特開 2024-177108 電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024177108

(43)【公開日】2024-12-19

(54)【発明の名称】電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20241212BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20241212BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241212BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20241212BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20241212BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241212BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z ZNA

C12Q1/34

C12M1/34 B

C12M1/42

G01N21/78 C

C12Q1/6876 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024090810

(22)【出願日】2024-06-04

(31)【優先権主張番号】202310685007.0

(32)【優先日】2023-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】594164542

【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】515190906

【氏名又は名称】南京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001771

【氏名又は名称】弁理士法人虎ノ門知的財産事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウー シァオティン

(72)【発明者】

【氏名】シュ チチ

(72)【発明者】

【氏名】ファン ハオ

(72)【発明者】

【氏名】ヂィー フアンシィェン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ヂィエ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB20

4B029FA15

4B063QA01

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR83

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX04

(57)【要約】

【課題】増幅する必要がなく、高感度、高精度及び特異性を有しかつ高柔軟性を有する電気化学発光ナノプローブを提供することである。
【解決手段】実施形態の電気化学発光ナノプローブの製造方法は、共役ポリマーとコポリマー分子を重合させ、Ｐｄｏｔｓナノ粒子を合成するＰｄｏｔｓナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたＰｄｏｔｓナノ粒子を修飾するＰｄｏｔｓナノ粒子修飾工程とを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

共役ポリマーとコポリマー分子を重合させ、Ｐｄｏｔｓナノ粒子を合成するＰｄｏｔｓナノ粒子合成工程と、
クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたＰｄｏｔｓナノ粒子を修飾するＰｄｏｔｓナノ粒子修飾工程と、
を含む、電気化学発光ナノプローブの製造方法。

【請求項2】

前記共役ポリマーは、下記の化学式（１）に示すPDHF、PFO、PPE、MEH-PPV、PFPV、PFBT、CN-PPV、PF-DBT5、およびPBOCのうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。

【化1】

【請求項3】

前記コポリマー分子は、下記の化学式（２）に示すポリスチレン－ポリアクリル酸ブロック共重合体（PS-PAA）、ポリスチレン無水マレイン酸共重合体（PSMA）、およびポリ（イソブチレン－alt－無水マレイン酸）（PIMA）のうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。

【化2】

【請求項4】

前記共役ポリマーと前記コポリマー分子は、ナノ共沈法により前記Ｐｄｏｔｓナノ粒子を合成する、
請求項１に記載の製造方法。

【請求項5】

前記クエンチャー分子は、ブラックホールクエンチャー、ダーククエンチャー、およびアミン反応性クエンチャーのうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。

【請求項6】

前記オリゴヌクレオチド鎖は、一本鎖ＤＮＡである、
請求項１に記載の製造方法。

【請求項7】

前記一本鎖ＤＮＡは、ヘアピン構造の一本鎖ＤＮＡである、
請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

前記オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖ＤＮＡである、
請求項１に記載の製造方法。

【請求項9】

共役ポリマーとコポリマー分子とが重合されたＰｄｏｔｓナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたＰｄｏｔｓナノ粒子である、
電気化学発光ナノプローブ。

【請求項10】

共役ポリマーとコポリマー分子とが重合されたＰｄｏｔｓナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたＰｄｏｔｓナノ粒子である電気化学発光ナノプローブが滴下された動作電極である、
電気化学発光センサ。

【請求項11】

前記動作電極は、ガラス炭素電極、酸化インジウムスズ電極、およびスクリーン印刷電極のうちの一つである、
請求項１０に記載の電気化学発光センサ。

【請求項12】

測定されるサンプルを標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒体系に添加する酵素反応工程と、
共役ポリマーとコポリマー分子とが重合されたＰｄｏｔｓナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたＰｄｏｔｓナノ粒子である電気化学発光ナノプローブが滴下された動作電極に、前記酵素反応工程で得られた反応溶液を添加し、電気化学発光信号を採取し、分析するサンプル検出工程と、
を含む、電気化学発光検出方法。

【請求項13】

前記Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２（ＶＡ型）、Ｃａｓ１３（ＶＩ型）、およびＣａｓ１４（ＶＦ型）のうち少なくとも一つのＣａｓタンパク質を含む、
請求項１２に記載の電気化学発光検出方法。

【請求項14】

前記Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、およびＣａｓ１４ｃのうち少なくとも一つのＣａｓタンパク質を含む、
請求項１３に記載の電気化学発光検出方法。

【請求項15】

前記電気化学発光ナノプローブにおけるオリゴヌクレオチド鎖は、一本鎖ＤＮＡである、
請求項１２に記載の電気化学発光検出方法。

【請求項16】

前記一本鎖ＤＮＡは、ヘアピン構造の一本鎖ＤＮＡである、
請求項１５に記載の電気化学発光検出方法。

【請求項17】

前記電気化学発光ナノプローブにおけるオリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖ＤＮＡであり、かつ前記酵素反応工程においてさらにＥＸＯ ＩＩＩ酵素を使用する、
請求項１２に記載の電気化学発光検出方法。

【請求項18】

標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒系を含む酵素反応溶液と、
動作電極に、共役ポリマーとコポリマー分子とが重合されたＰｄｏｔｓナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたＰｄｏｔｓナノ粒子である電気化学発光ナノプローブが固定されている検出チップと、
を含む、電気化学発光検出用キット。

【請求項19】

前記電気化学発光ナノプローブにおけるオリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖ＤＮＡであり、かつ前記酵素反応溶液はさらにＥＸＯ ＩＩＩ酵素を含む、
請求項１８に記載の電気化学発光検出用キット。

【請求項20】

前記検出チップは、前記動作電極といてスクリーン印刷された三電極シートの動作電極が用いられた使い捨てのＰｄｏｔｓ使い捨て検出チップである、
請求項１８に記載の電気化学発光検出用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の実施形態は、電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

電気化学発光（ＥＣＬ）は、電気化学によるエネルギー緩和過程であり、励起モードと信号検出が分離されるため、電気化学的制御可能性と低バックグラウンドの特徴を有する。電気化学発光技術の比較的に簡便な時間及び空間制御により、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを利用して信号収集を行う電気化学発光イメージングは、急速に発展しかつ様々な標的分子の分析に用いられ、遺伝子毒素スクリーニング、免疫測定、指紋分析、細胞検出、及び反応メカニズムの研究に広く応用される。電気化学発光の検出方法は、化学発光方法が持つ高感度、広い線形範囲、観察の便利さ及び装置の簡単などの利点を保留するとともに、化学発光方法が比較にならない利点、例えば再現性が高く、試薬が安定し、制御が簡単で、及びいくつかの試薬が繰り返し使用できることなどもある。

【0003】

従来の電気化学発光イメージングは、ルテニウム及びイリジウム錯体などの無機錯体発光系を採用することが多いが、これらの錯体の水溶液における不溶性及び含まれる重金属による細胞毒性問題により、その生物学的分析への応用が制限される。

