知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタの特許一覧
特開2024-177252カルボジイミドで処理された寛容化ワクチンによる移植寛容誘導
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024177252
(43)【公開日】2024-12-19
(54)【発明の名称】カルボジイミドで処理された寛容化ワクチンによる移植寛容誘導
(51)【国際特許分類】
A61K 35/15 20150101AFI20241212BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241212BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241212BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20241212BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241212BHJP
A61K 31/439 20060101ALI20241212BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241212BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241212BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/22 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/42 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/37 20150101ALI20241212BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20241212BHJP
C07K 7/08 20060101ALN20241212BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20241212BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20241212BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20241212BHJP
【ＦＩ】
A61K35/15
A61P37/06
A61P43/00 105
A61K45/06
A61P43/00 121
A61P43/00 111
A61P37/02
A61K31/439
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K38/16
A61K35/545
A61K35/22
A61K35/407
A61K35/34
A61K35/39
A61K35/42
A61K35/37
A61K35/28
A61K35/15 ZNA
C07K7/08 ZNA
C07K16/18
C07K16/28
C12N5/078
C07K7/08
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024170828
(22)【出願日】2024-09-30
(62)【分割の表示】P 2021521149の分割
【原出願日】2019-10-19
(31)【優先権主張番号】62/748,115
(32)【優先日】2018-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/902,091
(32)【優先日】2019-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】305023366
【氏名又は名称】リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】バーナード ジェイ． へリング
(72)【発明者】
【氏名】サバリナサン ラマチャンドラン
(57)【要約】
【課題】カルボジイミドで処理された寛容化ワクチンによる移植寛容誘導の提供。
【解決手段】本開示は、移植レシピエントにおける移植された細胞、臓器または組織に対する免疫寛容を誘導するための組成物およびシステムに関する。寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンを作製する方法、およびこれを投与する方法も本明細書に提供する。一部の態様では、同種移植または異種移植のための前処置レジメンであって、（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性ドナー白血球、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含み、前処置レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、前処置レジメンが本明細書に開示される。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、移植レシピエントにおける移植された細胞、臓器または組織に対する免疫寛容を誘導するための組成物およびシステムに関する。寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンを作製する方法、およびこれを投与する方法も本明細書に提供する。一部の態様では、同種移植または異種移植のための前処置レジメンであって、（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性ドナー白血球、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含み、前処置レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、前処置レジメンが本明細書に開示される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７４８，１１５号、および２０１９年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９０２，０９１号の利益を主張し、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究に関する陳述
本出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７４８，１１５号、および２０１９年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９０２，０９１号の利益を主張し、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府支援研究に関する陳述
【0002】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって付与された助成Ｕ０１ＡＩ１０２４６３の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
移植は、末期の臓器不全を有する患者のための最も有効な処置の選択肢になっている。現在の免疫抑制処置は、移植された臓器および細胞の急性拒絶反応の予防において有効であるが、しかしながら、それらの重大な病的状態および慢性拒絶反応の予防におけるそれらの有効性の欠如により、慢性的に免疫抑制された移植レシピエントの増加する集団において深刻な満たされていない医学的必要性が存在する。適切なブタドナー由来の臓器、組織および細胞の異種移植は、同種移植に関連するドナー不足を克服するが、同種移植の場合と同様、レシピエントは、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、心臓血管系の合併症、腎臓毒性、および慢性的な免疫抑制に関連する他の病的状態を発生するリスクの増加にさらされるだろう。同種グラフトおよび異種グラフトに対する免疫寛容の誘導は、維持免疫抑制の必要性を克服し、慢性拒絶反応に起因するグラフト喪失を排除することによってグラフト生着の寿命を延ばし、これによって、患者の満足度、転帰および移植の費用効果が大きく改善する。
参照による組み込み
参照による組み込み
【0004】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。他に任意の指示がない限り、本出願において言及される刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
一部の態様では、同種移植または異種移植のための前処置レジメンであって、（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性ドナー白血球、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含み、前処置レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、前処置レジメンが本明細書に開示される。
【0006】
一部の実施形態では、前処置レジメンは、レシピエントへの（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の投与のための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、同種移植または異種移植の約１０日前～約３０日後にレシピエントに投与される。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つは、同種移植または異種移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日前にレシピエントに投与される。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つは、同種移植または異種移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日前にレシピエントに投与される。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つは、レシピエントに、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、脳室内、鼻腔内、頭蓋内、腔内、脳内、髄腔内もしくは経皮、または局所に投与される。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。一部の実施形態では、レシピエントにおけるｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルは、１ｍＬあたり約５～１２ｎｇである。一部の実施形態では、抗腫瘍壊死因子剤は、抗腫瘍壊死因子抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗腫瘍壊死因子剤は、腫瘍壊死因子受容体の腫瘍壊死因子結合ドメインを含む。一部の実施形態では、抗腫瘍壊死因子剤は、エタネルセプトである。一部の実施形態では、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量でレシピエントに投与される。一部の実施形態では、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量でレシピエントに投与される。一部の実施形態では、抗インターロイキン６受容体剤は、アンタゴニスト性抗インターロイキン６受容体抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗インターロイキン６受容体剤は、トシリズマブである。一部の実施形態では、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの用量でレシピエントに投与される。一部の実施形態では、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤は、約１０ｍｇ／ｋｇの用量でレシピエントに投与される。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量でレシピエントに投与される。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、約５０ｍｇ／ｋｇの用量でレシピエントに投与される。一部の実施形態では、前処置レジメンのレシピエントへの投与は、移植細胞、組織または臓器に対する長期寛容を提供する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、哺乳動物白血球である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ブタ白血球である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ヒト白血球である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、死体ドナー、脳死ドナー、心停止ドナーまたは生体ドナー由来である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、脾臓または末梢血から単離される。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、Ｂリンパ球を含む。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞または誘導多能性幹細胞から分化した細胞を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、移植細胞、組織または臓器のドナーに由来する。一部の実施形態では、移植細胞、組織または臓器は、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、胚性幹細胞由来膵島ベータ細胞、誘導多能性幹細胞由来膵島ベータ細胞、胚性幹細胞由来膵島、誘導多能性幹細胞由来膵島、幹細胞由来の細胞、組織もしくは臓器、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、レシピエントおよび移植細胞、組織または臓器のドナーは、ＭＨＣクラスＩ不適合である。一部の実施形態では、レシピエントおよび移植細胞、組織または臓器のドナーは、ＭＨＣクラスＩＩ不適合である。一部の実施形態では、レシピエントおよび移植細胞、組織または臓器のドナーは、ハプロタイプ一致である。一部の実施形態では、レシピエントおよび移植細胞、組織または臓器のドナーは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について適合する。一部の実施形態では、レシピエントおよび移植細胞、組織または臓器のドナーは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子について適合する。一部の実施形態では、レシピエントおよび移植細胞、組織または臓器のドナーは、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子である少なくともＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子について適合する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球およびレシピエントは、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子のうちの少なくとも１つについて適合する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球およびレシピエントは、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子であるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子について適合する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球およびレシピエントは、完全に不適合である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球および移植片は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子について適合する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球および移植片は、ハプロタイプ一致である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、移植のドナーに由来する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、移植細胞、組織または臓器のドナー由来の幹細胞の分化に由来する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖もしくはＤＰβ鎖、またはそれらの組合せに由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲ、ＤＰまたはＤＱのα１またはα２ドメイン全部を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲ、ＤＰまたはＤＱのβ１またはβ２ドメイン全部を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、レシピエントのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、超可変領域由来の配列を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、少なくとも１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、約１０～３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、合成または組換えである。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、レシピエントに由来するか、またはレシピエント由来の幹細胞の分化の際に誘導されたものであり、アポトーシス性白血球は、その表面にコンジュゲートされたＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、移植のドナー中で発現する。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７またはＨＬＡＢ８である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１によってコードされる。一部の実施形態では、１種または複数のペプチドは、架橋剤での処理によってアポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、架橋剤は、カルボジイミドを含む。一部の実施形態では、カルボジイミドは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、架橋剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む。一部の実施形態では、架橋剤は、カルボジイミドを含まない。一部の実施形態では、架橋剤は、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ジイミドエステルは、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、所定の時間、固定されている。一部の実施形態では、所定の時間は、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである。一部の実施形態では、１種または複数の免疫調節分子の前記量は、レシピエントの抗原提示細胞の機能を改変するのに十分である。一部の実施形態では、１種または複数の免疫調節分子は、ＩＦＮ－γ、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質のすべてもしくは一部、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、別々に、または同時に投与される。
【0007】
一部の態様では、同種移植片または異種移植片のレシピエントの移植後安定化のための寛容化レジメンであって、カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされる、アポトーシス性白血球；ｍＴＯＲ阻害剤；抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤；抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤；ならびに抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含み、寛容化レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、寛容化レジメンが本明細書に開示される。
【0008】
一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、架橋剤との接触の前に、出発集団に対して、少なくとも約３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍または２５０倍増やされる、請求項７４に記載の寛容化レジメン。一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は、別々に、または同時に投与される。
【0009】
一部の態様では、細胞、組織または臓器移植片をレシピエントに移植するための前処置レジメンであって、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含み、ここで、アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチドを含み、前処置レジメンが、レシピエントへの投与のためである、前処置レジメンが本明細書に開示される。
【0010】
一部の実施形態では、前処置レジメンは、移植レシピエントの短期免疫抑制のための１種または複数の薬剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制のための１種または複数の薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤もしくは抗腫瘍壊死因子受容体剤、抗インターロイキン６剤もしくは抗インターロイキン６受容体剤、抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０リガンド剤、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、前処置レジメンは、移植レシピエントへの短期免疫抑制のための１種または複数の薬剤の投与のための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖もしくはＤＰβ鎖、またはそれらの組合せに由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲのβ１またはβ２ドメイン全部を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、レシピエントのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲ、ＤＰまたはＤＱのα１またはα２ドメイン全部を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＱのβ１またはβ２ドメイン全部を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、超可変領域由来の配列を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、少なくとも１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、約１０～３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、合成または組換えである。一部の実施形態では、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球は、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、アポトーシス性白血球は、ドナーとＭＨＣクラスＩＩ適合、およびレシピエントとＭＨＣクラスＩＩ不適合である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、移植のドナー中で発現する。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７またはＨＬＡＢ８である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１によってコードされる。一部の実施形態では、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球は、ドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、アポトーシス性白血球は、レシピエントと、ＭＨＣクラスＩ適合もしくはＭＨＣクラスＩＩ適合、またはその両方である。一部の実施形態では、１種または複数のペプチドは、架橋剤での処理によってアポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、架橋剤は、カルボジイミドを含む。一部の実施形態では、カルボジイミドは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、架橋剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む。一部の実施形態では、架橋剤は、カルボジイミドを含まない。一部の実施形態では、架橋剤は、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ジイミドエステルは、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、所定の時間、固定されている。一部の実施形態では、所定の時間は、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである。
【0011】
一部の態様では、レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含む、有効量の組成物をレシピエントに投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
【0012】
一部の実施形態では、アポトーシス性白血球およびレシピエントは、レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について適合する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球およびレシピエントは、ＭＨＣ不適合である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、１種または複数のペプチドは、アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞から分化した細胞を含み、幹細胞は、細胞、組織または臓器移植片のドナーに由来する。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、レシピエントとＭＨＣ適合である。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、細胞、組織または臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、１種または複数のペプチドは、アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞から分化した細胞を含み、幹細胞は、細胞、組織または臓器移植片のレシピエントに由来する。一部の実施形態では、本方法は、細胞、組織または臓器移植片を移植することをさらに含む。一部の実施形態では、移植することは、組成物の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日後、またはそれよりも後に行われる。一部の実施形態では、本方法は、組成物の少なくとも１ブースター用量を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ブースター用量は、移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、２０、２１または２４日後に投与される。一部の実施形態では、寛容は、少なくとも１か月の期間にわたる。一部の実施形態では、寛容は、少なくとも１００日の期間にわたる。一部の実施形態では、寛容は、少なくとも１年の期間にわたる。
【0013】
一部の態様では、レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む有効量の組成物をレシピエントに投与することを含み、アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチドを含む、方法が本明細書に開示される。
【0014】
一部の実施形態では、寛容は、移植後５０日後に免疫抑制療法の非存在下において存在する。一部の実施形態では、寛容は、ブースターレジメンの非存在下において存在する。
【0015】
一部の態様では、レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する免疫応答を阻害するための方法であって、（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤の有効量をレシピエントに投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
【0016】
一部の態様では、レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する免疫応答を阻害するための方法であって、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む有効量の組成物をレシピエントに投与することを含み、ここで、アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチドを含む、方法が本明細書に開示される。
【0017】
一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞増殖、マクロファージ活性化、サイトカイン産生、またはそれらの組合せを含む。
【0018】
一部の態様では、対象を移植後免疫寛容化する方法であって、（ａ）カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされる、アポトーシス性白血球、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
【0019】
一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、末梢血から単離される。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、陰性選択によってＢ細胞について富化されている。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、カルボジイミド架橋剤によるモジュレートの前に、出発集団に対して少なくとも２００倍増やされる。
【0020】
一部の態様では、レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片の移植のためのキットであって、（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む第１の組成物を含む第１の容器、（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤を含む第２の組成物を含む第２の容器、（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を含む第３の組成物を含む第３の容器、（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を含む第４の組成物を含む第４の容器、および（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含む第５の組成物を含む第５の容器を含む、キットが本明細書に開示される。
【0021】
一部の態様では、レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片の移植のためのキットであって、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む第１の組成物を含む第１の容器を含み、ここで、アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチドを含む、キットが本明細書に開示される。
【0022】
一部の実施形態では、キットは、細胞、組織または臓器移植片をさらに含む。
【0023】
一部の態様では、前処置レジメンおよび寛容化レジメンを含む移植キットであって、前処置レジメンが、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球；ｍＴＯＲ阻害剤；抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤；抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤；および抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含み、寛容化レジメンが、カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされる、アポトーシス性白血球；ｍＴＯＲ阻害剤；抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤；抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤；ならびに抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含み、前処置レジメンが、移植の前に対象に投与され、寛容化レジメンが、移植後に対象に投与される、移植キットが本明細書に開示される。
【0024】
一部の実施形態では、移植キットは、細胞、組織または臓器移植片をさらに含む。一部の実施形態では、寛容化レジメンのアポトーシス性白血球は、末梢血から単離される。一部の実施形態では、寛容化レジメンのアポトーシス性白血球は、陰性選択によってＢ細胞について富化されている。一部の実施形態では、寛容化レジメンのアポトーシス性白血球は、架橋剤との接触の前に、出発集団に対して少なくとも２００倍増やされる。
【0025】
一態様では、本明細書において、同種グラフトのための哺乳動物白血球であって、前記哺乳動物白血球が、死体の哺乳動物白血球であり、前記死体の哺乳動物白血球が、カルボジイミド中において固定されている、哺乳動物白血球が提供される。
【0026】
別の態様では、本開示は、同種グラフトのための哺乳動物白血球であって、前記哺乳動物白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた哺乳動物白血球であり、前記ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた哺乳動物白血球が、カルボジイミド中において固定されている、哺乳動物白血球を提供する。
【0027】
一部の実施形態では、前記ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた哺乳動物白血球は、生体ドナー由来である。一部の実施形態では、前記生体ドナーは、ヒトである。一部の実施形態では、前記死体の哺乳動物白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球の集団由来である。一部の実施形態では、前記死体の哺乳動物白血球は、心停止ドナー由来である。一部の実施形態では、前記死体の哺乳動物白血球は、脳死ドナー由来である。一部の実施形態では、前記哺乳動物白血球は、ヒト白血球である。一部の実施形態では、前記哺乳動物白血球は、脾臓から単離される。一部の実施形態では、前記哺乳動物白血球は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、前記哺乳動物白血球は、所定の時間、固定されている。一部の実施形態では、前記所定の時間は、少なくとも約１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である。
【0028】
上記態様の一部の実施形態では、前記哺乳動物白血球は、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである。一部の実施形態では、前記量は、その後に３７℃に４時間曝露された時に、ドナー反応性細胞のアポトーシス死の引き金を引くのに十分である。一部の実施形態では、１種または複数の免疫調節分子は、ＩＦＮ－γ、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、α１－アンチトリプシン、表面抗原分類タンパク質のすべてもしくは一部、ｇｐ３９アンタゴニスト、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せである前記ＮＦ－ｋＢ阻害剤。一部の実施形態では、前記カルボジイミドは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、前記カルボジイミド剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む。
【0029】
一態様では、本明細書において、細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、上記に開示される前記哺乳動物白血球の量を含む組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、前記細胞または組織移植片は、前記哺乳動物白血球のドナー由来である。一部の実施形態では、前記細胞または組織移植片は、前記哺乳動物白血球のドナーとＭＨＣ適合であるドナー由来である。一部の実施形態では、前記細胞または組織移植片は、前記哺乳動物白血球のドナーとハプロタイプ一致であるドナー由来である。一部の実施形態では、前記細胞または組織移植片は、前記哺乳動物白血球のドナーと、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ
Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子を共有するドナー由来である。一部の実施形態では、前記細胞または組織移植片は、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島ベータ細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島、またはそれらの組合せである。
Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子を共有するドナー由来である。一部の実施形態では、前記細胞または組織移植片は、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島ベータ細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島、またはそれらの組合せである。
【0030】
一部の実施形態では、本方法は、前記細胞または組織移植片を前記対象に移植することをさらに含む。一部の実施形態では、前記移植することは、前記組成物の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日後、またはそれよりも後に行われる。一部の実施形態では、前記移植することは、前記組成物の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日前、またはそれよりも前に行われる。一部の実施形態では、上記に開示される態様の方法は、前記組成物の少なくとも１ブースター用量を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、前記組成物の１、２、３、４または５ブースター用量を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前記ブースター用量は、前記移植することの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日後、またはそれよりも後に投与される。一部の実施形態では、前記ブースター用量は、前記移植することの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日前、またはそれよりも前に投与される。一部の実施形態では、前記ブースター用量は、より低い量の前記哺乳動物白血球を含む。
【0031】
一態様では、本明細書において、架橋剤中において固定された白血球を含む移植のための前処置レジメンであって、前記白血球が、レシピエントにおける抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤で処理される、前処置レジメンが提供される。一部の実施形態では、前記抗炎症性サイトカインは、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、前記前処置レジメンは、前記白血球のドナー由来の移植された細胞、組織または臓器に対する前記レシピエントの長期寛容を提供する。一部の実施形態では、前記長期寛容は、少なくとも１か月の期間にわたる。一部の実施形態では、前記長期寛容は、ブースターレジメンの非存在下において存在する。
【0032】
一部の実施形態では、前記白血球は、哺乳動物白血球である。一部の実施形態では、前記白血球は、ブタ白血球である。一部の実施形態では、前記白血球は、ヒト白血球である。一部の実施形態では、前記白血球は、死体の白血球である。一部の実施形態では、前記白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球である。一部の実施形態では、前記死体の白血球は、心停止ドナー由来である。一部の実施形態では、前記死体の白血球は、脳死ドナー由来である。他の実施形態では、前記ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球は、生体ドナー由来である。
【0033】
一部の実施形態では、前記白血球は、脾臓から単離される。一部の実施形態では、前記白血球は、所定の時間、固定されている。一部の実施形態では、前記所定の時間は、少なくとも約１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である。一部の実施形態では、前記薬剤は、α１－アンチトリプシンを含む。一部の実施形態では、前記白血球は、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである。一部の実施形態では、前記量は、ドナー反応性細胞のアポトーシス死の引き金を引くのに十分である。
【0034】
一部の実施形態では、１種または複数の免疫調節分子は、ＩＦＮ－γ、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質のすべてもしくは一部、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せである前記ＮＦ－ｋＢ阻害剤。一部の実施形態では、前記白血球は、ドナーから単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球の集団由来である。一部の実施形態では、前記架橋剤は、カルボジイミド、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む。
【0035】
一部の実施形態では、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含むジイミドエステルを含む前処置レジメン。一部の実施形態では、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む前記カルボジイミドを含む前処置レジメン。一部の実施形態では、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）である前記カルボジイミド。一部の実施形態では、前記白血球は、Ｂリンパ球を含む。一部の実施形態では、前記Ｂリンパ球は、生体ドナー由来である。
【0036】
本開示の特徴は、特に、添付の特許請求の範囲と共に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理を利用する、例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【図4】図４は、必要に応じて、レシピエントの慢性的かつ全身性の免疫抑制の非存在下での、レシピエントにおける移植およびグラフトの拒絶を阻害する、もしくは最小化する、および／またはその生存を延長するための例示的な移植レジメンを示す。ある特定の実施形態では、レジメンは、以下の３つの成分のうちの１つまたは複数：ｉ）αＧａｌ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＭＨＣクラスＩ、補体Ｃ３、および／またはＣＸＣＬ１０の発現ならびに必要に応じて、ＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｅのトランスジェニック発現が欠損および／または低減した、遺伝子操作された膵島などの移植細胞または組織；ｉｉ）αＧａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＤ－Ｌ２および／またはＳｄａ／ＣＡＤの発現ならびに必要に応じて、ＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｅのトランスジェニック発現が欠損および／または低減し、ヒトＣＤ４７を含む、または含まない（例えば、前処置レジメンまたは寛容化ワクチンにおける遺伝子操作された細胞）、遺伝子操作されたドナーアポトーシス性および非アポトーシス性単核細胞（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞またはＥＣＤＩ固定Ｂリンパ球などのＥＣＤＩ固定白血球を含む前処置レジメンまたは寛容化レジメンまたはワクチン）；ならびにｉｉｉ）例えば、限定されるものではないが、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ抗体、Ｆｃ操作された抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ラパマイシン、コンプスタチンもしくはコンプスタチン誘導体（例えば、コンプスタチン誘導体ＡＰＬ－２）を含む一過性抗炎症療法、抗ＩＬ－６受容体ｍＡｂ、可溶性ＴＮＦ受容体、Ｂ細胞標的化戦略（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、および／またはα１－抗トリプシンのうちの１つまたは複数などの、本明細書に記載の前処置レジメンの１つまたは複数の成分を含む一過的免疫抑制の投与を含んでもよい。Ｂ細胞を標的とする生物製剤の非限定例としては、リツキシマブ、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【0041】
【図5】図５は、ヒト死体ドナーに由来する脾臓Ｂ細胞などの前処置または寛容化レジメンにおける使用のための、アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）の調製のための白血球の増幅のための例示的プロトコールを示す。脾細胞を単離し、ナイロンウールカラム上でＲＢＣ溶解およびＢ細胞富化にかける。単離された脾細胞の第１の画分（例えば、約８０％）を使用して、移植に対して最初の時点（例えば、－７日目）での注入のためのアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）の用量を生成することができる。脾細胞を、本明細書に開示されるようにＥＣＤＩ処理し、リリース試験にかけ、レシピエントに注入することができる。単離された脾細胞の第２の画分（例えば、約２０％）を取り分け、これを使用して、＋１日目での注入のためのＡＤＬの第２の用量を生成することができる。第２の画分は、Ｂ細胞を富化するための選択（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用する陽性または陰性選択）に供してもよく、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅することができる（例えば、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈ－ＩＬ２１、ｈＢＡＦＦ、およびｈ－ＣＤ４０Ｌ多量体の存在下で８日を超える）。富化されたＢ細胞は、ＥＣＤＩ処理、リリース試験、および移植レシピエントへの注入の前（例えば、１日目）に少なくとも１５倍の増幅に供してもよい。
【0042】
【0043】
