特開 2024-176189 凍結細胞解凍装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024176189

(43)【公開日】2024-12-19

(54)【発明の名称】凍結細胞解凍装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20241212BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023094537

(22)【出願日】2023-06-08

(71)【出願人】

【識別番号】000111085

【氏名又は名称】ニッタ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002675

【氏名又は名称】弁理士法人ドライト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】石井 大貴

(72)【発明者】

【氏名】亀野 峻介

(72)【発明者】

【氏名】初田 雅弘

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA12

4B029AA27

4B029BB11

4B029DG10

4B029GA02

(57)【要約】

【課題】凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避することができる凍結細胞解凍装置を提供する。
【解決手段】凍結細胞解凍装置１１は、液体の培地２６を案内する導入配管２５と、凍結保護剤を含む凍結処理液を含有する凍結細胞１２を収容しながら導入配管２５から培地２６を導入する容器１３を保持し、凍結細胞１２に接触する培地から凍結細胞１２に融解熱を加える融解ユニット１５と、凍結細胞１２に対して培地の相対移動を生み出す液流れユニット３４と、容器１３に接続されて、解凍された細胞を含む培地の排出を案内する排出配管３２とを備え、解凍された細胞が培地に分散する際に培地中で凍結保護剤の濃度は３ｖｏｌ％以下、好ましくは１ｖｏｌ％以下に維持される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体の培地を案内する導入配管と、
凍結保護剤を含む凍結処理液を含有する凍結細胞を収容しながら前記導入配管から前記培地を導入する容器を保持し、前記凍結細胞に接触する前記培地から前記凍結細胞に融解熱を加える融解ユニットと、
前記凍結細胞に対して前記培地の相対移動を生み出す液流れユニットと、
前記容器に接続されて、解凍された細胞を含む前記培地の排出を案内する排出配管と
を備え、
解凍された前記細胞が前記培地に分散する際に前記培地中で前記凍結保護剤の濃度は３ｖｏｌ％以下に維持される
凍結細胞解凍装置。

【請求項2】

前記凍結細胞は、前記凍結保護剤を５ｖｏｌ％以上１０ｖｏｌ％以下で含有する
請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。

【請求項3】

解凍された前記細胞が前記培地に分散する際に前記培地中で前記凍結保護剤の濃度は１ｖｏｌ％以下に維持される
請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。

【請求項4】

前記容器への導入に先立って前記培地を加熱する加温ユニットを備える
請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。

【請求項5】

前記容器に接続されて、前記容器を加熱する顕熱変化ユニットを備える
請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。

【請求項6】

前記凍結保護剤は、ジメチルスルホキシドを含有する
請求項１に記載の凍結細胞解凍装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、凍結細胞を解凍して細胞を回収する凍結細胞解凍装置に関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１は、バイアルを加熱するヒーターを備える凍結細胞解凍装置を開示する。細胞を含む懸濁液はバイアル内で凍結する。ヒーターからバイアルに凍結細胞の融解熱は伝達される。凍結細胞は外周から中心に向かって徐々に融解していく。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第６６６１６１６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

細胞の凍結にあたって懸濁液には凍結保護剤が混ぜられる。凍結保護剤には一般にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれる。解凍後のジメチルスルホキシドは細胞にダメージを与えることから、できるだけ短時間で解凍は完了することが望まれる。とはいえ、細胞が４２℃を超えた高温に曝されると、細胞は死滅してしまう。その一方で、低温の解凍に伴って細胞とジメチルスルホキシドとの接触時間が延びると、細胞は死滅してしまう。したがって、バイアルの加熱にあたって複雑かつ高度な温度制御が要求される。

