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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024176101
(43)【公開日】2024-12-19
(54)【発明の名称】肥満を治療又は予防するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/353 20060101AFI20241212BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20241212BHJP
C07D 311/32 20060101ALN20241212BHJP
C12N 5/077 20100101ALN20241212BHJP
【ＦＩ】
A61K31/353
A61P3/04 ZNA
C07D311/32
C12N5/077
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023094357
(22)【出願日】2023-06-07
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）発行物名：第２５回インターフェックスＷｅｅｋ東京の発表要旨、掲載ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｐｈｅｘ．ｊｐ／ｔｏｋｙｏ／ｊａ－ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／２０２３／ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ／ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ－ｄｅｔａｉｌｓ．ｏｒｇ－８６ｂａ６７７ｂ－４６ｄ４－４２３ａ－９ｄｅｄ－ｂ６６ｄｅｂ７８６ａ０５．ｈｔｍｌ＃／、掲載年月日：令和５年４月１１日 （２）発行物名：第５回ファーマラボＥＸＰＯ東京医薬品研究・開発展の出展要旨、掲載ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｐｊｔ２０２３．ｔｅｍｓ－ｓｙｓｔｅｍ．ｃｏｍ／ｅｘｈｉＳｅａｒｃｈ／ＩＰＷ／ｊｐ／ＤｅｔａｉｌｓＦｏｒＡＤ？ｉｄ＝ＴＸ３４ｕｎ５４ｚｃｃ％３Ｄ＆ｔｙｐｅ＝４、掲載年月日：令和５年４月１９日
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】三浦 基文
(72)【発明者】
【氏名】和田 平
(72)【発明者】
【氏名】野伏 康仁
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BD26
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA70
(57)【要約】
【課題】中性脂肪の蓄積を抑制することが可能な、肥満を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
【解決手段】一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体を含有する、肥満を治療又は予防するための医薬組成物。Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、置換基を表す。ｎ１は、０～４の整数を表す。ｎ２は、０～７の整数を表す。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体を含有する、肥満を治療又は予防するための医薬組成物。Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、置換基を表す。ｎ１は、０～４の整数を表す。ｎ２は、０～７の整数を表す。
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体を含有する、肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、置換基を表し；ｎ１は、０～４の整数を表し；ｎ２は、０～７の整数を表す。］
【化1】
【請求項2】
前記化合物（１）が、下記一般式（１－１）で表される化合物である、請求項１に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ２１は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表す。］
【化2】
【請求項3】
前記一般式（１－１）中のＲ１１、Ｒ１２、及びＲ２１が、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子である、請求項２に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項4】
前記一般式（１－１）中のＲ１１、Ｒ１２、及びＲ２１が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子である、請求項３に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項5】
前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化を誘導する、請求項１に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項6】
白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換を誘導する、請求項１に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肥満を治療又は予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
肥満治療には、バランスの取れた食事及び適度な運動が最も効果的である。しかしながら、多忙な日常生活においては、それらの継続は困難である。肥満治療の手段の一つとして薬物療法がある。肥満治療用の薬物候補として、ベージュ脂肪細胞を特異的に誘導する成分の探索が行われているが、十分な安全性と有効性とを兼ね備えた成分は、未だ得られていない。
【0003】
フラバノンは、植物に含有されるフラボノイドの一種であり、現在、約４５０種以上の化合物が天然に広く存在していることが知られている。近年、キク科植物及びコメ等の含まれるフラバノンであるサクラネチンに、脂肪組織を構成する脂肪細胞の形成を促進する作用があることが報告されている（非特許文献１）。また、柑橘類に含まれるフラバノンであるナリンゲニンに、脂肪細胞分化を抑制する作用が報告されている（非特許文献２）。
一方、本発明者らは、フッ化物イオン触媒を用いたフラバノンの効率的な化学合成法を確立している（非特許文献３）。
一方、本発明者らは、フッ化物イオン触媒を用いたフラバノンの効率的な化学合成法を確立している（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Saito et al., Sakuranetin induces adipogenesis of 3T3-L1 cells through enhanced expression of PPARgamma2. 2008. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Aug 8;372(4):835-9.
【非特許文献2】Dayarathne et al., Restoration of the adipogenic gene expression by naringenin and naringin in 3T3-L1 adipocytes. J Vet Sci. 2021 Jul; 22(4): e55.
【非特許文献3】Miura et al., Convenient synthesis of flavanone derivatives via oxa-Michael addition using catalytic amount of aqueous cesium fluoride. Tetrahedron Letters Volume 85, 23 November 2021, 153480.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
中性脂肪の蓄積を抑制可能な化合物は、肥満を効果的に治療及び／又は予防できると期待される。
【0006】
そこで、本発明は、中性脂肪の蓄積を抑制することが可能な、肥満を治療又は予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体を含有する、肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［１］下記一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩と、薬学的に許容される担体を含有する、肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【0008】
【化1】
【0009】
［２］前記化合物（１）が、下記一般式（１－１）で表される化合物である、［１］に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【0010】
【化2】
【0011】
［３］前記一般式（１－１）中のＲ１１、Ｒ１２、及びＲ２１が、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子である、［２］に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［４］前記一般式（１－１）中のＲ１１、Ｒ１２、及びＲ２１が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子である、［３］に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［５］前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化を誘導する、［１］～［４］のいずれか１つに記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［６］白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換を誘導する、［１］～［５］のいずれか１つに記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［４］前記一般式（１－１）中のＲ１１、Ｒ１２、及びＲ２１が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子である、［３］に記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［５］前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化を誘導する、［１］～［４］のいずれか１つに記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
［６］白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換を誘導する、［１］～［５］のいずれか１つに記載の肥満を治療又は予防するための医薬組成物。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、中性脂肪の蓄積を抑制することが可能な、肥満を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】脂肪細胞の分化及び形質転換を説明する模式図である。
【図2】実施例１において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣの影響を評価した結果を示す顕微鏡画像である。
【図3】実施例１において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣの影響を脂肪蓄積量により定量的に評価した結果を示す図である。
【図4】実施例２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣの影響を、遺伝子発現量により評価した結果を示す図である。白色脂肪細胞の分化マーカー：Ｐｐａｒγ２、ａＰ２、Ｃ／ｅｂｐα；ベージュ脂肪細胞の分化マーカー：Ｕｃｐ１；ベージュ脂肪細胞関連遺伝子：Ｅｌｏｖｌ３、Ｐｇｃ１α。
【図5】実施例３における各処理群の詳細を示す図である。
【図6A】実施例３において、２ＮＣによるベージュ脂肪細胞分化誘導に関与する因子を検証した結果を示す図である。
【図6B】実施例３において、２ＮＣによるベージュ脂肪細胞分化誘導に関与する因子を検証した結果を示す図である。
【図6C】実施例３において、２ＮＣによるベージュ脂肪細胞分化誘導に関与する因子を検証した結果を示す図である。
【図7】実施例４において、２ＮＣによるベージュ化過程におけるＦｇｆ９遺伝子の発現量の変化を評価した結果を示す図である。
【図8】実施例５において、２ＮＣによるベージュ化過程におけるミトコンドリア量の変化を評価した結果を示す図である。
【図9】実施例６において、２ＮＣによる白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換を検証した結果を示す図である。
【図10】実施例７において、２ＮＣによるベージュ脂肪細胞への形質転換についてミトコンドリア量の観点から検証した結果を示す図である。
【図11】実施例８において、２ＮＣを投与したマウスの体重量の変動を示す図である。
【図12】実施例８において、２ＮＣを投与したマウスの組織重量の変動を示す図である。ｅＷＡＴ：精巣上体周囲の脂肪組織重量；ｓＷＡＴ：皮下脂肪組織重量。
【図13】実施例９において、２ＮＣを投与したマウスの脂肪組織の病理組織画像である。
【図14】実施例１０において、２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織におけるＵＣＰ１のタンパク質量を評価した結果を示す図である。
【図15】実施例１１において、２ＮＣを投与したマウスの脂肪組織におけるミトコンドリア量の変化を評価した結果を示す図である。
【図16】実施例１２及び１３で用いた、２ＮＣ誘導体を示す。フラバノン骨格のＡ環を修飾した２ＮＣ誘導体である。
【図17】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を評価した結果を示す顕微鏡画像である。
【図18A】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を、遺伝子発現量により評価した結果を示す図である。
【図18B】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を、遺伝子発現量により評価した結果を示す図である。
【図19】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を、ミトコンドリア量により評価した結果を示す図である。
【図20】実施例１２及び１３で用いた、２ＮＣ誘導体を示す。フラバノン骨格のＢ環を修飾した２ＮＣ誘導体である。
【図21】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を評価した結果を示す顕微鏡画像である。
【図22】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を、遺伝子発現量により評価した結果を示す図である。
【図23】実施例１２において、前駆脂肪細胞の分化誘導に対する２ＮＣ誘導体の影響を、ミトコンドリア量により評価した結果を示す図である。
【図24】実施例１３において、２ＮＣ誘導体による、白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換促進作用を、遺伝子発現量により評価した結果を示す図である。
【図25】実施例１３において、２ＮＣ誘導体による、白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換促進作用を、ミトコンドリア量の観点から検証した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
「脂肪族」とは、芳香族に対する相対的な概念であって、芳香族性を持たない基、化合物等を意味するものと定義する。
「アルキル基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の１価の飽和炭化水素基を包含するものとする。アルコキシ基中のアルキル基も同様である。
「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
「置換基を有してもよい」と記載する場合、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換する場合と、メチレン基（－ＣＨ２－）を２価の基で置換する場合との両方を含む。
「アルキル基」は、特に断りがない限り、直鎖状、分岐鎖状及び環状の１価の飽和炭化水素基を包含するものとする。アルコキシ基中のアルキル基も同様である。
「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
「置換基を有してもよい」と記載する場合、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換する場合と、メチレン基（－ＣＨ２－）を２価の基で置換する場合との両方を含む。
【0015】
本明細書及び本特許請求の範囲において、化学式で表される構造によっては、不斉炭素が存在し、エナンチオ異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）やジアステレオ異性体（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）が存在し得るものがある。その場合は一つの化学式でそれら異性体を代表して表す。それらの異性体は単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。
【0016】
［肥満を治療又は予防するための医薬組成物］
本発明の第１の態様は、肥満を治療又は予防するための医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、下記一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩を有効成分として含有する。
本発明の第１の態様は、肥満を治療又は予防するための医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、下記一般式（１）で表される化合物（１）又はその塩を有効成分として含有する。
【0017】
【化3】
【0018】
（化合物（１））
化合物（１）は、中性脂肪の蓄積を抑制する作用を有し、中性脂肪の蓄積抑制剤として機能する。化合物（１）による中性脂肪の蓄積の抑制は、ベージュ化の誘導によるものでもよく、前駆脂肪細胞から白色脂肪細胞への分化の抑制によるものであってもよい。
化合物（１）は、中性脂肪の蓄積を抑制する作用を有し、中性脂肪の蓄積抑制剤として機能する。化合物（１）による中性脂肪の蓄積の抑制は、ベージュ化の誘導によるものでもよく、前駆脂肪細胞から白色脂肪細胞への分化の抑制によるものであってもよい。
【0019】
化合物（１）がベージュ化誘導作用を有する場合、化合物（１）は、ベージュ化誘導剤として機能する。「ベージュ化」とは、前駆脂肪細胞の分化によりベージュ脂肪細胞が誘導されること、及び白色脂肪細胞の形質転換によりベージュ脂肪細胞が誘導されること、の両方を包含する概念である。ベージュ化誘導剤は、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導、及び白色脂肪細胞の形質転換によるベージュ脂肪細胞の誘導のいずれか又は両方を促進する作用を有する薬剤である。
図１は、脂肪細胞の分化及び形質転換を説明する模式図である。前駆脂肪細胞は、白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に分化する。ベージュ脂肪細胞は、白色脂肪細胞の可逆的な形質転換によっても誘導される。白色脂肪細胞は、中性脂肪を蓄積する脂肪細胞であり、中性脂肪の含有量が多い。ベージュ脂肪細胞は、ミトコンドリア含有量が多く、中性脂肪を消費して、エネルギーを産生する。そのため、ベージュ化を誘導することにより、中性脂肪の蓄積を抑制し、肥満を治療又は予防することができる。
図１は、脂肪細胞の分化及び形質転換を説明する模式図である。前駆脂肪細胞は、白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞に分化する。ベージュ脂肪細胞は、白色脂肪細胞の可逆的な形質転換によっても誘導される。白色脂肪細胞は、中性脂肪を蓄積する脂肪細胞であり、中性脂肪の含有量が多い。ベージュ脂肪細胞は、ミトコンドリア含有量が多く、中性脂肪を消費して、エネルギーを産生する。そのため、ベージュ化を誘導することにより、中性脂肪の蓄積を抑制し、肥満を治療又は予防することができる。
【0020】
化合物（１）は、前記一般式（１）で表される化合物である。
前記一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２における置換基は、芳香環の水素原子を置換する１価の基である。Ｒ１及びＲ２における置換基としては、例えば、置換基を有してもよい炭化水素基、ヒドロキシ基、及びハロゲン原子等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２における置換基は、芳香環の水素原子を置換する１価の基である。Ｒ１及びＲ２における置換基としては、例えば、置換基を有してもよい炭化水素基、ヒドロキシ基、及びハロゲン原子等が挙げられる。
【0021】
置換基を有してもよい炭化水素基は、脂肪族炭化水素基でもよく、芳香族炭化水素基でもよいが、脂肪族炭化水素基が好ましい。脂肪族炭化水素基は、飽和でもよく、不飽和でもよいが、飽和が好ましい。