【図7】図７は、ドナーの末梢血から得られ、移植に対して－７および＋１日目での注入のためにｅｘ ｖｉｖｏで増幅した、寛容化アポトーシス性ドナーＢ細胞の患者用量を生成するための例示的プロトコールを示す。プロトコールを、移植の少なくとも約３～４週間前に開始することができる。１回または複数回の低体積白血球除去輸血手順を、サイトカイン刺激されていない生きているドナー（例えば、腎臓ドナー）に対して行う。Ｂ細胞を富化して（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用する陽性または陰性選択による）、約０．５ｘ１０＾９個のＢ細胞の入力細胞収量を提供する。富化されたＢ細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで少なくとも２００倍に増幅して、標的細胞用量を提供する（例えば、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈ－ＩＬ－２１、ｈＢＡＦＦ、およびｈ－ＣＤ４０Ｌ多量体の存在下で、約１６日にわたって増幅される）。増幅後、Ｂ細胞を、本明細書に開示されるようにＥＣＤＩ処理し、リリース試験にかけ、レシピエントに注入する（例えば、移植に対して－７日目および＋１日目に）。
【0044】
【0045】
図８Ｂは、拒絶がない膵島同種グラフト生存のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｒ推定量を提供する。本明細書に記載のアポトーシス性白血球を含む前処置および寛容化レジメンの投与は、生存の有意な改善と関連していた。Ｐ＝０．０２１、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ。
【0046】
【図9】図９Ａ～Ｆは、本明細書に記載のアポトーシス性白血球を含む前処置および寛容化レジメンの投与が、膵島同種グラフトの安定な寛容を容易にすることを示す。図９Ａは、本明細書に記載のアポトーシス性白血球を含む前処置および寛容化レジメンを受けたサルが、移植後すぐに正常血糖になり、移植後２１日目の免疫抑制および外因性インスリンの中止後もそのままであったことを示す。食前および食後ＢＧを線で示し、１日インスリンをバーで示す。グラフは、７日間培養した膵島の門脈内移植後の正常血糖の回復（ＤＮＡによる５５４７ＩＥ／ｋｇ）、および移植後＋２１日目でのインスリンおよび免疫抑制の中止にも拘わらず、正常血糖の維持を示す。図９Ｂは、レシピエントの糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルが、移植後に正常になり、それを保持したことを示す。図９Ｃは、移植後の継続的体重増加を示す。図９Ｄは、コホートＣのサルにおける、強く陽性の移植後の空腹時および無作為血清Ｃペプチドレベルならびに１年のフォローアップを通した刺激後のその増加が、安定な膵島同種グラフト機能を確認したことを示す。図９Ｅは、そのレシピエントにおける、ＳＴＺ前の速度と同等である、グルコースのＩＶチャレンジ後の安定な移植後血中グルコース消失速度（Ｋｇ）が観察されたことを示す。図９Ｆは、適合試験に由来するＣペプチドレベルが、移植後の経過を通して１ｎｇ／ｍＬを超える実質的な増加を示したことを示す。
【0047】
【0048】
【図11】図１１Ａ～Ｆは、移植の１年後に犠牲にならなかった、本開示の前処置レジメンを受けた移植レシピエントが、免疫抑制の中止後も２年を超えて継続的な膵島同種グラフトの機能を示したことを示す。図１１Ａは、食前および食後血糖（それぞれ、実線および破線）ならびに１日インスリン（バー）を提供する。図１１Ｂは、フォローアップを通した正の、かつ安定なＣペプチドレベル（空腹、無作為、および混合食刺激）を示す。図１１Ｃは、フォローアップを通した正常に近いＨｂＡ１ｃレベルの回復を示す。図１１Ｄは、移植後の継続的な体重増加を示し、移植後の正常血糖が吸収不良状態に起因するものではないことを示している。図１１Ｅは、０．５ｇ／ｋｇのグルコースのＩＶ注入（ＩＶＧＴＴ）の前後での血糖ならびに糖尿病誘導の前後および移植後のＫｇレベルを示す。図１１Ｆは、ＩＶグルコース（０．５ｇ／ｋｇ）に対する急性Ｃペプチド応答を示す。
【0049】
【0050】
【図13】図１３Ａ～Ｆは、本明細書に記載のアポトーシス性白血球を含む前処置および寛容化レジメンの投与を受けなかったサルが、特に、移植の４ヶ月後に明らかであったように、グラフト機能の徐々の低下を示したことを示す。図１３Ａは、食前および食後血糖値（それぞれ、実線および破線）ならびに１日インスリン（バー）を示す。上向きの傾向と共に、移植後１３３日目で出発して食後不安定性が明らかであり、拒絶に起因する同種グラフトの喪失を示唆していた。図１３Ｂは、Ｃペプチドレベル（空腹、無作為、および混合食刺激）が移植後に正になり、基底レベルは、移植後１６１日目まで約１ｎｇ／ｍＬのままであったことを示す。図１３Ｃは、正常に近いＨｂＡ１ｃレベルの回復を示し、次いで、１４０日目あたりで、継続的な上向きの傾向と共にレベルの上昇が始まっている。図１３Ｄは、移植後の継続的な体重増加を示し、移植後の正常血糖が吸収不良状態に起因するものではないことを示している。図１３Ｅは、０．５ｇ／ｋｇのグルコースのＩＶ注入（ＩＶＧＴＴ）の前後での血糖値ならびに糖尿病誘導の前後および移植後のＫｇレベルを示す。図１３Ｆは、ＩＶグルコース（０．５ｇ／ｋｇ）に対する急性のＣペプチド応答を示す。
【0051】
【図14】図１４Ａ～Ｆは、移植前および移植後の様々な時点でのコホートＢおよびＣにおけるエフェクター細胞応答を示す。図１４Ａは、コホートＢ（ｎ＝７）およびＣ（ｎ＝５）に由来するレシピエントにおける、移植前ならびに移植後３、６および１２ヶ月で長期的に測定された、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のＣＤ４＋Ｔエフェクター記憶（ＴＥＭ）細胞のパーセンテージを示す。図１４Ｂは、コホートＢ（ｎ＝３～７）およびＣ（ｎ＝２～５）に由来するレシピエントにおける、終結時のＰＢＬ、肝臓単核細胞（ＬＭＮＣ）、およびリンパ節（ＬＮ）中のＣＤ４＋ＴＥＭ細胞のパーセンテージを示す。図１４Ｃは、６日間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における、移植前および移植後の示された間隔での照射されたドナーＰＢＬに応答するコホートＢおよびＣにおけるカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の倍率変化（移植前レベルとの比較；ナイーブ）を示す。図１４Ｄは、コホートＢ（ｎ＝７）およびＣ（ｎ＝５）に由来するＰＢＬ中の循環ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞のパーセンテージを示す。図１４Ｅは、コホートＢ（ｎ＝３～７）およびＣ（ｎ＝３～５）に由来するレシピエントにおける終結時のＰＢＬ、ＬＭＮＣ、およびＬＮ中のＣＤ８＋ＴＥＭ細胞のパーセンテージを示す。図１４Ｆは、６日間のＭＬＲにおける、移植前および移植後の示された間隔での照射されたドナーＰＢＬに応答するコホートＢおよびＣにおけるＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の倍率変化（移植前レベルとの比較；ナイーブ）を示す。
【0052】
【0053】
【0054】
【図17】図１７Ａ～Ｅは、寛容化および前処置レジメンの部分としてのＡＤＬが、ＭＤＳＣの増幅および寛容原性ＡＰＣを誘導することを示す。図１７Ａは、ＭＤＳＣの特定のためのゲーティング戦略を示す。シングレットを最初にゲート化して、ダブレットを除去し、死滅した細胞を除外した。ＣＤ３３＋およびＣＤ１１ｂ＋の同時発現に基づいて、Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－集団内のゲート化されたＣＤ１４＋細胞中で、およびＣＤ３－ＣＤ２０－細胞を描写するＬｉｎを用いて、ＭＤＳＣを特定した。１匹のコホートＢ（上）および１匹のコホートＣ（下）のサルに由来する代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す。図１７Ｂは、コホートＢのサルと比較した、コホートＣのサルにおける循環ＭＤＳＣのパーセンテージの有意な増加を示す。図１７Ｃは、循環ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞のＭＦＩの倍率変化を示す。図１７Ｄは、循環ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１４＋単球のＭＦＩの倍率変化を示す。図１７Ｅは、循環ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２０＋Ｂ細胞のＭＦＩの倍率変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0055】
本開示の以下の議論は、例示および説明の目的で提示されている。以下は、本発明を本明細書に開示の１つまたは複数の形態に限定することを意図するものではない。本開示の説明は、１つまたは複数の実施形態、ならびにある特定の変形および改変の説明を含むが、他の変形および改変は、例えば、本開示を理解した後、当業者の技能および知識内であり得るように、本開示の範囲内である。特許請求に係る構造、機能、範囲またはステップに対して、代替、互換および／または同等の構造、機能、範囲またはステップを含む代替の実施形態を、そのような代替、互換および／または同等の構造、機能、範囲またはステップが本明細書に開示されているか否かにかかわらず、かつ任意の特許可能な主題を公に供することを意図することなく、許容される程度で含む権利を取得することを意図する。
【0056】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のみのためであって、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0057】
本開示のさまざまな特徴は、単一の実施形態の文脈で記載され得るが、この特徴はまた、別々に、または任意の適切な組合せで提供することができる。逆に、本開示は、明確にするために別々の実施形態の文脈で本明細書に記載され得るが、さまざまな態様および実施形態は、単一の実施形態で実行することができる。
【0058】
本明細書に開示の一部の実施形態の実施は、他に指示されない限り、当技術分野の技能の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０１２）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ． Ｍ．
Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）， ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ． （１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （２０１０））を参照されたい。
定義
Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）， ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ． （１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （２０１０））を参照されたい。
定義
【0059】
以下の定義は、当技術分野における定義を補足するものであり、現在の出願を対象とし、任意の関連または非関連の場合に、例えば、任意の一般に所有されている特許または出願に帰属させるべきではない。本明細書に記載の方法および材料に類似または同等の任意の方法および材料を本開示の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。したがって、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であって、限定することを意図するものではない。
【0060】
本出願では、単数形の使用は、他に具体的に言及されない限り、複数形を含む。本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」いう用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的ではない。
【0061】
本明細書で使用される場合、「および／または」および「その任意の組合せ」という用語、ならびにそれらの文法的に同等の用語は、互換的に使用することができる。これらの用語は、任意の組合せが具体的に企図されることを伝えることができる。単なる説明の目的のために、以下の「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組合せ」という語句は、「個々にＡ、個々にＢ、個々にＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＡおよびＣ、ならびにＡ、ＢおよびＣ」を意味し得る。
【0062】
「または」という用語は、文脈が具体的に選言的な使用を指していない限り、接続的または選言的に使用することができる。
【0063】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容される誤差の範囲内を意味し、これは、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定系の限界に、部分的に依存し得る。例えば、「約」は、当技術分野における実施で、標準偏差が１または１を超える範囲内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が、本出願および特許請求の範囲に記載される場合、他に言及されない限り、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【0064】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）という語は、包括的またはオープンエンドなものであり、追加の列挙されていない要素または方法のステップを排除しない。本明細書で議論される任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実行することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらにまた、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
【0065】
本明細書における「一部の実施形態」、「１つの実施形態」、「一実施形態」または「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしも本発明のすべての実施形態に含まれなくてもよいことを意味する。
【0066】
本明細書で使用される場合、「移植」という用語およびその文法的に同等の用語は、ドナーからレシピエントへの細胞、組織または臓器の移植、埋込または注入を含む任意の手順を包含する。移植の非限定的な例示的な種類としては、自家移植、自家グラフト、同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、同種グラフト、同系移植、同系グラフト、異種移植、異種グラフト、ならびに分割グラフトおよびドミノ移植が挙げられる。１つの実施形態では、「分割グラフト」という用語は、２以上のレシピエントに分割されるドナーからの細胞、臓器、組織、またはさらに特定のタンパク質の移植を含む任意の手順を包含する。
【0067】
本明細書で使用される場合、「自家移植」、「自家移植片」、「自家グラフト」という用語または文法的に同等の用語は、身体の一部由来の臓器、組織、細胞、またはさらに特定のタンパク質もしくは発現産物の同じ対象の別の部分への移植を含む任意の手順を包含する。１つの実施形態では、対象は、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーである。１つの実施形態では、対象は、有蹄動物、例えば、ブタ、キリン、ラクダ、シカまたはウシである。１つの実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類である。このような手順によって移植される自家組織（自家（ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ）、自家（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）または自家（ａｕｔｏｇｅｎｉｃ）組織とも呼ばれる）は、自家グラフトまたは自家移植片と呼ばれる。
【0068】
本明細書で使用される場合、「同種移植」、「同種移植片」、「同種グラフト」という用語またはそれらの文法的に同等の用語は、レシピエントおよびドナーが同じ種である、レシピエントへの細胞、組織もしくは臓器の移植、埋込または注入を含む任意の手順を包含する。１つの実施形態では、レシピエントおよび／またはドナーは、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーである。１つの実施形態では、レシピエントおよび／またはドナーは、有蹄動物、例えば、ブタ、キリン、ラクダ、シカまたはウシである。１つの実施形態では、本明細書に記載の細胞、組織または臓器は、ヒトまたは非ヒト霊長類に移植される。同種移植としては、限定されるものではないが、血管化同種移植片、部分的血管化同種移植片、非血管化同種移植片、同種ドレッシング、同種包帯および同種構造が挙げられる。一部の場合では、同種移植片は、臓器または組織が、ドナーから遺伝的に同一のレシピエント（一卵性双生児など）へ移植される、同系グラフトまたは同系移植片である。
【0069】
本明細書で使用される場合、「異種移植」、「異種移植片」または「異種グラフト」という用語またはその文法的に同等の用語は、レシピエントおよびドナーが異なる種である、レシピエントへの細胞、組織または臓器の移植、埋込または注入を含む任意の手順を包含する。１つの実施形態では、レシピエントおよび／またはドナーは、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーである。１つの実施形態では、レシピエントおよび／またはドナーは、有蹄動物、例えば、ブタ、キリン、ラクダ、シカまたはウシである。１つの実施形態では、ドナーは、ブタであり、レシピエントは、ヒトまたは非ヒト霊長類である。１つの実施形態では、本明細書に記載の細胞、組織または臓器は、ヒトまたは非ヒト霊長類に移植される。異種移植としては、限定されるものではないが、血管化異種移植片、部分的血管化異種移植片、非血管化異種移植片、異種ドレッシング、異種包帯およびナノ構造が挙げられる。
【0070】
本明細書で使用される場合、「移植片拒絶反応」という用語およびその文法的に同等の用語は、臓器移植レシピエントの免疫応答が、移植された材料（例えば、細胞、組織および／または臓器）に対する反応を、移植された材料の機能を損なうまたは破壊するのに十分に高める、１つまたは複数のプロセスを指し得る。
【0071】
本明細書で使用される場合、「超急性拒絶反応」という用語およびその文法的に同等の用語は、移植後最初の２４時間以内に起こるかまたは始まる、移植された材料または組織の拒絶反応を指し得る。例えば、超急性拒絶反応は、限定されるものではないが、「急性体液性拒絶反応」および「抗体媒介拒絶反応」を包含し得る。
【0072】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹを含み、単鎖全抗体を含む全抗体、およびその抗原結合性（Ｆａｂ）断片を含むことを意味する。抗原結合性抗体断片としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ（ＶＨおよびＣＨ１からなる）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結可変断片（ｄｓＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片が挙げられる。抗体は、任意の動物起源由来であり得る。単鎖抗体を含む抗原結合性抗体断片は、可変領域を、単独で、または以下、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全部もしくは一部と組み合わせて、含むことができる。可変領域、ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの任意の組合せも含まれる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体であり得る。
【0073】
本明細書で使用される場合、「改善する」、「増強する」、「向上する」およびその文法的に同等の用語は、当業者によって認識される任意の改善を意味し得る。例えば、移植を改善するとは、超急性拒絶反応を軽減することを意味し得、これは、望ましくない効果または症状の減少、軽減または減弱を包含し得る。
【0074】
本明細書で使用される場合、「膵島（ｉｓｌｅｔ）」、「膵島細胞」、「膵島同等物」、「膵島様細胞」、「膵島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ）、「天然膵島細胞」、「非天然膵島細胞」、「膵島様細胞培養物」という用語およびそれらの文法的に同等の用語は、生物体の膵臓に存在する内分泌（例えば、ホルモン産生）細胞、または生物体の膵臓に存在する細胞の１つまたは複数の機能を模倣する細胞を指す。例えば、膵島細胞は、限定されるものではないが、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞および／または膵ε細胞を含む、異なる種類の細胞を含み得る。膵島細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞を含む、細胞、細胞集塊などの群も指し得る。一部の実施形態では、膵島細胞は、膵島ドナーから抽出され、分化、増幅および血管新生のために膵島レシピエントの所定の部位に埋込または移植されて、本明細書に記載の方法、システムおよび／または試薬によって治療用量のβ細胞塊を形成する。１つの実施形態では、所定の部位は、膵島レシピエントの腎臓被膜下腔である。一部の実施形態では、ドナーから抽出された膵島細胞は、一過性の免疫抑制に援護されて、レシピエントに埋込または移植される。ランゲルハンス島は、内分泌（例えば、ホルモン産生）細胞（例えば、ベータ細胞）を含有する膵臓の領域である。一部の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載の方法、システムおよび／または試薬によってドナーから単離された膵臓系列細胞（例えば、ベータ様細胞またはベータ様細胞を含む細胞集団）を含む、新生仔膵島クラスター（ＮＩＣＣ）または新生仔ブタ膵島（ＮＰＩ）が提供される。一部の実施形態では、ＮＩＣＣまたはＮＰＩは、膵島ドナーから抽出され、分化、増幅および血管新生のために膵島レシピエントの所定の部位に埋込または移植されて、本明細書に記載の方法、システムおよび／または試薬によって治療用量のβ細胞塊を形成する。１つの実施形態では、所定の部位は、膵島レシピエントの腎臓被膜下腔である。一部の実施形態では、ドナーから抽出されたＮＩＣＣまたはＮＰＩは、一過性の免疫抑制に援護されて、レシピエントに埋込または移植される。一部の実施形態では、膵島細胞は、幹細胞由来膵島細胞、誘導多能性幹細胞由来膵島細胞、分化形質転換または代替膵島細胞であり得る。「ドナー」は、任意の哺乳動物生物体、ヒトまたは非ヒトを含むことを意味し、これは、移植のため、および／またはドナー細胞寛容を誘導するためのドナー組織または細胞の供給源としての役割を果たし得る。非ヒト哺乳動物としては、限定されるものではないが、偶蹄類（例えば、ブタ、ペッカリー、カバ、ラクダ、ラマ、マメジカ（マウスシカ）、シカ、キリン、プロングホーン、アンテロープ、ヤギ－アンテロープ（ヒツジ、ヤギなどを含む）、またはウシ）もしくは奇蹄類（例えば、ウマ、バクおよびサイ）などの有蹄動物、非ヒト霊長類（例えば、サルまたはチンパンジー）、イヌ科（例えば、イヌ）またはネコが挙げられる。非ヒト動物は、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーであり得る。ドナーは、生体ドナーまたは死体ドナーであり得る。一部の場合では、ドナーは、生体ドナーである。一部の場合では、ドナーは、死体ドナーである。死体ドナーは、例えば、脳死の心臓が鼓動しているドナー（ＢＤＤ）であり得る。死体ドナーは、例えば、心停止ドナー（ＮＨＢＤ）であり得る。ドナーが、生体ドナーまたは死体ドナー（例えば、ＢＤＤまたはＮＨＢＤ）であるかに関わらず、ドナーは、任意の動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物由来であり得る。ドナーは、限定されるものではないが、胎児、周産期、新生児、離乳前、離乳後、子供、若年成体または成体を含む、任意の発育段階におけるものであり得る。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製において使用される細胞のドナーは、移植ドナー（例えば、移植のために使用される細胞、組織または臓器のドナー）と完全または部分的にＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）適合であり得る。一部の場合では、部分的に適合したドナーは、移植ドナーとハプロタイプ一致である。一部の場合では、部分的に適合したドナーは、移植ドナーと１つまたは複数のＭＨＣ対立遺伝子を共有する。例えば、部分的に適合したドナーは、移植ドナーと、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子、またはそれらの組合せの１つまたは複数を共有することができる。一部の場合では、部分的に適合したドナーは、移植ドナーと、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子、またはそれらの組合せの１つまたは複数を共有することができる。部分的に適合したドナーは、移植ドナーと１つのＤＲ対立遺伝子を共有することができる。
【0075】
「レシピエント」は、移植グラフトを受けることができるか、移植グラフトを受けているか、もしくは移植グラフトを受けた、ヒトまたは非ヒト動物であり得、寛容化ワクチン、移植のための前処置レジメンおよび／または他の組成物が本開示において提供される。レシピエントはまた、本明細書に提供される、移植グラフト、寛容化ワクチン、移植のための前処置レジメンおよび／または他の組成物を必要とし得る。一部の場合では、レシピエントは、移植グラフトを受けることができるか、移植グラフトを受けているか、もしくは移植グラフトを受けた、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。一部の場合では、レシピエントは、本記載の移植のための寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを受けることができるか、それを受けているか、もしくはそれを受けた、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。
【0076】
本明細書で使用される場合、「非ヒト動物」という用語およびその文法的に同等の用語は、非ヒト哺乳動物を含む、ヒト以外のすべての動物種を含み、これは、在来動物または遺伝子改変された非ヒト動物であり得る。非ヒト哺乳動物としては、偶蹄類（例えば、ブタ、ペッカリー、カバ、ラクダ、ラマ、マメジカ（マウスシカ）、シカ、キリン、プロングホーン、アンテロープ、ヤギ－アンテロープ（ヒツジ、ヤギなどを含む）、またはウシ）もしくは奇蹄類（例えば、ウマ、バクおよびサイ）などの有蹄動物、非ヒト霊長類（例えば、サルまたはチンパンジー）、イヌ科（例えば、イヌ）またはネコが挙げられる。非ヒト動物は、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーであり得る。Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目は、Ｗａｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｗａｒｄｓ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｏｒｄｉｎａｌ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｍａｍｍａｌｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８ （１）： １－５ （１９９９）に記載の哺乳動物の群を含み得る。Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーとしては、Ｅｕｌｉｐｏｔｙｐｈｌａ（ハリネズミ、トガリネズミおよびモグラ）、Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ（サイ、ウマおよびバク）、Ｃａｒｎｉｖｏｒａ（肉食動物）、Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ（偶蹄類およびクジラ類）、Ｃｈｉｒｏｐｔｅｒａ（コウモリ）およびＰｈｏｌｉｄｏｔａ（センザンコウ）が挙げられ得る。Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーは、本明細書に記載の有蹄動物、例えば、奇蹄類または偶蹄類であり得る。有蹄動物は、ブタであり得る。メンバーは、ネコまたはイヌなどのＣａｒｎｉｖｏｒａのメンバーであり得る。一部の場合では、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーは、ブタであり得る。
【0077】
本明細書で使用される場合、「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」、「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）動物」、「ブタ（ｐｉｇ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語ならびにその文法的に同等の用語は、偶蹄類のＳｕｉｄａｅ科ファミリー内のＳｕｓ属の動物を指し得る。例えば、ブタは、野生ブタ、飼育ブタ、ミニブタ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａブタ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓブタ、または近交系ブタであり得る。
【0078】
「胎児動物」という用語およびその文法的に同等の用語は、動物の任意の生まれていない子孫を指し得る。一部の場合では、膵臓細胞または組織は、移植のために、６週齢の胚性ブタから単離される。「周産期動物」という用語およびその文法的に同等の用語は、出生直前または直後の動物を指し得る。例えば、周産期は、妊娠の２０～２８週から開始して、出生の１～４週後に終わり得る。「新生児動物」という用語およびその文法的に同等の用語は、任意の新たに生まれた動物を指し得る。例えば、新生児動物は、出生の１か月以内の動物であり得る。「離乳前非ヒト動物」という用語およびその文法的に同等の用語は、母乳をやめる前の任意の動物を指し得る。「子動物」という用語およびその文法的に同等の用語は、若年成体動物になる前の任意の動物を指し得る。例えば、幼若期のブタは、２歳またはそれよりも若い任意のブタを指し得る。
【0079】
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変された」、「遺伝子操作された」、「トランスジェニック」、「遺伝子改変」という用語およびその文法的に同等の用語は、核酸、例えば、生物体のゲノム内の核酸の１つまたは複数の変更を有することを指す。例えば、遺伝子改変とは、遺伝子の変更、付加および／または欠失を指し得る。遺伝子改変細胞は、付加、欠失および／または変更された遺伝子を有する細胞も指し得る。遺伝子改変細胞は、遺伝子改変非ヒト動物由来であり得る。遺伝子操作非ヒト動物由来の遺伝子操作細胞は、このような遺伝子操作非ヒト動物から単離された細胞であり得る。遺伝子改変非ヒト動物由来の遺伝子改変細胞は、このような遺伝子改変非ヒト動物が起源の細胞であり得る。遺伝子操作細胞または遺伝子操作動物は、動物の少なくとも１つの細胞において、および典型的には、動物の少なくとも１つの生殖系列細胞において、遺伝子型または表現型の効果を媒介するために、付加もしくは組み込まれた導入遺伝子もしくは他の外来ＤＮＡ、または、標的とされ、組換えられ、中断され、欠失し、破壊され、置き換えられ、抑制され、増強され、もしくは他に変更されることを含む、改変された内在性遺伝子を含むことができる。
【0080】
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語およびその文法的に同等の用語は、生物体に移動することができる遺伝子または遺伝子材料を指し得る。例えば、導入遺伝子は、生物体に導入される遺伝子を含有するＤＮＡの区間またはセグメントであり得る。遺伝子または遺伝子材料は、異なる種由来であり得る。遺伝子または遺伝子材料は、合成であり得る。導入遺伝子が生物体に移動する場合、その結果、生物体は、トランスジェニック生物体と称され得る。導入遺伝子は、トランスジェニック生物体においてＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）を産生するその能力を保持することができる。導入遺伝子は、タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片）をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。導入遺伝子のポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドであり得る。タンパク質の断片（例えば、機能的断片）は、タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも、または少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を含むことができる。タンパク質の断片は、タンパク質の機能的断片であり得る。タンパク質の機能的断片は、タンパク質の機能の一部またはすべてを保持することができる。外因性ポリペプチドは、外因性タンパク質またはその機能的断片をコードすることができる。
【0081】
本明細書で使用される場合、「外因性核酸配列」、「外因性ポリヌクレオチド」という用語およびその文法的に同等の用語は、細胞または動物の外側で生じた、細胞または動物に移動した遺伝子または遺伝材料を指し得る。外因性核酸配列は、合成的に生成し得る。外因性核酸配列は、異なる種、または同じ種の異なるメンバー由来であり得る。外因性核酸配列は、内因性核酸配列の別のコピーであり得る。
【0082】
「遺伝子ノックアウト」または「ノックアウト」という用語は、「ノックアウト」される遺伝子の発現を低減する任意の遺伝子改変を指し得る。発現の低減は、発現なしを含み得る。遺伝子改変は、ゲノム破壊を含み得る。
【0083】
本明細書で使用される場合、「破壊する」という用語およびその文法的に同等の用語は、例えば、欠失、挿入、突然変異、転位、またはそれらの任意の組合せによる、遺伝子を変更するプロセスを指し得る。例えば、遺伝子は、ノックアウトによって破壊され得る。遺伝子の破壊は、遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現）を部分的に低減する、または完全に抑制することであり得る。破壊は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ドミナントネガティブなどの阻害技術、または遺伝子もしくはタンパク質の機能性もしくは発現を阻害する任意の他の手段も含み得る。
【0084】
本明細書で使用される場合、「遺伝子編集」という用語およびその文法的に同等の用語は、１つまたは複数のヌクレオチドが、ゲノムに挿入、置き換えまたはそれから除去される遺伝子操作を指し得る。例えば、遺伝子編集は、ヌクレアーゼ（例えば、天然に存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使用して行うことができる。
【0085】
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」という用語およびその文法的に同等の用語は、標的ＤＮＡに特異的であり得、かつＣａｓタンパク質と複合体を形成し得る、ＲＮＡを指し得る。ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに「導く」のを助けることができる。
【0086】
本明細書で使用される場合、「状態」という用語およびその文法的に同等の用語は、疾患、事象または健康状態の変化を指し得る。
【0087】
本明細書で使用される場合、「糖尿病」という用語およびその文法的に同等の用語は、長期にわたる高血糖レベルによって特徴付けられる疾患を指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、「糖尿病」という用語およびその文法的に同等の用語は、限定されるものではないが、１型、２型、３ｃ型（嚢胞性線維症関連、ならびに外科的、およびヘモクロマトーシス関連を含む膵性糖尿病）、妊娠糖尿病および一遺伝子性糖尿病（ＨＮＦ１Ａ－ＭＯＤＹ、ＧＣＫ－ＭＯＤＹ ２など）、ならびに他の形態のミトコンドリア糖尿病を含む、すべてまたは任意の種類の糖尿病を指し得る。一部の場合では、糖尿病は、遺伝性糖尿病の形態であり得る。
【0088】
本明細書で使用される場合、「表現型」という用語およびその文法的に同等の用語は、生物体の観察可能な特性または形質、例えば、その形態、発生、生物学的または生理学的性質、生物季節学、挙動、および挙動の生成物の複合を指し得る。文脈に応じて、「表現型」という用語は、時々、集団の観察され得る特性または形質の複合を指し得る。
【0089】
全体にわたって開示される一部の数値は、例えば、「Ｘは、少なくとも、または少なくとも約１００、または２００［または任意の数値］である」と称する。この数値は、数字それ自体および以下のすべてを含む：
ｉ）Ｘは、少なくとも１００である；
ｉｉ）Ｘは、少なくとも２００である；
ｉｉｉ）Ｘは、少なくとも約１００である；および
ｉｖ）Ｘは、少なくとも約２００である。
ｉ）Ｘは、少なくとも１００である；
ｉｉ）Ｘは、少なくとも２００である；
ｉｉｉ）Ｘは、少なくとも約１００である；および
ｉｖ）Ｘは、少なくとも約２００である。
【0090】
すべてのこれらの異なる組合せは、全体にわたって開示される数値によって企図される。すべての開示される数値は、他に具体的にその反対を指示しない限り、治療薬の投与を指すか、または日、月、年、体重、投薬量などを指すかにかかわらず、このように解釈されるものとする。
【0091】
全体にわたって開示される範囲は、時々、例えば、「Ｘは、１～２日目もしくは２～３日目、または約１～２日目もしくは約２～３日目［または任意の数の範囲］に投与される」と称する。この範囲は、数字それら自体（例えば、範囲の端点）、および以下のすべてを含む：
ｉ）Ｘは、１日目～２日目に投与される；
ｉｉ）Ｘは、２日目～３日目に投与される；
ｉｉｉ）Ｘは、約１日目～２日目に投与される；
ｉｖ）Ｘは、約２日目～３日目に投与される；
ｖ）Ｘは、１日目～約２日目に投与される；
ｖｉ）Ｘは、２日目～約３日目に投与される；
ｖｉｉ）Ｘは、約１日目～約２日目に投与される；および
ｖｉｉｉ）Ｘは、約２日目～約３日目に投与される。
ｉ）Ｘは、１日目～２日目に投与される；
ｉｉ）Ｘは、２日目～３日目に投与される；
ｉｉｉ）Ｘは、約１日目～２日目に投与される；
ｉｖ）Ｘは、約２日目～３日目に投与される；
ｖ）Ｘは、１日目～約２日目に投与される；
ｖｉ）Ｘは、２日目～約３日目に投与される；
ｖｉｉ）Ｘは、約１日目～約２日目に投与される；および
ｖｉｉｉ）Ｘは、約２日目～約３日目に投与される。
【0092】
すべてのこれらの異なる組合せは、全体にわたって開示される範囲によって企図される。すべての開示される範囲は、他に具体的にその反対を指示しない限り、治療薬の投与を指すか、または日、月、年、体重、投薬量などを指すかにかかわらず、このように解釈されるものとする。
移植免疫調節
移植免疫調節
【0093】
本明細書において、グラフト寛容を誘導するための組成物、システムおよび方法を記載する。特に、本開示は、ドナーの移植細胞、組織または臓器の投与の前、その間またはその後に、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを投与することに関する。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、グラフトレシピエントにおける同種グラフトまたは異種グラフトに対する寛容を誘導することができる。
【0094】
臓器、組織または細胞は、幹細胞から分化され得るか、デノボで成長し得るか、または動物（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）から単離され得、同じ種（同種移植）または異なる種（異種移植）から移植を必要とするレシピエントに移植され得る。臓器、組織または細胞のドナーは、本明細書において、移植ドナーと称され得る。移植された臓器、組織または細胞は、本明細書において、移植片またはグラフトと称され得る。
【0095】
移植片またはグラフトのドナーは、ヒトおよび非ヒト動物を含む任意の動物であり得る。一部の場合では、ドナーは、ヒトである。一部の場合では、移植ドナーは、非ヒト動物である。移植ドナー（例えば、非ヒト動物ドナー）は、例えば、移植片もしくはグラフトがレシピエントの免疫系によって認識され得る可能性を低減もしくは排除するため、または移植片もしくはグラフトを認識する際に、レシピエントの免疫系による免疫応答を低減するために、遺伝子改変され得る。
【0096】
移植片またはグラフトのドナーは、生体ドナーまたは死体ドナーであり得る。一部の場合では、移植ドナーは、生体ドナーである。一部の場合では、移植ドナーは、死体ドナーである。死体ドナーは、脳死の心臓が鼓動しているドナー（ＢＤＤ）であり得る。あるいは、死体ドナーは、心停止ドナー（ＮＨＢＤ）であり得る。移植ドナーが、生体ドナーまたは死体ドナー（例えば、ＢＤＤまたはＮＨＢＤ）であるかに関わらず、ドナーは、任意の動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物由来であり得る。
【0097】
移植片またはグラフトのドナーは、任意の年齢または発育段階であり得る。例えば、移植ドナーは、胎児、周産期、新生児、離乳前、離乳後、子供、若年成体または成体のヒトまたは動物であり得る。
【0098】
移植片またはグラフトは、それを必要とするレシピエントにおける疾患または障害を処置するために使用することができる。処置され得る適切な疾患は、レシピエントの臓器、組織または細胞が、欠陥または傷害を受けており、レシピエントが、臓器、組織または細胞（例えば、腎臓、心臓、肺、肝臓、静脈、皮膚、膵内分泌部、膵臓の膵島細胞、またはそれらの組合せ）の移植によって処置され得る、任意のものである。一部の場合では、移植片は、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵内分泌部、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、膵島ベータ細胞もしくは肝細胞などの胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来肝細胞、またはそれらの組合せを含む。
移植片／グラフト拒絶反応
移植片／グラフト拒絶反応
【0099】
移植片／グラフト拒絶反応は、ドナー特異的抗原の認識、例えば、宿主の抗原提示細胞（間接的）またはドナーの抗原提示細胞（直接的）によってＴ細胞に提示されるドナー特異的抗原の認識を含み得る。ドナー特異的抗原への応答におけるＴ細胞活性化は、炎症促進性応答および移植片拒絶反応をもたらし得る。
【0100】
移植片／グラフト拒絶反応は、本明細書に記載の方法を含む、免疫応答を和らげる方法によって、予防することができる。本開示の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、例えば、移植片に対する炎症促進性免疫応答を低減すること、および／または寛容促進免疫応答を増強することによって、移植片拒絶反応を予防するため、または拒絶反応を遅延させるために、使用することができる。一部の場合では、本開示の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、レシピエントの長期免疫抑制についての必要性を回避することができる。
【0101】
移植片拒絶反応（例えば、Ｔ細胞媒介移植片拒絶反応）は、１種または複数の免疫調節分子による慢性的な免疫抑制によって予防することができる。しかしながら、免疫抑制は、費用がかかり、深刻な副作用のリスクと関連する。慢性的な免疫抑制についての必要性を回避するために、国際公開第２０１６／０９４６７９号、米国特許出願公開第２０１６０１６５８６１号および国際公開第２０１７／２１８７１４号に記載のような多面的なＴ細胞を標的とする拒絶反応の予防が開発されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、Ｔ細胞を標的とする拒絶反応の予防は、（ｉ）ＭＨＣクラスＩの機能発現を欠く遺伝子改変グラフトを利用し、それによって直接特異性によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を妨げ、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性エフェクター機能を起こさないようにする、（ｉｉ）Ｂ細胞（および他のＡＰＣ）媒介Ｔ細胞プライミング、およびアンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ、Ｂ細胞標的剤（例えば、Ｂ細胞を生物学的に枯渇させる、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を生物学的に標的とする、および／またはＢ細胞を生物学的にモジュレートする、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を生物学的に標的とする）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ－アルファ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、またはそれらの組合せを含む誘導免疫療法を使用する抗ドナーＴ細胞のメモリー発生を妨げる、ならびに／あるいは（ｉｉｉ）アポトーシス性ドナー細胞ワクチン（すなわち、寛容化ワクチン）の移植前後の注入を介して間接的特異性により抗ドナーＴ細胞を枯渇させる。一部の場合では、Ｂ細胞標的剤は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、リツキシマブおよび／またはＢ細胞枯渇抗体であり得る。
【0102】
一部の実施形態では、最小限の免疫抑制薬の使用（例えば、１種または複数の免疫調節分子）なし、またはありで、移植拒絶反応を予防するため、または移植拒絶反応までの時間を延長するための本明細書に記載の方法は、細胞、臓器または組織ドナーとして、遺伝子改変動物を使用することを含む。変更されたドナー動物、例えば、ドナーの非ヒト動物の細胞、臓器および／または組織は、採取することができ、同種グラフトまたは異種グラフトにおいて使用することができる。あるいは、細胞、臓器または組織は、動物から抽出することができ、遺伝子変更された細胞、臓器または組織を発生させるために使用することができる。一部の場合では、初代細胞は、動物から抽出することができ、遺伝子変更された細胞を作製するために使用することができる。一部の場合では、動物（例えば、細胞系）に由来する細胞、臓器または組織は、遺伝子変更された細胞、臓器または組織を作出するために使用することができる。
【0103】
移植片拒絶反応は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを使用して、移植片またはグラフトに対する寛容を誘導することによって、低減または排除することもできる。
寛容の誘導
寛容の誘導
【0104】
本明細書において、細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法およびレジメンが提供される。本明細書で使用される場合、「寛容」または「免疫寛容」という用語は、免疫応答を誘発する能力を有する物質または組織に対する免疫系の無応答の状態を指す。本開示の組成物、前処置レジメンまたは寛容化レジメンは、前記移植片の移植の際に、移植片に対する寛容または部分寛容を達成するために有用である。本明細書で使用される場合、「部分寛容」は、免疫応答の低減または阻害をもたらす部分的な免疫寛容である。一部の実施形態では、本明細書において、免疫応答を阻害するため、および／または出現もしくはＧＶＨＤを阻害するための方法およびレジメンが提供される。本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介および／またはＢ細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞傷害活性が挙げられ、加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的にもたらされる免疫応答を含む。免疫応答に関与する免疫細胞としては、Ｂ細胞およびＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）などのリンパ球；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄性細胞が挙げられる。例えば、免疫応答は、移植片拒絶反応、および例えば、間質性線維症、慢性グラフト動脈硬化症または血管炎などのそのような免疫応答の随伴的な生理学的結果に関与する。
【0105】
したがって、本明細書に開示のアポトーシス性白血球および他の組成物、または前処置レジメンもしくは寛容化レジメンが投与されていない対象に対する比較において、本明細書に開示の白血球などのアポトーシス細胞および他の組成物、または前処置レジメンもしくは寛容化レジメンが投与される対象は、例えば、ａ）移植片に対する免疫応答のレベル低下（Ｂ細胞媒介免疫応答、より詳細にはドナー特異的抗体によって少なくとも一部は媒介されると考えられる）、ｂ）移植片に対する免疫応答の開始もしくは進行の遅延、ｃ）移植片に対する免疫応答の開始もしくは進行のリスク低下、またはｄ）ＧＶＨＤの出現の阻害もしくはその出現のリスク低下を示す。
