＲＮＡ中のウラシルと共有結合させることでｍＲＮＡ
－リンカー連結体を得た。ここは各ラウンドで必要量合成した。
転写により得られたｍＲＮＡ ２０ｐｍｏｌあたり、ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１
２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４μＬ、１Ｍ ＮａＣｌ
４μＬを加え、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで合計２０μＬとなるように
調製した（表５）。９０℃で１ｍｉｎインキュベートした後に７０℃で１ｍｉｎインキュ
ベートし、０．０４℃／ｓのスピードで２５℃まで温度を下げた。紫外線（３６５ｎｍ）
を４０５ｍｊ照射し、ｃｎｖＫとｍＲＮＡ中のウラシルと共有結合させることでｍＲＮＡ
－リンカー連結体を得た。ここは各ラウンドで必要量合成した。
【0053】
【表5】
【0054】
＜翻訳＞
上記のｍＲＮＡ－リンカー連結体を無細胞翻訳系により以下のように翻訳した。下記表
６に示す組成の比率の反応液を超純水で５０μＬに調製し、３７℃で１５分間反応させて
、この反応液に、２４μＬの３Ｍ ＫＣｌ及び６μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を加えた。その
後、この溶液を更に３７℃で２０分間反応させ、翻訳されたペプチドのＣ末端とピューロ
マイシンを結合させることでｍＲＮＡ－ペプチド連結体を得た。
上記のｍＲＮＡ－リンカー連結体を無細胞翻訳系により以下のように翻訳した。下記表
６に示す組成の比率の反応液を超純水で５０μＬに調製し、３７℃で１５分間反応させて
、この反応液に、２４μＬの３Ｍ ＫＣｌ及び６μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を加えた。その
後、この溶液を更に３７℃で２０分間反応させ、翻訳されたペプチドのＣ末端とピューロ
マイシンを結合させることでｍＲＮＡ－ペプチド連結体を得た。
【0055】
【表6】
【0056】
（３）磁性体ビーズによる精製
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐ
ｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を説明書に従って洗浄し、上記ペプチ
ド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を固定するのに必要な量をエッペンドルフチューブにとり
、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、上清を除去し、溶液Ａ（１００ｍＭ Ｎａ
ＯＨ， ５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再懸濁した。タッピングを１～２分間行った後に、磁気
スタンド上に１分間静置した。その後、溶液Ａでもう１回、同様の操作を行い、溶液Ｂ（
１００ｍＭ ＮａＣｌ）で１回、同様の操作を行った。
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐ
ｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を説明書に従って洗浄し、上記ペプチ
ド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を固定するのに必要な量をエッペンドルフチューブにとり
、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、上清を除去し、溶液Ａ（１００ｍＭ Ｎａ
ＯＨ， ５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再懸濁した。タッピングを１～２分間行った後に、磁気
スタンド上に１分間静置した。その後、溶液Ａでもう１回、同様の操作を行い、溶液Ｂ（
１００ｍＭ ＮａＣｌ）で１回、同様の操作を行った。
【0057】
前記ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体に、２×結合バッファー（２０ ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０，５００ｍＭ ＥＤＴＡ）を等量加えて、上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性
粒子と室温で３０分インキュベートした。エッペンドルフチューブを磁気スタンド上に１
分間静置した後に、上清を除去した。１×結合バッファーを２００μＬ加え、タッピング
を１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置して上清を除去した。この操作を
さらに２回繰り返し、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化されたペプチド－リ
ンカー－ｍＲＮＡ連結体を得た。
ｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０，５００ｍＭ ＥＤＴＡ）を等量加えて、上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性
粒子と室温で３０分インキュベートした。エッペンドルフチューブを磁気スタンド上に１
分間静置した後に、上清を除去した。１×結合バッファーを２００μＬ加え、タッピング
を１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置して上清を除去した。この操作を
さらに２回繰り返し、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化されたペプチド－リ
ンカー－ｍＲＮＡ連結体を得た。
【0058】
（４）逆転写反応によるｃＤＮＡの合成
上記固定化ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体に、下記表７の反応液の比率で使用し
たストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子と同体積の溶液を入れ、４２度で３０分間インキ
ュベートして逆転写を行い、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化された状態の
まま、ｃＤＮＡディスプレイを調製した。
上記固定化ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体に、下記表７の反応液の比率で使用し
たストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子と同体積の溶液を入れ、４２度で３０分間インキ
ュベートして逆転写を行い、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化された状態の