脂肪族炭化水素基は、炭素原子数１～１０が好ましく、炭素原子数１～６がより好ましく、炭素原子数１～３がさらに好ましく、炭素原子数１又は２が特に好ましい。
脂肪族炭化水素基は、鎖状の脂肪族炭化水素基でもよく、環状の脂肪族炭化水素基でもよいが、鎖状の脂肪族炭化水素基が好ましい。鎖状の脂肪族炭化水素基は、直鎖状の脂肪族炭化水素基でもよく、分岐鎖状の脂肪族炭化水素基でもよい。
鎖状の脂肪族炭化水素基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。直鎖状アルキル基としては、炭素原子数１～１０が好ましく、炭素原子数１～６がより好ましく、炭素原子数１～３がさらに好ましく、炭素原子数１又は２が特に好ましい。分岐状アルキル基としては、炭素原子数３～１０が好ましく、炭素原子数３～６がより好ましく、炭素原子数３がさらに好ましい。
脂肪族炭化水素基は、炭素原子数１～１０が好ましく、炭素原子数１～６がより好ましく、炭素原子数１～３がさらに好ましく、炭素原子数１又は２が特に好ましい。
脂肪族炭化水素基は、鎖状の脂肪族炭化水素基でもよく、環状の脂肪族炭化水素基でもよいが、鎖状の脂肪族炭化水素基が好ましい。鎖状の脂肪族炭化水素基は、直鎖状の脂肪族炭化水素基でもよく、分岐鎖状の脂肪族炭化水素基でもよい。
鎖状の脂肪族炭化水素基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。直鎖状アルキル基としては、炭素原子数１～１０が好ましく、炭素原子数１～６がより好ましく、炭素原子数１～３がさらに好ましく、炭素原子数１又は２が特に好ましい。分岐状アルキル基としては、炭素原子数３～１０が好ましく、炭素原子数３～６がより好ましく、炭素原子数３がさらに好ましい。
【0022】
直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、置換基を有してもよく、有していなくてもよい。アルキル基の水素原子を置換する置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基等が挙げられる。アルキル基のメチレン基を置換する置換基としては、カルボニル基（－ＣＯ－）、酸素原子（－Ｏ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、アミド結合（－ＣＯＮＨ－）等が挙げられ、酸素原子が好ましい。アルキル基のメチレン基が酸素原子で置換された基としては、例えば、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基等が挙げられる。
【0023】
環状の脂肪族炭化水素基は、多環式でもよく、単環式でもよいが、単環式が好ましい。単環式基である脂肪族炭化水素基としては、モノシクロアルカンから１個の水素原子を除いた基が好ましい。該モノシクロアルカンとしては、炭素原子数３～６が好ましい。該モノシクロアルカンの具体例としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン等が挙げられる。
【0024】
芳香族炭化水素基は、芳香環を少なくとも１つ有する炭化水素基である。この芳香環は、４ｎ＋２個のπ電子をもつ環状共役系であれば特に限定されず、単環式でも多環式でもよい。芳香環の炭素原子数は５～１２が好ましく、炭素原子数６～１２がより好ましい。芳香環の具体例としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン等が挙げられる。芳香環は、芳香族炭化水素環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子（硫黄原子、窒素原子、酸素原子等）で置換された芳香族複素環でもよい。
【0025】
Ｒ１及びＲ２における置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子が好ましい。
アルキル基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基が好ましく、直鎖状のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１～３の直鎖状のアルキル基がさらに好ましく、メチル基又はエチル基がより好ましい。
アルコキシ基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基が好ましく、直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、炭素原子数１～３の直鎖状のアルコキシ基がさらに好ましく、メトキシ基又はエトキシ基がより好ましい。
オキシアルキレン構造含有基は、オキシアルキレン構造（－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－）を含むきである。前記式中、ｍは、１以上の整数であり、１～３の整数が好ましく、１又は２がより好ましく、１がさらに好ましい。オキシアルキレン構造含有基が含むオキシアルキレン構造の数は、１～５個が挙げられ、１～３個が好ましく、１個又は２個がより好ましい。オキシアルキレン構造含有基の炭素原子数は、１～５が好ましく、１～３がより好ましく、２がさらに好ましい。オキシアルキレン構造含有基としては、－Ｏ－［（ＣＨ２）ｍ－Ｏ］ｎ－ＣＨ３（ｍは１～３の整数、ｎは１～１０の整数）で表される基が挙げられる。前記式中、ｍは１又は２が好ましく、１がより好ましい。前記式中、ｎは１～５の整数が好ましく、１～３の整数がより好ましく、１又は２がさらに好ましく、１がより好ましい。
中でも、Ｒ１及びＲ２における置換基としては、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましい。
アルキル基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基が好ましく、直鎖状のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１～３の直鎖状のアルキル基がさらに好ましく、メチル基又はエチル基がより好ましい。
アルコキシ基としては、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルコキシ基が好ましく、直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、炭素原子数１～３の直鎖状のアルコキシ基がさらに好ましく、メトキシ基又はエトキシ基がより好ましい。
オキシアルキレン構造含有基は、オキシアルキレン構造（－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－）を含むきである。前記式中、ｍは、１以上の整数であり、１～３の整数が好ましく、１又は２がより好ましく、１がさらに好ましい。オキシアルキレン構造含有基が含むオキシアルキレン構造の数は、１～５個が挙げられ、１～３個が好ましく、１個又は２個がより好ましい。オキシアルキレン構造含有基の炭素原子数は、１～５が好ましく、１～３がより好ましく、２がさらに好ましい。オキシアルキレン構造含有基としては、－Ｏ－［（ＣＨ２）ｍ－Ｏ］ｎ－ＣＨ３（ｍは１～３の整数、ｎは１～１０の整数）で表される基が挙げられる。前記式中、ｍは１又は２が好ましく、１がより好ましい。前記式中、ｎは１～５の整数が好ましく、１～３の整数がより好ましく、１又は２がさらに好ましく、１がより好ましい。
中でも、Ｒ１及びＲ２における置換基としては、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましい。
【0026】
Ｒ１における置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましい。ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、及び臭素原子が好ましく、塩素原子、及びフッ素原子がより好ましい。Ｒ１における置換基は、ベージュ化誘導の観点から、アルキル基、アルコキシ基、又はオキシアルキレン構造含有基が好ましく、アルキル基又はオキシアルキレン構造含有基がより好ましい。
Ｒ２における置換基としては、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、及び臭素原子が好ましく、臭素原子がより好ましい。
Ｒ２における置換基としては、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、及び臭素原子が好ましく、臭素原子がより好ましい。
【0027】
前記式（１）中、ｎ１は、０～３の整数が好ましく、０～２の整数がより好ましく、０又は１がさらに好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、ｎ１は１が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、ｎ１は０が好ましい。
前記式（１）中、ｎ２は、０～５の整数が好ましく、０～３の整数がより好ましく、０～２の整数がさらに好ましく、０又は１が特に好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、ｎ２は１が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、ｎ２は０が好ましい。
前記式（１）中、ｎ２は、０～５の整数が好ましく、０～３の整数がより好ましく、０～２の整数がさらに好ましく、０又は１が特に好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、ｎ２は１が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、ｎ２は０が好ましい。
【0028】
化合物（１）は、下記一般式（１－１）で表される化合物が好ましい。
【0029】
【化4】
【0030】
前記式（１－１）中のＲ１１、Ｒ１２、及びＲ２１における置換基は、芳香環の水素原子を置換する１価の基である。Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ２１における置換基としては、前記式（１）中のＲ１及びＲ２における置換基として挙げたものと同様のものが挙げられる。
中でも、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ２１における置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子が好ましく、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子がより好ましい。
中でも、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ２１における置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子が好ましく、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子がより好ましい。
【0031】
Ｒ１１は、水素原子、アルコキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メトキシ基、又はハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子は、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ１１は、アルコキシ基、又はハロゲン原子が好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ１１は、水素原子又はアルコキシ基が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ１１は、水素原子が好ましい。
Ｒ１２は、水素原子、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メチル基、メトキシメトキシ基、又はハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子は、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ１２は、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ１２は、水素原子、アルキル基、又はオキシアルキレン構造含有基が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ１２は、水素原子が好ましい。
Ｒ２１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子がより好ましく、水素原子又はハロゲン原子がさらに好ましい。ハロゲン原子は、臭素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ２１は、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ２１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ２１は、水素原子が好ましい。
Ｒ１２は、水素原子、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メチル基、メトキシメトキシ基、又はハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子は、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ１２は、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ１２は、水素原子、アルキル基、又はオキシアルキレン構造含有基が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ１２は、水素原子が好ましい。
Ｒ２１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子がより好ましく、水素原子又はハロゲン原子がさらに好ましい。ハロゲン原子は、臭素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ２１は、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ２１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ２１は、水素原子が好ましい。
【0032】
化合物（１）としては、下記一般式（１－１－１）～（１－１－３）のいずれかで表される化合物が好ましい。
【0033】
【化5】
【0034】
前記式（１－１－１）～（１－１－３）中、Ｒ１１１、Ｒ１２１、及びＲ２１１における置換基としては、前記式（１）中のＲ１及びＲ２と同様のものが挙げられる。Ｒ１１１、Ｒ１２１、及びＲ２１１における置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン構造含有基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子が好ましく、メチル基、メトキシ基、メトキシメトキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子がより好ましい。
【0035】
Ｒ１１１は、水素原子、アルコキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メトキシ基、又はハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子は、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ１１１は、アルコキシ基、又はハロゲン原子が好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ１１１は、水素原子又はアルコキシ基が好ましい。前駆脂肪細胞からベージュ細胞への分化誘導を促進させる観点からは、Ｒ１１１は、アルコキシ基が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ１１１は、水素原子が好ましい。
Ｒ１２１は、水素原子、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メチル基、メトキシメトキシ基、又はハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子は、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ１２１は、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ１２１は、水素原子、アルキル基、又はオキシアルキレン構造含有基が好ましい。前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導を促進させる観点からは、アルキル基、又はオキシアルキレン構造含有基Ｒ１２１は、アルコキシ基が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ１２は、水素原子が好ましい。
Ｒ２１１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子がより好ましく、水素原子又はハロゲン原子がさらに好ましい。ハロゲン原子は、臭素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ２１１は、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ２１１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞へ形質転換を誘導する観点からは、Ｒ２１１は、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ２１１は、水素原子が好ましい。
Ｒ１２１は、水素原子、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メチル基、メトキシメトキシ基、又はハロゲン原子がより好ましい。ハロゲン原子は、塩素原子又はフッ素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ１２１は、アルキル基、オキシアルキレン構造含有基、又はハロゲン原子が好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ１２１は、水素原子、アルキル基、又はオキシアルキレン構造含有基が好ましい。前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導を促進させる観点からは、アルキル基、又はオキシアルキレン構造含有基Ｒ１２１は、アルコキシ基が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ１２は、水素原子が好ましい。
Ｒ２１１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子がより好ましく、水素原子又はハロゲン原子がさらに好ましい。ハロゲン原子は、臭素原子が好ましい。低用量で中性脂肪抑制効果を発揮させる観点からは、Ｒ２１１は、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。ベージュ化を誘導する観点から、Ｒ２１１は、水素原子、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞へ形質転換を誘導する観点からは、Ｒ２１１は、アルコキシ基、ヒドロキシ基、又はハロゲン原子が好ましい。ミトコンドリア含有量を増加させる観点からは、Ｒ２１１は、水素原子が好ましい。
【0036】
前記式（１－１－１）又は（１－１－２）で表される化合物は、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導能が高い傾向がある。前記式（１－１－３）で表される化合物は、白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換誘導能が高い傾向がある。
【0037】
化合物（１）の具体例を以下に示すが、これらに限定されない。
【0038】
【化6】
【0039】
【化7】
【0040】
上記の中でも、化合物（１）としては、２ＮＣ、２ＮＣ－Ａ２、２ＮＣ－Ａ３、２ＮＣ－Ａ４、２ＮＣ－Ｂ４、２ＮＣ－Ｂ６、及び２ＮＣ－Ｂ７が好ましく、２ＮＣ、２ＮＣ－Ａ２、２ＮＣ－Ａ４、及び２ＮＣ－Ｂ７がより好ましい。ベージュ化誘導剤としては、２ＮＣ、２ＮＣ－Ａ２、２ＮＣ－Ａ３、２ＮＣ－Ａ４、２ＮＣ－Ｂ４、２ＮＣ－Ｂ６、及び２ＮＣ－Ｂ７が好ましい。前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導剤としては、２ＮＣ、２ＮＣ－Ａ２、２ＮＣ－Ａ３、及び２ＮＣ－Ａ４が好ましい。白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換誘導剤としては、２ＮＣ、２ＮＣ－Ｂ４、２ＮＣ－Ｂ６、及び２ＮＣ－Ｂ７が好ましい。
【0041】
化合物（１）は、塩の形態であってもよい。塩としては、薬学的に許容される塩が挙げられる。「薬学的に許容可能な塩」とは、化合物（１）の薬理作用を阻害しない塩の形態をいう。化合物（１）の薬理機作用能としては、中性脂肪蓄積低減作用、ベージュ化誘導作用等が挙げられる。化合物（１）の薬学的に許容可能な塩としては、特に制限されず、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）との塩；アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウムなど）との塩；有機塩基（ピリジン、トリエチルアミンなど）との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、及び無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩等が挙げられる。
【0042】