本明細書で使用される場合、「移植片拒絶反応を予防する、または低減する」というという用語は、免疫移植片拒絶反応の予防または阻害、および免疫移植片拒絶反応の開始または進行を遅延させることを包含することを意味する。この用語はまた、患者の移植片の生着を延長すること、または患者の移植片の失敗を反転させることを包含することを意味する。さらに、この用語は、例えば、間質性線維症、慢性グラフト動脈硬化症または血管炎などの、例えば、免疫拒絶反応に関連する免疫学的合併症を改善することを含む、免疫移植片拒絶反応の症状を改善することを包含することを意味する。したがって、「寛容を誘導する」とは、免疫細胞のレベルの変化（例えば、寛容原性ＡＰＣの数の増加、Ｔｒｅｇの数の増加、Ｔｒ１細胞の数の増加、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および／またはＣＤ２０＋細胞の減少）、免疫調節分子のレベルの変化（例えば、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βの増加）、またはそれらの組合せを指し得る。一部の実施形態では、免疫応答のモジュレートは、免疫応答の抑制または免疫抑制であり得る。本明細書で使用される場合、レベル、数、カウントおよび濃度という用語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、「免疫調節分子」という用語は、対象の免疫系の細胞の増殖または活性化をもたらすことができる任意の分子を指す。このような分子としては、限定されないが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、一酸化窒素、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）およびインターロイキン１０（ＩＬ－１０）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「移植片拒絶反応を予防する、または低減する」というという用語は、免疫移植片拒絶反応の予防または阻害、および免疫移植片拒絶反応の開始または進行を遅延させることを包含することを意味する。この用語はまた、患者の移植片の生着を延長すること、または患者の移植片の失敗を反転させることを包含することを意味する。さらに、この用語は、例えば、間質性線維症、慢性グラフト動脈硬化症または血管炎などの、例えば、免疫拒絶反応に関連する免疫学的合併症を改善することを含む、免疫移植片拒絶反応の症状を改善することを包含することを意味する。したがって、「寛容を誘導する」とは、免疫細胞のレベルの変化（例えば、寛容原性ＡＰＣの数の増加、Ｔｒｅｇの数の増加、Ｔｒ１細胞の数の増加、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および／またはＣＤ２０＋細胞の減少）、免疫調節分子のレベルの変化（例えば、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βの増加）、またはそれらの組合せを指し得る。一部の実施形態では、免疫応答のモジュレートは、免疫応答の抑制または免疫抑制であり得る。本明細書で使用される場合、レベル、数、カウントおよび濃度という用語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、「免疫調節分子」という用語は、対象の免疫系の細胞の増殖または活性化をもたらすことができる任意の分子を指す。このような分子としては、限定されないが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、一酸化窒素、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）およびインターロイキン１０（ＩＬ－１０）が挙げられる。
【0106】
細胞培養系および対象の免疫系が両方とも基礎レベルの免疫細胞および免疫調節分子を含むことが当業者に理解される。基礎レベルおよび正常レベルという語句は、互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、免疫細胞の種類もしくは免疫調節分子の基礎レベルは、ある特定の参照状態（例えば、健康な個体において、移植前、本明細書に開示の白血球組成物もしくは前処置レジメンもしくは寛容化レジメンなどのアポトーシス細胞の投与前、または免疫抑制療法の投与前、あるいはそれらの組合せ）下の個々の集団に存在する細胞型もしくは免疫調節分子の平均数を指すか、または免疫細胞の種類もしくは免疫調節分子の基礎レベルは、活性化されていない細胞の集団に存在する細胞型もしくは免疫調節分子の平均レベルを指す。当業者は、このような細胞の集団中、または生体試料中の特定の免疫細胞のレベルを決定することができる。本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価の目的で対象（例えば、移植片のレシピエント）から得られ得る任意の試料を指す。好ましい生体試料は、血液試料（例えば、全血試料、血清試料または血漿試料）である。
【0107】
例えば、フローサイトメトリーによる特異的表面マーカータンパク質の発現の特定に基づく方法を含む、免疫細胞を測定するための方法は、当技術分野において周知である。免疫細胞のレベルは、例えば、３Ｈ－チミジン取り込み、ブロモデオキシウリジン取り込み（ＢｒｄＵ）、ＡＴＰ発光、蛍光色素減少（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）様色素）によって増殖を測定すること；例えば、Ｍｕｌｔｉ－Ａｎａｌｙｔｅ ＥＬＩＳＡｒｒａｙキット、ビーズ系マルチプレックスアッセイを使用するサイトカイン測定；例えば、フローサイトメトリーによって表面抗原発現を測定すること；例えば、Ｔｗｏ－Ｌａｂｅｌフローサイトメトリー、カルセインＡＭ色素放出、ルシフェラーゼ形質導入標的またはアネキシンＶによって細胞傷害性を測定することによって測定することができる。Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を測定するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９（６），
５９５－６００ （２０１０）， ｍＢｉｏ． ２０１５ Ｊｕｌ－Ａｕｇ； ６（４）を参照されたい。
５９５－６００ （２０１０）， ｍＢｉｏ． ２０１５ Ｊｕｌ－Ａｕｇ； ６（４）を参照されたい。
【0108】
細胞または分子の参照レベルまたは基礎レベルは、特定の量（例えば、特定の濃度）であり得るか、またはこれは、量の範囲を包含し得る。免疫細胞および免疫調節性分子の基礎レベルまたは範囲は、当業者に公知である。例えば、健康な個体において、ヒト血液中に存在するＣＤ４＋ Ｔ細胞の正常レベルは、細胞５００～１５００個／ｍｌである。細胞の基礎レベルはまた、総細胞集団のパーセンテージとして報告することができる。
【0109】
免疫細胞の数および機能は、例えば、サイトカインの産生、増殖または細胞傷害性などの活性によって免疫細胞を検出するアッセイによって、モニタリングされてもよい。例えば、抗原に対する応答において増殖するＴ細胞の能力をアッセイするリンパ増殖アッセイを、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の存在の指標として使用することができる。典型的には、精製Ｔ細胞またはＰＢＭＣの検体を、さまざまな希釈の抗原、または刺激細胞（照射された自家性、またはＨＬＡ適合の抗原提示細胞）の存在下の抗原と混合する。７２～１２０時間後、［３Ｈ］チミジンを添加し、ＤＮＡ合成（増殖の測定として）を、ＤＮＡに組み込まれた放射性標識チミジンの量を測定するガンマカウンターを使用することによって定量化する。刺激指数を、検体についてのｃｐｍの数を対照における１分あたりのカウントの数で割ることによって、計算することができる。増殖アッセイは、本開示の組成物による処置の前後でＴ細胞応答を比較するために使用することができる。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞）の増殖の検出のために用いることができるアッセイの別の例としては、細胞内蛍光色素の使用、混合リンパ球反応における５，６－カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＣＦＳＥ－ＭＬＲ）およびフローサイトメトリーを使用する増殖性細胞の決定が挙げられる。用いることができるアッセイの別の例は、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる分泌されたサイトカインの検出である。
【0110】
対象における免疫細胞によるサイトカイン分泌（例えば、移植片に応答して）は、いずれかのバルクのサイトカイン産生を測定すること（ＥＬＩＳＡによる）、または免疫細胞を産生する個々のサイトカインを数え上げること（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる）によって検出されてもよい。マクロファージ活性化は、例えば、好中球、未成熟樹状細胞、ナチュラルキラー細胞および活性化Ｔ細胞のための化学誘引物質として放出される、ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８、ＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０、ＭＩＰ－１アルファ／ＣＣＬ３、ＭＩＰ－１ベータ／ＣＣＬ４およびＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５などのケモカインのレベルを測定することによって、決定することができる。ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－６およびＴＮＦ－アルファを含む炎症促進性サイトカインのレベルが放出され、またはＩＬ－１０、ＴＧＦ－βを含む抗炎症性サイトカインは、当技術分野において周知のアッセイによって測定することもできる。
【0111】
本明細書において、移植片またはグラフトに対する免疫寛容を誘導するための組成物、方法およびシステムが提供される。本明細書に開示の組成物、方法およびシステムは、寛容化ワクチン、または寛容化ワクチンを含む前処置レジメンを含むことができる。
【0112】
移植の利益は、生じた慢性的な免疫抑制の感染、代謝および悪性の負荷によって一般に減少する。慢性的な移植片拒絶反応は、長期の移植の成功を達成する上での課題のままであるが、しかしながら、長期免疫抑制（例えば、１種または複数の免疫調節分子）の使用は、感染症および薬物毒性などの重大なリスクに関連し得る。本開示の組成物および方法は、長期免疫抑制を回避しながら、移植片に対する長期寛容を呼び起こすことができる。安定的なドナー特異的免疫寛容の誘導は、維持免疫抑制のための必要性を取り除くことができる。移植片寛容の誘導は、移植の結果を改善することができる。
【0113】
自己免疫およびアレルギーに対する抗原特異的で安定的な寛容の誘導は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）で架橋された抗原の、白血球または間葉間質細胞などの同系アポトーシス細胞の表面へのＩＶ送達を介して確立することができる。同種移植モデルでは、－７日目および＋１日目でのＥＣＤＩ処置ＡＤＬ（アポトーシス性ドナー白血球）の移植前後のＩＶ注入は、マイナーな抗原不適合皮膚グラフト、完全なＭＨＣ不適合の膵島同種グラフトに対して、および短期のｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、シロリムス、エベロリムス）と組み合わせた場合に心臓同種グラフトに対しても、効果的かつ安全に、長続きする寛容を誘導することができる。ＥＣＤＩ固定アポトーシス性ドナー脾細胞のＩＶ注入は、膵島および心臓同種グラフトなどの移植片に対するドナー特異的寛容を誘導することが公知である。ドナーのＥＣＤＩ固定脾細胞は、ＩＶ注入後、迅速なアポトーシスを受け得、アポトーシス小体の取り込み後に、成熟が停止し、負の共刺激分子を選択的に上方調節するが、正の共刺激分子を上方調節しない、脾臓の樹状細胞（ＤＣ）によって急速に内部移行され得る。このようなレシピエントＤＣに遭遇すると、間接的な同種特異性を有するＴ細胞は、迅速に増幅され、続いて著明なクローン収縮を起こし、残りのＴ細胞は、グラフトまたはグラフト流入領域リンパ節への輸送なく、脾臓に隔離される。宿主食細胞によって内部移行されないドナーのＥＣＤＩ固定脾細胞は、直接的な同種特異性を有するＴ細胞を弱く活性化し、それらをその後の刺激に対して耐性にする（アネルギー）ことができる。ＥＣＤＩ固定脾細胞は、Ｔｒｅｇおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を誘導／増やすこともできる。したがって、これらのモデルにおけるグラフト保護のメカニズムは、Ｔ細胞の直接的および間接的な特異性の、欠失、アネルギーおよび調節を含み得る。この抗原特異的寛容戦略は、ナイーブＴ細胞のプライミングを防止することも、既存のメモリー／エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を効果的に制御することもできる。
【0114】
同種グラフトに対する強い寛容は、ネガティブワクチン戦略を用いることによって、激烈な前処置療法に関連する同じドナーの骨髄または造血幹細胞移植の必要なく、達成することができる。例示的なプロトコールは、０日目の同じドナーの膵島同種移植、続いて例えば＋１日目の第２の用量のＡＤＬに対して、例えば－７日目に、予定レシピエントの静止免疫系に先制する第１の用量のＥＣＤＩ固定ＡＤＬを投与することを含むことができる。寛容は、非感作レシピエントにおいて、達成、および例えば、≧１年間維持することができる。短期免疫抑制に追加されたＡＤＬ注入は、著明な方法で、宿主の同種抗原特異的エフェクターおよび調節性免疫も変化させる。
【0115】
１つの例示的な実施形態では、本開示の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、アポトーシス性ドナー白血球をレシピエントに投与すること、および（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｉｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｉｖ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤のいずれか１つまたは複数を含む短期免疫抑制を含むことができる。これらの薬剤と本明細書に開示のアポトーシス性ドナー白血球と一緒の短期投与は、長期維持免疫抑制をレシピエントに投与していないにもかかわらず、移植された細胞、臓器または組織に対する長期寛容を促進することができる。
【0116】
１つの例示的な実施形態では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤、抗インターロイキン６受容体剤および抗ＣＤ４０剤を投与することを含む。これらの薬剤と本明細書に開示のアポトーシス性ドナー白血球と一緒の短期投与は、長期維持免疫抑制をレシピエントに投与していないにもかかわらず、移植された細胞、臓器または組織に対する長期寛容を促進することができる。
【0117】
１つの例示的な実施形態では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤、可溶性抗腫瘍壊死因子受容体、抗インターロイキン６受容体抗体およびアンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む。これらの薬剤と本明細書に開示のアポトーシス性ドナー白血球と一緒の短期投与は、長期維持免疫抑制をレシピエントに投与していないにもかかわらず、移植された細胞、臓器または組織に対する長期寛容を促進することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏの白血球の増幅
ｅｘ ｖｉｖｏの白血球の増幅
【0118】
本開示の寛容誘導戦略を生体ドナー同種移植（例えば、腎臓または膵島同種移植）の臨床の場へと移行させるために、臨床的に適用可能な白血球の供給源、例えば、ドナー白血球または幹細胞由来／分化白血球は、例えば、短期免疫抑制レシピエントにおいて、予定同種グラフトに対するドナー特異的寛容を誘導するのに効果的であると特定することができる。ドナー白血球の供給源として生体ドナーの脾臓を回収することで、感染症を阻止するドナーの能力を損なうことがあり、したがって、ドナー白血球の代替供給源のほうが好ましいことがある。例えば、Ｂリンパ球は、１つもしくは複数の採血および／もしくはアフェレーシス手順でドナーから採取することができ、必要に応じてｅｘ ｖｉｖｏで増やされるか、または移植ドナーと適切に適合もしくは部分的に適合する別個の細胞ドナーを特定することができる。
【0119】
一部の場合では、別個のドナーは、寛容原性白血球および同種グラフトのために使用することができる。例えば、予定生体移植ドナーと、完全に適合または部分的に適合する（例えば、ハプロタイプ一致）死体ドナー由来の脾細胞は、寛容原性白血球の臨床的に実行可能な供給源である。適合、部分的に適合またはハプロタイプ一致の脾臓が利用可能になると、寛容化プロトコールは、例えば－７日目に脾細胞の注入で開始して、続いて、例えば０日目に生体ドナー移植（例えば、腎臓移植）、および例えば＋１日目にｅｘ ｖｉｖｏで増やされた脾臓Ｂ細胞の注入を行うことができる。生体ドナーと１つのＭＨＣクラスＩおよびＩＩハプロタイプを共有する死体ドナーから調製された脾細胞および／または増やされた脾臓Ｂ細胞の移植前後の注入によって可能になる寛容誘導は、連鎖抑制に依存し得る。これらの自己抗原に対する特異性を有する調節性細胞は、共有ハプロタイプを有するＡＤＬの注入によって活性化および増やすことができ、これらが、同じ宿主の抗原提示Ｔ細胞において共有抗原と一緒に提示される、連鎖抑制と称される現象のために、不適合の生体ドナーの抗原を対象にする拒絶反応を抑制するそれらの影響を延長することができる。
【0120】
ヒト同種移植レシピエントにおける使用のために、例えば、－７日目にワクチンを死体ドナーの脾臓から調製し、同じ日に予定膵島移植レシピエントに注入することができる。これは、単離された膵島は、例えば、移植前の７日間、培養で保つことができるので、膵島移植の状況において可能である。＋１日目のワクチンは、死体ドナーの脾臓のアリコートに由来する、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされたＢ細胞に基づき得る。腎臓、新生仔ブタ膵島または複合腎臓－膵島異種グラフトのいずれかのブタとヒトの異種移植における使用のために、アポトーシス性ドナー白血球は、十分な数でまたはクローンのブタドナーから利用可能である場合、グラフトドナー由来であり得、必要によりｅｘ ｖｉｖｏで増やすことができる。
【0121】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの調製において使用される細胞（例えば、白血球）は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やすことができる。一部の場合では、白血球細胞は、寛容化ワクチンとしての使用の前に所定の期間、１種または複数の試薬の存在下でｉｎ
ｖｉｔｒｏで増やすことができる。例えば、細胞は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、３９０または３００時間、少なくとも１種のサイトカインと接触させることができる。一部の場合では、細胞は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間、またはそれよりも長く、少なくとも１種のサイトカインと接触させることができる。一部の場合では、細胞は、約１～２、２～３、３～４、１～４、１～３または２～４週間、少なくとも１種のサイトカインと接触させることができる。一部の場合では、サイトカインは、１種または複数のインターロイキンである。一部の場合では、インターロイキン（ＩＬ）は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦ、マルチマーＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５のうちの少なくとも１つである。一部の場合では、細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびマルチマーＣＤ４０Ｌと接触される。
ｖｉｔｒｏで増やすことができる。例えば、細胞は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、３９０または３００時間、少なくとも１種のサイトカインと接触させることができる。一部の場合では、細胞は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間、またはそれよりも長く、少なくとも１種のサイトカインと接触させることができる。一部の場合では、細胞は、約１～２、２～３、３～４、１～４、１～３または２～４週間、少なくとも１種のサイトカインと接触させることができる。一部の場合では、サイトカインは、１種または複数のインターロイキンである。一部の場合では、インターロイキン（ＩＬ）は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦ、マルチマーＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５のうちの少なくとも１つである。一部の場合では、細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびマルチマーＣＤ４０Ｌと接触される。
【0122】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンにおいて使用される白血球は、少なくとも、または少なくとも約１０％、例えば、２５％のＣＤ１９陽性、ＣＤ２０陽性またはＣＤ２１陽性のＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含むことができる。例えば、ドナー脾細胞は、少なくとも、または少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％、例えば、約、少なくとも、または少なくとも約１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％または６０～７０％のＣＤ１９、ＣＤ２０および／またはＣＤ２１陽性のＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含むことができる。一部の場合では、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンにおいて使用される脾臓のＢ細胞または白血球は、少なくとも、または少なくとも約６０％、例えば、９０％のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２１陽性のＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含むことができる。例えば、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンにおいて使用される脾臓のＢ細胞または白血球は、約、少なくとも、または少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、例えば、少なくとも、または少なくとも約６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％または９０～９５％のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２１陽性のＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含むことができる。一部の場合では、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンにおいて使用されるドナーの脾細胞または白血球は、５０％～１００％または約５０％～１００％、例えば、６０％～１００％もしくは約６０％～１００％、または８０％～１００％もしくは約８０％～１００％のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２１陽性のＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含むことができる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩは、ブタ白血球抗原（ＳＬＡ）クラスＩＩである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩである。
【0123】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、生体ドナー由来の細胞を含む。例えば、細胞は、末梢血白血球（例えば、末梢血Ｂ細胞）であり得る。末梢血白血球は、１つもしくは複数の採血、アフェレーシス、または任意の他の方法によって得ることができる。末梢血白血球は、Ｂ細胞について富化され得る。末梢血白血球は、直接使用することができ、またはｅｘ ｖｉｖｏで増やすことができる。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、直接単離された白血球、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球、またはそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、寛容化ワクチンの初期用量は、直接単離された末梢血白血球（例えば、Ｂ細胞）を含み得るが、その後の用量は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた末梢血白血球（例えば、Ｂ細胞）を含むことができる。
【0124】
一部の場合では、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンは、死体ドナー由来の細胞を含む。死体ドナーは、脳死の心臓が鼓動しているドナー（ＢＤＤ）であり得る。あるいは、死体ドナーは、心停止ドナー（ＮＨＢＤ）であり得る。ドナーは、任意の動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物由来であり得る。例えば、細胞は、脾臓（例えば、脾細胞、脾臓Ｂ細胞）、肝臓、末梢血（末梢血Ｂ細胞を含む）、リンパ節、胸腺、骨髄、またはそれらの任意の組合せから得られた死体の白血球であり得る。一部の場合では、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンは、脾臓白血球（例えば、脾臓Ｂ細胞）、末梢血白血球（例えば、末梢血Ｂ細胞）、またはそれらの組合せを含む。白血球は、直接使用することができ、またはｅｘ ｖｉｖｏで増やすことができる。一部の場合では、寛容化ワクチンの初期用量は、直接単離された末梢血白血球（例えば、末梢血Ｂ細胞）、脾臓白血球（例えば、脾臓Ｂ細胞）、またはそれらの組合せを含み得るが、その後の用量は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた末梢血白血球（例えば、末梢血Ｂ細胞）、脾臓白血球（例えば、脾臓Ｂ細胞）、またはそれらの組合せを含むことができる。
【0125】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの調製のための細胞は、幹細胞、または幹細胞から生成する分化細胞型（例えば、白血球）であり得る。幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞または誘導幹細胞であり得る。幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞または複能性幹細胞であり得る。一部の場合では、幹細胞は、完全に発達した動物（例えば、ヒト動物）に発達することはできない。一部の場合では、幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の場合では、幹細胞は、動員剤、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、モゾビルまたはそれらの組合せにより骨髄から末梢血に幹細胞を動員することによって得ることができる。
【0126】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製において使用される細胞のドナーは、移植ドナー（例えば、移植のために使用される細胞、組織または臓器のドナー）と完全または部分的にＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）適合であり得る。一部の場合では、部分的に適合したドナーは、移植ドナーとハプロタイプ一致である。一部の場合では、部分的に適合したドナーは、移植ドナーと１つまたは複数のＭＨＣ対立遺伝子を共有する。例えば、部分的に適合したドナーは、移植ドナーと、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子、またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数を共有することができる。一部の場合では、１つまたは複数の共有されたＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。部分的に適合したドナーは、移植ドナーと１つのＤＲ対立遺伝子を共有することができる。
【0127】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製において使用される細胞の部分的に適合したドナーは、移植ドナーと、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）、および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ）対立遺伝子を共有し得る。一部の場合では、１つまたは複数の共有されたＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製において使用される細胞の部分的に適合したドナーは、移植ドナーと、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）、および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）、ならびに移植レシピエントと、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得、ここで、移植ドナーおよび移植レシピエントと共有されたＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、同じＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子である。一部の場合では、１つまたは複数の共有されたＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
【0128】
一部の場合では、細胞のドナーは、移植ドナーまたは移植レシピエントと、部分的または完全にＭＨＣ不適合であり得る。例えば、一部の場合では、移植ドナーおよび／または移植レシピエントと適合するＭＨＣ分子に由来するペプチドは、本明細書に開示のｅｘ ｖｉｖｏで増やされたドナー細胞とコンジュゲートされ得る。
寛容化ワクチン／レジメン
寛容化ワクチン／レジメン
【0129】
伝統的に、ワクチンは、宿主において特定の疾患に対する活性な獲得免疫を提供する生物学的調製物である。伝統的なワクチンは、疾患を引き起こす病原体と似ている薬剤を含有し得、病原体、その毒素またはその表面タンパク質の１つの減弱形態または死滅形態から作製され得る。薬剤は、宿主の免疫系を刺激して、脅威として薬剤を認識し、それを破壊し、将来遭遇し得るその薬剤に関連するいずれかの病原体をさらに認識および破壊する。例えば、皮下に不活化ウイルスをアジュバントとともに注射することで、そのウイルスの活性および／または病原性のあるバージョンに対する一時的または永久的な免疫をもたらし得る。これは、正のワクチンと称され得る（図１）。
【0130】
しかしながら、静脈内に注射もしくは注入された不活性化細胞またはアポトーシス細胞は、同様の細胞マーカーまたは抗原を有する細胞（例えば、移植されたドナー細胞）に対する免疫寛容をもたらし得る。これは、寛容化ワクチンと称され得る（負のワクチンとも称される）（図１）。一部の実施形態では、不活性化細胞またはアポトーシス細胞は、アジュバントまたは追加薬剤（例えば、１種または複数の免疫調節分子）なしで注射または注入され得る。一部の実施形態では、不活性細胞またはアポトーシス細胞は、追加薬剤（例えば、１種または複数の免疫調節分子）とともに注射され得る。一部の場合では、追加薬剤は、抗原提示細胞の活性化および／または成熟を阻害することによって、寛容化ワクチンの寛容原性を増強する。
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンのための細胞の供給源
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンのための細胞の供給源
【0131】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製のための細胞は、動物、細胞系および／または実験室で生成された細胞を含む任意の供給源から得ることができる。例えば、細胞は、ヒトまたは非ヒト動物から得ることができる。別の例では、細胞は、細胞系（例えば、ヒトまたは非ヒト細胞系）由来であり得る。一部の場合では、細胞は、ヒト細胞である。他の場合では、細胞は、非ヒト細胞である。一部の場合では、細胞は、非ヒト霊長類の細胞である。一部の場合では、細胞は、Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ上目のメンバーの細胞である。一部の場合では、細胞は、有蹄動物、例えば、ラクダ類またはブタの細胞である。一部の場合では、細胞は、ブタの細胞である。一部の場合では、細胞は、移植ドナーと同じ種由来である。一部の場合では、細胞は、移植レシピエントと同じ種由来である。一部の場合では、細胞は、移植ドナーおよび移植レシピエントと同じ種由来である。一部の場合では、細胞は、移植ドナーと異なる種由来である。一部の場合では、細胞は、移植レシピエントと異なる種由来である。一部の場合では、細胞は、移植ドナーおよび移植レシピエントと異なる種由来である。
【0132】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製のための細胞は、生体ドナーまたは死体ドナーから得ることができる。一部の場合では、ドナーは、生体ドナーである。一部の場合では、ドナーは、死体ドナーである。死体ドナーは、例えば、脳死の心臓が鼓動しているドナー（ＢＤＤ）であり得る。死体ドナーは、例えば、心停止ドナー（ＮＨＢＤ）であり得る。ドナーが、生体ドナーまたは死体ドナー（例えば、ＢＤＤまたはＮＨＢＤ）であるかに関わらず、ドナーは、任意の動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物由来であり得る。一部の場合では、寛容化ワクチンの調製のための細胞は、グラフトまたは移植片と同じドナー由来であり得る。一部の場合では、寛容化ワクチンの調製のための細胞は、グラフトまたは移植片と異なるドナー由来であり得る。
【0133】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製のための細胞は、任意の年齢または発育段階のドナー動物から得ることができる。例えば、ドナー動物は、胎児、周産期、新生児、離乳前、離乳後、子供、若年成体または成体の動物であり得る。一部の場合では、非ヒト動物は、離乳年齢を過ぎていることができる。例えば、ドナー動物は、少なくとも、または少なくとも約６か月齢であり得る。一部の場合では、ドナー動物は、少なくとも、または少なくとも約１８か月齢であり得る。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製のための細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞および／または間葉系幹細胞）から得ることができる（例えば、分化することができる）。
【0134】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される細胞は、組織、臓器または体液由来の１種または複数の細胞を含み得る。例えば、細胞は、限定されるものではないが、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、眼、網膜、生殖器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄、もしくは尿管、子宮、卵巣、精巣、血液、髄液、リンパ液、またはそれらの組合せを含む、組織、臓器または体液由来であり得る。
【0135】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される細胞は、１つまたは複数の種類の細胞を含み得る。例えば、細胞としては、限定されるものではないが、トリコサイト、ケラチノサイト、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、クロム親和性細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜実質細胞、網膜ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞）、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えば、Ｉ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、小襞細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば、中胚葉由来のクッパー細胞）、胆嚢細胞、腺房中心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えば、ＰＰ細胞）、膵臓ε細胞、甲状腺（例えば、濾胞細胞）、副甲状腺（例えば、副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋衛星細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハール介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば、糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞、間細胞、テロサイト、単純上皮細胞、有足細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ｐｅｇ細胞、胚細胞、精子、卵子、リンパ球、骨髄性細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、メソ血管芽細胞、周皮細胞、壁細胞、間葉間質細胞、または脾細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、マイクロファージ、白血球）が挙げられ得る。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される細胞は、ＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞型を含む。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される細胞は、ＭＨＣクラスＩＩを発現しない細胞型を含む。
【0136】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、白血球を含むことができる。白血球としては、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、またはそれらの組合せが挙げられ得る。リンパ球としては、例えば、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはそれらの組合せが挙げられ得る。
【0137】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける白血球は、例えば、ドナー、細胞系または分化幹細胞を含む、任意の供給源から得ることができる。ドナーから得られる白血球としては、脾臓（例えば、脾細胞、脾臓Ｂ細胞）、肝臓、末梢血（末梢血Ｂ細胞を含む）、リンパ節、胸腺、骨髄、または任意の他の臓器、組織もしくは体液、あるいはそれらの任意の組合せから得られる白血球が挙げられ得る。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、脾臓Ｂ細胞、末梢血Ｂ細胞、またはそれらの組合せを含む。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、動員剤により骨髄から末梢血に動員された細胞、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、モゾビルまたはそれらの組合せにより動員された細胞を含む。ドナーから得られる寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける白血球は、初代細胞、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた細胞、またはそれらの組合せを含むことができる。
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための遺伝子改変細胞
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための遺伝子改変細胞
【0138】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの調製において使用される細胞のドナーは、遺伝子改変することができる。あるいは、または加えて、ドナーから得られる細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変することができる。一部の場合では、細胞系を、遺伝子改変して、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける使用のための細胞を産生する。遺伝子改変されたドナーおよび／または細胞は、本明細書に記載の方法を含む当技術分野において公知の任意の方法を使用して、生成することができる。遺伝子改変細胞が、遺伝子改変動物から単離されるか、培養で産生されるか、またはそれらの組合せであるかにかかわらず、遺伝子改変細胞は、ヒトおよび非ヒト動物を含む任意の動物種の遺伝子改変細胞であり得る。
【0139】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおいて使用される遺伝子改変細胞は、発現または遺伝子もしくは遺伝子産物（例えば、タンパク質）を低減または排除する、１つまたは複数の遺伝子改変を含むことができる。遺伝子改変は、その発現が低減または排除される遺伝子への改変であり得る。このような遺伝子は、破壊遺伝子と称され得る。遺伝子改変はまた、その発現が低減または排除される遺伝子とは別個のゲノムの領域に向けてであり得る（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写因子などへの改変）。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおいて使用される遺伝子改変細胞は、その発現が遺伝子改変によって低減または排除される、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０、またはそれよりも多くの遺伝子を含むことができる。
【0140】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおいて使用される細胞における遺伝子改変によって発現が低減または排除され得る遺伝子の非限定的な例としては、限定されるものではないが、アルファ１，３ガラクトース転移酵素（ＧＧＴＡ１）；推定上のシチジンモノホスファターゼ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）；β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）；主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ特異的エンハンセオソームの構成成分（例えば、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５））；ＭＨＣ Ｉ－結合ペプチドのトランスポーター（例えば、抗原プロセシングに関連するトランスポーター１（ＴＡＰ１））；補体成分３（Ｃ３）；ＣＸＣケモカイン受容体３リガンド（ＣＸＣＬ３）；ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子；ＭＨＣ ＩＩトランス活性化因子（ＭＨＣＩＩＴＡ）；ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）遺伝子；ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）遺伝子；ナチュラルキラー（ＮＫ）グループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）；腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ－Ｒ）；ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）；Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【0141】
一部の場合では、寛容化ワクチンにおいて使用される遺伝子改変細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、またはそれらの任意の組合せを含む１つまたは複数の遺伝子中に破壊を含むことができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される遺伝子改変細胞は、ＧＧＴＡ１のみが破壊されている可能性があり、またはＣＭＡＨのみが破壊されている可能性があり、またはＢ４ＧＡＬＮＴ２、Ｂ２ＭもしくはＮＬＲＣ５のみが破壊されている可能性がある。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される遺伝子改変細胞はまた、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨが破壊されている可能性があり、ＧＧＴＡ１およびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されている可能性があり、またはＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されている可能性があり、またはＮＬＲＣ５およびＢ２Ｍが破壊されている可能性がある。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを作製するために使用される遺伝子改変細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されている可能性がある。任意の特定の理論に縛られることを望まないが、このような破壊は、臓器、組織、細胞および細胞系グラフト（例えば、寛容化ワクチンにおいて使用される細胞と同じ遺伝子改変を含む異種グラフトまたは同種グラフト）に対する、細胞媒介免疫、抗体媒介免疫、抗体依存性細胞媒介免疫および／または細胞依存性抗体媒介免疫を最小化または排除することができる。
【0142】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおいて使用される遺伝子改変細胞は、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させる１つまたは複数の遺伝子改変を含むことができ、またはさらに含むことができる。増加した発現は、ゼロ発現からであり得、例えば、増加した発現は、遺伝子改変なしの細胞中で正常に発現しない遺伝子または遺伝子産物の発現であり得る。増加した発現は、閾値レベル、例えば、遺伝子改変なしの細胞中で正常に発現するレベルと比較することができる。遺伝子改変は、ポリペプチド（例えば、内因性または外因性ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含むことができる。
【0143】
外因性ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＭＨＣ
Ｉ形成サプレッサー（例えば、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７））；補体活性化の調節因子（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９）；ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド；Ｂ７ファミリーメンバー（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２などのプログラム死リガンド）；セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｓｐｉ９）；ガレクチン；インターロイキン（例えば、ＩＬ－３７）；ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ遮断剤（例えば、ＣＤ４０アンタゴニストポリペプチド、抗ＣＤ４０リガンドポリペプチド）；Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）；それらの任意の機能的断片；またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞のための阻害性リガンドは、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、またはそれらの任意の組合せなどのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、ＨＬＡ－Ｇ７、またはそれらの任意の組合せである。一部の場合では、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４またはガレクチン－１５である。例えば、ガレクチンは、ガレクチン－９であり得る。