まま、ｃＤＮＡディスプレイを調製した。
【0059】
【表7】
【0060】
（５）ペプチドの架橋反応
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを架
橋バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，
１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０
ｍＭ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ： Ｔｈｅ
ｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）及び４ｍＭ ビスマレイミドエタン（Ｂ
ＭＯＥ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を含む架橋バッファー１
２５μＬを加え２５℃で１時間インキュベートしてランダム領域のＮ末端とＣ末端にある
システインに対し架橋反応を行った。
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを架
橋バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，
１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０
ｍＭ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ： Ｔｈｅ
ｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）及び４ｍＭ ビスマレイミドエタン（Ｂ
ＭＯＥ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を含む架橋バッファー１
２５μＬを加え２５℃で１時間インキュベートしてランダム領域のＮ末端とＣ末端にある
システインに対し架橋反応を行った。
【0061】
（６）磁性体ビーズによる精製からの溶出
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを、
１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），
０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，５～３０ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０．１％
Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０ＵのＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏ
ｎ製）を含む３０μＬの１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを加え、３７℃で１５分間イン
キュベートし、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズからリンカー中の切断部位（リボ
Ｇ）から切断されたｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを、
１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），
０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，５～３０ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０．１％
Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０ＵのＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏ
ｎ製）を含む３０μＬの１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを加え、３７℃で１５分間イン
キュベートし、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズからリンカー中の切断部位（リボ
Ｇ）から切断されたｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。
【0062】
（７）Ｎｉ－ＮＴＡによる精製
Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（Ｈｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ：ＧＥヘルスケ
ア製）１０μＬをエッペンドルフチューブにとり、磁気スタンド上に１分間静置した。そ
の後、上清を除去し１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーで再懸濁した。タッピングを１～２
分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、もう一度同じ作業を行った
。
Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（Ｈｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ：ＧＥヘルスケ
ア製）１０μＬをエッペンドルフチューブにとり、磁気スタンド上に１分間静置した。そ
の後、上清を除去し１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーで再懸濁した。タッピングを１～２
分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、もう一度同じ作業を行った
。
【0063】
前記ｃＤＮＡディスプレイを上記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズと室温で３０分インキュベー
トした。エッペンドルフチューブを磁気スタンド上に１分間静置した後に、上清を除去し
た。１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを２００μＬ加え、タッピングを１～２分間行った
後に、磁気スタンド上に１分間静置して上清を除去した。この操作をさらに繰り返した後
、Ｈｉｓ－タグ溶出バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），
０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，２５０～５００ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０