【0004】

半導体ポリマー量子ドット（Semiconducting Polymer Dots，Pdots）は新規な有機蛍光材料であり、無毒性で、且つ大きい光吸収断面、高い蛍光量子効率、光安定性及び生体適合性等の特徴を有するため、生体検出、細胞生物学及び臨床医学などに広く用いられる。

【0005】

従来技術において、半導体高分子量子ドットを蛍光プローブとし、電気化学発光検出に用いられている様々な試みがなされている（非特許文献１、２参照）。半導体ポリマー量子ドットの形式で製造された電気化学発光センサは、従来の電気化学発光プラットフォームと比べて、例えば発光輝度がより高く、光安定性がよりよく、生体適合性がより良い等の利点がある。

【0006】

しかし、電気化学発光プラットフォームは信号検出のプラットフォームとし、それ自体が測定される標的分子に対する識別機能を備えず、一般的に特殊なプローブを配合して特定の標的分子に対する識別及び分析を実現する必要がある。そのため、測定対象物に対する識別特異性／正確性はそれに配合される特殊なプローブに依存する。このようなプローブの選択及び標的可能な核酸配列は、一般的に特異的な要求により制限され、すなわち検出の精度／特異性が限られ、任意の核酸配列を検出しにくい。例えば、非特許文献２にＰｄｏｔｓをＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブに連結することにより、微量核酸分子の識別及び分析を実現した。

【0007】

Ｃａｓ酵素は、ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔメカニズムを有する核酸認識及び切断酵素タンパク質であるため、一塩基分解精度を有し、Ｃａｓ酵素に基づく核酸検出の最大の利点はＣａｓ酵素特有のｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔメカニズムを利用することにより、核酸に対する検出が一塩基の分解感度に達することができるにある。また、Ｃａｓ酵素のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し合成することにより、任意の核酸配列を低コストで検出することができる。

【0008】

例えば、非特許文献３は、Ｃａｓ１２ａに基づく電気化学発光バイオセンサを設計しかつそれをヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ－１６）ＤＮＡの検出に用いる。

【0009】

このような技術は、超高精度な核酸認識の正確性を有するが、微量核酸の識別感度が十分ではない。そのため、検出限界を向上するために一般的に核酸の予備増幅を行う必要がある。予備増幅の利用により、検出の感度が向上するが、検出の正確性が低下する。大量の核酸断片の増幅によりエアロゾルの汚染を引き起こす可能性があり、偽陽性結果を発生するためである。また、予備増幅ステップも検出ステップを複雑にし、かつ検出時間を延長させる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ningning Wang, Yaqiang Feng，et al.,”ElectrochemiluMinescent Imaging for Multi-immunoassay Sensitized by Dual DNA Amplification of Polymer Dot Signal”, Anal. Chem., 2018, 90, 7708-7714

【非特許文献2】Guangming Li et al., “Ratiometric fluorescent detection of miRNA-21 via pH-regulated adsorption of DNA on polymer dots and exonuclease III-assisted amplification”，Analytica Chimica Acta, 1232（2022）340450

【非特許文献3】Peng-Fei Liu et al., “Cas12a-based electrochemiluMinescence biosensor for target amplification-free DNA detection”, Biosensors and Bioelectronics, 176, (2021), 112954

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明が解決しようとする課題は、増幅する必要がなく、高感度、高精度及び特異性を有しかつ高柔軟性を有する電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キットを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

実施形態の電気化学発光ナノプローブの製造方法は、共役ポリマーとコポリマー分子を重合させ、Ｐｄｏｔｓナノ粒子を合成するＰｄｏｔｓナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたＰｄｏｔｓナノ粒子を修飾するＰｄｏｔｓナノ粒子修飾工程とを含む。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、実施形態のナノプローブの構造例を示す模式図である。

【図2】図２は、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づくＥＣＬスイッチ原理を示す標的核酸検出の概略図である。

【図3】図３は、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づく二重酵素触媒ＥＣＬスイッチ原理を示す標的核酸検出の概略図である。

【図4】図４は、実施例１で製造されたＰＦＢＴ ＰｄｏｔｓのＴＥＭ解析結果を示す図である。

【図5A】図５Ａは、実施例１で製造されたＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの紫外の解析結果を示す図である。

【図5B】図５Ｂは、実施例１で製造されたＤＮＡ－ＰｄｏｔｓのＤＬＳの解析結果を示す図である。

【図6A】図６Ａは、実施例２で製造された異なるＥＣＬセンサ電極の酵素活性化前後でのＥＣＬ強度の比較結果を示す図である。

【図6B】図６Ｂは、実施例２で製造された異なるＥＣＬセンサ電極の酵素活性化前後でのＥＣＬ強度の比較結果を示す図である。

【図6C】図６Ｃは、実施例２で製造された異なるＥＣＬセンサ電極の酵素活性化前後でのＥＣＬ強度の比較結果を示す図である。

【図7】図７は、実施例２で製造されたｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓセンサ電極を用いてＨＰＶ １６ ＤＮＡを検出した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

前記のように、Ｃａｓ酵素は任意の核酸断片を標的することができるという利点を有するが、それ自体の感度が限られ、他の技術（例えば一般的に使用される予備増幅）と結合して感度を向上させる必要がある。ただし、前述のように偽陽性の発生を引き起こし、元の核酸を定量することも困難である。電気化学発光方法、例えば半導体ポリマー量子ドット（Ｐｄｏｔｓ）に基づく電気化学発光検出方法は信号増幅を行うことができ、正確性が高く、定量できる利点を有し、かつ予備増幅を行う必要がなく、エアロゾルによる偽陽性を回避することができる。しかし、配合し使用されるオリゴヌクレオチドプローブに高度に依存し、検出の精度／特異性が限られ、任意の核酸配列を検出しにくい。

【0015】

本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、高感度、高精度及び特異性を有しかつ高い柔軟性を有する電気化学発光検出方法を提供することである。

【0016】

本発明の発明者らは、上記従来技術に存在する問題に対して鋭意研究を行った結果、Ｃａｓ酵素体系を半導体ポリマー量子ドット（Ｐｄｏｔｓ）に基づく電気化学発光方法に応用することにより、Ｃａｓ酵素に基づく電気化学発光検出方法を構築し、Ｐｄｏｔｓに基づくＥＣＬ及びＣａｓ１２に基づく方法のそれぞれの不足を補足することができることにより、増幅する必要がなく、高感度、高精度及び特異性を有しかつ高柔軟性を有する電気化学発光検出方法を提供できることを見出した。

【0017】

具体的には、Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡの複合体（Ｃａｓタンパク質－ｃｒＲＮＡ）により標的核酸を識別しＣａｓ酵素活性を活性化させ、クエンチャー分子で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖（Ｑ－ＤＮＡ）を用いてＰｄｏｔｓナノ粒子を修飾して、ナノプローブを作製し、標的により活性化されたＣａｓタンパク質―ｃｒＲＮＡの切断活性を利用してナノプローブ上のＱ－ＤＮＡを切断することにより、Ｐｄｏｔｓ ＥＣＬ信号スイッチに対する制御を実現できる。また、Ｃａｓ酵素とエキソヌクレアーゼＩＩＩ（以下、「ＥＸＯ ＩＩＩ」ということもある）との二重酵素触媒系を採用することにより、さらにＰｄｏｔｓ ＥＣＬ信号スイッチの感度をさらに向上させる。