【0005】

本発明は、凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避することができる凍結細胞解凍装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の凍結細胞解凍装置は、液体の培地を案内する導入配管と、凍結保護剤を含む凍結処理液を含有する凍結細胞を収容しながら前記導入配管から前記培地を導入する容器を保持し、前記凍結細胞に接触する前記培地から前記凍結細胞に融解熱を加える融解ユニットと、前記凍結細胞に対して前記培地の相対移動を生み出す液流れユニットと、前記容器に接続されて、解凍された細胞を含む前記培地の排出を案内する排出配管とを備え、解凍された前記細胞が前記培地に分散する際に前記培地中で前記凍結保護剤の濃度は３ｖｏｌ％以下に維持される。

【発明の効果】

【0007】

以上のように開示の凍結細胞解凍装置によれば、凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避できる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】本発明の一実施形態に係る凍結細胞解凍装置の構成を概略的に示す全体図である。

【図2】凍結細胞の顕熱変化の様子を概略的に示す模式図である。

【図3】凍結細胞の潜熱変化の様子を概略的に示す模式図である。

【図4】凍結細胞解凍装置での解凍に費やされる時間のシミュレーションに用いた凍結細胞を収容した容器を説明する図である。

【図5】凍結細胞解凍装置での解凍における時間経過と解凍の様子の一例を示す図である。

【図6】凍結細胞解凍装置での解凍における時間経過と温度変化の一例を示す図である。

【図7】実施例に係る凍結細胞解凍装置での培地投入動作のパターンを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、添付図面を参照しつつ本発明の一実施形態を説明する。

【0010】

（凍結細胞解凍装置１１の構成）
図１は本発明の一実施形態に係る凍結細胞解凍装置の構成を概略的に示す。凍結細胞解凍装置１１は、凍結細胞１２を収容する第１容器１３を保持し、第１容器１３に収容される凍結細胞１２に第１容器１３内の培地１４から融解熱を加える融解ユニット１５を備える。ここでは、第１容器１３は、例えばガラス製のバイアル１３ａと、バイアル１３ａの開口を塞ぐキャップ１３ｂとで構成されることができる。バイアル１３ａに凍結細胞１２は収容される。細胞の凍結にあたってバイアル１３ａには懸濁液が収容される。懸濁液はバイアル１３ａとともに凍結される。凍結細胞１２の保存にあたって例えば凍結細胞１２は液体窒素で冷却されることができる。このとき、凍結細胞１２の温度はマイナス１９６℃付近まで低下する。キャップ１３ｂには導入ポート１６および排出ポート１７が形成される。

【0011】

懸濁液は凍結処理液と当該凍結処理液に分散する細胞とで構成される。凍結処理液は培地と細胞凍結保存液とヒト血清アルブミンとを含有する。細胞凍結保存液には凍結保護剤として、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含有される。ジメチルスルホキシドの濃度は例えば凍結処理液の５ｖｏｌ％以上１０ｖｏｌ％以下であり、具体的には５ｖｏｌ％に設定される。ジメチルスルホキシドは細胞の凍結にあたって細胞内で凝固する水分の膨張を防止することができる。ジメチルスルホキシドは良好に細胞の死滅を防止することができる。凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシドの他にグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。上記の凍結保護剤は細胞膜透過性であり、細胞内へ浸透し氷晶形成を抑制する効果がある反面、細胞内で代謝により有害物質へ変化し、生物学的毒性を発現することが知られている。

【0012】

第１容器１３には、外側からバイアル１３ａを加熱する顕熱変化ユニット２３が結合される。顕熱変化ユニット２３は、例えば、凍結細胞１２の融解温度未満でバイアル１３ａを加熱するヒーター２４を備える。ヒーター２４は、例えば、バイアル１３ａを受け止めバイアル１３ａを支持する形状を有することができる。ヒーター２４の温度は凍結細胞１２の融解温度未満に制限されることから、バイアル１３ａからの熱伝達で凍結細胞１２の融解は回避されることができる。その一方で、凍結細胞１２の温度は顕熱変化で可能な限り融解温度に近づくことができる。ここでは、ヒーター２４の温度は例えばマイナス１℃に設定される。あるいは、ヒーター２４の温度は、顕熱変化を早めるために細胞を死滅させない範囲の高温、例えば３７℃～４２℃、具体的には４２℃に設定しても良い。

