知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024175022
(43)【公開日】2024-12-17
(54)【発明の名称】Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 13/00 20060101AFI20241210BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241210BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
C12P13/00
C12N1/21 ZNA
C12N9/14
C12N1/21
C12P13/00 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024158876
(22)【出願日】2024-09-13
(62)【分割の表示】P 2023104443の分割
【原出願日】2019-02-27
(31)【優先権主張番号】P 2018077741
(32)【優先日】2018-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000000066
【氏名又は名称】味の素株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】永田 秀美
(72)【発明者】
【氏名】檀上 景子
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼倉 淳
(72)【発明者】
【氏名】野崎 博之
(57)【要約】 （修正有）
【課題】酵素的方法によるＮ－アシル－アミノ基含有化合物の効率的な製造方法を提供する。
【解決手段】カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する酵素の存在下において、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を反応させて、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することを含む、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法である。
【選択図】なし
【解決手段】カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する酵素の存在下において、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を反応させて、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することを含む、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する酵素の存在下において、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を反応させて、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することを含む、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法。
【請求項2】
前記酵素が植物または微生物由来酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記酵素がＧＨ３タンパク質である、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
前記酵素が、グループＩ、グループＩＩ、またはグループＩＩＩのいずれかのグループに属するＧＨ３タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
ＧＨ３タンパク質が、下記：
（Ａ）配列番号９、１～８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号９、１～８からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号９、１～８からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
（Ａ）配列番号９、１～８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号９、１～８からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号９、１～８からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
前記酵素がＰａａＫタンパク質である、請求項１または２記載の方法。
【請求項7】
ＰａａＫタンパク質が、下記：
（Ａ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、請求項６記載の方法。
（Ａ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項8】
アミノ基含有化合物が、アニオン性基を有するアミノ基含有化合物である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
【請求項9】
アミノ基含有化合物が、アミノ酸またはペプチドである、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
アミノ基含有化合物が、α－アミノ酸、β－アミノ酸、またはγ－アミノ酸、あるいはこれらのジペプチドである、請求項９記載の方法。
【請求項11】
アミノ酸がＬ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項12】
アミノ基含有化合物が、以下：
（１）（ａ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選ばれるα－アミノ酸；
（ｂ）β－アラニン；
（ｃ）γ－アミノ酪酸；ならびに
（ｄ）サルコシン；
からなる群より選ばれるアミノ酸；
（２）タウリン；ならびに
（３）アスパルチルフェニルアラニン、グリシルグリシン、およびアラニルヒスチジンからなる群より選ばれるジペプチド；
からなる群から選ばれる、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
（１）（ａ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選ばれるα－アミノ酸；
（ｂ）β－アラニン；
（ｃ）γ－アミノ酪酸；ならびに
（ｄ）サルコシン；
からなる群より選ばれるアミノ酸；
（２）タウリン；ならびに
（３）アスパルチルフェニルアラニン、グリシルグリシン、およびアラニルヒスチジンからなる群より選ばれるジペプチド；
からなる群から選ばれる、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
カルボキシル基含有化合物が脂肪酸である、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項14】
脂肪酸が、炭素原子数６～１８の脂肪酸である、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
脂肪酸が、炭素原子数６～１２の脂肪酸である、請求項１４記載の方法。
【請求項16】
脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項17】
前記酵素が精製酵素である、請求項１～１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項18】
前記酵素の存在下における反応が、前記酵素を産生する形質転換微生物またはその処理物を用いて行われる、請求項１～１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項19】
前記形質転換微生物が、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの微生物である、請求項１８記載の方法：
（ｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物；
（ｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を非天然ゲノム領域または非ゲノム領域に含む微生物；あるいは
（ｉｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドを、複数のコピー数において発現単位に含む微生物。
（ｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物；
（ｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を非天然ゲノム領域または非ゲノム領域に含む微生物；あるいは
（ｉｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドを、複数のコピー数において発現単位に含む微生物。
【請求項20】
前記微生物が腸内細菌科に属する細菌である、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項21】
前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物（例、Ｎα－アシルアミノ酸）は、香粧品素材（例、界面活性剤）等として用いられている。Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の化学的合成（例、ショッテン・バウマン反応）は、合成反応の副産物による環境負荷の課題を有する。そこで、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の酵素的合成が求められている。Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の酵素的合成に関する先行技術がいくつか報告されている。
【0003】
特許文献１では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのサーファクチン生合成酵素を利用した糖からのＮα－アシルアミノ酸発酵が報告されている。しかし、Ｎα－アシルグルタミン酸の生成量は１１６．８ｍｇ／Ｌと微量であるため、この発酵は工業的スケールでの製造には適していない。
【0004】
特許文献２では、ヒト由来アミノ酸Ｎ－アシルトランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来アシルＣｏＡ合成酵素を利用して、アミノ酸と脂肪酸からＮα－アシルグリシンを合成する方法について報告されている。しかし、この方法では脂肪酸に直接アミノ酸を結合させることができず、２段階の酵素反応が必要となるため、単一の酵素を利用する反応と比較すると制御が複雑になるという課題がある。
【0005】
非特許文献１では、ブタ腎臓由来アシラーゼを用いて、グリセロールを含む溶液中で、アミノ酸と脂肪酸からＮα－アシルアミノ酸を合成する方法が報告されている。本方法は、グリセロールを含む溶液中では、アシラーゼによるＮα－アシルアミノ酸の加水分解反応が進行しにくいことを利用している。しかし、グリセロールの大量使用が要求される点、およびグリセロールを含まない水系溶媒中でのＮα－アシルアミノ酸合成は低収率となる点に鑑みて、この方法は、工業的製造では低効率となる。
【0006】
非特許文献２では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来アシラーゼを用いて、グリセロールを含む溶液中で、アミノ酸と脂肪酸からＮα－アシルアミノ酸を合成する方法が報告されている。しかし、グリセロールを含まない水系溶媒中でのＮα－アシルアミノ酸合成は報告されていないため、この方法の工業的製造への効率性は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２００８／１３１００２号
【特許文献2】国際公開第２０１５／０２８４２３号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００２，７９（１）， ｐｐ ４１－４６
【非特許文献2】Ｋｏｒｅｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，５４（１），ｐｐ ７２－７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、酵素的方法によるＮ－アシル－アミノ基含有化合物の効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、鋭意検討した結果、カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する酵素が、脂肪酸を含めたカルボキシル基含有化合物およびアミノ基含有化合物からＮ－アシル－アミノ基含有化合物を効率的に生成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する酵素の存在下において、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を反応させて、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することを含む、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法。
