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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024176686
(43)【公開日】2024-12-19
(54)【発明の名称】ＡＴＰ産生促進組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/706 20060101AFI20241212BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20241212BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20241212BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241212BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20241212BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241212BHJP
【ＦＩ】
A61K31/706
A61K31/122
A61K31/05
A61P43/00 111
A61P43/00 107
A61P39/06
A61P25/00
A61P43/00 105
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023095426
(22)【出願日】2023-06-09
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和５年３月５日発行の日本農芸化学会２０２３年度（令和５年度）大会講演要旨集において公開 〔刊行物等〕 令和５年３月１６日に日本農芸化学会２０２３年度（令和５年度）大会講演において公表 〔刊行物等〕 令和５年４月２５日発行の日本ビタミン学会第７５回大会プログラム・講演要旨において公開
(71)【出願人】
【識別番号】301049744
【氏名又は名称】日清ファルマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100231991
【弁理士】
【氏名又は名称】高原 愼太郎
(72)【発明者】
【氏名】大西 圭悟
(72)【発明者】
【氏名】掛川 明希
(72)【発明者】
【氏名】安井 謙介
(72)【発明者】
【氏名】白川 仁
(72)【発明者】
【氏名】大崎 雄介
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 雅
【テーマコード（参考）】
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZB21
4C086ZB22
4C086ZC37
4C086ZC41
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA19
4C206CB27
4C206CB29
4C206KA01
4C206KA04
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA72
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZB21
4C206ZB22
4C206ZC37
4C206ZC41
4C206ZC75
(57)【要約】
【課題】 酸化ストレス下でのより優れたＡＴＰ産生促進効果を有するＮＭＮ含有ＡＴＰ産生促進組成物を提供すること。
【解決手段】 ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、ＭＫ－４のいずれか１つ以上を含むＡＴＰ産生促進組成物。
【選択図】図４
【解決手段】 ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、ＭＫ－４のいずれか１つ以上を含むＡＴＰ産生促進組成物。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、ＭＫ－４のいずれか１つ以上を含むＡＴＰ産生促進組成物。
【請求項2】
ＮＭＮ１００質量％に対してＣｏＱ１０が１～５００質量％、レスベラトロールが０．０５～７０質量％、ＭＫ－４が０．０１～１５０質量％である請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
経口用である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
ミトコンドリア機能の改善によってＡＴＰ産生を促進する、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記ミトコンドリア機能の改善が、酸化ストレスに対する保護効果である、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
脳神経細胞に作用する、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＴＰ産生促進組成物に関する。