【0013】

顕熱変化ユニット２３によって、凍結細胞１２の温度は融解に先立って顕熱変化でできる限り高温まで加熱されることから、培地の熱エネルギーは効率的に潜熱変化に利用されることができ、培地に基づく凍結細胞１２の解凍は促進されることができる。凍結細胞１２の温度が培地の融解温度よりも低温であると、凍結細胞１２に接触する培地は凍結してしまい、凍結細胞１２の解凍に支障を来してしまうが、凍結細胞１２の温度が高まれば、凍結細胞１２に培地が接触しても培地の凍結は回避されることができ、培地は効率的に凍結細胞１２を解凍することができる。

【0014】

第１容器１３には水平軸線１８回りに第１容器１３の回転を生み出す傾斜ユニット２１が結合される。傾斜ユニット２１は、例えばヒーター２４に接続されて、水平軸線１８回りでヒーター２４を駆動するモーター２２を備える。モーター２２は、例えば、電力の供給に応じて軸心回りで回転する駆動軸を備える。駆動軸の回転力は歯車機構を介してヒーター２４に伝達されることができる。傾斜ユニット２１の働きで第１容器１３の姿勢は水平軸線１８回りに変化することができる。第１容器１３は、バイアル（円筒）１３ａの中心軸線が鉛直方向に一致する第１位置と、バイアル１３ａの底よりもキャップ１３ｂが下方に位置する第２位置とで保持されることができる。第２位置では導入ポート１６よりも排出ポート１７は下方に位置する。

【0015】

キャップ１３ｂの導入ポート１６には、１本の流路を区画する導入配管２５の一端が連結される。導入配管２５は例えば軟質樹脂製のチューブで構成されることができる。導入配管２５の他端には、液体の培地２６を保持する第２容器２７が接続される。培地２６には、凍結細胞１２に含まれる細胞に適した培地が用いられる。培地２６は例えば常温で細胞の生存環境を提供することができる。第１容器１３には導入配管２５から液体の培地２６が導入される。導入された培地は凍結細胞１２に接触する。こうして培地２６から凍結細胞１２に融解熱は伝達される。

【0016】

第２容器２７には第２容器２７に収容される培地２６を加熱する加温ユニット３１が結合される。加温ユニット３１の働きで第２容器２７内の培地２６は室温以上に温められることができる。培地２６に熱エネルギーは供給される。培地２６は第１容器１３への導入に先立って加熱される。ただし、培地２６の温度は細胞の死滅温度未満に維持される。ここでは、培地２６の温度は３７℃以下に制限される。

【0017】

キャップ１３ｂの排出ポート１７には、１本の流路を区画する排出配管３２の一端が連結される。排出配管３２の他端には、解凍された細胞を回収する第３容器３３が接続される。排出配管３２は、第１容器１３から第３容器３３に、解凍された細胞を含む培地の排出を案内する。第３容器３３には、解凍されて培地で希釈化された懸濁液が流れ込む。

【0018】

導入配管２５には第２容器２７から第１容器１３に向かって培地を動かすポンプ３４が結合される。ポンプ３４は第１容器１３内で凍結細胞１２に対して培地の相対移動を生み出す液流れユニットとして機能することができる。ポンプ３４には例えばチューブポンプが用いられることができる。第１容器１３は密閉されることから、ポンプ３４の圧力は第１容器１３から希釈化された懸濁液の排出を促すことができる。ポンプ３４の働きに応じて、培地の流量は調整されることができる。こうして流量が調整されることで、第１容器１３内で解凍された細胞が培地に分散する際に培地中でジメチルスルホキシドの濃度は３ｖｏｌ％以下に維持されることができる。解凍された細胞は３ｖｏｌ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含む培地に接触するので、培地との接触時間に関係なくジメチルスルホキシドに基づく細胞の死滅は低減されることができる。細胞は良好に解凍されることができる。