〔２〕前記酵素が植物または微生物由来酵素である、〔１〕の方法。
〔３〕前記酵素がＧＨ３タンパク質である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記酵素が、グループＩ、グループＩＩ、またはグループＩＩＩのいずれかのグループに属するＧＨ３タンパク質である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕ＧＨ３タンパク質が、下記：
（Ａ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記酵素がＰａａＫタンパク質である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔７〕ＰａａＫタンパク質が、下記：
（Ａ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、〔６〕の方法。
〔８〕アミノ基含有化合物が、アニオン性基を有するアミノ基含有化合物である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕アミノ基含有化合物が、アミノ酸またはペプチドである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕アミノ基含有化合物が、α－アミノ酸、β－アミノ酸、またはγ－アミノ酸、あるいはこれらのジペプチドである、〔９〕の方法。
〔１１〕アミノ酸がＬ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸である、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕アミノ基含有化合物が、以下：
（１）（ａ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選ばれるα－アミノ酸；
（ｂ）β－アラニン；
（ｃ）γ－アミノ酪酸；ならびに
（ｄ）サルコシン；
からなる群より選ばれるアミノ酸；
（２）タウリン；ならびに
（３）アスパルチルフェニルアラニン、グリシルグリシン、およびアラニルヒスチジンからなる群より選ばれるジペプチド；
からなる群から選ばれる、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕カルボキシル基含有化合物が脂肪酸である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕脂肪酸が、炭素原子数６～１８の脂肪酸である、〔１３〕の方法。
〔１５〕脂肪酸が、炭素原子数６～１２の脂肪酸である、〔１４〕の方法。
〔１６〕脂肪酸が飽和脂肪酸である、〔１４〕または〔１５〕の方法。
〔１７〕前記酵素が精製酵素である、〔１〕～〔１６〕のいずれかの方法。
〔１８〕前記酵素の存在下における反応が、前記酵素を産生する形質転換微生物またはその処理物を用いて行われる、〔１〕～〔１７〕のいずれかの方法。
〔１９〕前記形質転換微生物が、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの微生物である、〔１８〕の方法：
（ｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物；
（ｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を非天然ゲノム領域または非ゲノム領域に含む微生物；あるいは
（ｉｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドを、複数のコピー数において発現単位に含む微生物。
〔２０〕前記微生物が腸内細菌科に属する細菌である、〔１８〕または〔１９〕の方法。
〔２１〕前記細菌がエシェリヒア・コリである、〔２０〕の方法。
〔１〕カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する酵素の存在下において、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を反応させて、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することを含む、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法。
〔２〕前記酵素が植物または微生物由来酵素である、〔１〕の方法。
〔３〕前記酵素がＧＨ３タンパク質である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記酵素が、グループＩ、グループＩＩ、またはグループＩＩＩのいずれかのグループに属するＧＨ３タンパク質である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕ＧＨ３タンパク質が、下記：
（Ａ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記酵素がＰａａＫタンパク質である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔７〕ＰａａＫタンパク質が、下記：
（Ａ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；
からなる群から選ばれる、〔６〕の方法。
〔８〕アミノ基含有化合物が、アニオン性基を有するアミノ基含有化合物である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕アミノ基含有化合物が、アミノ酸またはペプチドである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕アミノ基含有化合物が、α－アミノ酸、β－アミノ酸、またはγ－アミノ酸、あるいはこれらのジペプチドである、〔９〕の方法。
〔１１〕アミノ酸がＬ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸である、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕アミノ基含有化合物が、以下：
（１）（ａ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンからなる群から選ばれるα－アミノ酸；
（ｂ）β－アラニン；
（ｃ）γ－アミノ酪酸；ならびに
（ｄ）サルコシン；
からなる群より選ばれるアミノ酸；
（２）タウリン；ならびに
（３）アスパルチルフェニルアラニン、グリシルグリシン、およびアラニルヒスチジンからなる群より選ばれるジペプチド；
からなる群から選ばれる、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕カルボキシル基含有化合物が脂肪酸である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕脂肪酸が、炭素原子数６～１８の脂肪酸である、〔１３〕の方法。
〔１５〕脂肪酸が、炭素原子数６～１２の脂肪酸である、〔１４〕の方法。
〔１６〕脂肪酸が飽和脂肪酸である、〔１４〕または〔１５〕の方法。
〔１７〕前記酵素が精製酵素である、〔１〕～〔１６〕のいずれかの方法。
〔１８〕前記酵素の存在下における反応が、前記酵素を産生する形質転換微生物またはその処理物を用いて行われる、〔１〕～〔１７〕のいずれかの方法。
〔１９〕前記形質転換微生物が、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの微生物である、〔１８〕の方法：
（ｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物；
（ｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を非天然ゲノム領域または非ゲノム領域に含む微生物；あるいは
（ｉｉｉ）前記酵素をコードするポリヌクレオチドを、複数のコピー数において発現単位に含む微生物。
〔２０〕前記微生物が腸内細菌科に属する細菌である、〔１８〕または〔１９〕の方法。
〔２１〕前記細菌がエシェリヒア・コリである、〔２０〕の方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明の方法によれば、アミノ基含有化合物とカルボキシル基含有化合物とのアミド結合によるＮ－アシル－アミノ基含有化合物生成反応を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造方法を提供する。本発明の方法は、酵素の存在下において、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を反応させて、Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することを含む。
【0014】
本発明の方法で用いられる酵素は、カルボキシル基およびアミノ基をＡＴＰ依存的様式において結合させてアミド結合を形成する能力を有する。本発明の方法で用いられる酵素は、カルボキシル基含有化合物をアデニル化により活性化し、アミノ基含有化合物がこのアデニル化中間体を求核攻撃する機構によりアミド結合を形成すると考えられる。
【0015】
本発明の方法で用いられる酵素は、植物または微生物由来であってもよい。本発明の方法で用いられる酵素が由来する植物としては、例えば、裸子植物門、被子植物門、シダ植物門、ヒカゲノカズラ植物門、ツノゴケ植物門、マゴケ植物門、ゼニゴケ植物門、車軸藻綱、接合藻綱、緑藻植物門、灰色植物門、紅色植物門に属する植物が挙げられ、より具体的には、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ；例、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ；例、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ；例、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ；例、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ナス属またはトマト属（ＳｏｌａｎｕｍまたはＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ；例、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍまたはＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ；例、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニセツリガネゴケ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ；例、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ；例、Ｃｉｔｒｕｓ ｍａｄｕｒｅｎｓｉｓ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ；例、Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎａｓｔｅｒ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ；例、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ；例、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ；例、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ；例、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｉｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ；例、Ｚｅａ ｍａｙｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ；例、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ；例、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）が挙げられる。本発明の方法で用いられる酵素が由来する微生物としては、シストバクター属（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ；例、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｓｃｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ；例、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ；例、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；例、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）が挙げられる。
【0016】
