(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024017648
(43)【公開日】2024-02-08
(54)【発明の名称】核酸増幅用組成物の保存安定性向上方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20240201BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240201BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z ZNA
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】30
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022120441
(22)【出願日】2022-07-28
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＢＲＩＪ
３．Ｔｒｉｔｏｎ
４．ノニデット
５．Ｅｍｕｌｇｅｎ
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】永友 寛一郎
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】 保存安定性の向上した核酸増幅用組成物を提供すること。
【解決手段】 本発明は、（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及び／又はモノヌクレオチドであるヌクレオチド類、及び（ＩＩＩ）緩衝剤と、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤とを共存させることで、保存安定性が向上したプレミックスタイプの核酸増幅用組成物を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明は、（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及び／又はモノヌクレオチドであるヌクレオチド類、及び（ＩＩＩ）緩衝剤と、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤とを共存させることで、保存安定性が向上したプレミックスタイプの核酸増幅用組成物を提供する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、及び（ＩＩＩ）緩衝剤を含む核酸増幅用組成物に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を共存させることを特徴とする、核酸増幅用組成物の保存安定性を向上させる方法。
【請求項2】
２５℃で１日間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下を抑制する、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項3】
４℃で１ヵ月間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下を抑制する、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項4】
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項5】
界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＥｍｕｌｇｅｎ４２０からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項6】
２価以上の金属イオンとして、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも一種を含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項7】
（ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種とを含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項8】
（ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオン、界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項9】
（ＩＩ）ヌクレオチド類として蛍光標識されたプローブを含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項10】
更に、（Ｖ）抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項11】
（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項12】
（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項13】
更に、（ＶＩＩ）逆転写酵素を含む、請求項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項14】
（ＶＩＩ）逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１３に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項15】
蛍光標識されたプローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項９に記載の保存安定性を向上させる方法。
【請求項16】
（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、（ＩＩＩ）緩衝剤、並びに（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を含む、プレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項17】
２５℃で１日間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下が抑制されている、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項18】
４℃で１ヵ月間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下が抑制されている、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項19】
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項20】
界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＥｍｕｌｇｅｎ４２０からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項21】
２価以上の金属イオンとして、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも一種を含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項22】
（ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種とを含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項23】
（ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオン、界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項24】
（ＩＩ）ヌクレオチド類として蛍光標識されたプローブを含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項25】
更に、（Ｖ）抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項26】
（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項27】
（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項28】
更に、（ＶＩＩ）逆転写酵素を含む、請求項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項29】
（ＶＩＩ）逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項２８に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【請求項30】
蛍光標識されたプローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項２４に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸増幅用組成物の保存安定性向上方法に関する。より具体的には、所定の添加剤を共存させることにより核酸増幅用組成物の保存安定性を向上させる方法、及びこれにより保存安定性が向上した核酸増幅用組成物、並びにこのように保存安定性が向上した核酸増幅用組成物を用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応またはリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により核酸を検出する方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能な数億コピー以上に増幅する技術であり、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において広く用いられている。代表的な核酸増幅法に、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）がある。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、サイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
【0003】
ＲＮＡを分析する手法として、ＰＣＲの前段で、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施するＲＴ－ＰＣＲがある。ＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを連続して実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲの２つに大別される。
【0004】
ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲは、遺伝子検査や病原性微生物検査に広く用いられている。ウイルス検査の例として、病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスが挙げられる。ノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、日本においては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ－ＰＣＲ法が公定法として普及しており、ノロウイルスの数多くの試験が実施されている。
【0005】
病原性微生物検査では、感染拡大を早期に抑止するためにも、多検体を短時間で効率的に検査することが求められている。例えば、ノロウイルスや変異型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をはじめとするＲＮＡウイルスを検出する検査であれば、作業が煩雑で時間を要する検体からのＲＮＡ精製作業を省略し、作業を簡略化する手法が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。
【0006】
市販のＰＣＲ反応試薬は、往々にして複数のパーツに分かれており、試験に使用する際は各パーツを混合し、ＰＣＲ反応液を用事調製する必要がある。高頻度に試験を実施する場合、ＰＣＲ反応液の調製作業の回数を減らすため、複数回の試験分を一括して調製することで、作業負担の軽減が試みられてきた。しかし、調製したＰＣＲ反応液は長期間保存すると感度が低下する問題があった。例えば、蛍光化合物を利用した増幅産物の検出方法では、得られる蛍光強度の低下や消失として確認される。試薬の感度低下は、検査を正しく実施できなくなり偽陰性を生じさせる恐れがある。
【0007】
そこで、作業性に優れながら、ＰＣＲ反応液などの核酸増幅用組成物の保存安定性を高める方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】ＷＯ２０１９／０１７４５２号パンフレット
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】食品微生物学会誌、第３５巻、２０１８年、第１９３－１９８頁
【発明の概要】
【0010】
本発明の目的は、作業性に優れながら、核酸増幅用組成物としての保存安定性の低下が抑制され、長期保存後に使用しても十分な感度でターゲット核酸の有無を検出できる手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、ＰＣＲ反応液等の核酸増幅用組成物に所定の添加剤を共存させることで、当該組成物の保存安定性低下を抑制するとともに、長期保存後に当該組成物をＰＣＲ反応またはＲＴ－ＰＣＲ反応等の核酸増幅反応に供する場合にも、ターゲット核酸（例えば、ウイルスや細菌等の病原性微生物由来のターゲット核酸）を十分な感度で検出することが可能であることを見出した。
【0012】
