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特開2024-177109電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024177109
(43)【公開日】2024-12-19
(54)【発明の名称】電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6837 20180101AFI20241212BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241212BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20241212BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20241212BHJP
C12Q 1/6834 20180101ALI20241212BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20241212BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241212BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6837 Z
C12M1/34 B
C12M1/42
C12Q1/34
C12Q1/6834 Z
G01N21/78 C
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024090811
(22)【出願日】2024-06-04
(31)【優先権主張番号】202310682568.5
(32)【優先日】2023-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】594164542
【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001771
【氏名又は名称】弁理士法人虎ノ門知的財産事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウー シァオティン
(72)【発明者】
【氏名】シュ チチ
(72)【発明者】
【氏名】ファン ハオ
(72)【発明者】
【氏名】ゥアン チャオ
(72)【発明者】
【氏名】ヂィー フアンシィェン
(72)【発明者】
【氏名】ウー ヂィエ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029CC03
4B029FA15
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR55
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX04
(57)【要約】
【課題】検出範囲が広く感度が高い電気化学発光ナノプローブを提供することである。
【解決手段】実施形態の電気化学発光ナノプローブの製造方法は、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させ、ホット励起子ナノ粒子を合成するホット励起子ナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程と、を含む。
【選択図】図１
【解決手段】実施形態の電気化学発光ナノプローブの製造方法は、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させ、ホット励起子ナノ粒子を合成するホット励起子ナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程と、を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させ、ホット励起子ナノ粒子を合成するホット励起子ナノ粒子合成工程と、
クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程と、
を含む、電気化学発光ナノプローブの製造方法。
クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程と、
を含む、電気化学発光ナノプローブの製造方法。
【請求項2】
前記ホット励起子有機発光分子は、下記の化学式（１）の群（ａ）から選ばれるドナー（Ｄ）構造と下記の化学式（２）の群（ｂ）から選ばれるアクセプター（Ａ）構造とを含む、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【化1】
【化2】
【請求項3】
前記ドナー（Ｄ）は、カルバゾールであり、
前記アクセプター（Ａ）は、ベンゾチアジアゾールである、
請求項２に記載の製造方法。
前記アクセプター（Ａ）は、ベンゾチアジアゾールである、
請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記ホット励起子有機発光分子は、下記の化学式（３）のＢＣｚＰ－ＢＴである、
請求項３に記載の製造方法。
請求項３に記載の製造方法。
【化3】
【請求項5】
前記コポリマー分子は、下記の化学式（４）に示すポリスチレン－ポリアクリル酸ブロック共重合体（PS-PAA）、ポリスチレン無水マレイン酸共重合体（PSMA）、およびポリ（イソブチレン－alt－無水マレイン酸）（PIMA）のうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【化4】
【請求項6】
前記ホット励起子有機発光分子と前記コポリマー分子は、ナノ共沈法によりホット励起子ナノ粒子を合成する、
請求項５に記載の製造方法。
請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
前記ホット励起子ナノ粒子は、ナノボール、ナノチューブ、ナノロッド、およびナノオニオンのうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項8】
前記クエンチャー分子は、ブラックホールクエンチャー、ダーククエンチャー、およびアミン反応性クエンチャーのうちの一つである、
請求項１に記載の製造方法。
請求項１に記載の製造方法。
【請求項9】
ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子とが重合されたホット励起子ナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたホット励起子ナノ粒子である、
電気化学発光ナノプローブ。
電気化学発光ナノプローブ。
【請求項10】
ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子とが重合されたホット励起子ナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたホット励起子ナノ粒子である電気化学発光ナノプローブが滴下された動作電極である、
電気化学発光センサ。
電気化学発光センサ。
【請求項11】
前記動作電極は、ガラス炭素電極、酸化インジウムスズ電極、およびスクリーン印刷電極のうちの一つである、
請求項１０に記載の電気化学発光センサ。
請求項１０に記載の電気化学発光センサ。
【請求項12】
前記動作電極は、金－酸化インジウムスズ電極である、
請求項１１に記載の電気化学発光センサ。
請求項１１に記載の電気化学発光センサ。
【請求項13】
ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子とが重合されたホット励起子ナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたホット励起子ナノ粒子である電気化学発光ナノプローブが滴下された動作電極である電気化学発光センサを用いた、
電気化学発光検出方法。
電気化学発光検出方法。
【請求項14】
測定されるサンプルを標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒体系に添加し、サンプル反応溶液を得る酵素反応工程と、
前記サンプル反応溶液を前記電気化学発光センサに添加し、電気化学発光信号を採取し、分析するサンプル検出工程と、
を更に含む、請求項１３に記載の電気化学発光検出方法。
前記サンプル反応溶液を前記電気化学発光センサに添加し、電気化学発光信号を採取し、分析するサンプル検出工程と、
を更に含む、請求項１３に記載の電気化学発光検出方法。
【請求項15】
前記サンプル反応溶液において、Ｃａｓ酵素におけるＣａｓタンパク質の濃度が４０ｎＭ以上である、
請求項１４に記載の電気化学発光検出方法。
請求項１４に記載の電気化学発光検出方法。
【請求項16】
ｃｒＲＮＡの使用量がＣａｓタンパク質より多い、
請求項１４に記載の電気化学発光検出方法。
請求項１４に記載の電気化学発光検出方法。
【請求項17】
前記電気化学発光センサ上でのサンプル反応溶液のインキュベーション時間が３０分以上である、
請求項１３に記載の電気化学発光検出方法。
請求項１３に記載の電気化学発光検出方法。
【請求項18】
ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子とが重合されたホット励起子ナノ粒子であって、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖が修飾されたホット励起子ナノ粒子である電気化学発光ナノプローブが滴下された動作電極である電気化学発光センサと、
Ｃａｓ酵素含有検出試薬と、
を含む、電気化学発光検出用キット。
Ｃａｓ酵素含有検出試薬と、
を含む、電気化学発光検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
エレクトロルミネセンス（ＥＬ）とは発光材料が電界によって、電流電圧の励起を受けて発光する現象であり、直接的に電気エネルギーを光エネルギーに変換する過程である。有機エレクトロルミネセンスとは、有機発光物質から作製された薄膜素子が電界の励起により発光する現象をいう。有機エレクトロルミネセンス素子の発光原理は、外部電圧の駆動で、電極から注入された電子及び正孔は有機物中で複合してエネルギーを放出し、エネルギーを有機発光物質の分子に伝達し、それを励起させ、基底状態から励起状態に遷移し、励起分子が励起状態から基底状態に戻る時に放射遷移して発光現象を発生することである。励起状態は、スピン多重性の違いによって、一重項（Ｓ）励起子と三重項（Ｔ）励起子とに分けることができる。励起状態の分子は最低エネルギーの一重項励起状態Ｓ１又は三重項励起状態Ｔ１であってもよく、より高い一重項励起状態（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、…）又は三重項励起状態（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、…）であってもよい。Ｓ１励起状態にある分子が放射遷移によりＳ０基底状態に戻る場合、「蛍光発光」を発生する。Ｔ１励起状態にある分子が放射遷移によりＳ０基底状態に戻ると、「燐光発光」を発生する（図１９参照）。図１９は、混成局所－電荷移動励起状態（ＨＬＣＴ）性質を有するホット励起子材料の発光原理を示す模式図である。
【0003】
電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）技術は電気化学的原理を利用して電極表面で電気化学反応を行って励起状態を生成して特異的な発光を起こす方法である。電気化学発光過程における励起状態は、電気活性物質と電極との間で電子伝達して形成された中間体ラジカルの間で電子移動反応が起こることにより生じる。
【0004】
電気化学発光系は発光試薬に応じて金属錯体電気化学発光系と有機化合物電気化学発光系（以下、「有機発光材料」ということもある）、例えば有機フルオレン等の芳香族炭化水素、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、フルオレン系ポリマー及び様々な有機ナノ材料等に分けることができる。一般的な電気化学発光金属錯体には、例えばトリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）があり、それは燐光発光系に属し、それをＥＣＬ発光プローブとして用いる場合、励起子利用率は１００％に達することができるため、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）に基づく電気化学発光検出方法は、電気化学発光検出の標準方法となる。一方、上記有機発光材料は蛍光発光系に属し、励起子利用率は２５％しか達成できない。
【0005】
励起状態では、現在、電気化学発光分野で使用される有機発光材料は、主に二種類の伝統的な励起状態方式、すなわち局所励起状態（locally-excited、ＬＥ）及び電荷移動励起状態（charge-transfer、ＣＴ）が存在する。この二種類の励起状態の電子正孔分布及びその形成された励起子の束縛エネルギー特性により、局所励起状態の励起子利用率が低くて放射遷移速度／量子収率（ΦＰＬ）が高く、電荷移動励起状態の励起子利用率が高くて放射遷移速度／量子収率が低く、両者が高い励起子利用率及び高い放射遷移速度／量子収率を同時に両立させることができず、その発光効率及び強度が理想的な最適なレベルに達することができない。これにより、下流の応用、例えば電気化学発光の効率を制限する。
【0006】
２０１２年、馬於光と楊兵等は、革新的に逆項間交差（ＲＩＳＣ）の光物理現象を有機エレクトロルミネセンス材料の設計に応用し、一連の異なる光色のドナー・アクセプター型蛍光材料を成功に発展させた。効果的な高位の逆項間交差過程により、そのエレクトロルミネセンス素子の励起子利用率を大幅に向上させる。ここで、高位の三重項状態（Ｔｎ、ｎ≧２）と一重項状態（Ｓｍ、ｍ≧１）との間の変換過程をホット励起子（ホットエキシトン）過程と呼ばれ、ホット励起子過程に基づいて実現された発光メカニズムはホット励起子メカニズムと呼ばれ、明らかなホット励起子逆項間交差を有する発光材料はホット励起子材料と呼ばれる。ホット励起子材料は一般的に大きいＴｎ－Ｔ１エネルギー準位及び小さいＴｎ－Ｓｍ状態エネルギー準位を有する。大きいＴｎ－Ｔ１エネルギー準位はＴｎからＴ１への内部変換を抑制することができ、小さいＴｎ－Ｓｍエネルギー準位はＴｎからＳｍへの逆項間交差速度を向上させることができる。ＴｎからＳｍへの項間交差とＴｎからＴ１への内部変換は相互に競合するため、理論的には、逆項間交差速度が十分に高く、内部変換が完全に抑制され、全ての高位の三重項励起子が一重項励起子に変換され、ホット励起子材料の励起子利用率が１００％に達することができる（非特許文献１、図１９参照）。これにより、ホット励起子材料は独立した「ホット励起子」チャネルにより逆系間交差（ｈＲＩＳＣ）を実現して一重項Ｓ１励起子の生成割合を増加させることができる。同時に、Ｓ１状態励起子はＣＴ状態の高い励起子利用率を有し、またＬＥ状態の高放射発光特性を有するため、ホット励起子材料は混成局所－電荷移動励起状態（Hybrid Locally-excited and Charge-transfer、ＨＬＣＴ）性質を有し、高い励起子利用率と高い量子収率を同時に有することができる。混成局所－電荷移動励起状態とは局所励起状態（ＬＥ）の性質を含有するだけでなく、電荷移動（ＣＴ）励起状態特性を含むが、局所励起状態と電荷移動励起状態との間は簡単な混合ではなく、混成した後に形成された単一励起状態である。
