特開 2024-177176 生体分子を分離するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024177176

(43)【公開日】2024-12-19

(54)【発明の名称】生体分子を分離するための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20241212BHJP

   B03C 1/01 20060101ALI20241212BHJP

   B03C 1/02 20060101ALI20241212BHJP

   B03C 1/00 20060101ALI20241212BHJP

   B03C 1/23 20060101ALI20241212BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22

B03C1/01

B03C1/02 A

B03C1/00 A

B03C1/00 B

B03C1/23

B03C1/00 H

【審査請求】有

【請求項の数】38

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024152524

(22)【出願日】2024-09-04

(62)【分割の表示】P 2021557164の分割

【原出願日】2020-03-23

(31)【優先権主張番号】1904225.8

(32)【優先日】2019-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1914134.0

(32)【優先日】2019-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(71)【出願人】

【識別番号】597064713

【氏名又は名称】サイティバ・スウェーデン・アクチボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100154922

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 允辰

(74)【代理人】

【識別番号】100207158

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 研二

(72)【発明者】

【氏名】オラ・リンド

(72)【発明者】

【氏名】ニルス・ノルマン

(72)【発明者】

【氏名】サラ・ハグブラッド・サールベリ

(72)【発明者】

【氏名】ロニー・パルムグレーン

(57)【要約】

【課題】生体分子を分離するための改善した方法に対するニーズが存在する。
【解決手段】本開示は、生体分子を細胞培養物から又は生体溶液から分離するための方法であって、（ａ）生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、（ｂ）生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持する工程と、（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄する工程と、（ｅ１）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持しつつ、磁気セパレーターを通過する溶出液の流れを提供して、結合した生体分子を磁性粒子から溶出させる工程と、（ｆ１）磁気セパレーターから溶出した生体分子をメンブレンクロマトグラフィーデバイスに搬送する工程と、（ｇ１）メンブレンクロマトグラフィーにより、不純物及び／又は汚染物質から生体分子を分離する工程とを含む方法と関連する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体分子を細胞培養物から分離するための方法であって、
（ａ）前記生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、
（ｂ）前記生体分子を含む細胞培養物を前記磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、
（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に前記磁性粒子を保持する工程と、
（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて前記磁性粒子を洗浄する工程と、
（ｅ）前記磁気セパレーターの少なくとも１つの面において前記磁性粒子を攪拌して、前記磁気セパレーター内に磁性粒子の流動床を形成する工程と、
（ｆ）前記磁場を用いて前記磁気セパレーター内に前記磁性粒子を保持しつつ、前記少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向に溶出液の流れを提供して、前記結合した生体分子を前記磁性粒子から溶出させる工程と
を含む方法。

【請求項2】

工程（ｅ）が、前記磁場の強度を変化させることにより、例えば振動磁場を適用すること等により、前記磁性粒子を攪拌する工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

生体分子を細胞培養物から又は生体溶液から分離するための方法であって、
（ａ）前記生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、
（ｂ）前記生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を前記磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、
（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に前記磁性粒子を保持する工程と、
（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて前記磁性粒子を洗浄する工程と、
（ｅ１）前記磁場を用いて前記磁気セパレーター内に磁性粒子を保持しつつ、前記磁気セパレーターを通過する溶出液の流れを提供して、前記結合した生体分子を前記磁性粒子から溶出させる工程と、
（ｆ１）前記磁気セパレーターから溶出した前記生体分子をメンブレンクロマトグラフィーデバイスに搬送する工程と、
（ｇ１）メンブレンクロマトグラフィーにより、不純物及び／又は汚染物質から前記生体分子を分離する工程と
を含む方法。

【請求項4】

工程（ｅ１）が、
（ｅ１ａ）前記磁気セパレーターの少なくとも１つの面において前記磁性粒子を攪拌して、前記磁気セパレーター内に磁性粒子の流動床を形成する工程と、
（ｅ１ｂ）前記少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向に溶出液の流れを提供して、前記結合した生体分子を前記磁性粒子から溶出させる工程と
を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

工程（ｅ１ａ）が、前記磁場の強度を変化させることにより、例えば振動磁場を適用すること等により、前記磁性粒子を攪拌する工程を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程（ｇ１）において、前記生体分子が前記メンブレンクロマトグラフィーデバイス内に滞留する時間が、約０．５秒～約６分、好ましくは約１秒～約３０秒の範囲である、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記磁気セパレーターが、前記メンブレンクロマトグラフィーデバイスを通じて溶出液の流れ及び任意選択的に洗浄液の流れを提供するクロマトグラフィーシステムと接続している、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記メンブレンクロマトグラフィーデバイスが、使用する際に、移動相が通過可能である複数の細孔を備える静止相を形成する、１つ又は複数の静電紡糸ポリマーナノファイバーを含むクロマトグラフィー材料を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記静止相がメンブレンの形態である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記メンブレンクロマトグラフィーデバイスが、少なくとも１つの吸着性メンブレンを含む、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記吸着性メンブレンが、ポリマーナノファイバーを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記メンブレンが、ポリマーナノファイバーの不織布ウェブを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

ポリマーが、ポリスルホン、ポリアミド、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、及びポリエチレンオキサイド、及びその混合物からなる群から選択される、請求項８から９及び１１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ポリマーが、セルロース及びセルロースの部分的誘導体、特にセルロースエステル、架橋セルロース、グラフト結合セルロース、又はリガンド結合セルロースからなる群から選択されるようなセルロース性ポリマーである、請求項８から９及び１１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記メンブレンクロマトグラフィーデバイスが、（ｉ）正に荷電した基、例えば四級アミノ基、四級アンモニウム基、若しくはアミン基等、又は（ｉｉ）負に荷電した基、例えばスルホネート基若しくはカルボキシレート基等により機能化されたクロマトグラフィー材料を含む、請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記メンブレンクロマトグラフィーデバイスが、マルチモーダルアニオン交換リガンド及びマルチモーダルカチオン交換リガンドからなる群から選択されるマルチモーダルリガンドにより機能化されたクロマトグラフィー材料を含む、請求項３から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記マルチモーダルアニオン交換リガンドが、支持体とカップリングしたＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンリガンドであり、前記支持体が、リンカーを介して前記リガンドの窒素原子とリンクしている、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記メンブレンクロマトグラフィーデバイスが、（ｉ）イオン交換基、（ｉｉ）親和性ペプチド／タンパク質に基づくリガンド、（ｉｉｉ）疎水的相互作用リガンド、（ｉｖ） ＩＭＡＣリガンド、又は（ｖ） ＤＮＡに基づくリガンド、例えばオリゴｄＴ等により機能化されたクロマトグラフィー材料を含む、請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

工程（ｇ１）の前記メンブレンクロマトグラフィーが、フロースルーメンブレンクロマトグラフィーである、請求項３から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

メンブレン又はクロマトグラフィー材料を通じた溶出液の流れが、通常流又は接線流である、請求項８から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

工程（ｅ１）と工程（ｆ１）との間に、溶出液のｐＨの調整、溶出液の希釈、又は溶出液の電気伝導度の調整を実施する工程を更に含む、請求項３から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記メンブレンクロマトグラフィーデバイス（１０１）が、
対流に基づくクロマトグラフィー材料を含む、少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット（１０３）と、
液体を、少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット（１０３）の内部及びその外部に送達するように構成された少なくとも１つの液体送達システム（１０７）と、
インレット（１１５）と、
液体送達システム（１０７）により、前記インレットを少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット（１０３）に結びつける少なくとも１つのインレット流体チャンネル（１１７）と、
アウトレット（１１９）と、
液体送達システム（１０７）を介して、アウトレット（１１９）を少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット（１０３）に結びつける少なくとも１つのアウトレット流体チャンネル（１２１）であって、少なくともインレット（１１５）及びアウトレット（１１９）が開放されたまま、前記メンブレンクロマトグラフィーデバイス（１０１）の少なくともいくつかの部分が共に密閉されている、少なくとも１つのアウトレット流体チャンネル（１２１）と
を含む、請求項３から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

工程（ｂ）又は工程（ｃ）が、前記磁性粒子を、少なくとも１つの撹拌機、例えば複数の撹拌機等を含む磁気セパレーターに添加する工程を含み、及び工程（ｅ）又は工程（ｅ１ａ）が、撹拌機のスイッチをオンにすることにより、前記磁性粒子を攪拌する工程を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

工程（ｄ）が、下記のサブ工程、
（ｄ１）少なくとも１つの面において前記磁性粒子を攪拌して、磁性粒子の流動床を形成する工程と、
（ｄ２）前記磁場内で前記磁性粒子を保持しつつ、前記少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向に洗浄液の流れを提供して前記細胞培養物を除去する工程と
を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

工程（ｅ）又は工程（ｅ１ａ）が、前記磁気セパレーターの複数の実質的に平行な面において、前記磁性粒子を攪拌して磁性粒子の複数の流動床を形成する工程を含み、及び工程（ｆ）又は工程（ｅ１ｂ）が、複数の面に対して実質的に直角方向に、前記溶出液の流れを提供する工程を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記生体分子が、最大１０ベッド容積、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ベッド容積等、好ましくは最大４ベッド容積、より好ましくは最大３ベッド容積の溶出液を用いて溶出される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

少なくとも工程（ｃ）～工程（ｆ）又は工程（ｃ）～工程（ｅ１）、例えば工程（ｂ）～工程（ｆ）又は工程（ｂ）～工程（ｅ１）等が、前記磁気セパレーター内で実施され、好ましくは前記磁気セパレーターが高勾配磁気分離システムである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

工程（ｂ）が、
（ｉ）前記磁性粒子を磁気セパレーターに添加する工程と、その後に前記細胞培養物に由来するフィードを前記磁気セパレーターに提供する工程、又は
（ｉｉ）前記結合した生体分子を含む、前記細胞培養物と前記磁性粒子との混合物に由来するフィードを磁気セパレーターに提供する工程
を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