．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）を１０μＬ加え、室温で１５分インキュベートすること
でｃＤＮＡディスプレイの精製を行った。
トした。エッペンドルフチューブを磁気スタンド上に１分間静置した後に、上清を除去し
た。１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを２００μＬ加え、タッピングを１～２分間行った
後に、磁気スタンド上に１分間静置して上清を除去した。この操作をさらに繰り返した後
、Ｈｉｓ－タグ溶出バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），
０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，２５０～５００ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０
．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）を１０μＬ加え、室温で１５分インキュベートすること
でｃＤＮＡディスプレイの精製を行った。
【0064】
（８）試験管内淘汰サイクル
下記表８に従い上記ｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを混合し選択用のバッファー（１
０～３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１～０．３Ｍ ＮａＣｌを含む）
で１ｍＬにした後２５℃で３０分間インキュベートした。
下記表８に従い上記ｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを混合し選択用のバッファー（１
０～３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１～０．３Ｍ ＮａＣｌを含む）
で１ｍＬにした後２５℃で３０分間インキュベートした。
【0065】
【表8】
【0066】
＜遠心沈殿法によるＶＬＰ－ｃＤＮＡディスプレイ複合体の分離＞
遠心管に上記混合物を加え、超遠心機（日立製、ＣＳ１５０ＦＮＸ）を用いて４℃で約
２時間の間１３０，０００×ｇで遠心した。上清を除去し、１ｍＬの選択用のバッファー
で壁面を洗浄した後に上清を除去した。１００μＬのＲＮａｓｅフリー水を加えて沈殿物
を再溶解した。
遠心管に上記混合物を加え、超遠心機（日立製、ＣＳ１５０ＦＮＸ）を用いて４℃で約
２時間の間１３０，０００×ｇで遠心した。上清を除去し、１ｍＬの選択用のバッファー
で壁面を洗浄した後に上清を除去した。１００μＬのＲＮａｓｅフリー水を加えて沈殿物
を再溶解した。
【0067】
＜透析法によるＶＬＰ－ｃＤＮＡディスプレイ複合体の分離＞
作製したｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを下記の表９の濃度になるように透析用選択
バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％
ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中で２５℃、３０分間インキュベートした。その後、透析用
選択バッファーで１ｍＬにメスアップしＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙ
ｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ ＣＥ， １０００ ｋＤ ＭＷＣＯ（スペクトラム・ラボラトリ
ーズ製）に加え、外液１Ｌの透析用選択バッファーで、２５℃で透析した。途中、２時間
おきに３回外液を入れ替えて４回目に一晩（８時間）透析した。透析産物をＡｍｉｃｏｎ
Ｕｌｔｒａ １００Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて１４，０００×
ｇ、５分により濃縮した。
作製したｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを下記の表９の濃度になるように透析用選択
バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％
ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中で２５℃、３０分間インキュベートした。その後、透析用
選択バッファーで１ｍＬにメスアップしＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙ
ｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ ＣＥ， １０００ ｋＤ ＭＷＣＯ（スペクトラム・ラボラトリ
ーズ製）に加え、外液１Ｌの透析用選択バッファーで、２５℃で透析した。途中、２時間
おきに３回外液を入れ替えて４回目に一晩（８時間）透析した。透析産物をＡｍｉｃｏｎ
Ｕｌｔｒａ １００Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて１４，０００×
ｇ、５分により濃縮した。
【0068】
（９）ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７ ＶＬＰを対象としたセレクション
イムノプレート（Ｃ－ＢＯＴＴＯＭ，ＣＬＥＡＲ，ＭＩＣＲＯＬＯＮ（登録商標），Ｈ
ＩＧＨ ＢＩＮＤＩＮＧ，Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に３μｇ／ｍＬのＧＩＩ．３またはＧＩＩ
．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ加え、４℃、Ｏ．Ｎ．で固定化した。その後、溶液を捨
てて２００μＬのブロッキング試薬（ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ ＢｌoｋＴＭ
ＮＳＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ社）を加え、室温で２時間穏やかに攪拌することでブロッキングした。この際に
、ＶＬＰを固定していないウェルもプレセレクションで使用するために同様にブロッキン
グを行った。
ウェルから溶液を捨てて、２００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（１０ ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７．４），１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）で３回
洗浄後、１００μＬのｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ（１．５ ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－Ｌｉｎｋ