【0019】

凍結細胞解凍装置１１では、解凍された細胞が培地に分散する際に培地中でジメチルスルホキシドの濃度は、好ましくは１ｖｏｌ％以下に維持される。細胞の死滅はさらに低減され、細胞は良好に解凍されることができる。

【0020】

モーター２２、ヒーター２４、加温ユニット３１およびポンプ３４には制御ユニット３５が接続される。制御ユニット３５は、モーター２２、ヒーター２４、加温ユニット３１およびポンプ３４にそれぞれ制御信号を供給する。モーター２２は制御信号の供給に応じて第１位置および第２位置の間で水平軸線１８回りに第１容器１３を駆動する。ヒーター２４は制御信号の供給に応じて制御信号で特定される温度で第１容器１３に接触する。制御信号は、例えば、バイアル１３ａに装着される温度センサーの出力に基づき生成されることができる。加温ユニット３１は制御信号の供給に応じて制御信号で特定される温度で第２容器２７に接触する。制御信号は、例えば、第２容器２７に組み込まれて培地２６の温度を検出する温度センサーの出力に基づき生成されることができる。制御ユニット３５は例えばマイクロプロセッサーユニット（ＭＰＵ）から構成されることができる。このとき、制御ユニット３５の動作は制御ユニット３５内のメモリーに格納されるソフトウエアに基づき実現されることができる。

【0021】

次に凍結細胞解凍装置１１の動作を説明する。凍結細胞１２は準備される。凍結細胞１２は懸濁液の凝固体に相当する。懸濁液は第１容器１３に収容されて第１容器１３ともども凍結される。懸濁液の調製にあたって凍結処理液に細胞は混入される。凍結処理液は、例えば、５０ｖｏｌ％の培地、３４ｖｏｌ％の細胞凍結保存液および１６ｖｏｌ％のヒト血清アルブミンで形成される。ここでは、凍結処理液は５ｖｏｌ％の濃度でジメチルスルホキシドを含有する。ジメチルスルホキシドは細胞の凍結時に良好に細胞の死滅を防止することができる。凍結細胞１２の保存にあたって凍結細胞１２を収容する第１容器１３は例えば液体窒素で冷却される。

【0022】

凍結細胞１２の第１容器１３は融解ユニット１５にセットされる。第１容器１３は例えばヒーター２４に装着され支持される。キャップ１３ｂの導入ポート１６には導入配管２５が結合される。導入配管２５は第１容器１３に第２容器２７を接続する。キャップ１３ｂの排出ポート１７には排出配管３２が結合される。排出配管３２は第１容器１３に第３容器３３を接続する。制御ユニット３５は傾斜ユニット２１を制御する。ここでは、第１容器１３は水平軸線１８回りに第１位置に位置決めされる。

【0023】

第２容器２７には液体の培地２６が保持される。制御ユニット３５は加温ユニット３１を制御する。加温ユニット３１には制御ユニット３５から制御信号が供給される。加温ユニット３１は第２容器２７内の培地２６を加熱する。培地２６は室温よりも高温に温められることができる。ここでは、加温ユニット３１は例えば３７℃に維持される。

【0024】

制御ユニット３５は顕熱変化ユニット２３を制御する。ヒーター２４には制御ユニット３５から制御信号が供給される。ヒーター２４はバイアル１３ａ内の凍結細胞１２を加熱する。図２に示されるように、凍結細胞１２にはバイアル１３ａから熱エネルギーが伝達される。凍結細胞１２では顕熱変化が実現される。凍結細胞１２の温度は上昇していく。凍結細胞１２は融解温度未満まで温められる。凍結細胞１２の温度は融解温度未満で維持される。