一般に、ＰＣＲ反応液中には、反応に必要となる酵素、オリゴヌクレオチド等のヌクレオチド類、金属イオン、検出用途の蛍光化合物、緩衝液、添加剤等の様々な成分が含まれており、従来ＰＣＲ反応液は用事調製される。これは、ＰＣＲ反応液を保管すると、反応液中の構成物の劣化や分解、酵素による予期せぬ反応による構成物の消化等の要因により、検出感度の著しい低下を引き起こすと考えられるためである。しかし、全く予想外のことに、核酸増幅用組成物に、界面活性剤、硫酸アンモニウム及び／又は０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを共存させるというシンプルな手法で、核酸増幅用組成物の保存安定性の低下を抑制し、一定期間保存しても検出感度の低下を高度に抑制でき、蛍光化合物等によるターゲット核酸の検出が可能になることを見出した。その結果、例えば、ＰＣＲ反応液を事前に調製して保存することが可能となり、多量の検体を高頻度に試験する際に負担となる反応液の調製作業を大幅に省略することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、及び（ＩＩＩ）緩衝剤を含む核酸増幅用組成物に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を共存させることを特徴とする、核酸増幅用組成物の保存安定性を向上させる方法。
［項２］ ２５℃で１日間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下を抑制する、項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項３］ ４℃で１ヵ月間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下を抑制する、項１又は２に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項４］ 界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１～３のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項５］ 界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＥｍｕｌｇｅｎ４２０からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１～４のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項６］ ２価以上の金属イオンとして、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも一種を含む、項１～５のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項７］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種とを含む、項１～６のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項８］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオン、界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含む、項１～７のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項９］ （ＩＩ）ヌクレオチド類として蛍光標識されたプローブを含む、項１～８のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１０］ 更に、（Ｖ）抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む、項１～９のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１１］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、項１～１０のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１２］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼである、項１～１１のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１３］ 更に、（ＶＩＩ）逆転写酵素を含む、項１～１２のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１４］ （ＶＩＩ）逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１３に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１５］ 蛍光標識されたプローブがＴａｑＭａｎプローブである、項９に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１６］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、（ＩＩＩ）緩衝剤、並びに（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を含む、プレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１７］ ２５℃で１日間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下が抑制されている、項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１８］ ４℃で１ヵ月間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下が抑制されている、項１６又は１７に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１９］ 界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１６～１８のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２０］ 界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＥｍｕｌｇｅｎ４２０からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１６～１９のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２１］ ２価以上の金属イオンとして、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも一種を含む、項１６～２０のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２２］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種とを含む、項１６～２１のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２３］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオン、界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含む、項１６～２２のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２４］ （ＩＩ）ヌクレオチド類として蛍光標識されたプローブを含む、項１６～２３のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２５］ 更に、（Ｖ）抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む、項１６～２４のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２６］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、項１６～２５のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２７］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼである、項１６～２６のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２８］ 更に、（ＶＩＩ）逆転写酵素を含む、項１６～２７のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２９］ （ＶＩＩ）逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２８に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項３０］ 蛍光標識されたプローブがＴａｑＭａｎプローブである、項２４に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、及び（ＩＩＩ）緩衝剤を含む核酸増幅用組成物に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を共存させることを特徴とする、核酸増幅用組成物の保存安定性を向上させる方法。
［項２］ ２５℃で１日間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下を抑制する、項１に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項３］ ４℃で１ヵ月間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下を抑制する、項１又は２に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項４］ 界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１～３のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項５］ 界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＥｍｕｌｇｅｎ４２０からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１～４のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項６］ ２価以上の金属イオンとして、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも一種を含む、項１～５のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項７］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種とを含む、項１～６のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項８］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオン、界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含む、項１～７のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項９］ （ＩＩ）ヌクレオチド類として蛍光標識されたプローブを含む、項１～８のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１０］ 更に、（Ｖ）抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む、項１～９のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１１］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、項１～１０のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１２］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼである、項１～１１のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１３］ 更に、（ＶＩＩ）逆転写酵素を含む、項１～１２のいずれかに記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１４］ （ＶＩＩ）逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１３に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１５］ 蛍光標識されたプローブがＴａｑＭａｎプローブである、項９に記載の保存安定性を向上させる方法。