工程（ｂ）～工程（ｆ）又は工程（ｂ）～工程（ｅ１）が、統合型バイオリアクター容器／コンタクター及び磁気セパレーター内で実施される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

工程（ｄ）が、下記のサブ工程、
（ｉ）前記磁場を除去する工程と
（ｉｉ）前記磁性粒子を再懸濁する工程と、
（ｉｉｉ）前記磁性粒子を洗浄液の一部分と接触させる工程と、
（ｉｖ）磁場を用いて前記磁性粒子を保持する工程と、
（ｖ）保持された前記磁性粒子から前記洗浄液を除去する工程と
を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

工程（ｄ）が、工程（ｅ）又は工程（ｅ１）に進む前に少なくとも１回繰り返される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

工程（ｆ）又は（ｅ１）における前記溶出液の線流速が、工程（ｆ）において１０～３０００ｃｍ／時の範囲、好ましくは５０～６００ｃｍ／時の範囲である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

工程（ｅ）又は（ｅ１ａ）における撹拌機のスピードが、１５～１５００ｒｐｍの範囲、好ましくは５０～３００ｒｐｍの範囲である、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記磁気セパレーターが、クロマトグラフィーシステムと接続している、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記磁性粒子が、８～３００μｍの範囲、好ましくは３７～１００μｍの範囲の容積加重されたメジアン直径（ｄ５０、ｖ）を有する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記磁性粒子が、沈降した粒子１ｍｌ当たり１．０５～１．２０ｇの平均密度を有する、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記磁性粒子のそれぞれが、多孔性ポリマーマトリックス及び前記多孔性ポリマーマトリックス中に埋め込まれた１つ又は複数の磁性顆粒を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記磁性粒子のそれぞれが、５～１５質量％の前記磁性顆粒を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記磁性顆粒が、１～５μｍの容積加重されたメジアン直径（ｄ５０、ｖ）を有する、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項40】

前記磁性粒子のそれぞれが、粒子の中央領域において、前記粒子の表面領域における濃度の少なくとも２００％の磁性顆粒の濃度を含み、前記中央領域が、粒子表面から粒子半径の０．２倍を上回る距離を有することとして定義され、及び前記表面領域が、粒子表面から粒子半径の０．２倍未満の距離を有することとして定義される、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、生体分子分離分野に関し、特に磁気セパレーター内で細胞培養物から又は生体溶液から生体分子を分離するための方法と関連する。

【背景技術】

【0002】

磁性吸着ビーズを使用して生体分子を分離することは、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第７５０６７６５Ｂ２号は、磁場内に配置されている磁性材料のプレート状分離構造のマトリックスを通じて実施される、懸濁物からの磁性粒子の選択的分離を目的とする高勾配磁気セパレーターについて記載する。更に、本明細書により参考としてそのまま組み込まれている米国特許第６６０２４２２Ｂ１号は、マイクロ分離カラム上で生体物質を精製するための分離及び放出方法に関する。同方法は、磁性担体からの生体物質の放出及びマイクロ分離カラムからの溶出を含み、但し該磁性担体は、強磁性粒子のマトリックスによりマイクロ分離カラム内部になおも磁気的に保持されている。国際公開第２０１８１２２２４６号は、生体分子を細胞培養物から分離するための方法であって、生体分子を磁性ビーズに結合させる工程、磁気セパレーターを使用することにより、結合した生体分子を含む磁性ビーズを残りの細胞培養物から分離する工程、結合した生体分子を含む磁性ビーズを、添加したバッファーと共にスラリーとして搬送して、溶出細胞を分離する工程、及び生体分子を溶出細胞内の磁性ビーズから溶出させる工程を含む方法について記載する。また、国際公開第２０１８１２２０８９号も、多孔性マトリックス及びマトリックス内に埋め込まれた１つ又は複数の磁性粒子を含み、そして多孔性マトリックスと共有結合的にカップリングした免疫グロブリン結合リガンドを更に含む磁性ビーズに関する。

【0003】

磁性ビーズ処理は、未精製のフィード細胞ストックから標的生体分子を直接精製する有効なやり方であり、またこの技術は、清澄化ツール、例えば遠心分離、濾過、及びキャプチャークロマトグラフィー等に置き換わることができる。磁性ビーズは、標的生体分子に対して親和性を有するリガンドにより機能化される。磁性ビーズが添加され、そしてフィード内のすべての標的生体分子に特異的に結合するように、未精製のフィードと所定の時間混合される。結合後、磁性ビーズはマグネットによりトラップされる一方、細胞及び不純物はデカント除去される。洗浄バッファーが磁性ビーズに添加され、そしてマグネットは解除され、そして洗浄バッファー及び磁性ビーズと共に混合される。混合後、マグネットを稼働させるとビーズがトラップされ、そして洗浄バッファーはデカント除去される。数回洗浄後、溶出バッファーが、洗浄バッファーの場合と同様に磁性ビーズに添加され、そしていくつかのバッチ溶出工程を使用することで、標的生体分子が磁性ビーズから放出される。すべての洗浄工程及び溶出工程はバッチモードで行われ、また高溶出収率を実現するために数回のバッチ溶出工程を実施する必要があるので、この技術を使用した場合、標的物は、カラムクロマトグラフィーと比較してそれよりも稀釈されてしまう。また、バッチ溶出法を使用した場合、溶出バッファーは、磁性ビーズから標的生体分子を放出させるための適正な溶出条件に到達するために、洗浄バッファーの用量を設定する必要があり、また溶出工程毎に異なる又は大量の溶出バッファーを必要とするので、溶出条件を最適化するのもより困難である。これを克服する一つのやり方は、洗浄したビーズを溶出工程用のクロマトグラフィーカラム中に移して溶出バッファー容積を減少させ、そして最適化された１つの溶出バッファーによる分画化を使用して溶出プールを収集することである。しかしながら、これは追加の機器及びカラム充填を必要とし、時間がかかる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第７５０６７６５Ｂ２号

【特許文献2】米国特許第６６０２４２２Ｂ１号

【特許文献3】国際公開第２０１８１２２２４６号

【特許文献4】国際公開第２０１８１２２０８９号

【特許文献5】米国特許第２０１４０２９６４６４Ａ１号

【特許文献6】米国特許第２０１６０２８８０８９Ａ１号

【特許文献7】国際公開第２０１８０１１６００Ａ１号

【特許文献8】国際公開第２０１８０３７２４４Ａ１号

【特許文献9】国際公開第２０１３０６８７４１Ａ１号

【特許文献10】国際公開第２０１５０５２４６５Ａ１号

【特許文献11】米国特許第７８６７７８４Ｂ２号

【特許文献12】インド特許第２０１９１１０１９２８９号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｕｓ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ－ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／ｆｉｂｒｏ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従って、当技術分野において、プロセス時間の短縮及びより高コスト効率のプロセスを実現しつつ、未精製フィードから生体分子を効率的に捕捉及び精製することを含む、生体分子を分離するための改善した方法に対するニーズが存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

生体分子を分離するための改善した方法を提供する上記目的は本開示により達成され、同目的は、磁気セパレーター内でフロー溶出及び撹拌を同時に適用することにより生体分子を分離するための方法に関する。本明細書に示す通り、これにより、少ない溶出容積を使用することで、驚異的に高い収率及び純度を有して標的生体分子を磁気セパレーターから直接フロー溶出することが可能である。方法の精度はカラムクロマトグラフィーの精度に等しくありながら、必要とされるプロセス時間は実質的により短い。

【0008】

より具体的には、本開示は、生体分子を細胞培養物から又は生体溶液から分離するための方法であって、
（ａ）生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、
（ｂ）生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、
（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持する工程と、
（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄する工程と、
（ｅ）磁気セパレーターの少なくとも１つの面において磁性粒子を攪拌して、磁気セパレーター内に磁性粒子の流動床を形成する工程と、
（ｆ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持しつつ、少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向に溶出液の流れを提供して、結合した生体分子を磁性粒子から溶出させる工程と
を含む方法と関連する。

【0009】

本発明者らが実現した更なる改善として、磁気分離には、メンブレンクロマトグラフィーが生体分子を更に精製するために後続し得ることが挙げられる。従って、本開示は、生体分子を細胞培養物から又は生体溶液から分離するための方法であって、
（ａ）生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、
（ｂ）生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、
（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持する工程と、
（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄する工程と
（ｅ１）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持しつつ、磁気セパレーターを通過する溶出液の流れを提供して、結合した生体分子を磁性粒子から溶出させる工程と、
（ｆ１）磁気セパレーターから溶出した生体分子をメンブレンクロマトグラフィーデバイスに搬送する工程と、
（ｇ１）メンブレンクロマトグラフィーにより、不純物及び／又は汚染物質から生体分子を分離する工程と
を含む方法を提供する。

【0010】

本開示の好ましい態様を、本発明を実施するための形態及び従属する特許請求の範囲において、以下に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本開示に基づき生体分子を分離するための方法のフローチャートを示す図である。

【図2】本開示の方法で使用するのに適するシステムを図式的に示す図である。

【図3】本開示の方法で使用するのに適する磁気セパレーターの非限定的な実施形態の概略図を示す図である。

【図4】下記実施例１に記載されているポリクロナールＩｇＧ実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図5A】下記実施例２に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図5B】下記実施例２に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図5C】下記実施例２に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図6】本開示に基づき生体分子を分離するための代替法のフローチャートを示す図である。