本発明の方法で用いられる酵素は、ＧＨ３タンパク質であってもよい。「ＧＨ３タンパク質」とは、ジャスモン酸、オーキシン類（インドール－３－酢酸）、サリチル酸、置換ベンゾエート等のカルボキシル基含有植物ホルモンのアミド化に機能する酵素群およびそれらのホモログをいう。構造的特徴として、「ＧＨ３タンパク質」とは、ＧＨ３スーパーファミリードメインを含有するタンパク質をいう。ＧＨ３スーパーファミリードメインは、配列データベースで定義されたものから検索可能であり、例えば、ＮＣＢＩのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓデータベース上で「ＧＨ３ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」と定義されるドメインを有するタンパク質として検索可能である。
【0017】
ＧＨ３タンパク質のうち、特に植物由来ＧＨ３タンパク質は、配列類似性および基質特異性に基づいて、グループＩ、グループＩＩ、およびグループＩＩＩに分類できる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５，２９７８０－２９７８６、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．，２００５，１７（２）．６１６－６２７）。
【0018】
グループＩは、主としてジャスモン酸を基質とする酵素として見出された酵素群である。グループＩに属する酵素としては、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来酵素（例、ＡｔＧＨ３－１０、ＡｔＪＡＲ１〔ＡｔＧＨ３－１１とも呼ぶ〕）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来酵素（例、ＯｓＡＫ０７１７２１、ＯｓＢＡＡ９６２２１）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来酵素（例、ＬｅＢＴＯ１３６９７、ＬｅＵ１４４８１０）、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）由来酵素（例、ＰｐＡＢＯ６１２２１）が挙げられる。
【0019】
グループＩＩは、主としてインドール酢酸、またはサリチル酸を基質とする酵素として見出された酵素群である。グループＩＩに属する酵素としては、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来酵素（例、ＡｔＧＨ３－１、ＡｔＧＨ３－２、ＡｔＧＨ３－３、ＡｔＧＨ３－４、ＡｔＧＨ３－５、ＡｔＧＨ３－６、ＡｔＧＨ３－９、ＡｔＧＨ３－１７）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来酵素（例、ＯｓＢＡＢ６３５９４、ＯｓＢＡＢ９２５９０、ＯｓＧＨ３－８〔ＯｓＢＡＣ７９６２７とも呼ぶ〕）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）由来酵素（例、ＣｃＡＹ５２５０８９）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由来酵素（例、ＧｍＧＨ３）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来酵素（例、ＬｅＢＴ０１３４４６）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来酵素（例、ＮｔＡＦ１２３５０３）が挙げられる。
【0020】
グループＩＩＩは、主として置換ベンゾエートを基質とする酵素として見出された酵素群である。グループＩＩＩに属する酵素としては、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来酵素（例、ＡｔＧＨ３－７、ＡｔＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－１２、ＡｔＧＨ３－１３、ＡｔＧＨ３－１４、ＡｔＧＨ３－１５、ＡｔＧＨ３－１６、ＡｔＧＨ３－１８、ＡｔＧＨ３－１９）が挙げられる。
【0021】
ＧＨ３タンパク質のうち、微生物由来ＧＨ３タンパク質としては、例えば、シストバクター・フスクス（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｓｃｕｓ）由来酵素（例、ＣｆＨＰ〔ＷＰ＿００２６２６３３６〕）、シネココッカスｓｐ．（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来酵素（例、ＳｓＧＨ３〔ＧＨ３オーキシン応答性プロモータースーパーファミリー〕）が挙げられる。
【0022】
ＧＨ３タンパク質は、下記であってもよい：
（Ａ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質。
【0023】
本発明の方法で用いられる酵素は、ＰａａＫタンパク質であってもよい。「ＰａａＫタンパク質」とは、フェニル酢酸をフェニル酢酸ＣｏＡに変換する機能を有する酵素群およびそれらのホモログをいう。構造的特徴として、「ＰａａＫタンパク質」とは、ＰａａＫスーパーファミリードメインを含有する酵素群である。ＰａａＫスーパーファミリードメインは、配列データベースで定義されたものから検索可能であり、例えば、ＮＣＢＩのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓデータベース上で「ＰａａＫ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」と定義されるドメインを有するタンパク質として検索可能である。ＰａａＫタンパク質は、配列データベースにおいてＧＨ３タンパク質のホモログとしても見出されることがあり、ＧＨ３タンパク質と、例えば、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【0024】
ＰａａＫタンパク質としては、例えば、インドール酢酸にリジンを結合するインドール酢酸－リジンシンテターゼ（ＩＡＡＬ）が挙げられる。例えば、シュードモナス・サバスタニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）由来酵素（例、ＰｓＩＡＡＬ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来酵素（例、ＰａＨＰ〔ＷＰ＿０３１５９１９４８〕）が挙げられる。
【0025】
ＰａａＫタンパク質は、下記であってもよい：
（Ａ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号１０または１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質。
【0026】
タンパク質（Ｂ）および（Ｂ’）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、特に好ましくは１～１０個または１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【0027】
タンパク質（Ｃ）および（Ｃ’）では、配列番号１～９からなる群から選ばれるアミノ酸配列または配列番号１０または１１のアミノ酸配列との同一性％は、９０％以上である。好ましくは、同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。ポリペプチド（タンパク質）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、ポリペプチドの同一性の算定％は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。ポリヌクレオチド（遺伝子）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎにより行うことができる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性％の算定は、ＮＣＢＩにおいて提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｎにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ＝１，－２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）を用いて行うことができる。
【0028】
「Ｎ－アシラーゼ活性」とは、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物を基質としてＮ－アシル－アミノ基含有化合物を生成する活性をいう。ＧＨ３タンパク質およびＰａａＫタンパク質について、（Ａ）～（Ｃ）および（Ａ’）～（Ｃ’）のタンパク質は、Ｎ－アシラーゼ活性を有することから、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物からＮ－アシル－アミノ基含有化合物を生成することができる。（Ｂ）、（Ｂ’）、（Ｃ）、および（Ｃ’）のタンパク質はそれぞれ、特定の測定条件で活性を測定した場合、もとのアミノ酸配列に対応する（Ａ）または（Ａ’）のタンパク質の活性を基準として、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等（すなわち、１００％）以上の活性を有していてもよい。このような特定の測定条件としては、次の条件を採用することができる。（Ａ）または（Ａ’）のタンパク質（以下、「野生型酵素」と呼ぶ）、ならびに（Ｂ）、（Ｂ’）、（Ｃ）、または（Ｃ’）のタンパク質（以下、「改変酵素」と呼ぶ）を精製酵素として調製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸（例、グリシン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸）、５ｍＭ 脂肪酸ナトリウム（例、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートし、反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－アシルアミノ酸（例、Ｎα－カプリロイルグリシン、Ｎα－カプリノイルグリシン、Ｎα－ラウロイルグリシン、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－グルタミン酸、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－グルタミン酸、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－グルタミン酸、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸）と一致する分子量のシグナルを測定することによりＮ－アシラーゼ活性を評価する。
【0029】
タンパク質（Ｂ）、（Ｂ’）、（Ｃ）、および（Ｃ’）は、目的特性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明で用いられるタンパク質のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【0030】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【0031】
本発明で用いられるタンパク質はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、およびこれらの変異型等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【0032】
本発明の方法に用いることができるアミノ基含有化合物は、窒素原子が１個または２個の水素原子と結合したアミノ基を含有する有機化合物、または窒素原子が水素原子と結合していないアミノ基を含有する有機化合物のいずれであってもよい。アミノ基含有化合物としては、酵素の基質特異性等の観点から、窒素原子が１個または２個の水素原子と結合したアミノ基を含有する化合物が好ましく、窒素原子が２個の水素原子と結合したアミノ基を含有する化合物がより好ましい。
【0033】
本発明の方法に用いることができるアミノ基含有化合物は、アニオン性基を有するアミノ基含有化合物が好ましい。アニオン性基としては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基が挙げられる。
【0034】
アニオン性基としてカルボキシル基を有するアミノ基含有化合物としては、例えば、アミノ酸およびペプチドが挙げられる。
【0035】
アミノ酸としては、例えば、α－アミノ酸、β－アミノ酸、およびγ－アミノ酸が挙げられる。α－アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられる。β－アミノ酸としては、例えば、β－アラニンが挙げられる。γ－アミノ酸としては、例えば、γ－アミノ酪酸が挙げられる。アミノ酸のアミノ基は、窒素原子が２個の水素原子と結合したアミノ基、窒素原子が１個の水素原子と結合したアミノ基、および窒素原子が水素原子と結合していないアミノ基のいずれであってもよい。窒素原子が１個の水素原子と結合したアミノ基を含有するアミノ酸としては、例えば、サルコシン、Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－メチルタウリン、プロリンが挙げられる。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸のいずれであってもよい。
【0036】