化合物（１）は、溶媒和物の形態であってもよく、化合物（１）の塩の溶媒和物の形態であってもよい。溶媒和物としては、特に制限されず、例えば、水和物、エタノール溶媒和物等が挙げられる。
【0043】
本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）及びその塩からなる群より選択される化合物を１種以上含有する。化合物（１）及びその塩からなる群より選択される化合物は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0044】
本実施形態の医薬組成物は、単位投与形態あたり、治療的有効量の化合物（１）及び／又はその塩を含んでもよい。「治療的有効量」とは、対象疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。本実施形態の医薬組成物において、化合物（１）及び／又はその塩の治療的有効量は、肥満の治療又は予防に有効な量であり得る。治療的有効量は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。本実施形態の医薬組成物は、単位投与形態あたり、０．０１～２０００ｍｇの前記化合物（１）及び／又はその塩を含有してもよい。本実施形態の医薬組成物において、化合物（１）及び／又はその塩の含有量は、０．０１～９０質量％であってもよく、０．０５～８０質量％であってもよく、０．１～６０質量％であってもよい。
【0045】
（任意成分）
本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）又はその塩に加えて、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、例えば、薬学的に許容される担体が挙げられる。
「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態の医薬組成物においては、薬学的に許容される担体は、化合物（１）又はその塩の薬理作用を阻害せず、且つその投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体である。薬学的に許容される担体は、典型的には非活性成分とみなされる、公知のあらゆる薬学的に許容され得る成分を包含する。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、例えば、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）又はその塩に加えて、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、例えば、薬学的に許容される担体が挙げられる。
「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態の医薬組成物においては、薬学的に許容される担体は、化合物（１）又はその塩の薬理作用を阻害せず、且つその投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体である。薬学的に許容される担体は、典型的には非活性成分とみなされる、公知のあらゆる薬学的に許容され得る成分を包含する。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、例えば、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【0046】
本実施形態の医薬組成物は、上記成分に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されず、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができる。他の成分としては、例えば、上記以外の医薬品添加剤が挙げられる。医薬品添加剤としては、例えば、保存剤（例えば、酸化防止剤）、キレート剤、矯味矯臭剤、甘味剤、増粘剤、緩衝剤、着色剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）又はその塩以外の活性成分を含んでいてもよい。活性成分としては、例えば、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤等が挙げられるが、これらに限定されない。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）又はその塩以外の活性成分を含んでいてもよい。活性成分としては、例えば、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤等が挙げられるが、これらに限定されない。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【0047】
（剤型、投与方法等）
本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。本実施形態の医薬組成物は、経口製剤であってもよく、非経口製剤であってもよい。経口製剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、液剤、ドロップ愛、乳剤等が挙げられる。非経口製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、点鼻剤、経腸剤、吸入剤等が挙げられる。これらの剤型の医薬組成物は、定法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、製剤化することができる。
本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。本実施形態の医薬組成物は、経口製剤であってもよく、非経口製剤であってもよい。経口製剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、液剤、ドロップ愛、乳剤等が挙げられる。非経口製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、点鼻剤、経腸剤、吸入剤等が挙げられる。これらの剤型の医薬組成物は、定法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、製剤化することができる。
【0048】
本実施形態の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口又は非経口経路で投与することができる。非経口投与としては、静脈投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経腸投与等が挙げられる。
【0049】
本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）及び／又はその塩の治療的有効量を投与することができる。例えば、本実施形態の医薬組成物は、１回の投与量として、投与対象の体重１ｋｇあたり、０．０１～２０００ｍｇの化合物（１）及び／又はその塩を投与することができる。前記投与量は、０．０５～１５００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．１～１０００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．２～５００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．３～３００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【0050】
本実施形態の医薬組成物は、単回投与であってもよく、反復投与であってもよい。反復投与である場合、投与間隔は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。投与間隔は、例えば、数時間毎、１日２～３回、１日１回、２～３日に１回、１週間に１回、１月に１回、数カ月に１回等とすることができる。
【0051】
本実施形態の医薬組成物の投与対象は、特に限定されない。医薬組成物の投与対象は、哺乳動物が好ましく、ヒトであってもよく、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、ヒト以外の霊長類（サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等）、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ目（ウサギ等）、有蹄目（ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等）、ネコ目（イヌ、ネコ等）等が挙げられる。
【0052】
本実施形態の医薬組成物は、肥満を治療又は予防するために用いることができる。化合物（１）は、中性脂肪の蓄積を抑制する作用を有するため、肥満の治療又は予防に有効である。化合物（１）は、ベージュ化の誘導により、脂肪燃焼を促進させて、抗肥満作用を示し得る。そのため、本実施形態の医薬組成物は、摂食抑制、又は脂肪吸収阻害作等を作用機序とする従来の抗肥満薬とは、異なる作用機序により、肥満を治療又は予防し得る。
化合物（１）は、ＰＰＡＲγのパーシャルなアゴニスト活性を有するため、インスリン抵抗性改善作用を有し得る。化合物（１）は、天然化合物であるフラバノンの類縁体であるため、安全性の面でも優れていると考えられる。本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）又はその塩を有効成分として含有するため、インスリン抵抗性改善作用を期待でき、且つ安全性が高いと考えられる。
化合物（１）は、ＰＰＡＲγのパーシャルなアゴニスト活性を有するため、インスリン抵抗性改善作用を有し得る。化合物（１）は、天然化合物であるフラバノンの類縁体であるため、安全性の面でも優れていると考えられる。本実施形態の医薬組成物は、化合物（１）又はその塩を有効成分として含有するため、インスリン抵抗性改善作用を期待でき、且つ安全性が高いと考えられる。
【0053】
［他の態様］
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩の有効量を、対象に投与することを含む、肥満を治療又は予防する方法を提供する。前記有効量は、化合物（１）又はその塩の治療的有効量であり得る。前記対象は、肥満の治療又は予防が必要な対象である。
一態様において、本発明は、肥満を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、化合物（１）又はその塩の使用を提供する。
一態様において、本発明は、肥満の治療又は予防に使用するための、化合物（１）又はその塩を提供する。
一態様において、本発明は、肥満を治療又は予防するための化合物（１）又はその塩の使用を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を含有する、中性脂肪低減剤を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を含有する、ベージュ化誘導剤を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を、前駆脂肪細胞及び／又は白色脂肪細胞に接触させることを含む、ベージュ化誘導方法を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を、前駆脂肪細胞に接触させることを含む、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導方法を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を、白色脂肪細胞に接触させることを含む、白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換誘導方法を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩の有効量を、対象に投与することを含む、肥満を治療又は予防する方法を提供する。前記有効量は、化合物（１）又はその塩の治療的有効量であり得る。前記対象は、肥満の治療又は予防が必要な対象である。
一態様において、本発明は、肥満を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、化合物（１）又はその塩の使用を提供する。
一態様において、本発明は、肥満の治療又は予防に使用するための、化合物（１）又はその塩を提供する。
一態様において、本発明は、肥満を治療又は予防するための化合物（１）又はその塩の使用を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を含有する、中性脂肪低減剤を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を含有する、ベージュ化誘導剤を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を、前駆脂肪細胞及び／又は白色脂肪細胞に接触させることを含む、ベージュ化誘導方法を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を、前駆脂肪細胞に接触させることを含む、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化誘導方法を提供する。
一態様において、本発明は、化合物（１）又はその塩を、白色脂肪細胞に接触させることを含む、白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換誘導方法を提供する。
【実施例0054】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0055】
（合成例１：２ＮＣの合成）
＜カルコン（３Ａａ）の合成＞
２’－ヒドロキシアセトフェノン（１Ａ）（１．２０ｍＬ，０．０１ｍｏｌ）と１－ナフトアルデヒド（２ａ）（１．０７ｇ，０．０１ｍｏｌ）をエタノール３０ｍＬに溶解させ、そこに水酸化ナトリウム１．２０ｇ（０．０３ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。生じた黄色の懸濁溶液を濃塩酸１０ｍＬ及び氷２００ｇに加えて２時間攪拌した後、生成した黄色固体を吸引濾過した。得られた固体を沸騰したエタノールから再結晶することでナフタレン骨格を有したカルコン（３Ａａ）を２．６０ｇ（収率９５％）得た。得られた化合物データは文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０２１年８５巻 １５３４８０ページ）と一致した。
＜カルコン（３Ａａ）の合成＞
２’－ヒドロキシアセトフェノン（１Ａ）（１．２０ｍＬ，０．０１ｍｏｌ）と１－ナフトアルデヒド（２ａ）（１．０７ｇ，０．０１ｍｏｌ）をエタノール３０ｍＬに溶解させ、そこに水酸化ナトリウム１．２０ｇ（０．０３ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。生じた黄色の懸濁溶液を濃塩酸１０ｍＬ及び氷２００ｇに加えて２時間攪拌した後、生成した黄色固体を吸引濾過した。得られた固体を沸騰したエタノールから再結晶することでナフタレン骨格を有したカルコン（３Ａａ）を２．６０ｇ（収率９５％）得た。得られた化合物データは文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０２１年８５巻 １５３４８０ページ）と一致した。
【0056】
【化8】
【0057】
＜２ＮＣの合成＞
耐圧性ガラス容器に、カルコン（３Ａａ）（２．６０ｇ，０．０９５ｍｏｌ）とアセトニトリル１００ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／Ｌ ＣｓＦ水溶液を１ｍＬ加えて密栓し、８０℃の温浴で２時間加熱攪拌を行った。反応液を室温まで戻し、エバポレーターにて溶媒を留去した後、得られた黄色の残渣を沸騰したエタノールから再結晶することで微黄色固体である２ＮＣ（４Ａａ）を２．２１ｇ（収率８５％）で得た。得られた化合物データは文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０２１年８５巻 １５３４８０ページ）と一致した。
耐圧性ガラス容器に、カルコン（３Ａａ）（２．６０ｇ，０．０９５ｍｏｌ）とアセトニトリル１００ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／Ｌ ＣｓＦ水溶液を１ｍＬ加えて密栓し、８０℃の温浴で２時間加熱攪拌を行った。反応液を室温まで戻し、エバポレーターにて溶媒を留去した後、得られた黄色の残渣を沸騰したエタノールから再結晶することで微黄色固体である２ＮＣ（４Ａａ）を２．２１ｇ（収率８５％）で得た。得られた化合物データは文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０２１年８５巻 １５３４８０ページ）と一致した。
【0058】
【化9】
【0059】
（合成例２：２ＮＣ－Ａ２～Ａ７の合成）
＜カルコン（３Ｂａ～３Ｇａ）の合成＞
２’－ヒドロキシアセトフェノン誘導体（１Ｂ～１Ｇ）（いずれも０．００５ｍｏｌ）のそれぞれに対し、１－ナフトアルデヒド（２ａ）（０．５４ｇ，０．００５ｍｏｌ）を加えてエタノール１５ｍＬに溶解させた。そこに水酸化ナトリウム０．６ｇ（０．０１５ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌し、生じた黄色の懸濁溶液を濃塩酸５ｍＬ及び氷１００ｇに加えて２時間攪拌した後、生成した黄色固体を吸引濾過した。得られた固体を沸騰したエタノールから再結晶することでナフタレン骨格を有したカルコン（３Ｂａ～３Ｇａ）を得た。
＜カルコン（３Ｂａ～３Ｇａ）の合成＞
２’－ヒドロキシアセトフェノン誘導体（１Ｂ～１Ｇ）（いずれも０．００５ｍｏｌ）のそれぞれに対し、１－ナフトアルデヒド（２ａ）（０．５４ｇ，０．００５ｍｏｌ）を加えてエタノール１５ｍＬに溶解させた。そこに水酸化ナトリウム０．６ｇ（０．０１５ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌し、生じた黄色の懸濁溶液を濃塩酸５ｍＬ及び氷１００ｇに加えて２時間攪拌した後、生成した黄色固体を吸引濾過した。得られた固体を沸騰したエタノールから再結晶することでナフタレン骨格を有したカルコン（３Ｂａ～３Ｇａ）を得た。
【0060】
【化10】
【0061】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ：３Ｂａ
収量・収率０．８２ｇ・５７％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．７８（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９７（ｍ，３Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５８－７．６４（ｍ，３Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ）．
収量・収率０．８２ｇ・５７％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．７８（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９７（ｍ，３Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５８－７．６４（ｍ，３Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ）．
【0062】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ：３Ｃａ
収量・収率１．０６ｇ・７０％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．４（ｓ，１Ｈ），８．７９（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９７（ｍ，３Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４－７．６４（ｍ，３Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）．
収量・収率１．０６ｇ・７０％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１２．４（ｓ，１Ｈ），８．７９（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９７（ｍ，３Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４－７．６４（ｍ，３Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）．
【0063】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）－３－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ：３Ｄａ
収量・収率１．２２ｇ・７３％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．７５（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８８－７．９５（ｍ，４Ｈ，７．６７（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．６２（ｍ，３Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ）．
収量・収率１．２２ｇ・７３％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．７５（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８８－７．９５（ｍ，４Ｈ，７．６７（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．６２（ｍ，３Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ）．