【図7】本開示に基づき生体分子を分離するための代替法の１つの実施形態に基づき使用され得るメンブレンクロマトグラフィーデバイスの断面を示す図である。

【図8A】下記実施例３に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図8B】下記実施例３に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図8C】下記実施例３に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【図8D】下記実施例３に記載されているモノクロナール抗体（ｍＡｂ）実験から得られた溶出曲線を表すグラフを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本開示は、図１に例示するような、細胞培養物から又は生体溶液から生体分子を分離するための方法を提供することにより、生体分子を分離するための既存の方法と関連する問題を解決し、又は少なくとも緩和するが、同方法は、
（ａ）生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、
（ｂ）生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、
（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持する工程と、
（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄する工程と、
（ｅ）磁気セパレーターの少なくとも１つの面において磁性粒子を攪拌して、磁気セパレーター内に磁性粒子の流動床を形成する工程と、
（ｆ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持しつつ、少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向に溶出液の流れを提供して、結合した生体分子を磁性粒子から溶出させる工程と
を含む。

【0013】

本開示の方法の顕著な利点として、生体分子が驚異的に低い総溶出容積、より具体的には、最大１０ベッド容積の溶出液、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ベッド容積等、好ましくは最大４ベッド容積、より好ましくは最大３ベッド容積である溶出容積を用いて溶出されることが挙げられる。本明細書では、「ベッド容積」は、通常ミリリットル（ｍｌ若しくはｍＬ）又はリットル（Ｌ）で表わされる、沈降した磁性粒子の容積として理解される。生体分子を溶出するのに必要とされる総溶出容積が小さいほど、溶出した生体分子のサンプルの濃度は高まり、分散度は低くなる。大容量のサンプルの取り扱いを回避するために、生体分子の濃度が高い方が後続するポリッシング工程のいずれにおいても望ましい。

【0014】

上記したように、本開示の方法の更なる改善は、磁気分離後のメンブレンクロマトグラフィーによる生体分子の更なる精製と関係し得る。従って、本開示は、図６に例示するように、細胞培養物又は生体溶液から生体分子を分離するための方法を提供するが、同方法は、
（ａ）生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を提供する工程と、
（ｂ）生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を磁性粒子と接触させて、結合した生体分子を含む磁性粒子を取得する工程と、
（ｃ）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持する工程と、
（ｄ）任意選択的に、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄する工程と、
（ｅ１）磁場を用いて磁気セパレーター内に磁性粒子を保持しつつ、磁気セパレーターを通過する溶出液の流れを提供して、結合した生体分子を磁性粒子から溶出させる工程と、
（ｆ１）磁気セパレーターから溶出した生体分子をメンブレンクロマトグラフィーデバイスに搬送する工程と、
（ｇ１）メンブレンクロマトグラフィーにより、不純物及び／又は汚染物質から生体分子を分離する工程と
を含む。

【0015】

磁気分離後にメンブレンクロマトグラフィーを追加すると、高純度の生体分子をもたらす極めて単純且つ迅速なプロセスが得られる。

【0016】

用語「生体分子」は、生体分子が細胞培養物中の細胞によって産生され（多くの場合、組換えにより）、そして任意の分離及び精製手段によって細胞培養物から精製されるバイオプロセシングの分野におけるその従来の意味を有する。代替的に、生体分子は、細胞培養物に必ずしも由来しない生体溶液中に存在する。生体分子の非限定的な例は、共にリンクしたモノマーからなる大型の生物学的ポリマー、例えば酵素、抗体及び抗体断片、並びに炭水化物、及び核酸配列、例えばＤＮＡ及びＲＮＡ等を含む、但しこれらに限定されないペプチドやタンパク質（天然物又は組換え物であり得る）である生体高分子である。生体分子のその他の非限定的な例は、プラスミド及びウイルスである。生体分子又は生体高分子は、例えばバイオ医薬品、すなわち医薬化合物として使用されるように意図される生物学的高分子を含む、但しこれに限定されない生体分子であり得る。本明細書では、本開示の方法により、残りの細胞培養物又は生体溶液から分離される生体分子は、代替的に「標的生体分子」又は「標的」と呼ばれる場合もある。「生体分子」は生体分子の種類を意味するように意図され、そして該用語の単数形であっても、多数の生体分子のそれぞれを包含し得るものと理解される。

【0017】

本明細書において、用語「細胞培養物」とは、細胞の培養物又は培養される細胞の群を指し、その場合、細胞は任意の種類の細胞、例えば細菌細胞、ウイルス細胞、真菌細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞等であり得る。細胞培養物は曖昧であり得、すなわち複数の細胞を含み、又は細胞枯渇状態であり得、すなわち培養物は全く又はほとんど細胞を含まないが、しかし細胞を除去する前に細胞から放出された生体分子を含む。更に、本開示の方法で使用されるような曖昧な細胞培養物は、無処理細胞、破壊された細胞、細胞ホモジネート、及び／又は細胞ライセートを含み得る。

【0018】

用語「生体溶液」とは、生体分子又は数種類の生体分子の混合物を含む、生物学的起源の溶液を意味するように意図されている。生体溶液の例は、ヒト又は動物に由来する任意の種類の体液、例えば血漿、血液、喀痰、尿、及び乳汁等である。

【0019】

用語「磁性粒子」は、磁場により引き付けられ得る粒子として本明細書では定義される。同時に、本開示の方法で使用される磁性粒子は、磁場が存在しない場合には凝集しないものでなければならない。換言すれば、磁性粒子は超常磁性粒子のように挙動しなければならない。粒子は、任意の対称形状、例えば球形若しくは立方形等、又は任意の非対称形状を有し得る。球状の磁性粒子は、多くの場合磁性ビーズと呼ばれる。用語「磁性粒子」、「磁性ビーズ」、「Ｍａｇ粒子」、「Ｍａｇビーズ」、「マグ粒子」、及び「マグビーズ」は、本明細書では交換可能に使用され得るものと理解され、その範囲は球状形状を有する磁性粒子に限定されない。

【0020】

本開示の方法で使用するのに適する磁性粒子は、本明細書により参考としてそのまま組み込まれている国際公開第２０１８１２２０８９号に記載されている。特に、磁性粒子は、８～３００μｍの範囲、例えば８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、１０５、１１０、１５０、２００、２５０、又は３００μｍ等、好ましくは２０～２００μｍの範囲、より好ましくは３７～１００μｍの範囲の容積加重されたメジアン直径（ｄ５０、ｖ）を有し得る。更に、本開示の方法で使用するのに適する磁性粒子は、沈降した磁性粒子１ｍｌ当たり１．０５～１．２０ｇの平均密度を有し得る。

【0021】

本開示の方法で使用するのに適する磁性粒子は、多孔性マトリックス、好ましくは多孔性ポリマーマトリックス、及び多孔性マトリックス中に埋め込まれた１つ又は複数の磁性顆粒を含み得る。磁性粒子は、好適には約５～１５質量％の磁性顆粒を含み得る。各磁性粒子の多孔性マトリックス中に埋め込まれた磁性顆粒は、約１～約５μｍの容積加重されたメジアン直径（ｄ５０、ｖ）を有し得る。更に、磁性粒子は、好適には、磁性粒子の中央領域において、該磁性粒子の表面領域における濃度の少なくとも２００％の磁性顆粒の濃度を含み得るが、但し、該中央領域は、該磁性粒子表面から粒子半径の０．２倍を上回る距離を有することとして定義され、及び該表面領域は、該磁性粒子の表面から粒子半径の０．２倍未満の距離を有することとして定義される。

【0022】

本開示の方法で使用される磁性粒子は、生体分子に結合することができるリガンドを含む。リガンドは、磁性粒子の多孔性マトリックスと共有結合的にカップリングし得る。リガンドの種類及び生体分子に対するその親和性定数ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎは、細胞培養物又は生体溶液から分離される生体分子の種類に基づき選択されるものと理解される。更に、磁性粒子１個当たりのリガンドの濃度は、例えば細胞培養物内又は生体溶液内の生体分子の濃度、磁性粒子の寸法、及び／又は磁気セパレーターに添加される磁性粒子の総容積に依存し、又はそれらと相互に関係するものと理解される。

【0023】

本開示の現時点で好ましい実施形態では、生体分子を分離するための本開示の方法で使用される磁性粒子は、Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ社、ａｒｔ． ｎｏ． １７５５００００）である。

【0024】

図２は、本開示に基づく方法を実施するのに使用され得る分離システム１の非限定的な例を図式的に示す。システム１は磁気セパレーター５を備える。用語「磁気セパレーター」は、分離プロセスの分野におけるその従来の意味を有し、そして磁性粒子を液体から分離する装置を指す。本開示の現時点で好ましい実施形態では、生体分子を分離するための本方法で使用される磁気セパレーターは高勾配磁気セパレーターであり、本明細書により参考としてそのまま組み込まれている米国特許第７５０６７６５Ｂ２号に記載されるように、高勾配磁気分離システム（ＨＧＭＳ）と代替的に呼ばれる。図２に示す分離システム１の部分は、本明細書により参考としてそのまま組み込まれている国際公開第２０１８１２２２４６号に記載されているシステムの部分と類似している。磁気セパレーター５は、前記生体分子を含む細胞培養物３又は生体溶液３由来のフィードを受け取り、及びこの生体分子に結合することができるリガンドを含む磁性粒子を受け取るためのインレット５ａを備える。磁気セパレーター５は、前記結合した生体分子を含む前記磁性粒子を、残りのフィードから分離するように構成される。磁気セパレーター５は、磁気セパレーター内部に磁性材料又は着磁可能材料の部分を含み、その部分は磁場が適用されたときに磁性粒子を引き付ける。