詳細には、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と、コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）、レスベラトロール、メナキノン－４（ＭＫ－４）のいずれか1つ以上を組み合わせることで、ＡＴＰの産生が相乗的に向上する、ＡＴＰ産生促進組成物に関する。
詳細には、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と、コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）、レスベラトロール、メナキノン－４（ＭＫ－４）のいずれか1つ以上を組み合わせることで、ＡＴＰの産生が相乗的に向上する、ＡＴＰ産生促進組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＮＭＮ（β-ニコチンアミドモノヌクレオチド）は、生体内に広く分布する補酵素ＮＡＤ＋の中間代謝産物である。ＮＡＤ＋については、近年、老化現象に関わるサーチュイン（ＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素）との関連が注目されている。老化に伴い細胞内のＮＡＤ＋量およびサーチュイン活性は低下するが、細胞内のＮＡＤ＋を増加させることで老化現象の抑制が可能であると考えられている。
また、ＮＭＮなどのＮＡＤ＋中間代謝産物を生体内に補充することでサーチュインが再活性化することが知られている。そこで、ＮＭＮの持つ抗老化作用を、皮膚外用剤、化粧料、食品などの用途に利用することが検討されている。
さらに、２０２０年の食薬区分改正においてＮＭＮは「非医薬品リスト」に追加されたことから、今後、健康食品、サプリメント等への利用の拡大が期待される。
また、ＮＭＮなどのＮＡＤ＋中間代謝産物を生体内に補充することでサーチュインが再活性化することが知られている。そこで、ＮＭＮの持つ抗老化作用を、皮膚外用剤、化粧料、食品などの用途に利用することが検討されている。
さらに、２０２０年の食薬区分改正においてＮＭＮは「非医薬品リスト」に追加されたことから、今後、健康食品、サプリメント等への利用の拡大が期待される。
【0003】
ＮＡＤ＋は生体内で必須の成分であり、ストレス応答、遺伝子発現、ＤＮＡ修復など、体内の様々な反応に使われる。ＮＡＤ＋は解糖系やクエン酸回路でも補酵素として利用され、ミトコンドリアにおける電子伝達系でのＡＴＰ産生にも関与している。
【0004】
特許文献１には、ＮＭＮを有効成分とする老化防止剤が示されており、生体内の活性酸素が低減することが示されている。
【0005】
特許文献２には、ＮＭＮを含む、酸化的ストレスおよびミトコンドリアストレスから細胞を保護する組成物が示されており、ＤＮＡ損傷、酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全に対する細胞抵抗性の増強や、ＤＮＡ修復能の改善に用いられることが示されている。
【0006】
特許文献３には、ＮＭＮおよびＣｏＱ１０、ビタミンを含むＮＭＮ含有抗酸化組成物が示されており、ＮＭＮは、体のエネルギー代謝を活性化させ、体の酸化ストレス応答を改善する役割を果たすことができ、同時に、ＣｏＱ１０やビタミン等との相乗効果により、抗酸化、老化遅延、及び代謝速度の向上など優れた効果が得られることが記載されている。
【0007】
ＮＡＤ＋がＡＴＰ産生に関与していることは知られているが（非特許文献１）、ＮＭＮが他の食品成分と協調的にはたらいてＡＴＰ産生が相乗的に促進されることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０２０／０５４７９５
【特許文献2】特表２０２１－５２４４９５号公報
【特許文献3】特開２０２２－５４４８３号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】ビタミンＢ3関連分子による生体機能調節，松岡ら，千葉科学大学紀要，Ｖｏｌ．１３， １１１－１１７ ２０２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の課題は、酸化ストレス下で、より優れたＡＴＰ産生促進効果を示すＮＭＮ含有ＡＴＰ産生促進組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、またはＭＫ－４を組み合わせることで、協調的にはたらいてＡＴＰ産生が相乗的に促進されることを見出し、本発明を完成させた。
【0012】
したがって、上記の課題は、以下の組成物によって解決することができる。
（１）ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、ＭＫ－４のいずれか１つ以上を含むＡＴＰ産生促進組成物。
（２）ＮＭＮ１００質量％に対してＣｏＱ１０が１～５００質量％、レスベラトロールが０．０５～７０質量％、ＭＫ－４が０．０１～１５０質量％である、（１）に記載の組成物。
（３）経口用である、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）ミトコンドリア機能の改善によってＡＴＰ産生を促進する、（１）～（３）に記載の組成物。