【0064】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ：３Ｅａ
収量・収率０．４３ｇ・２８％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．８３（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９７（ｍ，４Ｈ），７．５７－７．６９（ｍ，４Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ）
収量・収率０．４３ｇ・２８％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．８３（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９７（ｍ，４Ｈ），７．５７－７．６９（ｍ，４Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ）
【0065】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ：３Ｆａ
収量・収率１．０７ｇ・６９％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．５１（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９３（ｍ，３Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝１９．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．６２－７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５４－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．９Ｈｚ，１Ｈ）
収量・収率１．０７ｇ・６９％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．５１（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９３（ｍ，３Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝１９．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．６２－７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５４－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．９Ｈｚ，１Ｈ）
【0066】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ：３Ｇａ
収量・収率０．５０ｇ・３４％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．８３（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９５（ｍ，２Ｈ），７．６２－７．６６（ｍ，３Ｈ），７．５９（ｑ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２６－７．２９（ｍ，３Ｈ），７．０２－７．０４（ｍ，１Ｈ）
収量・収率０．５０ｇ・３４％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．８３（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．９５（ｍ，２Ｈ），７．６２－７．６６（ｍ，３Ｈ），７．５９（ｑ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２６－７．２９（ｍ，３Ｈ），７．０２－７．０４（ｍ，１Ｈ）
【0067】
＜２ＮＣ－Ａ２～Ａ７（４Ｂａ～４Ｇａ）の合成＞
耐圧性ガラス容器に、得られたカルコン（３Ｂａ～３Ｇａ）（いずれも０．００１ｍｏｌ）を入れ、それぞれのカルコンに対し、アセトニトリル５ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／ＬＣｓＦ水溶液を３０μＬ加えて密栓し、６０℃の温浴で２時間加熱攪拌を行った。反応液を室温まで戻し、エバポレーターにて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：１０％酢酸エチル／ヘキサン溶液）にて精製を行い、２ＮＣ―Ａ２～Ａ７（４Ｂａ～４Ｇａ）を得た。
耐圧性ガラス容器に、得られたカルコン（３Ｂａ～３Ｇａ）（いずれも０．００１ｍｏｌ）を入れ、それぞれのカルコンに対し、アセトニトリル５ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／ＬＣｓＦ水溶液を３０μＬ加えて密栓し、６０℃の温浴で２時間加熱攪拌を行った。反応液を室温まで戻し、エバポレーターにて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：１０％酢酸エチル／ヘキサン溶液）にて精製を行い、２ＮＣ―Ａ２～Ａ７（４Ｂａ～４Ｇａ）を得た。
【0068】
【化11】
【0069】
７－Ｍｅｔｈｙｌ－２－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ｂａ
白色固体
収量・収率０．２３ｇ・８０％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８８－７．９３（ｍ，３Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５２－７．５７（ｍ，３Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，２Ｈ），６．２１（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２２－３．２７（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１７．１，２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９２．２，１６２．０，１４８．０，１３７．５，１３４．５，１３４．１，１３０．４，１２９．６，１２９．３，１２７．３，１２７．０，１２６．９，１２６．２，１２５．６，１２４．１，１２３．４，１２３．１，１１９．１，１１８．４，１１８．２，７６．８，４４．２，４４．１，２２．２，２０．７．
白色固体
収量・収率０．２３ｇ・８０％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８８－７．９３（ｍ，３Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５２－７．５７（ｍ，３Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，２Ｈ），６．２１（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２２－３．２７（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１７．１，２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９２．２，１６２．０，１４８．０，１３７．５，１３４．５，１３４．１，１３０．４，１２９．６，１２９．３，１２７．３，１２７．０，１２６．９，１２６．２，１２５．６，１２４．１，１２３．４，１２３．１，１１９．１，１１８．４，１１８．２，７６．８，４４．２，４４．１，２２．２，２０．７．
【0070】
６－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ｃａ
白色固体
収量・収率０．１４ｇ・４６％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９３（ｍ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５２－７．５７（ｍ，３Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．１９（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．２３－３．２８（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｄｄ，Ｊ＝１７．１，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ１９２．６，１５６．７，１５４．６，１３４．５，１３４．１，１３０．４，１２９．６，１２９．３，１２６．９，１２６．２，１２５．６，１２５．６，１２４．１，１２３．０，１２１．１，１１９．７，１０７．７，５６．１，４４．１．
白色固体
収量・収率０．１４ｇ・４６％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９３（ｍ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５２－７．５７（ｍ，３Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．１９（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．２３－３．２８（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｄｄ，Ｊ＝１７．１，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ１９２．６，１５６．７，１５４．６，１３４．５，１３４．１，１３０．４，１２９．６，１２９．３，１２６．９，１２６．２，１２５．６，１２５．６，１２４．１，１２３．０，１２１．１，１１９．７，１０７．７，５６．１，４４．１．
【0071】
７－（Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）－２－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ｄａ
白色固体
収量・収率０．１４ｇ・４２％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９６（ｍ，３Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，３Ｈ），６．７３－６．７７（ｍ，２Ｈ），６．２２（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．１９－３．２４（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝１７．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９１．２，１６３．９，１６３．７，１３４．４，１３４．１，１３０．４，１２９．６，１２９．３，１２９．１，１２６．９，１２６．２，１２５．６，１２４．１，１２３．０，１１６．０，１１１．５，１０４．０，９４．３，５６．６，４４．０．
白色固体
収量・収率０．１４ｇ・４２％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９６（ｍ，３Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，３Ｈ），６．７３－６．７７（ｍ，２Ｈ），６．２２（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．１９－３．２４（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝１７．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９１．２，１６３．９，１６３．７，１３４．４，１３４．１，１３０．４，１２９．６，１２９．３，１２９．１，１２６．９，１２６．２，１２５．６，１２４．１，１２３．０，１１６．０，１１１．５，１０４．０，９４．３，５６．６，４４．０．
【0072】
６－Ｃｈｌｏｒｏ－２－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ｅａ
白色固体
収量・収率０．２２ｇ・７２％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０２（ｄ，Ｊ＝７．７ Ｈｚ，１Ｈ），７．９０－７．９６（ｍ，３Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，３Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝２．８，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），６．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２３－３．２８（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）
白色固体
収量・収率０．２２ｇ・７２％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０２（ｄ，Ｊ＝７．７ Ｈｚ，１Ｈ），７．９０－７．９６（ｍ，３Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，３Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝２．８，８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），６．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２３－３．２８（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）
【0073】
７－Ｃｈｌｏｒｏ－２－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ｃａ
白色固体
収量・収率０．１１ｇ・３７％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９４（ｍ，３Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５４－７．５９（ｍ，３Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０８－７．０９（ｍ，１Ｈ），６．２５（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２４－３．２９（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）
白色固体
収量・収率０．１１ｇ・３７％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．９４（ｍ，３Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５４－７．５９（ｍ，３Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０８－７．０９（ｍ，１Ｈ），６．２５（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２４－３．２９（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）
【0074】
６－Ｆｌｕｏｒｏ－２－（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ｄａ
白色固体
収量・収率０．２９ｇ・９９％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９０－７．９４（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６４－７．６６（ｍ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，３Ｈ），７．２５－７．２８（ｍ，４Ｈ），７．０７－７．０９（ｍ，１Ｈ），６．２２（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２４－３．２９（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）
白色固体
収量・収率０．２９ｇ・９９％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９０－７．９４（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６４－７．６６（ｍ，１Ｈ），７．５３－７．５８（ｍ，３Ｈ），７．２５－７．２８（ｍ，４Ｈ），７．０７－７．０９（ｍ，１Ｈ），６．２２（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２４－３．２９（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）
【0075】
（合成例３：２ＮＣ－Ｂ２、Ｂ４、Ｂ７の合成）
＜カルコン（３Ａｂ～３Ａｄ）の合成＞
２’－ヒドロキシアセトフェノン（１Ａ）（０．６ｍＬ，０．００５ｍｏｌ）と１－ナフトアルデヒド誘導体（２ｂ～２ｄ）（０．００５ｍｏｌ）をそれぞれ加えてエタノール１５ｍＬに溶解させた。そこに水酸化ナトリウム０．６ｇ（０．０１５ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応液を濃塩酸５ｍＬ及び氷１００ｇに加えた後、分液漏斗に移し、酢酸エチル１００ｍＬで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、ろ過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：３Ａｂおよび３Ａｃはトルエン，３Ａｄは５０％酢酸エチル／ヘキサン）にて精製することでナフタレン骨格を有したカルコン（３Ａｂ～３Ａｄ）を得た。
＜カルコン（３Ａｂ～３Ａｄ）の合成＞
２’－ヒドロキシアセトフェノン（１Ａ）（０．６ｍＬ，０．００５ｍｏｌ）と１－ナフトアルデヒド誘導体（２ｂ～２ｄ）（０．００５ｍｏｌ）をそれぞれ加えてエタノール１５ｍＬに溶解させた。そこに水酸化ナトリウム０．６ｇ（０．０１５ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応液を濃塩酸５ｍＬ及び氷１００ｇに加えた後、分液漏斗に移し、酢酸エチル１００ｍＬで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、ろ過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：３Ａｂおよび３Ａｃはトルエン，３Ａｄは５０％酢酸エチル／ヘキサン）にて精製することでナフタレン骨格を有したカルコン（３Ａｂ～３Ａｄ）を得た。
【0076】
【化12】
【0077】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－３－ｏｎｅ：３Ａｂ
収量・収率０．８２ｇ・５４％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．６３（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９４－７．９２（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０９（ｓ，３Ｈ）．
収量・収率０．８２ｇ・５４％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．６３（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９４－７．９２（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０９（ｓ，３Ｈ）．
【0078】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－３－ｏｎｅ：３Ａｃ
収量・収率０．７５ｇ・４５％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｓ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ）．
収量・収率０．７５ｇ・４５％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｓ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ）．
【0079】
（Ｅ）－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－（２－ｂｒｏｍｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－３－ｏｎｅ：３Ｄａ
収量・収率１．１０ｇ・６３％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．２７（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．６０－７．５２（ｍ，４Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）．
収量・収率１．１０ｇ・６３％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．２７（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８９－７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．６０－７．５２（ｍ，４Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）．