【0025】

図２に示す分離システム１は、磁気セパレーター５のインレット５ａと接続する捕捉セル９を備える。図２に示す捕捉セル９は、細胞培養物３由来のフィードを受け取るための細胞培養物／生体溶液インレット９ａ、及び磁性粒子を受け取るための少なくとも１つの磁性粒子インレット９ｂを備える。捕捉セル９は、細胞培養物又は生体溶液からのフィードを混合するように構成され、従って磁性粒子は、磁気セパレーター５に搬送される前に、標的生体分子が磁性粒子と結合するのを可能にする。しかしながら、捕捉セル９は、システム１の任意選択的なコンポーネントであるものと理解される。磁性ビーズが細胞培養物３又は生体溶液にそれぞれ添加され、結合した生体分子を含む、細胞培養物と磁性粒子との混合物に由来する、又は生体溶液と磁性粒子との混合物に由来するフィードを磁気セパレーター５に提供する工程が後続する場合には、細胞培養物３又は生体溶液３は捕捉セルとして等しく十分に機能し得る。別の代替案として、それに替えて磁性ビーズを磁気セパレーター５に直接添加することが挙げられる。細胞培養物又は生体溶液のそれぞれを個別に添加すること、及び磁性ビーズを磁気セパレーター中に直接添加することは、すべての実施形態について可能である。

【0026】

従って、本開示の方法の工程（ｂ）は、
（ｉ）磁性粒子を磁気セパレーターに添加する工程と、その後に細胞培養物又は生体溶液に由来するフィードを磁気セパレーターに提供する工程、又は
（ｉｉ）結合した生体分子を含む、細胞培養物と磁性粒子との混合物に由来する、若しくは生体溶液と磁性粒子との混合物に由来するフィードを磁気セパレーターに提供する工程
を含み得る。

【0027】

工程（ｂ）、すなわち、生体分子を含む細胞培養物又は生体溶液を磁性粒子と接触させて、生体分子を磁性粒子に結合させる工程の後、工程（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）に記載の磁性粒子は、結合した生体分子を含むものと理解される。

【0028】

上記した工程（ｄ）によれば、本開示の方法は、任意選択的に、洗浄液を用いて磁性粒子を洗浄する工程を含み得る。この目的のために、磁気セパレーター５は、好ましくは、磁性材料の部分に磁気的に結合したコンポーネント以外のその他のコンポーネントを磁気セパレーター５から洗い出すように構成された洗浄装置１３と接続している。洗浄装置１３は、ポンプ及びおそらくは捕捉セル９経由で磁気セパレーターのインレット５ａに接続した、少なくとも１つの洗浄バッファー供給装置１５、及び磁気セパレーター５のアウトレット５ｂに接続した洗浄バッファー収集装置１７を備える。洗浄装置１３は、磁性部分に結合したコンポーネント以外のフィードのその他のコンポーネントを洗い出すために、磁気セパレーター５を通じて洗浄バッファーを流すように構成される。

【0029】

本開示の方法によれば、磁性ビーズは、磁気セパレーターにおいてバッチモードで洗浄され得るが、磁気セパレーターは、磁性粒子がバッチモードで洗浄されるときに、磁場を放出するように構成されている。代替的且つ有利には、上記方法は、少なくとも１つの洗浄工程を連続モードで適用する工程を含み、この場合、上記方法の工程（ｄ）は、下記のサブ工程：
（ｄ１）少なくとも１つの面において磁性粒子を攪拌して、磁性粒子の流動床を形成する工程と、
（ｄ２）磁場内で磁性粒子を保持しつつ、少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向に洗浄液の流れを提供して、細胞培養物又は生体溶液を除去する工程と
を含む。

【0030】

本明細書において、慣用句「少なくとも１つの面に対して実質的に直角」は、少なくとも１つの面に対して８０～９０°の角度を意味するように解釈される。

【0031】

更に、本開示の方法の工程（ｄ）は、下記のサブ工程：
（ｉ）磁場を除去する工程と、
（ｉｉ）磁性粒子を再懸濁する工程と、
（ｉｉｉ）磁性粒子を洗浄液の一部分と接触させる工程と、
（ｉｖ）磁場を用いて磁性粒子を保持する工程と、
（ｖ）保持された磁性粒子から洗浄液を除去する工程と
を含み得る。

【0032】

代替的又は付加的に、本開示の方法の工程（ｄ）は、工程（ｅ）又は代替的に工程（ｅ１）に進む前に、少なくとも１回、例えば１、２、３回等、又はそれより多くの回数、反復され得る。

【0033】

図２に示すようなシステム１は、溶出液及び廃棄物を収集するための収集セル７を更に備える。本開示の方法の工程（ｆ）において、溶出液がインレット５ａ経由で磁気セパレーター５に進入可能にすることによって、及び溶出液がアウトレット５ｂ経由で磁気セパレーター５から排出可能にすることによって、磁気セパレーター５を通じて溶出液の流れが提供されるものと理解される。溶出した生体分子は、溶出液と共に磁気セパレーター５から排出され、そして磁気セパレーター５のアウトレット５ｂと接続した収集セル７内に収集され得る。

【0034】

従って、本開示の方法は、任意選択的に、工程（ｆ）の後に、磁場を用いて磁性粒子を磁気セパレーター内に保持しつつ、磁気セパレーターから溶出液と共に排出される溶出した生体分子を収集セル内に収集する工程を含む工程（ｇ）を更に含み得る。収集セルは、磁気セパレーターのアウトレットと接続している。

【0035】

代替的実施形態によれば、収集セル７の代わりに、図２に示すようなシステム１は、生体分子を更に精製（ポリッシングとも呼ばれる）するためのメンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１を備える。本実施形態では、本開示の方法の工程（ｅ１）において、溶出液がインレット５ａ経由で磁気セパレーター５に進入可能にすることによって、及び溶出液がアウトレット５ｂ経由で磁気セパレーター５から排出可能にすることによって、磁気セパレーター５を通じて溶出液の流れが提供される。溶出した生体分子は、溶出液と共に磁気セパレーター５から排出され、そして磁気セパレーター５のアウトレット５ｂと接続したメンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１内での不純物及び／又は汚染物質からの分離によって更に精製され得る。

【0036】

図２に示すシステム１において、細胞培養物３又は生体溶液３、磁気セパレーター５、及び収集セル７又は代替的にメンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１は、事前滅菌処理された可撓性チューブ及び無菌コネクターによって接続され得るものと理解される。更に、収集セル７又は代替的にメンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１は、事前滅菌処理済み且つディスポーザブルであり得る。単回使用のための閉鎖した滅菌状態の分離システムが、本明細書により提供可能である。

【0037】

本開示の方法を実施するのに使用される磁気セパレーターは、攪拌装置を更に備える（図２には図示せず；下記で更に記載するように、１つの非限定的な例を図３に示す）。攪拌装置は、磁性粒子に対して攪拌動作を適用し、磁気セパレーターを通過する流れの方向に対して直角の面内で磁性粒子を動き回らせるように構成される。攪拌装置は、少なくとも１つのコンポーネント、例えば振動磁場を適用すること、すなわち中央の点又は面付近で規則的に強度を変化させること等により、磁場の強度を変化させるように構成された複数のコンポーネント等を含み得る。従って、本開示の方法の工程（ｅ）又は代替的に工程（ｅ１）は、磁気セパレーターの少なくとも１つの面において磁場の強度を変化させることにより、例えば磁気セパレーターの少なくとも１つの面において振動磁場を適用すること等により、磁性粒子を攪拌する工程を含み得る。代替的に、攪拌装置は、少なくとも１つの撹拌機、例えば複数の撹拌機等を含み得るが、この場合、本開示の方法の工程（ｅ）又は代替的に工程（ｅ１）は、撹拌機を適用すること、又はそのスイッチをオンにすることにより、磁性粒子を攪拌する工程を含む。本明細書において、用語「撹拌機」とは、磁気セパレーター内で磁性粒子を攪拌する、例えば回転させ又はかき混ぜる等の能力を有する任意の種類のデバイス又は物質／材料を指す。適する撹拌機の非限定的な例は、磁気セパレーターの少なくとも１つの固定された構造に連結した、例えばローターを形成する中央の回転可能なキャリアシャフトに取り付けられたデバイス、例えば回転可能な分離構造等、例えば回転可能なディスク又は回転可能なブレード等である。分離構造は、例えば、ワイヤーメッシュ、有孔金属箔、又は有孔金属シートから構成され得る。

【0038】

有利には、撹拌機は着磁可能材料を含み得るが、この場合、撹拌機は磁気セパレーター内部の磁性材料の部分として作動することができ、その部分は、磁場が適用されたときに磁性粒子を引き付ける。

【0039】

図３は、本開示に基づく方法を実施するのに使用され得る磁気セパレーター５の非限定的な例の断面図を図式的に示す。図３の矢印は、インレット５ａから磁気セパレーター５に進入し、そして磁気セパレーター５のアウトレット５ｂから排出され得る液体（例えば、溶出液）の流れを例示する。磁気セパレーター５は筐体６を備え、及び電磁石が起動すると、磁気セパレーター内で磁場を生み出すように構成された中空で円筒形の電磁石１１を更に備える。磁気セパレーターは、複数の回転ディスク１７が取り付けられたローター１５を備える攪拌装置１３を更に備える。攪拌装置１３は、本開示の方法の工程（ｅ）又は代替的に工程（ｅ１）に基づき、磁気セパレーター５の少なくとも１つの面において磁性粒子２１を攪拌して、磁気セパレーター内に磁性粒子の流動床を形成するように構成される。図３では、磁気セパレーター５は、筐体６に取り付けられた複数の静止ディスク１９を更に備える。回転ディスク１７及び静止ディスク１９は、筐体６内で交互に配置されている。回転ディスク１７及び／又は静止ディスク１９は、着磁可能材料を含み得る。更に、回転ディスク１７及び／又は静止ディスク１９は、磁性粒子及び細胞培養物／生体溶液がディスクを通過できるように有孔であり得る。回転ディスクのコンフィギュレーション及び／又は静止ディスクのコンフィギュレーションは、図３に示すコンフィギュレーションとは異なってもよいものと理解される。例えば、静止ディスク１９は、例えばシーリング材料によってローター１５と接続し得る。更に、回転ディスクは、筐体６の壁に接合する場合もあれば、また結合しない場合もある。攪拌装置は、図３に示すコンポーネント以外のその他のコンポーネントを含み得るものと、更に理解される。例えば、磁気セパレーターの固定された構造に連結した着磁可能材料の部分を有することに替えて、又はそれに付加して磁気セパレーターの固定された構造のいずれにも連結しておらず、また磁場が適用されたときに磁性粒子を引き付け、そして磁場中の磁性粒子を磁気セパレーター内に保持する能力を有する磁性材料又は着磁可能材料の部分、例えば多量若しくは多数のスチールウール又はワイヤーウール等を磁気セパレーター内部に含めることが検討される。