ペプチドは、上述したアミノ酸がアミド結合により連結された構造を有する化合物である。ペプチドとしては、例えば、２～１０個のアミノ酸がアミド結合により連絡された構造を有するオリゴペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド）、および１１個以上のアミノ酸がアミド結合により連結された構造を有するポリペプチド（タンパク質）が挙げられる。ジペプチドとしては、例えば、アスパルチルフェニルアラニン、グリシルグリシン、およびβ－アラニルヒスチジン、アラニルグルタミンが挙げられる。
【0037】
アニオン性基としてスルホン酸基を有するアミノ基含有化合物としては、例えば、タウリン、Ｎ－メチルタウリン、システイン酸が挙げられる。
【0038】
アニオン性基として硫酸基を有するアミノ基含有化合物としては、例えば、Ｏ－スルホセリン、Ｏ－スルホスレオニンが挙げられる。
【0039】
アニオン性基としてリン酸基を有するアミノ基含有化合物としては、例えば、エタノールアミンリン酸、ホスホセリン、ホスホスレオニンが挙げられる。
【0040】
本発明の方法に用いることができるカルボキシル基含有化合物は、置換されていないカルボキシル基（例、遊離型、イオン、塩）を含有する化合物である。カルボキシル基含有化合物としては、例えば、脂肪酸、芳香族カルボン酸、インドールカルボン酸が挙げられる。
【0041】
脂肪酸は、例えば炭素原子数６～１８の脂肪酸、好ましくは炭素原子数６～１６の脂肪酸、より好ましくは６～１４の脂肪酸、さらにより好ましくは炭素原子数６～１２の脂肪酸であってもよい。炭素原子数６～１８の脂肪酸としては、例えばカプロン酸（Ｃ６）、エナント酸（Ｃ７）、カプリル酸（Ｃ８）、ペラルゴン酸（Ｃ９）、カプリン酸（Ｃ１０）、ウンデシル酸（Ｃ１１）、ラウリン酸（Ｃ１２）、トリデシル酸（Ｃ１３）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸（以上、Ｃ１６）、マルガリン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸、α-リノレン酸、γ-リノレン酸、リノール酸、バクセン酸、オレイン酸（以上、Ｃ１８）が挙げられ（括弧内は炭素原子数を示す。）、その他に、ヤシ油脂肪酸、パーム脂肪酸、硬化牛脂脂肪酸等の混合脂肪酸も使用可能である。
【0042】
脂肪酸は、飽和脂肪酸が好ましい。上記脂肪酸のうち飽和脂肪酸としては、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸が挙げられる。
【0043】
芳香族カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、サリチル酸、没食子酸、ケイ皮酸が挙げられる。
【0044】
本発明の方法で製造されるＮ－アシル－アミノ基含有化合物は、上記アミノ基含有化合物のアミノ基と上記カルボキシル基含有化合物のカルボキシル基とがアミド結合を形成した構造を有する化合物である。上記Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物は、上記酵素の存在下において、上記アミノ基含有化合物および上記カルボキシル基含有化合物の反応により生成される。カルボキシル基と反応するアミノ基は、上記アミノ基含有化合物のいずれの位置にあってもよく、例えば、α位、β位、γ位、δ位、ε位のいずれであってもよい。
【0045】
本発明の方法で用いられる酵素として、天然タンパク質または組換えタンパク質を利用することができる。組換えタンパク質は、例えば、無細胞系ベクターを用いて、または本発明で用いられる酵素を産生する微生物から得ることができる。本発明で用いられる酵素は、未精製、粗精製または精製酵素として利用することができる。これらの酵素としては、反応において、固相に固定された固相化タンパク質として利用されてもよい。
【0046】
本発明の方法で用いられる酵素を公知の方法で単離し、必要に応じて更に精製することにより、目的とする酵素が得られる。酵素を産生する微生物としては、酵素の大量入手等の観点より、形質転換微生物が好ましい。本発明では、用語「形質転換」は、宿主細胞に対するポリヌクレオチドの導入のみならず、宿主細胞におけるゲノムの改変もまた意図される。
【0047】
形質転換微生物の培養条件としては、特に限定されず、宿主に応じて標準的な細胞培養条件を用いることができる。形質転換微生物を培養するための培地は公知であり、例えば、ＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加して用いることができる。
培養温度としては、４～４０℃が好ましく、１０～３７℃がより好ましい。培養時間としては、５～１６８時間が好ましく、８～７２時間がより好ましい。ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％～約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５～９であることが好ましい。また、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
培養温度としては、４～４０℃が好ましく、１０～３７℃がより好ましい。培養時間としては、５～１６８時間が好ましく、８～７２時間がより好ましい。ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％～約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５～９であることが好ましい。また、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
【0048】
培養方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。宿主細胞に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。このような培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法が挙げられる。形質転換体微生物により産生される特定のタンパク質の発現がｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターの制御下にある場合、培養培地中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）等の誘導剤を添加して、タンパク質の発現を誘導してもよい。
【0049】
産生された目的酵素は、形質転換微生物の抽出物から公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法等、またはこれらの組み合わせにより、精製および単離することが可能である。目的酵素を分泌発現させた場合には、形質転換微生物を培養して得られた培養液から、菌体を遠心分離等で除くことで目的酵素を含む培養上清が得られる。この培養上清からも目的酵素を精製および単離することが可能である。
【0050】
上記酵素の存在下における反応は、前記酵素を産生する形質転換微生物またはその処理物（例、微生物の破砕物、溶菌物、凍結乾燥物）を用いて行われてもよい。
【0051】
好ましくは、本発明で用いられる上記酵素をコードするポリヌクレオチドは、以下（ａ）～（ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドであってもよい：
（ａ）配列番号１２～２２からなる群から選ばれる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２～２２からなる群から選ばれる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＮ－アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２～２２からなる群から選ばれる塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＮ－アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｄ）（ａ）～（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
（ａ）配列番号１２～２２からなる群から選ばれる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２～２２からなる群から選ばれる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＮ－アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２～２２からなる群から選ばれる塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつＮ－アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｄ）（ａ）～（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【0052】
上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。配列番号１２～２２の塩基配列はそれぞれ、配列番号１～１１のアミノ酸配列をコードする。
【0053】
上記ポリヌクレオチド（ｂ）において、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０～６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【0054】
上記ポリヌクレオチド（ｃ）では、配列番号１２～２２の塩基配列に対する塩基配列の同一性％は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
【0055】
上記ポリヌクレオチド（ｄ）において、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質（酵素）は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（酵素）と同一である。
【0056】
好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。
【0057】
【表1】
【0058】
したがって、本発明では、後述するような宿主細胞のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１～４００個、１～３００個、１～２００個、または１～１００個である。
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１～４００個、１～３００個、１～２００個、または１～１００個である。
【0059】
低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ： ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００６ Ｊｕｎ ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できる。
【0060】
上記酵素の活性が野生型微生物に比し向上した形質転換微生物は、好ましくは、上記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む微生物である。
【0061】
本発明において、用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位はまた、宿主細胞に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ））であっても、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、非固有）であってもよい。発現単位はまた、タンパク質として発現されるべき１つのポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、モノシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）、またはタンパク質として発現されるべき複数のポリヌクレオチド（例えば２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上のポリヌクレオチド）、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）であってもよい。発現単位は、微生物（宿主細胞）においてゲノム領域（例、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが固有に存在する天然ローカスである天然ゲノム領域、もしくは当該天然ローカスではない非天然ゲノム領域）、または非ゲノム領域（例、細胞質内）に含まれることができる。発現単位は、１または２以上（例、１、２、３、４、または５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、および人工染色体が挙げられる。
【0062】
発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質（酵素）を宿主細胞で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよい。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましくは、宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【0063】
