特開 2024-177015 椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024177015

(43)【公開日】2024-12-19

(54)【発明の名称】椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20241212BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20241212BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241212BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20241212BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20241212BHJP

   A61K 35/32 20150101ALI20241212BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20241212BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241212BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12Q1/6851 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6837 Z

A61K35/32

A61P19/00

A61P29/00

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023154059

(22)【出願日】2023-09-21

(31)【優先権主張番号】112121278

(32)【優先日】2023-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

(71)【出願人】

【識別番号】524144899

【氏名又は名称】精準再生生醫股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100201329

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 真二郎

(72)【発明者】

【氏名】蔡詩辰

(72)【発明者】

【氏名】陳韋弘

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ36

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA93X

4B065BA24

4B065BA30

4B065BC50

4B065BD44

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB46

4C087NA14

4C087ZA08

4C087ZA96

(57)【要約】

【課題】椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途を提供する。
【解決手段】本発明は、主に椎間板から髄核細胞を取得すると共に、体外で拡大培養する方法が開示される。本発明は、上記の方法により得られる髄核細胞を用いて、下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途を提供することを副次的な目的とし、前記髄核細胞を含有する医薬組成物の応用を経て、慢性下背部痛を治療するために用いられる。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法であって、
ａ）髄核組織（ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）を提供する工程と、ｂ）前記髄核組織を酵素で加水分解すると共に、加水分解されていない前記髄核組織と初代髄核細胞とを篩い分け手段及び遠心分離手段により分離する工程と、ｃ）前記工程ｂ）にて得られる当該初代髄核細胞について初代培養を行う工程と、ｄ）前記工程ｃ）にて初代培養を行った当該初代髄核細胞が所定の細胞密度に達した後、当該初代髄核細胞を取り出して継代培養を行う工程と、ｅ）１個または多数個の遺伝子の発現量に基づいて、前記工程ｄ）にて継代培養を行った当該初代髄核細胞中から髄核細胞を選別する工程と、ｆ）前記工程ｅ）にて得られる当該髄核細胞について拡大培養を行う工程とを含み、当該１個または多数個の遺伝子は、髄核発生遺伝子、軟骨分化遺伝子、髄核特異的な遺伝子、髄核退行変性遺伝子及び線維輪特異的な遺伝子よりなる遺伝子モジュール中から選択される遺伝子であることを特徴とする、椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法。

【請求項2】

前記髄核発生遺伝子は、ＫＤＭ４Ｅであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記軟骨分化遺伝子は、ＳＯＸ９と、ＣＯＬ２Ａ１と、Ａｇｃ１とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記髄核特異的な遺伝子は、ＰＡＸ１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記髄核退行変性遺伝子は、ＳＡＡ１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記線維輪特異的な遺伝子は、ＣＤ９０であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記髄核組織を加水分解するための前記酵素は、コラゲナーゼ、トリプシンまたはこれらの組み合せであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞密度は、８０～９０％の細胞密度であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

当該遺伝子の発現量は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ウェスタンブロッティング法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）により検出測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

請求項１に記載の方法により得られる前記髄核細胞から、下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途であることを特徴とする、方法の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞拡大培養方法の技術分野に係り、特に、椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途の技術分野に関するものである。

【背景技術】

【0002】

椎間板組織（Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ）は、椎骨（Ｖｅｒｔｅｂｒａ）の間に位置しており、線維輪（Ａｎｎｕｌｕｓ ｆｉｂｒｏｓｕｓ）と、髄核組織（Ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｕｓ）とから構成され、椎体間の動きによって生じる摩擦を緩衝することができる。椎間板退行変性症（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｉｓｃ ｄｉｓｅａｓｅ）は、下背部痛（Ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ）などの症状を引き起こすことが多く、年齢が３０～５０歳代の成人個体に好発し、症状が重い方では、椎間板の崩壊が起こることもある。統計によると、８０％の成人が一生のうちに下背部痛を経験すると言われており、その中でも約４分の１の人が、長引く背部痛によって仕事に支障をきたしてしまう。