【0040】

本開示の方法の工程（ｅ）又は代替的に工程（ｅ１ａ）は、磁気セパレーターの少なくとも１つの面内、例えば複数の実質的に平行な面又は平行面内等において磁性粒子を攪拌して、磁性粒子の複数の流動床を形成する工程を含み得る。本明細書において、「実質的に平行な面」とは、相互の関係において、０～１０°の角度で配置されている面として解釈される。複数の実質的に平行な面又は平行面の場合、工程（ｆ）又は代替的に工程（ｅ１ｂ）は、複数の面に対して実質的に直角又は直角の方向に溶出液の流れを提供する工程を含む。理論に拘泥するものではないが、攪拌装置が、磁気セパレーター内に平行に配置され、そして複数の平行面内で磁性粒子を撹拌するように構成された、回転可能なコンポーネントの形態の複数の撹拌機を含む場合には、撹拌機の各対の間に流動床を形成することが可能であると考えられている。

【0041】

本開示の方法において、工程（ｅ）における、又は代替的に工程（ｅ１）における撹拌機のスピードは、１５～１５００ｒｐｍの範囲、例えば１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、又は１５００等、好ましくは５０～３００ｒｐｍの範囲であり得る。

【0042】

代替的実施形態によれば、工程（ｅ）に後続する上記工程（ｆ）及び（ｇ）は、工程（ｅ１）に後続する工程（ｆ１）及び（ｇ１）に置き換わり、
（ｆ１）磁気セパレーターから溶出した生体分子をメンブレンクロマトグラフィーデバイスに搬送する工程と、
（ｇ１）メンブレンクロマトグラフィーにより、生体分子を不純物及び／又は汚染物質から分離する工程と
を含む。

【0043】

図２に示すシステム１内のメンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１の位置は上記されている。工程（ｇ１）は、生体分子のポリッシングと代替的に呼ばれる場合がある。

【0044】

用語「メンブレンクロマトグラフィー」は、バイオプロセシングの分野におけるその従来の意味を有する。メンブレンクロマトグラフィーでは、液体のコンポーネント、例えば、個々の分子、会合物、又は粒子を、該液体と接触する固相表面に結合させる工程が存在する。固相の活性な表面には、対流輸送により、分子のアクセスが可能である。充填式のクロマトグラフィーカラムに対するメンブレン吸着材の長所として、かなり高流速で稼働させるのにそれが適していることが挙げられる。これは対流式クロマトグラフィーとも呼ばれる。対流式クロマトグラフィーマトリックスには、マトリックスの流入側と流出側との間に水圧差を負荷することがマトリックスを潅流させる力となり、物質のマトリックス中への又はマトリックス外への実質的に対流式の輸送（高流速において非常に迅速にもたらされる）を実現する任意のマトリックスが含まれる。対流式クロマトグラフィー及びメンブレン吸着材は、例えば、本明細書により参考としてそのまま組み込まれている米国特許第２０１４０２９６４６４Ａ１号、同第２０１６０２８８０８９Ａ１号、国際公開第２０１８０１１６００Ａ１号、同第２０１８０３７２４４Ａ１号、同第２０１３０６８７４１Ａ１号、同第２０１５０５２４６５Ａ１号、米国特許第７８６７７８４Ｂ２号に記載されている。

【0045】

本開示の方法では、メンブレンクロマトグラフィーデバイスは、使用する際に、移動相が通過可能である複数の細孔を備える静止相を形成する、１つ又は複数の静電紡糸ポリマーナノファイバーを含むクロマトグラフィー材料を含み得る。静止相はメンブレンの形態であり得る。

【0046】

或いは、メンブレンクロマトグラフィーデバイスは、少なくとも１つの吸着性メンブレンを含み得る。吸着性メンブレンは、ポリマーナノファイバーを含み得る。任意選択的に、メンブレン、例えば吸着性メンブレンは、ポリマーナノファイバーの不織布ウェブを含み得る。

【0047】

ポリマーナノファイバーは、平均直径１０ｎｍ～１０００ｎｍを有し得る。いくつかの用途において、平均直径２００ｎｍ～８００ｎｍを有するポリマーナノファイバーが適する。平均直径２００ｎｍ～４００ｎｍを有するポリマーナノファイバーは、特定の用途に適し得る。

【0048】

クロマトグラフィー材料又はメンブレン、例えば吸着性メンブレンは、ポリスルホン、ポリアミド、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、及びポリエチレンオキサイド、及びその混合物からなる群から選択されるポリマーを含み得る。代替的又は付加的に、ポリマーは、例えばセルロース及びセルロースの部分的誘導体、特にセルロースエステル、例えばセルロースアセテート、架橋セルロース、グラフト結合セルロース、又はリガンド結合セルロース等からなる群から選択されるようなセルロース性ポリマーであり得る。

【0049】

本開示の方法において、メンブレンクロマトグラフィーデバイスは、（ｉ）正に荷電した基、例えば四級アミノ基、四級アンモニウム基、若しくはアミン基等、又は（ｉｉ）負に荷電した基、例えばスルホネート基若しくはカルボキシレート基等により機能化されたクロマトグラフィー材料を含み得る。代替的又は付加的に、メンブレンクロマトグラフィーデバイスは、マルチモーダルアニオン交換リガンド及びマルチモーダルカチオン交換リガンドからなる群から選択されるマルチモーダルリガンドにより機能化されたクロマトグラフィー材料を含み得る。マルチモーダルアニオン交換リガンドは、支持体とカップリングしたＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンリガンドであり得、前記支持体は、リンカーを介してリガンドの窒素原子とリンクしている。代替的又は付加的に、メンブレンクロマトグラフィーデバイスは、（ｉ）イオン交換基、（ｉｉ）親和性ペプチド／タンパク質に基づくリガンド、（ｉｉｉ）疎水的相互作用リガンド、（ｉｖ） ＩＭＡＣリガンド、又は（ｖ） ＤＮＡに基づくリガンド、例えばオリゴｄＴ等により機能化されたクロマトグラフィー材料を含み得る。

【0050】

対流式メンブレン吸着材について、その表面積及び容量を増加させるために、例えば上記のようなナノファイバーの使用等により、対流マトリックスの対流細孔のサイズを低下させることができる。その結果、しかしながら流れに対する抵抗は増加する。従って、高容量の対流マトリックスを含むクロマトグラフィーデバイスを通じて高速の流速を得るには、高動作圧に耐えることができるクロマトグラフィーデバイス及び設計を必要とする。

【0051】

メンブレンクロマトグラフィーが関係する本開示の方法の一実施形態では、本明細書により参考としてそのまま組み込まれている、これまでに出願された特許出願、インド特許第２０１９１１０１９２８９号、内部参照番号５０２８００－ＩＮ－１に詳記されているようなメンブレンクロマトグラフィーデバイスを使用することができる。

【0052】

図７に例示するように、メンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１は、カセット１０５内に設けられたクロマトグラフィー材料ユニット１０３を含む。メンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１は、少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット１０３の内部及び外部に液体を送達するように構成された液体送達システム１０７を更に含む。クロマトグラフィー材料ユニット１０３は、上記したような液体送達システム１０７の送達デバイス１０９ａと収集デバイス１０９ｂの間にサンドイッチされている。送達デバイス１０９ａ及び収集デバイス１０９ｂは、図７に示す実施形態において同一であるが、しかしながら、そうである必要はない。図７に示す実施形態において、カセット１０５は、送達デバイス１０９ａ及び収集デバイス１０９ｂの形態で、クロマトグラフィー材料ユニット１０３及び液体送達システム１０７を含む。別の実施形態では、前記液体送達システム１０７は、カセット１０５とは分離して、例えば分離ユニットとして提供可能、又はクロマトグラフィーデバイス１０１の筐体１１３に一体化可能である。

【0053】

メンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１は、筐体１１３を更に含み、その中に少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット３及びカセット１０５が設けられる。筐体は、トッププレート１２５及びボトムプレート１２７を備える。液体フィードを受け取るためのインレット１１５はトッププレート１２５に設けられ、またクロマトグラフィーデバイスからの液体流出流を移送するためのアウトレット１１９は、ボトムプレート１２７に設けられる。トッププレート１２５及びボトムプレート１２７は、インレット流体チャンネル１１７が、インレット１１５を、液体送達システム１０７を介してクロマトグラフィー材料ユニット１０３に結びつけるように、及びアウトレット流体チャンネル１２１が、アウトレット１１９を、液体送達システム１０７を介してクロマトグラフィー材料ユニット１０３に結びつけるように相互に接続している。

【0054】

液体送達システム１０７の送達デバイス１０９ａは、クロマトグラフィー材料ユニット１０３のインレット表面１５３ａに隣接して設けられたプレート（図示せず）を含み得るが、その場合、前記プレートは、クロマトグラフィーデバイス１０１のインレット１１５から供給された液体フィードを、クロマトグラフィー材料ユニット１０３に送達するためのいくつかの開口部を備え、該プレート内の前記開口部の総面積は、該プレートの残りの面積より小さく、又は該プレートの残りの面積の２０％未満若しくは１０％未満であり、前記開口部は、送達デバイス１０９ａに設けられた１つ又は複数の流体導管（図示せず）を介して、送達デバイスインレット１５７ａと繋がっている。