【0018】

本発明により、増幅する必要がなく、高感度、高精度及び特異性を有しかつ高柔軟性を有する電気化学発光検出方法を提供することができる。具体的には、
（１）ＰｄｏｔｓナノプローブとＣａｓ酵素による連帯切断活性との組み合わせるにより、予備増幅を必要とせずに、標的核酸に対する検出感度を向上させることができる。
（２）Ｃａｓ酵素の一塩基分解特異性により、ＥＣＬ信号検出の正確性を向上させ、標的核酸の誤認識による偽陽性信号を回避することができる。
（３）カスタマイズされたＣａｓ酵素のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）により、任意の核酸配列への標的、及びＥＣＬに基づく高感度信号の出力を実現することができる。
（４）ｄｓＤＮＡ剛性構造を介してクエンチ基を連結する場合、Ｃａｓ１２とＥＸＯ ＩＩＩとの二重酵素触媒系を採用することにより、Ｃａｓ１２酵素の切断適用範囲を広くすることができ、かつＥＣＬ検出の感度をさらに向上させることが望まれている。
（５）本発明のＥＣＬナノプローブは使い捨て検出チップに作製可能であり、ＰＯＣＴ（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）に役立ち、便利で、迅速な核酸検出を実現することができる。

【0019】

以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。なお、以下の実施形態についての説明は、本発明の発明構想を説明するためだけであり、本発明を限定するものではない。

【0020】

＜電気化学発光ナノプローブ及びその製造方法＞
本発明の一実施形態は、共役ポリマーとコポリマー分子を重合させ、Ｐｄｏｔｓナノ粒子を合成するＰｄｏｔｓナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたＰｄｏｔｓナノ粒子を修飾するＰｄｏｔｓナノ粒子修飾工程とを含む、電気化学発光ナノプローブ（以下、「ＥＣＬナノプローブ」ということもある）の製造方法に関する。

【0021】

（半導体ポリマー量子ドット）
半導体ポリマー量子ドット（以下、「Ｐｄｏｔｓ」ということもある）は、主にπ－共役ポリマーで構成される小粒径（通常、直径２０－３０ ｎｍ）で、高輝度を有するナノ粒子である。

【0022】

共役ポリマーは主鎖の構造によって、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリピロール、ポリパラフェニレン、ポリフルオレン、ポリフェニレンビニレン等に分類され、現在一般的に使用される共役ポリマーの主鎖構造は下記の化学式（１）の構造式に示すとおりである。

【0023】

【化1】

【0024】

具体的な共役ポリマーとしては、特に限定されず、例えばAngew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 3086 - 3109に記載の共役ポリマーを用いることができ、例えば下記の化学式（２）に示すＰＤＨＦ、ＰＦＯ、ＰＰＥ、ＭＥＨ－ＰＰＶ、ＰＦＰＶ、ＰＦＢＴ、ＣＮ－ＰＰＶ、ＰＦ－ＤＢＴ５、及びＰＢＯＣから選択される化合物であってもよい。

【0025】

【化2】

【0026】

なお、上記列挙されている共役ポリマーは例示に過ぎず、当業者には明らかなように、上記化合物が一つ又は複数の置換基（例えばアルキル基、ヒドロキシ基、ハロゲン等）で置換されて形成された誘導体、及びそれらの空間異性体等は、本発明において同様に使用することができる。

【0027】

本発明に使用される共役ポリマーの製造方法は特に限定されず、例えば鈴木カップリング反応、シェラーカップリング反応及びクロスカップリング反応などの合成経路を介して化学反応により合成することができ、又は商業的な経路で購入することができ、特に限定されない。

【0028】

（Ｐｄｏｔｓナノ粒子の合成）
本発明において、共役ポリマーとコポリマー分子を重合させることにより、Ｐｄｏｔｓナノ粒子を合成する。

【0029】

本発明におけるナノ粒子とは三次元空間において少なくとも一次元がナノサイズ（０．１～１００ ｎｍ）にある粒子を指す。前記ナノ粒子は具体的にはナノボール、ナノチューブ、ナノロッド、又はナノオニオン等の様々な幾何学的形態であってもよい。半導体ポリマー量子ドットをナノ形態に形成することにより、ＥＣＬ応答信号を効果的に増幅し、ＥＣＬセンサの検出限界、検出範囲、選択性及び安定性等を向上させることができる。本発明では、後述する実施例のように、ナノボール形態の材料を成功的に製造したが、本発明において使用可能なナノ粒子はナノボールに限定されず、採用される化合物原料及び合成経路によってナノロッドなどの他のナノ形態を形成することもできる。

【0030】

本発明において、共役ポリマーと前記コポリマー分子は、従来の技術における既知の有機材料ナノ構造を製造する方法により合成することができ、例えばナノ共沈法、マイクロエマルション法及び自己組織化法等（劉栄華、新規な蛍光共役重合体ナノ粒子の製造及び応用、北京科技大学博士学位論文、２０１８年）は、特に限定されない。ここで、生体適合性の観点から、マイクロエマルション法及びナノ共沈法を用いることがより好ましい。

【0031】

マイクロエマルション法では、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）等のポリエチレングリコール系分子、生体高分子例えばリン脂質等の無毒性、非免疫原性の親水性ポリマーで発光分子を被覆することにより、生体適合性が高く、安定性が高い発光分子ナノ粒子を得ることができる。

【0032】

ナノ共沈法は発光分子（共役ポリマー）を良溶媒に溶解し、超音波条件下で大量の貧溶媒を注入し、発光分子の溶解度が急激に低下して凝集し、それにより小粒子の形で沈殿し、その後に残留した有機溶媒を除去すれば発光分子ナノ粒子を得る。ナノ共沈法は操作しやすくかつ製造されたナノ粒子のサイズが小さくかつ均一であるため、好ましい。

【0033】

ナノ共沈法において、両親媒性ポリマーを用いて発光分子ナノ粒子を表面機能化することができる。製造プロセスにおいて、発光分子と両親媒性ポリマーは自己組織化し、両親媒性ポリマーの一端は疎水性機能性基を有し他端は親水性機能性基を有するため、両親媒性ポリマーで被覆された発光分子ナノ粒子を得ることができ、かつ両親媒性ポリマーの機能性基（例えばアミノ基及びカルボキシ基）はナノ粒子の外表面に露出し、これにより表面機能化された発光ナノ粒子を得る。核酸、ポリペプチド、糖、又はタンパク質等の機能性基は、縮合反応又は生物直交クリック反応により上記両親媒性ポリマーのナノ粒子の外表面に露出する官能基と反応し、識別機能を有する発光分子ナノ粒子を得ることができる。