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞の発生
Ｉ形成サプレッサー（例えば、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７））；補体活性化の調節因子（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９）；ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド；Ｂ７ファミリーメンバー（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２などのプログラム死リガンド）；セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｓｐｉ９）；ガレクチン；インターロイキン（例えば、ＩＬ－３７）；ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ遮断剤（例えば、ＣＤ４０アンタゴニストポリペプチド、抗ＣＤ４０リガンドポリペプチド）；Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）；それらの任意の機能的断片；またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞のための阻害性リガンドは、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、またはそれらの任意の組合せなどのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、ＨＬＡ－Ｇ７、またはそれらの任意の組合せである。一部の場合では、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４またはガレクチン－１５である。例えば、ガレクチンは、ガレクチン－９であり得る。
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞の発生
【0144】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、アポトーシス細胞、非アポトーシス細胞、またはそれらの組合せを含むことができる。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、非アポトーシス細胞を含む。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、アポトーシス細胞および非アポトーシス細胞の両方を含む。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、アポトーシス細胞を含む。
【0145】
「アネルギー」という用語は、特定の抗原に対する正常な免疫応答の非存在下（例えば、炎症促進性応答の非存在下）を指し得る。「Ｔ細胞アネルギー」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が、抗原遭遇後に本質的に機能的に不活性化されるが、反応性低下状態で長期間生存したままである、寛容メカニズムを指し得る。本開示は、任意の特定のメカニズムに限定されない。理論によって縛られないが、アポトーシス細胞は、宿主抗原提示細胞によって捕捉され（例えば、脾臓において）、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるアネルギーの誘導をもたらす非免疫原性様式で宿主免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に提示され得る。例えば、寛容化ワクチンにおけるアポトーシス細胞（例えば、ＥＣＤＩ処理脾細胞、白血球または間葉間質細胞、これらは細胞表面に固定され、多くの表面分子を不活性化することができる）は、抗原特異的正常Ｔ細胞クローンの活性化および／または増殖を刺激することができない。理論に縛られることを望まないが、寛容化ワクチンにおけるアポトーシス細胞は、Ｔ細胞に共刺激シグナルを提供することができない。結果として、アポトーシス細胞は、アネルギーと称される長期無応答の状態を誘導することができる。一部の実施形態では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの注入によって誘導される寛容は、無傷プログラム死１受容体－プログラム死リガンド１シグナル伝達経路およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の間の相乗効果に依存し得る。
【0146】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、いくつかの異なる方法でアポトーシスを起こすことができる。例えば、細胞を、化学物質（例えば、固定剤または架橋剤、細胞損傷剤、またはそれらの組合せ）と接触させて、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。別の例では、細胞に、照射（例えば、紫外線照射、ガンマ線照射など）を行って、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。
【0147】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、固定剤または架橋剤などの化学物質と接触させることができる。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。適切な固定剤または架橋剤としては、限定されるものではないが、アミン－アミンクロスリンカー、スルフヒドリル－スルフヒドリルクロスリンカー、アミン－スルフヒドリルクロスリンカー、ｉｎ ｖｉｖｏクロスリンカー、スルフヒドリル－炭水化物クロスリンカー、光反応性クロスリンカー、化学選択的ライゲーション架橋剤、カルボキシル－アミンクロスリンカー、カルボジイミド、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せが挙げられる。
【0148】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、カルボジイミドまたはカルボジイミド誘導体と接触させることができる。カルボジイミドでの処理は、遊離アミンおよびカルボキシル基を化学的に架橋することができ、細胞、臓器および／または組織においてアポトーシスを効果的に誘導することができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。カルボジイミドは、エチルカルボジイミド、エチレンカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣＩ、ＥＤＣ、ＥＣＤＩまたはＥＤＡＣ）、またはそれらの組合せを含み得る。一部の場合では、カルボジイミドは、エチルカルボジイミドを含む。一部の場合では、カルボジイミドは、エチレンカルボジイミドを含む。一部の場合では、カルボジイミドは、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含む。一部の場合では、カルボジイミドは、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を含む。一部の場合では、カルボジイミドは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣＩ、ＥＤＣ、ＥＣＤＩまたはＥＤＡＣ）を含む。一部の場合では、寛容化ワクチンは、ＥＤＣＩ誘導体および／または官能化ＥＤＣＩで処理された細胞を含む。
【0149】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、ジイミドエステルと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。ジイミドエステルは、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）もしくはジエチルジカーボネート、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含み得る。
【0150】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、アミン－アミンクロスリンカーと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。一部の場合では、アミン－アミンクロスリンカーは、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３）、トリス－（スクシンイミジル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、ＢＳ（ＰＥＧ）５、ＢＳ（ＰＥＧ）９、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）、３，３’－ジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（ＤＴＳＳＰ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、ビス（２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（コハク酸スクシンイミジル）（ＥＧＳ）、スルホ－ＥＧＳ、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の場合では、アミン－アミンクロスリンカーは、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、ピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）、スベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ）、ジメチル３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、またはそれらの任意の組合せなどのイミドエステルを含む。一部の場合では、アミン－アミンクロスリンカーは、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）などのジフルオロを含む。
【0151】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、スルフヒドリル－スルフヒドリルクロスリンカーと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。一部の場合では、スルフヒドリル－スルフヒドリルクロスリンカーは、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、１，４－ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、トリス（２－マレイミドエチル）アミン（ＴＭＥＡ）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８－ビスマレイミド－ジエチレングリコールなど）；ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１－ビスマレイミド－トリエチレングリコールなど）、ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、またはそれらの任意の組合せなどのマレイミドを含む。
【0152】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、アミン－スルフヒドリルクロスリンカーと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。一部の場合では、アミン－スルフヒドリルクロスリンカーは、ＮＨＳ－ハロアセチルクロスリンカー、ＮＨＳ－マレイミド、ＮＨＳ－ピリジルジチオールクロスリンカー、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スルホスクシンイミジル（ＳＭＣＣ）クロスリンカー、またはそれらの任意の組合せを含む。ＮＨＳ－ハロアセチルクロスリンカーは、ヨード酢酸スクシンイミジル（ＳＩＡ）、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＢＡＰ）、（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸スクシンイミジル（ＳＩＡＢ）、スルホ－ＳＩＡＢ、またはそれらの組合せを含み得る。ＮＨＳ－マレイミドは、Ｎ－α－マレイミドアセト－オキシスクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、Ｎ－β－マレイミドプロピル－オキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スルホ－ＧＭＢＳ、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ－ＭＢＳ、ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＣＣ、Ｎ－ε－マレイミドカプロイル－オキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、スルホ－ＥＭＣＳ、４－（ｐ－マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）、スルホ－ＳＭＰＢ、６－（（ベータ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸）スクシンイミジル（ＳＭＰＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロン酸）スルホスクシンイミジル（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－κ－マレイミドウンデカノイル－オキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＫＭＵＳ）、またはそれらの組合せを含み得る。ＮＨＳ－ピリジルジチオールクロスリンカーは、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、６－（３（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサン酸スクシンイミジル（ＬＣ－ＳＰＤＰ）、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ、または４－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－α（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｔｏｌｕｎｅ）（ＳＭＰＴ）を含み得る。
【0153】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、スルフヒドリル－炭水化物クロスリンカーと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。一部の場合では、スルフヒドリル－炭水化物クロスリンカーは、（Ｎ－β－マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、Ｎ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジド（ＫＭＵＨ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、またはそれらの任意の組合せを含む。
【0154】
一部の場合では、カルボキシル－アミンクロスリンカーは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣＩ、ＥＤＣまたはＥＤＡＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ－ＮＨＳ、またはそれらの任意の組合せである。
【0155】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、光反応性クロスリンカーと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。一部の場合では、光反応性クロスリンカーは、ＮＨＳエステル／アリールアジド、ＮＨＳエステル／ジアジリン、またはそれらの組合せを含む。ＮＨＳエステル／アリールアジドは、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯＳ）、スルホ－ＳＡＮＰＡＨ、またはそれらの組合せを含み得る。ＮＨＳエステル／ジアジリンは、ＳＤＡ（ＮＨＳ－ジアジリン／４，４’－アジペンタン酸スクシンイミジル）、スルホ－ＳＤＡ、ＬＣ－ＳＤＡ（ＮＨＳ－ＬＣ－ジアジリン／６－（４，４’－アジペンタンアミド）ヘキサン酸スクシンイミジル）、スルホ－ＬＣ－ＳＤＡ、ＳＤＡＤ（ＮＨＳ－ＳＳ－ジアジリン／２－（（４，４’－アジペンタンアミド）エチル）１，３’－ジチオプロピオン酸スクシンイミジル）、スルホ－ＳＤＡＤ、またはそれらの組合せを含み得る。
【0156】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏクロスリンカーと接触させることができる。接触は、所定の時間の間であり得る。接触は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こすことができる。ｉｎ ｖｉｖｏクロスリンカーは、ＢＳ３、ＤＴＳＳＰ、スルホ－ＥＧＳ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＥＧＳ、スルホ－ＳＤＡ、スルホ－ＬＣ－ＳＤＡ、スルホ－ＳＤＡＤ、ＳＤＡ、ＬＣ－ＳＤＡ、ＳＤＡＤ、ＮＨＳ－エステルジアジリン、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【0157】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける使用のための細胞は、細胞損傷剤またはアポトーシス誘導因子で処理される。一部の場合では、細胞損傷剤は、接触させた細胞の一部またはすべてにおいてアポトーシスを誘導する。非限定的な例示の細胞損傷剤としては、ドキソルビシン、スタウロスポリン、エトポシド、カンプトテシン（ｃｏｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、パクリタキセル、ビンブラスチン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。非限定的な例示のアポトーシス誘導因子としては、マリノピロールＡ、マリトクラックス、（Ｅ）－３，４，５，４’－テトラメトキシスチルベン、１７－（アリルアミノ）－１７－デメトキシゲルダナマイシン、２，４，３’，５’－テトラメトキシスチルベン、２ＯＨＯＡ、６，８－ビス（ベンジルチオ）－オクタン酸、ＡＴ１０１、アポトリジン、ＦＵ ４０Ａ、ａｒａ－Ｇ水和物、アリールキン（ａｒｙｌｑｕｉｎ）１、ＢＡＤ、ＢＡＭ７、ＢＡＸ活性化因子分子７、ＢＨ３Ｉ－１、ＢＩＤ、ＢＭＳ－９０６０２４、ＢＶ０２、ベンダムスチン、ボレリジン（ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）、ボレリジン（ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎｅ）、シクロペンタンカルボン酸、ＮＳＣ ２１６１２８、トレポネマイシン、ブラシニン（ｂｒａｓｓｉｎｉｎ）、ブラシニン（ｂｒａｓｓｉｎｉｎｅ）、ブレフェルジンＡ、アスコトキシン、ＢＦＡ、シアネイン、デクンビン、ブファリン、ＣＣＦ６４２、ＣＣＴ００７０９３、ＣＤ４３７、ＣＨＭ－１水和物、２－（２－フルオロフェニル）－６，７－メチレンジオキシ－２－４－キノロン水和物、ＮＳＣ ６５６１５８、ＣＩＬ－１０２、ＣＰ－３１３９８、二塩酸塩水和物、カマレキシン（ｃａｍａｌｅｘｉｎ）、３－（チアゾール－２－イル）－１Ｈ－インドール、カマレキシン（ｃａｍａｌｅｘｉｎｅ）、カルボキシアトラクチロシド、セファランチン、セファランチン、シンナバリン酸、シルシリオール、コンブレタスタチンＡ４、コスツノリド、ＤＢｅＱ、ＤＩＭ－Ｃ－ｐＰｈｔＢｕ、ＤＭＸＡＡ、ＤＰＢＱ、エンニアチンＡ１、エンニアチンＡ、エンニアチンＢ１、エンニアチンＢ、エラスチン、オイパトリン、ＦＡＤＤ、プロピオン酸フルチカゾン、フォスブレタブリン二ナトリウム、ＧＯ－２０１トリフルオロ酢酸塩、ガンボギン酸、ＨＡ １４－１、ＨＭＢＡ、ヘキサアミノレブリネート（ＨＡＬ）、ＩＭＢ５０４６、ＩＭＳ２１８６、イカルガマイシン、イミキモド、イニパリブ、クラリノン、ＬＬＰ－３、リポカリン－２、ロメトレキソール、ＭＩ－４Ｆ、ＭＬ ２１０、ＭＬ２９１、モルギン、ムリステロンＡ、ＮＡ－１７、ＮＩＤ－１、ＮＰＣ２６、ＮＳＣ５９９８４、Ｎａｐ－ＦＦ、ネオカルチノスタチン、ニフェテピミン、ニチジンクロリド、ヌトリン－３、ヌトリン－３ａ、ＰＫＦ１１８－３１０、ＰＲＩＭＡ－１、ＰＲＴ４１６５、ペメトレキセド、ペンタ－Ｏ－ガロイル－β－Ｄ－グルコース水和物、フェノキソジオール、プロジギオシン（ＰＧ）、プソラリジン、プテロスチルベン、ラルチトレキセド、ラプチナール、リダイフェン－Ｂ、リファブチン、ロスリン２、ｓ－ｐ－ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステル、ＳＪ－１７２５５、ＳＭＢＡ１、ＳＴＦ－６２２４７、スプラフェナシン（ｓｕｐｒａｆｅｎａｃｉｎｅ）、シロシンゴピン、タルニフルメート、タウロリジン、テモポルフィン、テモゾロミド、テトラザンビゲン（ｔｅｔｒａｚａｎｂｉｇｅｎ）、タキストミンＡ、チオコルヒチン、チラパザミン、ＵＣＤ３８Ｂ、ＵＭＩ－７７、ウンデシルプロジギオシン、ＶＫ３－ＯＣＨ３、バキノール－１、ビオラセイン、ボサロキシン、ゼルンボン、ｇＡｃｒｐ３０、ｇＡｃｒｐ３０／アジポリーン（ａｄｉｐｏｌｅａｎ）、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。細胞損傷剤またはアポトーシス誘導因子と接触させた細胞は、その後、固定剤または架橋剤と接触させてもよい。
【0158】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞は、細胞を化学物質（例えば、固定剤もしくは架橋剤、細胞損傷剤、またはそれらの組合せ）と所定の時間接触させることによってアポトーシスを起こすことができる。一部の実施形態では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞は、架橋剤（例えば、ＥＣＤＩ）で所定の時間固定することによってアポトーシスを起こす。一部の場合では、所定の時間は、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間または約７２時間である。一部の場合では、所定の時間は、１時間未満である。一部の場合では、所定の時間は、少なくとも約１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である。一部の場合では、所定の時間は、最大で約３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である。一部の場合では、所定の時間は、約１分～約２４０分、１分～約１０分、１０分～約２４０分、約１０分～約１８０分、約１０分～約１２０分、約１０分～約９０分、約１０分～約６０分、約１０分～約３０分、約３０分～約２４０分、約３０分～約１８０分、約３０分～約１２０分、約３０分～約９０分、約３０分～約６０分、約５０分～約２４０分、約５０分～約１８０分、約５０分～約１２０分、約５０分～約９０分、約５０分～約６０分、約１０分～約２０分、約２０分～約３０分、約３０分～約４０分、約４０分～約５０分、約５０分～約６０分、約６０分～約７０分、約７０分～約８０分、約８０分～約９０分、約９０分～約１００分、約１００分～約１１０分、約１１０分～約１２０分、約１０分～約３０分、約３０分～約５０分、約５０分～約７０分、約７０分～約９０分、約９０分～約１１０分、約１１０分～約１３０分、約１３０分～約１５０分、約１５０分～約１７０分、約１７０分～約１９０分、約１９０分～約２１０分、約２１０分～約２４０分、約３０分まで、約３０分～約６０分、約６０分～約９０分、約９０分～約１２０分または約１２０分～約１５０分である。
【0159】
接触は、任意の温度においてであり得る。一部の場合では、接触は、氷上（例えば、４℃）で行われる。他の場合では、接触は、室温で行われる。一部の場合では、接触は、少なくとも約０℃、２℃、４℃、８℃、１５℃、２０℃、２５、３０℃、３５℃または３７℃の温度で行われる。一部の場合では、接触は、最高で約４℃、８℃、１５℃、２０℃、２５、３０℃、３５℃、３７℃または４０℃の温度で行われる。一部の場合では、接触は、約０℃～約３７℃、約０℃～約２５℃、約０℃～約１５℃、約０℃～約１０℃、約０℃～約８℃、約０℃～約６℃、約０℃～約４℃、約０℃～約２℃、約２℃～約１０℃、約２℃～約８℃、約２℃～約６℃、約４℃～約２５℃、約４℃～約１０℃、約１５℃～約３７℃、約１５℃～約２５℃、約２０℃～約４０℃、約２０℃～約３７℃または約２０℃～約３０℃の温度で行われる。
【0160】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞は、一部またはすべての細胞のアポトーシスを起こす方法の結果として、凝集し得る。例えば、細胞は、固定剤または架橋剤などの化学物質との接触の後に凝集し得る。細胞を化学物質と接触させる所定の時間は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける凝集の量を最小化するために選択することができる。一部の場合では、凝集物は、例えば、洗浄および／または濾過によって除去することができる。
【0161】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μｌあたり、０．０１～１０または約０．０１～１０の凝集物を含むことができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μｌあたり、０．０１～１、０．１～１、０．２５～１、０．５～１、１～５もしくは１～１０、または約０．０１～１、０．１～１、０．２５～１、０．５～１、１～５もしくは１～１０の凝集物を含むことができる。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μｌあたり、約０．１、０．５、０．７５、１、５または１０未満の凝集物を含むことができる。
【0162】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μｌあたり５未満の凝集物を含むことができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μｌあたり、約５、４、３、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５または０．０１未満の凝集物を含むことができる。
【0163】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μｌあたり１またはそれよりも少ない凝集物を含む。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１μＬあたり、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９または約１．０の凝集物を含むことができる。
【0164】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、０．０１％～１０％または約０．０１％～１０％、例えば０．０１％～２％または約０．０１％～２％の壊死細胞を含み得る。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞は、０．０１％～１０％、０．０１％～７．５％、０．０１％～５％、０．０１％～２．５％、もしくは０．０１％～１％、または約０．０１％～１０％、０．０１％～７．５％、０．０１％～５％、０．０１％～２．５％、もしくは０．０１％～１％の壊死細胞を含むことができる。一部の実施形態では、本開示の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞は、最大で約０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％の壊死細胞を含むことができる。
アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされる分子
アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされる分子
【0165】
免疫調節分子
【0166】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞（例えば、白血球）は、１種または複数の免疫調節分子の存在下、固定剤または架橋剤（例えば、ＥＣＤＩなどのカルボジイミド）で処理することができる。１種または複数の免疫調節分子は、ＩＦＮ－γ、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、抗ＣＤ４０抗体、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、α１－アンチトリプシン、表面抗原分類タンパク質、ｇｐ３９アンタゴニスト、α１－アンチトリプシン、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ラパマイシン、コンプスタチン、アバタセプト、イピリムマブ、またはそれらの組合せのすべてまたは一部を含み得る。ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せを含み得る。表面抗原分類タンパク質は、ＣＤ４、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ５９、もしくはそれらの一部、またはそれらの組合せを含み得る。
【0167】
一部の実施形態では、１種または複数の免疫調節分子は、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンまたはタクロリムス）、共刺激シグナル遮断物質、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤（例えば、ダクリズマブまたはバシリキシマブ）、細胞周期ブロッカー（例えば、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはアザチオプリン）、Ｔ細胞再循環阻害剤（例えば、ＦＴＹ７２０または別のスフィンゴシン１－ホスフェート（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニスト）、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、またはそれらの任意の組合せのすべてまたは一部を含み得る。
【0168】
一部の実施形態では、免疫調節分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ３ｅ、ＦＫ５０６－結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、例えば、ペムブロリズマブ）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４０、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α（例えば、インフリキシマブ）、ＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒ（例えば、トシリズマブ、アクテムラ、クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、サリルマブ、オロキズマブ）、ＩＬ－７、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ５２、α－４インテグリン、ｍＴＯＲ（例えば、ラパマイシンまたはエベロリムス）、ＤＮＡ合成、炎症促進性経路の分子（例えば、サイトカイン、α１－アンチトリプシン、ＮＦｋＢ）、またはそれらの任意の組合せを標的とすることができる。
【0169】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞（例えば、白血球）は、レシピエントにおいて抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤の存在下、固定剤または架橋剤（例えば、ＥＣＤＩなどのカルボジイミド）で処理することができる。抗炎症性サイトカインとしては、例えば、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、またはそれらの組合せが挙げられ得る。一部の場合では、レシピエントにおいて抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤は、α１－アンチトリプシンを含む。
【0170】
ＡＤＬが移植レシピエントに複数回投与される一部の場合では、すべての用量からのＡＤＬは、同じ免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープとすべてコンジュゲートされ得る。ＡＤＬが移植レシピエントに複数回投与される一部の場合では、１つまたは複数の用量からのＡＤＬは、免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープの第１のセットとコンジュゲートされ得、他の用量からのＡＤＬは、免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープの異なるセットとコンジュゲートされ得る。ＡＤＬが移植レシピエントに複数回投与される一部の場合では、１つまたは複数の用量からのＡＤＬは、免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープのセットとコンジュゲートされ得、他の用量からのＡＤＬは、任意のコンジュゲートされた免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープが欠如し得る。
【0171】
ペプチド、抗原およびエピトープ
【0172】
一態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む白血球または間葉間質細胞などのアポトーシス細胞を含む、前処置レジメンならびに／または寛容化ワクチンおよびレジメンを提供する。一部の実施形態では、アポトーシス細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドをさらに含む。
【0173】
このように、ペプチド中のアミノ酸残基の配列は、ＭＨＣ分子中のポリペプチド配列と実質的に類似または機能的に同等であり得る。したがって、「ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチド」は、「ＭＨＣクラスＩＩ分子中の領域由来」配列（例えば、超可変領域）を有するペプチドを指し、その領域の天然に存在するＭＨＣアミノ酸配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％または１００％同一の配列を有するペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の超可変領域と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％または１００％同一の配列を含むことができる。したがって、「ＭＨＣクラスＩ分子に由来するペプチド」は、「ＭＨＣクラスＩ分子中の領域由来」配列（例えば、超可変領域）を有するペプチドを指し、その領域の天然に存在するＭＨＣアミノ酸配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％または１００％同一の配列を有するペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子の超可変領域由来の配列を含む。
【0174】
本明細書で使用される場合、ＭＨＣ分子の「超可変領域」は、同じ遺伝子座の異なる対立遺伝子によってコードされるポリペプチドが高い配列変動性または多型を有する分子の領域である。多型は、典型的には、クラスＩ分子のα１およびα２ドメイン、ならびにクラスＩＩ分子のα１およびβ１ドメインに集中する。対立遺伝子の数、および対立遺伝子の中の多型の程度は、異なる遺伝子座で変わり得る。例えば、ＨＬＡ－ＤＲ分子において、すべての多型は、β鎖の属性と考えられ、α鎖は、比較的不変である。ＨＬＡ－ＤＱについて、αおよびβ鎖は両方とも多型である。
【0175】
本開示のペプチドは、単離されたペプチドであり得る。「単離された」または「生物学的に純粋」という語句は、その天然状態で見られるような、通常それに付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。したがって、本開示のペプチドは、それらのｉｎ ｓｉｔｕ環境、例えば、抗原提示細胞上の他の表面タンパク質に通常関連する材料を含有しない。タンパク質が、均質または優性バンドに単離されている場合でさえ、所望のタンパク質と共精製される天然タンパク質の５～１０％の範囲の微量の夾雑物が存在する。本開示の単離されたペプチドは、このような内因性の共精製されたタンパク質を含有しない。
【0176】
「残基」という用語は、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってオリゴペプチドに組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸ミメティックを指す。本開示における使用に適切なペプチドは、各種の方法で得ることができる。好都合には、それらは、Ｂｅｃｋｍａｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、または周知のプロトコールを使用する他の市販のペプチド合成機などの自動合成機を用いる従来技術によって合成することができる。それらはまた、当技術分野において周知の技術を使用して、手作業で合成することもできる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， Ｐｉｅｒｃｅ）， ２ｄ Ｅｄ． （１９８４）を参照されたい。
【0177】
あるいは、または加えて、特定のＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ配列は、ペプチドを提供するためにクローニングおよび発現され得る。各種のＭＨＣ遺伝子を含む細胞は、容易に入手でき、例えば、それらは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（”Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，” ６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８８） Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．， Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手してもよい。標準的な技術を使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、所望の配列をコードする配列を特定することができる（参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９を参照されたい）。融合タンパク質（２種またはそれよりも多くのタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部からなるもの）は、組換えで生成することができる。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発技術を使用して、無関係のタンパク質は、適した配列を含むように突然変異され得る。
【0178】
各種の天然起源由来のＭＨＣ糖タンパク質はまた、標準的なタンパク質精製技術を使用して、好都合に単離される。ペプチドは、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換または免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズでの分離、または電気泳動（一般に、参照により本明細書に組み込まれるＳｃｏｐｅｓ， Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ． （１９８２）を参照されたい）を含む、任意の各種の公知の技術によって精製することができる。
【0179】
本開示のペプチドを改変して、各種の所望の特質、例えば、未改変ペプチドの生物学的活性を増加させるか、または実質的にすべてを少なくとも保持しながら、改善された薬理学的特性を提供することができることが理解される。例えば、ペプチドは、ペプチドのアミノ酸配列を伸長させること、減少させることによって、改変することができる。異なるアミノ酸またはアミノ酸ミメティックによる置換を行うこともできる。
【0180】
一部の実施形態では、アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされたペプチドは、ＭＨＣ分子に由来する。「ＭＨＣ分子」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）糖タンパク質のタンパク質配列を含む分子を指す。本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体を指すことが理解され、これは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む主要組織適合遺伝子複合体の糖タンパク質抗原を特定する遺伝子座のセットとして定義される。本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ」という用語は、ヒト白血球抗原を指すことが理解され、これは、ヒトにおいて見出される主要組織適合抗原として定義される。本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ」は、ヒト型の「ＭＨＣ」であり、したがって、互換的に使用することができる。本開示および特許請求の範囲に係る発明概念に従って利用することができるＨＬＡタンパク質の例としては、限定されるものではないが、ＨＬＡクラスＩα鎖、ＨＬＡクラスＩＩα鎖およびＨＬＡクラスＩＩβ鎖が挙げられる。本開示および特許請求の範囲に係る発明概念に従って利用し得るＨＬＡクラスＩＩαおよび／またはβタンパク質の特定の例としては、限定されるものではないが、以下の遺伝子座：ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＬＡ－ＤＲＢ１；ＨＬＡ－ＤＲＢ３、４、５；ＨＬＡ－ＤＱＡ；ＨＬＡ－ＤＱＢ；ＨＬＡ－ＤＰＡ；およびＨＬＡ－ＤＰＢでコードされるものである。
【0181】
一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に由来し得るか、またはＭＨＣクラスＩ分子に由来するそのようなペプチドのバリアントである。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来し得るか、またはＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドのバリアントである。ＭＨＣ分子は、高等脊椎動物の細胞で発現するヘテロ二量体糖タンパク質であり、免疫応答において役割を果たす。ヒトでは、これらの分子をヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称する。ＭＨＣ糖タンパク質は、クラスＩおよびクラスＩＩの２つの群に分けられ、これは、互いに構造的および機能的に異なる。一般に、ＭＨＣ分子の主要な機能は、抗原性ペプチドに結合すること、および細胞の表面上でそれらを表示することである。ＭＨＣによってコードされる糖タンパク質は、ヒトおよびマウス系の両方において広く研究されており、それらの核酸およびタンパク質の配列は、当技術分野において周知である。多くの組織適合性タンパク質は、単離され、特徴付けられている。ＭＨＣ糖タンパク質の構造および機能の一般的な概説について、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｅ． Ｐａｕｌ， ｅｄ．， （Ｒａｖｅｎｓ Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ． １９９３）を参照されたい。
【0182】
ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどすべての有核細胞で発現し、細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され、これは次いで、抗原保有細胞を破壊する。マウスでは、クラスＩ分子は、ＭＨＣのＫ、ＤおよびＱａ領域によってコードされる。クラスＩＩ分子は、Ｉ－ＡおよびＩ－Ｅサブ領域によってコードされる。マウスＩ－ＡおよびＩ－Ｅサブ領域によってコードされる単離された抗原は、２つの非共有結合的に結合したペプチド鎖：３２～３８ｋｄのα鎖および２６～２９ｋｄのβ鎖からなることが示されている。第３の不変の３１ｋｄのペプチドは、これらの２つのペプチドと非共有結合的に会合するが、これは、多型ではなく、細胞表面上の抗原の成分とは思われない。Ｉ－Ａ領域のいくつかの対立遺伝子バリアントのαおよびβ鎖は、クローニングおよび配列決定されている。
【0183】
ヒトクラスＩタンパク質も研究されている（Ｂｊｏｒｋｍａｎ， Ｐ． Ｊ．， ｅｔ
ａｌ．， （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６－５１２）。これらは、４４ｋｄのサブユニットＭＨＣクラスＩ重鎖、およびすべての抗原特異性に共通する１２ｋｄのβ２－ミクログロブリンサブユニットからなることが見出されている。さらなる研究は、クラスＩヒト抗原のＨＬＡ－Ａ２の３次元構造の詳細な像をもたらしている。
ａｌ．， （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６－５１２）。これらは、４４ｋｄのサブユニットＭＨＣクラスＩ重鎖、およびすべての抗原特異性に共通する１２ｋｄのβ２－ミクログロブリンサブユニットからなることが見出されている。さらなる研究は、クラスＩヒト抗原のＨＬＡ－Ａ２の３次元構造の詳細な像をもたらしている。
【0184】
構造的に、ＭＨＣクラスＩ分子は、２つの非共有結合的に結合したポリペプチド鎖のより大きな「ＭＨＣクラスＩ重鎖（α）」およびより小さな「軽」鎖（（β－２－ミクログロブリン）で構成されるヘテロ二量体である。多型の多遺伝子性の重鎖（４５ｋＤａ）は、第６染色体のＭＨＣ内でコードされる。第６染色体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃの３つの遺伝子座を有し、この最初の２つは、ＭＨＣクラスＩ重鎖同種抗原のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂをそれぞれコードする多数の対立遺伝子を有する。ＭＨＣクラスＩ重鎖（α）（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ）は、３つの細胞外ドメイン（α１、α２およびα３と指定）、１つの細胞内ドメインおよび１つの膜貫通ドメインに細分化される。２つの最外部の細胞外ドメインのα１およびα２は、一緒に、抗原ペプチドに結合する溝を形成する。したがって、ＴＣＲとの相互作用は、タンパク質のこの領域で起こる。分子の３番目の細胞外ドメインは、ＣＴＬにおけるＣＤ８タンパク質についての認識部位を含有し、この相互作用は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触を安定化する働きをする。
【0185】
第１５染色体のＭＨＣの外側でコードされる不変の軽鎖（１２ｋＤａ）は、単一の細胞外ポリペプチドからなる。「ＭＨＣクラスＩ軽鎖」、「β－２－ミクログロブリン」および「β２ｍ」という用語は、本明細書において、互換的に使用され得る。クラスＩ重鎖および軽鎖の会合は、細胞膜上のクラスＩ分子の発現のために必要である。この状況では、β２－ミクログロブリンタンパク質および重鎖のα３ドメインが会合する。したがって、本明細書に開示のＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体、ＭＨＣクラスＩ重鎖（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ）、ＭＨＣクラスＩ軽鎖、またはそれらの部分を指し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ重鎖、例えば、ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｂに由来し得る。一部の実施形態では、全ＭＨＣクラスＩ重鎖を使用することができる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩ重鎖のドメイン（α１、α２またはα３）であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ重鎖のα１、α２またはα３領域由来の配列を含み得るか、またはそれらと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％もしくは１００％同一の配列を含むことができる。重鎖のα１およびα２ドメインは、ペプチドが結合する抗原結合部位を形成する超可変領域を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ重鎖のα１またはα２ドメインに由来し得る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子の超可変領域由来の配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩに由来する１種または複数のペプチドは、本明細書に開示の表から選択されるか、または本明細書における表に開示されるペプチドと、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％もしくは１００％同一である。