一実施形態では、上記酵素の活性が野生型微生物に比し向上した形質転換微生物は、（ｉ）上記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物であってもよい。用語「異種発現単位」とは、発現単位が宿主細胞に対して異種であることを意味する。したがって、本発明では、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが宿主細胞に対して異種である。宿主細胞に対して異種である、発現単位を構成するエレメントとしては、例えば、上述したエレメントが挙げられる。好ましくは、異種発現単位を構成する、目的酵素をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞に対して異種である。したがって、本発明では、目的酵素をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞以外の生物（例、原核生物および真核生物、または微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物）もしくはウイルスに由来するか、または人工的に合成されたものである。異種発現単位としては、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが宿主細胞に対して異種である異種発現単位が好ましい。
【0064】
（ｉ）の微生物は、発現単位を構成するタンパク質が宿主細胞に対して異種であってもよい。このような微生物としては、例えば、下記（Ａ’’）～（Ｃ’’）のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む微生物が挙げられる：
（Ａ’’）配列番号１～１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ’’）配列番号１～１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’’）配列番号１～１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ’’）配列番号１～１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ’’）配列番号１～１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’’）配列番号１～１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アシラーゼ活性を有するタンパク質。
【0065】
別の実施形態では、上記酵素の活性が野生型微生物に比し向上した形質転換微生物は、（ｉｉ）上記酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を非天然ゲノム領域または非ゲノム領域に含む微生物であってもよい。
【0066】
さらに別の実施形態では、上記酵素の活性が野生型微生物に比し向上した形質転換微生物は、（ｉｉｉ）上記酵素をコードするポリヌクレオチドを、複数のコピー数において発現単位に含む微生物であってもよい。複数のコピー数は、例えば２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上のコピー数であってもよい。
【0067】
さらに別の実施形態では、上記酵素の活性が野生型微生物に比し向上した形質転換微生物は、（ｉｖ）上記酵素の発現を増強するように、固有の発現単位（例、プロモーター領域）において変異が導入された非天然の発現単位を含む微生物、または（ｖ）上記酵素の活性が向上するように上記酵素をコードするポリヌクレオチドに対してゲノム編集等の技術により変異が導入された非天然の発現単位を含む微生物であってもよい。
【0068】
好ましくは、上記酵素の活性が野生型微生物に比し向上した形質転換微生物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの微生物である。
【0069】
本発明において、形質転換微生物として使用される宿主細胞としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌、および真菌が挙げられる。細菌はまた、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。グラム陽性細菌としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が挙げられる。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましい。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌が挙げられる。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）が好ましい。真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物が好ましい。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
【0070】
本発明において、形質転換微生物として使用される宿主細胞としては、例えば、アシルアミノ酸、脂肪酸、またはアミノ酸の分解系が弱化または欠損した宿主であってもよい。上記分解系が弱化または欠損した宿主としては、例えば、上記分解系に関連する酵素等のタンパク質が弱化または欠損した宿主、上記分解系に関連する酵素等のタンパク質の阻害因子を産生する宿主が挙げられる。上記分解系に関連する酵素等のタンパク質が弱化または欠損した宿主としては、例えば、宿主ゲノム中に上記タンパク質の発現量を低下または欠失させる変異を含む宿主、宿主ゲノム中に上記タンパク質の活性を低下または欠失させる変異を含む宿主が挙げられる。上記分解系に関連する酵素等のタンパク質の阻害因子を産生または強化する宿主としては、例えば、上記阻害因子の発現単位が形質転換により導入された宿主、宿主ゲノム中に上記阻害因子の発現量を強化させる変異を含む宿主、宿主ゲノム中に上記阻害因子の活性を強化させる変異を含む宿主が挙げられる。アシルアミノ酸の分解系に関連する酵素等のタンパク質としては、例えば、アシラーゼ、脂肪酸の分解系に関連する酵素等のタンパク質としては、例えば、アシルＣｏＡ合成酵素が挙げられる。
【0071】
本発明において、形質転換微生物として使用される宿主細胞としては、酵素反応の基質の供給効率を向上させて生成効率を向上させるために、例えば、アミノ酸と脂肪酸の取り込み能が強化された宿主であってもよい。上記取り込み能が強化された宿主としては、例えば、上記取り込み能に関連する酵素等のタンパク質を産生または強化する宿主が挙げられる。上記取り込み能に関連する酵素等のタンパク質を産生または強化する宿主としては、例えば、上記タンパク質の発現単位が形質転換により導入された宿主、宿主ゲノム中に上記タンパク質の発現量を強化させる変異を含む宿主、宿主ゲノム中に上記タンパク質の活性を強化させる変異を含む宿主が挙げられる。
【0072】
本発明で用いられる形質転換微生物は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、上述したような形質転換微生物は、発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、またはゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むこと、および宿主細胞が固有に備える発現単位を改変することが可能である。
【0073】
発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【0074】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【0075】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用されている発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、ｐＥＴ（例、ｐＥＴ２８ａ）およびその誘導体が挙げられる。
【0076】
本発明の方法において用いられる基質であるアミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物は、上記酵素を含む反応系（例、上記酵素を含む水溶液、上記酵素を産生する形質転換微生物を含む培養液、上記酵素を産生する形質転換微生物の処理物）に添加することができる。あるいは、本発明の方法では、別の反応系において生成したアミノ基含有化合物またはカルボキシル基含有化合物を基質として利用することもできる。
【0077】
本発明の方法が上記酵素自体（例、精製酵素）を用いて行われる場合、反応系としては、上記酵素を含む水溶液を用いることができる。水溶液としては、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液が挙げられる。ｐＨは、例えば、約５～１０が好ましい。反応系における酵素、ならびにアミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化合物（基質）の量、ならびに反応時間は、生成されるべきＮ－アシル－アミノ基含有化合物の量に応じて、適宜調節することができる。反応温度は、反応が進行する限り特に限定されないが、２０～４０℃が好ましい。
【0078】
本発明の方法は、ＡＴＰ再生系との組合せで行われてもよい。本発明の方法が上記酵素自体（例、精製酵素）を用いて行われる場合、ＡＴＰ再生系との組合せとしては、例えば、ＡＴＰ再生酵素との組合せ（例、混合）による反応が挙げられる。ＡＴＰ再生酵素としては、例えば、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素とポリリン酸キナーゼとの組み合わせ、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素とアデニル酸キナーゼとの組み合わせが挙げられる。本発明の方法が前記酵素を産生する形質転換微生物またはその処理物を用いて行われる場合、ＡＴＰ再生系との組合せとしては、例えば、ＡＴＰ供給能を増強した微生物を宿主として用いることが挙げられる。ＡＴＰ供給能を増強した微生物としては、例えば、上述したＡＴＰ再生酵素を産生または強化する微生物が挙げられる。ＡＴＰ再生酵素を産生または強化する微生物としては、例えば、ＡＴＰ再生酵素の発現単位が形質転換により導入された宿主、宿主ゲノム中にＡＴＰ再生酵素の発現量を強化させる変異を含む宿主、宿主ゲノム中にＡＴＰ再生酵素の活性を強化させる変異を含む宿主が挙げられる。
【0079】
Ｎ－アシル－アミノ基含有化合物の製造の確認は、適宜行うことができる。例えば、このような確認は、反応系に反応停止液（例、１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析することにより行うことができる。
【実施例0080】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0081】
実施例１：アシルアミノ酸合成酵素の発現および精製
１）アシルアミノ酸合成酵素発現プラスミドの構築
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＪＡＲ１（ＡｔＪＡＲ１、Ｑ９ＳＫＥ２、配列番号３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．６（ＡｔＧＨ３－６、Ｑ９ＬＳＱ４、配列番号１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．５（ＡｔＧＨ３－５、Ｏ８１８２９、配列番号４）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ＧＨ３－１０（ＡｔＧＨ３－１０、ＯＡＯ９８０７７、配列番号５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来４－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｂｅｎｚｏａｔｅｓ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｌｉｇａｓｅ ＧＨ３．１２（ＡｔＧＨ３－１２、Ｑ９ＬＹＵ４、配列番号６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．１７（ＡｔＧＨ３－１７、Ｑ９ＦＺ８７、配列番号７）、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｓｃｕｓ由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣｆＨＰ、ＷＰ＿００２６２６３３６、配列番号９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ ７３３５由来ＧＨ３ ａｕｘｉｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＳｓＧＨ３、ＷＰ＿００６４５８０２２、配列番号８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ由来ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｔｅ－ｌｙｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＰｓＩＡＡＬ、Ｐ１８２０４、配列番号１０）、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰａＨＰ、ＷＰ＿０３１５９１９４８、配列番号１１）の遺伝子について、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用にコドンを最適化し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）のマルチクローニングサイト内のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドＤＮＡをユーロフィンジェノミクス社から購入した。プラスミドをそれぞれ、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＪＡＲ１、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－６、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－５、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１０、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１２、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１７、ｐＥＴ－２８ａ－ＣｆＨＰ、ｐＥＴ－２８ａ－ＳｓＧＨ３、ｐＥＴ－２８ａ－ＰｓＩＡＡＬ、ｐＥＴ－２８ａ－ＰａＨＰと命名した。本プラスミドでは、Ｎ末端側にＨｉｓ－ｔａｇおよびトロンビン切断部位が融合したタンパク質が発現される。