ｅｒから作製）をＶＬＰが固定されていないウェルに投入し、室温で３０分穏やかに攪拌
してプレセレクションを行った。その後、ブロッキング剤に結合しなかったｃＤＮＡ ｄ
ｉｓｐｌａｙを含む上澄をＶＬＰが固定されているウェルに投入し、室温で３０分穏やか
に攪拌することでＶＬＰと結合させた。上澄を捨てた後、１００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆ
ｆｅｒで４回洗浄後、１００μＬの５％ ＳＤＳ溶液を加え、５０℃で１５分インキュベ
ートすることで結合したｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを溶出した。
イムノプレート（Ｃ－ＢＯＴＴＯＭ，ＣＬＥＡＲ，ＭＩＣＲＯＬＯＮ（登録商標），Ｈ
ＩＧＨ ＢＩＮＤＩＮＧ，Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に３μｇ／ｍＬのＧＩＩ．３またはＧＩＩ
．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ加え、４℃、Ｏ．Ｎ．で固定化した。その後、溶液を捨
てて２００μＬのブロッキング試薬（ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ ＢｌoｋＴＭ
ＮＳＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ社）を加え、室温で２時間穏やかに攪拌することでブロッキングした。この際に
、ＶＬＰを固定していないウェルもプレセレクションで使用するために同様にブロッキン
グを行った。
ウェルから溶液を捨てて、２００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（１０ ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７．４），１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）で３回
洗浄後、１００μＬのｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ（１．５ ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－Ｌｉｎｋ
ｅｒから作製）をＶＬＰが固定されていないウェルに投入し、室温で３０分穏やかに攪拌
してプレセレクションを行った。その後、ブロッキング剤に結合しなかったｃＤＮＡ ｄ
ｉｓｐｌａｙを含む上澄をＶＬＰが固定されているウェルに投入し、室温で３０分穏やか
に攪拌することでＶＬＰと結合させた。上澄を捨てた後、１００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆ
ｆｅｒで４回洗浄後、１００μＬの５％ ＳＤＳ溶液を加え、５０℃で１５分インキュベ
ートすることで結合したｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを溶出した。
【0069】
この後、上記で得られたＶＬＰ－ｃＤＮＡディスプレイ複合体を１００μＬに透析用選
択バッファーでメスアップした後、共沈剤（Ｑｕｉｃｋ－Ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓ Ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ， ＥｄｇｅＢｉｏ製）を１０μＬ、１００％エタノールを２２０μＬ加え
、２０，０００×ｇ、５分遠心した。その後、上澄を捨て７０％エタノールを１ｍＬ加え
リンスを行った。チューブを１０分間乾燥させた後に２０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶
出し、フォワードプライマーとしてＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ（配列番
号２８４）、リバースプライマーとしてＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ
（配列番号２８５）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは（ａ）９８℃２分
、（ｂ）９５℃２０秒、（ｃ）６９℃２０秒、（ｄ）７２℃２０秒（ｂ～ｄを２５サイク
ル）、（ｅ）７２℃１分とした。
択バッファーでメスアップした後、共沈剤（Ｑｕｉｃｋ－Ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓ Ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ， ＥｄｇｅＢｉｏ製）を１０μＬ、１００％エタノールを２２０μＬ加え
、２０，０００×ｇ、５分遠心した。その後、上澄を捨て７０％エタノールを１ｍＬ加え
リンスを行った。チューブを１０分間乾燥させた後に２０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶
出し、フォワードプライマーとしてＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ（配列番
号２８４）、リバースプライマーとしてＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ
（配列番号２８５）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは（ａ）９８℃２分
、（ｂ）９５℃２０秒、（ｃ）６９℃２０秒、（ｄ）７２℃２０秒（ｂ～ｄを２５サイク
ル）、（ｅ）７２℃１分とした。
【0070】
【表9】
【0071】
得られたＰＣＲ産物を次のサイクルのライブラリＤＮＡとして用い、（２）に記載した
ライブラリの転写から同様の操作を行い、淘汰サイクルを繰り返した。
ライブラリの転写から同様の操作を行い、淘汰サイクルを繰り返した。
【0072】
＜遺伝子配列情報の解析＞
上記試験管内淘汰サイクル（ＧＩＩ．４を対象とした７サイクル及びＧＩＩ．４透析法
により得られた７サイクルのライブラリを基に、ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７を対象とした
５サイクル）後、以下に示す方法で、シークエンスライブラリーの調製を行い、配列情報
を解析した。シーケンスライブラリーの調製及びシーケンスは１６Ｓ Ｍｅｔａｇｅｎｏ
ｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコル（
Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）に従い行った。
上記試験管内淘汰サイクル（ＧＩＩ．４を対象とした７サイクル及びＧＩＩ．４透析法