【0055】

更に、液体送達システム１０７の収集デバイス９ｂは、クロマトグラフィー材料ユニット１０３のアウトレット表面１５３ｂに隣接して設けられるプレート（図示せず）を含み得るが、その場合、前記プレートは、クロマトグラフィー材料ユニット１０３からの液体を収集するためのいくつかの開口部を備え、該プレート内の前記開口部の総面積は、該プレートの残りの面積より小さく、又は該プレートの残りの面積の２０％未満若しくは１０％未満であり、前記開口部は、収集デバイス１０９ｂ内に設けられた１つ又は複数の流体導管（図示せず）を介して収集デバイスアウトレット１５７ｂに接続している。

【0056】

少なくとも１つのクロマトグラフィー材料ユニット１０３は、少なくとも１つの吸着性メンブレン、及び／又は本明細書に別途記載されている任意の１つの若しくはいくつかのクロマトグラフィー材料を含み得る。最低１つのクロマトグラフィー材料ユニットが、少なくとも１つのトップスペーサー層（図示せず）と少なくとも１つのボトムスペーサー層（図示せず）の間にサンドイッチされた少なくとも１つの吸着性メンブレンを含み得る、又は相互に積層され且つスペーサー層（図示せず）を用いて隙間が設けられ、そして少なくとも１つのトップスペーサー層と少なくとも１つのボトムスペーサー層の間にサンドイッチされた、少なくとも２つの吸着性メンブレンを含み得る。

【0057】

前記クロマトグラフィーデバイス１０１の少なくともいくつかの部分は、少なくともインレット１１５及びアウトレット１１９が開放されたまま、共に密閉され得る。いくつかの実施形態では、前記クロマトグラフィーデバイス１０１の少なくともいくつかの部分は、プラスチック又はエラストマーにより共に密閉され得る。代替的又は付加的に、前記クロマトグラフィーデバイス１０１の少なくともいくつかの部分がオーバーモールドされ、そして共に密閉され得る。更に、カセット１０５及び／又は筐体１１３はオーバーモールドされ得る。オーバーモールドとは、密閉性を生み出す方法であり、そしてデバイスに安定性を付与し、これにより頑強なメンブレンクロマトグラフィーデバイス１０１を提供する方法である。オーバーモールド後、クロマトグラフィーデバイス１０１は、少なくとも１０ｂａｒ又は少なくとも１５ｂａｒの動作圧に耐えることができる。

【0058】

本開示の方法の工程（ｆ）又は代替的に工程（ｅ１ｂ）において、少なくとも１つの面に対して実質的に直角方向、又は代替的に複数の面に対して実質的に直角方向の線流速は、１０～３０００ｃｍ／時の範囲、好ましくは５０～６００ｃｍ／時の範囲である。類似した流速、すなわち、１０～３０００ｃｍ／時の範囲、好ましくは５０～６００ｃｍ／時の範囲の流速が、例えば、工程（ｄ）、工程（ｅ）若しくは代替的に工程（ｅ１）、及び／又は工程（ｇ）若しくは代替的に工程（ｆ１）、及び／又は工程（ｇ１）等の、但しこれらに限定されない、本開示の方法のその他の工程において、該当する場合適用され得る。

【0059】

本開示の方法の工程（ｇ１）において、生体分子がメンブレンクロマトグラフィーデバイス内に滞留する時間は、約０．５秒～約６分、好ましくは約１秒～約３０秒の範囲であり得る。これは、メンブレン又はクロマトグラフィー材料内に生体分子が滞留する時間が、約０．５秒～約６分、好ましくは約１秒～約３０秒の範囲であり得ることに等しい。

【0060】

従って、メンブレンクロマトグラフィーデバイスを通過する溶出液の流速は、工程（ｇ１）におけるメンブレンクロマトグラフィーデバイス内の滞留時間（約０．５秒～約６分、好ましくは約１秒～約３０秒の範囲）に対応する範囲であり得る。

【0061】

メンブレン又はクロマトグラフィー材料を通過する溶出液の流れは、通常流又は接線流であり得る。

【0062】

更に、工程（ｇ１）におけるメンブレンクロマトグラフィーは、フロースルーメンブレンクロマトグラフィーであり得る。

【0063】

本開示の方法は、工程（ｅ１）と工程（ｆ１）との間に、溶出液のｐＨの調整、溶出液の希釈、又は溶出液の電気伝導度の調整を実施する工程を更に含み得る。本開示の方法において、少なくとも工程（ｃ）～（ｆ）、又は代替的に工程（ｃ）～（ｅ１）、例えば工程（ｂ）～（ｆ）又は代替的に工程（ｂ）～（ｅ１）等は、磁気セパレーター内で実施され得る。

【0064】

代替的に、工程（ｂ）～（ｆ）又は工程（ｂ）～（ｅ１）のそれぞれは、コンタクターと流体接続しているバイオリアクター容器、及び磁気セパレーターと流体接続しているコンタクターを備えるシステムにおいて実施され得る。バイオリアクター容器は、細胞培養物／生体溶液から生体分子を分離するのを開始する前に、細胞培養物／生体溶液を含む。磁性粒子と細胞培養物／生体溶液との接触は、細胞培養物／生体溶液及び磁性粒子が搬送される（例えば、ポンプ搬送される、液体の流れに取り込まれる、又は重力によりフィードされる）容器であり得、また磁性粒子中に迅速な質量輸送を提供するためにある程度攪拌され得るコンタクター内で実施され得る。バイオリアクター容器又はコンタクターは、例えば可撓性のバッグ、例えば１つ又は複数のインレットポート及びアウトレットポートを備える可撓性のプラスチックバッグ等であり得る。

【0065】

本開示の方法で使用される分離システムは、加圧装置、例えば磁気セパレーターを通過する流れを生み出すように構成されたペリスタポンプを更に含み得る。代替的に、磁気セパレーターを通過する流れは、もっぱら重力により生み出され得る。一般的に、本開示の方法を機能させるためにシステムに適用される圧力は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムに適用される圧力よりもかなり低圧であり得る。本明細書に関連する長所として、より簡素な構成及びより低いコストが挙げられる。分離システムに適用される圧力の好適な範囲の非限定的な例は、０～０．５ｂａｒ、例えば０．０１～０．５ｂａｒ等である。

【0066】

本開示の方法において、磁気セパレーターは、クロマトグラフィーシステム、例えばＡＫＴＡ（商標）パイロットシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）等と接続し得る（すなわち、クロマトグラフィーシステム内のクロマトグラフィーカラムと置き換わる）。クロマトグラフィーシステムのポンプ圧力性能は不要であるものの、勾配生成用のデュアルポンプ、バルブ系、及びクロマトグラフィーシステムの検出器を含むバッファーコントロール特性を使用するのが好都合であり得る。

【0067】

本開示の方法で使用されるシステム及び／又は磁気セパレーター及び／又はその中のメンブレンクロマトグラフィーデバイスは、自動操作、半自動操作、又は手動操作用として構成され得る。それらは、パイロットスケールプロセス及び製造スケールプロセスの両方において使用可能であり、磁性粒子の量は、少なくとも０．１Ｌ～１０Ｌである。それらは、特にバイオ医薬品を、清澄化前のフィード、例えば細胞培養物、生体溶液、又は細胞ライセート等から捕捉するのに適用可能である。

【0068】

１つ又は複数の列挙した要素「を含む」デバイスは、特に列挙されないその他の要素も含み得る。用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、サブセットとして、デバイスはリスト化されたコンポーネントを有し、提示されたその他の特性又はコンポーネントは有さないことを意味する「～から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含む。同様に、１つ又は複数の列挙した工程「を含む」方法は、特に列挙されないその他の工程も含み得る。

【0069】

単数形「ａ」及び「ａｎ」は、複数形もまた含むものとして解釈されなければならない。

【0070】

下記の実施例で使用される磁気セパレーターは、高勾配磁気分離システム（ＨＧＭＳ）、より具体的にはＭＥＳ １００ ＲＳ（Ａｎｄｒｉｔｚ ＫＭＰＴ ＧｍｂＨ社）である。しかしながら、上記で詳記したように構成された任意の種類の磁気セパレーターが、本開示の方法を実施するのに使用され得るものと理解される。

【0071】

同じように、上記したように、高動作圧に耐えることができる設計を有する任意の種類のメンブレンクロマトグラフィーデバイスが、本開示の方法を実施するのに使用することができ、従って下記の実施例のいくつかで使用されるようなセルロースファイバークロマトグラフィー（Ｆｉｂｒｏクロマトグラフィーとして知られている）カセット／ユニットに限定されないものと理解される。Ｆｉｂｒｏクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は、プロセスの所要時間を短くし、また生産性を高めるための超高速クロマトグラフィー精製法であり、高流速及び高容量セルロースファイバーを利用する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｕｓ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ－ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／ｆｉｂｒｏ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）。

【0072】

更に、メンブレンクロマトグラフィーデバイスで使用されるメンブレンクロマトグラフィー材料は、下記の実施例のいくつかで使用されるような、いわゆるＦｉｂｒｏ ａｄｈｅｒｅ材料に限定されない。Ｆｉｂｒｏ ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は、セルロースナノファイバーを含む材料であり、強力なイオン交換マルチモーダルリガンドを用いて誘導体化され得る。好適なメンブレンクロマトグラフィー材料の別の非限定的な例は、高流体速度の使用を可能にする硬質アガロースマトリックスに基づくＣａｐｔｏ（商標） ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）である。アガロースマトリックスは、マルチモーダルアニオン交換リガンド、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンを用いて誘導体化される。