【0034】

本発明において、上記両親媒性ポリマーはコポリマー分子とも呼ばれる。コポリマー分子として、本分野のよく用いられるコポリマー分子、例えば下記の化学式（３）に示すポリスチレン－ポリアクリル酸ブロックコポリマー（ＰＳ－ＰＡＡ）、ポリスチレン無水マレイン酸コポリマー（ＰＳＭＡ）又はポリ（イソブチレン－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＩＭＡ）等を使用することができ、特に限定されない。

【0035】

【化3】

【0036】

ナノ共沈法により得られたナノ粒子の直径は最小で１ ｎｍ～２ ｎｍに達することができる。

【0037】

なお、Ｐｄｏｔｓナノ粒子の表面機能化修飾は上記の両親媒性ポリマーによる修飾方法に限定されず、直接機能化法（即ち、アルコキシ鎖、アミノ／カルボキシ基、又は標的機能を有する生体分子等の官能基を共有結合の方法により発光分子に直接修飾する）、物理的被覆（即ち、リン脂質又は二酸化ケイ素等でナノ粒子を被覆する）等の他の修飾方法を採用することができる。

【0038】

発光分子ナノ粒子を表面機能化することにより、ナノ粒子１個あたりの表面に大量の官能基を有することができ、さらに大量のオリゴヌクレオチドなどの生体分子を結合することができるため、電気化学発光信号を増幅し、その検出感度を向上させることができる。

【0039】

（Ｐｄｏｔｓナノ粒子の修飾）
本発明において、Ｐｄｏｔｓナノ粒子の修飾とは、Ｐｄｏｔｓナノ粒子のオリゴヌクレオチド修飾を指し、具体的には、クエンチャー分子で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を用いて上記表面機能化されたＰｄｏｔｓナノ粒子を修飾し、オリゴヌクレオチドで修飾されたＰｄｏｔｓナノ粒子（以下、「ＥＣＬナノプローブ」ということもある）を得る。

【0040】

オリゴヌクレオチドとＰｄｏｔｓナノ粒子との結合方式は共有結合反応（例えばＮＨ_２－ＣＯＯＨによる架橋）に限らず、静電作用、親和吸着等の他の結合方式によりもよい。

【0041】

修飾に用いられるオリゴヌクレオチド鎖は二本鎖オリゴヌクレオチド鎖（例えばｄｓＤＮＡなど）であってもよく、一本鎖オリゴヌクレオチド鎖（例えばＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ）などであってもよく、具体的には使用されるＣａｓ酵素の種類に応じて適宜選択することができる。

【0042】

クエンチャー分子をＰｄｏｔｓに近接させ、ＥＣＬシグナルの増幅を増強する観点から、前記オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖オリゴヌクレオチド鎖、またはクエンチャー分子をＰｄｏｔｓに近接させることができる二次構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチド鎖、例えばヘアピン構造の一本鎖オリゴヌクレオチド鎖であることが好ましい。

【0043】

また、Ｃａｓ酵素による連帯切断活性が非特異的であるため、オリゴヌクレオチド鎖を構成するヌクレオチド配列は特に限定されず、任意の配列であればよい。オリゴヌクレオチド鎖の長さも特に限定されず、クエンチャー分子をＰｄｏｔｓに結合でき、且つクエンチャー分子とＰｄｏｔｓナノ粒子との間に共鳴エネルギー移動を発生させることができればよく、従来技術でよく用いられている様々な連結用のオリゴヌクレオチド鎖を参照して設計することができる。

【0044】

前記オリゴヌクレオチド鎖が直鎖の一本鎖オリゴヌクレオチド鎖である場合、Ｃａｓ酵素による切断の感度の観点から、そのヌクレオチドの数は多く過ぎない方がよく、好ましくは３～２０個、より好ましくは４～１１個、さらに好ましくは５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個である。

【0045】

前記オリゴヌクレオチド鎖がヘアピン構造の一本鎖のオリゴヌクレオチド鎖である場合、そのヌクレオチドの数は、例えば２０個以上であってもよく、ヘアピンを構成する環状断片のヌクレオチドの数は特に限定されず、環状を形成すればよい。Ｃａｓ酵素による切断の感度の観点から、ヘアピンを構成する茎部断片のヌクレオチドの数は多く過ぎない方がよく、好ましくは４～２０個、より好ましくは４～１０個、さらに好ましくは４個、５個、６個、７個、又は８個である。

【0046】

前記オリゴヌクレオチド鎖が二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖である場合、当該二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖は、好ましくはＰｄｏｔｓに直接的に結合される鎖と、ハイブリダイゼーションによってＰｄｏｔｓに間接的に結合される鎖とを含む。前記Ｐｄｏｔｓに直接的に結合される鎖は、好ましくは、Ｃａｓ酵素によって切断可能な一本鎖の末端部分と、ハイブリッド鎖と、二本鎖部分を構成するＤＮＡエキソヌクレアーゼによって切断可能な二本鎖部分を含む。Ｃａｓ酵素およびＤＮＡエキソヌクレアーゼによる切断の感度の観点から、前記二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における一本鎖の末端部分のヌクレオチドの数は、好ましくは３～２０個、より好ましくは４～１０個、より好ましくは４個、５個または６個であり、前記二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における二本鎖部分は、単本鎖としてヌクレオチドの数が好ましくは１５～２４個、より好ましくは１６～２０個、より好ましくは１７個、１８個または１９個である。

【0047】

本発明のオリゴヌクレオチド鎖にはクエンチャー分子が修飾されている。クエンチャー分子の動的消光は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）又は衝突消光により発生する。クエンチャー分子は光吸収とＰｄｏｔｓナノ粒子の蛍光放射とが重なるため、共鳴エネルギーは励起されたナノ粒子からクエンチャー分子に転移することができ、共役ポリマー分子の発射を消光することができる。

【0048】

前記クエンチャー分子は本分野の一般的に用いられる共鳴エネルギー転移特性を有するクエンチャー分子を使用することができ、特に限定されず、例えばブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ^ＴＭ試薬、即ちＢＨＱ系クエンチャー）、ダーククエンチャー（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ、例えばＤＡＢＣＹＬシリーズクエンチャー等）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ^ＴＭクエンチャー（即ちＢＢＱシリーズクエンチャー）、Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙクエンチャー（即ちＢＬＵシリーズクエンチャー）、又はアミン反応性クエンチャー（ＱＳＹシリーズクエンチャー）等を用いることができる。そのうち、ＢＨＱクエンチャーはよく用いられる。これらのクエンチャーはいずれも商業的（例えばＬＧＣ、ＢｉｏｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ）等）に得ることができる。

【0049】

クエンチャー分子とオリゴヌクレオチドとの連結方法は特に限定されず、本分野において慣用される方法を使用することができる。また、クエンチャー分子はオリゴヌクレオチドの末端に連結されてもよく、オリゴヌクレオチド配列の中に挿入されてもよい。