【0080】
＜２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ７（４Ａｂ、４Ａｄ）、４Ａｃの合成＞
耐圧性ガラス容器に、得られたカルコン（３Ａｂ～３Ａｄ）（いずれも０．００１ｍｏｌ）を入れ、それぞれのカルコンに対し、アセトニトリル５ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／ＬＣｓＦ水溶液を１００μＬ加えて密栓し、８０℃の温浴で３時間加熱攪拌を行った。反応液を室温まで戻し、エバポレーターにて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：トルエン）にて精製を行い、２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ７（４Ａｂ、４Ａｄ）、及び４Ａｃを得た。
耐圧性ガラス容器に、得られたカルコン（３Ａｂ～３Ａｄ）（いずれも０．００１ｍｏｌ）を入れ、それぞれのカルコンに対し、アセトニトリル５ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／ＬＣｓＦ水溶液を１００μＬ加えて密栓し、８０℃の温浴で３時間加熱攪拌を行った。反応液を室温まで戻し、エバポレーターにて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：トルエン）にて精製を行い、２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ７（４Ａｂ、４Ａｄ）、及び４Ａｃを得た。
【0081】
＜２ＮＣ－Ｂ６（５Ａｃ）の合成＞
５０ｍＬのナス型フラスコに、４Ａｃ（０．２０ｇ，０．０００６ｍｏｌ）を入れ、そこに１０％塩化水素・メタノール溶液５ｍＬを加え８０℃で１時間加熱還流を行った。室温に戻し、溶液を減圧下で濃縮したのち、酢酸エチル５０ｍＬおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍＬを加えて分液操作を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、目的物である２ＮＣ－Ｂ６（５Ａｃ）を３７ｍｇ（収率２１％）で得た。
５０ｍＬのナス型フラスコに、４Ａｃ（０．２０ｇ，０．０００６ｍｏｌ）を入れ、そこに１０％塩化水素・メタノール溶液５ｍＬを加え８０℃で１時間加熱還流を行った。室温に戻し、溶液を減圧下で濃縮したのち、酢酸エチル５０ｍＬおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍＬを加えて分液操作を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、目的物である２ＮＣ－Ｂ６（５Ａｃ）を３７ｍｇ（収率２１％）で得た。
【0082】
【化13】
【0083】
２－（２－Ｍｅｔｈｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ａｂ
白色固体
収量・収率０．１３ｇ・４２％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．４６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，３．１Ｈｚ１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７６（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．１Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９３．２，１６２．４，１５４．８，１３６．２，１３２．３，１３１．５，１３０．０，１２９．２，１２７．５，１２７．０，１２４．７，１２３．９，１２１．７，１２１．４，１１８．６，１１８．３，１１３．２，７４．２，５６．７，４２．５．
白色固体
収量・収率０．１３ｇ・４２％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．４６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，３．１Ｈｚ１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７６（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．１Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９３．２，１６２．４，１５４．８，１３６．２，１３２．３，１３１．５，１３０．０，１２９．２，１２７．５，１２７．０，１２４．７，１２３．９，１２１．７，１２１．４，１１８．６，１１８．３，１１３．２，７４．２，５６．７，４２．５．
【0084】
２－（２－Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ａｃ
白色固体
収量・収率０．２０ｇ・５９％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．４８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５５－７．４６（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６２－６．５９（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，３．１Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９３．１，１６２．３，１５２．７，１３６．３，１３２．１，１３１．５，１３０．６，１２９．２，１２７．６，１２７．０，１２４．９，１２４．４，１２１．７，１２１．３，１１９．５，１１８．５，１１６．１，９５．５，７４．３，５６．７，４２．５．
白色固体
収量・収率０．２０ｇ・５９％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．４８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５５－７．４６（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６２－６．５９（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，３．１Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９３．１，１６２．３，１５２．７，１３６．３，１３２．１，１３１．５，１３０．６，１２９．２，１２７．６，１２７．０，１２４．９，１２４．４，１２１．７，１２１．３，１１９．５，１１８．５，１１６．１，９５．５，７４．３，５６．７，４２．５．
【0085】
２－（２－Ｂｒｏｍｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：４Ａｄ
白色固体
収量・収率０．１９ｇ・５５％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．６２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５８－７．５２（ｍ，３Ｈ），７．１４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６３（ｔ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），２．８９（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．５Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９１．８，１６１．５，１３６．５，１３３．９，１３２．１，１３２．０，１３１．１，１３０．５，１２９．５，１２７．７，１２７．２，１２６．５，１２５．４，１２２．２，１２２．１，１２１．３，１１８．６，４１．８．
白色固体
収量・収率０．１９ｇ・５５％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．６２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５８－７．５２（ｍ，３Ｈ），７．１４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６３（ｔ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），２．８９（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．５Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１９１．８，１６１．５，１３６．５，１３３．９，１３２．１，１３２．０，１３１．１，１３０．５，１２９．５，１２７．７，１２７．２，１２６．５，１２５．４，１２２．２，１２２．１，１２１．３，１１８．６，４１．８．
【0086】
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１０．４２（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６１－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９０（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１９２．１，１６１．３，１５３．９，１３６．０，１３１．７，１２６．７，１２６．３，１２５．３，１２４．６，１２４．５，１２４．２，１２３．３，１２２．５，１２１．３，１２０．８，１１７．９，１０６．９，７５．７，４２．５．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１９２．１，１６１．３，１５３．９，１３６．０，１３１．７，１２６．７，１２６．３，１２５．３，１２４．６，１２４．５，１２４．２，１２３．３，１２２．５，１２１．３，１２０．８，１１７．９，１０６．９，７５．７，４２．５．
【0087】
２－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ：５Ａｃ
白色固体
収量・収率３７ｍｇ・２１％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１０．４２（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６１－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９０（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１９２．１，１６１．３，１５３．９，１３６．０，１３１．７，１２６．７，１２６．３，１２５．３，１２４．６，１２４．５，１２４．２，１２３．３，１２２．５，１２１．３，１２０．８，１１７．９，１０６．９，７５．７，４２．５．
白色固体
収量・収率３７ｍｇ・２１％
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１０．４２（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６１－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９０（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，２．８Ｈｚ，１Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１９２．１，１６１．３，１５３．９，１３６．０，１３１．７，１２６．７，１２６．３，１２５．３，１２４．６，１２４．５，１２４．２，１２３．３，１２２．５，１２１．３，１２０．８，１１７．９，１０６．９，７５．７，４２．５．
【0088】
（実施例１：フラバノン誘導体２－（Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ）ｃｈｒｏｍａｎ－４－ｏｎｅ（２ＮＣ）による前駆脂肪細胞の脂肪細胞分化についての検証）
３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞は、通常、分化誘導を経て白色脂肪細胞へと分化する。近年、寒冷刺激、又は食事の摂取などによって、白色脂肪組織に存在する前駆脂肪細胞がベージュ脂肪細胞へと分化すると共に、白色脂肪細胞がベージュ脂肪細胞に形質転換することが報告されている。そこで、まず初めに、２ＮＣによる前駆脂肪細胞のベージュ化誘導作用を評価するために、マウス由来前駆脂肪細胞である３Ｔ３－Ｌ１細胞を用いて試験を実施した。
３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞は、通常、分化誘導を経て白色脂肪細胞へと分化する。近年、寒冷刺激、又は食事の摂取などによって、白色脂肪組織に存在する前駆脂肪細胞がベージュ脂肪細胞へと分化すると共に、白色脂肪細胞がベージュ脂肪細胞に形質転換することが報告されている。そこで、まず初めに、２ＮＣによる前駆脂肪細胞のベージュ化誘導作用を評価するために、マウス由来前駆脂肪細胞である３Ｔ３－Ｌ１細胞を用いて試験を実施した。
【0089】
フラバノン誘導体２ＮＣは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フイルム和光純薬（株）社製）に、１０ｍＭ又は２０ｍＭの濃度で溶解させて実験に使用した。
細胞の培養は、１０％仔ウシ血清（Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ，サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）社製）含有ダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ，日水製薬（株）社製）・ペニシリン－ストレプトマイシン－Ｌグルタミン溶液（ＰＳＧ，サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で行った。細胞は、８０％コンフルエントになるまで培養し、実験に用いた。
細胞の培養は、１０％仔ウシ血清（Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ，サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）社製）含有ダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ，日水製薬（株）社製）・ペニシリン－ストレプトマイシン－Ｌグルタミン溶液（ＰＳＧ，サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で行った。細胞は、８０％コンフルエントになるまで培養し、実験に用いた。
【0090】
脂肪細胞への分化は、以下のように行った。
細胞が１００％コンフルエントに達したことを顕微鏡下で確認後、培地を除去し、１．６μＭインスリン（富士フイルム和光純薬（株）社製）、０．２５μＭデキサメタゾン（富士フイルム和光純薬（株）社製）、及び５００μＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（富士フイルム和光純薬工業（株）社製）を含む１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，コスモ・バイオ（株）社製）含有ＤＭＥＭ・ハムＦ１２（日水製薬（株）社製）・ＰＳＧ・トリヨードチロシン（シグマアルドリッチジャパン（合）社製、Ｔ３）培地を添加し、脂肪細胞への分化誘導を行った。この時点を培養０日目とし、培養２日目に、インスリンを含む１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ・ハムＦ１２・ＰＳＧ・Ｔ３培地に交換し、以後２日毎に培地交換した。
細胞が１００％コンフルエントに達したことを顕微鏡下で確認後、培地を除去し、１．６μＭインスリン（富士フイルム和光純薬（株）社製）、０．２５μＭデキサメタゾン（富士フイルム和光純薬（株）社製）、及び５００μＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（富士フイルム和光純薬工業（株）社製）を含む１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，コスモ・バイオ（株）社製）含有ＤＭＥＭ・ハムＦ１２（日水製薬（株）社製）・ＰＳＧ・トリヨードチロシン（シグマアルドリッチジャパン（合）社製、Ｔ３）培地を添加し、脂肪細胞への分化誘導を行った。この時点を培養０日目とし、培養２日目に、インスリンを含む１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ・ハムＦ１２・ＰＳＧ・Ｔ３培地に交換し、以後２日毎に培地交換した。
【0091】
３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞への影響を評価するために、リピットアッセイキット（コスモ・バイオ（株）社製）を用いてＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を以下のように行った。組織培養マルチウェルプレート（１２ｗｅｌｌｓ，ＡＧＣテクノグラス（株）社製）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した細胞を、上記の方法で培養した。２ＮＣは、終濃度が１０μＭ又は２０μＭになるように培地で希釈して、０日目、２日目、及び４日目に細胞培養液に添加した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．１％添加したものをコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、同様に処理した。
【0092】
細胞の培養終了後（６日目）、１ｘリン酸緩衝液（１ｘＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、固定液（４％ホルムアルデヒド溶液）で細胞を１晩固定させた。固定液を精製水で洗浄した後、オイルレッドＯ液で細胞を染色し、乾燥させて顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，オリンパスライフサイエンス（株）社製）で細胞を観察した。脂肪滴の定量は、乾燥させたｗｅｌｌに細胞抽出液（リピットアッセイキットの付属品）を加えて色素を溶出させ、マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯ ｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ，ＢＭＧ ＬＡＢ ＴＥＣＨ（有）社製）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。色素の溶出時間は６０分とした。Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞とそれぞれの処理群との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌと比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0093】
結果を図２に示した。脂肪細胞への分化誘導と共に、２ＮＣを６日間処理した細胞では、ＤＭＳＯを処理したＣｏｎｔｒｏｌ細胞に比較して、中性脂肪を蓄積した細胞の数が少ないことが顕微鏡下で観察された。さらに、２ＮＣを６日間処理した細胞では、定量的にも脂肪滴蓄積量の有意な減少が確認された（図３）。すなわち、２ＮＣは、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化に伴う中性脂肪の蓄積を抑制することが示された。
【0094】
（実施例２：２ＮＣを処理した細胞における遺伝子発現量の測定）
実施例１の結果からは、２ＮＣを処理した３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞における中性脂肪蓄積量の低下が、直接的に前駆脂肪細胞から白色脂肪細胞への分化の抑制に由来するのか、あるいはベージュ化誘導作用による脂質燃焼能の増加に依存しているのかは明らかではない。そこで、２ＮＣによる脂肪蓄積抑制作用を明らかにするため、２ＮＣを処理した細胞における遺伝子発現量を測定した。白色脂肪細胞の分化マーカーであるＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ２（Ｐｐａｒγ２）遺伝子及びＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎα（Ｃ／ｅｂｐα）遺伝子、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ２（ａＰ２）遺伝子とともに、ベージュ脂肪細胞化の分子マーカーであるＵｎｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｕｃｐ１）遺伝子、ベージュ脂肪細胞関連遺伝子であるＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ（Ｅｌｏｖｌ３）遺伝子、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １－ａｌｐｈａ（Ｐｇｃ１α）遺伝子の発現量を測定した。