【0007】
現在、ホット励起子材料は主に半導体材料の分野に用いられ、例えば有機エレクトロルミネセンスダイオード（ＯＬＥＤ）の分野に用いられ（非特許文献２参照）、それは第一世代の有機発光材料（蛍光材料）、第二世代の有機発光材料（燐光材料）、第三世代の有機発光材料（熱活性化遅延蛍光、ＴＡＤＦ）材料に続く新規な発光材料である。
【0008】
ホット励起子材料が優れた光学的性質を有するため、生物検出における応用が望まれている。特許文献１ではホット励起子材料を蛍光検出に用いる試みが行われているが、現在ＥＣＬ検出分野の成功例はまだ存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】中国特許出願公開第１１０９８１８２１号明細書
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】徐玉偉，「ホット励起子発光材料の高位の逆項間交差過程及び光電性能研究」，華南理工大学博士学位論文，２０２０年
【非特許文献2】Xiaojie Chen, Dongyu Ma et al., “Hybridized Local and Charge-Transfer Excited-State Fluorophores through the Regulation of the Donor-Acceptor Torsional Angle For Highly Efficient Organic Light-Emitting Diodes”，CCS Chem. 2022, 4, 1284-1294
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明が解決しようとする課題は、検出範囲が広く感度が高い電気化学発光ナノプローブの製造方法、電気化学発光ナノプローブ、電気化学発光センサ、電気化学発光検出方法、および電気化学発光検出用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
実施形態の電気化学発光ナノプローブの製造方法は、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させ、ホット励起子ナノ粒子を合成するホット励起子ナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
周知のように、有機エレクトロルミネセンスダイオード（ＯＬＥＤ）は全固体素子であり、液体成分がない。有機エレクトロルミネセンスダイオードにおいて、発光分子は外部電圧の作用下で励起されて基底状態から励起状態に遷移し、励起分子が励起状態から基底状態に戻る時に放射遷移して発光を生成する。一方、電気化学発光の検出環境は液状であり、発光分子は電極表面で電気化学反応を起こして励起状態を生成し、放射遷移して発光する。したがって、有機エレクトロルミネセンスダイオードと電気化学発光との両方の発光原理及び発光環境が異なる。現在の有機エレクトロルミネセンスダイオード（ＯＬＥＤ）分野に利用されているホット励起子材料を電気化学発光（ＥＣＬ）検出の発光分子として用いることを考慮する場合、まず実行可能性及び信頼性等の問題が考えられる。
【0015】
本願の発明者らは上記問題に対して鋭意研究を重ねた結果、ホット励起子有機発光分子をナノ技術により電気化学発光ナノプローブ（以下、「ＥＣＬナノプローブ」ということもある）を製造し、かつクエンチャー分子で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を用いて修飾することにより、電気化学発光の全体的な効能を向上させることができ、それにより標的分子に対する迅速な非増幅のハイスループット検出を実現でき、かつ広い検出範囲及び極めて高い感度を有することを見出した。
【0016】
本発明において、初めてホット励起子有機発光分子を電気化学発光の分野に応用し、かつ初めて該ホット励起子有機発光分子を発光体としてナノ粒子を製造し、標的分子に対する迅速な非増幅のハイスループット検出を実現することができ、かつ広い検出範囲及び極めて高い感度を有するホット励起子有機発光分子に基づく電気化学発光（ＥＣＬ）ナノプローブ、該電気化学発光ナノプローブを用いたセンサ、検出方法及び検出用キットを提供することができる。
【0017】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。なお、以下の実施形態についての説明は、本発明の発明構想を説明するためだけであり、本発明を限定するものではない。
【0018】
＜電気化学発光ナノプローブ及びその製造方法＞
本発明の一つの実施態様は、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させ、ホット励起子ナノ粒子を合成するホット励起子ナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程とを含む、電気化学発光ナノプローブの製造方法に関する。
本発明の一つの実施態様は、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させ、ホット励起子ナノ粒子を合成するホット励起子ナノ粒子合成工程と、クエンチャー分子修飾を有するオリゴヌクレオチド鎖を用いて、得られたホット励起子ナノ粒子を修飾し、修飾されたホット励起子ナノ粒子を得るホット励起子ナノ粒子修飾工程とを含む、電気化学発光ナノプローブの製造方法に関する。
【0019】
（ホット励起子有機発光分子）
本発明において使用されるホット励起子有機発光分子は特に限定されず、混成局所－電荷移動励起状態の性質を有するホット励起子有機発光分子であれば、いずれも使用可能であり、例えば非特許文献１、２等に記載の様々なホット励起子有機発光分子である。
本発明において使用されるホット励起子有機発光分子は特に限定されず、混成局所－電荷移動励起状態の性質を有するホット励起子有機発光分子であれば、いずれも使用可能であり、例えば非特許文献１、２等に記載の様々なホット励起子有機発光分子である。
【0020】
ホット励起子材料は混成局所－電荷移動励起状態（Hybrid Locally-excited and Charge-transfer、ＨＬＣＴ）の性質を有する分子である。なお、混成局所－電荷移動励起状態を有する分子は必ずしもホット励起子材料ではなく、例えば一重項材料及び三重項材料は混成局所－電荷移動励起状態の性質を有するが、ホット励起子材料に属しない。
【0021】
ホット励起子材料は、一般に、構造単位として一次元の縮合環構造を有し、ヘテロ原子を含むドナーセルを有する。
【0022】
縮合環構造としては、例えばベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環等が挙げられ、これらのベンゼン環、ナフタレン環及びアントラセン環に置換基を有していてもよい。
ドナー・アクセプター単位の具体的な構成構造として、例えばＤ－Ａ型構造又はＤ－Ａ－Ｄ型構造等であってもよい。Ｄはドナー単位（ｄｏｎｏｒ）を示し、Ａはアクセプター単位（Ａｃｃｅｐｔｏｒ）を示す。
ドナー・アクセプター単位の具体的な構成構造として、例えばＤ－Ａ型構造又はＤ－Ａ－Ｄ型構造等であってもよい。Ｄはドナー単位（ｄｏｎｏｒ）を示し、Ａはアクセプター単位（Ａｃｃｅｐｔｏｒ）を示す。
【0023】
ドナー・アクセプター単位としては、例えば下記の化学式（１）の群（ａ）から選択されるドナー（Ｄ）と下記の化学式（２）の群（ｂ）から選択されるアクセプター（Ａ）で構成されたものが挙げられる。
【0024】
【化1】
【0025】
【化2】
【0026】
ホット励起子材料は伝統的なの蛍光材料スピン統計制限を突破した一種の発光材料であり、放射される光の種類では、青色光ホット励起子材料、緑色光ホット励起子材料及び赤色光ホット励起子材料を含む。
【0027】
ホット励起子材料のドナー・アクセプター強度が適切であるため、Ｄ－Ａ型蛍光材料の分子設計において、純青色及び深い青色光の発光をより容易に得る。現在の成功的に製造された青色光ホット励起子材料は、例えばフェナントレンイミダゾール（Phenanthrimidazole）単位含有青色光ホット励起子材料、アントラセン単位含有青色光ホット励起子材料及び他の種類の青色光ホット励起子材料を有する。
【0028】
フェナントレンイミダゾール単位を含む青色光ホット励起子材料としては、例えば下記の化学式（３）および化学式（４）に示すフェナントレンイミダゾール単位含有青色光ホット励起子材料が挙げられる。
【0029】
【化3】
【0030】
【化4】
【0031】
アントラセン単位含有青色光ホット励起子材料としては、例えば下記の化学式５に示すアントラセン含有単位の青色光ホット励起子材料が挙げられる。
【0032】
【化5】
【0033】
他の種類の青色光ホット励起子材料としては、例えば下記の化学式６に示す他の種類の青色光ホット励起子材料が挙げられる。
【0034】
【化6】
【0035】
代表的な緑色光ホット励起子材料として、例えば下記の化学式７に示す緑色光ホット励起子材料が挙げられる。
【0036】
【化7】
【0037】
代表的な赤色光ホット励起子材料として、例えば下記の化学式８に示す赤色光ホット励起子材料が挙げられる。
【0038】
【化8】
【0039】
また、Ｄ－Ａ－Ｄ型のホット励起子材料では、アクセプター（Ａ）単位とドナー（Ｄ）単位との接続方式は、オルト位接続、メタ位接続及びパラ位接続であってもよい。ここで、パラ位接続時に空間抵抗を減少させることができるため、アクセプター（Ａ）単位とドナー（Ｄ）単位との間のねじれ角が減少し、より局所的に励起された成分を与えることができ、より速い放射減衰をもたらす。ことにより、オルト位及びメタ位より高い外部量子効率（ＥＱＥ）を得ることができるため、より好ましい。例えば、本発明の実施例において、４、７－ビス（４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニル）ベンゾ［ｃ］［１,２,５］チアジアゾール（ｐ－ＢＣｚＰ－ＢＴ）を例示する。該化合物において、電子ドナー（Ｄ）はカルバゾールであり、電子アクセプター（Ａ）はベンゾチアジアゾールである。
【0040】
なお、混成局所－電荷移動励起状態（ＨＬＣＴ）性質を有するホット励起子材料であれば、いずれも本発明において使用することができる。上記の挙げられているホット励起子材料は例示に過ぎず、当業者には明らかなように、上記化合物が一つ又は複数の置換基（例えばアルキル基、ヒドロキシ基、ハロゲン等）で置換されて形成された誘導体、及びそれらの空間異性体等は、本発明において同様に使用することができる。
【0041】
本発明で使用されるホット励起子材料の製造方法は特に限定されず、例えば鈴木カップリング反応、シェラーカップリング反応及びクロスカップリング反応などの合成経路を介して化学反応により合成することができ、又は商業的な経路で購入することができ、特に限定されない。
【0042】
本発明の実施例では鈴木カップリング反応の合成経路を採用したが、必要に応じて他の合成経路を採用してもよい。鈴木カップリング反応はよく利用される炭素炭素結合形成反応であり、それはゼロ価パラジウムを触媒とし、アリール又はアルケニルボロン酸を塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン化芳香族炭化水素と反応させる。パラジウム触媒としては、例えばテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）、Ｐｄ［Ｐ（ｏ－ｔｏｌｙ）３］３及びＢｕｃｈｗａｌｄ触媒などを用いることができる。アリール又はアルケニルボロン酸、及びハロゲン化芳香族炭化水素として、必要に応じて合成されるホット励起子有機発光分子中の電子ドナー（Ｄ）及び電子アクセプター（Ａ）に応じてそれぞれ対応する化合物原料を採用することができ、特に限定されない。
【0043】
（ホット励起子ナノ粒子の合成）
本発明において、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させることにより、ホット励起子ナノ粒子を合成する。
本発明において、ホット励起子有機発光分子とコポリマー分子を重合させることにより、ホット励起子ナノ粒子を合成する。
【0044】
本発明におけるナノ粒子とは三次元空間において少なくとも一次元がナノサイズ（０．１～１００ ｎｍ）にある粒子を指す。前記ナノ粒子は具体的にはナノボール、ナノチューブ、ナノロッド、又はナノオニオン等の様々な幾何学的形態であってもよい。ホット励起子有機発光分子をナノ形態に形成することにより、ＥＣＬ応答信号を効果的に増幅し、ＥＣＬセンサの検出限界、検出範囲、選択性及び安定性等を向上させることができる。本発明では、後述する実施例のように、ナノロッド（ｎａｎｏｒｏｄｓ、ＮＲ）形態の材料を成功的に製造したが、本発明において使用可能なナノ粒子はナノロッドに限定されず、採用される化合物原料及び合成経路によってナノボールなどの他のナノ形態を形成することもできる。
【0045】
本発明において、ホット励起子有機発光分子と前記コポリマー分子は、従来の技術における既知の有機材料ナノ構造を製造する方法により合成することができ、例えばナノ共沈法、マイクロエマルション法及び自己組織化法等（劉栄華、新規な蛍光共役重合体ナノ粒子の製造及び応用、北京科技大学博士学位論文、２０１８年）は、特に限定されない。ここで、生体適合性の観点から、マイクロエマルション法及びナノ共沈法を用いることがより好ましい。
【0046】
マイクロエマルション法では、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）等のポリエチレングリコール系分子、生体高分子例えばリン脂質等の無毒性、非免疫原性の親水性ポリマーで発光分子を被覆することにより、生体適合性が高く、安定性が高い発光分子ナノ粒子を得ることができる。
【0047】
ナノ共沈法は発光分子を良溶媒に溶解し、超音波条件下で大量の貧溶媒を注入し、発光分子の溶解度が急激に低下して凝集し、それにより小粒子の形で沈殿し、その後に残留した有機溶媒を除去すれば発光分子ナノ粒子を得る。ナノ共沈法は操作しやすくかつ製造されたナノ粒子のサイズが小さくかつ均一であるため、好ましい。
【0048】