【0050】

本発明において、前記クエンチャー分子が修飾されている前記オリゴヌクレオチドは以下に記載のＣａｓ酵素と共に本発明の信号スイッチとして機能する。具体的には、オリゴヌクレオチドが活性化されたＣａｓ酵素により切断されない場合、クエンチャー分子はオリゴヌクレオチドを介してＰｄｏｔｓナノ粒子の表面に連結され、Ｐｄｏｔｓに対して消光作用を発揮し、センサ電極は低いＥＣＬ強度（ＥＣＬ ＯＦＦ）を表示する。一方、オリゴヌクレオチドが活性化されたＣａｓ酵素により切断された時に、クエンチャー分子はＰｄｏｔｓナノ粒子の表面から離脱し、それによりセンサ電極は強いＥＣＬ信号（ＥＣＬ ＯＮ）を表示する。

【0051】

＜電気化学発光センサ＞
本発明の電気化学発光センサ（以下、ＥＣＬセンサということもある）は、上記ＥＣＬナノプローブを動作電極に滴下することにより得ることができる。

【0052】

本発明に使用される動作電極としては、特に限定されず、ＥＣＬ検出に一般的に用いられる電極、例えばガラス炭素電極（ＧＣＥ）、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極、又はスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）等のうちの一種を使用することができる。好ましくは酸化インジウムスズ電極を使用し、より好ましくは三電極システムを使用する。該電極システムには例えば白金ワイヤ対電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極及び酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）動作電極が配置されている。

【0053】

＜電気化学発光検出方法＞
本発明の一実施形態は、測定されるサンプルを標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒体系に添加する酵素反応工程と、上記電気化学発光ナノプローブを動作電極に固定するＰｄｏｔｓチップ作製工程と、酵素反応工程で得られた反応溶液を前記動作電極に添加し、電気化学発光信号を採取し、分析するサンプル検出工程とを含む、Ｃａｓ酵素に基づく電気化学発光検出方法（以下、「ＥＣＬ検出方法」ということもある）に関する。

【0054】

また、本発明のＥＣＬ検出方法は上記のＰｄｏｔｓチップ作製工程を含まずに上記のＥＣＬセンサ（ＥＣＬチップともいう）を直接使用してもよい。

【0055】

本発明のＥＣＬ検出方法により、測定されるサンプル中の標的分子を検出することができる。前記測定されるサンプルは特に限定されず、例えば尿、血液、血清、脳脊髄液又は唾液等であってもよい。前記標的分子は特に限定されず、例えば核酸、タンパク質、化学小分子等であってもよい。

【0056】

本発明において、酵素触媒反応又は他の特異的化学反応において標的識別及び信号変換単位として、標的分子を滴下する時、この酵素反応又は化学反応によりＥＣＬナノプローブの信号スイッチ状態を変更することができ、それにより標的信号に対する定性又は定量検出を実現する。

【0057】

酵素触媒反応に使用される酵素として、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素中の連帯切断活性（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）を有するＣａｓ酵素を使用することができ、当該活性は非特異的なヌクレアーゼの切断活性に属し、標的核酸分子に標的化されると、Ｃａｓ酵素が活性化されて、任意の核酸分子を切断する非特異的な活性を取得する。

【0058】

前記Ｃａｓ酵素は例えばＣａｓ１２（ＶＡ型）、Ｃａｓ１３（ＶＩ型）及びＣａｓ１４（ＶＦ型）から選択される少なくとも一種のＣａｓタンパク質を含んでもよく、例えばＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ及びＣａｓ１４ｃから選択される少なくとも一種のＣａｓタンパク質である。ここで、Ｃａｓ１２はｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ）を標的とし、Ｃａｓ１３はｓｓＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）を標的とし、Ｃａｓ１４はｓｓＤＮＡを標的とする。また、Ｃａｓ１２ａはさらにｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ）に対する非特異的切断活性（トランス切断活性とも呼ばれる）を有するため、さらにｓｓＤＮＡを標的とすることができる。

【0059】

また、Ｃａｓ１２酵素はＤＮＡを標的とし、商業的に成熟し、且つＤＮＡに加えて他の非核酸検出分野（例えばタンパク質、生物小分子等）に用いることができるため、より好ましい。

【0060】

本発明において、Ｃａｓ酵素のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し合成することにより、任意の核酸配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは二つの部分で構成され、一つはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、標的核酸と相補的にペアリングする１７～２０個の塩基長さのヌクレオチド配列である；及び一つは足場としてＣａｓ酵素の折り畳みを助けるｔｒａｃｒ ＲＮＡである。ガイドＲＮＡは標的核酸のオリゴヌクレオチドと結合することによりＣａｓ酵素を活性化する。活性化されたＣａｓ酵素は、連帯切断活性によりＥＣＬナノプローブに連結されているオリゴヌクレオチドを切断してＥＣＬナノプローブの信号スイッチ状態を変更させる。

【0061】

以下、本発明の信号スイッチの原理及びＥＣＬ検出方法を具体的に説明する。本発明の信号スイッチの原理は以下のとおりである。

【0062】

本発明においてオリゴヌクレオチド鎖で修飾されたＰｄｏｔｓナノ粒子をＥＣＬナノプローブとして使用し、オリゴヌクレオチド鎖（例えば実施例で使用されているｓｓＤＮＡ、ｈＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ）の末端にクエンチャー分子が修飾されているため、ＰｄｏｔｓはＥＣＬ ＯＦＦ状態である。標的分子が存在せず、Ｃａｓ酵素が標的分子により活性化されない場合、クエンチャー分子で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖がＰｄｏｔｓ表面から離脱することがなく、センサ電極が低ＥＣＬ強度を表示する（ＥＣＬ ＯＦＦ）。逆に、標的分子が存在し、Ｃａｓ酵素が活性化される場合、Ｃａｓ１２酵素等のＣａｓ酵素が連帯切断活性を有するため、Ｐｄｏｔｓに連結されているオリゴヌクレオチド鎖が切断され、これによりクエンチャー分子がＰｄｏｔｓ表面から離脱し、ＰｄｏｔｓのＥＣＬを回復し、センサ電極が強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。

【0063】

図１は、実施形態のナノプローブの構造例を示す模式図である。図１には、それぞれ直鎖の一本鎖ＤＮＡで修飾されたＰｄｏｔｓナノプローブ（ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ）、ヘアピン構造の一本鎖ＤＮＡで修飾されたＰｄｏｔｓナノプローブ（ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ）、及び二本鎖ＤＮＡで修飾されたＰｄｏｔｓナノプローブ（ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ）の構造を示す模式図を例示する。

【0064】

図１に示すように、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）鎖の末端にクエンチャー分子が連結されており、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの構造において、クエンチャー分子がＰｄｏｔｓに近いため、より良好な信号消光効果を有し、より強い信号増幅を有するため、より良好な検出感度を有することが期待されている。