実施例１の結果からは、２ＮＣを処理した３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞における中性脂肪蓄積量の低下が、直接的に前駆脂肪細胞から白色脂肪細胞への分化の抑制に由来するのか、あるいはベージュ化誘導作用による脂質燃焼能の増加に依存しているのかは明らかではない。そこで、２ＮＣによる脂肪蓄積抑制作用を明らかにするため、２ＮＣを処理した細胞における遺伝子発現量を測定した。白色脂肪細胞の分化マーカーであるＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ２（Ｐｐａｒγ２）遺伝子及びＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎα（Ｃ／ｅｂｐα）遺伝子、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ２（ａＰ２）遺伝子とともに、ベージュ脂肪細胞化の分子マーカーであるＵｎｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｕｃｐ１）遺伝子、ベージュ脂肪細胞関連遺伝子であるＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ（Ｅｌｏｖｌ３）遺伝子、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １－ａｌｐｈａ（Ｐｇｃ１α）遺伝子の発現量を測定した。
【0095】
実験は以下のように行った。細胞培養ディッシュ６０ｍｍ（ビーエム機器（株）社製）に１×１０５ｃｅｌｌｓの密度で播種した細胞を、上記の方法で分化誘導処理した。２ＮＣは、終濃度が２０μＭになるように分化用培地で希釈して、０日目、２日目、及び４日目に細胞培養液に添加した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．１％添加したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。
【0096】
０日目、２日目、４日目及び６日目の細胞から、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ（株）社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して精製した。１μｇ相当のＴｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ＲＴ（東洋紡（株）社製）、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（シグマアルドリッチジャパン（合）社製）、ｄＮＴＰ ｍｉｘ（（株）ニッポンジーン社製）を用いて逆転写反応により、ｃＤＮＡの合成を行った。５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ＲＴの付属品）、滅菌精製水 ２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ２μＬ、１０μＭ Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー １μＬ、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ １μＬ（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ＲＴの付属品）、及びＴｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇ相当１０μＬを混合し、全量を２０μＬとして、反応液とした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ（株）社製）を使用して、「４２℃×４０分→９９℃×５分」で逆転写反応を行った。反応後の逆転写反応液を滅菌精製水にて３倍希釈し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析に使用した。
【0097】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析には、Ｍｘ３０００ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（アジレント・テクノロジー社製）を使用した。
プライマーには、Ｐｐａｒγ２フォワードプライマー（５’－ＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧ－３’）（配列番号１）、Ｐｐａｒγ２リバースプライマー（５’－ＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧ－３’）（配列番号２）、ａＰ２フォワードプライマー（５’－ＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＡＣＡＧＧＡ－３’）（配列番号３）、ａＰ２リバースプライマー（５’－ＴＧＴＧＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＴＴ－３’）（配列番号４）、Ｃ／ｅｂｐαフォワードプライマー（５’－ＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧ－３’）（配列番号５）、Ｃ／ｅｂｐαリバースプライマー（５’－ＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣ－３’）（配列番号６）、Ｕｃｐ１フォワードプライマー（５’－ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＴＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡ－３’）（配列番号７）、Ｕｃｐ１リバースプライマー（５’－ＣＴＣＧＧＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡ－３’）（配列番号８）、Ｅｌｏｖｌ３フォワードプライマー（５’ －ＡＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＧＴＣＣＡＴＴＣ－３’）（配列番号９）、Ｅｌｏｖｌ３リバースプライマー（５’－ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧ－３’）（配列番号１０）、Ｐｇｃ１αフォワードプライマー（５’－ＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＧＣ－３’）（配列番号１１）、Ｐｇｃ１αリバースプライマー（５’－ＧＣＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡ－３’）（配列番号１２）を使用した。内部標準として、３６ｂ４フォワードプライマー（５’－ＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣＴ－３’）（配列番号１３）、３６ｂ４リバースプライマー（５’－ＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴ－３’）（配列番号１４）を使用した。プライマーはいずれもシグマアルドリッチジャパン（合）社製を使用した。
プライマーには、Ｐｐａｒγ２フォワードプライマー（５’－ＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧ－３’）（配列番号１）、Ｐｐａｒγ２リバースプライマー（５’－ＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧ－３’）（配列番号２）、ａＰ２フォワードプライマー（５’－ＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＡＣＡＧＧＡ－３’）（配列番号３）、ａＰ２リバースプライマー（５’－ＴＧＴＧＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＴＴ－３’）（配列番号４）、Ｃ／ｅｂｐαフォワードプライマー（５’－ＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧ－３’）（配列番号５）、Ｃ／ｅｂｐαリバースプライマー（５’－ＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣ－３’）（配列番号６）、Ｕｃｐ１フォワードプライマー（５’－ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＴＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡ－３’）（配列番号７）、Ｕｃｐ１リバースプライマー（５’－ＣＴＣＧＧＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡ－３’）（配列番号８）、Ｅｌｏｖｌ３フォワードプライマー（５’ －ＡＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＧＴＣＣＡＴＴＣ－３’）（配列番号９）、Ｅｌｏｖｌ３リバースプライマー（５’－ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧ－３’）（配列番号１０）、Ｐｇｃ１αフォワードプライマー（５’－ＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＧＣ－３’）（配列番号１１）、Ｐｇｃ１αリバースプライマー（５’－ＧＣＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡ－３’）（配列番号１２）を使用した。内部標準として、３６ｂ４フォワードプライマー（５’－ＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣＴ－３’）（配列番号１３）、３６ｂ４リバースプライマー（５’－ＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴ－３’）（配列番号１４）を使用した。プライマーはいずれもシグマアルドリッチジャパン（合）社製を使用した。
【0098】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応には、Ｇｏ Ｔａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（プロメガ（株）社製）を使用した。０．２ｍＬキャップ一体型ＰＣＲ８連チューブフラット１２０（日本ジェネティクス(株)社製）中に、Ｇｏ－Ｔａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μＬ、０．１ｍＭ フォワードプライマー０．１μＬ、０．１ｍＭ リバースプライマー０．１μＬ、ｃＤＮＡ溶液２μＬ、及び滅菌精製水 ７．８μＬを混合して入れて反応液とした。｛９５℃×３０秒（前処理）→「変性：９５℃×３０秒→アニーリング：５８℃×３０秒→伸長反応７２℃×３０秒」×４０サイクル（増幅）、９５℃×１５秒→６０℃×３０秒→９５℃×１５秒×１サイクル（融解曲線解析）｝のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
【0099】
測定して得られた３６ｂ４のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）と、Ｐｐａｒγ２、ａＰ２、Ｃ／ｅｂｐα、Ｕｃｐ１、Ｅｌｏｖｌ３及びＰｇｃ１αのＣｔ値とから、各遺伝子発現量の相対値をデルタ・デルタＣｔ（ΔΔＣｔ）法により算出した。２ＮＣを処理した細胞とＣｏｎｔｒｏｌ細胞との同日間における遺伝子発現量の比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
【0100】
結果を図４に示した。２ＮＣを６日間処理した細胞におけるＰｐａｒγ２遺伝子、ａＰ２遺伝子及びＣ／ｅｂｐα遺伝子の発現量が、Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞に比較して有意に増加していることが示された。また、２ＮＣを処理した細胞において、Ｕｃｐ１遺伝子及びＥｌｏｖｌ３遺伝子の発現量が顕著に増加していた。一方、分化誘導に伴うＰｇｃ１α遺伝子の発現誘導は、２ＮＣを処理した細胞において抑制された。これらのことから、２ＮＣによる脂肪滴蓄積抑制は、前駆脂肪細胞から白色脂肪細胞への分化誘導の抑制によるものではなく、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化促進作用によるものであることが示唆された。
【0101】
（実施例３：２ＮＣによるベージュ脂肪細胞分化誘導作用に関わる因子の探索）
実施例２では２ＮＣのベージュ脂肪細胞への分化促進作用が示された。脂肪細胞のベージュ化の促進因子として、ＰＰＡＲγ、甲状腺刺激ホルモン受容体Ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲ）、及びβアドレナリン受容体の活性化に加えて、線維芽細胞成長因子Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＦＧＦｓ）などが報告されている。そこで、実施例３では２ＮＣによるベージュ脂肪細胞分化誘導に関与する因子を検証した。
実施例２では２ＮＣのベージュ脂肪細胞への分化促進作用が示された。脂肪細胞のベージュ化の促進因子として、ＰＰＡＲγ、甲状腺刺激ホルモン受容体Ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲ）、及びβアドレナリン受容体の活性化に加えて、線維芽細胞成長因子Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＦＧＦｓ）などが報告されている。そこで、実施例３では２ＮＣによるベージュ脂肪細胞分化誘導に関与する因子を検証した。
【0102】
実施例２と同様に３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞を播種し、細胞がコンフルエントになるまで培養した。実施例３では、実施例２で用いた分化培地から、甲状腺刺激ホルモンであるトリヨードチロシン（Ｔ３）を除いたものを基本分化誘導培地とした（１．６μＭインスリン、０．２５μＭデキサメタゾン、５００μＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチンを含む１０％ＦＢＳ，含有ＤＭＥＭ・ハムＦ１２・ＰＳＧ含有）。ＰＰＡＲγのアゴニストであるピオグリタゾン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）社製，Ｐｉｏ）を、５ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解し、実験に用いた。
【0103】
実験は以下のように行った。細胞は実施例１と同様の方法で培養し、２ＮＣ、Ｐｉｏ、及びＴ３を、終濃度がそれぞれ２０μＭ、５μＭ及び０．０２ｎＭなるように、０日目にそれぞれ添加し、２日目、及び４日目にも添加した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．１％添加したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。それぞれの処理群の詳細については、図５に示した。
【0104】
分化６日目の細胞から、実施例２と同様の方法でｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。実施例２で測定したＰｐａｒγ２遺伝子、Ｃ／ｅｂｐα遺伝子、ａＰ２遺伝子、Ｕｃｐ１遺伝子、及びＥｌｏｖｌ３遺伝子に加え、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ １－３（Ａｄｒｂ１－３）遺伝子、Ｆｇｆ６遺伝子、Ｆｇｆ９遺伝子、及びＦｇｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（Ｆｇｆｒ１）遺伝子について遺伝子発現量を解析した。
解析にはＡｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ １（Ａｄｒｂ１）フォワードプライマー（５’－ＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＴＧ－３’）（配列番号１５）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ １（Ａｄｒｂ１）リバースプライマー（５’－ＡＧＣＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧ－３’）（配列番号１６）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ２（Ａｄｒｂ２）フォワードプライマー（５’－ＧＡＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣ－３’）（配列番号１７）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ２（Ａｄｒｂ２）リバースプライマー（５’－ＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧ－３’）（配列番号１８）Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ３（Ａｄｒｂ３）フォワードプライマー（５’－ＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＣＡＴ－３’）（配列番号１９）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ３（Ａｄｒｂ３）リバースプライマー（５’－ＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣ－３’）（配列番号２０）、Ｆｇｆ６フォワードプライマー（５’－ＧＣＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＧＡＧＧＡ－３’）（配列番号２１）、Ｆｇｆ６リバースプライマー（５’－ＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣ－３’）（配列番号２２）、Ｆｇｆ９フォワードプライマー（５’－ＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡ－３’）（配列番号２３）、Ｆｇｆ９リバースプライマー（５’－ＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴ－３’）（配列番号２４）、Ｆｇｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（Ｆｇｆｒ１）フォワードプライマー（５’－ＡＴＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧ－３’）（配列番号２５）、Ｆｇｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（Ｆｇｆｒ１）リバースプライマー（５’－ＧＧＡＡＧＴＣＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧ－３’）（配列番号２６）を使用した。プライマーはいずれもシグマアルドリッチジャパン（合）社製を使用した。
解析にはＡｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ １（Ａｄｒｂ１）フォワードプライマー（５’－ＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＴＧ－３’）（配列番号１５）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ １（Ａｄｒｂ１）リバースプライマー（５’－ＡＧＣＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧ－３’）（配列番号１６）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ２（Ａｄｒｂ２）フォワードプライマー（５’－ＧＡＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣ－３’）（配列番号１７）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ２（Ａｄｒｂ２）リバースプライマー（５’－ＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧ－３’）（配列番号１８）Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ３（Ａｄｒｂ３）フォワードプライマー（５’－ＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＣＡＴ－３’）（配列番号１９）、Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ Ｂｅｔａ ３（Ａｄｒｂ３）リバースプライマー（５’－ＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣ－３’）（配列番号２０）、Ｆｇｆ６フォワードプライマー（５’－ＧＣＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＧＡＧＧＡ－３’）（配列番号２１）、Ｆｇｆ６リバースプライマー（５’－ＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣ－３’）（配列番号２２）、Ｆｇｆ９フォワードプライマー（５’－ＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡ－３’）（配列番号２３）、Ｆｇｆ９リバースプライマー（５’－ＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴ－３’）（配列番号２４）、Ｆｇｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（Ｆｇｆｒ１）フォワードプライマー（５’－ＡＴＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧ－３’）（配列番号２５）、Ｆｇｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（Ｆｇｆｒ１）リバースプライマー（５’－ＧＧＡＡＧＴＣＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧ－３’）（配列番号２６）を使用した。プライマーはいずれもシグマアルドリッチジャパン（合）社製を使用した。