【0186】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのための細胞（例えば、白血球）は、１種または複数の抗原および／またはエピトープの存在下、固定剤または架橋剤（例えば、ＥＣＤＩなどのカルボジイミド）で処理することができる。抗原および／またはエピトープは、移植ドナー、移植レシピエント、第三者、またはそれらの組合せ由来の抗原および／またはエピトープを含むことができる。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞は、レシピエントの抗原および／またはエピトープにカップリングされる。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞は、第三者の抗原および／またはエピトープにカップリングされる。一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞は、移植ドナーの抗原および／またはエピトープにカップリングされる。
【0187】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、免疫応答の開始および支持に関与する細胞、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージなどにおいて主に発現する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、ヘルパーＴリンパ球の増殖、および表示される特定の抗原ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。Ｔ細胞受容体の関与は、チロシンリン酸化の増加、Ｃａ＋＋流入、ＰＩ代謝回転、サイトカインおよびサイトカイン受容体の合成、ならびに細胞分裂などの細胞活性化に特徴的な一連の分子事象を誘導する（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４８：２２７－３６０を参照されたい。Ｔ細胞が抗原を認識する方法の一般的な議論については、Ｇｒｅｙ， Ｈ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｐ ５６－６４， （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， １９８９）を参照されたい。
ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質のＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＰ（ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ遺伝子座の対立遺伝子によってコードされる）は、クラスＩのものと同様の抗原結合部位を含むドメイン構造を有する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つのほぼ相同のサブユニット：αおよびβ鎖からなるヘテロ二量体であり、この両方とも、ＭＨＣにおいてコードされる。したがって、一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のヘテロ二量体を指す。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘテロ二量体のサブユニットであり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱＡまたはＨＬＡ－ＤＲＡ）、もしくはＭＨＣクラスＩＩβ鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＰＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢまたはＨＬＡ－ＤＲＢ）、またはそれらのドメインであり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲＢである。
ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質のＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＰ（ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ遺伝子座の対立遺伝子によってコードされる）は、クラスＩのものと同様の抗原結合部位を含むドメイン構造を有する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つのほぼ相同のサブユニット：αおよびβ鎖からなるヘテロ二量体であり、この両方とも、ＭＨＣにおいてコードされる。したがって、一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のヘテロ二量体を指す。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘテロ二量体のサブユニットであり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱＡまたはＨＬＡ－ＤＲＡ）、もしくはＭＨＣクラスＩＩβ鎖（例えば、ＨＬＡ－ＤＰＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢまたはＨＬＡ－ＤＲＢ）、またはそれらのドメインであり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲＢである。
【0188】
ＨＬＡ－ＤＲＢは、ヒトの４つの遺伝子座（ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４およびＨＬＡ－ＤＲＢ４）によってコードされるが、しかしながら、３つ以下の機能的遺伝子座が、単一の個体に存在し、２つ以下の機能的遺伝子座が、単一の染色体に存在する。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲＢであるＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４またはＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子座によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４によってコードされる。ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座は、広範に分布し、非常に多数の機能的可変遺伝子産物（ＨＬＡ－ＤＲ１～ＨＬＡ－ＤＲ１７）をコードする。ＨＬＡ－ＤＲ５２を特異的にコードするＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子座は、中程度の可変性であり、ある特定のＨＬＡ－ＤＲＢ１の種類に可変的に関連する。ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子座は、ＨＬＡ－ＤＲ５３をコードする。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲＢであるＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４またはＨＬＡ－ＤＲ５から選択される。
【0189】
クラスＩＩ分子中のそれぞれのサブユニットは、α１、α２、β１およびβ２と称される球状ドメインからなる。α１ドメインを除くすべてが、免疫グロブリンスーパーファミリーの分子の典型的な鎖内ジスルフィド結合によって安定化される。クラスＩＩ分子中のそれぞれの鎖は、２つの外部ドメイン：α１およびα２外部ドメインを含有する３３ｋＤａのα鎖、さらにβ１およびβ２外部ドメインを含有する２８ｋＤａのβ鎖を含有する。クラスＩ重鎖分子の膜近位の第３の細胞外ドメインのような膜近位のα２およびβ２ドメインは、免疫グロブリンの折り畳みドメイン構造に相同の配列を保有する。クラスＩＩ分子の膜遠位のドメインは、α１およびβ１ドメインで構成され、これは、処理されたペプチド抗原の抗原結合間隙を形成する。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、球状ドメイン、例えば、α１、α２、β１またはβ２であり得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、全サブユニット（αまたはβ鎖）、またはそれらの大部分を含むことができる。例えば、ペプチドは、約９０～１００残基のＭＨＣクラスＩＩサブユニット由来の細胞外ドメイン（例えば、クラスＩＩ分子のβ１およびβ２、またはα１およびα２）を含み得るか、またはそれらと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％もしくは１００％同一の配列を含むことができる。αおよびβ鎖のＮ末端部分のα１およびβ１ドメインは、抗原結合部位の大部分を含むと考えられる超可変領域を含有する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３－３９ （１９９３）を参照されたい）。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の超可変領域（例えば、それぞれ、αおよびβ鎖サブユニットのα１およびβ１ドメイン）由来の配列、またはそれらと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％または１００％同一の配列を含むことができる。
【0190】
一部の実施形態では、ペプチドは、有害な免疫応答に関連するＭＨＣクラスＩＩ分子のαまたはβ鎖の超可変領域に由来する。この方法において、標的抗原（例えば、自己抗原またはアレルゲン）を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の能力が阻害される。
【0191】
レピシエント型のＭＨＣクラスＩＩ分子を白血球または間葉間質細胞などのアポトーシス細胞にコンジュゲートすることにより、哺乳動物レシピエントにおける同種移植または異種移植（例えば、膵島、腎臓、または胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来の細胞、組織および臓器などの他の細胞、組織もしくは臓器の移植）の前処置レジメンの寛容誘導有効性を増強することができる。例えば、部分的または完全にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ不適合のドナー－レシピエントの対について、レピシエント型のＭＨＣクラスＩＩ分子をＡＤＬにコンジュゲートすることにより、移植された細胞、組織または臓器に対する寛容の誘導におけるＡＤＬ有効性を増強することができる。移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子の１つ（または複数）に由来する１種または複数のペプチドの完全に不適合のＡＤＬの表面へのカップリングにより、ＡＤＬの取り込み後（例えば、レシピエント脾臓周辺帯抗原提示細胞または肝臓類洞内皮細胞による）、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子による提示のための豊富な量のレピシエント型のＭＨＣクラスＩＩペプチドを提供することができる。自己ＭＨＣクラスＩＩの認識は、例えば、調節性Ｔ細胞サブセットを介して、レシピエントの寛容を促進することができる。
【0192】
寛容を誘導することができる手段の追加例は、胸腺由来ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）の活性化を介してである。例えば、マウスにおける実験移植研究では、ＭＨＣクラスＩＩペプチド特異的ｔＴｒｅｇの発生およびＭＨＣ－ＩＩ適合同種グラフトの寛容は、ドナーのＭＨＣクラスＩＩ由来ペプチドの胸腺発現に依存し得る。ｔＴｒｅｇは、それら自身のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるそれら自身のＭＨＣクラスＩＩペプチドの認識によって選択される。ＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合し、それによって提示される自己ペプチドのかなりの割合は、ＭＨＣクラスＩＩそれ自身に由来する。したがって、多くの循環（ｔ）Ｔｒｅｇは、自己ＭＨＣクラスＩＩペプチドに対する特異性を有する。この複合体が、活性化されたエフェクターＴ細胞の表面上に提示される場合、これは、ｔＴｒｅｇに対する強力な活性化シグナルとしての機能を果たし得、ｔＴｒｅｇ活性化、したがって免疫寛容の促進をもたらす。
【0193】
ｔＴｒｅｇが活性化され得る１つの方法は、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるＭＨＣクラスＩＩペプチドの活性化Ｔ細胞へのトロゴサイトーシスによる。トロゴサイトーシスは、ＭＨＣクラスＩＩペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子全体の交換を含む。結合した自己ＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＤＲＢ）ペプチドとのＭＨＣクラスＩＩ複合体の活性化Ｔ細胞へのトロゴサイトーシスは、これらのＴ細胞を、同じ自己ＭＨＣクラスＩＩペプチドに対する特異性を有するｔＴｒｅｇの強力な活性化因子に変化させることができる。したがって、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩペプチドを提示するレシピエント型のＭＨＣクラスＩＩ分子が、活性化レシピエントＴ細胞に送達され、活性化レシピエントＴ細胞によって提示されると、これは、ｔＴｒｅｇに対する強力な活性化シグナルとしての機能を果たし得る。ｔＴｒｅｇの活性化は、抗原特異性を必要とするが、それらの調節機能は、抗原特異性を必要としない。このように、活性化ｔＴｒｅｇは、直接的および間接的特異性のドナー特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む抗ドナー免疫を直接下方調節することができ、Ｔｒ１細胞を含む調節能を有する他の免疫細胞サブセットの増幅による抗ドナー免疫を下方調節することもできる。
【0194】
自己ＭＨＣクラスＩＩに結合する自己ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）は、ＬＡＧ－３受容体シグナル伝達を介した寛容の誘導にも寄与し得る。それらが由来するＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合するＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）は、ペプチド：Ｔ細胞上のＬＡＧ－３受容体による認識およびそれを介したシグナル伝達に必要なＭＨＣクラスＩＩの立体構造を安定化することができる。ＬＡＧ－３は、安定なペプチドを不安定なペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ複合体から区別することができるＴＣＲ共受容体である。自己ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドの特異性は、したがって、ＬＡＧ－３を介して免疫応答の特異性を調節し得る。したがって、
【0195】
ＬＡＧ－３の発現および機能は、寛容誘導に関連する。例えば、ＬＡＧ３およびＣＤ４９ｂの共発現を使用して、Ｔｒ１細胞を特定することができ、Ｔｒ１細胞上のＬＡＧ３の遮断は、Ｔｒ１誘導寛容を抑止する。ＬＡＧ３はまた、活性化されたｔＴｒｅｇにおいて一過的に、および活性化されたＴｅｆｆ細胞において有意に低いレベルで発現し、ＬＡＧ３が調節能力を有する細胞の確実なマーカーであり得ることを示唆する。加えて、ＤＣにおけるＭＨＣクラスＩＩのＬＡＧ３架橋は、ＤＣを寛容化する。自己ＭＨＣクラスＩＩペプチドが、ＬＡＧ－３認識に関連する立体構造でペプチドを提示する自己ＭＨＣクラスＩＩを安定化することを考慮すると、豊富な量の自己ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）の送達は、ＤＣにおいて安定な自己ペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体の存在を強化し得、それによって、寛容に寄与し得る（例えば、Ｔｒ１細胞の増幅を介して）。これは、１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子で適合したアポトーシス性ドナー白血球が、同種移植レシピエントにおいて寛容を促進することを示すデータによって裏付けられる。
【0196】
１つ（または複数）の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチド（例えば、ＤＲα鎖、ＤＲβ鎖、ＤＱα鎖、ＤＱβ鎖、ＤＰα鎖またはＤＰβ鎖）は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのＡＤＬの白血球の表面にコンジュゲートされ得る。一部の場合では、移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドは、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖、ＤＰβ鎖、またはそれらの組合せを含む。一部の場合では、１種または複数のペプチドは、１つまたは複数の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子由来である。一部の場合では、１種または複数のペプチドは、１つまたは複数の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ対立遺伝子由来である。一部の場合では、１種または複数のペプチドは、１つまたは複数の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＱＡ対立遺伝子由来である。一部の場合では、１種または複数のペプチドは、１つまたは複数の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＱＢ対立遺伝子由来である。一部の場合では、１種または複数のペプチドは、１つまたは複数の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＰＡ対立遺伝子由来である。一部の場合では、１種または複数のペプチドは、１つまたは複数の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＰＢ対立遺伝子由来である。
【0197】
ＤＲα鎖は、機能的に単形性であり得、したがって、一部の実施形態では、他のＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドが、寛容誘導のために好ましい。他の実施形態では、レシピエント型のＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ分子をアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）にコンジュゲートすることにより、前処置レジメンの寛容を誘導する有効性を増強することができる。ＤＲα鎖は、機能的に単形性であり得、これは、ＤＲα鎖を寛容誘導のために好都合な標的とし得る。一部の場合では、単形性ＤＲアルファ鎖由来のペプチドを提示するレシピエント型のＭＨＣクラスＩＩは、その同族特異性について胸腺で選択されるｔＴｒｅｇ細胞のサブセットへの活性化シグナルとしての機能を果たし得る。普遍的細胞に由来する任意の容易に増幅可能なＴ細胞などの任意の細胞は、単形性ＤＲＡ抗原に由来する同じ鎖、ドメインまたはペプチドとコンジュゲートすることができ、プロセシングして、移植片に対する寛容を促進するために使用することができるＡＤＬを発生させることができる。この方法は、レシピエントがＤＲＡ抗原について陽性である、移植シナリオの範囲に幅広く適用可能であり得る。例えば、この方法は、普遍的ドナー細胞を使用して寛容を誘導するために使用することができる。
【0198】
一部の場合では、ＡＤＬは、移植レシピエントと完全にＭＨＣ不適合である。一部の場合では、ＡＤＬは、移植レシピエントと部分的にＭＨＣ適合である（例えば、レシピエントと１つもしくは複数のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原を共有する）。一部の場合では、ＡＤＬは、移植レシピエントとハプロタイプ一致である。一部の場合では、ＡＤＬは、移植片と同じドナー由来である。一部の場合では、ＡＤＬは、移植片と同じドナー由来ではない。
【0199】
レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、全ＭＨＣクラスＩＩ分子を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰの全α鎖を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰの全β鎖を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰの全α１および／またはα２ドメインを含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰの全β１および／またはβ２ドメインを含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣ－ＤＲ１、ＭＨＣ－ＤＲ２、ＭＨＣ－ＤＲ３、ＭＨＣ－ＤＲ４および／またはＭＨＣ－ＤＲ５を含み得る。
【0200】
レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα１および／またはα２ドメインの断片を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ１および／またはβ２ドメインの断片を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣ－ＤＲ１、ＭＨＣ－ＤＲ２、ＭＨＣ－ＤＲ３、ＭＨＣ－ＤＲ４および／またはＭＨＣ－ＤＲ５の断片を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、超可変領域由来の配列を含み得る。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲＢ分子の超可変領域由来のｉｎ ｓｉｌｉｃｏで特定される高、中または低親和性のペプチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のペプチド）を含むことができる。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ペプチド結合領域におよぶ可変領域（例えば、約２０、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または４０アミノ酸のペプチド）を含むことができる。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲＢ結合溝に対して異なる親和性を有するカテプシンＳ切断可能リンカーを有する二量体ペプチドを含むことができる。一部の場合では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのアルファ鎖由来のペプチドを含まない。
【0201】
レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、合成または組換えであってもよい。一部の場合では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、約１０～３０アミノ酸長であってもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、少なくとも１０～３０アミノ酸長であってもよい。一部の実施形態では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２７５、２００または２５０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、最大で約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２７５、２００または２５０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２７５、２００または２５０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、約５～２５０、１０～２５０、２０～２５０、３０～２５０、５０～２５０、１００～２５０、５～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、５０～１００、５～５０、１０～５０、２０～５０、３０～５０、５～３０、１０～３０、１５～３０または２０～３０アミノ酸長であり得る。
【0202】
一部の場合では、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、１型糖尿病を有する患者において最も優勢なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子であるＨＬＡ ＤＲ３およびＤＲ４分子のペプチド結合溝への結合に関する高い親和性を有し得る。ヒトにおけるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ３およびＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ４分子への結合に関する高い親和性を有するＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ３およびＤＲ４ペプチドの非限定的な例を、実施例１４に提示する（表２～６）。
【0203】
一部の場合では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞は、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、またはそれらの組合せにカップリングされる。
【0204】
一部の実施形態では、ペプチドの「カクテル」が、アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、白血球などのアポトーシス細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、白血球などのアポトーシス細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する、例えば、少なくとも２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、またはそれよりも多くのペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、アポトーシス性白血球は、ＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、白血球などのアポトーシス細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に由来する、例えば、少なくとも２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、またはそれよりも多くのペプチドを含むことができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する２種以上のペプチドの混合物は、レシピエントにおいて増加した免疫寛容応答を誘導する利点を有する。増加した寛容は、例えば、連鎖廃止と呼ばれるメカニズムによるものであり得る。連鎖抑制のメカニズムは、当業者に公知である。例えば、αおよびβ鎖の超可変領域由来の配列を含むペプチドは、組み合わせて使用されてもよい。ある特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチド（野生型または改変）のサイズは、限定されるものではないが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、またはそれよりも多くのアミノ分子を含んでいてもよく、それらにおいて導きだせる任意の範囲もしくは値、またはその派生を含む。ある特定の態様では、ＭＨＣ分子の、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０またはそれよりも多くの連続した、誘導体を含むアミノ酸および断片を使用することができる。ペプチドは、トランケーションによって突然変異されて、それらの対応する野生型形態よりも短くされ得るが、特定の機能を有する異種タンパク質配列と融合またはコンジュゲートすることによって変化させられる可能性もあることが企図される（例えば、タンパク質複合体としての提示のため、免疫原性の増強のためなど）。
【0205】
ドナーまたはレシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＨＣクラスＩ分子、およびＭＨＣ状態は、例えば、当技術分野において公知のＨＬＡタイピングまたは組織タイピングの従来の方法によって、決定することができる。用いることができる方法の非限定的な例としては、血清学的方法、細胞法およびＤＮＡタイピング法が挙げられる。血清学を使用して、細胞の表面上のＨＬＡタンパク質が特定される。補体依存性細胞傷害試験またはマイクロリンパ球毒性アッセイを、ＭＨＣ分子の血清学的識別のために使用することができる。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、ＭＨＣクラスＩ抗原を発現し、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃの血清学タイピングのために使用される。ＭＨＣクラスＩＩタイピングは、これらの細胞がクラスＩＩ分子を発現するので、ＰＢＬから単離されたＢリンパ球を用いて行われる。ＨＬＡタイピングは、公知のＨＬＡ特異性の血清を含有する各ウェルを有するマルチウェルプラスチックトレイ中で行われる。
【0206】
リンパ球は、ウェルにプレーティングされ、インキュベートされ、補体（供給源としてウサギ血清）を添加して、抗体結合リンパ球の溶解を媒介する（Ｔｅｒａｓａｋｉ Ｐｉ， Ｎａｔｕｒｅ． １９６４を参照されたい）。混合リンパ球培養（ＭＬＣ）などの細胞アッセイは、個体間のクラスＩＩタンパク質の相違を測定する。これは、そのすべてが当業者に公知のいくつかの方法で達成され得、例えば、サブタイピングは、混合リンパ球応答（ＭＬＲ）タイピングによって、および薬物刺激リンパ球試験（ＰＬＴ）によって達成され得る。両方の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに記載されている。これはまた、調べるＭＨＣ遺伝子座に特異的なＤＮＡプローブを使用してＤＮＡ制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を分析することによって達成され得る。ＭＨＣ遺伝子座のためのプローブを調製するための方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｇｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：５９６６を参照されたい。移植片およびレシピエントにおけるＭＨＣ分子の高分解能識別は、ＤＮＡタイピング法によって行うことができる。ＤＮＡタイピングによって定義される異なるＨＬＡ対立遺伝子は、血清学タイピングを使用して区別できないＨＬＡタンパク質を特定することができる。例えば、ＤＲＢ１＊０４０１０１対立遺伝子を持つ個体は、ＤＲＢ１＊０４１２対立遺伝子を持つ個体と同じ血清型（ＤＲ４）を有するだろう。したがって、ＤＲＢ１＊０４０１０１およびＤＲＢ１＊０４１２は、広い特異性のＤＲ４の分割である。これらの分割は、ＤＮＡタイピングによって特定される。
【0207】
ＭＨＣ分子の特定は、遺伝子座のゲノムＤＮＡ、または遺伝子座内でコードされるｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの配列決定によって達成することができる。配列決定されたＤＮＡは、ＭＨＣコードポリペプチドの超可変領域をコードするセクションを含む。プローブを有する所望のＤＮＡを特異的に特定するため、所望の領域の増幅のための技術は、当技術分野において公知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が挙げられる。
【0208】
代替法として、多型ＤＮＡ配列は、増幅プライマーとして使用することができ、この場合において、これらのプライマーに相補的な配列を含む対立遺伝子のみがプライマーにアニーリングされ、増幅が進行する。ＤＮＡタイピングのこの第２の戦略は、配列特異的プライマー（ＳＳＰ）法と呼ばれ、例えば、Ａｌｔａｆ ｅｔ ａｌ Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２０１７、Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｖｏｌ． １４， ３４７－３５６， Ａｐｒｉｌ， ２００１、Ｄｕｎｃｋｌｅｙ Ｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１２、米国特許出願公開第２００９００６９１９０Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０１１７５５３Ａ１号に記載されている。当業者は、ＭＨＣ分子の遺伝子配列がＤＮＡタイピング法によって決定されると、タンパク質産物を決定することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＭＨＣクラスＩ分子のペプチドの組換え合成のために使用することができる。
【0209】
あるいは、または加えて、細胞は、ビオチンまたはストレプトアビジンの存在下、固定剤または架橋剤で処理することができる。このような場合では、１種もしくは複数の免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープは、ストレプトアビジンまたはビオチンとカップリングさせることができ、固定剤または架橋剤との接触後に、細胞と接触させることができる。１種もしくは複数の免疫調節分子、抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤および／または抗原もしくはエピトープは、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して細胞に結合することができる。
【0210】
代替戦略は、免疫調節分子、レシピエントにおける抗炎症性サイトカインの発現を増加させる薬剤、移植ドナーの抗原および／もしくはエピトープ、移植レシピエントの抗原および／もしくはエピトープ、ならびに／または第三者の抗原および／もしくはエピトープのうちの１種または複数をポリスチレンナノ粒子などのナノ粒子にカップリングさせることを含むことができる。このようなナノ粒子は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンとともに、またはその一部として、投与することができる。
【0211】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲートする」または「にコンジュゲートされる」などの用語は、分子実体（例えば、本開示のペプチドおよびアポトーシス性白血球）が共有結合または非共有結合により一緒に連結されることを指す。コンジュゲーションは、２つの分子実体の直接カップリング、例えば、ヒドロキシル基、アミノ基およびカルボン酸からエステルまたはアミドの作出によって、達成されてもよい。コンジュゲーションは、２つの分子実体の間接カップリング、例えば、ポリエチレングリコールなどの連結基の設立によって、達成されてもよい。コンジュゲーションは、分子実体を互いと反応する化学基で修飾することによって、例えば、アジド官能化実体を有するアルキン官能化実体、またはジスルフィド結合を形成する個々の実体上のチオール基の還元によって、達成されてもよい。エチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート、２つのエポキシ残基を含有するプロピレングリコールジグリシジルエーテル、およびエピクロロヒドリンなどのコンジュゲートを、ペプチドまたはタンパク質のアポトーシス性白血球の表面への固定のために使用することができる。アポトーシス性白血球の表面上の反応性カルボキシル基は、ペプチドまたはタンパク質上の遊離アミン（例えば、Ｌｙｓ残基由来）に、それらを、例えば、１－エチル－３－［３，９－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）と反応させることによって、接合することができる。同様に、同じ化学物質を、アポトーシス性白血球の表面上の遊離アミンを、ペプチドまたはタンパク質上の遊離カルボキシル（例えば、Ｃ末端由来、またはＡｓｐもしくはＧＩｕ残基由来）とコンジュゲートさせるために使用してもよい。あるいは、アポトーシス性白血球の表面上の遊離アミノ基は、本質的にＡｒａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃｈｅｍ． ２：７１－６に記載されているスルホ－ＳＩＡＢ化学を使用して、ペプチドおよびタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質の融合タンパク質に共有結合的に結合されてもよい。当技術分野において周知の多種多様な手段を、ペプチドをアポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートさせるために使用してもよい。これらの方法には、ペプチドの生物活性およびアポトーシス性白血球の生物活性を破壊または大幅に限定せず、寛容を誘導することを可能にする配向で十分な数のペプチドを表面にコンジュゲートするのを可能にする任意の標準的な化学を含む。一部の実施形態では、ペプチドのＣ末端領域がコンジュゲートされる。他の実施形態では、ペプチドのＮ末端を、アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートさせることができる。
短期免疫抑制
短期免疫抑制
【0212】
本開示の前処置レジメンまたは寛容化ワクチンは、１種もしくは複数の免疫抑制剤および／または抗炎症剤を移植レシピエントに投与すること、例えば、アポトーシス細胞（アポトーシス性ドナー白血球または間葉間質細胞など）に加えて１種もしくは複数の免疫抑制剤および／または抗炎症剤を投与することを含むことができる。
【0213】
一部の場合では、本開示の前処置レジメンまたは寛容化ワクチンは、移植レシピエントの短期免疫抑制を含むことができる。一部の場合では、移植された細胞、臓器または組織に対する移植レシピエントの寛容は、レシピエントに長期免疫抑制または維持免疫抑制を投与していないにもかかわらず、維持され得る。
【0214】
短期免疫抑制は、本明細書に開示の任意の免疫抑制剤および／または抗炎症剤を移植レシピエントに投与することを含むことができる。
【0215】
一部の実施形態では、本開示の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、レシピエントに対するアポトーシス細胞（例えば、アポトーシス性ドナー白血球または間葉間質細胞）、およびｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含む短期免疫抑制を投与することを含むことができる。
【0216】
例示的な実施形態では、本開示の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、アポトーシス性ドナー白血球をレシピエントに投与すること、ならびに（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｉｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｉｖ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤のうちの１種または複数を含む短期免疫抑制を含むことができる。これらの薬剤と本明細書に開示のアポトーシス性ドナー白血球と一緒の短期投与は、長期維持免疫抑制をレシピエントに投与していないにもかかわらず、移植された細胞、臓器または組織に対する長期寛容を促進することができる。
【0217】
１つの例示的な実施形態では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤、抗インターロイキン６受容体剤および抗ＣＤ４０剤を投与することを含む。これらの薬剤と本明細書に開示のアポトーシス性ドナー白血球と一緒の短期投与は、長期維持免疫抑制をレシピエントに投与していないにもかかわらず、移植された細胞、臓器または組織に対する長期寛容を促進することができる。
【0218】
１つの例示的な実施形態では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤、可溶性抗腫瘍壊死因子受容体、抗インターロイキン６受容体抗体およびアンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む。これらの薬剤と本明細書に開示のアポトーシス性ドナー白血球と一緒の短期投与は、長期維持免疫抑制をレシピエントに投与していないにもかかわらず、移植された細胞、臓器または組織に対する長期寛容を促進することができる。
【0219】
ｍＴＯＲ阻害剤の非限定的な例としては、ラパマイシン、シロリムスおよびエベロリムスが挙げられる。一部の場合では、本開示のｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。
【0220】
抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤は、抗腫瘍壊死因子抗体もしくはその抗原結合性断片、アンタゴニスト性抗腫瘍壊死因子受容体抗体もしくはその抗原結合性断片、または腫瘍壊死因子受容体の可溶性腫瘍壊死因子結合ドメイン（例えば、エタネルセプト）を含み得る。腫瘍壊死因子は、ＴＮＦ－アルファであり得る。一部の場合では、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤は、腫瘍壊死因子受容体の可溶性腫瘍壊死因子結合ドメイン（例えば、エタネルセプト）である。抗腫瘍壊死因子剤および抗腫瘍壊死因子受容体剤の非限定的な例としては、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴルおよびゴリムマブが挙げられる。
【0221】
抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤は、抗インターロイキン６抗体、アンタゴニスト性抗インターロイキン６受容体抗体、またはそれらの抗原結合性断片であり得る。一部の場合では、本開示の抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤は、アンタゴニスト性抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、トシリズマブ）である。抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤の非限定的な例としては、トシリズマブ、アクテムラ、クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、サリルマブおよびオロキズマブが挙げられる。
【0222】
抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、例えば、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト性抗ＣＤ４０リガンド抗体、またはそれらの抗原結合性断片であり得る。抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはそれらの抗原結合性断片であり得る。アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体の非限定的な例としては、２Ｃ１０、２Ｃ１０Ｒ４、ＡＳＫＰ１２４０、４Ｄ１１、ブレセルマブ、ＢＩ－６５５０６４、ＨＣＤ１２２、ＣＦＺ５３３、ｃｈ５Ｄ１２、ＣＤＰ７６５７およびＦＦＰ１０４が挙げられる。一部の場合では、抗ＣＤ４０剤は、ＡＳＫＰ１２４０である。抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０リガンド抗体またはそれらの抗原結合性断片であり得る。アンタゴニスト性抗ＣＤ４０リガンド抗体の非限定的な例としては、ＢＧ９５８８、ルプリズマブ、トラリズマブ、ＩＤＥＣ－１３１、ダピロリズマブ、レトリズマブ、ＢＭＳ－９８６００４、ＶＩＢ４９２０およびＭＥＤＩ４９２０が挙げられる。
【0223】
一部の実施形態では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。
【0224】
一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、および（ｉｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、および（ｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、および（ｉｉ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、および（ｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、および（ｉｉ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｉｉ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。
【0225】
一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、および（ｉｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、および（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、（ｉ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、（ｉｉｉ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を投与することを含む。
【0226】
短期免疫抑制は、本開示の１種または複数の免疫抑制剤および／または抗炎症剤を、移植後最長で約１００日間、投与することを含むことができる。短期免疫抑制は、本開示の１種または複数の免疫抑制剤および／または抗炎症剤を、例えば、移植後最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日間投与することを含むことができる。一部の場合では、短期免疫抑制は、移植後２８日以内に終了することができる。一部の場合では、短期免疫抑制は、移植の約２１日後に終了することができる。
【0227】
一部の実施形態では、短期免疫抑制は、移植の前に始めることができる。例えば、短期免疫抑制は、移植の約または最長で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３５または５０日前に開始することができる。一部の場合では、短期免疫抑制は、移植の最長で約１０日前に開始することができる。一部の場合では、短期免疫抑制は、移植の約７日前に開始することができる。
【0228】
短期免疫抑制の期間（例えば、免疫抑制剤および／または抗炎症剤の最初の用量および最後の用量を投与する間の時間の長さ）は、約または最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日であり得る。一部の場合では、短期免疫抑制の期間は、約または最長で約３０日であり得る。一部の場合では、短期免疫抑制の期間は、約２８日であり得る。
【0229】
一部の場合では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を、移植の最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日後に投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を、移植の最長で約２１日後に投与することを含む。
【0230】
一部の場合では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を、移植の約または最長で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３５または５０日前に始めて投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を、移植の約または最長で約７日前に始めて投与することを含む。