１）アシルアミノ酸合成酵素発現プラスミドの構築
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＪＡＲ１（ＡｔＪＡＲ１、Ｑ９ＳＫＥ２、配列番号３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．６（ＡｔＧＨ３－６、Ｑ９ＬＳＱ４、配列番号１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．５（ＡｔＧＨ３－５、Ｏ８１８２９、配列番号４）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ＧＨ３－１０（ＡｔＧＨ３－１０、ＯＡＯ９８０７７、配列番号５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来４－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｂｅｎｚｏａｔｅｓ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｌｉｇａｓｅ ＧＨ３．１２（ＡｔＧＨ３－１２、Ｑ９ＬＹＵ４、配列番号６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．１７（ＡｔＧＨ３－１７、Ｑ９ＦＺ８７、配列番号７）、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｓｃｕｓ由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣｆＨＰ、ＷＰ＿００２６２６３３６、配列番号９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ ７３３５由来ＧＨ３ ａｕｘｉｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＳｓＧＨ３、ＷＰ＿００６４５８０２２、配列番号８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ由来ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｔｅ－ｌｙｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＰｓＩＡＡＬ、Ｐ１８２０４、配列番号１０）、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰａＨＰ、ＷＰ＿０３１５９１９４８、配列番号１１）の遺伝子について、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用にコドンを最適化し、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）のマルチクローニングサイト内のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドＤＮＡをユーロフィンジェノミクス社から購入した。プラスミドをそれぞれ、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＪＡＲ１、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－６、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－５、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１０、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１２、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１７、ｐＥＴ－２８ａ－ＣｆＨＰ、ｐＥＴ－２８ａ－ＳｓＧＨ３、ｐＥＴ－２８ａ－ＰｓＩＡＡＬ、ｐＥＴ－２８ａ－ＰａＨＰと命名した。本プラスミドでは、Ｎ末端側にＨｉｓ－ｔａｇおよびトロンビン切断部位が融合したタンパク質が発現される。
【0082】
Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｄｏ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ＧＨ３．８（ＯｓＧＨ３－８、Ａ３ＢＬＳ０、配列番号２）の遺伝子について、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用にコドンを最適化した合成ＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社より購入した。合成ＤＮＡをＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩで処理したｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出し、ｐＥＴ－２８ａ－ＯｓＧＨ３－８と命名した。本プラスミドでは、Ｎ末端側にＨｉｓ－ｔａｇおよびトロンビン切断部位が融合したタンパク質が発現される。
【0083】
２）アシルアミノ酸合成酵素の発現
プラスミドｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＪＡＲ１、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－６、ｐＥＴ－２８ａ－ＯｓＧＨ３－８、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－５、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１２、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１７、ｐＥＴ－２８ａ－ＰｓＩＡＡＬ、ｐＥＴ－２８ａ－ＰａＨＰをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ１００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．６に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
プラスミドｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＪＡＲ１、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－６、ｐＥＴ－２８ａ－ＯｓＧＨ３－８、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－５、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１２、ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１７、ｐＥＴ－２８ａ－ＰｓＩＡＡＬ、ｐＥＴ－２８ａ－ＰａＨＰをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ１００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．６に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
【0084】
プラスミドｐＥＴ－２８ａ－ＣｆＨＰをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ１００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．２に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
【0085】
プラスミドｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－１０をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴＢ１００ｍＬに植菌し、坂口フラスコ用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．４に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
【0086】
プラスミドｐＥＴ－２８ａ－ＳｓＧＨ３をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴＢ１００ｍＬに植菌し、坂口フラスコ用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．２に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
【0087】
３）アシルアミノ酸合成酵素の精製
培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０または１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。得られた可溶性画分を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０または１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅで平衡化したＨｉｓ－ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ５ｍｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０または１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いて洗い流した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いて、５ｍＬ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮とバッファー交換を行った。必要に応じて、培養液量を増やして精製を行った。
培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０または１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。得られた可溶性画分を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０または１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅで平衡化したＨｉｓ－ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ５ｍｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０または１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いて洗い流した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いて、５ｍＬ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮とバッファー交換を行った。必要に応じて、培養液量を増やして精製を行った。
【0088】
実施例２：アシルアミノ酸合成酵素を用いたＮ－カプリノイルアミノ酸の合成