により得られた７サイクルのライブラリを基に、ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７を対象とした
５サイクル）後、以下に示す方法で、シークエンスライブラリーの調製を行い、配列情報
を解析した。シーケンスライブラリーの調製及びシーケンスは１６Ｓ Ｍｅｔａｇｅｎｏ
ｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコル（
Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）に従い行った。
【0073】
１）Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ
表１０の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を２３サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
表１０の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を２３サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
【0074】
【表10】
【0075】
２）Ｃｌｅａｎ ｕｐ
Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ
を２０μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置し
た。プレートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレート
をマグネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加
し、３０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノール
を風乾後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．
５溶液を各ウェルに５２．５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネ
ットスタンド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応する
ウェルへ５０μＬずつ移した。
Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ
を２０μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置し
た。プレートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレート
をマグネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加
し、３０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノール
を風乾後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．
５溶液を各ウェルに５２．５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネ
ットスタンド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応する
ウェルへ５０μＬずつ移した。
【0076】
３）Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ
精製したＡｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物にシークエンスのためのアダプターとＩｎｄｅ
ｘ配列を付与するためのＰＣＲ反応を行った。
表１１の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を８サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
精製したＡｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物にシークエンスのためのアダプターとＩｎｄｅ
ｘ配列を付与するためのＰＣＲ反応を行った。
表１１の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を８サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
【0077】
【表11】
【0078】
用いたＩｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒのセットは下記表１２に示す。
【0079】
【表12】
【0080】
４）Ｃｌｅａｎ ｕｐ２
Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを５６
μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置した。プ
レートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレートをマグ
ネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加し、３
０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノールを風乾
後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液
を各ウェルに２５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネットスタン
ド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルへ５
０μＬずつ移した。
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ｃｈ
ｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いてバリデーションを行った
。
Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを５６
μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置した。プ
レートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレートをマグ
ネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加し、３