【0003】

一般に、椎間板退行変性症の初期症状が現われる時期に、初めは臨床医師が処方する鎮痛薬物を患者に渡し、服用してもらうことで、生理的な疼痛を一時的に軽減することができる。現在、よく用いられている薬物は、非ステロイド性消炎鎮痛薬（ＮＳＡＩＤ）、アセトアミノフェン（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、ステロイド系薬物などを含む。これらの種類の薬物は、細胞の分泌バランスが乱れてしまう場合があると共に、胃や腸などの消化器系の副作用を起こすおそれがある。椎間板退行変性の症状が重い人では、椎間板置換術を行う治療の必要はあるものの、人工椎間板インプラントのその材質は、高分子ポリマーと金属物質を混ぜ合せたものであり、かつ生体適合性がないため、より一層深刻な副作用が起こりやすい。上記で述べたような方法は、いずれも直接退行変性に陥った椎間板に対して治療を行うことができず、かつ患者の生活の質の向上に向けての顕著な改善も見られない。

【0004】

椎間板構造に損傷または退行変性が発生する時に、髄核組織は、不安定になる可能性があると共に、かかる負荷や圧力が増大することが原因で、外側に突出するか、さらにひどくなると、線維輪を突き破って外に飛び出すこともある。このように突出した髄核組織が、例えば、脊髄や神経根のような周囲の神経構造を圧迫することにより、疼痛、放散通、麻痺や筋無力などの症状を引き起こす。このため、椎間板突出と髄核組織の位置及び圧力との間に密接な関係が存在している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本願の発明者は、現今の椎間板退行変性症の治療方式の制限及び欠点、並びに椎間板退行変性と髄核組織との間に基づく関係に鑑み、そのために本願の発明者は、椎間板退行変性の初期に、患者の椎間板の髄核組織中から髄核細胞を取得すると共に、体外で拡大培養した後にそれを凍結保存でき、患者からの要望があれば、次にそれを解凍した後に再培養すると共に、患者の患部に植え込むことで、それを患者の患部で成長させるため、免疫拒絶反応が生じることはないことから、髄核組織の再生及び椎間板退行変性の治療という目的を達成することが望まれている。このため、本願の発明者は、極力研究発明した結果、遂に本発明に係る椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法及び前述した方法により得られる髄核細胞から下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途を研究開発して完了させた。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の主要な目的は、椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法を提供することであり、それは、ａ）髄核組織（ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）を提供する工程と、ｂ）前記髄核組織を酵素で加水分解すると共に、加水分解されていない前記髄核組織と組織から脱落する初代髄核細胞とを篩い分け手段及び遠心分離手段により分離する工程と、ｃ）前記工程ｂ）にて得られる当該初代髄核細胞について初代培養を行う工程と、ｄ）前記工程ｃ）にて初代培養を行った当該初代髄核細胞が所定の細胞密度に達した後、当該初代髄核細胞を取り出して継代培養を行う工程と、ｅ）１個または多数個の遺伝子の発現量に基づいて、前記工程ｄ）にて継代培養を行った当該初代髄核細胞中から髄核細胞を選別する工程と、ｆ）前記工程ｅ）にて得られる当該髄核細胞について拡大培養を行う工程とを含み、その内、当該１個または多数個の遺伝子は、髄核発生遺伝子、軟骨分化遺伝子、髄核特異的な遺伝子、髄核退行変性遺伝子及び線維輪特異的な遺伝子よりなる遺伝子モジュール中から選択される遺伝子である。

【0007】

上記の方法において、前記髄核発生遺伝子は、ＫＤＭ４Ｅであり、前記軟骨分化遺伝子は、ＳＯＸ９と、ＣＯＬ２Ａ１と、Ａｇｃ１とを含み、前記髄核特異的な遺伝子は、ＰＡＸ１であり、前記髄核退行変性遺伝子は、ＳＡＡ１であり、及び前記線維輪特異的な遺伝子は、ＣＤ９０である。