ナノ共沈法において、両親媒性ポリマーを用いて発光分子ナノ粒子を表面機能化することができる。製造プロセスにおいて、発光分子と両親媒性ポリマーは自己組織化し、両親媒性ポリマーの一端は疎水性機能性基を有し他端は親水性機能性基を有するため、両親媒性ポリマーで被覆された発光分子ナノ粒子を得ることができ、かつ両親媒性ポリマーの機能性基（例えばアミノ基及びカルボキシル基）はナノ粒子の外表面に露出し、これにより表面機能化された発光ナノ粒子を得る。核酸、ポリペプチド、糖、タンパク質又は抗体等の機能性基は、縮合反応又は生物直交クリック反応により上記両親媒性ポリマーのナノ粒子の外表面に露出する官能基と反応し、識別機能を有する発光分子ナノ粒子を得ることができる。
【0049】
本発明において、上記両親媒性ポリマーはコポリマー分子とも呼ばれる。コポリマー分子として、本分野のよく用いられるコポリマー分子、例えば下記の化学式９に示すポリスチレン－ポリアクリル酸ブロック共重合体（ＰＳ－ＰＡＡ）、ポリスチレン無水マレイン酸共重合体（ＰＳＭＡ）又はポリ（イソブチレン－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＩＭＡ）等を使用することができ、特に限定されない。
【0050】
【化9】
【0051】
ナノ共沈法により得られたナノ粒子の直径は最小で１ ｎｍ～２ ｎｍに達することができる。
【0052】
なお、ホット励起子ナノ粒子の表面機能化修飾は上記の両親媒性ポリマーによる修飾方法に限定されず、直接機能化法（即ち、アルコキシ鎖、アミノ／カルボキシル基、又は標的機能を有する生体分子等の官能基を共有結合の方法により発光分子に直接修飾する）、物理的被覆（即ち、リン脂質又は二酸化ケイ素等でナノ粒子を被覆する）等の他の修飾方法を採用することができる。
【0053】
発光分子ナノ粒子を表面機能化することにより、ナノ粒子１個あたりの表面に大量の官能基を有することができ、さらに大量のオリゴヌクレオチドを結合することができるため、電気化学信号を増幅し、ＥＣＬ検出の感度を向上させることができる。
【0054】
（ホット励起子ナノ粒子の修飾）
本発明において、ホット励起子ナノ粒子の修飾とは、ホット励起子ナノ粒子のオリゴヌクレオチド修飾を指し、具体的には、クエンチャー分子で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を用いて上記表面機能化されたホット励起子ナノ粒子を修飾し、オリゴヌクレオチドで修飾されたホット励起子ナノ粒子（以下、「ＥＣＬナノプローブ」ということもある）を得る。
本発明において、ホット励起子ナノ粒子の修飾とは、ホット励起子ナノ粒子のオリゴヌクレオチド修飾を指し、具体的には、クエンチャー分子で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖を用いて上記表面機能化されたホット励起子ナノ粒子を修飾し、オリゴヌクレオチドで修飾されたホット励起子ナノ粒子（以下、「ＥＣＬナノプローブ」ということもある）を得る。
【0055】
オリゴヌクレオチドとホット励起子ナノ粒子との結合方式は共有結合反応（例えばＮＨ２－ＣＯＯＨによる架橋）に限らず、静電作用、親和吸着等の他の結合方式によりもよい。
【0056】
修飾に用いられるオリゴヌクレオチド鎖は二本鎖オリゴヌクレオチド鎖（例えばｄｓＤＮＡなど）であってもよく、一本鎖オリゴヌクレオチド鎖（例えばＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ）などであってもよく、具体的には使用されるＣａｓ酵素の種類に応じて適宜選択することができる。
【0057】
また、Ｃａｓ酵素による連帯切断活性が非特異的であるため、オリゴヌクレオチド鎖を構成するヌクレオチド配列は特に限定されず、任意の配列であればよい。オリゴヌクレオチド鎖の長さも特に限定されず、クエンチャー分子をホット励起子ナノ粒子に結合でき、且つクエンチャー分子とホット励起子ナノ粒子との間に共鳴エネルギー移動を発生させることができればよく、従来技術でよく用いられている様々な連結用のオリゴヌクレオチド鎖を参照して設計することができる。
【0058】
Ｃａｓ酵素による切断の感度の観点から、前記オリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドの数は多く過ぎない方がよく、単本鎖として、好ましくは３～２０個、より好ましくは４～１１個、さらに好ましくは５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個である。
【0059】
本発明のオリゴヌクレオチド鎖にはクエンチャー分子が修飾されている。クエンチャー分子の動的消光は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）又は衝突消光により発生する。クエンチャー分子は光吸収とホット励起子ナノ粒子の蛍光放射とが重なるため、共鳴エネルギーは励起されたナノ粒子からクエンチャー分子に転移することができ、ホット励起子有機発光分子の発射を消光することができる。
【0060】
前記クエンチャー分子は本分野の一般的に用いられる共鳴エネルギー転移特性を有するクエンチャー分子を使用することができ、特に限定されず、例えばブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ試薬、即ちＢＨＱ系クエンチャー）、ダーククエンチャー（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ、例えばＤＡＢＣＹＬシリーズクエンチャー等）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙＴＭクエンチャー（即ちＢＢＱシリーズクエンチャー）、Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙクエンチャー（即ちＢＬＵシリーズクエンチャー）、又はアミン反応性クエンチャー（ＱＳＹシリーズクエンチャー）等を用いることができる。そのうち、ＢＨＱクエンチャーはよく用いられる。これらのクエンチャーはいずれも商業的（例えばＬＧＣ、ＢｉｏｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）等）に得ることができる。
【0061】
クエンチャー分子とオリゴヌクレオチドとの接続方法は特に限定されず、本分野において慣用される方法を使用することができる。また、クエンチャー分子はオリゴヌクレオチドの末端に接続されてもよく、オリゴヌクレオチド配列の中に挿入されてもよい。
【0062】
図１は、本発明の電気化学発光ナノプローブの製造方法を示す模式図である。本発明の実施例１で製造されたホット励起子有機発光分子ＢＣｚＰ－ＢＴ分子を例とし、ホット励起子有機発光分子ＢＣｚＰ－ＢＴ分子をコポリマー分子ＰＳＭＡとナノ共沈法により重合させ、ホット励起子ナノ粒子（ＢＢ ＮＲｓ）を得て、その後末端にクエンチャー分子ＢＨＱが接続されているオリゴヌクレオチドＤＮＡをＮＨ２－ＣＯＯＨの共有結合反応によりホット励起子ナノ粒子に接続し、それにより本発明の電気化学発光ナノプローブ（ＥＣＬナノプローブ）を得る。
【0063】
本発明において、前記クエンチャー分子が修飾されている前記オリゴヌクレオチドは以下に記載のＣａｓ酵素と共に本発明の信号スイッチとして機能する。具体的には、オリゴヌクレオチドが活性化されたＣａｓ酵素により切断されない場合、クエンチャー分子はオリゴヌクレオチドを介してホット励起子ナノ粒子の表面に接続され、ホット励起子有機発光分子に対して消光作用を発揮し、センサ電極は低いＥＣＬ強度（ＥＣＬ ＯＦＦ）を表示する。一方、オリゴヌクレオチドが活性化されたＣａｓ酵素により切断された時に、クエンチャー分子はホット励起子ナノ粒子の表面から離脱し、それによりセンサ電極は強いＥＣＬ信号（ＥＣＬ ＯＮ）を表示する。
【0064】
＜電気化学発光センサ＞
本発明の電気化学発光センサ（以下、「ＥＣＬセンサ」ということもある）は、上記ＥＣＬナノプローブを動作電極に滴下することにより得ることができる。
本発明の電気化学発光センサ（以下、「ＥＣＬセンサ」ということもある）は、上記ＥＣＬナノプローブを動作電極に滴下することにより得ることができる。
【0065】
本発明に使用される動作電極としては、特に限定されず、ＥＣＬ検出に一般的に用いられる電極、例えばガラス炭素電極（ＧＣＥ）、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極、又はスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）等のうちの一種を使用することができる。好ましくは酸化インジウムスズ電極を使用し、より好ましくは三電極システムを使用する。該電極システムには例えば白金ワイヤ対電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極及び酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）動作電極が配置されている。
【0066】
また、本発明が後文の実施例で検証されたように、金が共反応剤トリプロピルアミンなどに対して良好な触媒効果を有するため、ＩＴＯ電極に比べて、金－酸化インジウムスズ（Ａｕ－ＩＴＯ）電極はさらにＥＣＬ信号を増強することができるため、本発明においてＡｕ－ＩＴＯ電極を使用することがより好ましい。
【0067】
＜電気化学発光検出方法＞
本発明の電気化学発光検出方法（以下、「ＥＣＬ検出方法」ということもある）は、上述したＥＣＬセンサを用いる。また、本発明のＥＣＬ検出方法は、測定されるサンプルを標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒体系に添加し、サンプル反応溶液を得る酵素反応工程と、前記サンプル反応溶液を前記電気化学発光センサに添加し、電気化学発光信号を採取し、分析するサンプル検出工程とをさらに含んでもよい。
本発明の電気化学発光検出方法（以下、「ＥＣＬ検出方法」ということもある）は、上述したＥＣＬセンサを用いる。また、本発明のＥＣＬ検出方法は、測定されるサンプルを標的核酸と結合可能なガイド核酸を含むＣａｓ酵素触媒体系に添加し、サンプル反応溶液を得る酵素反応工程と、前記サンプル反応溶液を前記電気化学発光センサに添加し、電気化学発光信号を採取し、分析するサンプル検出工程とをさらに含んでもよい。
【0068】
また、本発明のＥＣＬ検出方法において、本発明のＥＣＬセンサをそのまま用いるのではなく、使用時に製造することもできる。この場合、本発明のＥＣＬ検出方法は、本発明のＥＣＬナノプローブを動作電極に滴下して本発明のホット励起子チップ（即ち、ＥＣＬセンサ）を得るホット励起子チップ作製工程をさらに含んでもよい。
【0069】
本発明のＥＣＬ検出方法により、測定されるサンプル中の標的分子を検出することができる。前記測定されるサンプルは特に限定されず、例えば尿、血液、血清、脳脊髄液又は唾液等であってもよい。前記標的分子は特に限定されず、例えば核酸、タンパク質、化学小分子等であってもよい。
【0070】
本発明において、酵素触媒反応又は他の特異的化学反応を標的識別及び信号変換単位として、標的分子を滴下する時、上記酵素反応又は化学反応によりＥＣＬナノプローブの信号スイッチ状態を変更することができ、それにより標的信号に対する定性又は定量検出を実現する。
【0071】
酵素触媒反応に使用される酵素として、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素中の連帯切断活性（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）を有するＣａｓ酵素を使用することができ、上記活性は非特異的なヌクレアーゼの切断活性に属し、Ｃａｓ酵素が標的核酸分子に標的化されると、Ｃａｓ酵素が活性化されて、任意の核酸分子を切断する非特異的な活性を取得する。
【0072】
前記Ｃａｓ酵素は例えばＣａｓ１２（ＶＡ型）、Ｃａｓ１３（ＶＩ型）及びＣａｓ１４（ＶＦ型）から選択される少なくとも一種のＣａｓタンパク質を含んでもよく、例えばＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ及びＣａｓ１４ｃから選択される少なくとも一種Ｃａｓタンパク質である。ここで、Ｃａｓ１２はｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ）を標的とし、Ｃａｓ１３はｓｓＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）を標的とし、Ｃａｓ１４はｓｓＤＮＡを標的とする。また、Ｃａｓ１２ａはさらにｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ）に対する非特異的切断活性（トランス切断活性とも呼ばれる）を有するため、さらにｓｓＤＮＡを標的とすることができる。
【0073】
また、Ｃａｓ１２酵素はＤＮＡを標的とし、商業的に成熟し、且つＤＮＡに加えて他の非核酸検出分野（例えばタンパク質、生物小分子等）に用いることができるため、より好ましい。
【0074】
本発明において、Ｃａｓ酵素のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し合成することにより、任意の核酸配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは二つの部分で構成され、一つはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、標的核酸と相補的にペアリングする１７～２０個の塩基長さのヌクレオチド配列である；及び一つは足場としてＣａｓ酵素の折り畳みを助けるｔｒａｃｒ ＲＮＡである。ガイドＲＮＡは標的核酸のオリゴヌクレオチドと結合することによりＣａｓ酵素を活性化する。活性化されたＣａｓ酵素は、連帯切断活性によりＥＣＬナノプローブに接続されているオリゴヌクレオチドを切断してＥＣＬナノプローブの信号スイッチ状態を変更させる。
【0075】
以下、本発明の実施例で製造されたホット励起子有機ナノロッド（ＢＢ ＮＲｓ）及びセンサアレイを例として、本発明の信号スイッチの原理及びＥＣＬ検出チップの製造及び検出方法を具体的に説明する。
【0076】
本発明の信号スイッチの原理について、図２に示すＥＣＬ検出チップを例として具体的に説明する。図２は、本発明のｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブに基づくＥＣＬスイッチの概略図である。本発明のホット励起子ナノ粒子（ＢＢ ＮＲｓ）を末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ）が修飾されているオリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）に接続し、本発明のＥＣＬナノプローブ（ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブ）を得て、ＥＣＬ検出におけるリポータープローブとする。ｓｓＤＮＡの末端にＢＨＱが修飾されているため、ＢＢ ＮＲｓはＥＣＬ ＯＦＦ状態である。ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブをＩＴＯ電極の表面に直接滴下し、ＥＣＬセンサ界面を構築する。反応溶液をセンサ界面に滴下し、Ｃａｓ酵素（Ｃａｓ１２ａ酵素）が活性化されない場合、ＢＨＱはｓｓＤＮＡを介してＢＢ ＮＲｓ表面に接続され、センサ電極は低ＥＣＬ強度を表示する（ＥＣＬ ＯＦＦ）。逆に、標的分子が存在し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化される場合、ｓｓＤＮＡが切断され、それによりＢＨＱはＢＢ ＮＲｓ表面から離脱し、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬを回復させ、センサ界面に強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。