【実施例0073】

目的
本試験の目的は、Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） ＰｒｉｓｍＡ、及び高勾配磁気セパレーター（ＨＧＭＳ）システム、ＭＥＳ１００ＲＳ（Ａｎｄｒｉｔｚ ＫＭＰＴ ＧｍｂＨ社）を使用して、ＩｇＧを結合及び溶出させることであった。本目的は、フロー溶出を使用して、ＨＧＭＳシステムからＩｇＧを溶出させることが可能であるか検討することであった。

【0074】

材料
ポリクロナールＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（商標））、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社
ＮａＨ_２ＰＯ_４ Ｈ_２Ｏ、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ２Ｈ_２Ｏ、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
酢酸Ｎａ三水和物、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
酢酸、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
ツイーン（商標）２０、Ｍｅｒｃｋ社
トリス塩基、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） ＰｒｉｓｍＡ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社

【0075】

機器
ＨＧＭＳ機器、ＭＥＳ １００ ＲＳ、Ａｎｄｒｉｔｚ ＫＭＰＴ ＧｍｂＨ社
２５Ｌプラスチックバッファートレイ
混合ローター、ＲＷ２０、Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ社
１２５ｍＬ滅菌プラスチックボトル、Ｎａｌｇｅｎｅ社
分光光度計、ＧＥＮＥＳＹＳ（商標） １０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社
ガラスフィルター、Ｇ３、約７００ｍＬ、Ｓｃｏｔｔ Ｄｕｒａｎ社
遠心分離機、５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ社

【0076】

バッファー
２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４
１１．３５ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４ Ｈ_２Ｏ、７４．３ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４、及び２１９．２ｇのＮａＣｌを、２５Ｌバッファーコンテナ内で、２５ＬのｄＨ_２Ｏを用いて稀釈、混合した。
１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ３．２
１４０ｍＬの酢酸及び７．４ｇのＮａＯＡｃ ３Ｈ_２Ｏを、２５Ｌバッファーコンテナ内で、２５ＬのｄＨ_２Ｏを用いて稀釈、混合した。
１Ｍ ＮａＯＨ
４０ｇのＮａＯＨを、１０００ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水を用いて稀釈、混合した。
０．０５％ツイーンを含むＰＢＳ
Ｍｅｄｉｃａｇｏ社製ＰＢＳの錠剤２個を、２０００ｍＬ ＭｉｌｌｉＱ水と混合した。１ｍＬのツイーン２０をピペット採取し、そして該溶液と混合した。
１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ２．９
５．７ｍＬの酢酸及び０．０２ｇのＮａＯＡｃ ３Ｈ_２Ｏを、１０００ｍＬのｍｉｌｌｉ－Ｑ水と混合した。

【0077】

プロトコール
Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡの調製
２００ｍＬのＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡを、使用前に、５ｃｖのＰＢＳを用いてガラスフィルター（Ｇ３ポアサイズ）上で洗浄した。
ＩｇＧの調製（６Ｌ中、２ｍｇ／ｍｌ）
１２ｇ（１６５ｍｇ／ｍｌで７３ｍｌ）のヒトＩｇＧ、Ｇａｍｍａｎｏｒｍを、６Ｌの２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で稀釈した。総容積は６０８０ｍｌであり、またＵＶ２８０においてＩｇＧ濃度を分析したところ１．９ｍｇ／ｍｌであった。
ＩｇＧを含むＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡ ３７～１００のインキュベーション
洗浄済みのビーズ４００ｍＬを、ＩｇＧｇを含む６Ｌの溶液と共にバケットに移し、そして１時間混合した。

【0078】

ＨＧＭＳプロセス
冷却水、空気圧、及び蒸留水を、ＭＥＳ １００ ＲＳシステムに負荷した。チューブを洗浄し、そしてシステムから空気を取り除くために、室温で１Ｌのメスフラスコを満たす水を用いて、次に調製済みのバッファーを用いて、システムのペリスタポンプを最初に較正した。

【0079】

【表1】

【0080】

インキュベーション後、磁気セパレーター上で下記のプログラムを使用した：
２ ＧＥ－ＩｇＧ－ｐｕｒｉｆ：
メイン工程１：磁性粒子（ＭＰ）の負荷
サブ１：負荷：開始前にすべて停止する、工程所要時間２５０秒、マグネットを稼働、ポンプ設定値＋５０％、バルブＸＶ０１及びＸＶ１４を開放。
ＰＢＳバッファーを使用しながら手作業により残りのフィードをポンプ搬送してチューブを洗浄した。
メイン工程２：再循環
サブ１：再循環：工程所要時間３０秒、マグネットを稼働、ポンプ設定値＋３０％、バルブＸＶ０８及びＸＶ１３を開放。
メイン工程３：バッファー洗浄
サブ１：バッファー１のフィード：工程所要時間６０秒、マグネット稼働、ポンプ設定値＋７０％、バルブＸＶ０２及びＸＶ１４を開放。
サブ２：バッファーの混合：開始前にすべて停止する、工程所要時間２０秒、ミキサー設定値６０％
サブ３：トラップ：工程所要時間１０秒、マグネット稼働、
サブ４：再捕捉：工程所要時間６０秒、マグネット稼働、ポンプ設定値＋３０％、バルブＸＶ０８及びＸＶ１３を開放。
サブ５：移送：工程所要時間１秒、マグネット稼働、バルブＸＶ０２、ＸＶ０８、及びＸＶ１３、及びＸＶ１４を開放。
メイン工程４： Ｈ２Ｏ洗浄
サブ１：バッファー２のフィード：工程所要時間６０秒、マグネット稼働、ポンプ設定値＋７０％、バルブＸＶ０３及びＸＶ１４を開放。
サブ２：バッファーの混合２：開始前にすべて停止する、工程所要時間２０秒、ミキサー設定値６０％
サブ３：トラップ：工程所要時間１０秒、マグネット稼働、
サブ４：再捕捉：工程所要時間６０秒、マグネット稼働、ポンプ設定値＋３０％、バルブＸＶ０８及びＸＶ１３を開放。
サブ５：移送：工程所要時間１秒、マグネット稼働、バルブＸＶ０２、ＸＶ０８、及びＸＶ１３、及びＸＶ１４を開放。
メイン工程５：溶出
サブ１：トラップ：工程所要時間１０秒、マグネット稼働
サブ２：再捕捉：工程所要時間６０秒、マグネット稼働、ポンプ設定値＋３０％、バルブＸＶ０８及びＸＶ１３を開放。
サブ３：移送：工程所要時間１秒、マグネット稼働、バルブＸＶ０７、ＸＶ０８、及びＸＶ１３、及びＸＶ１６を開放。
サブ４：溶出液のフィード：工程所要時間４２００秒、マグネット稼働、ミキサー設定値１０％、ポンプ設定値＋５％、バルブＸＶ０７及びＸＶ１６を開放。
溶出液を、約１００ｍｌの分画において、事前秤量した１２５ｍｌプラスチックボトル中に、手作業により収集した。溶出後、各ボトルを秤量し、そして各ボトル中の実際の溶出容量を、空のボトル容量が有する総容量（５１．５ｍｇ）を減じることにより決定した。

【0081】

分析
溶出液を、２Ｍトリス塩基を用いてｐＨ５に中和した。全分画について、力価を、分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製ＧＥＮＥＳＹＳ）を使用してＵＶ２８０で決定した。

【0082】

結果、分析、及び結論
１ｃｍキュベット内のＵＶ２８０値を吸光係数１．３６で割り算してＩｇＧの濃度をｍｇ／ｍｌで取得することにより、濃度を計算した。ＵＶ２８０値が１を上回る場合にはサンプルを稀釈した。濃度及び累積収率を溶出の累積容積に対してプロットした。
図４のグラフは、収率が９８％、２．７×ＣＶ（総磁性ビーズ容積０．４Ｌ）のときの特徴的な溶出ピークを示す。

【0083】

結論
マグビーズが溶出期間中に磁気チャンバーから流出しないように混合及び流速を設定した。同時にマグネットのスイッチをオンにしながら混合すると、マグビーズは磁気チャンバー内で懸濁され、ＩｇＧのバッチ溶出の代わりに連続溶出を可能にする。
この実験は、磁気チャンバー内でＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡ ３７～１００μｍと混合しながら、連続モードでＩｇＧを溶出させることが可能であり、２．７容積のＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズでは収率９８％が得られることを示す。

【実施例0084】

目的
この試験の目的は、Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡ（３７～１００μｍ）及び高勾配磁気セパレーター（ＨＧＭＳ）システム、ＭＥＳ１００ＲＳ（Ａｎｄｒｉｔｚ ＫＭＰＴ ＧｍｂＨ社）を使用して、ＩｇＧ１モノクロナール抗体を含むＣＨＯ細胞培養物を清透化及び精製することであった。本目的は、フロー溶出を使用してＭａｇセファロースを一切失うことなく、ｍＡｂをＨＧＭＳシステムから溶出させることが可能であるか検討することであった。

【0085】

材料
ＣＨＯ細胞培養物、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社
ＮａＨ_２ＰＯ_４ Ｈ_２Ｏ、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ２Ｈ_２Ｏ、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
酢酸Ｎａ三水和物、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
酢酸、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
ツイーン２０、Ｍｅｒｃｋ社
トリス塩基、ｐａ、Ｍｅｒｃｋ社
Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡ、３７～１００μｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社
ｍＡｂ標準、８．８２ｍｇ／ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社