【0025】

制御ユニット３５はポンプ３４を制御する。液体の培地２６は第２容器２７から第１容器１３に流入する。図３に示されるように、第１容器１３内で培地３８は凍結細胞１２の表面に接触する。凍結細胞１２の表面には培地３８から熱エネルギー（融解熱）３９が伝達される。凍結細胞１２は融解する。解凍された懸濁液はすぐさま培地３８に分散することができる。融解した懸濁液は培地３８で希釈化される。細胞４１は培地３８に分散する。培地３８の流れで懸濁液は凍結細胞１２の表面から押しのけられることから、凍結保護剤の濃度は良好な範囲で規制されることができる。こうして細胞４１に対してできる限り凍結保護剤の影響は回避されることができる。解凍の継続時間に関係なく、凍結保護剤に基づく細胞４１の死滅は低減されることができる。細胞４１は良好に解凍されることができる。培地３８の導入に先立って培地３８は室温よりも高温に温められることができる。凍結細胞１２の融解は促進されることができる。

【0026】

ここでは、制御ユニット３５は凍結細胞１２の温度に応じてポンプ３４の動作を制御する。ポンプ３４には制御ユニット３５から制御信号が供給される。制御信号は、培地３８の対流熱伝達で融解する懸濁液の容量に基づきポンプ３４の動作量を特定する。ポンプ３４の動作量は培地３８の流量を決定する。決定された流量に基づき、解凍された細胞４１が培地３８に分散する際に培地３８中でジメチルスルホキシドの濃度は１ｖｏｌ％以下に維持される。解凍された細胞４１は３ｖｏｌ％以下、好ましくは１ｖｏｌ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含む培地３８に接触するので、培地３８との接触時間に関係なく凍結保護剤に基づく細胞４１の死滅は低減されることができる。細胞４１は良好に解凍されることができる。

【0027】

解凍された細胞４１を含有する培地３８は第１容器１３から第３容器３３に流入する。こうして細胞４１は第３容器３３に回収される。細胞４１は例えば遠心分離機の働きで培地３８から分離されることができる。凍結細胞１２の解凍中に制御ユニット３５は傾斜ユニット２１を制御してもよい。制御に応じて第１容器１３は水平軸線１８回りで第２位置に位置決めされることができる。第２位置ではキャップ１３ｂの排出ポート１７は凍結細胞１２よりも下方に位置することから、解凍された細胞４１の排出は促進されることができる。

【0028】

本実施形態では、顕熱変化ユニット２３のヒーター２４は凍結細胞１２の融解温度未満でバイアル１３ａを加熱する。ヒーター２４からの熱伝達に基づく凍結細胞１２の融解は回避されることができる。希釈化から分離された凍結細胞１２の融解は阻止されることができる。こうして細胞４１は高濃度の凍結保護剤から良好に保護されることができる。凍結保護剤に基づく細胞の死滅は低減されることができる。その一方で、凍結細胞１２の温度は融解に先立って顕熱変化でできる限り高温まで加熱されることから、培地３８の熱エネルギー３９は効率的に潜熱変化に利用されることができる。培地３８に基づく凍結細胞１２の解凍は促進されることができる。しかも、凍結細胞１２の温度ができる限り高まれば、凍結細胞１２に培地３８が接触しても培地３８の凍結は回避されることができる。培地３８は効率的に凍結細胞１２を解凍することができる。凍結細胞１２の温度が培地３８の融解温度よりも低温であると、凍結細胞１２に接触する培地３８は凍結してしまう。凍結細胞１２の解凍に支障を来してしまう。

【0029】

凍結細胞１２の解凍にあたって「細胞の解凍に十分な熱量を持つ温度」は次式で表される。ただし、Ｍ_ｉは凍結細胞１２の質量［ｋｇ］、θ_ｉは凍結細胞の初期温度［℃］、Ｃ_ｉは凍結細胞の比熱［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］、Ｌは凍結細胞の潜熱［Ｊ／ｋｇ］、Ｍ_ｗは培地の質量［ｋｇ］、θ_ｗは培地の初期温度［℃］、および、Ｃ_ｗは培地の比熱［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］である。