［項１６］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、（ＩＩＩ）緩衝剤、並びに（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を含む、プレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１７］ ２５℃で１日間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下が抑制されている、項１６に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１８］ ４℃で１ヵ月間保存した場合の核酸増幅反応性能の低下が抑制されている、項１６又は１７に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項１９］ 界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１６～１８のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２０］ 界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＥｍｕｌｇｅｎ４２０からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項１６～１９のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２１］ ２価以上の金属イオンとして、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも一種を含む、項１６～２０のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２２］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１種とを含む、項１６～２１のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２３］ （ＩＶ）添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオン、界面活性剤及び硫酸アンモニウムを含む、項１６～２２のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２４］ （ＩＩ）ヌクレオチド類として蛍光標識されたプローブを含む、項１６～２３のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２５］ 更に、（Ｖ）抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む、項１６～２４のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２６］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、項１６～２５のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２７］ （Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼである、項１６～２６のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２８］ 更に、（ＶＩＩ）逆転写酵素を含む、項１６～２７のいずれかに記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項２９］ （ＶＩＩ）逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも一種である、項２８に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
［項３０］ 蛍光標識されたプローブがＴａｑＭａｎプローブである、項２４に記載のプレミックスタイプの核酸増幅用組成物。
【発明の効果】
【0014】
本発明によって、ＰＣＲ反応液（ＲＴ－ＰＣＲ反応液を含む）等の核酸増幅用組成物の保存安定性の低下が抑制され、検出感度が維持されるため、反応液の長期保存が可能となり、反応液の用事調製が不要となる。ＰＣＲ反応液の保存安定性の向上は、検出感度低下に伴う偽陰性の発生や試験の不成立を防ぎ、正確な試験が実施可能となるとともに、再試験等の作業を削減することができる。また、多検体を取り扱う場合に高頻度で発生する核酸増幅用組成物の調製作業が省略されることで、遺伝子検査および病原性微生物検査業務がさらに効率化する。病原性微生物検査業務の効率化は、感染していても症状が顕れない被験者の検査量を増やすことができ、感染症の拡大予防にも寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２価以上の金属イオンを種々の濃度で共存させた場合の２５℃での保存安定性を評価した増幅曲線を示す図である。
【図2】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２価以上の金属イオンを種々の濃度で共存させた場合の２５℃での保存安定性を評価した残存相対蛍光強度を示す図である。
【図3】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で界面活性剤又は硫酸アンモニウムを添加した場合の２５℃での保存安定性を評価した増幅曲線を示す図である。
【図4】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で界面活性剤又は硫酸アンモニウムを添加した場合の２５℃での保存安定性を評価した残存相対蛍光強度を示す図である。
【図5】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２．２ｍＭのマンガンイオンと共に界面活性剤を添加した場合の２５℃での保存安定性を評価した増幅曲線を示す図である。
【図6】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２．２ｍＭのマンガンイオンと共に界面活性剤を添加した場合の２５℃での保存安定性を評価した残存相対蛍光強度を示す図である。
【図7】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２価以上の金属イオン濃度を変更した場合の凍結及び４℃での保存安定性を評価した増幅曲線を示す図である。
【図8】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２価以上の金属イオン濃度を変更した場合の凍結及び４℃での保存安定性を評価した残存相対蛍光強度を示す図である。
【図9】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２．２ｍＭのマンガンイオンと共に界面活性剤及び硫酸アンモニウムを添加した場合の凍結及び４℃での保存安定性を評価した増幅曲線を示す図である。
【図10】１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液で２．２ｍＭのマンガンイオンと共に界面活性剤及び硫酸アンモニウムを添加した場合の凍結及び４℃での保存安定性を評価した残存相対蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。また本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
【0017】
本発明の一態様は、例えば、（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及び／又はモノヌクレオチドなどのヌクレオチド類、（ＩＩＩ）緩衝剤を含む核酸増幅用組成物に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を共存させることを特徴とした、核酸増幅用組成物の保存安定性を改善させる方法である。
本発明は、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び／又は０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを添加することで、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の成分を含む核酸増幅用組成物の保存安定性の低下を抑えることができ、一定期間保管であっても十分な感度で、試料中の病原性微生物（ウイルス、細菌、真菌等を含む）の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を蛍光化合物により検出できることを見出したことに基づく。
本発明は、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び／又は０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを添加することで、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の成分を含む核酸増幅用組成物の保存安定性の低下を抑えることができ、一定期間保管であっても十分な感度で、試料中の病原性微生物（ウイルス、細菌、真菌等を含む）の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を蛍光化合物により検出できることを見出したことに基づく。
【0018】
本発明の核酸増幅用組成物は、（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼを含有するものであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであっても、ＤＮＡ及びＲＮＡのどちらも鋳型にできるＤＮＡポリメラーゼ（即ち、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）であってもよい。また、ＤＮＡポリメラーゼは、任意のファミリーに属するＤＮＡポリメラーゼであり得るが、本発明の効果がより確実に得られ易いという観点から、ＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。本発明には、当該分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼを、核酸増幅の目的などに応じて適宜選択して使用できる。
【0019】
好ましい実施形態において、本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、例えば、夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼである。夾雑物耐性とは、例えば、ＰＣＲ阻害物質の存在下においても、核酸増幅反応に十分なＤＮＡポリメラーゼの高い酵素活性を有する性質である。夾雑物耐性を持つＤＮＡポリメラーゼとして、特に限定されるものではないが、例えば、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ、ＨａｗｋＺ０５やこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、Ｔｔｈ（配列番号２４）およびＨａｗｋＺ０５（配列番号２５）又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。通常夾雑耐性を有しないＴａｑなどのＤＮＡポリメラーゼにおいても、アミノ酸変異により夾雑耐性を有する変異体である場合は使用することが可能である。本発明の核酸増幅用組成物における前記夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの総量は、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。前記夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、ＰＣＲ反応開始までのＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制し、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
【0020】
本発明の核酸増幅用組成物により、逆転写反応のステップを含む核酸増幅を行うことを目的とする場合、本発明の核酸増幅用組成物は、ＤＮＡポリメラーゼおよび必要に応じて逆転写酵素を含むことが好ましい。本発明に用いられ得る逆転写酵素（ＲＴ）の由来は、ＲＮＡをＤＮＡに変換できる活性を有する酵素であれば特に限定されないが、例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、ＥＩＡＶ－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、トリ骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）またはそれらの変異体が挙げられる。
【0021】
逆転写酵素は、逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼであってもよい。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、夾雑物耐性及び／又は耐熱性を有することが好ましい。耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，Ｂｃａ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなども使用できる。特に好ましくは、Ｔｔｈ（配列番号２４）、Ｚ０５（配列番号２５）及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【0022】
本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素の変異体とは、その由来である野生型のＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、それらの対応する野生型酵素の活性（ＤＮＡポリメラーゼ活性又は逆転写酵素活性）が実質的に損なわれていないものをいう。逆転写活性も兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである場合、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性が実質的に損なわれていないものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、それらの対応する野生型酵素の活性（ＤＮＡポリメラーゼ活性又は逆転写酵素活性）が実質的に損なわれていないものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。
【0023】
本発明の核酸増幅用組成物は、（ＩＩ）ヌクレオチド類を含有するものであり得る。ヌクレオチド類は、モノヌクレオチドであってもよいし、オリゴヌクレオチドであってもよい。モノヌクレオチドとしては、ヌクレオチド（ヌクレオチド一リン酸、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレオチド三リン酸等を含む）、デオキシヌクレオチド（デオキシヌクレオチド一リン酸、デオキシヌクレオチド二リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸等を含む）、ヌクレオシド、デオキシヌクレオシド等のモノヌクレオチドを挙げることができる。オリゴヌクレオチドは、任意の長さのポリヌクレオチドであってよく、一般的には、２～４０塩基長程度、好ましくは２～２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の核酸増幅用組成物に含まれ得るヌクレオチド類は、例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ（蛍光標識されたプローブを含む）等であり得るが、これらに限定されない。