【0077】
本発明のＥＣＬ検出チップの製造及び検出方法について、図３に示すＥＣＬ検出方法を例として具体的に説明する。図３は、本発明のｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓに基づくセンサアレイの製造及び検出の概略図である。まず、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極又は金等の沈着により得られた金－酸化インジウムスズ（Ａｕ／ＩＴＯ）電極に、本発明のＥＣＬナノプローブを滴下し、本発明のＥＣＬ電極（即ちＥＣＬセンサ）を得る。Ｃａｓタンパク質、ｃｒＲＮＡ、及び含有可能性がある測定対象の標的核酸を含有する反応溶液をＥＣＬ電極に滴下し、上記信号スイッチにより、標的分子が存在せず、Ｃａｓ酵素が活性化されない場合、センサ電極は低ＥＣＬ強度（ＥＣＬ ＯＦＦ）を表示する。一方、標的分子が存在し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化される場合、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬが回復し、センサ界面に強いＥＣＬ信号（ＥＣＬ ＯＮ）を生成し、それにより本発明のホット励起子有機発光分子に基づく電気化学発光検出を実現する。
【0078】
より高いＥＣＬ信号強度を得る観点から、好ましくはＥＣＬの検出条件、例えばサンプル反応溶液におけるＣａｓタンパク質の濃度、Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡの使用割合、及びサンプル反応溶液のチップ上での反応時間（例えばインキュベーション時間）等を最適化する。
【0079】
Ｃａｓタンパク質の濃度について、特に限定されないが、より高いＥＣＬ信号強度を得る観点から、例えば４０ ｎＭ以上であってもよく、好ましくは４２ ｎＭ以上であり、より好ましくは４５ ｎＭ～７０ ｎＭであり、特に好ましくは５０ ｎＭ～６０ ｎＭである。
【0080】
Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡの使用割合については、特に限定されないが、より高いＥＣＬ信号強度を得る観点から、ｃｒＲＮＡの使用量はＣａｓタンパク質よりも多いことが好ましい。例えば、Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡの使用割合は１：１．２５～１：５であってもよく、好ましくは１：１．３５～１：４であり、より好ましくは１：１．５～１：３であり、特に好ましくは１：１．５～１：２である。
【0081】
サンプル反応溶液のチップ上のインキュベーション時間について、特に限定されないが、より高いＥＣＬ信号強度を得る観点から、例えば３０分間以上であってもよく、好ましくは３５～１２０分間であり、より好ましくは３７～９０分間以上であり、特に好ましくは４０～６０分間である。
【0082】
本発明の後文に記載の実施例により検証されたように、本発明のホット励起子材料のＥＣＬ効率は５６．７％に達し、蛍光量子収率（ΦＰＬ）は８９％以上に達することができる。この前に報告されている熱活性化遅延蛍光（ＴＡＤＦ）原理に基づくＰｄｏｔｓ（報告されている有機ＥＣＬナノ材料効率が最も高いものである）（Anal. Chem. 2022, 94, 15695-15702）及び従来の蛍光材料に基づくＰｄｏｔｓ（Chem. Sci. 2019, 10, 6815；Anal. Chem. 2016, 88, 845）よりも高い。
【0083】
図４は、ＴＡＤＦ化合物とホット励起子材料の発光原理を対照的に示す模式図である。図４に示すように、ＴＡＤＦ化合物のＲＩＳＣ過程はＴ１とＳ１との間に発生するため、冷励起子材料とも呼ばれる。ＴＡＤＦ化合物の最低の一重項状態（Ｓ１）と三重項（Ｔ１）励起状態との両者の電荷移動（ＣＴ）性質により低いΦＰＬを持たせるとともに、ＴＡＤＦ化合物のＴ１からＳ１への緩やかな逆項間交差（ＲＩＳＣ）は、長寿命の三重項励起子の蓄積を引き起こしやすく深刻な消滅を招く。ＴＡＤＦ化合物の冷励起子通路とは逆に、ホット励起子材料のＲＩＳＣは高エネルギー準位励起状態（hRISC，Tm→Sn，m≧2，n≧1）の間に発生する。ここで、大きいＴｍ－Ｔ１エネルギーギャップはＴｍからＴ１への内部変換（ＩＣ）を抑制し、狭いＴｍ－Ｓｎエネルギー分裂はｈＲＩＳＣを促進する。したがって、加速されたＲＩＳＣにより、ホット励起子材料はＴＡＤＦ材料よりも三重項励起子を十分に利用する。ｈＲＩＳＣ過程はＴ１励起子の消光を軽減する。また、ＴＡＤＦ材料の強いＣＴ特性と異なり、ホット励起子材料はＨＬＣＴ励起状態性質を有し、ここでＳ１状態はＬＥ又はＬＥが支配するＨＬＣＴ状態であり、Ｔｍ及びＳｎ状態はＣＴ状態であるため、それに高いΦＰＬ及び１００％の励起子利用効率を持たせる。
【0084】
また、ＨＰＶ１６ ＤＮＡの検出を例として、本発明のＥＣＬ検出方法を従来技術に記載された他の方法と検出範囲及び検出限界で比較し、その比較結果を表１に示す。
【0085】
【表1】
【0086】
なお、上付き文字１～６はそれぞれ下記の文献を示す。
1：L. Wang et al., Microchem. J. 2022, 181, 107818.
2：Y. Nie et al., Biosens. Bioelectron. 2020, 160, 112217.
3：P. Liu et al., Biosens. Bioelectron. 2021, 176, 112954.
4：Y. He et al., ACS Appl. Mater. Interfaces, 2021, 13, 298.
5：S. Jampasa et al., Sensor. Actuat. B-Chem, 2018, 265, 514.
6：Y. He et al., Sensor. Actuat. B-Chem, 2020, 320, 128407.
1：L. Wang et al., Microchem. J. 2022, 181, 107818.
2：Y. Nie et al., Biosens. Bioelectron. 2020, 160, 112217.
3：P. Liu et al., Biosens. Bioelectron. 2021, 176, 112954.
4：Y. He et al., ACS Appl. Mater. Interfaces, 2021, 13, 298.
5：S. Jampasa et al., Sensor. Actuat. B-Chem, 2018, 265, 514.
6：Y. He et al., Sensor. Actuat. B-Chem, 2020, 320, 128407.
【0087】
表１から分かるように、本発明の該ホット励起子有機発光分子に基づいて製造されたＥＣＬチップ（センサ）は、報告されている他のＥＣＬチップに比べてより広い検出範囲及びより高い感度を有する。
【0088】
＜ＥＣＬ検出用キット＞
本発明のＥＣＬ検出用キットは上記本発明のＥＣＬセンサを直接に含んでもよく、上記本発明のＥＣＬナノプローブを含んで、検出時に動作電極に滴下すればよい。ＥＣＬセンサに加え、ＥＣＬ検出に必要の他の試薬、例えばＣａｓ酵素を含有する検出試薬又は取扱説明書等を含むことができる。
本発明のＥＣＬ検出用キットは上記本発明のＥＣＬセンサを直接に含んでもよく、上記本発明のＥＣＬナノプローブを含んで、検出時に動作電極に滴下すればよい。ＥＣＬセンサに加え、ＥＣＬ検出に必要の他の試薬、例えばＣａｓ酵素を含有する検出試薬又は取扱説明書等を含むことができる。
【0089】
以上、実施形態に基づいて本発明の電気化学発光ナノプローブ及びその製造方法及び応用等を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限り、実施の形態に当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される他の形態も、本発明の範囲に含まれる。
【実施例0090】
以下に実施例を挙げて本発明のホット励起子ナノ粒子、ＥＣＬナノプローブ、ＥＣＬ検出方法等を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0091】
実施例で使用された試薬、実験方法及び使用される装置は以下のとおりである。
（１）試薬：
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（Ｐｐｈ３）４）は、Bide Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Shanghai,China)から購入される。
４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニルボロン酸ピナコールエステルはMacklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
４,７－ジブロモベンゾ［ｃ］－１,２,５－チアジアゾールはAladdin Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
ＥｎＧｅｎ（登録商標）Ｌｂａ Ｃａｓ１２ａ（１０μＭの溶液）はNew England Biolabs (Ipswich, MA, UK)から購入される。
ポリスチレン－無水マレイン酸（ＰＳＭＡ、平均Ｍｗ：１７００）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均Ｍｗ：３３５０）、１－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びテトラブチルアンモニウムクロリドはいずれもSigma-Aldrich Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
トリプロピルアミン（ＴＰｒＡ、＞９８％）はJ&K Chemical Ltd. (Beijing, China)から購入される。
酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）ガラスシート（１００×１００ ｍｍ×１．１ ｍｍ）はZhuhai Kaivo Optoelectronic Technology Co., Ltd. (Zhuhai, China)から購入される。
炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）水及び表２に記載の全てのオリゴヌクレオチドはいずれもSangon Bioengineering Co. Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
また、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ ７．４）はＫＨ２ＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４の貯蔵溶液を混合することにより調製される。
（１）試薬：
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（Ｐｐｈ３）４）は、Bide Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Shanghai,China)から購入される。
４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニルボロン酸ピナコールエステルはMacklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
４,７－ジブロモベンゾ［ｃ］－１,２,５－チアジアゾールはAladdin Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
ＥｎＧｅｎ（登録商標）Ｌｂａ Ｃａｓ１２ａ（１０μＭの溶液）はNew England Biolabs (Ipswich, MA, UK)から購入される。
ポリスチレン－無水マレイン酸（ＰＳＭＡ、平均Ｍｗ：１７００）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均Ｍｗ：３３５０）、１－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びテトラブチルアンモニウムクロリドはいずれもSigma-Aldrich Co., Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
トリプロピルアミン（ＴＰｒＡ、＞９８％）はJ&K Chemical Ltd. (Beijing, China)から購入される。
酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）ガラスシート（１００×１００ ｍｍ×１．１ ｍｍ）はZhuhai Kaivo Optoelectronic Technology Co., Ltd. (Zhuhai, China)から購入される。
炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）水及び表２に記載の全てのオリゴヌクレオチドはいずれもSangon Bioengineering Co. Ltd. (Shanghai, China)から購入される。
また、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ ７．４）はＫＨ２ＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４の貯蔵溶液を混合することにより調製される。
【0092】
実施例で使用されるオリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである。
【0093】
【表2】
【0094】
（２）実験方法及び装置
ＴＥＭは、ＴＥＣＮＡＩＧ２Ｆ ２０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、ＵＳＡ）により得られる。