【0030】

【数1】

【0031】

【数2】

【0032】

［数２］に基づき表１に示す「細胞の解凍に十分な熱量を持つ温度」が算出された。

【0033】

【表1】

【0034】

ここでは、比熱Ｃ_ｉ＝２０４０［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］（氷０［℃］の比熱）、比熱Ｃ_ｗ＝４１８０［Ｊ／（ｋｇ・Ｋ）］（水２０［℃］の比熱）、および、潜熱Ｌ＝３．３３６ｘ１０^５［Ｊ／ｋｇ］に設定された。

【0035】

次に、凍結細胞を収容した容器に培地を供給した状況を想定し、解凍に費やされる時間をシミュレーションしたところ、表２に示す計算結果が得られた。

【0036】

【表2】

【0037】

図４に示されるように、円筒形の容器に凍結細胞および培地は収容された。なお、計算にあたって容器は断熱と仮定された。対流熱伝達は考慮されなかった。熱伝導に基づく温度変化（顕熱変化）および相変化（潜熱変化）のみが考慮された。円柱の半径方向に温度勾配はないものと仮定され一元的に計算は実施された。図５に示されるように、例１では単位時間あたりの融解量は概ね一定に維持されることが算出された。図６に示されるように、時間の経過に拘わらず凍結細胞の表面では温度は概ね一定に維持されることが算出された。

【0038】

（凍結細胞解凍装置１１の作用・効果）
本実施形態の凍結細胞解凍装置１１において、凍結細胞１２には凍結細胞１２に接触する培地から融解熱が伝達される。解凍された懸濁液はすぐさま培地に分散することができる。融解した懸濁液は培地で希釈化されることができる。培地の流れで懸濁液は凍結細胞１２から押しのけられることから、細胞凍結保存液に含有されるジメチルスルホキシドの濃度は良好な範囲で規制されることができる。このようにして、凍結細胞の解凍にあたってできる限り凍結保護剤の影響を回避することができる。解凍の継続時間に関係なく、凍結保護剤に含有されるジメチルスルホキシドに基づく細胞の死滅は低減され、細胞は良好に解凍されることができる。

【0039】

（実施例）
本発明者は虹彩色素上皮細胞の懸濁液を調製した。細胞の濃度は凍結処理液中で１．０～２．０ｘ１０^６［ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］に設定された。凍結処理液は、５０ｖｏｌ％の培地、３４ｖｏｌ％の細胞凍結保存液および１６ｖｏｌ％のヒト血清アルブミンで形成された。凍結処理液は５ｖｏｌ％の濃度でジメチルスルホキシドを含有した。懸濁液は５［ｍＬ］の保存容器に封入された。保存容器はマイナス８０℃のフリーザーで緩慢冷却された。保存容器内で細胞は凍結した。凍結細胞および培地の総量は３０［ｍＬ］に調整された。図７に示されるように、培地はいくつかのパターンで保存容器に導入された。実施例７では２つの保存容器が直接に接続された。本検証では顕熱変化ユニット２３に代えて加温ユニットが用いられた。実験条件及び結果を表３に示す。

【0040】

【表3】

【0041】

表３中、「細胞生存率」では、残存する凍結細胞も含んで生存する細胞の総数が計数され、「細胞収率」では、排出配管３２から排出された培地内に含まれる細胞が計数された。

【符号の説明】

【0042】

１１ 凍結細胞解凍装置
１２ 凍結細胞
１３ 容器（第１容器）
１５ 融解ユニット
２３ 顕熱変化ユニット
２５ 導入配管
２６ （第２容器内の）培地
３１ 加温ユニット
３２ 排出配管
３４ 液流れユニット（ポンプ）
３８ （第１容器内の）培地

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】