（５）前記ミトコンドリア機能の改善が、酸化ストレスに対する保護効果である、（１）～（４）に記載の組成物。
（６）脳神経細胞に作用する、（１）～（５）に記載の組成物。
（１）ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、ＭＫ－４のいずれか１つ以上を含むＡＴＰ産生促進組成物。
（２）ＮＭＮ１００質量％に対してＣｏＱ１０が１～５００質量％、レスベラトロールが０．０５～７０質量％、ＭＫ－４が０．０１～１５０質量％である、（１）に記載の組成物。
（３）経口用である、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）ミトコンドリア機能の改善によってＡＴＰ産生を促進する、（１）～（３）に記載の組成物。
（５）前記ミトコンドリア機能の改善が、酸化ストレスに対する保護効果である、（１）～（４）に記載の組成物。
（６）脳神経細胞に作用する、（１）～（５）に記載の組成物。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、酸化ストレス下で、より優れたＡＴＰ産生促進効果を示すＮＭＮ含有ＡＴＰ産生促進組成物を提供することができる。
【0014】
本発明のＡＴＰ産生促進組成物のＮＭＮが、健康食品成分であるＣｏＱ１０やレスベラトロール、ＭＫ－４と協調的にはたらいてＡＴＰ産生が相乗的に促進されると、より高いエネルギー産生の促進が期待され、加齢に伴うエネルギー産生の低下などが抑制されることで、老化現象の抑制に繋がる。
【0015】
本発明の主要成分であるＮＭＮは市場価格が高く、より安価なＣｏＱ１０やレスベラトロール、ＭＫ－４と組み合わせることによってＮＭＮの使用量を少なくし、コスト面で利用しやすくすることには、産業上、大きな意義がある。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＮＭＮおよびＣｏＱ１０を併用した効果を示す。
【図2】ＮＭＮおよびレスベラトロールを併用した効果を示す。
【図3】ＮＭＮおよびＭＫ－４を併用した効果を示す。
【図4】ＮＭＮおよびＭＫ－４、ＣｏＱ１０またはレスベラトロールを併用した場合の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の組成物には、ＮＭＮおよび、ＣｏＱ１０、レスベラトロール、ＭＫ－４のいずれか１つ以上が含まれる。
【0018】
（ＮＭＮ）
本発明で使用するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドとしては、特に制限はないが、市販されている様々な製品を用いることもできる。市販品としては、例えば、洛陽華栄生物技術有限公司製の製品や、ＳｙｎｃｏＺｙｍｅｓ製の製品等を挙げることができる。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のＮＭＮの含有量は特に制限はないが、好ましくは１～８０質量％、より好ましくは６～６０質量％である。１質量％より少ないと所望の効果のために多量摂取が必要となり好ましくなく、８０質量％を超えると粉末を扱うときに流動性が悪くなる等のため、製造の歩留まりが悪くなるので好ましくない。
本発明で使用するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドとしては、特に制限はないが、市販されている様々な製品を用いることもできる。市販品としては、例えば、洛陽華栄生物技術有限公司製の製品や、ＳｙｎｃｏＺｙｍｅｓ製の製品等を挙げることができる。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のＮＭＮの含有量は特に制限はないが、好ましくは１～８０質量％、より好ましくは６～６０質量％である。１質量％より少ないと所望の効果のために多量摂取が必要となり好ましくなく、８０質量％を超えると粉末を扱うときに流動性が悪くなる等のため、製造の歩留まりが悪くなるので好ましくない。
【0019】
（ＣｏＱ１０）
コエンザイムＱ１０は、ユビデカレノンまたは補酵素Ｑ１０とも呼ばれ、高等動物に存在する補酵素の１種である。コエンザイムＱ１０は、補酵素として生物活性をもつだけでなく、エネルギー産生や抗酸化等の作用を有することが知られている。
本発明で用いられるコエンザイムＱ１０としては、生体から抽出されたものや、合成法で製造されたもの、発酵法で製造されたもの等、公知の手段で得られたものが特に制限なく利用できる。また、コエンザイムＱ１０は生体内に吸収されると還元型に変換されることから、本発明で用いられるコエンザイムＱ１０は、還元型であってもよい。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のコエンザイムＱ１０の含有量は特に制限はないが、好ましくは１～５０質量％、より好ましくは２～２０質量％である。
コエンザイムＱ１０は、ユビデカレノンまたは補酵素Ｑ１０とも呼ばれ、高等動物に存在する補酵素の１種である。コエンザイムＱ１０は、補酵素として生物活性をもつだけでなく、エネルギー産生や抗酸化等の作用を有することが知られている。