ゼータ電位は、９０ Ｐｌｕｓ ＤｙｎａＰｒｏ ＮａｎｏＳｔａｒ（Brookhaven Instrument Corporation，USA）を用いて記録する。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩＩ ５００ＨＤ分光計（ドイツ）により重水素化ＣＤＣｌ３を溶媒としテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として測定する。
ＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、ＵＶ－３６００分光光度計（日本島津）により得る。
フォトルミネセンス（ＰＬ）スペクトルおよび蛍光寿命は、ＦＬＳ－９８０蛍光分光光度計（Edinburgh, U.K.）を用いて測定した。
ＡＦＭは、原子間力顕微鏡（BRUKER Dimension Icon, Germany）によりＳｃａｎＡｓｙｓｔモードで取得される。
ＰＶＤ ７５電子ビーム蒸着システム（Ｋｕｒｔ Ｊ．Ｌｅｓｋｅｒ、ＵＳＡ）により５ ｎｍ Ｃｒと５０ ｎｍ Ａｕ層をＩＴＯガラスシートに堆積する。
ＥＣＬスペクトルは、山東大学のGuizheng Zhou教授実験室自製のＥＣＬ分光計により取得される。該分光計は、液体Ｎ２で冷却されるＰｙＬｏＮ ４００ＢＲ－ｅＸｃｅｌｏｎデジタルＣＣＤ検出器（Princeton, USA）とＶｅｒｓａＳＴＡＴ３電気化学分析器（Princeton, USA）を備えるＡｃｔｏｎ ＳＰ ２３００ｉモノクロメータで構成される。
サイクリックボルタンメトリー実験は、ＣＨＩ ６３０Ｄ電気化学ワークステーション（CHI instruments Inc., China）で行う。
陽極及び陰極ＥＣＬ実験は、ＭＰＩ－ＥＩＩ ＥＣＬ分析器（Xi’an Remex, China）の自製反応槽で行い、該分析器は三電極システムを採用する。
ＥＣＬイメージングは自製のＥＣＬイメージングシステムで行われる。該イメージングシステムには、集束レンズ（EF 50mm f/1.2L USM, Canon）、電子増倍電荷結合素子（EMCCD, iXon Ultra, Andor, UK）及びＣＨＩ－６６０Ｄ電気化学ワークステーションを備え、Ａｕ／ＩＴＯ電極を動作電極とし、Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤを参照電極とし、Ｐｔワイヤを対電極とする。
ＴＥＭは、ＴＥＣＮＡＩＧ２Ｆ ２０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、ＵＳＡ）により得られる。
ゼータ電位は、９０ Ｐｌｕｓ ＤｙｎａＰｒｏ ＮａｎｏＳｔａｒ（Brookhaven Instrument Corporation，USA）を用いて記録する。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩＩ ５００ＨＤ分光計（ドイツ）により重水素化ＣＤＣｌ３を溶媒としテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として測定する。
ＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、ＵＶ－３６００分光光度計（日本島津）により得る。
フォトルミネセンス（ＰＬ）スペクトルおよび蛍光寿命は、ＦＬＳ－９８０蛍光分光光度計（Edinburgh, U.K.）を用いて測定した。
ＡＦＭは、原子間力顕微鏡（BRUKER Dimension Icon, Germany）によりＳｃａｎＡｓｙｓｔモードで取得される。
ＰＶＤ ７５電子ビーム蒸着システム（Ｋｕｒｔ Ｊ．Ｌｅｓｋｅｒ、ＵＳＡ）により５ ｎｍ Ｃｒと５０ ｎｍ Ａｕ層をＩＴＯガラスシートに堆積する。
ＥＣＬスペクトルは、山東大学のGuizheng Zhou教授実験室自製のＥＣＬ分光計により取得される。該分光計は、液体Ｎ２で冷却されるＰｙＬｏＮ ４００ＢＲ－ｅＸｃｅｌｏｎデジタルＣＣＤ検出器（Princeton, USA）とＶｅｒｓａＳＴＡＴ３電気化学分析器（Princeton, USA）を備えるＡｃｔｏｎ ＳＰ ２３００ｉモノクロメータで構成される。
サイクリックボルタンメトリー実験は、ＣＨＩ ６３０Ｄ電気化学ワークステーション（CHI instruments Inc., China）で行う。
陽極及び陰極ＥＣＬ実験は、ＭＰＩ－ＥＩＩ ＥＣＬ分析器（Xi’an Remex, China）の自製反応槽で行い、該分析器は三電極システムを採用する。
ＥＣＬイメージングは自製のＥＣＬイメージングシステムで行われる。該イメージングシステムには、集束レンズ（EF 50mm f/1.2L USM, Canon）、電子増倍電荷結合素子（EMCCD, iXon Ultra, Andor, UK）及びＣＨＩ－６６０Ｄ電気化学ワークステーションを備え、Ａｕ／ＩＴＯ電極を動作電極とし、Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤを参照電極とし、Ｐｔワイヤを対電極とする。
【0095】
実施例１：ホット励起子有機ナノロッド（ＢＢ ＮＲｓ）の製造及び特性解析
【0096】
ａ．ホット励起子分子ＢＣｚＰ－ＢＴの合成
まず、４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニルボロン酸ピナコールエステル（Ｃｚ、１．１８１７ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）、４、７－ジブロモベンゾ［ｃ］－１,２,５－チアジアゾール（ＢＴ、０．４１４５ｇ、１．４１ ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．００４０ｇ、１４．５ ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（Ｐｐｈ３）４、０．２３１１ｇ、０．２ ｍｍｏｌ）を２０ ｍＬ トルエンと４ ｍＬ水の混合液を入れたシュレンク管に添加した後、シュレンク管をアルゴン雰囲気下で、９０℃で１８時間撹拌する。次に、反応済みの混合液をジクロロメタンで抽出し、石油エーテル及びジクロロメタンを溶出剤とし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、０．７５１２ｇ ＢＣｚＰ－ＢＴ生成物（即ち４、７－ビス（４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール（ｐ－ＢＣｚＰ－ＢＴ）を得て、以下も「ＢＣｚＰ－ＢＴ」と略称する）、収率が８６％である。核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）及び質量スペクトルによりＢＣｚＰ－ＢＴ分子の合成を検証し、その結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。図５Ａおよび図５Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）及び質量分析の結果を示す図である。ここで、図５ＡはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）分析の結果を示す図であり、図５ＢはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の質量分析の結果を示す図である。
まず、４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニルボロン酸ピナコールエステル（Ｃｚ、１．１８１７ｇ、３．２ ｍｍｏｌ）、４、７－ジブロモベンゾ［ｃ］－１,２,５－チアジアゾール（ＢＴ、０．４１４５ｇ、１．４１ ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．００４０ｇ、１４．５ ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（Ｐｐｈ３）４、０．２３１１ｇ、０．２ ｍｍｏｌ）を２０ ｍＬ トルエンと４ ｍＬ水の混合液を入れたシュレンク管に添加した後、シュレンク管をアルゴン雰囲気下で、９０℃で１８時間撹拌する。次に、反応済みの混合液をジクロロメタンで抽出し、石油エーテル及びジクロロメタンを溶出剤とし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、０．７５１２ｇ ＢＣｚＰ－ＢＴ生成物（即ち４、７－ビス（４－（９Ｈ－カルバゾール－９－イル）フェニル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾール（ｐ－ＢＣｚＰ－ＢＴ）を得て、以下も「ＢＣｚＰ－ＢＴ」と略称する）、収率が８６％である。核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）及び質量スペクトルによりＢＣｚＰ－ＢＴ分子の合成を検証し、その結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。図５Ａおよび図５Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）及び質量分析の結果を示す図である。ここで、図５ＡはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）分析の結果を示す図であり、図５ＢはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の質量分析の結果を示す図である。
【0097】
図５Ａは本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の核磁気（１Ｈ ＮＭＲ）分析の結果を示す図であり、図５ＢはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の質量分析の結果を示す図である。図５Ａ及び図５Ｂから分かるように、本発明はＢＣｚＰ－ＢＴ分子を成功的に合成した。
【0098】
ｂ．ホット励起子有機ナノロッド（ＢＢ ＮＲｓ）の製造
まず、５０μｇ／ｍＬのＢＣｚＰ－ＢＴ及び１０μｇ／ｍＬのポリ（スチレン－無水マレイン酸共重合体）（ＰＳＭＡ、Ｍｎ＝１７００）を含有する２．５ ｍＬのＴＨＦ溶液を室温で２０分間超音波処理する。次に、上記溶液を１０ ｍＬの水に迅速に注入し、３０秒超音波処理する。３５℃での回転蒸発により溶媒ＴＨＦを除去し、さらにポリエーテルスルホン注射器で濾過し、ＢＢ ＮＲｓを得た。
まず、５０μｇ／ｍＬのＢＣｚＰ－ＢＴ及び１０μｇ／ｍＬのポリ（スチレン－無水マレイン酸共重合体）（ＰＳＭＡ、Ｍｎ＝１７００）を含有する２．５ ｍＬのＴＨＦ溶液を室温で２０分間超音波処理する。次に、上記溶液を１０ ｍＬの水に迅速に注入し、３０秒超音波処理する。３５℃での回転蒸発により溶媒ＴＨＦを除去し、さらにポリエーテルスルホン注射器で濾過し、ＢＢ ＮＲｓを得た。
【0099】
ｃ．ＢＣｚＰ－ＢＴ分子の励起状態及び特性解析
本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の励起状態を分析し、その結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。図６Ａおよび図６Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の励起状態の分析結果を示す図である。ここで、図６ＡはＢＣｚＰ－ＢＴの異なる極性溶媒における正規化紫外－可視吸収及びＦＬスペクトルを示し、図６ＢはＢＣｚＰ－ＢＴ分子におけるＣｚＰ、ＢＴ及びＢＣｚＰ－ＢＴの１０－５Ｍ ＴＨＦ溶液におけるＦＬスペクトルを示す。
本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の励起状態を分析し、その結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。図６Ａおよび図６Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の励起状態の分析結果を示す図である。ここで、図６ＡはＢＣｚＰ－ＢＴの異なる極性溶媒における正規化紫外－可視吸収及びＦＬスペクトルを示し、図６ＢはＢＣｚＰ－ＢＴ分子におけるＣｚＰ、ＢＴ及びＢＣｚＰ－ＢＴの１０－５Ｍ ＴＨＦ溶液におけるＦＬスペクトルを示す。
【0100】
まず、ＢＣｚＰ－ＢＴ分子の異なる極性溶媒における正規化紫外－可視吸収及び蛍光（ＦＬ）スペクトルを考察した。その結果を図６Ａに示す。分子内の電荷がＣｚからＢＴ単位に移行するため、ＢＣｚＰ－ＢＴは約４００ ｎｍにブロードな吸収を示し、該紫外線吸収ピークの形状及び位置は溶剤の極性の増加に伴って大きく変化しなかった。しかしながら、溶媒の極性の増加に伴い、ＢＣｚＰ－ＢＴの蛍光スペクトルが６８ ｎｍの赤シフトを示し、かつ蛍光ピークが広くなり、ＢＣｚＰ－ＢＴ分子が溶媒効果を有することを示した。図６Ａから分かるように、ＢＣｚＰ－ＢＴ分子は強い電荷移動状態（ＣＴ）特徴を有する。
【0101】
次に、ＢＣｚＰ－ＢＴ分子におけるＣｚＰ、ＢＴ、及びＢＣｚＰ－ＢＴの１０－５Ｍ ＴＨＦ溶液におけるＦＬスペクトルの差異を分析した。その結果を図６Ｂに示す。図６Ｂから分かるように、ＢＣｚＰ－ＢＴ分子の発光はＣｚからＢＴへの電荷移動に由来し、モノマー自体由来ではない。
【0102】
図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴ分子の励起状態の性質を示す図である。ここで、図７Ａはストークス変位（ｖａ－ｖｆ）と溶媒の配向分極率（Δｆ）の変化曲線を示す図であり、図７ＢはＴＨＦにおけるＢＣｚＰ－ＢＴの過渡ＰＬ減衰曲線を示す図である。
【0103】
さらに、ＢＣｚＰ－ＢＴの励起状態性質を検討するために、Ｌｉｐｐｅｒｔ－Ｍａｔａｇａ溶媒誘起変色モデルに基づいてストークス変位（ｖａ－ｖｆ）と溶媒の配向分極率（Δｆ）の変化曲線を作成し、かつ曲線傾きによりＳ１の双極子モーメントを計算した。その結果を図７Ａに示す。
【0104】
図７Ａにおいて、二本の断面フィッティング線が観察され、低極性溶媒の双極子モーメントが小さく、高極性溶媒の双極子モーメントが大きく、それがそれぞれ局所励起状態（ＬＥ）及び電荷移動励起状態（ＣＴ）に対応する。中極性溶媒に対して、励起状態はＬＥ状態及びＣＴ状態性質を同時に表現した。
【0105】
また、ＢＣｚＰ－ＢＴの蛍光寿命を解析した。その結果を図７Ｂに示す。図７ＢはＴＨＦにおけるＢＣｚＰ－ＢＴの過渡ＰＬ減衰曲線を示す図であり、図７Ｂから分かるように、ＢＣｚＰ－ＢＴは６．７２ ｎｓのシングルインデックス減衰を示し、遅延がなかった。該結果は、ＢＣｚＰ－ＢＴのＳ１励起状態が混成局所－電荷移動励起状態（ＨＬＣＴ）であり、ＬＥとＣＴ状態の簡単な混合ではないことをさらに証明した。
【0106】
図８Ａおよび図８Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＣｚＰ－ＢＴのホット励起子過程の可能性の分析結果を示す図である。ここで、図８ＡはＢＣｚＰ－ＢＴ分子のエネルギー準位分布を示す図であり、図８ＢはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の自然遷移軌道シミュレーション結果を示す図である。