【0024】
一つの実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物は、ヌクレオチド類として、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を含むものであり得る。本発明で使用されるｄＮＴＰｓとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰをそれぞれ０．１～０．５ｍＭ程度、一般的には０．２ｍＭ程度含む混合物であり得る。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を利用したクロスコンタミネーションに対する予防処置をとることも可能である。
【0025】
本発明の核酸増幅用組成物は、ヌクレオチド類として、ターゲット核酸の所定領域を増幅するように設計された核酸プライマーを含むものであり得る。本発明の核酸増幅用組成物が、ＰＣＲ反応に用いられるものである場合、プライマーはプライマー対として使用され得る。本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。特に限定されないが、本発明では上記プライマーが２対以上含まれるものであってもよい。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。
【0026】
一つの実施形態において、例えば、本発明の核酸増幅用組成物でノロウイルスを検出する場合、ノロウイルス検出用のプライマー対の例として、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー記載のプライマー（配列番号１～５）が挙げられるが、これに限るものではない。前記プライマーでは、配列番号１、２によりノロウイルスＧ１型、配列番号３～５によりノロウイルスＧ２型を検出する。検出対象のプライマー濃度としては、特に限定はされないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．５μＭ以上２μＭ以下である。
【0027】
別の実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物で新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を検出する場合、プライマー対の例としては、国立感染症研究所が発表している「病原体検出マニュアル２０１９－ｎＣｏＶ」に記載の配列（配列番号９、１０、１２、１３）、アメリカ疾病予防管理センターが発表する「２０１９－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｐａｎｅｌ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ」（配列番号１５、１６、１８、１９、２１、２２）が挙げられ、本発明においても好適に使用することができるが、これに限るものではない。前記プライマー配列では、配列番号９および１０、１２および１３、１５および１６、１８および１９、２１および２２によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）領域を検出する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をはじめとするコロナウイルスの検出においては、ヌクレオキャプシド（Ｎ）領域、エンベロープタンパク質（Ｅ）領域、スパイクタンパク質（Ｓ）領域、ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲｄＲｐ）領域、Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）領域等の遺伝子を検出の対象とすることができるが、特にこれに限るものではない。使用するプライマーの濃度としては、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．５μＭ以上２μＭ以下である。
【0028】
本発明の核酸増幅用組成物は、ヌクレオチド類として、ターゲット核酸の増幅を検出するように設計された核酸プローブ（例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドからなるプローブ）を含むものであり得る。本発明の核酸増幅用組成物が、リアルタイムＰＣＲ反応又はリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられる場合、例えば、蛍光化合物で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、電気泳度等によらず、蛍光シグナルのモニタリングでターゲット核酸の増幅について監視でき、また、核酸増幅の検出のために反応容器を開放する必要がないため、コンタミネーションのリスクも低減できる。また、例えば、検出するウイルスおよび微生物の種類や、サブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、各標的の核酸を別々に識別することも可能である。
【0029】
上記のような蛍光標識されたプローブを含む核酸増幅用組成物を、核酸増幅反応に必要な他の成分（例えば、酵素、金属イオン、緩衝液、添加剤等の様々な成分）と共存させた状態で長期保存すると、核酸プローブ又は蛍光化合物などの劣化や分解等に恐らく起因して、経時的に蛍光強度が低下し、検出感度が落ちやすい傾向があることが分かっている。本発明では全く予想外のことに、２価以上の金属イオンを共存させる場合であっても共存させる量を所定範囲に調整することにより、そして更に必要に応じて界面活性剤及び／又は硫酸アンモニウムも共存させることにより、経時的な蛍光強度の低下を十分抑えることができることを見出している。従って、本発明によれば、このような蛍光標識したプローブを含む核酸増幅用組成物を一定期間保管した後であっても、保存安定性が改善されるので、蛍光強度の低下を抑制することができるので好ましい。
【0030】
一つの実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物をノロウイルス検出のために使用する場合、ノロウイルス検出用のハイブリダイゼーションプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列（配列番号６～８）が挙げられるが、これに限るものではない。前記プローブ配列では、配列番号６または７によりノロウイルスＧ１型、配列番号８によりノロウイルスＧ２型を検出する。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。蛍光標識プローブの濃度としては、０．０１μＭ以上１．０μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．０１３μＭ以上０．７５μＭ以下であり、更に好ましくは、０．０２μＭ以上０．５μＭ以下である。
【0031】
別の実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物で新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を検出する場合、その検出用のハイブリダイゼーションプローブの塩基配列としては、国立感染症研究所が発表している「病原体検出マニュアル２０１９－ｎＣｏＶ 」に記載の配列（配列番号１１および１４）および、アメリカ疾病予防管理センターが発表する「２０１９－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｐａｎｅｌ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ」（配列番号１７および２０および２３）が挙げられ、本発明においても好適に使用することができるが、これに限るものではない。前記プローブ配列ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ領域を検出する。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をはじめとするコロナウイルスの検出においては、Ｎ領域、Ｅ領域、Ｓ領域、ＲｄＲｐ領域、ＯＲＦ領域等の遺伝子を検出の対象とすることができるが、特にこれに限るものではない。蛍光標識プローブの濃度としては、０．０１μＭ以上１．０μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．０１３μＭ以上０．７５μＭ以下であり、更に好ましくは、０．０２μＭ以上０．５μＭ以下である。
【0032】
本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブは蛍光標識されたプローブであることが好ましい。このような蛍光標識プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
ハイブリダイゼーションプローブに用いられ得る蛍光化合物は、当該分野で公知の任意のものを使用することができ、例えば、使用したいｑＰＣＲ機器に合わせて選択することができる。蛍光化合物の具体例としては、例えば、ローダミン（ＲＯＸ）若しくはその誘導体（例えば、５－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、又はそれらの塩などのローダミン系化合物；フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５’－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト））、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、若しくはそれらの誘導体、又はそれらの塩等の非ローダミン系化合物等があげられるが、これらに限定されない。蛍光化合物は、必要に応じて、使用する蛍光物質にあった消光物質を使用することができる。上記のような蛍光物質に対応した消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル－ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0034】
なお、本発明の核酸増幅用組成物は、上記のようなハイブリダイゼーションプローブに代えて又はハイブリダイゼーションプローブと共に、２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を使用してターゲット核酸の有無を検出するものであってもよい。２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。このような蛍光化合物を使用する場合であっても、蛍光シグナルのモニタリングでターゲット核酸の有無を検出することができ、解析労力を低減することができる。
【0035】
本発明の核酸増幅用組成物は、（ＩＩＩ）緩衝剤を含むものであり得る。本発明で使用され得る緩衝剤としては、当該分野で公知の任意の緩衝剤を使用することができ、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、グリシン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ハンクス緩衝剤、グッド緩衝剤（例えば、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝剤、ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝剤、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＴＡＰＳＯ緩衝剤、ＰＯＰＳＯ緩衝剤、ＨＥＰＳＯ緩衝剤、ＥＰＰＳ緩衝剤）などが挙げられ、好ましくは、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。緩衝剤は、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものであり得る。また、本発明の核酸増幅用組成物における緩衝剤の濃度としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、１０～２００ｍＭ程度、より好ましくは２０～１５０ｍＭ程度であり得る。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられることが好ましい。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられるが、限定されない。
【0036】
本発明では、前記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の成分を少なくとも含む核酸増幅用組成物に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を共存させることを一つの特徴とする。この（ＩＶ）成分を共存させることにより、核酸増幅用組成物を一定期間保存した場合であっても、核酸増幅反応性能の大幅な低下を抑制でき、十分な感度で核酸増幅反応を行うことができる。
【0037】
前記（ＩＶ）成分の添加剤としては、界面活性剤、硫酸アンモニウム、又は０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンのなかから１つを選択して使用してもよいし、２つ以上を任意に組み合わせて使用してもよい。より高度に保存安定性の低下を抑制できるという観点から、（ＩＶ）成分として、少なくとも０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを含むことが好ましい。特定の実施形態では、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１つとを組み合わせて使用することが好ましく、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤と、硫酸アンモニウムとの３つを全て組み合わせて使用することが特に好ましい。このように（ＩＶ）成分を複数組み合わせて使用することにより、より一層高度に長期保存後の残存相対蛍光強度低下を抑えることが可能となり得る。
【0038】