【0065】

ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓをレポータープローブとする場合、酵素反応にＣａｓ酵素のみを使用すればよく、図２に示すように、ｈＤＮＡ自体は一本鎖ＤＮＡ断片であり、標的分子が存在し、Ｃａｓ酵素が活性化される時、Ｃａｓ酵素の連帯切断活性により、ヘアピンの環状一本鎖断片はまずＣａｓ酵素により切断され、水素結合により結合された二本鎖部分はヘアピンの一本鎖断片が切断された後、結合力が弱くなりハイブリダイゼーションが解消されるため、ＢＨＱはＰｄｏｔｓ表面から離脱し、ＰｄｏｔｓのＥＣＬを回復させ、センサ電極は強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。図２は、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づくＥＣＬスイッチ原理を示す標的核酸検出の概略図である。

【0066】

ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブをレポータープローブとする場合、酵素反応にＣａｓ酵素とＤＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩとの二重酵素触媒系を使用する必要があり、図３に示すように、標的分子が存在し、Ｃａｓ酵素が活性化される時、まずｄｓＤＮＡの外端に露出した短い一本鎖断片を切断し、さらにエキソヌクレアーゼＩＩＩが活性化され、残りの二本鎖断片を切断し、それによりクエンチャー分子がＰｄｏｔｓ表面から離脱し、ＰｄｏｔｓのＥＣＬを回復させ、センサ電極が強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。図３は、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づく二重酵素触媒ＥＣＬスイッチ原理を示す標的核酸検出の概略図である。

【0067】

上記ＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブについての説明は例示に過ぎず、当業者が分かるように、本発明において使用可能なオリゴヌクレオチドはＤＮＡに限定されず、ＲＮＡ等であってもよい；Ｃａｓ酵素も図面に示すＣａｓ１２ａに限定されず、他の種類のＣａｓ１２酵素又はＣａｓ１３、Ｃａｓ１４酵素も同様に使用することができる。また、上記二本鎖ＤＮＡを切断するための酵素もＥＸＯ ＩＩＩに限定されず、他の本分野で利用可能な切断酵素を使用してもよい。

【0068】

本発明のＥＣＬ検出方法の具体的な工程は例えば以下のとおりである。

【0069】

酵素反応工程：測定されるサンプルをＣａｓタンパク質、ｃｒＲＮＡを含むＣａｓ酵素体系に添加し、サンプル反応溶液を得る。ここで、上記ｃｒＲＮＡは測定されるサンプル中の標的核酸を特異的に識別することができる。

【0070】

Ｐｄｏｔｓチップ作製工程：動作電極に本発明のＥＣＬナノプローブを滴下し、本発明のＰｄｏｔｓチップ（すなわちＥＣＬセンサ、Ｐｄｏｔｓ ＥＣＬチップ）を得る。当然のことながら、当該ＥＣＬチップを使用時に製造することなく、本発明のＥＣＬセンサを直接使用することもできる。該ＥＣＬセンサは好ましくは使い捨て検出チップ（本発明において、“Ｐｄｏｔｓ使い捨て検出チップ”ということもある）である。それは、スクリーン印刷電極に本発明のＥＣＬナノプローブを固定することにより得ることができる。

【0071】

サンプル検出工程：上記サンプル反応溶液をＰｄｏｔｓチップに滴下し、一定の温度で一定の時間インキュベートした後に、電気化学発光信号を採取し、分析を行う。上記の信号スイッチにより、本発明のＥＣＬ検出を実現することができる。

【0072】

＜電気化学発光検出用キット＞
本発明の一実施形態は、標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒系を含む酵素反応溶液と、スクリーン印刷電極に上記電気化学発光ナノプローブが固定されているＰｄｏｔｓ使い捨て検出チップと、を含むＣａｓ酵素に基づく電気化学発光検出用キット（以下、「ＥＣＬ検出用キット」ということもある）に関する。

【0073】

前述したように、本発明のＥＣＬナノプローブにおけるオリゴヌクレオチド鎖が二本鎖ＤＮＡである場合、前記酵素反応溶液はさらにＥＸＯ ＩＩＩ酵素を含んでもよい。

【0074】

また、本発明のＥＣＬ検出用キットは、さらにＥＣＬ検出に必要の他の試薬及び取扱説明書等を含むことができる。

【0075】

以上、実施形態に基づいて本発明の電気化学発光ナノプローブ及びその製造方法及び応用等を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限り、実施の形態に当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される他の形態も、本発明の範囲に含まれる。

【0076】

（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明のＰｄｏｔｓナノ粒子、ＥＣＬナノプローブ、ＥＣＬ検出方法等を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0077】

実施例で使用された試薬、実験方法及び使用される装置は以下のとおりである。
（１）試薬
ＥｎＧｅｎ（登録商標）Ｌｂａ Ｃａｓ１２ａはNew England Biolabs (Ipswich, MA, UK)から購入した。
ポリスチレン無水マレイン酸（ＰＳＭＡ、平均Ｍｗ：１７００）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均Ｍｗ：３３５０）、及び１－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）はいずれもSigma-Aldrich Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入した。
ポリ［（９,９－ジオクチルフルオレニル－２,７－ジイル）－ｃｏ－（１,４－ベンゾ－｛２,１’,３｝－チアゾール）］（ＰＦＢＴ）及びトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ、］９８％）はJ&K Chemical Ltd. (Beijing, China)から購入した。
使い捨てスクリーン印刷電極は、Nanjing Jingjie Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China)から購入した。
表１に記載の全てのオリゴヌクレオチドはいずれもSangon Bioengineering Co. Ltd. (Shanghai, China)から購入した。
また、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ ７．４）はＫＨ_２ＰＯ_４とＮａ_２ＨＰＯ_４の貯蔵溶液を混合することにより調製される。

【0078】

実施例で使用されるオリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである。

【0079】

【表1】

【0080】

（２）実験方法及び装置
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、ＴＥＣＮＡＩＧ２Ｆ ２０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、ＵＳＡ）により得られる。

【0081】

ゼータ電位は、９０ Ｐｌｕｓ ＤｙｎａＰｒｏ ＮａｎｏＳｔａｒ（Brookhaven Instrument Corporation，USA）を用いて記録される。

【0082】

紫外吸収スペクトルは、ＵＶ－３６００分光光度計（日本島津）により得られる。

【0083】

サイクリックボルタンメトリー実験は、ＣＨＩ ６３０Ｄ電気化学ワークステーション（CHI instruments Inc., China）で行われる。

【0084】

ＥＣＬ実験は、ＭＰＩ－ＥＩＩ ＥＣＬ分析器（Xi’an Remex, China）の自製反応槽で行われ、該分析器は三電極システムを採用する。

【0085】

実施例１：ＥＣＬナノ材料の製造
１．ＰＦＢＴ Ｐｄｏｔｓの製造
製造プロセスは、発明者が発表した文章Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１８、９０、７７０８－７７１４を参照する。