【0008】

このほか、上記の方法において、前記髄核組織を加水分解するための前記酵素は、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）またはこれらの組み合せであり、なおかつ工程ｃ）にて初代培養を行った当該初代髄核細胞が、０～１４日間経過後、５０～１００％の細胞密度に達した後、より好ましくは５～７日間経過後、８０～９０％の細胞密度に達した後、当該初代髄核細胞を取り出して継代培養を行う。

【0009】

さらに、上記の方法において、当該遺伝子の発現量は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ウェスタンブロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）により検出測定される。

【0010】

同時に、本発明の副次的な目的は、上記の方法により得られる髄核細胞を用いて、下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途を提供することであり、その内、前記医薬組成物は、医薬学上許容され得る担体を含む。

【発明の効果】

【0011】

前記医薬組成物によれば、患者の髄核組織中から得られる前記髄核細胞を拡大培養した後、前記患者の患部（すなわち、椎間板退行変性の部位）に再移植することができ、それを患部において成長させ、髄核組織の再生を通じて治療の目的を達成すると共に、移植を受けた前記患者に免疫拒絶反応を起こす可能性を回避することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その髄核発生遺伝子：ＫＤＭ４Ｅの発現量を示す棒グラフである。

【図2A】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その軟骨分化遺伝子：ＳＯＸ９の発現量を示す棒グラフである。

【図2B】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その軟骨分化遺伝子：ＣＯＬ２Ａ１の発現量を示す棒グラフである。

【図2C】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その軟骨分化遺伝子：Ａｇｃ１の発現量を示す棒グラフである。

【図3】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その髄核特異的な遺伝子：ＰＡＸ１の発現量を示す棒グラフである。

【図4】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その髄核退行変性遺伝子：ＳＡＡ１の発現量を示す棒グラフである。

【図5】異なる年齢層において、本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法により得られる髄核細胞の、その線維輪特異的な遺伝子：ＣＤ９０の発現量を示す棒グラフである。

【図6】本発明の椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途を示すフローダイアグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書において記載される全ての技術的及び科学的専門用語は、別途定義されない限り、本開示が属する技術分野における通常の技術的知識を有する者によって共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明では、後述の実施例を模範的な例として解説するが、あくまでも例示にすぎず、必ずしもこれらに限定されるわけではなく、本発明は、下記の実施例によって限定されるものではない。別段の説明がない限り、本発明に用いられる材料は、いずれも市販されており、入手が容易なものであり、以下の説明は、入手可能なルートを単に例示するものである。