本発明に用いられ得る界面活性剤としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、当該分野で公知の任意の界面活性剤を使用することができる。より確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、界面活性剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤又は両性イオン性界面活性剤であり、より好ましくは非イオン性界面活性剤又はアニオン性界面活性剤であり、特に好ましくは非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤としては、好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル）等のポリオキシエチレン鎖を有するポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において界面活性剤は、１種だけ使用してもよいし、２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
【0039】
具体的には、本発明に用いられ得る界面活性剤として、例えば、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、エマルゲン４２０（Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０）等のポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のアニオン性界面活性剤；ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ等の両性イオン性界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。また界面活性剤は、任意のＨＬＢ値を有する界面活性剤であり得るが、好ましくは、ＨＬＢ値が１０～１９程度の界面活性剤であることが好ましく、ＨＬＢ値が１２～１７程度の界面活性剤であることがより好ましく、例えばＨＬＢ値が１２～１５程度の界面活性剤であってもよい。
【0040】
本発明において（ＩＶ）成分の添加剤として界面活性剤を使用する場合、前記核酸増幅用組成物において共存させる界面活性剤の濃度は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、好ましくは０．０１％以上、より好ましくは０．０２％以上、更に好ましくは０．０３％以上、更により好ましくは０．０４％以上であり得、例えば、０．０５％以上であってもよい。上限は特に限定されないが、一例として、１％以下とすることができる。このような濃度で界面活性剤を共存させることにより、より一層高度に保存安定性の低下を抑制することが可能となり得る。
【0041】
本発明では（ＩＶ）成分の添加剤として、前記界面活性剤に替えて又は前記界面活性剤と共に、硫酸アンモニウムを使用することもできる。より高い保存安定性が得られ易いという観点から、硫酸アンモニウムは、比較的低濃度の２価以上の金属イオン（例えば、２．２ｍＭ以下の２価以上の金属イオン、なかでも２．２ｍＭ以下のマンガンイオン）と組み合わせて用いられることが好ましく、前記のような比較的低濃度の２価以上の金属イオン及び界面活性剤と組み合わせて用いられることが特に好ましい。
【0042】
本発明において（ＩＶ）成分として硫酸アンモニウムを使用する場合、前記核酸増幅用組成物において共存させる硫酸アンモニウムの濃度は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、更により好ましくは７ｍＭ以上であり得る。上限は特に限定されないが、一例として、２０ｍＭ以下とすることができ、１５ｍＭ以下としてもよい。このような濃度で硫酸アンモニウムを共存させることにより、より一層高度に保存安定性の低下を抑制することが可能となり得る。
【0043】
本発明では、（ＩＶ）成分の添加剤として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを使用することもできる。（ＩＶ）成分としてこのような比較的低濃度の２価以上の金属イオンを使用する場合、前記界面活性剤及び／又は硫酸アンモニウムを組み合わせることは必須ではなく、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを単独で使用してもよい。しかし、一つの好ましい実施形態では、（ＩＶ）成分として、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと共に、前記界面活性剤及び／又は硫酸アンモニウムを使用するのがよく、このように添加剤を組み合わせて使用することでより一層高度に保存安定性の低下を抑制できることが確認されている。
【0044】
本発明に用いられ得る２価以上の金属イオンは、当該分野で公知の任意の金属イオンであり得、例えば、２価、３価、４価の金属イオンであり得る。好ましくは、本発明に用いられる２価以上の金属イオンは、２価以上の陽イオンであり、２価又は３価の陽イオンであることがより好ましく、２価の陽イオンであることが特に好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、核酸増幅反応において、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出も可能となり易いという利点がある。
【0045】
本発明に使用できる２価の陽イオンは、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、核酸増幅用組成物にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。
【0046】
本発明において（ＩＶ）成分として２価以上の金属イオンを使用する場合、前記核酸増幅用組成物において共存させる当該２価以上の金属イオンの濃度は０．１～２．２ｍＭである限り特に限定されないが、好ましくは０．５～２．２ｍＭ、より好ましくは１～２．２ｍＭ、更に好ましくは１．５～２．２ｍＭであり得る。例えば、２価以上の金属イオンの濃度は１．８～２．２ｍＭ程度であってもよい。このような濃度で２価以上の金属イオンを共存させることにより、より一層高度に保存安定性の低下を抑制することが可能となり得る。
【0047】
特定の実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物が、一酵素系ＲＴ－ＰＣＲ反応用の核酸増幅用組成物である場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１～２．２ｍＭのマンガン又はその塩を共存させるように濃度調整されていることが好ましく、１．５～２．２ｍＭのマンガン又はその塩を共存させるように濃度調整されていることが好ましい。また、逆転写酵素を含まない二酵素系ＲＴ－ＰＣＲ反応用または逆転写反応を伴わないＰＣＲ反応用の核酸増幅用組成物である場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マグネシウム又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＰＣＲ反応液において１～２．２ｍＭのマグネシウム又はその塩を含むように濃度調整されていることが好ましく、１．５～２．２ｍＭのマグネシウム又はその塩を含むように濃度調整されていることが好ましい。
【0048】
本発明の核酸増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含むものであってもよい。抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含むことによって、例えば、ＰＣＲ反応などの核酸増幅反応において高温下に曝すまでＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制することができるので、意図しない非特異的な核酸増幅を抑制するホットスタートＰＣＲ法を行うことができる。抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体は、当該分野で公知の任意のものを使用することができ、核酸増幅反応用組成物に含まれるＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて適宜選択して使用すればよい。本発明の核酸増幅用組成物における抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の濃度としては、特に限定されないが、例えば、０．００１～０．１μｇ／μＬ程度、好ましくは０．００５～０．０５μｇ／μＬ程度であり得る。
【0049】
本発明の核酸増幅用組成物は、上記のような成分に加えて、さらに他の添加剤を含むものであってもよい。例えば、本発明の核酸増幅用組成物がＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲ反応用試薬である場合、好ましい他の添加剤の例としては、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、ポリペプチド（ウシ血清アルブミン、セリシン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、ゼラチン）、グリセロール、グリコール及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つ等であり得る。
【0050】
本発明に用いられ得るポリペプチドは、例えば、分子量が５～５００ｋＤａ程度のポリペプチドが好ましく、６～４００ｋＤａ程度のポリメラーゼがより好ましい。本明細書において、分子量を示すときは、他の意味であることが明らかでない限り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて決定した値をいう。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分子量の測定は、当該分野で一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカー等を用いて行うことができる。例えば、「分子量５０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常５０ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲にあることをいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、上記分子量の範囲内のポリペプチドの混合物であってもよい。
【0051】
本発明に用いられ得る前記ポリペプチドは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なって形成されたタンパク質をいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、アミノ酸が連結されたポリペプチド構造を有する限り、例えば、熱変性等により三次元構造が解かれたような熱変性ポリペプチド（例えば、ゼラチン）等であってもよい。具体的には、本発明に使用され得るポリペプチドとして、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、卵由来アルブミン）、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン）、セリシン、カゼイン、フィブロイン等の天然由来タンパク質（天然由来ポリペプチド）；Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、コラーゲン加水分解物、ポリペプトン、酵母エキス、ビーフエキストラクト等の合成・分解等により人為的に製造されたポリペプチド等を用いることができる。より好ましくは、本発明に用いられ得るポリペプチドは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び／又はセリシンである。核酸増幅反応において少量でも有益であるという観点から、より好ましくは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン（なかでも魚ゼラチン）を用いるのが好適である。これらのポリペプチドは、１種類だけ使用してもよいし、２種類以上を組合わせて使用してもよい。また、これらのポリペプチドは、天然からの抽出や合成等の手段により調製してもよく、また市販品も好適に使用することができる。
【0052】
本発明において、前記のようなポリペプチドを使用する場合、その使用量は特に限定されないが、例えば、本発明の核酸増幅用組成物が一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液として用いられるときには、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の終濃度が０．０００１～２００ｍｇ／ｍＬとなるような量、好ましくは０．０１～１５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～１３０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５～１００ｍｇ／ｍＬとなるように調整された量であり得る。また、このようなポリペプチドの使用量は、使用するポリペプチドの種類、所望される効果の種類や程度等によって変動し得るが、例えば、ＰＣＲ反応又はＲＴ－ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅用組成物の場合、以下のような使用量を例示することができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ＢＰＦを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ＢＰＦを用いる場合：ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【0053】
本発明に用いられ得るベタイン様４級アンモニウムとしては、ベタイン（トリメチルグリシン）、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム濃度は、０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。
【0054】