【0086】

まず、１ ｍｇのＰＦＢＴ及びＰＳＭＡをそれぞれ１ ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解して１ ｍｇ／ｍＬのＰＦＢＴ及びＰＳＭＡを調製した。次に、５００μＬのＰＦＢＴ（１ ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのＰＳＭＡ（１ ｍｇ／ｍＬ）を取って９．４ ｍＬのＴＨＦに添加し、混合し、超音波で２０分間脱気し、前駆体溶液を得た。さらに５回に分けて超音波条件下で２ ｍＬの前駆体溶液をそれぞれ８ ｍＬの超純水に迅速に注入し、３分間超音波処理した後に、回転蒸留により余分な超純水及びテトラヒドロフランを除去した。最後に、孔径０．２２μｍのポリエーテルスルホンシリンジを用いて濾過し、ＰＦＢＴ－Ｐｄｏｔｓを製造した。

【0087】

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により製造されたＰＦＢＴ Ｐｄｏｔｓ形態を解析し、結果を図４に示す。図４は、実施例１で製造されたＰＦＢＴ ＰｄｏｔｓのＴＥＭ解析結果を示す図である。図４に示すように、Ｐｄｏｔｓナノ粒子は、良好な規則的な球状を呈し、大きさが均一であり、その平均粒径が２４ ± ２ ｎｍである。

【0088】

２．ＥＣＬナノプローブの製造
１）核酸で修飾されたＰＦＢＴ Ｐｄｏｔｓプローブの製造
ａ．ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの製造
６００μＬのＰＦＢＴ Ｐｄｏｔｓ、１２μＬの５％ ＰＥＧ及び１２μＬの１ Ｍ ＨＥＰＥＳを取って振動して均一に混合した後に、０．１ Ｍ ＮａＯＨでＰＨを７．３に調整した。さらに１２μＬの１０ ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ及び３μＬの１０ ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳを添加し、３０ ｍｉｎ発振して均一に混合した。次に、１０μＬの１００μＭ ｓｓＤＮＡを添加し、２００ ｒｐｍで４８ ｈ撹拌した後に、３０ ｋｄ限外濾過管で限外濾過して遊離ｓｓＤＮＡ（１００００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ／回、８回繰り返す）を除去し、ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓを得た。

【0089】

ｂ．ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの製造
６００μＬのＰＦＢＴ Ｐｄｏｔｓ、１２μＬの５％ ＰＥＧ及び１２μＬの１ Ｍ ＨＥＰＥＳを取って振動して均一に混合した後に、０．１ Ｍ ＮａＯＨでＰＨを７．３に調整した。さらに１２μＬの１０ ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ及び３μＬの１０ ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳを添加し、１０ ｍｉｎ発振して均一に混合した。次に、１０μＬの１００μＭ ｈａｉｒｐｉｎＤＮＡを添加し、２００ ｒｐｍで４８ ｈ撹拌した後に、３０ ｋｄ限外濾過管で限外濾過して遊離ｈａｉｒｐｉｎＤＮＡ（１００００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ／回、８回繰り返す）を除去し、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓを得た。

【0090】

ｃ．ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの製造
６００μＬのＰＦＢＴ Ｐｄｏｔｓ、１２μＬの５％ ＰＥＧ及び１２μＬの １ Ｍ ＨＥＰＥＳを取って振動して均一に混合した後に、０．１ Ｍ ＮａＯＨでＰＨを７．３に調整した。さらに１２μＬの１０ ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ及び３μＬの１０ ｍｇ／ｍＬのＮＨＳを添加し、１０ ｍｉｎ発振して均一に混合した。次に、６０μＬの１５．５μＭ ｄｓＤＮＡを添加し、２００ ｒｐｍで４８ ｈ撹拌した後に、３０ ｋｄ限外濾過管で限外濾過して遊離ｄｓＤＮＡを除去し（１００００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ／回、８回繰り返す）、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓを得た。

【0091】

なお、上記ｓｓＤＮＡ、ｈａｉｒｐｉｎＤＮＡ、ｄｓＤＮＡは、表１に示すように、いずれもクエンチャー分子ＢＨＱ２が予め連結されている。

【0092】

ｄ．ＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの特性解析
合成されたｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓに対して紫外線及びＤＬＳ解析を行い、結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。図５Ａは、実施例１で製造されたＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの紫外の解析結果を示す図である。図５Ｂは、実施例１で製造されたＤＮＡ－ＰｄｏｔｓのＤＬＳの解析結果を示す図である。

【0093】

図５Ａから分かるように、Ｐｄｏｔｓより、ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ（図示せず）、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓはいずれも２６０ ｎｍにＤＮＡの特性ピークを有する。また、図５Ｂから分かるように、Ｐｄｏｔｓより、ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ（図示せず）、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの吸収及び粒径はいずれも増加した。これらの結果はｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓの合成が成功したことを示す。

【0094】

実施例２：Ｃａｓ１２ａ変換触媒に基づく信号スイッチの検証及びＨＰＶ ＤＮＡの検出
１）信号スイッチの原理
ａ．基本原理
オリゴヌクレオチド鎖（上記のｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ及びｈＤＮＡ）の末端にＢＨＱが修飾されているため、ＰｄｏｔｓはＥＣＬ ＯＦＦ状態である。標的分子が存在せず、Ｃａｓ酵素が標的分子により活性化されない場合、ＢＨＱで修飾されたオリゴヌクレオチド鎖がＰｄｏｔｓ表面から離脱することがなく、センサ電極が低ＥＣＬ強度を表示する（ＥＣＬ ＯＦＦ）。逆に、標的分子が存在し、Ｃａｓ酵素が活性化される場合、その連帯切断活性によりオリゴヌクレオチド鎖が切断され、これによりＢＨＱがＰｄｏｔｓ表面から離脱し、ＰｄｏｔｓのＥＣＬを回復させ、センサ電極が強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。

【0095】

ｂ．ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づくＥＣＬスイッチ
ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓをレポータープローブとする場合、ｓｓＤＮＡ及びｈＤＮＡはいずれも一本鎖ＤＮＡ断片であり、上記ａに示すように、標的分子が存在し、Ｃａｓ酵素が活性化される時、連帯切断活性により一本鎖ＤＮＡが切断されるため、クエンチャー分子がＰｄｏｔｓ表面から脱離する。

【0096】

ｈＤＮＡ断片において、図２に示すように、ヘアピンの環状一本鎖断片はまずＣａｓ酵素により切断され、水素結合により結合された二本鎖部分は一本鎖が切断された後、結合力が弱くなり、ハイブリダイゼーションが解消されるため、ＢＨＱはＰｄｏｔｓ表面から離脱し、ＰｄｏｔｓのＥＣＬを回復させ、センサ電極は強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。

【0097】

ｃ．ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づく二重酵素触媒ＥＣＬスイッチ
ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブをレポータープローブとする場合、標的分子が存在し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化される時、まずｄｓＤＮＡの外端に露出した短い一本鎖断片を切断し、さらにエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥＸＯ ＩＩＩ）が活性化され、残りの二本鎖断片を切断し、それによりＢＨＱがＰｄｏｔｓ表面から離脱し、ＰｄｏｔｓのＥＣＬを回復させ、センサ電極が強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。