【0231】
一部の場合では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を、約または最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日の期間、投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、ｍＴＯＲ阻害剤を、約または最長で約２８日の期間、投与することを含む。
【0232】
ｍＴＯＲ阻害剤は、０日目の移植に対して、約、例えば、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５日目のうちの任意の１日またはそれよりも多く、短期抑制のために投与することができる。一部の場合では、ｍＴＯＲ阻害剤は、０日目の移植に対して、約－７日目から２１日目に短期抑制のために投与することたできる。
【0233】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を、移植の最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日後に投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を、移植の最長で約２１日後に投与することを含む。
【0234】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を、移植の約または最長で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３５または５０日前に始めて投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を、移植の約または最長で約７日前に始めて投与することを含む。
【0235】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を、約または最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日の期間、投与することを含む。一部の実施形態では、短期免疫抑制は、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を、約または最長で約２８日の期間、投与することを含む。
【0236】
抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤は、０日目の移植に対して、約、例えば、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５日目のうちの任意の１日またはそれよりも多く、短期抑制のために投与することができる。一部の場合では、抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤は、０日目の移植に対して、約－７、０、３、７、１０、１４および２１日目に、短期抑制のために投与することができる。
【0237】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を、移植の最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日後に投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を、移植の最長で約２１日後に投与することを含む。
【0238】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を、移植の約または最長で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３５または５０日前に始めて投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を、移植の約または最長で約７日前に始めて投与することを含む。
【0239】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を、約または最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日の期間、投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を、約または最長で約２８日の期間、投与することを含む。
【0240】
抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤は、０日目の移植に対して、約、例えば、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５日目のうちの任意の１日またはそれよりも多く、短期抑制のために投与することができる。一部の場合では、抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤は、０日目の移植に対して、約－７、０、７、１４および２１日目に、短期抑制のために投与することができる。
【0241】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を、移植の最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日後に投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を、移植の最長で約１４日後に投与することを含む。
【0242】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を、移植の約または最長で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３５または５０日前に始めて投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を、移植の約または最長で約８日前に始めて投与することを含む。
【0243】
一部の場合では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を、約または最長で約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４２、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００日の期間、投与することを含む。一部の場合では、短期免疫抑制は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を、約または最長で約２２日の期間、投与することを含む。
【0244】
抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、０日目の移植に対して、約、例えば、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５日目のうちの任意の１日またはそれよりも多く、短期抑制のために投与することができる。一部の場合では、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤は、０日目の移植に対して、約－８、－１、７および１４日目に、短期抑制のために投与することができる。
【0245】
一部の場合では、短期免疫抑制は、１種または複数の免疫抑制剤（例えば、免疫調節分子）を投与することを含むことができる。１種または２種以上の免疫抑制剤／免疫抑制薬は、一緒にまたは連続して使用することができる。免疫抑制剤としては、限定されるものではないが、抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ－アルファ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、α１－アンチトリプシン、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、ＩＦＮ－γ、ＮＦκＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９）、それらの任意の組合せ、またはそれらの任意の断片が挙げられる。一部の場合では、ＮＦκＢ阻害剤は、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せである。Ｂ細胞標的化生物製剤の非限定的な例としては、抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブが挙げられる。任意のこれらの追加の免疫抑制剤は、移植の前および／または後に対象に与えられ得る。
【0246】
一部の場合では、短期免疫抑制のために使用される免疫抑制剤は、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、アレムツズマブ（キャンパス）、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、ダクリズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（シムレクト）、インフリキシマブ（レミケード）、シクロスポリン、デオキシスペルグアリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／ソリリス）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、抗ＣＤ１５４－Ａｂ、レフルノミド、抗ＩＬ－２Ｒ－Ａｂ、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体、ヒト抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、ＣＤ４０アンタゴニスト、ならびにＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）アンタゴニストのうちのいずれか１種または複数であり得る。
【0247】
一部の場合では、短期免疫抑制のために使用される免疫抑制剤は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ３ｅ、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４０、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ５２、α－４インテグリン、ｍＴＯＲ（ラパマイシン、エベロリムス、セロリムスのメカニスティク標的）、ＤＮＡ合成、またはそれらの任意の組合せを標的とすることができる。
【0248】
一部の場合では、短期免疫抑制のために使用される免疫抑制剤は、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用遮断物質、非選択的枯渇剤、カルシニューリン阻害剤、共刺激シグナル遮断物質、サイトカイン遮断物質、リンパ球枯渇剤、細胞接着阻害剤、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、細胞周期ブロッカー、またはそれらの任意の組合せであり得る。例えば、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用遮断物質は、抗ａｂＴＣＲ ｍＡｂ Ｔ１０Ｂ９であり得る。例えば、非選択的枯渇剤は、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）または抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）であり得る。例えば、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンまたはタクロリムスであり得る。例えば、共刺激シグナル遮断物質は、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ、アバタセプト、イピリムマブ、抗ＰＤ－１（ペムブロリズマブなど）、抗ＰＤ－Ｌ１（ＭＰＤＬ３２８０Ａなど）、抗ＣＤ１５４ ｍＡｂ、抗ＣＤ４０ ｍＡｂまたは抗ＩＣＯＳ ｍＡｂであり得る。例えば、サイトカイン遮断物質は、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ダクリズマブまたはバシリキシマブなど）、抗ＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴルおよびゴリムマブ）、抗ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｍＡｂ（クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、オロキズマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アクテムラなど）または抗ＩＬ－７ ｍＡｂであり得る。例えば、リンパ球枯渇剤は、抗ＣＤ２ ｍＡｂ、ＩｇＧ１との融合タンパク質（アレファセプトなど）、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（リツキシマブなど）または抗ＣＤ５２ ｍＡｂ（アレムツズマブなど）であり得る。例えば、細胞接着阻害剤は、抗ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４（ＶＬＡ４）（ナタリズマブなど）であり得る。例えば、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、シロリムス（ラパマイシン）またはエベロリムスであり得る。例えば、細胞周期ブロッカーは、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはアザチオプリンであり得る。
投与方法
投与方法
【0249】
細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法が、本明細書で提供される。移植片は、異種移植片であることもあり、または同種移植片であることもある。方法は、寛容化ワクチンを含む組成物をまたは前処置レジメンを対象に投与するステップを含み得る。投与は、静脈内注入により得る。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与は、移植レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片に対する長期寛容をもたらすことができる。
【0250】
本明細書で開示される寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンは、レシピエントにおける移植片（例えば、異種グラフトまたは同種グラフト移植片）の生存期間を少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、または少なくとも１０年間増加させることができる。本明細書で開示される寛容化ワクチンまたは前処置レジメンはまた、移植後の免疫抑制の必要を低減または消失させることができる。
【0251】
異種グラフトまたは同種グラフト移植片は、臓器、組織、細胞、または幹細胞から分化した細胞を含む、臓器、組織、細胞、または細胞系であり得る。移植片および寛容化ワクチンは、異なるドナーからのものであることもあり、または同じドナーからのものであることもある。移植片および寛容化ワクチンは、異なる種からのものであることもあり、または同じ種からのものであることもある。一部の場合には、異種グラフト移植片および寛容化ワクチンは、実質的に遺伝学的に同一である異なるドナーからのものであることもある。
【0252】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの１または複数の用量を、移植レシピエントに投与することができる。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの１または複数の用量を、細胞、組織もしくは臓器が移植される前および／または移植中および／または移植された後に投与することができる。細胞、組織または臓器の移植日は、０日目と言うことができる。０日目を基準にして先行する日（レシピエントがグラフト細胞、組織または臓器を受け取る日）は、負の数によって述べることができる。例えば、グラフト細胞、組織または臓器の７日前に投与される寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、－７日目に投与されると表すことができる。同様に、レシピエントが移植細胞、臓器または組織を受け取る日より後の日は、正の数によって述べることができる。例えば、グラフト細胞、組織または臓器の７日後に投与される寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、７日目または＋７日目に投与されると表すことができる。
【0253】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日または６０日前に投与される。
【0254】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の最大でも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日または６０日前には投与される。
【0255】
一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日または６０日前に投与される。
【0256】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの用量は、レシピエントがグラフト細胞、組織または臓器を受け取る同じ日に投与される（例えば、用量は、０日目に投与される）。０日目に投与される用量を、グラフト細胞、組織もしくは臓器と同時に投与することができ、またはグラフト細胞、組織もしくは臓器の２４時間以内に投与することができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器を基準にして－２３、－２２、－２１、－２０、－１９、－１８、－１７、－１６、－１５、－１４、－１３、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３時間の時点で投与され得る。
【0257】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日または６０日後に投与される。
【0258】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の最大でも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日または６０日後には投与される。
【0259】
一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日または６０日後に投与される。
【0260】
前処置レジメンは、グラフト細胞、組織もしくは臓器の移植前および／または移植中および／または移植後に寛容化ワクチンの複数用量を含み得る。複数用量は、初回用量および１または複数のブースター用量を含むと言うことができる。初回用量は、グラフト細胞、組織または臓器の移植の前にまたはそれと同時に存在し得る。ブースター用量は、投与される場合、初回用量の後に存在する。寛容化ワクチンの初回用量がいつ投与されるのかに依存して、１または複数のブースター用量をグラフト細胞、組織もしくは臓器の移植の前におよび／または移植と同時におよび／または移植の後に投与することができる。
【0261】
寛容化ワクチン／レジメンの後続の（例えば、ブースター）用量は、先行する用量（例えば、初回用量）後に任意の時間間隔で投与され得る。例えば、後続の用量は、先行する用量の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、９０日、１２０日、１５０日または１８０日後に投与され得る。初回用量がいつ投与されるのかに依存して、後続の（例えば、ブースター）用量を、グラフト細胞、組織もしくは臓器の移植の前におよび／または移植と同時におよび／または移植の後に投与することができる。一部の場合には、前処置レジメンは、移植の前に寛容化ワクチンの少なくとも１用量を含む。一部の場合には、前処置レジメンは、移植の前に寛容化ワクチンの少なくとも２用量（例えば、初回用量およびブースター用量）を含む。一部の場合には、前処置レジメンは、移植の前に寛容化ワクチンの少なくとも３用量（例えば、初回用量および２用量のブースター用量）を含む。一部の場合には、前処置レジメンは、寛容化ワクチンの初回用量を移植の前に含み、ブースターワクチンの少なくとも１用量をグラフト細胞、組織もしくは臓器の移植と同時にもしくは移植の後に含む。
【0262】
一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの２用量が投与され得る。初回用量は、例えば、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして－１４、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６または７日目に投与され得る。２回目用量は、例えば、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日目に投与され得る。一部の実施形態では、初回用量は、－８日目に投与され、２回目用量は、－１日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－８日目に投与され、２回目用量は、０日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－８日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－７日目に投与され、２回目用量は、－１日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－７日目に投与され、２回目用量は、０日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－７日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－１２日目に投与され、２回目用量は、－４日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－１１、－１２、－１３または－１４日目に投与され、２回目用量は、－３、－４、－５または－６日目に投与される。
【0263】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメン（例えば、ブースターワクチン）の２回目用量は、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２９日目、２８日目、２７日目、２６日目、２５日目、２４日目、２３日目、２２日目、２１日目、２０日目、１９日目、１８日目、１７日目、１６日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、寛容化ワクチン（例えば、ブースターワクチン）の２回目用量は、ドナー細胞、臓器および／または組織の移植の１日後に投与され得る。一部の場合には、寛容化ワクチンの２回目用量は、０日目に移植ドナー細胞、臓器および／または組織に不随して投与される。一部の場合には、寛容化ワクチンの２回目用量は、必要とされない。
【0264】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの３回目用量が投与され得る。初回用量は、例えば、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして－１４、－１０、－９、－８、－７、－６、－５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６または７日目に投与され得る。２回目用量は、例えば、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日目に投与され得る。３回目用量は、例えば、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、２５０、３００、３５０または３６５日目に投与され得る。一部の実施形態では、初回用量は、－８日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与され、３回目用量は、７日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－８日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与され、３回目用量は、１４日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－８日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与され、３回目用量は、２１日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－７日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与され、３回目用量は、７日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－７日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与され、３回目用量は、１４日目に投与される。一部の実施形態では、初回用量は、－７日目に投与され、２回目用量は、１日目に投与され、３回目用量は、２１日目に投与される。
【0265】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメン（例えば、ブースターワクチン）の３回目用量は、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして３００日目、２００日目、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２９日目、２８日目、２７日目、２６日目、２５日目、２４日目、２３日目、２２日目、２１日目、２０日目、１９日目、１８日目、１７日目、１６日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、寛容化ワクチンは、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、もしくは７～１日目に、約３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、もしくは７～１日目に、投与され得る。
【0266】
一部の場合には、寛容化ワクチン／レジメン（例えば、ブースターワクチン）の４回目用量が、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして６００日目、５００日目、４００日目、３００日目、２００日目、１００、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２９日目、２８日目、２７日目、２６日目、２５日目、２４日目、２３日目、２２日目、２１日目、２０日目、１９日目、１８日目、１７日目、１６日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、寛容化ワクチンは、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして、６００～５００、５００～４００、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、または約６００～５００、５００～４００、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、投与され得る。
【0267】
一部の場合には、寛容化ワクチン（例えば、ブースターワクチン）の５回目用量が、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして、１，０００日目、９００日目、８００日目、７００日目、６００日目、５００日目、４００日目、３００日目、２００日目、１００、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２９日目、２８日目、２７日目、２６日目、２５日目、２４日目、２３日目、２２日目、２１日目、２０日目、１９日目、１８日目、１７日目、１６日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、寛容化ワクチンは、０日目のドナー細胞、臓器および／または組織の移植を基準にして、１，０００～９００、９００～８００、８００～７００、７００～６００、６００～５００、５００～４００、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、または約１，０００～９００、９００～８００、８００～７００、７００～６００、６００～５００、５００～４００、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、投与され得る。
【0268】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの投与は、移植レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片に対する長期寛容をもたらすことができる。一部の場合には、長期寛容は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１３ヶ月、少なくとも１４ヶ月、少なくとも１５ヶ月、少なくとも１６ヶ月、少なくとも１７ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも１９ヶ月、少なくとも２０ヶ月、少なくとも２１ヶ月、少なくとも２２ヶ月、少なくとも２３ヶ月または少なくとも２４ヶ月間である。一部の場合には、長期寛容は、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年または少なくとも１０年間である。一部の場合には、長期寛容は、ブースターワクチンまたはブースターレジメンの非存在下で実現される。一部の場合には、長期寛容は、ブースターワクチンまたはブースターレジメンの１または複数の用量の投与で実現される。一部の場合には、１または複数のブースターワクチン用量は、移植の当日に投与されるか、または移植の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日、１１０日、１１５日、１２０日、１２５日、１３０日、１３５日、１４０日、１４５日、１５０日、１５５日、１６０日、１６５日、１７０日、１７５日、１８０日、１８５日、１９０日、１９５日、２００日、２０５日、２１０日、２１５日、２２０日、２３０日もしくは２４０日後に、投与される。ある特定の場合には、前処置レジメンの１または複数（例えば、３）用量は、移植の前に投与され、１または複数のブースターワクチンの用量は、移植の１、７、１４、２１、９０または最大１８０日後に投与される。
【0269】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの用量は、寛容化ワクチンのレシピエントの体重に基づいて変わり得る。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの用量は、約１×１０１細胞／ｋｇ、１×１０２細胞／ｋｇ、１×１０３細胞／ｋｇ、１×１０４細胞／ｋｇ、１×１０５細胞／ｋｇ、１×１０６細胞／ｋｇ、１×１０７細胞／ｋｇ、１×１０８細胞／ｋｇ、１×１０９細胞／ｋｇ、１×１０１０細胞／ｋｇ、１×１０１１細胞／ｋｇ、１×１０１２細胞／ｋｇ、またはそれを超える用量を含み得る。一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメン用量は、約１×１０１～１×１０２細胞／ｋｇ、１×１０２～１×１０３細胞／ｋｇ、１×１０３～１×１０４細胞／ｋｇ、１×１０４～１×１０５細胞／ｋｇ、１×１０５～１×１０６細胞／ｋｇ、１×１０６～１×１０７細胞／ｋｇ、１×１０７～１×１０８細胞／ｋｇ、１×１０８～１×１０９細胞／ｋｇ、１×１０９～１×１０１０細胞／ｋｇ、１×１０１０～１×１０１１細胞／ｋｇ、１×１０１１～１×１０１２細胞／ｋｇを含み得る。例えば、投与のための寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの用量は、約０．０１×１０９細胞／ｋｇ、０．０２×１０９細胞／ｋｇ、０．０３×１０９細胞／ｋｇ、０．０４×１０９細胞／ｋｇ、０．０５×１０９細胞／ｋｇ、０．０６×１０９細胞／ｋｇ、０．０７×１０９細胞／ｋｇ、０．０８×１０９細胞／ｋｇ、０．０９×１０９細胞／ｋｇ、０．１×１０９細胞／ｋｇ、０．２×１０９細胞／ｋｇ、０．２１×１０９細胞／ｋｇ、０．２２×１０９細胞／ｋｇ、０．２３×１０９細胞／ｋｇ、０．２４×１０９細胞／ｋｇ、０．２５×１０９細胞／ｋｇ、０．２６×１０９細胞／ｋｇ、０．２７×１０９細胞／ｋｇ、０．２８×１０９細胞／ｋｇ、０．２９×１０９細胞／ｋｇ、０．３×１０９細胞／ｋｇ、０．４×１０９細胞／ｋｇ、０．５×１０９細胞／ｋｇ、０．６×１０９細胞／ｋｇ、０．７×１０９細胞／ｋｇ、０．８×１０９細胞／ｋｇ、０．９×１０９細胞／ｋｇ、１．０×１０９細胞／ｋｇ、１．５×１０９細胞／ｋｇ、２．０×１０９細胞／ｋｇ、２．５×１０９細胞／ｋｇ、３．０×１０９細胞／ｋｇ、３．５×１０９細胞／ｋｇ、４．０×１０９細胞／ｋｇ、４．５×１０９細胞／ｋｇ、５．０×１０９細胞／ｋｇ、５．５×１０９細胞／ｋｇ、６．０×１０９細胞／ｋｇ、６．５×１０９細胞／ｋｇ、７．０×１０９細胞／ｋｇ、７．５×１０９細胞／ｋｇ、８．０×１０９細胞／ｋｇ、８．５×１０９細胞／ｋｇ、９．０×１０９細胞／ｋｇ、９．５×１０９細胞／ｋｇ、１０．０×１０９細胞／ｋｇ、または２５．０×１０９細胞／ｋｇであり得る。
【0270】
一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメン用量は、少なくとも約１×１０４細胞／ｋｇ、５×１０４細胞／ｋｇ、１×１０５細胞／ｋｇ、５×１０５細胞／ｋｇ、１×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ、１×１０７細胞／ｋｇ、５×１０７細胞／ｋｇ、１×１０８細胞／ｋｇ、２×１０８細胞／ｋｇ、３×１０８細胞／ｋｇ、４×１０８細胞／ｋｇ、５×１０８細胞／ｋｇ、６×１０８細胞／ｋｇ、７×１０８細胞／ｋｇ、８×１０８細胞／ｋｇ、９×１０８細胞／ｋｇ、１×１０９細胞／ｋｇ、１×１０１０細胞／ｋｇ、またはそれを超える用量を含み得る。
【0271】
本明細書における方法は、レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくともまたは少なくとも約０．２５×１０９の細胞（例えば、アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）、例えばＥＣＤＩ処理細胞、例えばＥＣＤＩ処理白血球、またはアポトーシス性間葉系間質細胞）を投与するステップを含み得る。例えば、レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくともまたは少なくとも約１×１０７、１×１０８、０．２５×１０９、０．５０×１０９、０．７５×１０９、１．００×１０９、１．２５×１０９、１．５０×１０９、１．７５×１０９もしくは２×１０９の細胞（例えば、ＥＣＤＩ処理細胞、例えばＥＣＤＩ処理白血球）である、ＥＣＤＩ処理細胞が投与され得る。
【0272】
細胞は、白血球、例えば、脾細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、幹細胞由来白血球またはこれらの組合せを含み得る。脾細胞、ＰＢＭＣ、幹細胞由来白血球またはこれらの組合せは、Ｂ細胞またはＢリンパ球を含み得る。細胞は、初代細胞、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅された細胞、細胞系の細胞、またはこれらの組合せを含み得る。細胞は、間葉系間質細胞を含み得る。
【0273】
各用量を投与するための寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンの細胞が、輸注に好適な体積に浮遊していることもある。例えば、細胞は、約０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．３ｍｌ、０．４ｍｌ、０．５ｍｌ、０．６ｍｌ、０．７ｍｌ、０．８ｍｌ、０．９ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１１ｍｌ、１２ｍｌ、１３ｍｌ、１４ｍｌ、１５ｍｌ、１６ｍｌ、１７ｍｌ、１８ｍｌ、１９ｍｌ、２０ｍｌ、２１ｍｌ、２２ｍｌ、２３ｍｌ、２４ｍｌ、２５ｍｌ、２６ｍｌ、２７ｍｌ、２８ｍｌ、２９ｍｌ、３０ｍｌ、３１ｍｌ、３２ｍｌ、３３ｍｌ、３４ｍｌ、３５ｍｌ、３６ｍｌ、３７ｍｌ、３８ｍｌ、３９ｍｌ、４０ｍｌ、４１ｍｌ、４２ｍｌ、４３ｍｌ、４４ｍｌ、４５ｍｌ、４６ｍｌ、４７ｍｌ、４８ｍｌ、４９ｍｌ、５０ｍｌ、６０ｍｌ、７０ｍｌ、８０ｍｌ、９０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌまたは５００ｍｌの体積に浮遊していることがある。例えば、各用量を投与するための寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞は、約０．１ｍｌ～１ｍｌ、１ｍｌ～１０ｍｌ、１０ｍｌ～５０ｍｌ、５０ｍｌ～１００ｍｌ、１００ｍｌ～２００ｍｌ、２００ｍｌ～３００ｍｌ、３００ｍｌ～４００ｍｌ、または４００ｍｌ～５００ｍｌの体積に浮遊していることもある。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの７５×１０６細胞が、０．５ｍｌの体積に浮遊していることもある。
【0274】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンを、レシピエントの体重に依存して変わる体積で（例えば、静脈内注入により）投与することができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくともまたは少なくとも約０．０１ｍｌ、０．１ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌまたは５０ｍｌ、例えば、レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくともまたは少なくとも約０．０１～０．１、０．１～１、１～２、２～３、３～４、４～５、１～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、または４０～５０ｍｌの体積で、静脈内投与され得る。一部の場合には、寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ処理細胞を含む）は、レシピエントの体重１ｋｇ当たり約７ｍｌの体積で静脈内投与される。
【0275】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのブースター用量は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの初回用量より少ない細胞を含み得る。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンのブースター用量または後続の用量は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの初回用量または先行する用量より約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％もしくは７５％少ないまたはそれ未満の細胞を含み得る。
【0276】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞は、対象への投与後に循環半減期を有し得る。一部の場合には、本明細書に記載の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、少なくともまたは少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１８、２４、３６、４８、６０または７２時間の循環半減期を有し得る。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメン細胞の循環半減期は、０．１～０．５、０．５～１．０、１．０～２．０、１．０～３．０、１．０～４．０、１．０～５．０、５～１０、１０～１５、１５～２４、２４～３６、３６～４８、４８～６０、もしくは６０～７２時間、または約０．１～０．５、０．５～１．０、１．０～２．０、１．０～３．０、１．０～４．０、１．０～５．０、５～１０、１０～１５、１５～２４、２４～３６、３６～４８、４８～６０、もしくは６０～７２時間、であり得る。一部の場合には、本明細書に記載の寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、少なくともまたは少なくとも約３時間の循環半減期を有し得る。
【0277】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞を、それらの循環半減期を向上させるように処理することができる。そのような処理は、タンパク質、例えばＣＤ４７、で細胞をコーティングすることを含む。その循環半減期を向上させるように処理される細胞は、非アポトーシス性細胞であることがある。その循環半減期を向上させるように処理される細胞は、アポトーシス性細胞であることもある。あるいは、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンにおける細胞を、その循環半減期を向上させるように遺伝子改変すること（例えば、そのゲノム内にＣＤ４７などの導入遺伝子を挿入すること）ができる。その循環半減期を向上させるように遺伝子改変される細胞は、非アポトーシス性細胞であることがある。その循環半減期を向上させるように遺伝子改変される細胞は、アポトーシス性細胞であることもある。
【0278】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、グラフトレシピエントを寛容化してグラフト拒絶反応を防止または遅延させるため、移植において、例えば異種移植においてまたは同種移植において、有利であり得る。免疫抑制療法（例えば、１つまたは複数の免疫調節分子）を使用せずに、寛容化または前処置レジメンをグラフトレシピエントにもたらすことができる。しかし、一部の場合には、移植拒絶反応を防止、減少または遅延させるために、他の免疫抑制療法を寛容化ワクチンと組み合わせて使用することができる。
【0279】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンをアジュバント（例えば、１つまたは複数の免疫調節分子）とともにまたはなしで投与することができる。一部の場合には、アジュバントは、抗原提示細胞の活性化および成熟を阻害することにより寛容化ワクチンの免疫寛容原性を増強する。
【0280】
一部の実施形態では、免疫調節分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ３ｅ、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４０、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ５２、α－４インテグリン、ｍＴＯＲ、ＤＮＡ合成、炎症促進性経路の分子（例えば、サイトカイン）、α１－アンチトリプシン、ＮＦｋＢ、またはこれらの任意の組合せを標的とすることができる。一部の実施形態では、免疫調節分子は、ＮＦｋＢ阻害剤（例えば、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ））である。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫調節分子は、Ｂ細胞を標的とすることができる（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）。一部の実施形態では、Ｂ細胞を標的とする生物製剤は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）または他のＢ細胞枯渇抗体であり得る。一部の実施形態では、免疫調節分子は、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用遮断物質、非選択的枯渇剤、カルシニューリン阻害剤、共刺激シグナル遮断物質、サイトカイン遮断物質、Ｂ細胞をモジュレートする薬剤、リンパ球枯渇剤、細胞接着阻害剤、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、細胞周期ブロッカー、またはこれらの任意の組合せであり得る。例えば、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用遮断物質は、抗ａｂＴＣＲ ｍＡｂ Ｔ１０Ｂ９であり得る。例えば、非選択的枯渇剤は、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）または抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）であり得る。例えば、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンまたはタクロリムスであり得る。例えば、共刺激シグナル遮断物質は、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ、アバタセプト、イピリムマブ、抗ＰＤ－１（例えば、ペムブロリズマブ）、抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、抗ＣＤ１５４ ｍＡｂ、Ｆｃが操作された抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ、または抗ＩＣＯＳ ｍＡｂであり得る。例えば、サイトカイン遮断物質は、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（例えば、ダクリズマブもしくはバシリキシマブ）、抗ＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、およびゴリムマブ）、抗ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｍＡｂ（例えば、トシリズマブ、アクテムラ、クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、サリルマブ、オロキズマブ）、または抗ＩＬ－７ ｍＡｂであり得る。例えば、リンパ球枯渇剤は、抗ＣＤ２ ｍＡｂ、ＩｇＧ１との融合タンパク質（例えば、アレファセプト）、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）、または抗ＣＤ５２ ｍＡｂ（例えば、アレムツズマブ）であり得る。例えば、細胞接着阻害剤は、抗ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４（ＶＬＡ４）（例えば、ナタリズマブ）であり得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムス（ラパマイシン）またはエベロリムスまたは任意の他のｍＴＯＲ阻害剤であり得る。例えば、細胞周期ブロッカーは、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはアザチオプリンであり得る。一部の実施形態では、免疫調節分子は、Ｔ細胞再循環阻害剤（例えば、ＦＴＹ７２０および他のスフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニスト）であり得る。
【0281】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを、Ｔ細胞活性化を阻害する１つまたは複数の免疫調節分子とともにまたはなしで投与することができる。Ｔ細胞活性化を阻害する免疫調節分子は、抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）剤であり得る。抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ剤は、抗体、例えばアンタゴニスト抗体であり得る。抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体断片ＣＤＰ７６５７であり得る。抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、ＦｃＲが操作された、Ｆｃサイレント抗ＣＤ４０Ｌモノクローナルドメイン抗体、Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌ抗体、または別様にＦｃが操作された抗ＣＤ４０Ｌ抗体であり得る。抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ剤は、２Ｃ１０、２Ｃ１０Ｒ４、ＡＳＫＰ１２４０、４Ｄ１１、ブレセルマブ、ＢＩ－６５５０６４、ＨＣＤ１２２、ＣＦＺ５３３、ｃｈ５Ｄ１２、ＦＦＰ１０４、ＣＤＰ７６５７、ＢＧ９５８８、ルプリズマブ、トラリズマブ、ＩＤＥＣ－１３１、ダピロリズマブ、レトリズマブ、ＢＭＳ－９８６００４、ＶＩＢ４９２０、またはＭＥＤＩ４９２０であり得る。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、本明細書に記載の１つまたは複数のさらなる免疫調節分子とともに、例えば、Ｂ細胞を標的とする生物製剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ－アルファ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、α１ーアンチトリプシン、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、ＩＦＮ－γ、ＮＦκＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９）、これらの任意の組合せ、またはそれらの任意の断片のうちの１つまたは複数とともに、さらに投与することができる。一部の場合には、ＮＦκＢ阻害剤は、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはこれらの組合せである。Ｂ細胞を標的とする生物製剤の非限定的な例としては、リツキシマブ、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。一部の場合には、前処置レジメンの一部としての投与のための免疫調節分子を同種移植片または異種移植片に適応させることができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、異種移植の際にＢ細胞枯渇抗体とともに投与される。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、同種移植の際にはＢ細胞枯渇抗体とともに投与する必要がない。