さらには、当該技術分野でＰＣＲ反応又はＲＴ－ＰＣＲ反応を促進することが知られる物質と組み合わせることもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。
【0055】
本発明の核酸増幅用組成物は、任意の態様で提供され得る。一つの好ましい例として、本発明の核酸増幅用組成物は、プレミックスタイプの核酸増幅用試薬として提供することができる。プレミックスタイプの核酸増幅用試薬とは、核酸増幅反応に必要な成分が実質的にほぼ全て予め配合されており、通常は鋳型となる試料（例えば、検査試料又はインターナルコントロール等の合成核酸）と混合するだけで、核酸増幅反応を実施することが可能な状態にある核酸増幅用試薬のことをいう。プレミックスタイプの核酸増幅用試薬は、従来のように核酸増幅用組成物が各パーツに分かれて提供されていないので、使用時に用事調製するという手間が不要となるので好ましい。プレミックスタイプの核酸増幅用組成物は通常、所定温度で一定期間にわたり長期保管される。本発明によれば、核酸増幅用組成物の保存安定性が向上し、所定温度で一定期間にわたり長期保管された場合でも核酸増幅性能の低下が抑制されるので、このようなプレミックスタイプの核酸増幅用試薬として好適である。
【0056】
上記のような本発明の核酸増幅用組成物は、１以上のターゲット核酸を増幅できる任意の核酸増幅反応において使用することができる。本発明において「ターゲット核酸」とは、核酸増幅により検出することを目的とした核酸領域であり得る。例えば、病原性微生物に由来する核酸の有無を検査する場合は、その病原性微生物のゲノム核酸における増幅を意図する領域であり得る。また、ＰＣＲ反応液がインターナルコントロール等を含む場合は、ターゲット核酸はインターナルコントロール核酸における増幅を意図する領域であってもよい。本発明の方法では、対象となるターゲットの数に特に制限はないが、２箇所以上とすることができ、例えば３個所、４個所、５個所以上とすることもできる。ターゲット数の上限は特に制限されないが、例えば、１０箇所以下とすることができる。
【0057】
一つの好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物を用いてターゲット核酸の有無を検査する方法は、少なくとも以下の工程を含むＰＣＲ反応であり得る。
（１）核酸を含む試料と、本発明の核酸増幅用組成物とを混合する工程；
（２）反応容器を密閉後、ＰＣＲ反応を実施する工程；及び
（３）蛍光化合物により、ターゲット核酸の検出を行う工程
ここで、前記工程（１）では、ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲ反応の前に逆転写反応も行うＲＴ－ＰＣＲ反応液であってもよい。また、前記工程（２）では、ＰＣＲ反応の前に逆転写反応を伴うＲＴ－ＰＣＲ反応であってよい。前記工程（２）でＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの両者を含む２酵素反応系であっても、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１酵素反応系であってもよい。前記工程（１）～（３）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）～（３）のいずれの工程の間においても、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）において、好ましくは工程（２）及び（３）の両方の工程においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。また、前記工程（１）で使用する核酸を含む試料は、夾雑物質および不溶性物質を含みうる試料であってもよく、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液や、糞便試料等の固形試料をＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。
（１）核酸を含む試料と、本発明の核酸増幅用組成物とを混合する工程；
（２）反応容器を密閉後、ＰＣＲ反応を実施する工程；及び
（３）蛍光化合物により、ターゲット核酸の検出を行う工程
ここで、前記工程（１）では、ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲ反応の前に逆転写反応も行うＲＴ－ＰＣＲ反応液であってもよい。また、前記工程（２）では、ＰＣＲ反応の前に逆転写反応を伴うＲＴ－ＰＣＲ反応であってよい。前記工程（２）でＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの両者を含む２酵素反応系であっても、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１酵素反応系であってもよい。前記工程（１）～（３）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）～（３）のいずれの工程の間においても、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）において、好ましくは工程（２）及び（３）の両方の工程においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。また、前記工程（１）で使用する核酸を含む試料は、夾雑物質および不溶性物質を含みうる試料であってもよく、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液や、糞便試料等の固形試料をＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。
【0058】
本発明の核酸増幅用組成物を用いる検査方法における検査対象は、例えば、病原性微生物由来の核酸であり得るが、特に限定されない。ここで、病原性微生物とは、ヒトを始めとする哺乳動物等の生体に感染して感染症を引き起こし得る任意の微生物をいい、細菌又は真菌等の原核生物や真核生物に限定されず、ウイルス等をも含む概念である。
【0059】
病原性微生物としては、大腸菌（例えば、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ））；カンピロバクター属菌、ウエルシュ属菌、サルモネラ属菌、リステリア属菌、ボツリヌス属菌、セレウス属菌、シュードモナス属菌（多剤耐性緑膿菌）、クロストリジウム属菌、レジオネラ属菌、ストレプトコッカス属菌、黄色ブドウ球菌（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、アシネトバクター属菌（例えば、薬剤耐性アシネトバクター）、腸炎ビブリオ、赤痢菌、ジフテリア菌、コレラ菌、百日咳菌、結核菌、らい菌、炭疽菌、ペスト菌、リケッチア、クラミジア、コクシエラ、トキソプラズマなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。特に、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌などの食中毒の原因となる病原菌の検出は、腸内細菌検査として多量のサンプル数を扱う検査として行われる場合があり、作業性に優れて簡便な本発明の検査方法が特に有用である。
【0060】
特定の実施形態では、病原性微生物はウイルスであってもよい。本発明の対象となるウイルスとしては、ＤＮＡウイルスであって良く、ＲＮＡウイルスであっても良い。ＤＮＡウイルスとしては、ヘルペスウイルス科ウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス）；アデノウイルス科ウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）；ヘパドナウイルス科ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；パポバウイルス科ウイルス（例えば、乳頭種ウイルス、ポリオーマウイルス）；パルボウイルス科ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、ヒトパルボウイルス）；アスファウイルス科ウイルス（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【0061】
ＲＮＡウイルスとしては、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たないＲＮＡウイルスであっても、エンベロープを持つＲＮＡウイルスであっても良い。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科ウイルス（例えば、アストロウイルス）；カリシウイルス科ウイルス（例えば、サポウイルス、ノロウイルス）；ピコルナウイルス科ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；へぺウイルス科ウイルス（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；レオウイルス科ウイルス（例えば、ロタウイルス）などが挙げられ、限定されるものではないが、好ましくはカリシウイルス科ウイルス及びレオウイルス科ウイルスの検出に有用であり、より好ましくはノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、特にノロウイルスの検出に有用である。
【0062】
ノロウイルスは、ウイルスＲＮＡゲノムが約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体の内部に封入された、キャプシド構造を有する。通常の界面活性剤や７０％エタノールに代表されるウイルス不活化剤では、キャプシド構造を破壊できず、ウイルスの感染能が維持される。キャプシド構造を破壊するには、少なくとも８５℃以上、１分以上の過酷な条件での熱処理が必要とされている。一方、市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡの抽出・精製を行うと時間や労力を要する。
【0063】
ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、月に１回以上又は必要に応じノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。それゆえに、健常人も含めた定期的な検査を行う意義は大きく、多検体の検査を実施することが求められている。このように多検体を扱う場合でも簡便に且つ作業性良く検査でき検査担当者の負担を低減できるという観点から、本発明はノロウイルスの検査に利用されることが特に好ましい。
【0064】
エンベロープＲＮＡウイルスとしては、フラビウイルス科ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ジカウイルス、豚熱ウイルス）；トガウイルス科ウイルス（例えば、風疹ウイルス、チクングニアウイルス）；コロナウイルス科ウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス）；オルトミクソウイルス科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）；ラブドウイルス科ウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）；ブニヤウイルス科ウイルス（例えば、クリミヤ・コンゴ熱ウイルス、ハンタウイルス）；パラミクソウイルス科ウイルス（例えば、麻疹ウイルス、ヒトＲＳウイルス）；フィロウイルス科ウイルス（例えば、エボラウイルス）、などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、特にコロナウイルスの検出に有用である。
【0065】
コロナウイルスは、風邪を含む呼吸器感染症引き起こす原因ウイルスであり、風邪の流行期において約１０～３５％程度はコロナウイルスが原因と言われている。変異型ウイルスが発生することも知られており、稀にＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスやＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルス、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）など致死性の重篤な呼吸器疾患を齎すものが発生することが知られている。コロナウイルスを簡便、迅速、高感度に検出することは、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等で重要である。
【0066】
２０１９年に中国湖北省武漢市にて発生が確認された変異型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２においては、ウイルスゲノムＲＮＡの解析が完了次第、核酸増幅技術を用いた検査方法が樹立された。日本においても、国立感染症研究所の「病原体検出マニュアル２０１９－ｎＣｏＶ」にてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出するための方法が記載されている。現在、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む咽頭・鼻腔ぬぐい液や唾液、喀痰、糞便試料などの生体試料やふき取り環境試料から、ＲＮＡの抽出および精製工程なく、１ステップＲＴ－ＰＣＲによって迅速に検出できる方法の開発されている。本発明は、ＰＣＲ反応液の保存安定性を向上させることで、作業性・操作性においても改善された優れた方法であり、高感度にターゲット核酸を検出できるため、このようなコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検査において特に有益である。
【0067】
本発明において用いられる試料として、例えば咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液、うがい液、涙液、などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能である。特には、糞便、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰、肺吸引物、脳脊髄液、うがい液、唾液、涙液、培養細胞、培養上清からの検出に有用であり、なかでも糞便試料、唾液試料、喀痰試料、うがい液、涙液、咽頭ぬぐい液試料、鼻腔ぬぐい液試料の検出に有用である。本発明においては、これら試料を市販のＲＮＡ精製キット等を用いてＲＮＡを単離したものを試料として供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。また、前記試料は直接検出に供してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。また、粘性の強い生体試料（例えば、粘性の強い喀痰を含む試料）の場合は、特に限定されないが、スプタザイム酵素液で処理した試料であってもよい。