本発明で用いられるコエンザイムＱ１０としては、生体から抽出されたものや、合成法で製造されたもの、発酵法で製造されたもの等、公知の手段で得られたものが特に制限なく利用できる。また、コエンザイムＱ１０は生体内に吸収されると還元型に変換されることから、本発明で用いられるコエンザイムＱ１０は、還元型であってもよい。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のコエンザイムＱ１０の含有量は特に制限はないが、好ましくは１～５０質量％、より好ましくは２～２０質量％である。
【0020】
（レスベラトロール）
本発明のレスベラトロールとしては、スチルベノイド（スチルベン誘導体）ポリフェノールの一種であり、系統名が３，５，４’－トリヒドロキシ－ｔｒａｎｓ－スチルベンである。レスベラトロールは、赤ブドウの果皮や赤ワインに含まれる抗酸化物質として知られる。本発明の組成物においては、植物や食品から抽出したものや、合成法で製造されたもの等、公知の手段で得られたものが特に制限なく利用できる。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のレスベラトロールの含有量は、特に制限はないが、好ましくは０．１～５０質量％、より好ましくは０．３～３０質量％である。
本発明のレスベラトロールとしては、スチルベノイド（スチルベン誘導体）ポリフェノールの一種であり、系統名が３，５，４’－トリヒドロキシ－ｔｒａｎｓ－スチルベンである。レスベラトロールは、赤ブドウの果皮や赤ワインに含まれる抗酸化物質として知られる。本発明の組成物においては、植物や食品から抽出したものや、合成法で製造されたもの等、公知の手段で得られたものが特に制限なく利用できる。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のレスベラトロールの含有量は、特に制限はないが、好ましくは０．１～５０質量％、より好ましくは０．３～３０質量％である。
【0021】
（ＭＫ－４）
メナキノン－４（ＭＫ－４）はビタミンＫの１種で、動物性食品に広く分布しており、高い血液凝固活性を有することが知られている。
本発明の組成物においては、動植物組織から抽出したものや、合成法で製造されたもの等、公知の手段で得られたものが特に制限なく利用できる。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のＭＫ－４の含有量は特に制限はないが、好ましくは０．０００１～１０質量％、より好ましくは０．０００３～３質量％である。
メナキノン－４（ＭＫ－４）はビタミンＫの１種で、動物性食品に広く分布しており、高い血液凝固活性を有することが知られている。
本発明の組成物においては、動植物組織から抽出したものや、合成法で製造されたもの等、公知の手段で得られたものが特に制限なく利用できる。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中のＭＫ－４の含有量は特に制限はないが、好ましくは０．０００１～１０質量％、より好ましくは０．０００３～３質量％である。
【0022】
本発明のＡＴＰ産生促進組成物中の有効成分量は、それぞれＮＭＮ１００質量％に対してＣｏＱ１０が１～５００質量％、レスベラトロールが０．０５～７０質量％、ＭＫ－４が０．０１～１５０質量％であることが好ましく、ＣｏＱ１０が２～５０質量％、レスベラトロールが０．３～１０質量％、ＭＫ－４が０．１～１５質量％であることがより好ましい。
【0023】
（酸化ストレス）
本明細書において酸化ストレスとは、フリーラジカル（スーパーオキサイドアニオン、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素など）等の活性酸素種に起因して、細胞や個体に障害を与えることを指す。酸化ストレスは、生体内で生じる分子（タンパク質、脂質、ＤＮＡなど）レベルでの異常の蓄積による生体機能の低下と密接に関係しており、様々な疾患に関与していることが知られている。
本明細書において酸化ストレスとは、フリーラジカル（スーパーオキサイドアニオン、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素など）等の活性酸素種に起因して、細胞や個体に障害を与えることを指す。酸化ストレスは、生体内で生じる分子（タンパク質、脂質、ＤＮＡなど）レベルでの異常の蓄積による生体機能の低下と密接に関係しており、様々な疾患に関与していることが知られている。
【0024】
（酸化ストレス下におけるＡＴＰ産生促進作用から期待される効果、用途）
ミトコンドリアにはクエン酸回路や電子伝達系、ＡＴＰ産生酵素、ヘム合成や脂肪酸酸化、尿素サイクルがあり、エネルギー代謝を中心とする重要な生化学系が多く存在する。加齢によりミトコンドリアの活性酸素産生が増すことが知られており、ミトコンドリアの酸化的傷害はさらにミトコンドリアの活性酸素生成を増し、傷害速度が加速される。
電子伝達系で産生されるＡＴＰは、生体内のエネルギーとして重要であるが、加齢などに起因する酸化ストレスによりミトコンドリアが傷害を受けると、ＡＴＰ産生に悪影響を及ぼすことが考えられる。
酸化ストレス下においてもＡＴＰ産生を促進することで、加齢に伴う生体の機能低下の抑制に繋がることが期待される。