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ カプリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－カプリノイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルを検出した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ カプリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－カプリノイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルを検出した。
【0089】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は以下の通りである。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍＣｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）
移動相Ａ：０．１％ ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍＣｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）
移動相Ａ：０．１％ ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：
【0090】
【表2】
【0091】
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
インジェクション量：２μＬ
カラム温度：４０℃
イオン化法：ＥＳＩ－ネガティブ
インジェクション量：２μＬ
カラム温度：４０℃
イオン化法：ＥＳＩ－ネガティブ
【0092】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析の結果、以下の表３に示す酵素とアミノ酸を組み合わせた反応液において、該当するＮ－カプリノイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルが確認された。
【0093】
【表3】
【0094】
実施例３：アシルアミノ酸合成酵素を用いたＮ－カプリノイル－アミノ酸誘導体、Ｎ－カプリノイル－Ｄ－アミノ酸、およびＮ－カプリノイル－ペプチドの合成
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸誘導体、またはＤ－アミノ酸、またはペプチド、５ｍＭ カプリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－カプリノイルアミノ酸誘導体、またはＮ－カプリノイル－Ｄ－アミノ酸、またはＮ－カプリノイル－ペプチドと一致する分子量のシグナルを検出した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸誘導体、またはＤ－アミノ酸、またはペプチド、５ｍＭ カプリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－カプリノイルアミノ酸誘導体、またはＮ－カプリノイル－Ｄ－アミノ酸、またはＮ－カプリノイル－ペプチドと一致する分子量のシグナルを検出した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。
【0095】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析の結果、以下の表４に示す酵素とアミノ酸誘導体、またはＤ－アミノ酸、またはペプチドを組み合わせた反応液において、該当するＮ－カプリノイル－アミノ酸誘導体、またはＮ－カプリノイル－Ｄ－アミノ酸、またはＮ－カプリノイル－ペプチドと一致する分子量のシグナルが確認された。
【0096】
【表4】
【0097】
実施例４：アシルアミノ酸合成酵素を用いたＮ－ラウロイルアミノ酸、Ｎ－ラウロイル－アミノ酸誘導体の合成
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、またはアミノ酸誘導体、５ｍＭ ラウリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－ラウロイルアミノ酸、Ｎ－ラウロイル－アミノ酸誘導体と一致する分子量のシグナルを検出した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、またはアミノ酸誘導体、５ｍＭ ラウリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。反応終了後、０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－ラウロイルアミノ酸、Ｎ－ラウロイル－アミノ酸誘導体と一致する分子量のシグナルを検出した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。
【0098】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析の結果、以下の表５に示す酵素とアミノ酸、またはアミノ酸誘導体を組み合わせた反応液において、該当するＮ－ラウロイルアミノ酸、Ｎ－ラウロイル－アミノ酸誘導体と一致する分子量のシグナルが確認された。
【0099】
【表5】
【0100】
実施例５：アシルアミノ酸合成酵素を用いたＮ－アシルアミノ酸の合成
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ 脂肪酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．１ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。アミノ酸は、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－５、ＡｔＧＨ３－１２ではＬ－Ａｓｐ、ＣｆＨＰではＧｌｙまたはＬ－Ａｌａを用いた。反応終了後、０．４ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、ＵＶ２１０ｎｍ検出により生成したＮ－アシルアミノ酸を定量した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。分析の結果、ＡｔＧＨ３－６を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は３．９ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．５ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は２．２ｍＭ、ＯｓＧＨ３－８を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．３ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は３．５ｍＭ、ＡｔＧＨ３－５を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．１ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は２．５ｍＭ、ＡｔＧＨ３－１２を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は１．６ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は０．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は０．２ｍＭ、ＣｆＨＰを用いた場合、Ｎα－カプリロイルグリシンは４．５ｍＭ、Ｎα－カプリノイルグリシンは４．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイルグリシンは０．１ｍＭ、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アラニンは３．１ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アラニンは３．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アラニンは０．４ｍＭが検出された。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ 脂肪酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．１ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。アミノ酸は、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－５、ＡｔＧＨ３－１２ではＬ－Ａｓｐ、ＣｆＨＰではＧｌｙまたはＬ－Ａｌａを用いた。反応終了後、０．４ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、ＵＶ２１０ｎｍ検出により生成したＮ－アシルアミノ酸を定量した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。分析の結果、ＡｔＧＨ３－６を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は３．９ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．５ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は２．２ｍＭ、ＯｓＧＨ３－８を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．３ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は３．５ｍＭ、ＡｔＧＨ３－５を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．１ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は４．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は２．５ｍＭ、ＡｔＧＨ３－１２を用いた場合、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アスパラギン酸は１．６ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アスパラギン酸は０．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アスパラギン酸は０．２ｍＭ、ＣｆＨＰを用いた場合、Ｎα－カプリロイルグリシンは４．５ｍＭ、Ｎα－カプリノイルグリシンは４．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイルグリシンは０．１ｍＭ、Ｎα－カプリロイル－Ｌ－アラニンは３．１ｍＭ、Ｎα－カプリノイル－Ｌ－アラニンは３．６ｍＭ、Ｎα－ラウロイル－Ｌ－アラニンは０．４ｍＭが検出された。
【0101】
実施例６：アシルアミノ酸合成酵素を用いたＮ－アシルアミノ酸の合成
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ 脂肪酸ナトリウム（パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムは３ｍＭ）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．１ｍＬの反応液を２５℃で２４時間振とうさせた。パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムを用いた場合には、反応液に終濃度１０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含有していた。アミノ酸は、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－５、ＡｔＧＨ３－１２ではＬ－Ａｓｐ、ＡｔＪＡＲ１ではＬ－Ｉｌｅ、ＡｔＧＨ３－１０、ＳｓＧＨ３ではＬ－Ａｌａ、ＡｔＧＨ３－１７ではＬ－Ｇｌｕ、ＣｆＨＰではＧｌｙ、ＰｓＩＡＡＬではＬ－Ｌｙｓ、ＰａＨＰではＬ－Ｃｙｓを用いた。反応終了後、０．４ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－アシルアミノ酸と一致する分子量のシグナルを検出した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ 脂肪酸ナトリウム（パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムは３ｍＭ）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．１ｍＬの反応液を２５℃で２４時間振とうさせた。パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムを用いた場合には、反応液に終濃度１０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含有していた。アミノ酸は、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－５、ＡｔＧＨ３－１２ではＬ－Ａｓｐ、ＡｔＪＡＲ１ではＬ－Ｉｌｅ、ＡｔＧＨ３－１０、ＳｓＧＨ３ではＬ－Ａｌａ、ＡｔＧＨ３－１７ではＬ－Ｇｌｕ、ＣｆＨＰではＧｌｙ、ＰｓＩＡＡＬではＬ－Ｌｙｓ、ＰａＨＰではＬ－Ｃｙｓを用いた。反応終了後、０．４ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－アシルアミノ酸と一致する分子量のシグナルを検出した。