【0068】
前記工程（１）において、夾雑物質および不溶性物質を含みうる試料、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液や、糞便試料等の固形試料を使用する場合、病原性微生物の持つキャプシドや細胞壁などの堅牢な構造からＲＮＡまたはＤＮＡを抽出しやすくするために、前記試料を緩衝液や、酸またはアルカリ性溶液、有機溶媒などを含む溶液と混合した試料であって良い。前記溶液に含まれるものとして、酸性溶液としては、酸性の溶液であれば特に限定されない。酸性溶液としては、例えば、ギ酸水溶液、酢酸水溶液、酪酸水溶液、塩酸水溶液、硝酸水溶液、硫酸水溶液、クエン酸水溶液、乳酸水溶液、リン酸水溶液、安息香酸水溶液、シュウ酸水溶液、酒石酸水溶液、アスコルビン酸水溶液、スルホン酸水溶液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。アルカリ性溶液においても、アルカリ性の溶液であれば特に限定されない。アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液（ＴＡＰＳＯ，ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ）などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。有機溶媒として、具体的にはエタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ピリジン等が挙げられるがこれに限られるものではない。さらには、前記工程（１）において添加する試料は、前記溶液と混合後熱処理に供されたものであっても良い。熱処理の条件は、特に限定されないが、６０℃以上、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上、更により好ましくは９０℃以上で、１秒以上処理されたものであってよい。
【0069】
本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。これらの検査試料は、検査場所の汚れやほこりを多量含むことから、夾雑物や不溶性物質を含みうる試料において夾雑耐性を強化した本手法は、これらの検査に対して有益である。
【0070】
特定の実施形態において、本発明の方法は、核酸の単離処理を行っていない試料を使用してもよい。例えば、本発明は、各種試料から市販の核酸精製キットで核酸を単離したり、あるいはゲノム核酸を病原性微生物の構造（例えば、細胞膜、キャプシド構造）から露出させるための事前の熱処理等をしたりしていない、未処理試料を用いることができる。手間のかかる前処理が不要となるため簡便であるという観点から、これらの未処理試料を用いることが好ましい。また、夾雑物質を除去するような分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料であってもよい。ここで、分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料とは、試料中で核酸を露出させた状態にすることを意味し、例えば、試料中で細胞膜やカプシド、エンベロープ等を破壊し、これらに内包されていた核酸を抽出して露出させること（但し、破壊後に残存する細胞膜やカプシド、エンベロープの断片等は除去しないこと）をいう。本発明では、このような単離精製の手間を省いて用意した試料であっても良好に核酸増幅でき、安定して検査結果を得ることが可能となる。このような分離精製を伴わない核酸抽出処理は、前記工程（１）に先立って行うことができる。
【0071】
前記工程（１）においてＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲに供される試料に含みうる夾雑物質や不溶性物質は、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液、喀痰、うがい液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、涙液、血液、拭き取り検査試料に由来するものが挙げられるが、限定されるものではなく、生体に由来するものや、環境検査試料全般に用いることが可能であり、特に糞便（排泄便、直腸便）、唾液、喀痰、うがい液、涙液、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液からの検出に有用である。
【0072】
前記工程（２）におけるＰＣＲサイクルは、１．熱処理や２．逆転写反応のステップを含んでよい。また、各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含み得る。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、使用する逆転写酵素の逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。３のＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定温度を指す。
【0073】
本発明において、核酸増幅用組成物の保存安定性を判定する方法としては、限定されるものではないが、所定条件下で所定期間保管後の核酸増幅量から判断することができる。一例としては、ＲＴ－ＰＣＲ後の増幅産物を電気泳動に供し、鋳型ＲＮＡの塩基数から推定されるバンドと比較することで確認できる。電気泳動では泳動バンドの強弱により、核酸増幅量の多寡を定性的に判断できる。別の様態としては、２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。本手法における融解曲線解析を行うことで、融解曲線におけるピークの高さから核酸増幅量の多寡の判断を行うことができる。また、更に別の形態としてはハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）による検出方法においても確認できる。ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ検出系では、核酸増幅量に応じて蛍光強度が向上し、閾値の蛍光強度に達したＰＣＲの反応サイクル数をＣｔ値と呼ぶ。よって、到達蛍光強度の比較およびＣｔ値の増減により核酸増幅量の多寡を判断することができる。
【0074】
本発明における核酸増幅用組成物の保存条件については、特に限定されるものではない。保管温度としては、例えば、－９０℃以上５０℃以下、より好ましくは－３０℃以上４０℃以下である。保管期間としては、１分以上、好ましくは１時間以上、より好ましくは１２時間以上、更に好ましくは１日以上である。一つの実施形態において、保管期間は例えば２日以上であってもよいし、１週間以上であってもよいし、２週間以上であってもよい。本発明では、凍結（－３０～－１５℃）あるいは冷蔵（２～８℃）で１ヵ月保管しても、核酸増幅反応の性能低下を抑制できる。上限は特に限定されないが例えば１年以内とすることができる。
【0075】
特定の好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物は、４℃で２週間～１ヵ月間保存した場合でも核酸増幅反応性能の低下が抑制されており、当該条件下で保存後に核酸増幅反応に用いた場合に、十分な感度でターゲット核酸を増幅し、検出することが可能な核酸増幅用組成物である。４℃での保管は冷凍保存条件の加速試験にも相当することから、より長期間にわたって冷凍保存した場合にも本発明の組成物は安定な組成物であり得る。好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物は、４℃で２週間～１ヶ月間保存する場合に、当該条件下で保存する前（用事調製の場合に相当）と比較して、例えば３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上の保存安定性を示すものであり得、例えば８０％以上の保存安定性を示すものであってもよい。ここで保存安定性は、前記の保存安定性を判定する任意の方法によって測定することができるが、好ましくは、実施例に記載のようにハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）による検出方法において残存相対蛍光強度を測定することによって測定することができる。
【0076】
また別の好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物は、２５℃で１～２日間保存した場合でも核酸増幅反応性能の低下が抑制されており、前記条件下で保存後に核酸増幅反応に用いた場合でも、十分な感度でターゲット核酸を増幅し、検出することが可能な核酸増幅用組成物である。２５℃での保管は冷蔵保存条件の加速試験にも相当することから、より長期間にわたって冷蔵保存した場合にも本発明の組成物は安定な組成物であり得る。好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅用組成物は、２５℃で１～２日間間保存する場合に、当該条件下で保存する前（用事調製の場合に相当）と比較して、例えば３０％以上、好ましくは３５％以上の保存安定性を示すものであり得、例えば４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、又は８０％以上の保存安定性を示すものであってもよい。この保存安定性もまた、前記の保存安定性を判定する任意の方法によって測定することができるが、好ましくは、実施例に記載のようにハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ）による検出方法において残存相対蛍光強度を測定することによって測定することができる。
【0077】
前述のように、本発明によれば、核酸増幅用組成物の保存安定性が向上し、所定温度で一定期間にわたり長期保管された場合でも核酸増幅性能の低下を抑制することができる。従って、更に別の観点から本発明は、このように長期保管することが通常想定されているプレミックスタイプの核酸増幅用組成物をも提供する。本発明のプレミックスタイプの核酸増幅用試薬は、少なくとも（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、（ＩＩＩ）緩衝剤と共に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を含む。好ましい実施形態では、（ＩＶ）成分として、少なくとも０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンを含むことが好ましく、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤及び硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１つとを組み合わせて含むことがより好ましく、０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンと、界面活性剤と、硫酸アンモニウムとの３つを全て組み合わせて含むすることが特に好ましい。
【0078】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスまたは病原性微生物由来の核酸を検出する検査用キットまたは組成物であって、（Ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ＩＩ）オリゴヌクレオチド及びモノヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも一種のヌクレオチド類、（ＩＩＩ）緩衝剤と共に、（ＩＶ）界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び０．１～２．２ｍＭの２価以上の金属イオンからなる群より選択される少なくとも１種の添加剤を含有するＰＣＲ反応用試薬を含むことを特徴とする、蛍光化合物によりＰＣＲ法を行うためのプレミックスタイプの検査用キットまたは組成物である。
【0079】
これらの実施態様において使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類や量、プライマー又はプローブ等のヌクレオチド類の種類や量、緩衝剤の種類や量、界面活性剤、硫酸アンモニウム、及び２価以上の金属イオンの種類や量、検査に用いる試料の種類、検査対象となる病原性微生物等は、前記の検査方法において詳述したものと同様であり得る。
【実施例0080】
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0081】
試験例１．ＲＴ－ＰＣＲ反応液の保存安定性評価１
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、種々の濃度の２価金属イオンを添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ （東洋紡）
１．８～２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を２５℃で２日間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図１、２に示す。結果、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度２．５ｍＭにおいては、２５℃２日間保管で２９％まで蛍光強度が低下してしまうが、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度２．２ｍＭにおいては３６％、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度１．８ｍＭにおいては４７％の蛍光強度を維持しており、２価イオン濃度を下げることで保存安定性が向上する傾向が確認された。
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、種々の濃度の２価金属イオンを添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ （東洋紡）