【0105】
測定して得られた各細胞中の３６ｂ４のＣｔ値とＵｃｐ１、Ｅｌｏｖｌ３、Ｐｐａｒγ２、ａＰ２、Ｃ／ｅｂｐα、Ａｄｒｂ１、Ａｄｒｂ２、Ａｄｒｂ３、Ｆｇｆ６、Ｆｇｆ９、及びＦｇｆｒ１のＣｔ値とから、各遺伝子発現量の相対値を実施例２と同様に算出した。Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞とそれぞれの処理群との比較は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0106】
結果は図６Ａ～６Ｃに示した。２ＮＣ（２）、ピオグリタゾン（３）及びＴ３（４）の単独処理した細胞におけるＵｃｐ１遺伝子発現量を比較すると、２ＮＣ処理において顕著な発現誘導が認められた。また、２ＮＣ＋Ｔ３（５）、ピオグリタゾン＋Ｔ３（６）及び２ＮＣ＋ピオグリタゾン（７）の共処理した細胞における発現量を比較すると、２ＮＣを処理した細胞でのＵｃｐ１遺伝子発現量が顕著に増加していることが示された。しかしながら、２ＮＣによるＵｃｐ１遺伝子発現量の増加に対してピオグリタゾンおよびＴ３の相加効果および相乗効果は認められなかった。ベージュ化誘導作用を示すピオグリタゾンを単独処理（３）あるいはＴ３との共処理（６）した細胞においてＵｃｐ１遺伝子発現量の有意な増加が見られたが、２ＮＣによる発現誘導と比較してその程度は弱いものであった。このことから、２ＮＣは優れたベージュ脂肪細胞分化促進作用を有する化合物である可能性が示された。
一方、２ＮＣを処理した細胞においてＥｌｏｖｌ３遺伝子発現量の増加が見られたが、その増加はピオグリタゾン処理においても認められた。また、脂肪細胞分化のマーカーであるＰｐａｒγ２、Ｃ／ｅｂｐα及びａＰ２の各遺伝子発現量を測定したところ、２ＮＣ単独処理（２）およびＴ３との共処理（５）によってＰｐａｒγ２遺伝子発現量の増加または増加傾向が示された。さらに、ａＰ２遺伝子発現量においてはＣｏｎｔｒｏｌ細胞に比較していずれの細胞においても増加が見られ、Ｃ／ｅｂｐα遺伝子発現量では２ＮＣ処理（２）において増加が認められた。次に、アドレナリン受容体の遺伝子発現量について検証したところ、２ＮＣを処理した細胞においてＡｄｒｂ１遺伝子及びＡｄｒｂ２遺伝子の発現量の増加は認められなかった。Ａｄｒｂ３遺伝子発現量は２ＮＣ処理（２）によって増加がみられたが、ピオグリタゾンあるいはＴ３との共処理ではその増加は消失した。
最後に線維芽細胞増殖因子関連遺伝子の発現量を検証した。２ＮＣを処理した細胞のＦｇｆ６遺伝子発現量において有意な変化はみられなかったが、Ｆｇｆ９の遺伝子発現量が有意に増加を示した（２，５，７）。ピオグリタゾン単独あるいはピオグリタゾン＋Ｔ３の共処理した細胞においてＦｇｆ９遺伝子の発現量の増加は見られたが、２ＮＣ処理に比較してその誘導は軽度なものであった。ＦＧＦ受容体であるＦｇｆ１Ｒ遺伝子発現量は、２ＮＣ処理（２）によって増加がみられたが、ピオグリタゾンあるいはＴ３との共処理においてはその増加は消失した。これらのことから、２ＮＣによる前駆脂肪細胞のベージュ化誘導作用にはＦｇｆ９遺伝子発現誘導の関与が示唆された。
一方、２ＮＣを処理した細胞においてＥｌｏｖｌ３遺伝子発現量の増加が見られたが、その増加はピオグリタゾン処理においても認められた。また、脂肪細胞分化のマーカーであるＰｐａｒγ２、Ｃ／ｅｂｐα及びａＰ２の各遺伝子発現量を測定したところ、２ＮＣ単独処理（２）およびＴ３との共処理（５）によってＰｐａｒγ２遺伝子発現量の増加または増加傾向が示された。さらに、ａＰ２遺伝子発現量においてはＣｏｎｔｒｏｌ細胞に比較していずれの細胞においても増加が見られ、Ｃ／ｅｂｐα遺伝子発現量では２ＮＣ処理（２）において増加が認められた。次に、アドレナリン受容体の遺伝子発現量について検証したところ、２ＮＣを処理した細胞においてＡｄｒｂ１遺伝子及びＡｄｒｂ２遺伝子の発現量の増加は認められなかった。Ａｄｒｂ３遺伝子発現量は２ＮＣ処理（２）によって増加がみられたが、ピオグリタゾンあるいはＴ３との共処理ではその増加は消失した。
最後に線維芽細胞増殖因子関連遺伝子の発現量を検証した。２ＮＣを処理した細胞のＦｇｆ６遺伝子発現量において有意な変化はみられなかったが、Ｆｇｆ９の遺伝子発現量が有意に増加を示した（２，５，７）。ピオグリタゾン単独あるいはピオグリタゾン＋Ｔ３の共処理した細胞においてＦｇｆ９遺伝子の発現量の増加は見られたが、２ＮＣ処理に比較してその誘導は軽度なものであった。ＦＧＦ受容体であるＦｇｆ１Ｒ遺伝子発現量は、２ＮＣ処理（２）によって増加がみられたが、ピオグリタゾンあるいはＴ３との共処理においてはその増加は消失した。これらのことから、２ＮＣによる前駆脂肪細胞のベージュ化誘導作用にはＦｇｆ９遺伝子発現誘導の関与が示唆された。
【0107】
（実施例４：２ＮＣによるベージュ化過程におけるＦｇｆ９遺伝子の発現量の変化）
実施例３より、２ＮＣを処理した細胞においてＦｇｆ９発現量の増加が確認された。そこで、実施例２で作製したｃＤＮＡを用いて２ＮＣによるベージュ化過程におけるＦｇｆ９遺伝子の発現変化をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法によって解析した。２ＮＣを処理した細胞とＣｏｎｔｒｏｌ細胞との同日間における遺伝子発現量の比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
実施例３より、２ＮＣを処理した細胞においてＦｇｆ９発現量の増加が確認された。そこで、実施例２で作製したｃＤＮＡを用いて２ＮＣによるベージュ化過程におけるＦｇｆ９遺伝子の発現変化をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法によって解析した。２ＮＣを処理した細胞とＣｏｎｔｒｏｌ細胞との同日間における遺伝子発現量の比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
【0108】
結果を図７に示した。図６に示す結果から、２ＮＣ処理した細胞の分化誘導開始から４日目及び６日目においてＦｇｆ９遺伝子発現量の有意な増加が示された。これらのことから、２ＮＣによる前駆脂肪細胞に対するベージュ化誘導作用へのＦＧＦ９の関与が示唆された。
【0109】
（実施例５：２ＮＣによる脂肪細胞のベージュ化に伴うミトコンドリア量の変化）
ベージュ脂肪細胞は、白色脂肪細胞に比較してミトコンドリア量が多く、高い脂肪燃焼能を有することが報告されている。そこで、２ＮＣ処理した細胞におけるミトコンドリア含量を検証した。
ベージュ脂肪細胞は、白色脂肪細胞に比較してミトコンドリア量が多く、高い脂肪燃焼能を有することが報告されている。そこで、２ＮＣ処理した細胞におけるミトコンドリア含量を検証した。
【0110】
実施例１と同様に６日目まで２ＮＣを処理した細胞及びＣｏｎｔｒｏｌ細胞を採取した後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（（株）ニッポンジーン社製）で処理した。Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（タカラバイオ（株）社製）を加えてタンパク質を沈澱させた後、イソプロパノール、及び７０％エタノール溶液（富士フイルム和光純薬（株）社製）を用いてゲノムＤＮＡを精製及び抽出した。ゲノムＤＮＡ １０ｎｇ相当を用いてミトコンドリア特異的遺伝子であるＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ２（Ｃｏｘ２）遺伝子ならびに核に存在するβ－ａｃｔｉｎ遺伝子の相当量を実施例２と同様にリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。プライマーには、Ｃｏｘ２フォワードプライマー（５’－ＡＡＴＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧ－３’）（配列番号２７）、Ｃｏｘ２リバースプライマー（５’－ＧＴＡＧＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＣ－３’）（配列番号２８）、β－ａｃｔｉｎフォワードプライマー（５’－ＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣ－３’）（配列番号２９）、β－ａｃｔｉｎリバースプライマー（５’－ＡＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣ－３’）（配列番号３０）を用いた。プライマーはいずれもシグマアルドリッチジャパン（合）社製を使用した。ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて統計解析を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
【0111】
結果を図８に示した。２ＮＣを６日間処理した細胞におけるミトコンドリア量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞に比較して有意に増加を示した。これらのことから、２ＮＣによるベージュ化促進作用は、Ｕｃｐ１遺伝子の発現増加のみならず、ミトコンドリア量を増加させることが示された。
【0112】
（実施例６：２ＮＣによる白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換の検証）
実施例１～５では２ＮＣの前駆脂肪細胞に対する脂肪細胞のベージュ化促進作用について示した。次に、２ＮＣの形質転換能（白色脂肪細胞をベージュ脂肪細胞に形質転換させる作用）について検証した。
実施例１～５では２ＮＣの前駆脂肪細胞に対する脂肪細胞のベージュ化促進作用について示した。次に、２ＮＣの形質転換能（白色脂肪細胞をベージュ脂肪細胞に形質転換させる作用）について検証した。
【0113】
細胞培養に関しては以下のように行った。細胞培養ディッシュ６０ｍｍ（ビーエム機器（株）社製）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で細胞を播種した。次いで、実施例１の方法と同様に細胞の分化誘導をして２日毎に培地交換を行い、白色脂肪細胞に分化させた（１０日目）。白色脂肪細胞に、２ＮＣは終濃度が２０μＭになるように、ピオグリタゾンは終濃度が５μＭになるように、分化誘導１０日目から培地に添加し、１２日目、１４日目、１６日目にも同様に培地交換を行った。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．１％添加したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。
【0114】
１８日目の細胞から実施例２と同様の方法でＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行い、リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。解析は実施例２で測定した遺伝子の発現量を同様の方法で解析した。Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞とそれぞれの処理群との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0115】
結果を図９に示した。２ＮＣを８日間処理した白色脂肪細胞におけるＵｃｐ１、Ｅｌｏｖｌ３、及びＰｇｃ１αの各遺伝子の発現量はＣｏｎｔｒｏｌ細胞に比較して有意に増加を示した。一方、２ＮＣを処理した細胞におけるＰｐａｒγ２及びＦｇｆ９の各遺伝子発現量はＣｏｎｔｒｏｌ細胞のそれと比較して違いは認められなかった。ベージュ脂肪細胞への形質転換能を有するピオグリタゾン（Ｐｉｏ）を処理した細胞においては、Ｕｃｐ１、Ｅｌｏｖｌ３、Ｐｇｃ１α、Ｐｐａｒγ２及びＦｇｆ９の各遺伝子発現量の増加が見られた。これらの結果より、２ＮＣは白色脂肪細胞をベージュ脂肪細胞へと形質転換させる作用を有していることが示された。
【0116】
（実施例７：２ＮＣによるベージュ脂肪細胞への形質転換についてミトコンドリア量の観点からの検証）
実施例６と同様に白色脂肪細胞に分化させた後、２ＮＣを８日間処理した。そして実施例５と同様の方法で、細胞よりＤＮＡを精製及び抽出してＣｏｘ２ならびβ－ａｃｔｉｎ遺伝子の相当量をリアルタイムＰＣＲにより解析した。２ＮＣを処理した細胞とＣｏｎｔｒｏｌ細胞における比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
実施例６と同様に白色脂肪細胞に分化させた後、２ＮＣを８日間処理した。そして実施例５と同様の方法で、細胞よりＤＮＡを精製及び抽出してＣｏｘ２ならびβ－ａｃｔｉｎ遺伝子の相当量をリアルタイムＰＣＲにより解析した。２ＮＣを処理した細胞とＣｏｎｔｒｏｌ細胞における比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
【0117】
結果を図１０に示した。２ＮＣを処理した細胞におけるミトコンドリア含量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞に比較して有意に増加を示した。このことから、２ＮＣによるベージュ脂肪細胞への形質転換作用によってミトコンドリア量を増加させることが示された。以上の結果より、２ＮＣは、前駆脂肪細胞をベージュ脂肪細胞への分化促進作用のみならず、白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換能を有していることが示唆された。
【0118】
（実施例８：２ＮＣを投与したマウスの体重量の変動及び組織重量の検証解析）
培養細胞を用いた上記実施例より、２ＮＣのベージュ脂肪細胞分化ならびに形質転換の促進作用があることが示された。そこで、動物モデル（Ｉｎ ｖｉｖｏ）における２ＮＣのベージュ化作用について検証した。
培養細胞を用いた上記実施例より、２ＮＣのベージュ脂肪細胞分化ならびに形質転換の促進作用があることが示された。そこで、動物モデル（Ｉｎ ｖｉｖｏ）における２ＮＣのベージュ化作用について検証した。
【0119】
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（日本エスエルシー（株）社製）を日本大学薬学部実験動物倫理規定に準じて飼育した。マウスは１ケージあたり３匹に分配し、温度２３±１℃、相対湿度５０±１０％、明暗１２時間周期の条件で飼育した。マウスの飼料は、通常食（ＮＭＦ、オリエンタル酵母工業（株）社製）を用いて自由摂取とした。２ＮＣを２０％ ２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ溶液（ＨＰＣＤ、富士フイルム和光純薬（株）社製）で懸濁し、１ｍｇ／ｍＬ溶液に調製し、１０ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｃｅで投与した。溶媒である２０％ ＨＰＣＤ溶液をＶｅｈｉｃｌｅとして投与した。２ＮＣの投与は、経口ゾンデ（（有）フチガミ器械社製）を用いて６週間（２日毎）行った。投与開始より１週間毎に体重量を測定した（動物実験承認番号：ＡＰ２２ＰＨＡ０１９－１）。
【0120】
マウス体重量の変化を図１１に示した。また、投与開始６週間後の解剖時に、精巣上体周囲の脂肪組織、及び皮下脂肪組織を採取してその重量を測定した。２ＮＣを投与したマウスとＶｅｈｉｃｌｅを投与したマウスにおける比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌマウスの各組織と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。組織重量の結果を図１２に示す。
【0121】
２ＮＣを投与したマウスの体重変動は、Ｖｅｈｉｃｌｅを投与したマウスのそれと比較して有意な違いは見られなかったが、投与６週目において体重増加の抑制傾向がみられた（図１１）。また、２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織重量（ｓＷＡＴ）において有意な減少が認められたが、精巣上体周囲の脂肪組織重量（ｅＷＡＴ）に違いはみられなかった（図１２）。
【0122】
（実施例９：２ＮＣを投与したマウスの脂肪組織の病理組織学的な解析）
上記において、２ＮＣを投与したマウスの体重増加の抑制傾向ならびに皮下脂肪組織重量の減少が認められた。ベージュ脂肪細胞において細胞内に多房性脂肪滴が多くみられるとともに、ＵＣＰ１を発現したミトコンドリアが多く存在することが報告されている。そこで、脂肪組織の病理切片を作製し、組織学的な解析を行った。
上記において、２ＮＣを投与したマウスの体重増加の抑制傾向ならびに皮下脂肪組織重量の減少が認められた。ベージュ脂肪細胞において細胞内に多房性脂肪滴が多くみられるとともに、ＵＣＰ１を発現したミトコンドリアが多く存在することが報告されている。そこで、脂肪組織の病理切片を作製し、組織学的な解析を行った。
【0123】
実施例７の解剖時に採取した各脂肪組織（精巣上体周囲脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織）の一部を用いて病理切片を作製した。組織断片をユニカセット（サクラファインテックジャパン（株）社製）に入れ、４％ホルムアルデヒド溶液（富士フイルム和光純薬（株）社製）に浸透させ、１８時間固定した。パラフィンブロックの作製は、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）ＶＩＰＴＭ ６ＡＩ（サクラファインテックジャパン（株）社製）を用いて、５０％アルコール溶液（３時間）、７０％アルコール溶液（２４時間）、８０％アルコール溶液（１時間）、９０％アルコール溶液（１時間）、及び１００％アルコール溶液（２時間）で処理した後、キシレン（武藤化学（株）社製）で２時間処理し、６５℃で溶解させたパラフィン溶液（サクラファインテックジャパン（株）社製）に浸透（１６時間）させることにより行った。そのパラフィンブロックを加湿しながらミクロトーム（サクラファインテックジャパン（株）社製）およびフェザーミクロトーム用替刃Ｓ３５（東京硝子器械（株）社製）を用いて５μｍに薄切りしてパラフィン切片とし、Ｔ－７２パラフィン水浴伸展器（Ｔａｋａｓｈｉｍａ（株）社製）を４５℃に設定し、パラフィン切片を浮かべて組織を伸展した。そのパラフィン切片をファインフロストスライドガラス（松浪硝子工業（株）社製）に接着固定させ、Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｅｋ（登録商標） Ｓｌｉｄｅ ＷａｒｍｅｒＰＳ－５３（サクラファインテックジャパン（株）社製）上にて４０℃で１２時間乾燥させた。
【0124】
病理切片を接着させたスライドガラスをキシレンに３分ｘ３回→１００％アルコール溶液１分ｘ３回→９０％アルコール溶液１分→８０％アルコール溶液１分、７０％アルコールに２分、順次浸けて脱パラフィンを行った。脱パラフィンを行ったサンプルを流水水洗した後、蒸留水に浸けて以下の染色を行った。マイヤーへマトキシリン溶液（サクラファインテックジャパン（株）社製）１分→流水水洗した後、蒸留水→エオジン溶液（サクラファインテックジャパン（株）社製）４５秒。染色した試料を７０％アルコール溶液２分→８０％アルコール溶液１分→９０％アルコール溶液１分→１００％アルコール溶液１分ｘ３回→キシレンに３回浸し、封入剤ＮＥＷ ＭＸ（松浪硝子工業（株）社製）及びカバーガラス（松浪硝子工業（株）社製）を用いてスライドガラスを封入した。
【0125】
ヘマトキシリン・エオジン染色して封入したスライドガラスは、正立顕微鏡ＢＸ５３（オリンパスライフサイエンス（株）社製）を用いて観察し、顕微鏡用デジタルカメラＤＰ２８（オリンパスライフサイエンス（株）社製）を用いて病理組織画像を撮影した（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１００μｍ）。ＬＰＦ（Ｌｏｗ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ：低倍率視野（１００倍））は、ＨＰＦ（Ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ（１００倍の一部を拡大した画像）。
【0126】
その結果を図１３に示した。ベージュ脂肪細胞は細胞内に多房性脂肪滴を形成する特徴がある。２ＮＣを処理したマウスの皮下脂肪組織（ｓＷＡＴ）において多房性の脂肪細胞が多く観察された。一方、精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ）において多房性の脂肪細胞はいずれのマウスにおいてもほとんど観察されなかった。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）において病理学的な違いは観察されなかった。
【0127】
（実施例１０：２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織における脂肪細胞のベージュ化についての検証）
２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織において組織重量の減少ならびに多房性の脂肪滴の形成が見られたことから、脂肪細胞のベージュ化が促進したことが推察される。そこで、２ＮＣを投与したマウスの脂肪組織におけるＵＣＰ１のタンパク質発現量およびミトコンドリア量について検証した。
２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織において組織重量の減少ならびに多房性の脂肪滴の形成が見られたことから、脂肪細胞のベージュ化が促進したことが推察される。そこで、２ＮＣを投与したマウスの脂肪組織におけるＵＣＰ１のタンパク質発現量およびミトコンドリア量について検証した。
【0128】