【0107】
また、ホット励起子過程の可能性を検証するために、ＴＤ－ｍ０６２ｘ／６－３１１ｇ（ｄ）を用いてＢＣｚＰ－ＢＴの最も低い一重項状態及び三重項励起状態のエネルギー準位を計算した。その結果を図８Ａに示す。
【0108】
図８Ａの結果によると、Ｔ２とＴ１との間のバンドギャップ（１．０９ ｅＶ）は三重項の内部変換を抑制し、Ｔ２とＳ１との間のナローギャップ（０．１３ ｅＶ）は逆系間交差を促進することにより、三重項励起子の蓄積による消光を軽減し、かつ三重項励起子をホット励起子チャネルにより効果的に利用されることができる。
【0109】
また、Ｍｕｌｔｉｗｆｎソフトウェアを用いてＢＣｚＰ－ＢＴ分子に自然遷移軌道シミュレーション（ＮＴＯ）を行った。そのシミュレーション結果を図８Ｂに示す。図８Ｂの結果によると、Ｔ１は局在励起状態（ＬＥ）という特徴、Ｓｍ及びＴｎが電荷移動励起状態（ＣＴ）という特徴を有し、Ｓ１が混成局所－電荷移動励起状態を有するという特徴を有する（Ｓ１状態の電子がＢＴ及び隣接するベンゼン環に集中し、正孔が骨格全体に分布するため）。
【0110】
ｄ．ＢＢ ＮＲｓの特性解析：
本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓの特性を解析した。その結果を図９Ａ～図９Ｅに示す。図９Ａ～図９Ｅは、本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓの特性の解析結果を示す図である。ここで、図９ＡはＴＥＭ画像であり、図９ＢはＡＦＭ画像であり、図９Ｃ、図９Ｄ、および図９Ｅは、それぞれＢＢ ＮＲｓとＢＣｚＰ－ＢＴの紫外及び蛍光スペクトル及び蛍光寿命を示す図である。
本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓの特性を解析した。その結果を図９Ａ～図９Ｅに示す。図９Ａ～図９Ｅは、本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓの特性の解析結果を示す図である。ここで、図９ＡはＴＥＭ画像であり、図９ＢはＡＦＭ画像であり、図９Ｃ、図９Ｄ、および図９Ｅは、それぞれＢＢ ＮＲｓとＢＣｚＰ－ＢＴの紫外及び蛍光スペクトル及び蛍光寿命を示す図である。
【0111】
まず、ＴＥＭ及びＡＦＭにより合成されたＢＢ ＮＲｓの形態を解析した。ＴＥＭ画像及びＡＦＭ画像をそれぞれ図９Ａ及びＢに示す。図９Ａ及びＢの結果によると、ＢＢ ＮＲｓは幅が約３０ ｎｍであり、長さが約２００ ｎｍである棒状の形態である。
【0112】
図９Ｃ、図９Ｄ、および図９Ｅは、それぞれ、ＢＢ ＮＲｓとＢＣｚＰ－ＢＴの紫外及び蛍光スペクトル並びに蛍光寿命を示す図である。図９Ｃから分かるように、ＢＢ ＮＲｓ溶液は日光で浅緑色であり、３６５ ｎｍの紫外光照射で明るい黄緑色光を発する。図９Ｄから分かるように、ＢＣｚＰ－ＢＴに比べて、ＢＢ ＮＲｓが水中の極性環境で遷移エネルギーを低下させる可能性があるため、ＢＢ ＮＲｓの紫外線吸収は４００ ｎｍ付近にわずかな赤シフトを示した。図９Ｄから分かるように、ＢＣｚＰ－ＢＴ及びＢＢ－ＮＲは５５４ ｎｍにいずれも類似するＦＬ放出を示した。図９Ｅから分かるように、両者のＦＬ寿命は約６．７ ｎｓであり、これらの結果により、ＢＢ－ＮＲはＢＣｚＰ－ＢＴと同じ光物理的性質を有することが分かった。
【0113】
ｅ．ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ特性
本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ特性を分析した。
まず、消滅ＥＣＬ実験を行ってＢＢ ＮＲｓラジカル中間体の安定性を考察した。なお、消滅ＥＣＬ実験の具体的な条件は以下のとおりである。
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ ７．４、窒素ガス通気２０分間
ＥＣＬ：サイクリックボルタンメトリー法
消滅状態ＥＣＬ：パルスステップ法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：－２．０Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
ＰＭＴ：高圧８００Ｖ
本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ特性を分析した。
まず、消滅ＥＣＬ実験を行ってＢＢ ＮＲｓラジカル中間体の安定性を考察した。なお、消滅ＥＣＬ実験の具体的な条件は以下のとおりである。
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ ７．４、窒素ガス通気２０分間
ＥＣＬ：サイクリックボルタンメトリー法
消滅状態ＥＣＬ：パルスステップ法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：－２．０Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
ＰＭＴ：高圧８００Ｖ
【0114】
実験結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ特性の分析結果を示す図である。ここで、図１０ＡはＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥのサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）曲線及びＥＣＬ曲線を示す図であり、曲線ａはそれぞれ先に陽極走査を行う結果を示し、曲線ｂはそれぞれ先に陰極走査を行う結果を示す。図１０ＢはＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥの消滅状態ＥＣＬ曲線を示す図である。
【0115】
図１０Ａは、ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥのサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）曲線及びＥＣＬ曲線を示す図である。図１０Ａに示すように、Ｎ２で飽和したＰＢＳにおいて、ＢＢ ＮＲｓで修飾されたガラス炭素電極（ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ）のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）曲線は＋０．９５ Ｖに酸化ピーク（Ｃｚの酸化に対応する）が現れ、－１．４５ Ｖに還元ピークが現れた（ＢＴの還元に対応する）。
【0116】
また、図１０Ａから分かるように、走査方向がＥＣＬに大きく影響する。先に陽極走査を行う場合（曲線ａ）、＋１．０５ Ｖのみに微弱なＥＣＬ放射（０から＋１．５ Ｖまで、さらに－２．０ Ｖまで）が現れ、先に陰極走査を行う場合（曲線ｂ）、＋１．０ Ｖ及び－２．０ Ｖにいずれも強いＥＣＬ放射（０から－２．０ Ｖまで、さらに＋１．５ Ｖまで）が現れた。これらの結果は、ＢＢ ＮＲｓの還元状態がより安定することを表明した。
【0117】
同時に、パルスステップ法を利用してＢＢ ＮＲｓの消滅状態ＥＣＬを検出した。その結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂにおいて、左図は－２．０から＋１．５ Ｖを示し、右図は＋１．５から－２．０ Ｖを示す。図１０Ｂの結果により、初期電位が負であるか正であるかにかかわらず、＋１．５０ ＶのみでＢＢ ＮＲｓの過渡ＥＣＬ発射が観察され、ＢＢ ＮＲｓの還元状態がより高い安定性を有することを証明した。
【0118】
また、ＢＢ ＮＲｓの共反応剤存在下でのＥＣＬをさらに検討した。その分析結果を図１１に示す。
【0119】
まず、トリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）を共反応剤として、ＢＢ ＮＲｓの陽極ＥＣＬ挙動を考察した。
【0120】
陽極ＥＣＬ実験の具体的な実験条件は以下のとおりである。
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：１０ ｍＭ ＴＰｒＡ含有０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ ７．４
試験方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：０Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
ＥＣＬ：ＰＭＴ、高圧４００Ｖ
また、Ｓ２Ｏ８ ２－を共反応剤として、ＢＢ ＮＲｓの陰極ＥＣＬ挙動を考察した。
陰極ＥＣＬ実験の具体的な実験条件は以下のとおりである：
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：１００ ｍＭ Ｋ２Ｓ２Ｏ８含有０．１ Ｍ ＰＢＳ ｐＨ ７．４
試験方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：０Ｖ
最低電位：－２.０Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
ＥＣＬ：ＰＭＴ、高圧４００Ｖ
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：１０ ｍＭ ＴＰｒＡ含有０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ ７．４
試験方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：０Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
ＥＣＬ：ＰＭＴ、高圧４００Ｖ
また、Ｓ２Ｏ８ ２－を共反応剤として、ＢＢ ＮＲｓの陰極ＥＣＬ挙動を考察した。
陰極ＥＣＬ実験の具体的な実験条件は以下のとおりである：
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：１００ ｍＭ Ｋ２Ｓ２Ｏ８含有０．１ Ｍ ＰＢＳ ｐＨ ７．４
試験方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：０Ｖ
最低電位：－２.０Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
ＥＣＬ：ＰＭＴ、高圧４００Ｖ
【0121】
分析結果を図１１Ａ～図１１Ｆに示す。図１１Ａ～図１１Ｆは、本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓの共反応剤存在下でのＥＣＬの分析結果である。ここで、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃはそれぞれトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）を共反応剤とする場合のＢＢ ＮＲｓの陽極ＥＣＬ挙動及びメカニズムを示し、図１１Ａ、図１１Ｂ中の曲線ａはＴＰｒＡ自体、曲線ｂはＴＰｒＡなし、曲線ｃはＴＰｒＡと共存することを示す。図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１ＦはそれぞれＫ２Ｓ２Ｏ８を共反応剤とする場合のＢＢ ＮＲｓの陰極ＥＣＬ挙動及びメカニズムを示し、図１１Ｄ、図１１Ｅ中の曲線ａはＳ２Ｏ８
２－自体、曲線ｂはＳ２Ｏ８
２－なし、曲線ｃはＳ２Ｏ８
２－と共存することを示す。
【0122】
図１１Ａから分かるように、トリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）自体（曲線ａ）は＋０．９８ Ｖで不可逆酸化ピークが観察され、開始電位は＋０．５７ Ｖである。なお、ＴＰｒＡ・ラジカルはＴＰｒＡ・+（ＴＰｒＡ酸化生成物）が脱プロトン化した後に生成される。図１１Ａ及び図１１Ｂから分かるように、ＴＰｒＡがない場合（曲線ｂ）、ＢＢ ＮＲｓの酸化は＋０．７０ Ｖ付近で開始し、カチオンラジカルＢＢ ＮＲｓ・＋を生成した。これにより、明らかな酸化電流と微弱なＥＣＬ発射を示した。図１１Ａ及び図１１Ｂから分かるように、ＴＰｒＡと共存する場合（曲線ｃ）、ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥはＴＰｒＡ及びＢＢ ＮＲｓの酸化ピーク及び＋１．０７ Ｖでピーク値に達する強いＥＣＬ放射が観察された。この現象は、ＴＰｒＡ・とＢＢ ＮＲｓ・＋との間の電荷移動による励起された一重項状態と三重項状態ＢＢ ＮＲｓ（１ＢＢ ＮＲｓ＊及び３ＢＢ ＮＲｓ＊）の放射緩和に起因すると考える（図１１Ｃ参照）。
【0123】
図１１Ｄ及び図１１Ｅから分かるように、Ｓ２Ｏ８
２－自体（曲線ａ）は－１．０７ Ｖで強酸化性ＳＯ４
・－に還元されることができるが、そのＥＣＬ放射が低く、無視できる。図１１Ｄ及び図１１Ｅから分かるように、Ｋ２Ｓ２Ｏ８がない場合（曲線ｂ）、ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥは－１．５５ Ｖに明らかな還元ピークが現れるとともに、微弱なＥＣＬ放射を伴って、ＢＢ ＮＲｓがＢＢ ＮＲｓ・－に還元されることができることを表明した。図１１Ｄ及び図１１Ｅから分かるように、Ｋ２Ｓ２Ｏ８が存在する場合（曲線ｃ）、ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥは明らかな還元電流を生成し、ピーク電位が－１．４０ Ｖであるとともに、強いＥＣＬ放射を伴った。該現象は、ＢＢ ＮＲｓ・－とＳＯ４
－との反応により、１ＢＢ ＮＲｓ＊及び３ＢＢ ＮＲｓ＊の放射を生成することに起因すると考える（図１１Ｆ参照）。
【0124】
また、１０ ｍＭのＴＰｒＡ・又は１００ ｍＭのＫ２Ｓ２Ｏ８の存在下で１ ｍＭのＲｕ（ｂｐｙ）３
２＋を標準として、ＢＢ ＮＲｓの電流－時間曲線及びＥＣＬスペクトルを記録することにより、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ効率を検証した。なお、具体的な実験条件は上記の陽極ＥＣＬ実験及び陰極ＥＣＬ実験と同じである。その結果を図１２Ａ～図１２Ｄおよび表３に示す。図１２Ａ～図１２Ｄは、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋を基準とする本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ効率を示す図である。ここで、図１２Ａ及び図１２ＢはそれぞれＢＢ ＮＲｓ及びＲｕ（ｂｐｙ）３
２＋修飾ＧＣＥの陽極電流－時間曲線及びＥＣＬスペクトルを示す図であり、図１２Ｃ及び図１２ＤはそれぞれＢＢ ＮＲｓ及びＲｕ（ｂｐｙ）３
２＋修飾ＧＣＥの陰極電流－時間曲線及びＥＣＬスペクトルを示す。
【0125】
表３に、ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥとＲｕ（ｂｐｙ）３