【0102】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は以下の通りである。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍＣｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）移動相Ａ：０．１％ ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍＣｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）移動相Ａ：０．１％ ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：
【0103】
【表6】
【0104】
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
インジェクション量：２μＬ
カラム温度：４０℃
イオン化法：ＥＳＩ－ネガティブ
インジェクション量：２μＬ
カラム温度：４０℃
イオン化法：ＥＳＩ－ネガティブ
【0105】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析の結果、以下の表７に示す酵素と脂肪酸ナトリウムを組み合わせた反応液において、該当するＮ－アシルアミノ酸と一致する分子量のシグナルが確認された。
【0106】
【表7】
【0107】
実施例７：アシルアミノ酸合成酵素のＡＴＰ依存性解析
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ カプリン酸ナトリウム、１０ｍＭ または０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２５ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。アミノ酸は、ＡｔＧＨ３－６ではＬ－Ａｓｐ、ＣｆＨＰではＧｌｙを用いた。反応終了後、０．２ｍＬの反応液に０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、ＵＶ２１０ｎｍ検出により生成したＮ－カプリノイルアミノ酸を定量した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。分析の結果、ＡＴＰ存在下においては、ＡｔＧＨ３－６で３．８ｍＭ、ＣｆＨＰで５．２ｍＭのＮ－カプリノイルアミノ酸が検出されたが、ＡＴＰ非存在下ではＡｔＧＨ３－６、ＣｆＨＰいずれを用いた場合においてもＮ－カプリノイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルは検出されなかった。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ アミノ酸、５ｍＭ カプリン酸ナトリウム、１０ｍＭ または０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬ 精製酵素、ｐＨ８．０、０．２５ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。アミノ酸は、ＡｔＧＨ３－６ではＬ－Ａｓｐ、ＣｆＨＰではＧｌｙを用いた。反応終了後、０．２ｍＬの反応液に０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、ＵＶ２１０ｎｍ検出により生成したＮ－カプリノイルアミノ酸を定量した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。分析の結果、ＡＴＰ存在下においては、ＡｔＧＨ３－６で３．８ｍＭ、ＣｆＨＰで５．２ｍＭのＮ－カプリノイルアミノ酸が検出されたが、ＡＴＰ非存在下ではＡｔＧＨ３－６、ＣｆＨＰいずれを用いた場合においてもＮ－カプリノイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルは検出されなかった。
【0108】
実施例８：アシルアミノ酸合成酵素発現菌体を用いたＮ－カプリロイルアミノ酸の合成
（１）各種菌体液の調製
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－６、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＯｓＧＨ３－８、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａを２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ １００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．６に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＣｆＨＰを２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ １００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．２に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
（１）各種菌体液の調製
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－６、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＯｓＧＨ３－８、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＡｔＧＨ３－５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａを２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ １００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．６に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－２８ａ－ＣｆＨＰを２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ １００ｍＬに植菌し、坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養を行った。ＯＤ６１０が０．２に到達したら１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１５℃で２４時間振とう培養を行った。
【0109】
（無細胞抽出液の調製）
培養終了後、得られた培養液５ｍＬより菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄した後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）１ｍＬに菌体を懸濁した。１０～２０分間室温でインキュベートした後、遠心分離により上清を回収し、無細胞抽出液とした。
（洗浄菌体液の調製）
培養終了後、得られた培養液５ｍＬより菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）１ｍＬに菌体を懸濁し、洗浄菌体液とした。
（菌体液の調製）
培養終了後、得られた培養液１５ｍＬを遠心分離により濃縮して３ｍＬとし、菌体液とした。
培養終了後、得られた培養液５ｍＬより菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄した後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）１ｍＬに菌体を懸濁した。１０～２０分間室温でインキュベートした後、遠心分離により上清を回収し、無細胞抽出液とした。
（洗浄菌体液の調製）
培養終了後、得られた培養液５ｍＬより菌体を遠心分離により集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）１ｍＬに菌体を懸濁し、洗浄菌体液とした。
（菌体液の調製）
培養終了後、得られた培養液１５ｍＬを遠心分離により濃縮して３ｍＬとし、菌体液とした。
【0110】
（２）各種菌体液を用いたＮ－カプリロイルアミノ酸の合成反応
３３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３．３ｍＭ アミノ酸、３．３ｍＭ カプリル酸ナトリウム、６．７または０ｍＭ ＡＴＰ、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ ＤＴＴ、３０μＬ菌体液等（無細胞抽出液、洗浄菌体液、菌体液）、ｐＨ８．０、０．３ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。アミノ酸として、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－５ではＬ－Ａｓｐ、ＣｆＨＰではＧｌｙまたはＬ－Ａｌａを用いた。反応終了後、０．２ｍＬの反応液に０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－カプリロイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルを検出した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析の結果、以下の表８に示す菌体液等を用いた反応液において、該当するＮ－カプリロイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルが確認された。
３３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３．３ｍＭ アミノ酸、３．３ｍＭ カプリル酸ナトリウム、６．７または０ｍＭ ＡＴＰ、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ ＤＴＴ、３０μＬ菌体液等（無細胞抽出液、洗浄菌体液、菌体液）、ｐＨ８．０、０．３ｍＬの反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。アミノ酸として、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＧＨ３－５ではＬ－Ａｓｐ、ＣｆＨＰではＧｌｙまたはＬ－Ａｌａを用いた。反応終了後、０．２ｍＬの反応液に０．８ｍＬの反応停止液（１％（ｖ／ｖ）リン酸、７５％（ｖ／ｖ）メタノール）を添加し、混合液をフィルターろ過後にＵＰＬＣ－ＭＳ分析に供し、Ｎ－カプリロイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルを検出した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件は実施例２に記載の通りである。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析の結果、以下の表８に示す菌体液等を用いた反応液において、該当するＮ－カプリロイルアミノ酸と一致する分子量のシグナルが確認された。
【0111】
【表8】
【0112】
精製酵素を用いた反応においてはＡＴＰ非存在下ではＮ－アシルアミノ酸の生成は認められなかったが（実施例７）、菌体液を用いた反応においてはＡＴＰ非存在下でもＮ－アシルアミノ酸の生成が確認されたため、菌体中に含まれるＡＴＰを利用して酵素反応が進行したと考えられる。
【0113】
ＵＶ２１０ｎｍ検出により生成したＮ－アシルアミノ酸を定量した結果、ＣｆＨＰではＧｌｙを基質とした場合、洗浄菌体液で２．８ｍＭ、菌体液（ＡＴＰ存在下）で２．２ｍＭ、菌体液（ＡＴＰ非存在下）で２．６ｍＭ、Ｌ－Ａｌａを基質とした場合、洗浄菌体液で２．４ｍＭ、菌体液（ＡＴＰ存在下）で０．９ｍＭ、菌体液（ＡＴＰ非存在下）で１．０ｍＭのＮ－カプリロイルアミノ酸が検出された。
【産業上の利用可能性】
【0114】
本発明は、香粧品素材（特に、界面活性剤）等に利用可能なＮ－アシル－アミノ基含有化合物の製造のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0115】
配列番号１～１１はそれぞれ、ＡｔＧＨ３－６、ＯｓＧＨ３－８、ＡｔＪＡＲ１（ＡｔＧＨ３－１１）、ＡｔＧＨ３－５、ＡｔＧＨ３－１０、ＡｔＧＨ３－１２、ＡｔＧＨ３－１７、ＳｓＧＨ３、ＣｆＨＰ（ＷＰ＿００２６２６３３６）、ＰｓＩＡＡＬ、およびＰａＨＰ（ＷＰ＿０３１５９１９４８）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２～２２はそれぞれ、エシェリヒア・コリ発現用にコドンを最適化した配列番号１～１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
配列番号１２～２２はそれぞれ、エシェリヒア・コリ発現用にコドンを最適化した配列番号１～１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
【配列表】