【0098】

２）信号スイッチの検証
１．ＥＣＬセンサ電極の製造
それぞれ２μｌのｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓをスクリーン印刷電極の表面に滴下し、乾燥して固定し、ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓのセンサ電極を製造する。

【0099】

２．検出
ａ．ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ又はｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づくＥＣＬ検出
まず、５０ｎＭ Ｃａｓ１２ａタンパク質及び０．２５μＭ ｃｒＲＮＡを含有するサンプル反応溶液を調製した。１９μＬのサンプル反応溶液に１μＬのＨＰＶ１６ ＤＮＡを添加し、均一に混合し、Ｃａｓ１２ ａ検出溶液を調製した。

【0100】

次に、４μＬのＣａｓ１２ａ検出溶液を取り、それぞれｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ及びｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓセンサ電極の表面に滴下し、３７℃で１ｈインキュベートし、１ｘＰＢＳで洗浄し、自然乾燥する。

【0101】

最後に、ＥＣＬ検出電解液（０．１Ｍ ＴＰｒＡと０．１Ｍ ＫＮＯ_３を含む０．１Ｍ ｐＨ ７．４ ＰＢＳ）にＥＣＬ応答を記録した。ここで、ＥＣＬ検出はサイクリックボルタンメトリーを用いて、０から＋１．５０ Ｖまで走査し、走査速度は１００ ｍＶ／ｓである。

【0102】

ｂ．ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づく二重酵素触媒ＥＣＬ検出
まず、上記のようにＣａｓ１２ａ検出溶液（５０ ｎＭ Ｃａｓ１２ａ、０．２５μＭ ｃｒＲＮＡ、５０ ｎＭ ＨＰＶ１６ ＤＮＡを含む１０倍希釈のＢｕｆｆｅｒＩＩ）を調製した。

【0103】

次に、４μｌのＣａｓ１２ａ検出溶液を取り、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓセンサ電極の表面に滴下し、３７℃で１時間インキュベートし、１ｘＰＢＳで洗浄し、自然乾燥する。

【0104】

次に、３μｌのＥＸＯ ＩＩＩ溶液（１００Ｕ／ｍｌ ＥＸＯ ＩＩＩを含む１０倍希釈のＢｕｆｆｅｒ Ｉ）をセンサ電極の表面に滴下し、３７℃で、３０分間インキュベートし、１ｘＰＢＳで洗浄する。

【0105】

最後に、ＥＣＬ検出電解液（０．０２５Ｍ ＴＰｒＡと０．１Ｍ ＫＮＯ_３を含有する０．１Ｍ ｐＨ ７．４ ＰＢＳ）にＥＣＬ応答を記録した。具体的なＥＣＬ検出条件は以下のとおりである。
検出方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：０Ｖ
走査速度：１００ ｍＶ／ｓ
ＰＭＴ：高圧５００Ｖ

【0106】

ＥＣＬ検出結果を図６Ａ～図６Ｃに示す。図６Ａ～図６Ｃは、実施例２で製造された異なるＥＣＬセンサ電極の酵素活性化前後でのＥＣＬ強度の比較結果を示す図である。ここで、図６ＡはｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極のＣａｓ酵素活性化前後のＥＣＬ強度の比較結果を示す図であり、図６ＢはｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極のＣａｓ酵素活性化前後のＥＣＬ強度の比較結果を示す図であり、図６ＣはｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極の二重酵素活性化前後のＥＣＬ強度の比較結果を示す図である。

【0107】

図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃから分かるように、上記異なるＰｄｏｔｓナノプローブで修飾されたセンサ電極を使用する場合、ＥＣＬ強度はいずれも低下し、酵素が標的核酸により活性化された後にＥＣＬ強度はいずれも回復する。この結果は、本発明のＰｄｏｔｓナノプローブに基づく直接式ＥＣＬスイッチ体系の実行可能性を表明した。

【0108】

また、図６Ｂから分かるように、Ｐｄｏｔｓ修飾電極に比べて、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極のＥＣＬ強度が～２０％に低下し、センサ界面がＥＣＬ ＯＦＦ状態であることを表明した。１μＭの標的分子を添加する場合、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化され、ＥＣＬ ＯＮ応答を発生し、修飾電極のＥＣＬ強度が～８０％に回復した。すなわち、ｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極は、ｓｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極より良好な検出感度を示した。該結果は、ヘアピン構造のｓｓＤＮＡにおいて、クエンチャー分子がＰｄｏｔｓに近いため、より良好な信号消光効果を有し、より強い信号増幅を有すると考えられる。

【0109】

図６Ｃから分かるように、Ｐｄｏｔｓ修飾電極に比べて、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓ修飾電極のＥＣＬ強度が～３０％低下し、センサ界面がＥＣＬ ＯＦＦ状態であることを表明した。１μＭの標的分子を添加する場合、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化され、Ｃａｓ１２ａ－ＥＸＯ ＩＩＩ二重酵素による切断反応を起動し、ＥＣＬ ＯＮ応答を生成し、修飾電極のＥＣＬ強度が～６５％に回復した。この結果は、ｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブに基づく二重酵素触媒ＥＣＬスイッチ体系の実行可能性だけでなく、良好な検出感度を有することを表明した。ｄｓＤＮＡ構造はｈＤＮＡ構造と類似するため、クエンチャー分子は直鎖のｓｓＤＮＡよりもＰｄｏｔｓに近いため、同様に良好な検出感度を有すると考えられる。また、該検出にＣａｓ酵素及びエキソヌクレアーゼという二重酵素切断システムを採用するため、二重酵素切断システムの高活性に役立ち、ＥＣＬ信号を取得するのに必要な時間がより短くなった（３０分間より小さい）。

【0110】

ｃ．検出性能実験
上記のように製造されたｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓセンサ電極を用いて、異なる濃度のＨＰＶ １６ ＤＮＡを検出した。図７は、実施例２で製造されたｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓセンサ電極を用いてＨＰＶ １６ ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図７に示すように、ＨＰＶ１６ ＤＮＡ濃度が１０ ｐＭに達する時に依然として応答があり、本発明の製造されたＥＣＬナノプローブ及びＥＣＬセンサが実際に標的核酸の検出に用いられることを表明した。

【0111】

産業上の利用可能性
上記実施例から分かるように、本発明で製造されたＥＣＬナノプローブ、特にｈＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブ及びｄｓＤＮＡ－Ｐｄｏｔｓナノプローブは、Ｃａｓ酵素システムと組み合わせることにより、ＥＣＬ信号をオフからオンに切り替えることができ、それにより増幅する必要がなく、高感度、高精度及び特異性を有しかつ高柔軟性を有する電気化学発光検出方法を提供することができる。また、本発明のＥＣＬナノプローブはさらに使い捨て検出チップ、例えば、使い捨てプラスチックチップまたは紙基チップに製造することができるため、ＰＯＣＴに役立ち、便利で、迅速な核酸検出を実現することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【配列表】

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