２＋／ＧＣＥとの相対ＥＣＬ効率を示す。
【0126】
【表3】
【0127】
なお、φECLは以下の式（１）により計算する。
【0128】
【数1】
【0129】
ここで、φ及びφ°、I及びI°、Q及びQ°はそれぞれサンプル及び標準品のＥＣＬ効率、ＥＣＬ強度積分（積分ＥＣＬスペクトルｖｓ波長）、消費電荷（積分ＣＶ曲線ｖｓ時間）を示す。
【0130】
図１２Ａ～図１２Ｄ及び表３から分かるように、本発明のＢＢ ＮＲｓは同じ又はさらに低い濃度の共反応物存在下で従来の蛍光に基づくＰｄｏｔｓ（Z. Wang et al.，Adv. Funct. Mater. 2020，30，2000220；Y. Feng et al., Anal. Chem. 2016, 88, 845；Z. Wang et al., J. Phys. Chem. Lett. 2018，9，5296）及びＴＡＤＦ Ｐｄｏｔｓ（C. Wang et al., Anal. Chem. 2022，94，15695）より優れたＥＣＬ効率を示し、これはホット励起子メカニズムにより、ＢＢ ＮＲｓに高い放射遷移率及び有効的な励起子の利用効率を与えるためである。
【0131】
さらに、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ帰属を考察した。その分析結果を図１３Ａ～図１３Ｃに示す。図１３Ａ～図１３Ｃは、本発明の実施例１で製造されたＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ帰属の分析結果を示す図である。ここで、図１３ＡはＢＢ ＮＲｓの陽極、陰極ＥＣＬスペクトル及びＦＬスペクトルを示す図であり、図１３ＢはＢＢ ＮＲｓで修飾されたガラス炭素電極のＣＶ曲線を示す図である。図１３Ｃは、ＢＣｚＰ－ＢＴ分子の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）と最高占有分子軌道（ＨＯＭＯ）とのバンドギャップを示す模式図である。
【0132】
まず、ＢＢ ＮＲｓの陽極、陰極ＥＣＬスペクトル及びＦＬスペクトルを試験した。その試験結果を図１３Ａに示す。なお、陽極及び陰極ＥＣＬスペクトルの具体的な試験条件は、上記の陽極及び陰極ＥＣＬ実験と同じである。
【0133】
図１３Ａは、ＢＢ ＮＲｓの陽極、陰極ＥＣＬスペクトル及びＦＬスペクトルを示す図である。図１３Ａから分かるように、ＢＢ ＮＲｓの陽極と陰極ＥＣＬの発射ピークはそのＦＬ発射ピークとよくマッチングし、いずれも５６０ ｎｍであり、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬとＦＬ過程が同じ励起状態を有することを示した。これらの励起状態はバンドギャップ遷移により生成される。
【0134】
また、ＢＢ ＮＲｓの有機相におけるＣＶ曲線を試験した。その試験結果を図１３Ｂに示す。
【0135】
ここで、有機相ＣＶの具体的な試験条件は以下のとおりである。
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：０．１ Ｍ テトラブチルアンモニウムクロリド含有テトラヒドロフラン溶液、窒素ガス通気２０分間
試験方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：－２.２Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
電極材料：ＢＢ ＮＲｓ／ＧＣＥ
電解液：０．１ Ｍ テトラブチルアンモニウムクロリド含有テトラヒドロフラン溶液、窒素ガス通気２０分間
試験方法：サイクリックボルタンメトリー法
最高電位：＋１．５Ｖ
最低電位：－２.２Ｖ
走査速度：０．１Ｖ／ｓ
【0136】
図１３ＢはＢＢ ＮＲｓで修飾されたガラス炭素電極のＣＶ曲線を示す図であり、図１３ＣはＢＣｚＰ－ＢＴ分子の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）と最高占有分子軌道（ＨＯＭＯ）とのバンドギャップを示す模式図である。図１３Ｂ、図１３Ｃから分かるように、ＢＢ ＮＲｓの酸化ピークは二つのカルバゾールの酸化に対応するが、カルバゾールが電気化学反応して二量体を生成しやすいため、ＢＢ ＮＲｓのＣＶは不可逆的な酸化波を示し、その還元ピークはベンゾチアジアゾールの還元により生成され、ベンゾチアジアゾールは二つの電子吸引のイミノ結合（Ｃ＝Ｎ）を有するため、そのＣＶ曲線も二つの連続的な還元ピークを示す。
【0137】
実施例２：ＥＣＬナノプローブ
１）オリゴヌクレオチドで修飾されたＢＢ ＮＲｓプローブ：
ａ．ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓの製造
まず、１２μＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Ｍｗ＝３３５０）及び１２μＬの１ Ｍ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を順に６００μＬのＢＢ ＮＲｓに添加した後に、０．１ Ｍ ＮａＯＨで溶液のｐＨを７．４に調節し、さらに４０μＬのブラックホールクエンチャー２（ＢＨＱ２）で修飾された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ－ＢＨＱ２、１００μＭ）及び２４μＬ調製直後のＥＤＣ（１０ ｍｇ／ｍＬ）を添加し、室温で暗所で２４時間撹拌した後に限外濾過により遊離のｓｓＤＮＡ－ＢＨＱ２を遠心分離して除去し、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓを得た。ＢＢ ＮＲｓと４１０ ｎｍの波長で同じ吸光度を有するように希釈し、光を避けて保存する。
１）オリゴヌクレオチドで修飾されたＢＢ ＮＲｓプローブ：
ａ．ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓの製造
まず、１２μＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Ｍｗ＝３３５０）及び１２μＬの１ Ｍ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を順に６００μＬのＢＢ ＮＲｓに添加した後に、０．１ Ｍ ＮａＯＨで溶液のｐＨを７．４に調節し、さらに４０μＬのブラックホールクエンチャー２（ＢＨＱ２）で修飾された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ－ＢＨＱ２、１００μＭ）及び２４μＬ調製直後のＥＤＣ（１０ ｍｇ／ｍＬ）を添加し、室温で暗所で２４時間撹拌した後に限外濾過により遊離のｓｓＤＮＡ－ＢＨＱ２を遠心分離して除去し、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓを得た。ＢＢ ＮＲｓと４１０ ｎｍの波長で同じ吸光度を有するように希釈し、光を避けて保存する。
【0138】
ｂ．ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓの特性解析
ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓの紫外吸収スペクトル及びＺｅｔａ電位を測定した。その結果を図１４Ａ～図１４Ｃに示す。図１４Ａ～図１４Ｃは、本発明の実施例２で製造されたｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの特性の解析結果を示す図である。ここで、図１４ＡはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの紫外吸収スペクトル及びＦＬスペクトルを示す図である。図中の曲線ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ、ｓｓＤＮＡ、ＢＢ ＮＲｓの紫外吸収スペクトル及びＢＢ ＮＲｓのＦＬスペクトルを示す。図１４ＢはＺｅｔａ電位の解析結果を示す図である。図１４ＣはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの製造プロセスにおいて毎回の限外濾過された液の紫外解析結果を示す図である。図中の数字１～９は順に１回目～９回目の濾過液を示す。
ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓの紫外吸収スペクトル及びＺｅｔａ電位を測定した。その結果を図１４Ａ～図１４Ｃに示す。図１４Ａ～図１４Ｃは、本発明の実施例２で製造されたｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの特性の解析結果を示す図である。ここで、図１４ＡはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの紫外吸収スペクトル及びＦＬスペクトルを示す図である。図中の曲線ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ、ｓｓＤＮＡ、ＢＢ ＮＲｓの紫外吸収スペクトル及びＢＢ ＮＲｓのＦＬスペクトルを示す。図１４ＢはＺｅｔａ電位の解析結果を示す図である。図１４ＣはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの製造プロセスにおいて毎回の限外濾過された液の紫外解析結果を示す図である。図中の数字１～９は順に１回目～９回目の濾過液を示す。
【0139】
図１４Ａの曲線ａから分かるように、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓの紫外（ＵＶ－ｖｉｓ）吸収は４１０ ｎｍにＢＢ ＮＲｓの吸収ピークを有するだけでなく、２６０ ｎｍにもｓｓＤＮＡの吸収ピークがあり、５８０ ｎｍにＢＨＱ２の吸収ピークがある。また、図１４Ａから分かるように、ＢＨＱ２の広帯域吸収帯はＢＢ ＮＲｓのＦＬ放出ピーク（曲線ｄ）と重なり、ＢＨＱ２はＢＢ ＮＲｓの放出を消光することができることを表明した。
【0140】
図１４Ｂから分かるように、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓのＺｅｔａ電位づけによりＢＢ ＮＲｓに比べて、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓはより負のゼータ電位を有する。これらの結果は、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブの製造が成功したことを示した。
【0141】
また、ｓｓＤＮＡＢＢ ＮＲｓを限外濾過して精製する時に、毎回の濾過液を収集してその紫外を測定した。図１４Ｃから分かるように、限外濾過の回数の増加に伴い、溶液中のＤＮＡ及びＢＨＱ２の吸収ピークが徐々に低下し、該結果は製造されたｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブ溶液に遊離のｓｓＤＮＡ－ＢＨＱ２がほとんどないことを説明した。
【0142】
２）ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブに基づくＥＣＬスイッチ
ａ．信号スイッチの原理
ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブをレポータープローブとして説明する。図２に示すように、ｓｓＤＮＡの末端にＢＨＱが修飾されているため、ＢＢ ＮＲｓはＥＣＬ ＯＦＦ状態である。ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブをＩＴＯ電極の表面に直接滴下し、ＥＣＬセンサ界面を構築した。反応溶液をセンサ界面に滴下し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化されない場合、ＢＨＱはｓｓＤＮＡを介してＢＢ ＮＲｓ表面に接続され、センサ電極は低ＥＣＬ強度を表示する（ＥＣＬ ＯＦＦ）。一方、標的分子（標的核酸）が存在し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化される場合、ｓｓＤＮＡが切断され、それによりＢＨＱはＢＢ ＮＲｓ表面から離脱し、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬを回復させ、センサ界面に強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。
ａ．信号スイッチの原理
ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブをレポータープローブとして説明する。図２に示すように、ｓｓＤＮＡの末端にＢＨＱが修飾されているため、ＢＢ ＮＲｓはＥＣＬ ＯＦＦ状態である。ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブをＩＴＯ電極の表面に直接滴下し、ＥＣＬセンサ界面を構築した。反応溶液をセンサ界面に滴下し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化されない場合、ＢＨＱはｓｓＤＮＡを介してＢＢ ＮＲｓ表面に接続され、センサ電極は低ＥＣＬ強度を表示する（ＥＣＬ ＯＦＦ）。一方、標的分子（標的核酸）が存在し、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化される場合、ｓｓＤＮＡが切断され、それによりＢＨＱはＢＢ ＮＲｓ表面から離脱し、ＢＢ ＮＲｓのＥＣＬを回復させ、センサ界面に強いＥＣＬ信号を生成する（ＥＣＬ ＯＮ）。
【0143】
ｂ．信号スイッチの検証
まず、蛍光でＣａｓ１２ａ酵素のｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブに対するスイッチ応答を解析した。
まず、蛍光でＣａｓ１２ａ酵素のｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブに対するスイッチ応答を解析した。
【0144】
Ｃａｓ酵素－蛍光試験の試験条件は以下のとおりである。
検出装置：蛍光励起検出装置
励起波長：３６５ ｎｍ
発射波長範囲：４００～７００ ｎｍ
ＰＭＴ：８００ Ｖ
反応前：５０μＬのｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ＋５０μＬの水
反応後：５０μＬのｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ＋５０μＬ Ｃａｓ１２ａ体系
なお、Ｃａｓ１２ａ体系：２．５μＬ Ｃａｓ１２ａ（１μＭ）＋５μＬ ｃｒＲＮＡ（１μＭ）＋５μＬ ＮＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０×）＋３２．５μＬ ＤＥＰＣ水＋５μＬ ＨＰＶ１６ ｄｓＤＮＡ（５００ ｎＭ）
検出装置：蛍光励起検出装置
励起波長：３６５ ｎｍ
発射波長範囲：４００～７００ ｎｍ