ミトコンドリアにはクエン酸回路や電子伝達系、ＡＴＰ産生酵素、ヘム合成や脂肪酸酸化、尿素サイクルがあり、エネルギー代謝を中心とする重要な生化学系が多く存在する。加齢によりミトコンドリアの活性酸素産生が増すことが知られており、ミトコンドリアの酸化的傷害はさらにミトコンドリアの活性酸素生成を増し、傷害速度が加速される。
電子伝達系で産生されるＡＴＰは、生体内のエネルギーとして重要であるが、加齢などに起因する酸化ストレスによりミトコンドリアが傷害を受けると、ＡＴＰ産生に悪影響を及ぼすことが考えられる。
酸化ストレス下においてもＡＴＰ産生を促進することで、加齢に伴う生体の機能低下の抑制に繋がることが期待される。
【0025】
（脳神経細胞に対する作用から期待される効果、用途）
認知症は脳細胞の機能不全や脳細胞数の低下によっておこるが、実際には神経細胞死による脳細胞数の低下により引き起こされることが多いと言われている。また、フリーラジカルの関与が明らかな病態として筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が知られている。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物の脳神経細胞に対する作用によって、脳細胞の機能不全や脳細胞数の低下の抑制に繋がることが期待される。
認知症は脳細胞の機能不全や脳細胞数の低下によっておこるが、実際には神経細胞死による脳細胞数の低下により引き起こされることが多いと言われている。また、フリーラジカルの関与が明らかな病態として筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が知られている。
本発明のＡＴＰ産生促進組成物の脳神経細胞に対する作用によって、脳細胞の機能不全や脳細胞数の低下の抑制に繋がることが期待される。
【実施例0026】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【0027】
（実施例１～８）
（マウス海馬由来神経細胞ＨＴ－２２の酸化ストレス下におけるＡＴＰ産生量測定）
マウス海馬由来神経細胞ＨＴ－２２はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手した。９６ウェルプレートにＨＴ－２２細胞１．２５×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２００μＬずつ播種して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、ウシ胎児血清（１０％）、抗生物質（１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍL ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地 (Ｓｉｇｍａ)で１８時間培養した。培地を除去後、ＮＭＮを終濃度０、１０、１００、１０００ μＭ、ＣｏＱ１０を終濃度０、９、１８ μＭとなるように培地を調製した（実施例１および２）。同様に、ＮＭＮを終濃度０、１０、１００、１０００ μＭ、レスベラトロール（東京化成工業株式会社）を終濃度０、１、５、１０ μＭ（実施例３～５）、またはＮＭＮを終濃度０、１０、１００、１０００ μＭ、ＭＫ－４を終濃度０、０．１、１、１０ μＭ（実施例６～８）となるように培地を調製した。各培地をそれぞれ２００ μＬ／ｗｅｌｌで添加し、２４時間培養後、各ｗｅｌｌに過酸化水素２００μＭとなるように調製した培地を２０μＬずつ添加した。１時間培養後、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ測定キット ｖｅｒ．２（東洋ビーネット株式会社）を用いて細胞内のＡＴＰ量を定量した。
また、Ｌｏｗｒｙ法により細胞内の蛋白質量を定量した。被験物質と過酸化水素を添加しないｗｅｌｌをコントロールとし、得られた定量値から単位蛋白質量当たりのＡＴＰ量を算出し、コントロールを１とした相対比を求めた。
（マウス海馬由来神経細胞ＨＴ－２２の酸化ストレス下におけるＡＴＰ産生量測定）
マウス海馬由来神経細胞ＨＴ－２２はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手した。９６ウェルプレートにＨＴ－２２細胞１．２５×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２００μＬずつ播種して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、ウシ胎児血清（１０％）、抗生物質（１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍL ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地 (Ｓｉｇｍａ)で１８時間培養した。培地を除去後、ＮＭＮを終濃度０、１０、１００、１０００ μＭ、ＣｏＱ１０を終濃度０、９、１８ μＭとなるように培地を調製した（実施例１および２）。同様に、ＮＭＮを終濃度０、１０、１００、１０００ μＭ、レスベラトロール（東京化成工業株式会社）を終濃度０、１、５、１０ μＭ（実施例３～５）、またはＮＭＮを終濃度０、１０、１００、１０００ μＭ、ＭＫ－４を終濃度０、０．１、１、１０ μＭ（実施例６～８）となるように培地を調製した。各培地をそれぞれ２００ μＬ／ｗｅｌｌで添加し、２４時間培養後、各ｗｅｌｌに過酸化水素２００μＭとなるように調製した培地を２０μＬずつ添加した。１時間培養後、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ測定キット ｖｅｒ．２（東洋ビーネット株式会社）を用いて細胞内のＡＴＰ量を定量した。