【0282】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンを、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、抗ＩＬ－６Ｒ抗体（サリルマブ、トシリズマブ、アクテムラ）、抗ＩＬ－６抗体（クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、オロキズマブ）、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、抗ＣＤ１５４－Ａｂ、レフルノミド、抗ＩＬ－２Ｒ－Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体、ヒト抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、ＣＤ４０アンタゴニスト、およびＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）アンタゴニストなどの、１つもしくは複数の免疫調節分子とともに、またはそのような１つもしくは複数の免疫調節分子に加えて、投与することができる。Ｂ細胞を標的とする生物製剤の非限定的な例としては、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【0283】
寛容化ワクチン／レジメンまたは前処置レジメンを、１つもしくは複数の免疫抑制剤／薬とともに、または１つもしくは複数の免疫抑制剤／薬に加えて、投与することができる。例えば、１つまたは複数の免疫抑制剤／薬を、誘導療法にまたは維持療法に使用することができる。同じまたは異なる薬物を誘導および維持段階中に使用することができる。例えば、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、ラパマイシン、エベロリムス）が維持療法に使用される。別の例では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、ラパマイシン、エベロリムス）が維持療法に使用される。全身照射、胸腺照射、ならびに脾全および／または部分摘出術を含むがこれらに限定されない、非投薬レジメンを使用して、免疫抑制を実現することもできる。これらの技法を、１つまたは複数の免疫抑制薬または剤と組み合わせて使用することもできる。
【0284】
一部の実施形態では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを、本明細書で開示される少なくとも１つの抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤とともに投与することができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤は、移植の前に投与される本明細書に記載の前処置レジメンの一部である。一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、少なくとも１つの抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤と同時に、またはその前にもしくは後に投与される。一部の実施形態では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、１つもしくは複数のさらなる免疫抑制剤、ならびに／または抗ＣＤ４０剤（例えば、抗体）および／もしくは抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）剤との併用ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ遮断物質とともに、またはその前もしくは後に投与することもできる。追加の免疫抑制剤を、例えば、対象における寛容化ワクチンの免疫寛容原性有効性を増強するために、対象に投与することができる。追加の免疫抑制剤は、抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ－アルファ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、α１－アンチトリプシン、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、ＩＦＮ－γ、ＮＦκＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９）、これらの任意の組合せ、またはそれらの任意の断片を含み得る。一部の場合には、ＮＦκＢ阻害剤は、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはこれらの組合せである。Ｂ細胞を標的とする生物製剤の非限定的な例としては、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。これらの追加の免疫抑制剤のいずれかを移植の前および／または後に対象に投与することができる（図４）。
【0285】
追加の免疫抑制剤を寛容化ワクチンもしくは前処置レジメンの投与の前、投与の後および／または投与中に投与することができる。一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして－１００日目～０日目の間に、例えば、－９０日目、－８０日目、－７０日目、－６０日目、－５０日目、－４０日目、－３０日目、－２０日目、－１５日目、－１４日目、－１３日目、－１２日目、－１１日目、－１０日目、－９日目、－８日目、－７日目、－６日目、－５日目、－４日目、－３日目、－２日目、－１日目または０日目に投与され得る。一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンに付随して投与され得る。一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして－１００～－５０、－５０～－４０、－４０～－３０、－３０～－２０、－２０～－１０、－１０～－５、－１０～－１、－７～－１、－１０～０、もしくは－７～０日目に、または約－１００～－５０、－５０～－４０、－４０～－３０、－３０～－２０、－２０～－１０、－１０～－５、－１０～－１、－７～－１、－１０～０、もしくは－７～０日目に、投与され得る。
【0286】
一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして０日目～１００日目の間に、例えば、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２８日目、２１日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、２１～１、１４～１、７～１、２１～０、１４～０、もしくは７～０日目に、または約１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、２１～１、１４～１、７～１、２１～０、１４～０、もしくは７～０日目に、投与され得る。
【0287】
一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして０日目～３００日目の間に、例えば、３００日目、２００日目、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、または約３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、投与され得る。
【0288】
一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして０日目～６００日目の間に、例えば、６００日目、５００日目、４００日目、３００日目、２００日目、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして６００～５００日目、５００～４００日目、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、または約６００～５００日目、５００～４００日目、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、投与され得る。
【0289】
一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして０日目～１０００日目の間に、例えば、１０００日目、９００日、８００日、７００日、６００日目、５００日目、４００日目、３００日目、２００日目、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与され得る。例えば、免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与を基準にして１０００～９００、９００～８００、８００～７００、７００～６００、６００～５００日目、５００～４００日目、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、または約１０００～９００、９００～８００、８００～７００、７００～６００、６００～５００日目、５００～４００日目、４００～３００、３００～２００、２００～１００、１００～５０、５０～４０、４０～３０、３０～２０、２０～１０、１０～５、７～１日目に、投与され得る。
【0290】
一部の場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンが投与される日に投与され得る。他の場合には、追加の免疫抑制は、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与の前および後に投与され得る。例えば、シクロホスファミドが寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与後３日目または約３日目に投与され得る。
【0291】
免疫寛容原性有効性調節因子（例えば、シクロホスファミド）を５～１００ｍｇ／ｋｇ／日または約５～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。単位「ｍｇ／ｋｇ／日」は、１日当たりの対象の体重１ｋｇ当たりの投与される免疫寛容原性調節因子のミリグラム数を指すことができる。一部の場合には、免疫寛容原性有効性調節因子（例えば、シクロホスファミド）は、２０ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日～８０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日～７０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日、もしくは４０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日、または約２０ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日～８０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日～７０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日、もしくは４０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、投与され得る。
【0292】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、細胞、臓器および／または組織の拒絶反応を防止または遅延させるために必要とされる免疫抑制の用量を低減させることおよび／または期間を短縮することができる。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、維持免疫抑制を必要とすることなく細胞、臓器および／または組織の生存を延長することができる。
【0293】
一部の場合には、移植レシピエントは、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与後に免疫抑制を必要としないことがある。
【0294】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、必要とされる免疫抑制の用量を少なくともまたは少なくとも約５％低減させることができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、免疫抑制剤の必要用量を少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減させることができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、免疫抑制剤の必要用量を少なくともまたは少なくとも約５～１０、５～２５、２５～５０、５０～７５、７５～８５、８５～９０、９０～９５、または９５～１００％低減させることができる。本明細書で使用される場合の用語「低減する／させる」およびその文法的等価表現は、１つまたは複数の細胞、臓器および／または組織がレシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に移植されるときの免疫抑制の必要用量と比較して少ない免疫抑制を使用することを指すことがある。用語「低減する／させる」は、１つまたは複数の細胞、臓器および／または組織がレシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に移植されるときの免疫抑制薬の必要用量と比較して少ない免疫抑制薬または剤を使用することを指すこともある。
【0295】
レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制剤の低減用量を、移植後、少なくともまたは少なくとも約１、５、７、１０、１４、２０、２１、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、９００または１，０００日間、例えば、少なくともまたは少なくとも約１～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～６０、６０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１，０００日間、必要とすることもある。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制剤の低減用量を、移植後、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６ヶ月間、例えば、移植後、少なくともまたは少なくとも約１～２、２～３、３～６、６～９、９～１２、１２～１８、１８～２４、２４～３０、３０～３６ヶ月間、必要とすることもある。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制剤の低減用量を、移植後、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０年間、例えば、移植後、少なくともまたは少なくとも約１～２、２～３、３～４、４～５、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０年間、必要とすることもある。一部の場合には、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制剤の低減用量を最長でレシピエントの生涯にわたって必要とすることもある。
【0296】
レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制を、移植後、少なくともまたは少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、９００または１，０００日間、例えば、少なくともまたは少なくとも約１～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～６０、６０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１，０００日間、必要としないこともある。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制剤の低減用量を、移植後、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６ヶ月間、例えば、移植後、少なくともまたは少なくとも約１～２、２～３、３～６、６～９、９～１２、１２～１８、１８～２４、２４～３０、３０～３６ヶ月間、必要とすることもある。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制剤の低減用量を、移植後、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０年間、例えば、少なくともまたは少なくとも約１～２、２～３、３～４、４～５、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０年間、必要とすることもある。一部の場合には、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、免疫抑制を最長でレシピエントの生涯にわたって必要としないこともある。
【0297】
対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）における移植されたグラフト（例えば、同種グラフトまたは異種グラフト）の生存を延長するための非限定的な例示的手法は、図３および図４に示されている。一部の実施形態では、対象（グラフトレシピエント）は、グラフトドナーまたは別のドナーに由来するアポトーシス性細胞の注入（例えば、静脈内注入）（例えば、一過性免疫抑制の援護のもとでアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）を用いる寛容化ワクチン接種）を受ける。一部の場合には、同じドナーが、移植のための同種グラフトまたは異種グラフト（例えば、膵島、腎臓）も、寛容化ワクチンとしての細胞（例えば、脾細胞、脾Ｂ細胞、末梢血白血球、末梢血Ｂ細胞、アポトーシス性白血球、またはこれらの組合せ）も、提供することがある。
【0298】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞は、移植に使用される細胞、臓器および／または組織と同じ遺伝子型および／または表現型を有し得る。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンと移植片の遺伝子型および／または表現型が異なることもある。移植レシピエントに使用される寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、移植グラフトドナーからの細胞を含むことがある。移植レシピエントに使用される寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、移植のグラフトとは遺伝学的におよび／または表現型的に異なる細胞を含むことがある。一部の場合には、移植レシピエントに使用される寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、移植グラフトドナーからの細胞と、移植グラフトとは遺伝学的におよび／または表現型的に異なる細胞とを含むこともある。移植グラフトとは遺伝学的におよび／または表現型的に異なる細胞は、移植グラフトドナーの同じ種の動物からのものであり得る。
【0299】
一部の場合には、遺伝子改変細胞を含む寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、免疫応答を低減、阻害、または消失させることができる。例えば、遺伝子改変は、免疫細胞エフェクター機能を低下させることができ、免疫細胞増殖を減少させることができ、または免疫細胞における細胞溶解性エフェクター分子、例えばグランザイムＢおよびＣＤ１０７アルファ、の存続を減少させることおよび／もしくは発現を低減させることができる。免疫細胞は、単球および／またはマクロファージであることがある。免疫細胞は、Ｔ細胞および／またはＢ細胞であることもある。一部の場合には、ＩＦＮ－γなどのＴ細胞由来サイトカインは、ＩＦＮ－γの分泌によってマクロファージを活性化することができる。一部の場合には、Ｔ細胞活性化は阻害され、マクロファージも阻害される原因になり得る。
【0300】
これらの寛容化細胞ワクチンのいずれかの免疫寛容原性能力を、次のものの１つまたは複数を細胞の表面にカップリングさせることによってさらに最適化することができる：ＩＦＮ－γ、ＮＦ－κＢ阻害剤（例えば、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５）、ビタミンＤ３、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、または宿主抗原提示細胞および宿主リンパ球の機能を改変する本明細書で開示される他の免疫調節分子。
【0301】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、アポトーシス性細胞を含むことがあり、ドナー反応性細胞のアポトーシス死を誘発するそれらの表面分子、例えばＦａｓＬ、ＰＤ－Ｌ１、ガレクチン－９、ＣＤ８アルファ、を提示するように操作されたドナー細胞により補完されることもある。
【0302】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、予定レシピエントの体重１ｋｇ当たり、０．００１～約５．０または約０．００１～約５．０、例えば、０．００１～１．０または約０．００１～１．０の、エンドトキシン単位を含み得る。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、予定レシピエントの体重１ｋｇ当たり０．０１～５．０、０．０１～４．５、０．０１～４．０、０．０１～３．５、０．０１～３．０、０．０１～２．５、０．０１～２．０、０．０１～１．５、０．０１～１．０、０．０１～０．９、０．０１～０．８、０．０１～０．７、０．０１～０．６、０．０１～０．５、０．０１～０．４、０．０１～０．３、０．０１～０．２、もしくは０．０１～０．１、または約０．０１～５．０、０．０１～４．５、０．０１～４．０、０．０１～３．５、０．０１～３．０、０．０１～２．５、０．０１～２．０、０．０１～１．５、０．０１～１．０、０．０１～０．９、０．０１～０．８、０．０１～０．７、０．０１～０．６、０．０１～０．５、０．０１～０．４、０．０１～０．３、０．０１～０．２、もしくは０．０１～０．１の、エンドトキシン単位を含み得る。
【0303】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、約５０，０００の凍結されて解凍されたヒト末梢血単核細胞が、寛容化ワクチンの約１６０，０００細胞（例えば、ブタ細胞）とともにインキュベートされたとき、０．００１ｐｇ／ｍｌ～１０．０ｐｇ／ｍｌ、または約０．００１ｐｇ／ｍｌ～１０．０ｐｇ／ｍｌ、例えば、０．００１ｐｇ／ｍｌ～１．０ｐｇ／ｍｌ、または約０．００１ｐｇ／ｍｌ～１．０ｐｇ／ｍｌの、ＩＬ－１ベータの放出を誘発することができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、約５０，０００の凍結されて解凍されたヒト末梢血単核細胞が、寛容化ワクチンの約１６０，０００細胞（例えば、ヒト細胞またはブタ細胞）とともにインキュベートされたとき、０．００１～１０．０、０．００１～５．０、０．００１～１．０、０．００１～０．８、０．００１～０．２もしくは０．００１～０．１ｐｇ／ｍｌ、または約０．００１～１０．０、０．００１～５．０、０．００１～１．０、０．００１～０．８、０．００１～０．２もしくは０．００１～０．１ｐｇ／ｍｌの、ＩＬ－１ベータの放出を誘発する。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、約５０，０００の凍結されて解凍されたヒト末梢血単核細胞が、寛容化ワクチンの約１６０，０００細胞（例えば、ヒト細胞またはブタ細胞）とともにインキュベートされたとき、０．００１～２．０ｐｇ／ｍｌ、または約０．００１～２．０ｐｇ／ｍｌ、例えば、０．００１～０．２ｐｇ／ｍｌ、または約０．００１ｐｇ／ｍｌ～０．２ｐｇ／ｍｌの、ＩＬ－６の放出を誘発することができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、約５０，０００の凍結されて解凍されたヒト末梢血単核細胞が、寛容化ワクチンの約１６０，０００細胞（例えば、ヒト細胞またはブタ細胞）とともにインキュベートされたとき、０．００１～２．０、０．００１～１．０、０．００１～０．５もしくは０．００１～０．１ｐｇ／ｍｌ、または約０．００１～２．０、０．００１～１．０、０．００１～０．５もしくは０．００１～０．１ｐｇ／ｍｌの、ＩＬ－６の放出を誘発することができる。
【0304】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、３７℃での４時間の放出後インキュベーションまたは約４時間の放出後インキュベーション後に、６０％を超えるまたは約６０％を超える、例えば、８５％を超えるまたは約８５％を超える、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性のアポトーシス性細胞を含み得る。例えば、寛容化ワクチンは、３７℃での約４時間の放出後インキュベーション後に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％を超えるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性のアポトーシス性細胞を含む。
【0305】
有効量
【0306】
本開示の組成物（例えば、アポトーシス性白血球）は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と一緒に所望の応答を生じさせる組成物のその量である。移植の場合、所望の応答は、移植片拒絶反応の阻害、または移植片生存の増加である。慢性腎臓疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、がんなどの、特定の疾患を処置する場合、所望の応答は、疾患の進行の阻害である。これは、疾患の進行を一時的に緩徐化することをもっぱら含み得るが、より好ましくは、疾患の進行を永久に停止させることを含む。これを通例の方法によりモニタリングすることができる。
【0307】
そのような量は、もちろん、処置される特定の状態、障害の重症度、具体的な化合物の活性、投与の経路、組成物のクリアランス率、処置期間、組成物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、対象の年齢、体重、性別、食事および総体的な健康、ならびに医術および科学において周知のこれらに類する因子に依存し得る。「治療有効量」を決定する上で考慮される様々な一般的考慮事項は、当業者には公知であり、例えば、Ｇｉｌｍａｎ
ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， Ｇｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ８ｔｈ ｅｄ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０に記載されている。これらの因子は当業者には周知であり、単に通例の実験だけでこれらに因子に対処することができる。使用される個々の成分またはそれらの組合せの最大用量、すなわち、正当な医学的判断に従って最高安全用量が、一般に好ましい。上述の方法で使用される組成物は、好ましくは、無菌であり、患者への投与に好適な重量または体積の単位で所望の応答を生じさせる活性薬剤の有効量を含有する。
ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， Ｇｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ８ｔｈ ｅｄ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０に記載されている。これらの因子は当業者には周知であり、単に通例の実験だけでこれらに因子に対処することができる。使用される個々の成分またはそれらの組合せの最大用量、すなわち、正当な医学的判断に従って最高安全用量が、一般に好ましい。上述の方法で使用される組成物は、好ましくは、無菌であり、患者への投与に好適な重量または体積の単位で所望の応答を生じさせる活性薬剤の有効量を含有する。
【0308】
本明細書で開示される組成物（例えば、アポトーシス性白血球）を投与するステップを含む、本明細書で開示される方法の有効性を、グラフト生存またはグラフト拒絶反応の防止を評価する際に一般に使用される様々な評価項目により評価することができ、そのような評価項目としては、ａ）移植片に対する免疫応答のレベル低下（Ｂ細胞媒介免疫応答、より詳細にはドナー特異的抗体、によって少なくとも一部は媒介されると考えられる）もしくはグラフト対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率低下、ｂ）移植片に対する免疫応答の開始もしくは進行の遅延、ｃ）移植片に対する免疫応答の開始もしくは進行のリスク低下、ｄ）免疫寛容原性ＡＰＣのレベルの上昇、ｅ）Ｔｒｅｇのレベルの上昇、ｆ）Ｔｒ１細胞のレベルの上昇、ｇ）ＩＬ－１０、ＴＧＦβなどの、抗炎症性サイトカインのレベルの上昇、またはｈ）これらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
【0309】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、移植を受けるヒト対象群における奏効率を、追加の免疫抑制を用いてまたは用いずに有意に上昇させることができる。奏効率は、処置に奏効した移植レシピエントのパーセンテージと定義される。
自己免疫疾患に対する寛容の誘導
自己免疫疾患に対する寛容の誘導
【0310】
本明細書で提供される組成物、方法、キットおよび系を、自己免疫障害を予防および／または処置するために利用することができる。用語「自己免疫障害」、「自己免疫疾患」、「自己免疫状態」、およびこれらの文法的等価表現は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され得る。一部の場合には、本明細書で提供される寛容ワクチンを自己抗原ペプチド、自己抗原、または他の細胞担体に架橋させることができ、自己免疫障害に対する寛容療法として使用することができる。一部の場合には、細胞担体は、アポトーシス性細胞担体である。一部の場合には、細胞担体は、同系アポトーシス性細胞担体である。
【0311】
本明細書に記載の寛容化ワクチンを細胞担体（例えば、自己抗原、自己抗原ペプチド、アポトーシス性細胞担体）とともに使用して、自己免疫状態の処置に対する抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することができる。理論により拘束されないが、担体を伴うまたは伴わない寛容化ワクチンは、宿主脾臓抗原提示細胞により取り込まれ、プロセシングされ、免疫寛容原性様式で提示されることによって、調節性Ｔ細胞を誘導すること、および免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦ－β）の分泌を誘導することができる。
【0312】
自己免疫障害の非限定的な例としては、炎症、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性血管炎、セリアック病、自己免疫性甲状腺炎、輸血後免疫化、母胎不適合、輸血反応、免疫欠損、例えばＩｇＡ欠損症、分類不能免疫不全症、薬物誘発性ループス、真性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、若年発症糖尿病、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、免疫不全、アレルギー、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、慢性皮膚病、筋萎縮性側索硬化症、化学療法による損傷、グラフト対宿主病、骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、アトピー性湿疹、天疱瘡、ベーチェット病、慢性疲労症候群、線維筋痛症、化学療法による損傷、重症筋無力症、糸球体腎炎、アレルギー性網膜炎、全身性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、例えば凍瘡状エリテマトーデスなど、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、自己免疫性血管炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性心臓炎、自己免疫性脳炎、自己免疫介在性血液疾患、ｌｃ－ＳＳｃ（限局皮膚硬化型強皮症）、ｄｃ－ＳＳｃ（びまん皮膚硬化型強皮症）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＧＤ）、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、強直性脊椎炎、移植拒絶反応、免疫老化、リウマチ性／自己免疫疾患、混合性結合組織病、脊椎関節症、乾癬、乾癬性関節炎、筋炎、強皮症、皮膚筋炎、自己免疫性血管炎、混合性結合組織病、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、ヒトアジュバント病、変形性関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、特発性炎症性ミオパチー、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、免疫介在性腎疾患、中枢または末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、肝胆汁性疾患、感染性もしくは自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む）、グルテン感受性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性もしくは免疫介在性皮膚疾患、水疱性皮膚疾患、多形紅斑、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、蕁麻疹、肺の免疫疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、移植関連疾患、グラフト拒絶反応もしくはグラフト対宿主病、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、炎症性腸疾患に関連する反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞浸潤および慢性炎症反応を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴリンパ球により媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えばウェゲナー肉芽腫症など、顆粒球減少症、血管炎（例えば、ＡＮＣＡなど）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、免疫性溶血性貧血、例えば自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）など、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球遊出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器損傷症候群、重力筋無力症（ｍｙｓａｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、抗原－抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌異常、ライター病、スティフ・マン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性ニューロパチーまたはＩｇＭ介在性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、精巣および卵巣の自己免疫疾患、例えば自己免疫性精巣炎および卵巣炎など、原発性甲状腺機能低下症、自己免疫性内分泌疾患、例えば自己免疫性甲状腺炎など、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、多腺性自己免疫性症候群（または多腺性内分泌異常症候群）、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植症例）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、大血管炎（例えば、リウマチ性多発筋痛症および巨細胞（高安）動脈炎など）、中型血管炎（例えば、川崎病および結節性多発動脈炎など）、強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、クリオグロブリン血症、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。一部の場合には、自己免疫疾患は、ＳＬＥ、関節リウマチ、またはセリアック病である。
医薬組成物
医薬組成物
【0313】
対象における投与のためのキットおよび寛容化ワクチンを含む組成物または前処置レジメンが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、寛容化ワクチンもしくは前処置レジメンまたはそれらの成分（例えば、アポトーシス性ドナー白血球、例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞、もしくは間葉系間質細胞）は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と併せられる。使用され得る賦形剤は、食塩水である。使用され得る賦形剤は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。したがって、これらの医薬組成物を、移植を必要とする患者を処置するために使用することができる。
【0314】
本開示の組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストランなど；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン；保存剤；またはこれらの組合せを含み得る。本発明の組成物を静脈内投与（例えば、静脈内注射または注入）用に製剤化することができる。本開示の組成物は、無菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液または粘性組成物であり得る。
【0315】
本開示の組成物を選択されたｐＨに緩衝することができる。例えば、本開示の組成物をおおよそ５～９、５～８、５～７、５～６、６～９、６～８、６～７、７～９、７～８、６．５～８．５、６．５～８、６．５～７．７、６．５～７．６、６．５～７．５、６．５～７．４、６．５～７．３、６．５～７．２、６．５～７、７～７．７、７～７．６、７～７．５、７～７．４、７～７．３、７～７．２、７～７．１、７．２～７．６、７．２～７．５、７．２～７．４、７．３～７．７、７．３～７．６、７．３～７．５、７．３４～７．４５、７．０～７．２、７．２～７．４、７．３～７．５、７．４～７．６、または７．６～７．８のｐＨに緩衝することができる。加えて、組成物は、ｐＨ緩衝剤、例えば、０．１ｍＭ～１００ｍＭリン酸塩ｐＨ６．０～９．０、０．１～１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．０～９．０、０．１ｍＭ～１００ｍＭ重炭酸塩ｐＨ６．０～９．０、０．１ｍＭ～１００ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０～９．０、０．１～１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．０～８．０、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【0316】
組成物は、電解質、例えば、５ｍＭ～４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ～５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０５ｍＭ～５０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５ｍＭ～５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ～５０ｍＭ ＬｉＣｌ２、０．０５ｍＭ～５０ｍＭ ＭｎＣｌ２、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【0317】
組成物は、抗酸化剤、例えば、０．０５～１０ｍＭグルタチオン（還元型）、０．０５～１０ｍＭグルタチオン（酸化型）、０．００１ｍＭ～１０ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．００１ｍＭ～１０ｍＭジチオトレイトール、０．０１～１００ｍＭアスコルビン酸塩、０．００１～１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【0318】
組成物は、安定剤、例えば、０．０１％～１０％ヒト血清アルブミン、０．０１％～１０％ウシ血清アルブミン、０．１％～９９％ヒト血清、０．１％～９９％ウシ胎仔血清、０．０１％～１０％ＩｇＧ、０．１％～１０％免疫グロブリン、０．０６％～６０％トレハロース、もしくは０．１％～２０％ポリエチレングリコール（ＭＷ２００～２０，０００，０００）のような分子ポリマー、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【0319】
液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る、担体を含み得る。
【0320】
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝剤をはじめとする、組成物の安定性および無菌性を向上させる様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることできる。
【0321】
組成物は、等張性であり得、すなわち、それらは、血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいは他の薬学的に許容される薬剤、例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を使用して得ることができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝剤に特に好ましい。
【0322】
一部の実施形態では、寛容化ワクチンもしくは前処置レジメンまたはこれらの成分は、１つまたは複数のアジュバント（例えば、１つまたは複数の免疫調節分子）とともに投与される。
【0323】
一部の実施形態では、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、免疫抑制剤（例えば、１つまたは複数の免疫調節分子）とともに投与される。一部の場合には、免疫抑制剤は、Ｔ細胞活性化を阻害する。Ｔ細胞活性化を阻害する免疫抑制剤は、抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）剤であり得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０剤は、抗ＣＤ４０抗体であり得る。抗ＣＤ４０抗体は、アンタゴニスト抗体であり得る。抗ＣＤ４０抗体は、Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体断片ＣＤＰ７６５７であり得る。抗ＣＤ４０抗体は、ＦｃＲが操作されたＦｃサイレント抗ＣＤ４０Ｌモノクローナルドメイン抗体であり得る。抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ剤は、２Ｃ１０、２Ｃ１０Ｒ４、ＡＳＫＰ１２４０、４Ｄ１１、ブレセルマブ、ＢＩ－６５５０６４、ＨＣＤ１２２、ＣＦＺ５３３、ｃｈ５Ｄ１２、ＦＦＰ１０４、ＣＤＰ７６５７、ＢＧ９５８８、ルプリズマブ、トラリズマブ、ＩＤＥＣ－１３１、ダピロリズマブ、レトリズマブ、ＢＭＳ－９８６００４、ＶＩＢ４９２０、またはＭＥＤＩ４９２０であり得る。
【0324】
一部の場合には、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンは、本明細書に記載の１つまたは複数の追加の免疫抑制剤、例えば、抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ－アルファ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、ＩＦＮ－γ、ＮＦκＢ阻害剤、α１－アンチトリプシン、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質（ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９）、これらの任意の組合せ、またはそれらの任意の断片、のうちの１つまたは複数とともに投与される。一部の場合には、ＮＦκＢ阻害剤は、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはこれらの組合せである。一部の場合には、Ｂ細胞を標的とする生物製剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂまたは別の抗ＣＤ２０抗体であり得る。
【0325】
一部の場合には、免疫抑制薬は、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、抗ＩＬ－６Ｒ抗体（サリルマブ、トシリズマブ、アクテムラ）、抗ＩＬ－６抗体（クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、オロキズマブ）、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、ｍＴＯＲ阻害剤（シロリムス（例えば、Ｒａｐａｍｕｎｅ）、ラパマイシン、エベロリムス）、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ－ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、抗ＣＤ１５４－Ａｂ、レフルノミド、抗ＩＬ－２Ｒ－Ａｂ、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体、ヒト抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、ＣＤ４０アンタゴニスト、およびＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）アンタゴニストであり得る。Ｂ細胞を標的とする生物製剤の非限定的な例としては、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０
ｍＡｂ抗体、Ｆｃが操作された抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。１つまたは１つより多くの免疫抑制剤／薬を一緒にまたは別々に使用することができる。１つまたは１つより多くの免疫抑制剤／薬を誘導療法にまたは維持療法に使用することができる。同じまたは異なる薬物を誘導および維持段階中に使用することができる。例えば、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）、もしくはエベロリムス、または任意の他のｍＴＯＲ阻害剤が、維持療法に使用される。別の例では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）が維持療法に使用される。全身照射、胸腺照射、ならびに脾全および／または部分摘出術を含むがこれらに限定されない、非投薬レジメンを使用して、免疫抑制を実現することもできる。これらの技法を、１つまたは複数の免疫抑制薬と組み合わせて使用することもできる。