ＰＭＴ：８００ Ｖ
反応前：５０μＬのｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ＋５０μＬの水
反応後：５０μＬのｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ＋５０μＬ Ｃａｓ１２ａ体系
なお、Ｃａｓ１２ａ体系：２．５μＬ Ｃａｓ１２ａ（１μＭ）＋５μＬ ｃｒＲＮＡ（１μＭ）＋５μＬ ＮＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０×）＋３２．５μＬ ＤＥＰＣ水＋５μＬ ＨＰＶ１６ ｄｓＤＮＡ（５００ ｎＭ）
【0145】
蛍光試験の結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、本発明の実施例２で製造されたｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓプローブシグナルスイッチの実行可能性の分析結果を示す図である。ここで、図１５ＡはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓとＣａｓ１２ａ体系の反応前（曲線ａ）及び反応後（曲線ｂ）の蛍光解析結果を示す図である。図１５Ｂは異なるＩＴＯ電極の正規化ＥＣＬイメージング強度の解析結果を示す図である。ここで曲線ａはＢＢ ＮＲｓ修飾電極、曲線ｂはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ修飾電極、曲線ｃはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ＋Ｃａｓ１２ａ＋ｃｒＲＮＡ体系修飾電極に１ｎＭ標的分子を添加した結果を示し、曲線ｄはｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓ＋Ｃａｓ１２ａ＋ｃｒＲＮＡ修飾電極に標的分子を添加していない結果を示す。
【0146】
図１５Ａは、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓとＣａｓ１２ａ体系の反応前（曲線ａ）及び反応後（曲線ｂ）の蛍光解析結果を示す図である。図１５Ａに示すように、１ ｎＭの標的分子でＣａｓ１２ａ酵素を活性化した後、ｓｓＤＮＡ ＢＢ ＮＲｓの蛍光が大きく回復した（曲線ｂ）。
【0147】
図１５Ｂは、異なるＩＴＯ電極の正規化ＥＣＬイメージング強度の解析結果を示す図である。図１５Ｂに示すように、ＢＢ ＮＲｓで修飾されたセンサ電極（曲線ａ）に比べて、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓで修飾されたセンサ界面にＥＣＬイメージング信号（曲線ｂ）がほとんどなく、センサ界面がＥＣＬ ＯＦＦ状態であることを示した。１ ｎＭ標的分子を添加した後、Ｃａｓ１２ａ酵素が活性化され、ＢＢ ＮＲｓ上のＢＨＱ－ｓｓＤＮＡが切断され、ＥＣＬ ＯＮ応答を発生し、センサ電極のＥＣＬ強度が～７５％（曲線ｃ）に回復した。この結果は、ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブに基づくＥＣＬスイッチ体系の実行可能性を示した。
【0148】
また、図１５Ｂから分かるように、ＤＮＡ－ＢＨＱ２とＢＢ ＮＲｓの接続によりＢＢ ＮＲｓのＥＣＬ発射の９５．６％消光（曲線ａ、ｂ）をもたらした。
【0149】
実施例３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ変換触媒に基づくＨＰＶ遺伝子の電気化学発光検出方法
ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓに基づいて構築されたセンサアレイのＥＣＬイメージング検出
ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓに基づいて構築されたセンサアレイのＥＣＬイメージング検出
【0150】
ａ．検出の設計
該検出方法は「ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブのＥＣＬスイッチ」（図２）に基づいて構築され、ＨＰＶ遺伝子の検出に用いられる。
該検出方法は「ｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓナノプローブのＥＣＬスイッチ」（図２）に基づいて構築され、ＨＰＶ遺伝子の検出に用いられる。
【0151】
ｂ．検出チップの製造及びそれによる検出：具体的な検出フローは図３に示すとおりである。
【0152】
具体的な操作ステップは以下のとおりである。
【0153】
ステップ１：酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）ガラスをトルエン、アセトン、エタノール及び超純水でそれぞれ５分間超音波洗浄し、次に電子ビーム蒸着スパッタリング装置により５ナノメートルの厚さのクロム層及び５０ナノメートルの金層をメッキし、Ａｕ／ＩＴＯ電極を得た。
【0154】
ステップ２：Ａｕ／ＩＴＯ電極の表面に多孔質シール（直径２ ｍｍ、深さ１ ｍｍ、４×７ウェルアレイ）を貼り付けた。
【0155】
ステップ３：各ウェルに３μＬのｓｓＤＮＡ－ＢＢ ＮＲｓを滴下し、３７℃で３０分間乾燥した後、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水で各ウェルを丁寧に洗浄した。
【0156】
ステップ４：０．１５μＬのＬｂＣａｓ１２ａ（１μＭ）、０．３μＬのｃｒＲＮＡ（７５０ ｎＭ）、０．３μＬ ＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）及び１.９５μＬ ＤＥＰＣ水を３７℃で１０分間反応させた後に、０．３μＬの異なる濃度のＨＰＶ１６ ｄｓＤＮＡ又はサンプルを添加し、得られた混合液を迅速にウェルに一つずつ滴下し、３７℃で４０分間インキュベートした。
【0157】
ステップ５：チップ上の各ウェルをＤＥＰＣ水で三回洗浄して、放出されたＢＨＱ２を除去した後に、３７℃で５分間乾燥した。その後、ＥＣＬイメージング検出に用いられた。
【0158】
ステップ６：Ａｕ／ＩＴＯ電極を動作電極とし、Ａｇ／ＡｇＣＬ電極を参照電極とし、白金ワイヤ電極を対電極とし、電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ、ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ａｎｄｏｒ、ＵＫ）を信号読み出し装置とし、５ ｍＭのトリ－ｎ－プロピルアミン（ＴＰｒＡ）の０．１ Ｍ ｐＨ７．４ リン酸塩緩衝溶液を電解質として、暗箱にＥＣＬイメージング検出を行った。０～＋１．０ Ｖの間にサイクリックボルタンメトリー走査を行い、走査速度が０．１Ｖ／ｓであり、露光時間が２０秒である。
【0159】
ｃ．ＥＣＬ検出条件の最適化
まず、異なる検出条件で本発明のＥＣＬ検出を行った。検出結果を図１６Ａ～図１６Ｃに示す。図１６Ａ～図１６Ｃは、本発明の実施例３の異なる検出条件でＥＣＬ検出を行う検出結果を示す図である。ここで、図１６Ａは異なるＣａｓ１２ａ濃度での検出結果を示す。図１６Ｂは異なるＣａｓ１２ａとｃｒＲＮＡの使用割合での検出結果を示す。図１６Ｃはチップでの異なるインキュベーション時間での検出結果を示す。
まず、異なる検出条件で本発明のＥＣＬ検出を行った。検出結果を図１６Ａ～図１６Ｃに示す。図１６Ａ～図１６Ｃは、本発明の実施例３の異なる検出条件でＥＣＬ検出を行う検出結果を示す図である。ここで、図１６Ａは異なるＣａｓ１２ａ濃度での検出結果を示す。図１６Ｂは異なるＣａｓ１２ａとｃｒＲＮＡの使用割合での検出結果を示す。図１６Ｃはチップでの異なるインキュベーション時間での検出結果を示す。
【0160】
具体的には、図１６Ａ～図１６Ｃに示すような異なるＣａｓ１２ａの濃度、Ｃａｓ１２ａとｃｒＲＮＡの使用割合、及びチップ上の反応時間の条件でＥＣＬ検出を行い、異なる反応条件でのチップに対して電解液でＥＣＬイメージング測定を行った。
【0161】
【0162】
検出において、ＥＣＬ信号が最大プラットフォーム期間に達する時の条件を選択し最適な検出条件とする。図１６Ａ～図１６Ｃに示すように、本発明のＥＣＬ検出の最適化条件は、それぞれＣａｓ１２ａの濃度が５０ ｎＭであり、Ｃａｓ１２ａ：ｃｒＲＮＡが１：１．５であり、インキュベーション時間が４０分間である。
【0163】
次に、ＢＢ ＮＲで修飾された、ＩＴＯ及びＡｕ／ＩＴＯ電極を５ ｍＭのＴＰｒＡ含有０．１Ｍ、ｐＨ ７．４ ＰＢＳにおけるＥＣＬ画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより比較した。その結果を図１７Ａ～図１７Ｃに示す。図１７Ａ～図１７Ｃは、本発明の実施例３のＩＴＯ電極とＡｕ／ＩＴＯを用いた場合のＥＣＬイメージング結果を示す図である。ここで、図１７Ａ、図１７Ｂ及び図１７ＣはそれぞれＢＢ ＮＲで修飾されたＩＴＯとＡｕ／ＩＴＯ電極のＣＶ、ＥＣＬ曲線及びＥＣＬ画像を示す。
【0164】
図１７Ａ～図１７Ｃから分かるように、ＢＢ ＮＲで修飾されたＩＴＯに比べて、ＢＢ ＮＲｓで修飾されたＡｕ／ＩＴＯは向上した酸化電流を示し、０．９３ Ｖの酸化ピークに移行し、４６倍のより強いＥＣＬ応答、及び改善されたＥＣＬイメージング品質を有する。該差異は、金のＴＰｒＡの酸化に対する良好な触媒能力を有するためと考える。
【0165】
ｄ．検出性能
図１８Ａおよび図１８Ｂは、本発明の実施例３のＨＰＶ１６ ＤＮＡ標的核酸をセンサアレイでＥＣＬ検出した検出結果を示す図である。ここで、図１８Ａは１ ｆＭ～１０ ｎＭ濃度のＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出して得られたＥＣＬイメージング結果及び線形曲線を示し、図１８ＢはＨＰＶ１６ ＤＮＡに対してＥＣＬ検出を行う検出特異性の分析結果を示す。ここで、ａは１ ｎＭ ＨＰＶ１８ ＤＮＡ、ｂは１ ｎＭ ＨＰＶ３１ ＤＮＡ、ｃは１ ｎＭ ＨＰＶ５８ ＤＮＡ、ｄは１００ ｐＭ ＨＰＶ１６ ＤＮＡ、ｅは１ ｎＭ ＨＰＶ１８、３１、５８ ＤＮＡと１００ ｐＭ ＨＰＶ１６ ＤＮＡを含む混合液を示す。
図１８Ａおよび図１８Ｂは、本発明の実施例３のＨＰＶ１６ ＤＮＡ標的核酸をセンサアレイでＥＣＬ検出した検出結果を示す図である。ここで、図１８Ａは１ ｆＭ～１０ ｎＭ濃度のＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出して得られたＥＣＬイメージング結果及び線形曲線を示し、図１８ＢはＨＰＶ１６ ＤＮＡに対してＥＣＬ検出を行う検出特異性の分析結果を示す。ここで、ａは１ ｎＭ ＨＰＶ１８ ＤＮＡ、ｂは１ ｎＭ ＨＰＶ３１ ＤＮＡ、ｃは１ ｎＭ ＨＰＶ５８ ＤＮＡ、ｄは１００ ｐＭ ＨＰＶ１６ ＤＮＡ、ｅは１ ｎＭ ＨＰＶ１８、３１、５８ ＤＮＡと１００ ｐＭ ＨＰＶ１６ ＤＮＡを含む混合液を示す。
【0166】
検出線形及び感度：最適な検出条件で、構築されたセンサアレイでＨＰＶ１６ ＤＮＡ標的分子に対してＥＣＬイメージング検出を行った。その結果を図１８Ａに示す。図１８Ａの上方に濃度が１ ｆＭから１０ ｎＭのＨＰＶ１６ ＤＮＡに対するイメージング検出の結果を示す。当該結果から、ＥＣＬの強度がＨＰＶ１６ ＤＮＡ濃度の増加に伴って増加することが分かった。ＥＣＬ強度のアナログデジタル変換値（Ａ／Ｄ ｃｏｕｎｔ）とＨＰＶ１６ ＤＮＡ濃度の対数をプロットし、１ ｆＭ～１０ ｎＭの範囲内に良好な線形関係を呈することが見えた。３Ｓ／Ｎに基づいて計算することにより、該方法のＨＰＶ１６ ＤＮＡに対する検出限界は０．６ ｆＭである。
【0167】
検出選択性についての試験：本実施例において、さらに１０倍の高濃度の干渉ＤＮＡが存在する場合に、標的核酸ＨＰＶ１６ ＤＮＡに対する検出特異性を試験した。実験結果を図１８Ｂに示す。図１８Ｂは１ ｎＭ ＨＰＶ１８ ＤＮＡ、１ ｎＭ ＨＰＶ３１ ＤＮＡ、１ ｎＭ ＨＰＶ５８ ＤＮＡの単独（ａ、ｂ、ｃ）又は共存状況（ｅ）で１００ ｐＭ ＨＰＶ１６ ＤＮＡ（ｄ）に対してＥＣＬ検出を行う検出結果を示す。当該結果は、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを含有するサンプル溶液のみが明らかなＥＣＬ信号を有し、本方法がＨＰＶ１６ ＤＮＡの検出に対して良好な選択性を有することを示した。
【0168】
産業上の利用可能性
上記実施例から分かるように、本発明はＢＣｚＰ－ＢＴを発光分子として使用し、初めて敏感な消滅ＥＣＬ及び強共反応剤ＥＣＬの発光を有するホット励起子有機ナノロッド（ＢＢ ＮＲ）を製造した。局所励起状態に由来する高ΦＰＬ及び電荷転移状態に由来する高い励起子利用効率を有するため、従来の蛍光材料及び熱活性化遅延蛍光材料より優れたΦＥＣＬを示した。さらに、本発明のＥＣＬナノプローブを使用し、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素体系により標的核酸を識別し、信号をオフからオンに切り替えることにより、簡略化された操作手順を有するＨＰＶ１６ ＤＮＡの迅速及びハイスループット検出を実現した。したがって、本発明により、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するための高感度ＥＣＬ検出プラットフォームを構築することができる。その検出効果は、ＥＣＬ標準と見られるＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を使用したＥＣＬ検出方法に近い。したがって、本発明のＥＣＬ検出方法は実行可能でかつ検出信頼性を有するＥＣＬ検出方法である。
上記実施例から分かるように、本発明はＢＣｚＰ－ＢＴを発光分子として使用し、初めて敏感な消滅ＥＣＬ及び強共反応剤ＥＣＬの発光を有するホット励起子有機ナノロッド（ＢＢ ＮＲ）を製造した。局所励起状態に由来する高ΦＰＬ及び電荷転移状態に由来する高い励起子利用効率を有するため、従来の蛍光材料及び熱活性化遅延蛍光材料より優れたΦＥＣＬを示した。さらに、本発明のＥＣＬナノプローブを使用し、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素体系により標的核酸を識別し、信号をオフからオンに切り替えることにより、簡略化された操作手順を有するＨＰＶ１６ ＤＮＡの迅速及びハイスループット検出を実現した。したがって、本発明により、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するための高感度ＥＣＬ検出プラットフォームを構築することができる。その検出効果は、ＥＣＬ標準と見られるＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を使用したＥＣＬ検出方法に近い。したがって、本発明のＥＣＬ検出方法は実行可能でかつ検出信頼性を有するＥＣＬ検出方法である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【配列表】