また、Ｌｏｗｒｙ法により細胞内の蛋白質量を定量した。被験物質と過酸化水素を添加しないｗｅｌｌをコントロールとし、得られた定量値から単位蛋白質量当たりのＡＴＰ量を算出し、コントロールを１とした相対比を求めた。
【0028】
【表1】
【0029】
（実施例９～１１）
（マウス海馬由来神経細胞ＨＴ－２２の酸化ストレス下におけるミトコンドリア内酸化ストレス評価）
ミトコンドリア内酸化ストレス評価には、ＭｉｔｏＳＯＸ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＭＳＯに溶解後ＤＭＥＭ培地で希釈して５μＭに調製して用いた。
６ウェルプレート にＨＴ－２２細胞３．２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２００μＬずつ播種して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、ウシ胎児血清（１０％）、抗生物質（１００
Ｕ／ｍL ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地 (Ｓ
ｉｇｍａ)で１８時間培養した。培地を除去後、ＮＭＮを終濃度１０または１００μＭ、ＣｏＱ１０を終濃度９μＭ、ＭＫ－４を終濃度１μＭ、レスベラトロールを終濃度１μＭとなるように調製した培地をそれぞれ２μＬ／ｗｅｌｌで添加した。２４時間培養後、各ｗｅｌｌに過酸化水素２００μＭとなるように調製した培地を２００μＬずつ添加して、１時間培養後、トリプシン処理により細胞を回収、ＰＢＳで洗浄後、細胞をＰＢＳに懸濁して９６ｗｅｌｌＵ字型プレートに移した。遠心分離して上清を除去した後、調製した染色試薬を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、遮光して１５分間染色した。染色後の細胞を回収して、フローサイトメーター（ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にてＰＥの条件でミトコンドリアのスーパーオキシド量を測定した。
（マウス海馬由来神経細胞ＨＴ－２２の酸化ストレス下におけるミトコンドリア内酸化ストレス評価）
ミトコンドリア内酸化ストレス評価には、ＭｉｔｏＳＯＸ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＭＳＯに溶解後ＤＭＥＭ培地で希釈して５μＭに調製して用いた。
６ウェルプレート にＨＴ－２２細胞３．２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２００μＬずつ播種して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、ウシ胎児血清（１０％）、抗生物質（１００
Ｕ／ｍL ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地 (Ｓ
ｉｇｍａ)で１８時間培養した。培地を除去後、ＮＭＮを終濃度１０または１００μＭ、ＣｏＱ１０を終濃度９μＭ、ＭＫ－４を終濃度１μＭ、レスベラトロールを終濃度１μＭとなるように調製した培地をそれぞれ２μＬ／ｗｅｌｌで添加した。２４時間培養後、各ｗｅｌｌに過酸化水素２００μＭとなるように調製した培地を２００μＬずつ添加して、１時間培養後、トリプシン処理により細胞を回収、ＰＢＳで洗浄後、細胞をＰＢＳに懸濁して９６ｗｅｌｌＵ字型プレートに移した。遠心分離して上清を除去した後、調製した染色試薬を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加して、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、遮光して１５分間染色した。染色後の細胞を回収して、フローサイトメーター（ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にてＰＥの条件でミトコンドリアのスーパーオキシド量を測定した。
【0030】
本発明のＡＴＰ産生促進組成物は、ＮＭＮとＣｏＱ１０、レスベラトロール、またはＭＫ－４との相乗効果によって、ＮＭＮ単独の場合と比較してより優れたＡＴＰ産生促進効果を有することを確認した。また、本発明のＡＴＰ産生促進組成物により、細胞中のミトコンドリアのスーパーオキシド量が減少していることから、本発明の組成物のＡＴＰ産生促進効果は、ミトコンドリア機能が改善されることが大きな役割を果たしているものと推定される。
【0031】
本発明の組成物により、酸化ストレス下でより優れたＡＴＰ産生促進効果を有するＮＭＮ含有ＡＴＰ産生促進組成物を提供することができるため、食品、健康食品、医薬品等において、極めて利用性が高いものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】