【0086】

機器
ＨＧＭＳ機器、ＭＥＳ １００ ＲＳ、Ａｎｄｒｉｔｚ ＫＭＰＴ ＧｍｂＨ社
２５Ｌプラスチックバッファートレイ
混合ローター、ＲＷ２０、Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ社
１２５ｍＬ滅菌プラスチックボトル、Ｎａｌｇｅｎｅ社
ＨＰＬＣ、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社
ガラスフィルター、Ｇ３ポアサイズ、約７００ｍＬ、Ｓｃｏｔｔ Ｄｕｒａｎ社
遠心分離機、５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ社
ｐＨメーター、９１３ ｐＨメーター、Ｍｅｔｒｏｈｍ社
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＴｒａｐ、２９－０４９１－０４、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ社
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ社
０．２μｍシリンジフィルター、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ ＨＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社
１０～１００μＬピペット、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ社
１００～１０００μＬピペット、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ社
Ｃｅｌｌｂａｇ（商標） １０Ｌ、ＢＣ１１、Ｂａｓｉｃ、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ社

【0087】

条件及び実測値
溶液の調製物：
２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４
１１．３５ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４ Ｈ_２Ｏ、７４．３ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４、及び２１９．２ｇのＮａＣｌを稀釈し、そして２５Ｌバッファーコンテナ内で２５Ｌ ｄＨ_２Ｏと混合した。
１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ３．２
１４０ｍＬの酢酸及び７．４ｇのＮａＯＡｃ ３Ｈ_２Ｏを稀釈し、そして２５Ｌバッファーコンテナ内で２５ＬのｄＨ_２Ｏと混合した。
１Ｍ ＮａＯＨ
４０ｇのＮａＯＨを稀釈し、そして１０００ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水と混合した。
０．０５％ツイーンを含むＰＢＳ
Ｍｅｄｉｃａｇｏ社製ＰＢＳの錠剤２個を、２０００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水と混合した。１ｍＬのツイーン２０をピペット採取し、そして該溶液と混合した。
１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ２．９
５．７ｍＬの酢酸及び０．０２ｇのＮａＯＡｃ ３Ｈ_２Ｏを、１０００ｍＬのｍｉｌｌｉ－Ｑ水と混合した。

【0088】

ｍＡｂフィードの調製
ｍＡｂを含有する約７Ｌの量のＣＨＯ細胞を使用した。細胞密度は、２３．８１ＭＶＣ／ｍＬ、生存率： ６６．４％、及びｍＡｂ力価２．７ｍｇ／ｍＬであった。細胞を１０Ｌのｃｅｌｌ ｂａｇ（ｂａｓｉｃ）中にポンプ搬送した。

【0089】

力価分析法、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＴｒａｐ結合及び溶出の準備
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＴｒａｐ（商標）カラムをＨＰＬＣシステムに接合させた。下記の表に従い、ｍＡｂ（ｍＡｂ力価８．８２ｍｇ／ｍＬ）を用いた標準曲線を、２５０μＬプラスチック製ＨＰＬＣバイアル内で調製した。

【0090】

【表2】

【0091】

【表3】

【0092】

細胞培養物の力価決定
約１０ｍＬの細胞懸濁物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして総細胞懸濁物容積及び総固体容積をモニタリングすることにより、細胞デブリ（固体）容積は５％であることを確認した。上清を０．２μｍのフィルターを通じて１ｍＬ ＨＰＬＣバイアル中に濾過した。上清の力価を、上記記載の力価測定法に従い決定した。

【0093】

【表4】

【0094】

Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡの調製
４００ｍＬのＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡを、使用前に５ｃｖのＰＢＳを用いてガラスフィルター（Ｇ３ポアサイズ）上で洗浄した。

【0095】

Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡと細胞培養物のインキュベーション
４００ｍＬの洗浄済みビーズを６２５０ｇのＣＨＯ細胞懸濁物と共にボトルに移した。磁性ビーズをＣＨＯ細胞懸濁物と１時間混合した。１ｍＬのサンプルを遠心分離し、そしてフィード中の（Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＰｒｉｓｍＡに結合しなかった）残存ｍＡｂを調査するために、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ Ｈｉｔｒａｐ法（上記参照）を用いて分析した。

【0096】

ＨＧＭＳプロセス
冷却水、空気圧、及び蒸留水を、ＭＥＳ １００ ＲＳシステムに負荷した。室温で１Ｌのメスフラスコを満たす水を用いて、システムのペリスタポンプを較正した。
使用されるインレットチューブ及びバルブＸＶ０１、ＸＶ０２、ＸＶ０３、ＸＶ０７を、ｄＨ２Ｏでプライミングした。磁気セパレーター内の気泡を、すべての空気が除去されるまでシステムをプライミングし、同時にミキサーを５０％で稼働させることにより除去した。循環バルブＸＶ０８とＸＶ０１３の間のホースを、システム内で逆流を使用して空気が存在しなくなるまで満たした。
水によるプライミング後、実際のランニングバッファーでシステムをプライミングした。
ＸＶ０１＝ Ｍａｇビーズ混合物の負荷（２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４を用いてプライミングした）
ＸＶ０２＝ ２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４
ＸＶ０３＝ ｄＨ_２Ｏ
ＸＶ０７＝ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｐＨ３．２
インキュベーション後、磁気セパレーター上で下記のプログラムを使用した。
工程１． 磁性粒子及びフィードの混合物を負荷する
ポンプ搬送時間を２５０秒に設定し、６Ｌのフィード混合物をポンプ搬送した。
残存するフィードを、ＰＢＳバッファーを使用して手作業によりポンプ搬送して、混合物のインレットチューブを洗浄した。
システムを再循環に設定して、分離ユニット内の着磁可能ディスク上にすべての磁性ビーズをトラップした。
工程２． ２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄する、４サイクル繰り返す
サブ工程１． ７０％ポンプスピードを使用して、バッファーを６０秒間フィードする（バッファー２Ｌ）。
サブ工程２． バッファー及びビーズを、６０％ロータースピードで２０秒間混合し、そしてマグネット及びバルブの稼働を停止する。
サブ工程３． マグネットを稼働させてビーズをトラップする。
サブ工程４． 再捕捉。３０％のポンプ速度を使用して再循環し、すべてのビーズをトラップする。
サブ工程５． 移送。短時間（１ｓ）バルブを開放して背圧を回避する。
工程３． 水で洗浄する、１サイクル
水がバルブＸＶ０３からポンプ搬送された点を除き、２０ｍＭリン酸Ｎａ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌを用いた洗浄と同一のサブ工程を水洗浄で使用した。
工程４． 溶出
この工程では、ミキサー及びマグネットを稼働させながらｍＡｂをフロー溶出させた。
サブ工程１． トラップ。マグネットを稼働させる。
サブ工程２． 再捕捉。３０％ポンプスピードを使用して６０秒間再循環する。
サブ工程３． 移送。短時間（１ｓ）バルブを開放して背圧を回避する。
サブ工程４． 溶出液のフィード： １００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ３．２、バルブＸＶ０７を用いて溶出させる。マグネット稼働、ポンプスピード５％（１４０ｍＬ／分）、ミキサーを１０％に設定。溶出を４２８６秒行った。
溶出させた材料を、約１００ｍＬの分画において、事前秤量した１５０ｍＬプラスチックボトル中に、手作業により収集した。
溶出後、各ボトルを秤量し、そして各ボトル中の実際の溶出容量を、空のボトル容量が有する総容量を減じることにより決定した。下記の表５を参照。

【0097】

【表5】

【0098】

溶出液の分画は淡黄色～透明であった。
溶出液を、２Ｍトリス塩基を用いてｐＨ５に中和し、その後０．２μｍ濾過した。２Ｍトリス塩基の実際の容量も、上記溶出液の質量に含めた。全分画について、力価を、ＭａｇＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＨｉＴｒａｐ結合及び溶出アッセイにより決定した。上記参照。
最終的に、分画７～１８をプールし、そしてこのプールの１ｍＬを２００ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ６．８を用いて、１．５ｍＬ ＨＰＬＣバイアル内で２０×稀釈し、そしてＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィー分析法（ＳＥＣ）を用いて分析し、そしてｍＡｂ標準（同一のバッファーを用いて８×稀釈した）と比較した。
セパレーター内のＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをリリースし、そして容器内にポンプ搬送して戻した。樹脂を、２ｃｖの１Ｍ ＮａＯＨを用いて、Ｇ３ガラスフィルター上で３０分間洗浄し、それを５ｃｖのＰＢＳを用いて平衡化し、そして最終的に、２ｃｖの２０％エタノールを保存溶液として用いて洗浄し、そして保管用として、樹脂を２０％ ＥｔＯＨと共にプラスチックボトル中に戻した。

【0099】

ＳＥＣ法による純度
注入容積： １０μＬ
流速： ０．８ｍＬ／分
カラム： Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ
停止時間： ２６分
２１４ｎｍにおいて検出。

【0100】

ＨＣＰ分析
開始及びプール溶出液サンプルにおいて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）分析前に、５０μＬの保存溶液を４５０μＬのサンプルに添加した。
ソフトウェアパッケージ５．３．０を備えるＧｙｒｏｌａｂワークステーション（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）上で、第３世代ＣＨＯ－ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ社）を使用して分析を実施した。

【0101】

結果、分析、及び結論
図５Ａは、磁気セパレーターからのｍＡｂの溶出プロファイルを示す。１．２Ｌの溶出液に対応するプール分画（分画７～１８）は、３ベッド容積（１ベッド容積 ＝ ４００ｍＬ）の溶出バッファーを用いることで、８７％のｍＡｂ収率が取得可能であることを示す。プールされた溶出液の濃度は、４×濃度である１０．７ｍｇ／ｍＬであった。インキュベーション工程における結合収率は９４％であり、また総溶出収率は９１％であった。
プールされたサンプルをＳＥＣ及びＨＣＰアッセイにより分析し、そして純粋なｍＡｂ標準と比較した。結果を、図５Ｂ（より小スケール）及び図５Ｃ（より大スケール；ピークの基部を拡大）に示す。実線はプールされたｍＡｂ溶出液であり、また点線は純粋なｍＡｂ標準である。クロマトグラムは標準化されている。凝集ピーク、メインピーク、及びメインピーク後のピークを積分し、純度を９８．５％と決定した。