０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノールを風乾
後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液
を各ウェルに２５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネットスタン
ド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルへ５
０μＬずつ移した。
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ｃｈ
ｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いてバリデーションを行った
。
【0081】
５）ｑＰＣＲ
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＫａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ(日本ジェネティクス製)を用いてｑＰＣＲを行った。
Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを予め添加したＫａｐａ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓ
ｔｅｒ Ｍｉｘ １２μＬと、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒ ４μＬ、Ｉｎｄｅｘ
ＰＣＲ産物の１００倍希釈物を４μＬを混合しｑＰＣＲに供した。検量線用のサンプルは
キット付属のＳｔｄ１～６を用いた。
以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で５分
以下の反応を３５サイクル
・９５℃で３０秒
・６０℃で４５秒
Ｓｔｄ１～６のＣｔ値から検量線を引き、サンプル濃度を算出した。
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＫａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ(日本ジェネティクス製)を用いてｑＰＣＲを行った。
Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを予め添加したＫａｐａ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓ
ｔｅｒ Ｍｉｘ １２μＬと、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒ ４μＬ、Ｉｎｄｅｘ
ＰＣＲ産物の１００倍希釈物を４μＬを混合しｑＰＣＲに供した。検量線用のサンプルは
キット付属のＳｔｄ１～６を用いた。
以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で５分
以下の反応を３５サイクル
・９５℃で３０秒
・６０℃で４５秒
Ｓｔｄ１～６のＣｔ値から検量線を引き、サンプル濃度を算出した。
【0082】
６）Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ３ １５０ ｃｙｃｌｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ
製）のＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを水浴中で解凍させ、付属のＨＴ１バッファ
ーは常温で解凍させ、氷冷した。
ｑＰＣＲによって濃度既知のＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物は、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔ
ｅｒを用いて４ｎＭに希釈した。このサンプル４ｎＭ希釈物５μＬと、０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ（１０Ｎ ＮａＯＨ水溶液（Ｗａｋｏ製）をＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒを用いて
０．２Ｎに希釈したものを使用）５μＬとを混合し、室温で５分間静置した。その後氷冷
ＨＴ１バッファー９９０μＬを添加し、２０ｐＭの変性済みライブラリ１ｍＬを得た。
変性済み２０ｐＭライブラリ１８０μＬと、氷冷ＨＴ１バッファー４２０μＬとを混合
し、６ｐＭライブラリ６００μＬを得た。また、予め変性させておいた２０ｐＭ Ｐｈｉ
Ｘ ＤＮＡ ３０μＬと氷冷ＨＴ１バッファー１０μＬとを混合させ、１５ｐＭ 変性済
みＰｈｉＸを得た。１５ｐＭ変性済みＰｈｉＸ３０μＬと、６ｐＭ変性済みライブラリ５
７０μＬとを混合させ、水浴で解凍させたＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの「Ｌｏ
ａｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」(１７番)に６００μＬ全量を添加した。
Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ３ １５０ ｃｙｃｌｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ
製）のＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを水浴中で解凍させ、付属のＨＴ１バッファ
ーは常温で解凍させ、氷冷した。
ｑＰＣＲによって濃度既知のＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物は、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔ
ｅｒを用いて４ｎＭに希釈した。このサンプル４ｎＭ希釈物５μＬと、０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ（１０Ｎ ＮａＯＨ水溶液（Ｗａｋｏ製）をＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒを用いて
０．２Ｎに希釈したものを使用）５μＬとを混合し、室温で５分間静置した。その後氷冷
ＨＴ１バッファー９９０μＬを添加し、２０ｐＭの変性済みライブラリ１ｍＬを得た。
変性済み２０ｐＭライブラリ１８０μＬと、氷冷ＨＴ１バッファー４２０μＬとを混合
し、６ｐＭライブラリ６００μＬを得た。また、予め変性させておいた２０ｐＭ Ｐｈｉ
Ｘ ＤＮＡ ３０μＬと氷冷ＨＴ１バッファー１０μＬとを混合させ、１５ｐＭ 変性済
みＰｈｉＸを得た。１５ｐＭ変性済みＰｈｉＸ３０μＬと、６ｐＭ変性済みライブラリ５
７０μＬとを混合させ、水浴で解凍させたＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの「Ｌｏ
ａｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」(１７番)に６００μＬ全量を添加した。
【0083】
７）Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｕｎ
０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０によるＭａｉｎｔａｉｎａｎｃｅ Ｗａｓｈ済みのＭｉｓ
ｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）にＭｉｌｌｉＱ水及び９９．５％エタノールで洗浄したＦｌ
ｏｗ Ｃｅｌｌをセットし、ＰＲ２ボトル及び試薬がアプライされたＣａｒｔｒｉｄｇｅ
をセットしてシーケンシングを行った。
０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０によるＭａｉｎｔａｉｎａｎｃｅ Ｗａｓｈ済みのＭｉｓ
ｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）にＭｉｌｌｉＱ水及び９９．５％エタノールで洗浄したＦｌ
ｏｗ Ｃｅｌｌをセットし、ＰＲ２ボトル及び試薬がアプライされたＣａｒｔｒｉｄｇｅ
をセットしてシーケンシングを行った。
【0084】
８）遺伝子情報の解析
得られたシーケンス配列のＦａｓｔｑファイルをＦａｓｔａファイルに変換し、ソフト
ウェアのＭＥＧＡを用いて、ライブラリ配列（配列番号２７９）の１１５番目の開始コド
ン先頭（ＡＴＧ）から１５６番目のシステインコドン末端（ＴＧＣ）までについて、得ら
れた配列全てを一斉に翻訳した。翻訳後、Ｅｘｃｅｌのフィルター機能を用いて末端のシ
ステインから７残基上流のアミノ酸をシステインでフィルタリングし、ペプチドアプタマ
ー４３５７配列を得た。
得られたシーケンス配列のＦａｓｔｑファイルをＦａｓｔａファイルに変換し、ソフト
ウェアのＭＥＧＡを用いて、ライブラリ配列（配列番号２７９）の１１５番目の開始コド
ン先頭（ＡＴＧ）から１５６番目のシステインコドン末端（ＴＧＣ）までについて、得ら
れた配列全てを一斉に翻訳した。翻訳後、Ｅｘｃｅｌのフィルター機能を用いて末端のシ
ステインから７残基上流のアミノ酸をシステインでフィルタリングし、ペプチドアプタマ
ー４３５７配列を得た。
【0085】
９）配列の選定
得られたペプチドアプタマー７０６９配列について出現頻度解析を行い、出現頻度が６
以上の配列である配列番号１～２６９に示すペプチドをノロウイルスと特異的に結合する
ペプチドとして選定した。選定した２６９配列を表１６に示す。
実施例２ ＶＬＰｓとの相互作用
得られたペプチドアプタマー７０６９配列について出現頻度解析を行い、出現頻度が６
以上の配列である配列番号１～２６９に示すペプチドをノロウイルスと特異的に結合する
ペプチドとして選定した。選定した２６９配列を表１６に示す。
実施例２ ＶＬＰｓとの相互作用
【0086】
＜ペプチドの合成＞
ペプチド自動合成装置Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（ＣＥＭ Ｊａｐａｎ製）を用い、窒
素雰囲気下におけるＦｍｏｃ固相合成法によりペプチドを合成した。樹脂はＦｍｏｃ－Ｌ
ｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）またはＦ
ｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ（ペプチド研究所製）を用いた。溶媒
はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド：ＤＭＦ（和光純薬工業製）を用い、脱保護剤はピペリ
ジン（和光純薬工業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。カップリング反応促進
剤及び光学活性制御剤として、ジイソプロピルカルボジイミド（東京化成工業製）及びＥ
ｔｈｙｌ ｃｙａｎｏｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ－２－ｏｘｉｍｅ：Ｏｘｙｍａ（渡辺化学工
業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。合成反応は装置備え付けの合成プログラ
ムに従って行った。
ペプチド自動合成装置Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（ＣＥＭ Ｊａｐａｎ製）を用い、窒
素雰囲気下におけるＦｍｏｃ固相合成法によりペプチドを合成した。樹脂はＦｍｏｃ－Ｌ
ｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）またはＦ
ｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ（ペプチド研究所製）を用いた。溶媒
はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド：ＤＭＦ（和光純薬工業製）を用い、脱保護剤はピペリ
ジン（和光純薬工業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。カップリング反応促進
剤及び光学活性制御剤として、ジイソプロピルカルボジイミド（東京化成工業製）及びＥ
ｔｈｙｌ ｃｙａｎｏｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ－２－ｏｘｉｍｅ：Ｏｘｙｍａ（渡辺化学工
業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。合成反応は装置備え付けの合成プログラ
ムに従って行った。
【0087】
＜手動合成によるビオチンの導入＞
合成反応はペプチド手動合成機Ｐｅｔｉｓｙｚｅｒ（ハイペップ研究所製）を用いて行
った。下記割合で調製した混合液（表１３）を用いて、室温で１時間攪拌しトリプトファ
ンののＣ末端側にビオチンを導入した。反応後ＤＭＦ及びジエチルエーテルで洗浄した。
合成反応はペプチド手動合成機Ｐｅｔｉｓｙｚｅｒ（ハイペップ研究所製）を用いて行
った。下記割合で調製した混合液（表１３）を用いて、室温で１時間攪拌しトリプトファ
ンののＣ末端側にビオチンを導入した。反応後ＤＭＦ及びジエチルエーテルで洗浄した。
【0088】
【表13】
【0089】
＜スペーサー配列を付与したペプチドの樹脂からの切断＞
スペーサー配列を付与したペプチドが結合している樹脂は、ジエチルエーテル（和光純
薬工業製）を用いて洗浄・乾燥させた。この樹脂にＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．
５：２．５の混合液を室温で１時間接触させ、ペプチドを樹脂から切断した。ろ過により
樹脂と溶液を分離し、溶液に５倍量の氷冷ジエチルエーテルを加え、転倒攪拌し沈殿を発
生させた。生じた沈殿は１３，０００ｒｐｍ、２０℃、３分の条件で遠心分離し、再度ジ