【実施例0014】

＜髄核組織（Ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）検体の処理＞
１．まず、病院の手術室に、椎間板退行変性症または椎間板ヘルニアの患者の髄核組織を、手術を経て無菌方式で取り出し、抗生物質組成物が内包された生理食塩水を入れた無菌密閉担持器中に置き、それからヒト細胞・組織の取扱い基準（Ｇｏｏｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＧＴＰ）に準拠した実験室の無菌作業台中に送り込んで処理を行う。
２．髄核組織の検体重量と前記検体の患者の基本情報を記録する。
３．前記検体を２ｍＬのＰ０ ｍｅｄｉｕｍ（第０継代の培地、ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ０）含有の１０ｃｍ ｄｉｓｈ（培養皿）中に置き、次に前記検体を平均１ｍｍ^３よりも小さい小塊に切り出し、その内、１枚の１０ｃｍ ｄｉｓｈ中に約５ｇの検体を含み、検体が比較的に多い場合、一定の比例に基づいて髄核組織を数皿の培養皿に分け、その内、Ｐ０ ｍｅｄｉｕｍは、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ（ヒト血小板溶解物）及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（抗生物質）という成分を含む。
４．コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）溶液の調製：７ｍＬのＰ０ ｍｅｄｉｕｍ＋１ｍＬのｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（第１型コラーゲン）、すなわち、前記コラゲナーゼ溶液中のＰ０ ｍｅｄｉｕｍとｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅとの比例が７：１（体積比）である。
５．調製済みのコラゲナーゼ溶液を切り刻まれた髄核組織含有の培養皿中に加え、各皿の培養皿中に８ｍｌのコラゲナーゼ溶液を加えると共に、３７℃ 、５％ＣＯ_２のインキュベーター内に一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養する。
６．一晩培養後に、各培養皿中の髄核組織検体を１００μｍ細胞濾過器（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）で篩い分け、なおかつ篩い分け時に１０ｍＬ注射器のピストンを用いて組織を軽く磨くことができ、研磨完了後、１０ｍＬのＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）でｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒを清浄する。
７．篩い分け後に収集された細胞の懸濁液を、２００ｘｇの回転数で室温にて５分間遠心分離すると共に、上清液を除去する。
８．次に、２０ｍＬのＤＰＢＳで２回清浄（ｗａｓｈ）して沈殿細胞（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）を得る。
９．それから、得られた沈殿細胞（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）を２ｍＬのＰ０ ｍｅｄｉｕｍ中に再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）し、次にトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）で細胞計数を行い、計算して細胞数及びその生存率（８０～９９％）を得る。
１０．５～１０×１０^５の細胞数種を１０ｍＬのＰ０ ｍｅｄｉｕｍを含む１０ｃｍ ｄｉｓｈ中に取り、この時の細胞をＰ０（第０継代の細胞，ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ０）とし、すなわち、初代髄核細胞とすると共に、３７℃ 、５％ＣＯ_２のインキュベーター内に培養して初代培養を行う。
１１．前記初代髄核細胞の成長状況を持続的に観察すると共に、３日目の時点で旧Ｐ０ ｍｅｄｉｕｍを除去した後、６ｍＬのＤＰＢＳで１回清浄し、次に１０ｍＬの新規Ｐ０ ｍｅｄｉｕｍを加えて継続培養する。
１２．前記初代髄核細胞を０～１４日間培養したのち、５０～１００％の細胞密度に達した後、あるいはより好ましくは５～７日間培養したのち、細胞密度が８０～９０％に達することができ、この時、当該初代髄核細胞を取り出して１回目継代培養を行うことができる。

【実施例0015】

＜初代髄核細胞の継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）＞
１．実施例１における初代髄核細胞の細胞密度が５０～１００％に達するか、あるいはより好ましくは８０～９０％に達する時に、継代培養を行う。
２．旧Ｐ０ ｍｅｄｉｕｍを除去すると共に、１０ｃｍ ｄｉｓｈの底部に付着した初代髄核細胞を６ｍＬのＤＰＢＳで２回清浄する。
３．１０ｃｍ ｄｉｓｈ中に１ｍＬの０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（トリプシン－エチレンジアミン四酢酸）を加えると共に、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内にそれを３７℃下３分間作用させる。
４．作用完了後、１０ｃｍ ｄｉｓｈを手で軽くたたき、１０ｃｍ ｄｉｓｈの底部からの前記初代髄核細胞の剥離を促進する。
５．４ｍＬのＰ０ ｍｅｄｉｕｍを１０ｃｍ ｄｉｓｈ中に加えることによって、ｔｒｙｐｓｉｎ（トリプシン）を中和し、それからＰ０ ｍｅｄｉｕｍ中に懸濁した前記初代髄核細胞を収集し、遠心分離管中に置くと共に、室温下２００ｘｇの回転数で５分間遠心分離する。
６．遠心分離管中の上清液を除去した後、前記初代髄核細胞を適当な体積の培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）中に再懸濁する。前記初代髄核細胞の再懸濁に所要のｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍの体積を一定の比例に基づいて調製し、例えば、各１～２皿の１０ｃｍ ｄｉｓｈの前記初代髄核細胞を１ｍＬのｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍに再懸濁し、その内、ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍは、下記の成分を含み、つまりＤＭＥＭと、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅとを含む。
７．ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅで細胞計数を行い、前記初代髄核細胞の数及びその生存率（８０～９９％）を確認する。
８．再懸濁された前記初代髄核細胞を各皿の１０ｃｍ ｄｉｓｈ中に１×１０^６を含有する細胞数の比例に基づいて、１０ｍｌのｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍに継代培養を行い、この時の前記初代髄核細胞がＰ１（すなわち、第１継代の細胞，ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ １）となる。
９．約３～４日置きに１回の継代培養を行い、すなわち、上記のステップ１～８を繰り返し行う。