タンパク質の抽出は以下のように行った。実施例７の解剖時に採取した皮下脂肪組織（約１０ｍｇ）を３００μＬの組織抽出液（ＲＩＰＡ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１％デオキシコール酸、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（富士フイルム和光純薬（株）社製））に入れ、ダウンス型ホモジナイザー（アズワン（株）社製）、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（超音波機器、コスモバイオ（株）社製）を用いてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ（株）社製）を用いて反応させ、マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯ ｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ，ＢＭＧ ＬＡＢ ＴＥＣＨ（有）社製）を用いて５６２ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度を測定した。得られたタンパク質抽出液をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔに用いた。
【0129】
２ＮＣ又はＶｅｈｉｃｌｅを投与したマウスの皮下脂肪組織より得られた２０μｇ相当のタンパク質抽出液をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔに用いた。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により行った。タンパク質分子量マーカーとしてＥｘｃｅｌＢａｎｄ ３－ｃｏｌｏｒ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（コスモバイオ（株）社製）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、電気泳動槽ＡＥ－６５００ラピダス・ミニスラブ（アトー（株）社製）を用いて行い、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（株）社製）への転写はセミドライ式トランスファー装置（ホライズブロット２Ｍ－Ｒ、アトー（株）社製）を用いて行った。電気泳動後にポリアクリルアミドゲルからトランスファーしたＰＶＤＦメンブレンを以下のように反応させた。５％スキムミルク溶液（富士フイルム和光純薬（株）社製）（室温１時間）→１次抗体溶液（室温１時間）→１ｘＰＢＳＴ洗浄（１ｘＰＢＳにＴｗｅｅｎ２０を０．０５％添加した溶液、１０分ｘ３回）→２次抗体溶液（室温１時間）→１ｘＰＢＳＴ洗浄（１０分ｘ３回）して染色を行った。１次抗体はＵＣＰ抗体１（ａｂ１０９８３、アブカム社製）、β－ＡＣＴＩＮ抗体（６０００８－１－Ｉｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃ社製）、２次抗体はＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（７０７４Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊａｐａｎ（株）社製）、Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（＃７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊａｐａｎ（株）社製））を１ｘＰＢＳＴ溶液で希釈して反応させた。タンパク質の検出はＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ヘルスケア・ジャパン（株））を用いて染色し、ＣＣＤイメージャー（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ８００、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いて撮影した。ＵＣＰ１及び内部標準タンパク質β－ＡＣＴＩＮのタンパク質量を図１４に示した。なお、各１－４レーンには異なるマウスから得たタンパク質抽出液を泳動した。
【0130】
２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織においてＵＣＰ１タンパク質量の増加が見られた。このことから、２ＮＣの投与によって皮下脂肪組織においてベージュ化が促進していることが示された。
【0131】
（実施例１１：２ＮＣを投与したマウス脂肪組織におけるミトコンドリア量の変化）
実施例７の解剖時に採取した脂肪組織（精巣上体周囲脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織）から、実施例５と同様の方法によりＤＮＡを抽出し、ミトコンドリア量をリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。２ＮＣを投与したマウスとＶｅｈｉｃｌｅを投与したマウスにおける比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌマウスと比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
実施例７の解剖時に採取した脂肪組織（精巣上体周囲脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織）から、実施例５と同様の方法によりＤＮＡを抽出し、ミトコンドリア量をリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。２ＮＣを投与したマウスとＶｅｈｉｃｌｅを投与したマウスにおける比較をＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて行った（Ｃｏｎｔｒｏｌマウスと比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０５の場合を統計学的に有意とした）。
【0132】
結果を図１５に示した。２ＮＣを投与したマウスの皮下脂肪組織（ｓＷＡＴ）においてミトコンドリア量が有意に増加を示した。一方、精巣上体周囲脂肪組織（ｅＷＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）におけるミトコンドリア量に大きな違いは見られなかった。これらのことから、２ＮＣは、マウス皮下脂肪組織のベージュ化を促進する化合物であることが示された。
【0133】
（実施例１２：２ＮＣ誘導体のベージュ脂肪細胞への分化促進作用の検証）
上記の実験により、２ＮＣはベージュ化促進作用を示す化合物であることが示された。２ＮＣはフェニルクロマン構造（Ｃ６－Ｃ３－Ｃ６）を有する化合物である。そこで、フラバノン骨格のＡ環あるいはＢ環を修飾した誘導体を合成することで、ＮＣ化合物の最適化（生理活性、安定性など）を目的として、２ＮＣ誘導体のベージュ化促進作用について構造活性相関を検証した。
上記の実験により、２ＮＣはベージュ化促進作用を示す化合物であることが示された。２ＮＣはフェニルクロマン構造（Ｃ６－Ｃ３－Ｃ６）を有する化合物である。そこで、フラバノン骨格のＡ環あるいはＢ環を修飾した誘導体を合成することで、ＮＣ化合物の最適化（生理活性、安定性など）を目的として、２ＮＣ誘導体のベージュ化促進作用について構造活性相関を検証した。
【0134】
はじめに、フラバノン骨格のＡ環を変化させた誘導体のベージュ化促進作用を検証した。誘導体の構造式を図１６に示した。２ＮＣ－Ａ誘導体の前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化促進作用について、中性脂肪の蓄積量の変化を指標に評価した。２ＮＣ－Ａ誘導体はＤＭＳＯを用いてそれぞれ５ｍＭとなるように溶解した。２ＮＣ－Ａ誘導体の終濃度が５μＭになるように分化誘導培地で希釈し、実施例１と同様に分化誘導０日目、２日目、４日目の培地交換の際に添加した。なお、溶媒であるＤＭＳＯを０．１％添加した分化培養培地を同様に処理した細胞をＣｏｎｔｒｏｌ（Ｃｏｎ）とし、ベージュ化促進作用を示すピオグリタゾン（５μＭ）をポジティブコントロールとした。分化誘導６日目の細胞を１ｘＰＢＳで１回洗浄し、固定液で１晩固定させ、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色した後、顕微鏡下で観察した。
【0135】
結果を図１７に示す。脂肪細胞分化誘導と共に、２ＮＣ－Ａ誘導体を６日間処理したところ、２ＮＣ－Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ａ６，Ａ７を処理した細胞における中性脂肪の蓄積量が抑制された。
【0136】
中性脂肪蓄積の抑制作用を示した２ＮＣ－Ａ２～Ａ７について遺伝子発現量の観点から検証した。上記と同様に分化誘導時に２ＮＣ－Ａ２～Ａ７（５μＭ）を６日間処理した。６日目の細胞より実施例２の方法でＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作製してリアルタイムＰＣＲ法によって遺伝子発現量を解析した。遺伝子発現量の解析は、実施例２で２ＮＣ処理によって増加が見られた遺伝子（Ｕｃｐ１、Ｆｇｆ９、Ｅｌｏｖｌ３、Ｐｐａｒγ２、Ｃ／ｅｂｐαおよびａＰ２）について行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞と２ＮＣ－Ａ２～Ａ７誘導体を処理した細胞との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0137】
結果を図１８Ａ及び図１８Ｂに示す。２ＮＣ－Ａ２、２ＮＣ－Ａ３、２ＮＣ－Ａ４を処理した細胞におけるＵｃｐ１、Ｅｌｏｖｌ３、Ｐｐａｒγ２、ａＰ２の各遺伝子発現量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞（Ｃ）のそれと比較して有意に増加を示した。また実施例２で、２ＮＣ処理によるＵｃｐ１発現誘導と相関性が見られたＦｇｆ９遺伝子発現量は、２ＮＣ－Ａ２および２ＮＣ－Ａ４を処理した細胞において顕著に増加した。
【0138】
２ＮＣ－Ａ誘導体の中で、２ＮＣ－Ａ２および２ＮＣ－Ａ４が、Ｕｃｐ１、Ｆｇｆ９などのベージュ化関連遺伝子の発現誘導作用が亢進していたことから、２ＮＣ－Ａ２と２ＮＣ－Ａ４を処理した細胞におけるミトコンドリア量を実施例５の方法と同様に測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞と２ＮＣ－Ａ２および２ＮＣ－Ａ４を処理した細胞との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0139】
結果を図１９に示す。２ＮＣ－Ａ２および２ＮＣ－Ａ４をそれぞれ処理した細胞におけるミトコンドリア量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞に比較して有意に増加した。これらのことから、２ＮＣ－Ａ２および２ＮＣ－Ａ４は、２ＮＣ（２０μＭ）より低濃度（５μＭ）で前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化を促進させる化合物であることが示唆された。これらの結果より、２ＮＣ－Ａ２および２ＮＣ－Ａ４誘導体はＵｃｐ１遺伝子の発現増加作用とともに、ミトコンドリア量の調節にも関与していることが示された。
【0140】
次に、フラバノン骨格のＢ環を修飾した２ＮＣ誘導体のベージュ化促進作用を検証した。誘導体の構造式を図１９に示した。２ＮＣ－Ｂ誘導体の前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化促進作用について、上記と同様に中性脂肪の蓄積量の変化を指標に評価した。２ＮＣ－Ｂ誘導体はＤＭＳＯを用いてそれぞれ５ｍＭとなるように溶解した。２ＮＣ－Ｂ誘導体の終濃度が５μＭになるように分化誘導培地で希釈し、実施例１と同様に分化誘導０日目、２日目、４日目の培地交換の際に添加した後、細胞を１ｘＰＢＳで１回洗浄し、固定液で１晩固定させ、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色した後、顕微鏡下で観察した。
【0141】
結果を図２１に示す。その結果、２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ６およびＢ７を処理した細胞において中性脂肪蓄積量の抑制がみられた。特に、２ＮＣ－Ｂ７を処理した細胞における中性脂肪量の抑制は顕著に観察された。
【0142】
中性脂肪蓄積の抑制作用を示した２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ６およびＢ７について遺伝子発現量の観点から検証した。上記と同様に分化誘導時に２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ６およびＢ７（５μＭ）を６日間処理した。６日目の細胞よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応により、ｃＤＮＡを作製して上記と同様にリアルタイムＰＣＲ法によって遺伝子発現量を解析した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞と２ＮＣ－Ｂ誘導体を処理した細胞との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0143】
結果を図２２に示す。２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ６およびＢ７を処理した細胞におけるＵｃｐ１、Ｅｌｏｖｌ３、Ｆｇｆ９などの各ベージュ化関連遺伝子発現量及びＰｐａｒγ２、ａＰ２およびＣ／ｅｂｐαの各遺伝子発現量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞（Ｃ）のそれと比較して有意に増加を示した。
【0144】
２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６およびＢ７）についてミトコンドリア量の観点からベージュ化促進作用を検証した。上記と同様に２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６およびＢ７）を分化誘導時より処理し、分化誘導６日目の細胞より実施例５の方法と同様にＤＮＡを抽出してミトコンドリアＤＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞と２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ６および２ＮＣ－Ｂ７を処理した細胞との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0145】
その結果を図２３に示す。Ｕｃｐ１遺伝子などの発現誘導が見られた２ＮＣ－Ｂ４、Ｂ６およびＢ７のいずれの誘導体を処理した細胞においてもミトコンドリア量の増加は認められなかった。これらの結果より、２ＮＣ－Ｂ誘導体はＵｃｐ１遺伝子の発現増加作用を示すことから、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化促進作用を有していることが示されたが、ミトコンドリア量の調節作用には影響が少ない化合物であることが示された。
【0146】
（実施例１３：２ＮＣ誘導体のベージュ脂肪細胞への形質転換促進作用の検証）
実施例１２では２ＮＣ誘導体（Ａ，Ｂ）の前駆脂肪細胞に対する脂肪細胞のベージュ化促進作用について示した。次に、ベージュ化促進作用が見られた２ＮＣ誘導体（Ａ，Ｂ）の形質転換能（白色脂肪細胞がベージュ脂肪細胞へと形質転換する作用）について検証した。
実施例１２では２ＮＣ誘導体（Ａ，Ｂ）の前駆脂肪細胞に対する脂肪細胞のベージュ化促進作用について示した。次に、ベージュ化促進作用が見られた２ＮＣ誘導体（Ａ，Ｂ）の形質転換能（白色脂肪細胞がベージュ脂肪細胞へと形質転換する作用）について検証した。
【0147】
細胞培養および分化誘導は実施例６と同様の方法で行った。ディッシュ６０ｍｍ（ビーエム機器（株）社製）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で細胞を播種し、上記の方法で分化誘導を行った。２ＮＣ－Ａ誘導体（Ａ２、Ａ３、Ａ４）および２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６、Ｂ７）の終濃度が５μＭになるように分化培地で希釈し、分化誘導１０日目の白色脂肪細胞に添加し、同様に１２日目、１４日目、及び１６日目に培地交換時に添加処理した。なお、溶媒であるＤＭＳＯを０．１％添加した分化培養培地を同様に処理した細胞をＣｏｎｔｒｏｌ（Ｃｏｎ）とし、ベージュ化促進作用が示すピオグリタゾン（５μＭ）をポジティブコントロールとした。
【0148】
白色脂肪細胞に２ＮＣ誘導体を８日間処理した細胞より、上記と同様の方法でＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によってｃＤＮＡを作製した。そしてリアルタイムＰＣＲ法によってベージュ化マーカーであるＵｃｐ１およびＦｇｆ９遺伝子発現量を測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞と２ＮＣ－Ａ誘導体（Ａ２、Ａ３、Ａ４）および２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６、Ｂ７）を処理した細胞との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0149】
結果を図２４に示した。２ＮＣ－Ａ誘導体（Ａ２、Ａ３、Ａ４）および２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６、Ｂ７）をそれぞれ処理した細胞におけるＵｃｐ１遺伝子発現量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞のそれと比較して有意に増加を示した。その一方で、ピオグリタゾン（Ｐｉｏ）を処理した細胞に比較してＵｃｐ１遺伝子の発現誘導は軽度なものであった。Ｆｇｆ９遺伝子発現量は、２ＮＣおよび２ＮＣ－Ａ誘導体を処理した白色脂肪細胞においても変化は見られなかった。
【0150】
白色脂肪細胞においてもＵｃｐ１の発現誘導を示したことから、２ＮＣ－Ａ誘導体（Ａ２、Ａ３、Ａ４）および２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６、Ｂ７）についてミトコンドリア量の観点から形質転換作用について検証した。上記と同様に２ＮＣ－Ａ誘導体（Ａ２、Ａ３、Ａ４）および２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６、Ｂ７）の終濃度が５μＭになるように分化培地で希釈し、分化誘導１０日目の白色脂肪細胞に添加し、同様に１２日目、１４日目、及び１６日目に培地交換時に添加処理した。なお、溶媒であるＤＭＳＯを０．１％添加した分化培養培地を同様に処理した細胞をＣｏｎｔｒｏｌ（Ｃｏｎ）とし、ベージュ化促進作用が示すピオグリタゾン（５μＭ）をポジティブコントロールとした。
【0151】
分化誘導１８日目の細胞より、実施例５の方法と同様にＤＮＡを抽出してミトコンドリアＤＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）細胞と２ＮＣ－Ａ誘導体（Ａ２、Ａ３、Ａ４）および２ＮＣ－Ｂ誘導体（Ｂ４、Ｂ６、Ｂ７）を処理した細胞との比較は一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で検定し、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとしてＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いた（Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞と比較してそれぞれの有意水準（ｐ）が＊ｐ＜０．０１の場合を統計学的に有意とした）。
【0152】
結果を図２５に示す。Ｕｃｐ１遺伝子などの発現誘導が見られた２ＮＣ誘導体において２ＮＣ－Ｂ７を処理した細胞のミトコンドリア量はＣｏｎｔｒｏｌ細胞のそれと比較して有意な増加を示した。これらの結果より、２ＮＣ－Ｂ７はＵｃｐ１遺伝子の発現誘導とともに、ミトコンドリア量を増加させる形質転換促進作用を有していることが示された。
【0153】
以上の培養細胞を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏ実験ならびにマウスを用いたＩｎ ｖｉｖｏ実験の結果より、フラバノン誘導体である２ＮＣは、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化促進作用と白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換促進作用を示す有能な化合物であることが示された。また、２ＮＣによるベージュ脂肪細胞への分化促進作用にはベージュ化促進作用が報告されているＦＧＦ９の発現誘導と関連性が見られた。また、２ＮＣの誘導体化に伴って、２ＮＣと比較して低い濃度でもＵｃｐ１遺伝子の発現誘導を示した。Ａ環へ官能基を導入した誘導体（２ＮＣ－Ａ２，Ａ４）は、前駆脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への分化促進作用が増大し、Ｂ環へ官能基を導入した誘導体（２ＮＣ－Ｂ７）は白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への形質転換作用が亢進した。２ＮＣは構造活性相関の更なる解明により、ベージュ化促進作用を介した肥満治療薬の分子基盤を新たに提供するとともに、有能なシード化合物となることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【0154】
本発明によれば、中性脂肪の蓄積を抑制することが可能な、肥満を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】