エチルエーテルにより沈殿を洗浄・同条件による遠心を行った。沈殿物はドラフト内で乾
燥させ、得られた粉体は４℃で保存した。
スペーサー配列を付与したペプチドが結合している樹脂は、ジエチルエーテル（和光純
薬工業製）を用いて洗浄・乾燥させた。この樹脂にＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．
５：２．５の混合液を室温で１時間接触させ、ペプチドを樹脂から切断した。ろ過により
樹脂と溶液を分離し、溶液に５倍量の氷冷ジエチルエーテルを加え、転倒攪拌し沈殿を発
生させた。生じた沈殿は１３，０００ｒｐｍ、２０℃、３分の条件で遠心分離し、再度ジ
エチルエーテルにより沈殿を洗浄・同条件による遠心を行った。沈殿物はドラフト内で乾
燥させ、得られた粉体は４℃で保存した。
【0090】
＜ＥＬＩＳＡによる相互作用評価＞
ペプチドは１０％ＤＭＦ水溶液中に分散させた。吸光光度計により濃度を算出し、１０
％ＤＭＦ水溶液により５０μＭに調整した。これをＰｉｅｒｃｅTM Ｓｔｒｅｐｔａｖｉ
ｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ， Ｃｌｅａｒ， ９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間静
置した。 上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０含有）２
００μＬで３回洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＧＩＩ．３、ＧＩＩ．
４、ＧＩＩ．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去
し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、ウサギ由来抗ノロウイルスＶＬＰポリクローナ
ル抗体（ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７ ＶＬＰの混合物を抗原としてユーロフィンジェノミ
クス株式会社へ提出し、作製依頼したもの）を１μｇ／ｍＬにブロッキング剤で希釈した
ものを１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬ
で３回洗浄後、ＨＲＰで標識した抗ウサギ由来ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をブロッキング液で１０００倍に希釈したものを１００μ
Ｌ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、
３、３’、５、５’－テトラメチルベンジジン（Ａｂｃａｍ製）を１００μＬ添加し、室
温で１５分静置した。反応停止液として０．５Ｍ硫酸を１００μＬ添加し、マルチプレー
トリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定
した。結果を図４に示す。
ペプチドは１０％ＤＭＦ水溶液中に分散させた。吸光光度計により濃度を算出し、１０
％ＤＭＦ水溶液により５０μＭに調整した。これをＰｉｅｒｃｅTM Ｓｔｒｅｐｔａｖｉ
ｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ， Ｃｌｅａｒ， ９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間静
置した。 上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０含有）２
００μＬで３回洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＧＩＩ．３、ＧＩＩ．
４、ＧＩＩ．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去
し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、ウサギ由来抗ノロウイルスＶＬＰポリクローナ
ル抗体（ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７ ＶＬＰの混合物を抗原としてユーロフィンジェノミ
クス株式会社へ提出し、作製依頼したもの）を１μｇ／ｍＬにブロッキング剤で希釈した
ものを１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬ
で３回洗浄後、ＨＲＰで標識した抗ウサギ由来ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をブロッキング液で１０００倍に希釈したものを１００μ
Ｌ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、
３、３’、５、５’－テトラメチルベンジジン（Ａｂｃａｍ製）を１００μＬ添加し、室
温で１５分静置した。反応停止液として０．５Ｍ硫酸を１００μＬ添加し、マルチプレー
トリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定
した。結果を図４に示す。
【0091】
＜Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ法によるＫＤ値の算出＞
装置はＢＬＩｔｚＴＭ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いた。ＳＡ ｃｈｉｐ（Ｆｏｒｔ
ｅＢｉｏ社製）の先端を精製水に１分間接触させ水和させた後、１％ＢＳＡ水溶液に１時
間接触させブロッキングした。ブロッキング処理したＳＡ ｃｈｉｐをＢＬＩｔｚＴＭ本
体の測定部にセットし、表１４のプログラムに従って測定を行った。ペプチドは配列番号
１、２１、２８を用い、濃度は１００μＭに調整した。ＧＩＩ．３ＶＬＰ濃度は１、０．
１ｍｇ／ｍＬに調整した。測定データは付属のソフトウェアを用いて解析し、Ｋａ、Ｋｄ
値を基にＫＤ値を算出した。結果を表１５に示す。
装置はＢＬＩｔｚＴＭ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いた。ＳＡ ｃｈｉｐ（Ｆｏｒｔ
ｅＢｉｏ社製）の先端を精製水に１分間接触させ水和させた後、１％ＢＳＡ水溶液に１時
間接触させブロッキングした。ブロッキング処理したＳＡ ｃｈｉｐをＢＬＩｔｚＴＭ本
体の測定部にセットし、表１４のプログラムに従って測定を行った。ペプチドは配列番号
１、２１、２８を用い、濃度は１００μＭに調整した。ＧＩＩ．３ＶＬＰ濃度は１、０．
１ｍｇ／ｍＬに調整した。測定データは付属のソフトウェアを用いて解析し、Ｋａ、Ｋｄ
値を基にＫＤ値を算出した。結果を表１５に示す。
【0092】
【表14】
【0093】
【表15】
【0094】
【表16】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】