１．８～２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を２５℃で２日間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図１、２に示す。結果、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度２．５ｍＭにおいては、２５℃２日間保管で２９％まで蛍光強度が低下してしまうが、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度２．２ｍＭにおいては３６％、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度１．８ｍＭにおいては４７％の蛍光強度を維持しており、２価イオン濃度を下げることで保存安定性が向上する傾向が確認された。
【0082】
試験例２．ＲＴ－ＰＣＲ反応液の保存安定性評価２
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、硫酸アンモニウム（終濃度１０ｍＭ）もしくは界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０（終濃度０．０９％）を添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ （東洋紡）
２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
上記のＲＴ－ＰＣＲ反応液に、硫酸アンモニウムもしくはＴｗｅｅｎ２０を１．５μＬ添加した。陰性対照は、硫酸アンモニウムもしくはＴｗｅｅｎ２０の替わりに、１．５μＬのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を２５℃で１日間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図３、４に示す。結果、陰性対照においては、２５℃１日間保管で１３％まで蛍光強度が低下してしまうが、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度が２．５ｍＭの場合であっても、硫酸アンモニウム（終濃度１０ｍＭ）を添加した場合においては３０％、Ｔｗｅｅｎ２０（終濃度０．０９％）を添加した場合においては７１％の蛍光強度を維持しており、界面活性剤や硫酸アンモニウムを添加することでも保存安定性が向上する傾向が確認された。
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、硫酸アンモニウム（終濃度１０ｍＭ）もしくは界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０（終濃度０．０９％）を添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ （東洋紡）
２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
上記のＲＴ－ＰＣＲ反応液に、硫酸アンモニウムもしくはＴｗｅｅｎ２０を１．５μＬ添加した。陰性対照は、硫酸アンモニウムもしくはＴｗｅｅｎ２０の替わりに、１．５μＬのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を２５℃で１日間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図３、４に示す。結果、陰性対照においては、２５℃１日間保管で１３％まで蛍光強度が低下してしまうが、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度が２．５ｍＭの場合であっても、硫酸アンモニウム（終濃度１０ｍＭ）を添加した場合においては３０％、Ｔｗｅｅｎ２０（終濃度０．０９％）を添加した場合においては７１％の蛍光強度を維持しており、界面活性剤や硫酸アンモニウムを添加することでも保存安定性が向上する傾向が確認された。
【0083】
試験例３．ＲＴ－ＰＣＲ反応液の保存安定性評価３
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、２．２ｍＭの２価イオンと共に、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）
２．２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
上記のＲＴ－ＰＣＲ反応液にＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１．５μL添加した。比較のための対照は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に替えて、１．５μＬのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を２５℃で１日間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図５、６に示す。結果、２．２ｍＭのマンガンイオンのみを含む対照においても、２５℃１日間保管後の蛍光強度は４４％を示したが、これに更にＴｒｉｔｏｎＸ－１００（終濃度０．０１％）を添加した場合においては８４％、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（終濃度０．０５％）を添加した場合においては９１％の蛍光強度を維持しており、２価イオン濃度を２．２ｍＭに下げて、かつ界面活性剤を添加することで保存安定性が著しく向上する傾向が確認された。
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、２．２ｍＭの２価イオンと共に、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）
２．２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
上記のＲＴ－ＰＣＲ反応液にＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１．５μL添加した。比較のための対照は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に替えて、１．５μＬのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを添加した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を２５℃で１日間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図５、６に示す。結果、２．２ｍＭのマンガンイオンのみを含む対照においても、２５℃１日間保管後の蛍光強度は４４％を示したが、これに更にＴｒｉｔｏｎＸ－１００（終濃度０．０１％）を添加した場合においては８４％、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（終濃度０．０５％）を添加した場合においては９１％の蛍光強度を維持しており、２価イオン濃度を２．２ｍＭに下げて、かつ界面活性剤を添加することで保存安定性が著しく向上する傾向が確認された。
【0084】
試験例４．ＲＴ－ＰＣＲ反応液の保存安定性評価４
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、異なる濃度の２価イオンを添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）
２．２～２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を４℃で２週間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図７、８に示す。Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度が２．５ｍＭの場合においては、４℃２週間保管で１２％まで蛍光強度が低下してしまい、増幅曲線も殆ど立ち上がりが認められなかった。一方、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度が２．２ｍＭの場合においては４℃２週間保管後にも６６％の蛍光強度を維持しており、増幅曲線の立ち上がりも認められ、２価イオン濃度を２．２ｍＭ以下に下げることで保存安定性が向上する傾向が確認された。
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、異なる濃度の２価イオンを添加して、下記温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）
２．２～２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２（東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を４℃で２週間、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図７、８に示す。Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度が２．５ｍＭの場合においては、４℃２週間保管で１２％まで蛍光強度が低下してしまい、増幅曲線も殆ど立ち上がりが認められなかった。一方、Ｍｎ（ＯＡｃ）２濃度が２．２ｍＭの場合においては４℃２週間保管後にも６６％の蛍光強度を維持しており、増幅曲線の立ち上がりも認められ、２価イオン濃度を２．２ｍＭ以下に下げることで保存安定性が向上する傾向が確認された。
【0085】
試験例５．ＲＴ－ＰＣＲ反応液の保存安定性確評価５
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、２．２ｍＭの２価イオンと共に、硫酸アンモニウム（終濃度１０ｍＭ）及び界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０（終濃度０．０９％）を添加して、下記の各温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）
２．２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を－２０℃あるいは４℃で１ヵ月、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図９、１０に示す。結果、本発明に従って調製したＲＴ－ＰＣＲ反応液は、－２０℃１ヵ月保管において９５％の蛍光強度、４℃１ヵ月保管においては８４％の蛍光強度を維持していた。長期保存期間であるにもかかわらず、試験例４よりも更に蛍光強度が高く維持されており、２価イオン濃度を２．2ｍＭ以下に下げて且つ界面活性剤および硫酸アンモニウムを添加することで、より一層効果的に保存安定性が向上する傾向が確認された。
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、２．２ｍＭの２価イオンと共に、硫酸アンモニウム（終濃度１０ｍＭ）及び界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０（終濃度０．０９％）を添加して、下記の各温度条件において保管し、その後、１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスＲＮＡを検出した。
（１）反応液の調製
反応液（１０ｘＢｕｆｆｅｒを１ｘとなるように希釈して使用）
（ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
プライマー液（１０ｘプライマー液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
プローブ液（１０ｘプローブ液を１ｘとなるように希釈して使用）
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）
２．２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ 抗体
前記各試薬を混合後、最終液量が５０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
（２）ＰＣＲ反応液の保管
調製したＰＣＲ反応液を－２０℃あるいは４℃で１ヵ月、遮光下にて保管した。
（３）ＰＣＲの実施
調製直後のＰＣＲ反応液および、（２）の条件にて保管していたそれぞれのＰＣＲ反応液を用いて、以下の方法にて同様にＰＣＲを実施した。各反応液に５０コピー／μＬに調製したノロウイルスＧ２ ＲＮＡを１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。次いで、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒまたはＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウエアによって算出される到達相対蛍光強度を測定値とした。
９０℃ １分（熱変性条件）
５６℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５６℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ３５サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（４） 結果
用事調製の測定値として得られた到達相対蛍光強度を１００％とし、各条件において得られた測定値との比較を実施した。この結果を図９、１０に示す。結果、本発明に従って調製したＲＴ－ＰＣＲ反応液は、－２０℃１ヵ月保管において９５％の蛍光強度、４℃１ヵ月保管においては８４％の蛍光強度を維持していた。長期保存期間であるにもかかわらず、試験例４よりも更に蛍光強度が高く維持されており、２価イオン濃度を２．2ｍＭ以下に下げて且つ界面活性剤および硫酸アンモニウムを添加することで、より一層効果的に保存安定性が向上する傾向が確認された。
【産業上の利用可能性】
【0086】
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理、感染症拡大防止などを目的とした検査において、好適に用いられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】