ｍＡｂ抗体、Ｆｃが操作された抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。１つまたは１つより多くの免疫抑制剤／薬を一緒にまたは別々に使用することができる。１つまたは１つより多くの免疫抑制剤／薬を誘導療法にまたは維持療法に使用することができる。同じまたは異なる薬物を誘導および維持段階中に使用することができる。例えば、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）、もしくはエベロリムス、または任意の他のｍＴＯＲ阻害剤が、維持療法に使用される。別の例では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ）が維持療法に使用される。全身照射、胸腺照射、ならびに脾全および／または部分摘出術を含むがこれらに限定されない、非投薬レジメンを使用して、免疫抑制を実現することもできる。これらの技法を、１つまたは複数の免疫抑制薬と組み合わせて使用することもできる。
【0326】
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫調節分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ３ｅ、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４０、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ５２、α－４インテグリン、ｍＴＯＲ（ラパマイシン、エベロリムス、セロリムスのメカニスティク標的）、ＤＮＡ合成、またはこれらの任意の組合せを標的とすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫調節分子は、Ｂ細胞を標的とすることができる（Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）。一部の場合には、Ｂ細胞標的化剤は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）または他のＢ細胞枯渇抗体であり得る。一部の実施形態では、免疫抑制薬は、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用遮断物質、非選択的枯渇剤、カルシニューリン阻害剤、共刺激シグナル遮断物質、サイトカイン遮断物質、リンパ球枯渇剤、細胞接着阻害剤、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、細胞周期ブロッカー、またはこれらの任意の組合せであり得る。例えば、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用遮断物質は、抗ａｂＴＣＲ ｍＡｂ Ｔ１０Ｂ９であり得る。例えば、非選択的枯渇剤は、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）または抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）であり得る。例えば、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンまたはタクロリムスであり得る。例えば、共刺激シグナル遮断物質は、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ、アバタセプト、イピリムマブ、抗ＰＤ－１（例えば、ペムブロリズマブ）、抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、抗ＣＤ１５４ ｍＡｂ、抗ＣＤ４０ ｍＡｂ、または抗ＩＣＯＳ ｍＡｂであり得る。例えば、サイトカイン遮断物質は、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（例えば、ダクリズマブもしくはバシリキシマブ）、抗ＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、およびゴリムマブ）、抗ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ ｍＡｂ（例えば、クラザキズマブ、ＡＬＤ５１８、シルツキシマブ、エルシリモマブ、シルクマブ、オロキズマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アクテムラ）、または抗ＩＬ－７ ｍＡｂであり得る。例えば、リンパ球枯渇剤は、抗ＣＤ２ ｍＡｂ、ＩｇＧ１との融合タンパク質（例えば、アレファセプト）、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）、または抗ＣＤ５２ ｍＡｂ（例えば、アレムツズマブ）であり得る。例えば、細胞接着阻害剤は、抗ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４（ＶＬＡ４）（例えば、ナタリズマブ）であり得る。例えば、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、シロリムス（ラパマイシン）またはエベロリムスであり得る。例えば、細胞周期ブロッカーは、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはアザチオプリンであり得る。
キット
キット
【0327】
本開示の別の実施形態では、アポトーシス性白血球、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤もしくは抗腫瘍壊死因子受容体剤、抗インターロイキン６剤もしくは抗インターロイキン６受容体剤および抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０リガンド剤を含む組成物を含有する溶液形態のまたは凍結乾燥形態の製造物品、または製造物品を含むキットが、提供される。本開示のキットは、レシピエントにおける移植片の移植の際に使用するためのものであることもあり、またはレシピエントにおけるＧＶＨＤの発生を低減もしくは抑制するために使用するためのものであることもある。一部の実施形態では、キットは、移植前の前処置レジメンとして有用である。一部の実施形態では、キットは、移植後の寛容化レジメンとして有用である。キットは、組成物を希釈するための、またはその復元および／もしくは使用のための説明を含むことができる。製造物品は、１つまたは複数の容器を含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル（例えば、二室式バイアル）、注射器（例えば、二室式注射器）および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を、例えば凍結乾燥形態または溶液形態で保持し、容器上のまたは容器に付随するラベルは、復元および／または使用についての指示を示し得る。例えば、ラベルは、凍結乾燥組成物が上記の有効量に復元されることを示し得る。ラベルは、組成物が皮下投与もしくは静脈内投与に有用であることまたは皮下投与もしくは静脈内投与のためのものであることをさらに示し得る。組成物を保持する容器は、組成物の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする複数回使用用バイアルであることもある。製造物品は、好適な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ）を含む容器をさらに含むこともある。希釈剤と組成物の混合時、組成物中の最終濃度は、例えば、投与に好適な有効量であり得る。製造物品は、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書を伴う添付文書などを、さらに含むこともある。
【0328】
キットは、例えば、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を他の成分（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤もしくは抗腫瘍壊死因子受容体剤、抗インターロイキン６剤もしくは抗インターロイキン６受容体剤、および抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０リガンド剤）とともにまたはなしで収容している単一容器を有することもあり、または成分ごとに別個の容器を有することもある。一部の実施形態では、キットは、例えば、架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球であって、その表面上にコンジュゲートされた、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチドまたは細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数を含むアポトーシス性白血球を、他の成分（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤もしくは抗腫瘍壊死因子受容体剤、抗インターロイキン６剤もしくは抗インターロイキン６受容体剤、および抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０リガンド剤）とともにまたはなしで収容している単一の容器を含み、または成分ごとに別個の容器を有することもある。
【0329】
患者への投与前、キットの組成物が、あらかじめ複合体化されていることもあり、または各成分が別々の異なる容器の中にあることもある。キットの成分は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは滅菌水溶液の状態で備えられていることがある。キットの成分は、固体として備えられていることもあり、これらの固体を、別の異なる容器に好ましくは備えられている好適な溶媒の添加によって液体に変換することができる。一部の実施形態では、本開示のキットは、追加の成分（例えば、抗炎症剤、免疫調節剤、抗腫瘍剤、天然産物、ホルモンもしくはアンタゴニスト、抗血管新生剤もしくは阻害剤、アポトーシス誘導剤、またはキレート剤）の併用投与と組み合わせて使用するために包装された、本明細書に開示される成分を含む。キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または固体もしくは液体を封入する任意の他の手段であり得る。一部の実施形態では、キットは、別々の投与を可能にする、第２のバイアルまたは他の容器を含むことになる。キットは、薬学的に許容される液体のための別の容器も含むことがある。好ましくは、キットは、本キットの成分である本開示の組成物の投与を可能にする器具（例えば、１つまたは複数の針、注射器、点眼器、ピペットなど）を含むことになる。
【0330】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるキットは、移植片をさらに含む。一部の実施形態では、移植片は、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島ベータ細胞、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来膵島、胚性もしくは誘導多能性幹細胞由来肝細胞、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、移植片は、自己移植片、同種グラフト移植片または異種グラフト移植片であり得る。
遺伝子改変を行う方法
遺伝子改変を行う方法
【0331】
上記の遺伝子改変細胞または非ヒト動物を生じさせるために、様々な技法を使用することができる。遺伝子改変細胞または動物を作出するための少数の例が、本明細書で開示される。本明細書で開示される方法が単なる例であり、いかなる点においても限定を意図したものでないことを理解されたい。
【0332】
本明細書で開示される方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を宿主細胞に侵入させるために使用され得る技法を利用し得、それらは、これらに限定されないがリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、電気穿孔、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染、パーティクルボンバードメント、精子媒介遺伝子移入、または当業者が公知の任意の他の技法を含む。
【0333】
本明細書で開示されるある特定の態様は、ベクターを利用し得る。任意のプラスミドおよびベクターを、それらが選択された宿主において複製可能かつ生存可能であるのであれば、使用することができる。当技術分野において公知のベクターおよび市販のもの（およびそれらのバリアントまたは誘導体）を、方法に使用するための１つまたは複数の組換え部位を含むように操作することができる。使用され得るベクターは、これらに限定されないが、真核生物発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶおよびｐＴｅｔ－Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡおよびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２－８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏおよびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、ならびにｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａ－ｃＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ１１１、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４ならびにｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ならびにこれらのバリアントまたは誘導体を含む。
【0334】
これらのベクターを使用して、遺伝子、例えば導入遺伝子、または目的の遺伝子の一部分を発現させることができる。部分の遺伝子、または遺伝子を、制限酵素に基づく技法などの公知の方法を使用して挿入することができる。
遺伝子破壊
遺伝子破壊
【0335】
遺伝子破壊は、下記のいずれかの方法により、例えば、ノックアウト、ノックダウン、ＲＮＡ干渉、ドミナントネガティブなどにより、実行することができる。遺伝子破壊を非ヒト動物において行うことができる。遺伝子破壊をヒト細胞（例えば、ヒト脾細胞、末梢血白血球、および／または幹細胞由来の細胞、組織もしくは臓器）において行うことができる。方法の詳細な説明は、下記の遺伝子改変非ヒト動物に関するセクションで開示される。
【0336】
一部の実施形態では、グラフトドナーおよび／またはアポトーシス性細胞は、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＧＴＡ１）、推定上のシチジンモノホスファターゼ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）およびβ１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を発現する１つまたは複数の遺伝子の発現低減を有する。一部の実施形態では、グラフトドナーおよび／またはアポトーシス性細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２を発現する１つまたは複数の遺伝子の破壊を有する。これは、アポトーシス性細胞ワクチンドナー動物と遺伝学的に同一であるグラフトドナー動物からの臓器、組織、細胞および細胞系グラフト（例えば、異種グラフトまたは同種グラフト）に対する細胞媒介免疫および細胞依存性抗体媒介免疫を最小にすることまたは消失させることができる。
【0337】
例えば、細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１および／またはこれらの任意の組合せを含む、破壊され（例えば、発現が低減され）得る１つまたは複数の遺伝子を有し得る。例えば、細胞は、ＧＧＴＡ１のみが破壊されていること、またはＣＭＨＡのみが破壊されていること、またはＢ４ＧＡＬＮＴ２のみが破壊されていることがある。細胞は、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨが破壊されていること、ＧＧＴＡ１およびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されていること、またはＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されていることもある。細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されていることがある。一部の場合には、破壊されている遺伝子は、ＧＧＴＡ１を含まない。細胞は、ＧＧＴＡ１および／またはＣＭＡＨが破壊されていても、ＨＬＡ－Ｇを（内因的にまたは外因的に）発現することもある。細胞は、Ｃ３が破壊されていることもある。
【0338】
一部の実施形態では、グラフトドナー動物および／またはアポトーシス性細胞は、追加の遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、グラフトドナー動物および／またはアポトーシス性細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）Ｉ特異的エンハンセオソームの成分（例えば、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５））、ＭＨＣ－Ｉ結合ペプチドの輸送体（例えば、抗原プロセシング１（ＴＡＰ１））、補体成分３（Ｃ３）、ＣＸＣケモカイン受容体３リガンド（ＣＸＣＬ３）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子、ＭＨＣ ＩＩトランス活性化因子（ＭＨＣＩＩＴＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）遺伝子、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）遺伝子、ナチュラルキラー（ＮＫ）グループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ－Ｒ）、ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはこれらの任意の組合せをコードする、１つまたは複数の遺伝子の抑制または破壊を含む。
【0339】
一部の実施形態では、グラフトドナー動物および／またはアポトーシス性細胞は、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＭＨＣ Ｉ形成サプレッサー（例えば、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７））、補体活性化の調節因子（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５もしくはＣＤ５９）、ＮＫ細胞の阻害性リガンド、Ｂ７ファミリーメンバー（例えば、プログラム死リガンド、例えばＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２）、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｓｐｉ９）、ガレクチン、インターロイキン（例えば、ＩＬ－３７）、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ遮断剤（例えば、ＣＤ４０アンタゴニストポリペプチド、抗ＣＤ４０リガンドポリペプチド）、ＳＴ６ベータ－ガラクトシドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、これらの任意の機能性断片、またはそれらの任意の組合せのうちの、１つまたは複数を発現する。一部の実施形態では、ＮＫ細胞の阻害性リガンドは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えば、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、ＨＬＡ－Ｇ７、またはこれらの任意の組合せである。一部の場合には、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、またはガレクチン－１５である。例えば、ガレクチンは、ガレクチン－９であり得る。
【0340】
一部の場合には、破壊は、これらの遺伝子のみに限定されない。本願の範囲内の遺伝子の遺伝子相同体（例えば、遺伝子の任意の哺乳動物バージョン）が包含されると考えられる。例えば、破壊される遺伝子は、本明細書で開示される遺伝子、例えば、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３および／またはＭＨＣＩＩＴＡに対して、ある特定の同一性および／または相同性を示すことができる。したがって、少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％相同性を（核酸またはタンパク質レベルで）示す遺伝子、例えば、少なくともまたは少なくとも約５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９９％相同性を示す遺伝子が破壊され得ると考えられる。少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９９％、または１００％同一性を（核酸またはタンパク質レベルで）示す遺伝子、例えば、少なくともまたは少なくとも約５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９９％同一性を示す遺伝子が破壊され得ることも考えられる。一部の遺伝子相同体は当技術分野において公知であるが、相同体が不明である場合もある。しかし、哺乳動物間の相同遺伝子は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴなどの公開されている利用可能なデータベースを使用して核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列を比較することにより見つけることができる。
【0341】
遺伝子抑制も多数の方法で行うことができる。例えば、遺伝子のプロモーターを変更してノックアウトにより、および／または干渉ＲＮＡを投与すること（ノックダウン）により、遺伝子発現を低減させることができる。これを生物レベルでまたは組織、臓器および／もしくは細胞レベルで行うことができる。細胞、組織および／または臓器における１つまたは複数の遺伝子をノックダウンする場合、ＲＮＡ干渉試薬、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを投与することにより１つまたは複数の遺伝子を低減させることができる。例えば、ｓｈＲＮＡを発現することができる核酸を細胞に安定にトランスフェクトして、発現をノックダウンすることができる。さらに、ｓｈＲＮＡを発現することができる核酸を細胞または非ヒト動物のゲノムに挿入し、結果として、細胞または非ヒト動物における遺伝子をノックダウンすることができる。
【0342】
破壊方法は、ドミナントネガティブタンパク質を過剰発現させることも含み得る。この方法は、機能性野生型遺伝子の機能の全般的低下をもたらすことができる。加えて、ドミナントネガティブ遺伝子を発現させることにより、ノックアウトおよび／またはノックダウンのものと同様である表現型を生じさせることができる。
【0343】
一部の場合には、１つもしくは複数の遺伝子において（例えば、ヌクレオチド置換により）停止コドンを挿入または作出することができ、その結果、非機能性転写物またはタンパク質（ノックアウトと呼ばれることもある）を生じさせることができる。例えば、停止コドンを１つまたは複数の遺伝子の中央部内で作出した場合、結果として生じる転写および／またはタンパク質は、短縮化されることもあり、非機能性になることもある。しかし、一部の場合には、短縮化は、活性（ある程度または過度に活性な）タンパク質をもたらすことがある。一部の場合には、タンパク質が過度に活性である場合、これは、ドミナントネガティブタンパク質、例えば、野生型タンパク質の活性を破壊する突然変異型ポリペプチドを、生じさせる結果となり得る。
【0344】
このドミナントネガティブタンパク質を任意のプロモーターの制御の及ぶ範囲内で核酸において発現させることができる。例えば、プロモーターは、普遍的プロモーターであることがある。プロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、および／または成長特異的プロモーターであることもある。
【0345】
したがって、ドミナントネガティブタンパク質をコードする核酸を細胞または非ヒト動物に挿入することができる。任意の公知の方法を使用することができる。例えば、安定なトランスフェクションを使用することができる。加えて、ドミナントネガティブタンパク質をコードする核酸を細胞または非ヒト動物のゲノムに挿入することができる。
【0346】
細胞または非ヒト動物における１つまたは複数の遺伝子を、当技術分野において公知の任意の方法を使用してノックアウトすることができる。例えば、１つまたは複数の遺伝子をノックアウトすることは、細胞または非ヒト動物のゲノムから１つまたは複数の遺伝子を欠失させることを含み得る。ノックアウトすることは、細胞または非ヒト動物から遺伝子配列の全てまたは一部を除去することも含み得る。ノックアウトすることはまた、細胞または非ヒト動物のゲノム内の遺伝子の全てまたは一部を１つまたは複数のヌクレオチドで置換することを含み得ると考えられる。１つまたは複数の遺伝子のノックアウトすることは、１つまたは複数の遺伝子に配列を挿入することによって１つまたは複数の遺伝子の発現を妨げることも含み得る。例えば、配列を挿入することにより、１つまたは複数の遺伝子の中央部に停止コドンを生成することができる。配列を挿入することにより、１つまたは複数の遺伝子のオープンリーディングフレームをシフトさせることもできる。一部の場合には、ノックアウトを遺伝子の第１のエクソンにおいて実行することができる。他の場合には、ノックアウトを遺伝子の第２のエクソンにおいて実行することができる。
【0347】
ノックアウトを、ヒト細胞、または非ヒト動物の任意の細胞、臓器および／もしくは組織において行うことができる。例えば、ノックアウトは、全身ノックアウトであることがあり、例えば、非ヒト動物の全ての細胞において１つまたは複数の遺伝子の発現が低減される。ノックアウトは、非ヒト動物の１つまたは複数の細胞、組織および／または臓器に特異的であることもある。これは、１つまたは複数の遺伝子の発現が１つまたは複数の臓器、組織または細胞型において選択的に低減される、条件付きノックアウトによって実現することができる。条件付きノックアウトは、ｃｒｅが細胞、組織および／または臓器特異的プロモーターの制御下で発現される、Ｃｒｅ－ｌｏｘ系によって実行することができる。例えば、１つまたは複数の組織または臓器において１つまたは複数の遺伝子をノックアウトすることができ（または発現を低減させることができ）、この場合の１つまたは複数の組織または臓器は、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、眼、網膜、生殖器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄、または尿管、子宮、卵巣、精巣、および／またはこれらの任意の組合せを含み得る。１つの細胞型において１つまたは複数の遺伝子をノックアウトすることもでき（または発現を低減させることができ）、この場合の１つまたは複数の細胞型は、トリコサイト、ケラチノサイト、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、クロム親和性細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜実質細胞、網膜ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞）、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えば、Ｉ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、腸クロム親和性細胞様細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、小襞細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば、中胚葉由来のクッパ－細胞）、胆嚢細胞、腺房中心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、膵ε細胞、甲状腺（例えば、濾胞細胞）、副甲状腺（例えば、副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋衛星細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハール介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば、糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞、間細胞、テロサイト、単純上皮細胞、有足細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ｐｅｇ細胞、胚細胞、精子、卵子、リンパ球、骨髄性細胞、内皮前駆細胞、幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞、周皮細胞、壁細胞、および／またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【0348】
条件付きノックアウトは、誘導性であることもあり、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、成長特異的プロモーターを使用することによることもある。これは、任意の時点でまたは特定の時点で遺伝子／タンパク質の発現を消失させることまたは抑制することを可能にし得る。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターの場合に関して、テトラサイクリンを非ヒト動物に出生後任意の時点で与えることができる。非ヒト動物が、子宮内で成長する存在である場合には、テトラサイクリンを妊娠中の母体に与えることによりプロモーターを誘導することができる。非ヒト動物が卵の中で成長する場合、テトラサイクリンを注射することまたはテトラサイクリン中でインキュベートすることによりプロモーターを誘導することができる。テトラサイクリンを非ヒト動物に与えると、テトラサイクリンは、ｃｒｅの発現をもたらすことができ、するとそのｃｒｅが目的の遺伝子の切除をもたらすことができる。
【0349】
ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、成長特異的プロモーターの制御下にあることもある。例えば、一部のプロモーターは、出生後にまたはさらには思春期の開始後に活性化される。これらのプロモーターを使用してｃｒｅ発現を制御することができ、したがって、成長特異的ノックアウトに使用することができる。
【0350】
ノックアウト技術の任意の組合せを併用することができることも考えられる。例えば、組織特異的ノックアウトを誘導性技術と併用して、組織特異的、誘導性ノックアウトを生じさせることができる。さらに、成長特異的プロモーターなどの他の系を、組織特異的プロモーターおよび／または誘導性ノックアウトと組み合わせて使用することができる。
【0351】
細胞または非ヒト動物の１つまたは複数の遺伝子の全てに満たない対立遺伝子をノックアウトすることができることも考えられる。例えば、二倍体細胞および／または非ヒト動物では、２つの対立遺伝子の一方がノックアウトされると考えられる。これは、遺伝子の発現減少およびタンパク質レベル低下をもたらし得る。発現の全体的減少は、両方の対立遺伝子が機能している、例えば、ノックアウトおよび／またはノックダウンされていない場合と比較して、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満、または約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満、例えば、９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０％、６０％～５０％、５０％～４０％、４０％～３０％、もしくは３０％～２０％、または約９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０％、６０％～５０％、５０％～４０％、４０％～３０％、もしくは３０％～２０％の発現であり得る。加えて、タンパク質レベルの全体的低下は、全体的発現の減少と同じであることもあり、異なることもある。タンパク質レベルの全体的低下は、両方の対立遺伝子が機能している、例えば、ノックアウトおよび／またはノックダウンされていない場合と比較して、約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％もしくは２０％、または約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％もしくは２０％未満、例えば、９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０％、６０％～５０％、５０％～４０％、４０％～３０％、もしくは３０％～２０％、または約９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０％、６０％～５０％、５０％～４０％、４０％～３０％、もしくは３０％～２０％の発現であり得る。しかし、細胞および／または非ヒト動物における１つまたは複数の遺伝子の全ての対立遺伝子をノックアウトすることができることも考えられる。
【0352】
１つまたは複数の遺伝子のノックアウトを遺伝子型判定により検証することができる。遺伝子型判定方法は、シークエンシング、制限酵素断片長多型特定（ＲＦＬＰＩ）、ランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ＰＣＲ（例えば、ロングレンジＰＣＲ、または段階的ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、およびＤＮＡマイクロアレイまたはビーズへのハイブリダイゼーションを含み得る。例えば、遺伝子型判定をシークエンシングにより実行することができる。一部の場合には、シークエンシングは、高忠実度シークエンシングであり得る。シークエンシング法は、マクサム・ギルバートシークエンシング、連鎖停止法（例えば、サンガーシークエンシング）、ショットガンシークエンシング、およびブリッジＰＣＲを含み得る。一部の場合には、遺伝子型判定を次世代シークエンシングにより実行することができる。次世代シークエンシング法は、超並列シグネチャーシークエンシング、コロニーシークエンシング、パイロシークエンシング（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたパイロシークエンシング）、一分子リアルタイムシークエンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる）、イオン半導体シークエンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シークエンシングによる）、一塩基合成法（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａによるＳｏｌｅｘａシークエンシングによる）、ライゲーションによるシークエンシング（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍによるＳＯＬｉＤシークエンシング）、ＤＮＡナノボールシークエンシング、およびヘリスコープ一分子シークエンシングを含み得る。一部の場合には、本明細書における細胞または非ヒト動物の遺伝子型判定は、全ゲノムシークエンシング解析を含み得る。一部の場合には、細胞または動物における遺伝子のノックアウトを遺伝子の一部または遺伝子全体のシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）により検証することができる。
相同組換え
相同組換え
【0353】
相同組換えも、本明細書で開示される関連遺伝子改変のいずれかに使用することができる。相同組換えは、内在性遺伝子の部位特異的改変を可能にすることができ、ひいては新規改変をゲノムに組み込むことができる。例えば、相同組換え（遺伝子変換および古典的鎖切断／再結合）がＤＮＡ分子間で遺伝子配列情報を伝達できることにより、標的相同組換えを行うことができ、相同組換えがＤＮＡ分子間で遺伝子配列情報を伝達できることは、遺伝子操作および遺伝子マニピュレーションの効果的な方法になり得る。
【0354】
相同組換えされた細胞を多数の方法により特定することができる。例えば、選択法は、例えばヒト抗ｇａｌ抗体により、細胞に対する免疫応答の非存在を検出することができる。選択法は、細胞または組織に曝露されたときのヒト血液の凝固レベルを評定するステップも含み得る。抗生物質に対する耐性による選択をスクリーニングに使用することができる。
ランダム挿入
ランダム挿入
【0355】
本明細書に記載の方法の１つまたは複数の導入遺伝子を細胞のゲノムの任意の遺伝子座にランダムに挿入することができる。これらの導入遺伝子は、ゲノム内のどこに挿入されても機能性であり得る。例えば、導入遺伝子は、それ自体のプロモーターをコードすることができ、または導入遺伝子を、それが内在性プロモーターの制御下に置かれる位置に挿入することができる。あるいは、導入遺伝子を、遺伝子に、例えば、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーター、または非コード領域に、挿入することができる。導入遺伝子を遺伝子の第１のエクソンに組み込むことができる。
【0356】
導入配列をコードするＤＮＡを細胞の染色体にランダムに挿入することができる。ランダム挿入は、当業者に公知の、細胞にＤＮＡを導入する任意の方法の結果として生じ得る。この方法は、電気穿孔、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ＡＡＶおよびレトロウイルスベクターなど、の使用、ならびに／またはグループＩＩリボザイムを、これらに限定されないが、含み得る。
【0357】
導入遺伝子をコードするＤＮＡを、レポーター遺伝子を含むように設計することもでき、したがって、導入遺伝子またはその発現産物の存在をレポーター遺伝子の活性化によって検出することができる。上記のものなどの、当技術分野において公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができる。レポーター遺伝子が活性化された細胞を細胞培養下で選択することにより、導入遺伝子を含有する細胞を選択することができる。
【0358】
導入遺伝子をコードするＤＮＡを電気穿孔によって細胞に導入することができる。ＤＮＡをリポフェクション、感染または形質転換によって細胞に導入することもできる。電気穿孔および／またはリポフェクションを使用して、線維芽細胞にトランスフェクトすることができる。
【0359】
導入遺伝子の発現は、発現アッセイ、例えばｑＰＣＲにより、またはＲＮＡのレベルを測定することにより、検証することができる。発現レベルは、コピー数も示すことができる。例えば、発現レベルが極めて高度である場合、これは、導入遺伝子の１つより多くのコピーがゲノムに組み込まれたことを示すことができる。あるいは、高度な発現は、導入遺伝子が、高度に転写されるエリア内に、例えば、高度に発現されたプロモーターの付近に組み込まれたことを示すことができる。タンパク質レベルを、例えばウエスタンブロット法によって、測定することにより、発現を検証することもできる。
部位特異的挿入
部位特異的挿入
【0360】
本明細書で開示される方法のいずれかでの１つまたは複数の導入遺伝子の挿入は、部位特異的であり得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子をプロモーターに隣接して、例えば、Ｒｏｓａ２６プロモーターに隣接してまたはその付近に挿入することができる。
【0361】
細胞の標的となる遺伝子座の改変を、ＤＮＡをそのＤＮＡが標的遺伝子座に対して相同性を有する細胞に導入することにより、生じさせることができる。ＤＮＡは、組み込まれた構築物を含む細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むことができる。標的ベクター中の相同ＤＮＡを標的遺伝子座において染色体ＤＮＡと組み換えることができる。マーカー遺伝子の両側に、相同ＤＮＡ配列である３’組換えアームおよび５’組換えアームを隣接させることができる。
【0362】
様々な酵素は、宿主ゲノムへの外来ＤＮＡの挿入を触媒することができる。例えば、部位特異的リコンビナーゼを、明確に異なる生化学的特性を有する２つのタンパク質ファミリー、すなわち、チロシンリコンビナーゼ（ＤＮＡをチロシン残基に共有結合させる）およびセリンリコンビナーゼ（共有結合がセリン残基において起こる）に分けることができる。一部の場合には、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｆＣ３１インテグラーゼ（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓファージｆＣ３１に由来するセリンリコンビナーゼ）、またはバクテリオファージ由来の部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ、ラムダインテグラーゼ、バクテリオファージＨＫ０２２リコンビナーゼ、バクテリオファージＲ４インテグラーゼおよびファージＴＰ９０１－１インテグラーゼを含む）を含むことができる。
【0363】
発現制御配列も構築物に使用することができる。例えば、発現制御配列は、多種多様な細胞型に発現される構成的プロモーターを含むことができる。例えば、好適な、強力な構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーには、ＤＮＡウイルス（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ＣＭＶ、ＨＳＶなど）からのまたはレトロウイルスＬＴＲからの発現制御配列などがある。組織特異的プロモーターも使用することができ、特異的細胞系統に対して発現を指令するために組織特異的プロモーターを使用することができる。Ｒｏｓａ２６遺伝子プロモーターを使用して実験を行うことができるが、当業者には明らかであり得るように、遺伝子発現を指令することができる他のＲｏｓａ２６関連プロモーターを使用して同様の結果を得ることができる。したがって、本明細書における記載は、限定することを意図したものではなく、むしろ多くの可能な例の１つを開示することを意図したものである。一部の場合には、より短いＲｏｓａ２６ ５’上流配列であって、それにもかかわらず同程度の発現を実現することができるＲｏｓａ２６ ５’上流配列を使用することができる。Ｒｏｓａ２６プロモーターの小規模なＤＮＡ配列バリアント、例えば、点突然変異、部分的欠失または化学修飾も有用である。
【0364】
Ｒｏｓａ２６プロモーターを哺乳動物における発現に使用することができる。例えば、他の種（例えば、ヒト、ウシ、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびラット）のＲｏｓａ２６相同体のプロモーターを含むがこれらに限定されない、ブタＲｏｓａ２６遺伝子の５’隣接配列に類似している配列も、使用することができる。Ｒｏｓａ２６遺伝子は、異なる哺乳動物種間で十分に保存され得るため、他の哺乳動物Ｒｏｓａ２６プロモーターも使用することができる。
【0365】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して部位特異的挿入を実行することができる。例えば、ゲノムの挿入部位にニックまたは二本鎖切断をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより生じさせて挿入部位への導入遺伝子の挿入を助長することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による遺伝子編集
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による遺伝子編集
【0366】
一部の場合には、遺伝子編集は、ノックアウトを設計するのに有用であり得る。例えば、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびメガヌクレアーゼ（ｍａｇａｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を含む、ヌクレアーゼを使用して実行することができる。ヌクレアーゼは、遺伝子改変されたおよび／または組換えの、天然に存在するヌクレアーゼであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子編集系として好適であり得る。
【0367】
本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用し得る。例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して生じさせることができる。本明細書で開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９または任意の他のＣａｓ９による酵素作用は、標的部位配列において二本鎖切断を生じさせることができ、これらの標的部位配列は、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてその標的配列の２０ヌクレオチドの後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する。
【0368】
Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列にベクターを作動可能に連結させることができる。ここで使用され得るＣａｓタンパク質は、クラス１およびクラス２を含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１もしくはＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃｐｆ１、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、これらの相同体、またはこれらの改変バージョンが挙げられる。非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９などのＤＮＡ切断活性を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、一方または両方の鎖の標的配列における、例えば、標的内列内および／または標的配列の補体内での、切断を指示することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、一方または両方の鎖の標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれより多くの塩基対以内での切断を指示することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターであって、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、対応する野生型酵素に対して突然変異しており、したがって、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠いている、ベクターを、使用することができる。
【0369】
Ｃａｓ９は、野生型例示的Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ＰｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドを指すことがある。Ｃａｓ９は、野生型例示的Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓからのもの）に対して最大でまたは最大で約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドを指すこともある。Ｃａｓ９は、野生型のＣａｓ９タンパクを指すこともあり、または欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラもしくはこれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得る改変形態のＣａｓ９タンパク質を指すこともある。
【0370】
Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして使用することができる。しかし、他のものも使用することができる。一部の場合には、ある特定のゲノム標的を標的とするために異なるエンドヌクレアーゼが使用されることがある。一部の場合には、非ＮＧＧ ＰＡＭ配列を有する合成のＳｐＣａｓ９由来バリアントが使用されることもある。加えて、様々な種からの他のＣａｓ９オルソログが特定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、本発明にも有用であり得る様々なＰＡＭ配列に結合することができる。例えば、比較的大きいサイズのＳｐＣａｓ９（おおよそ４ｋｂのコード配列）は、細胞内で効率的に発現されないこともあるＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡを有するプラスミドをもたらし得る。逆に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりおおよそ１キロ塩基短く、このことが、細胞におけるその効率的発現を可能にする可能性がある。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞においておよびｉｎ ｖｉｖｏでマウスにおいて標的遺伝子を改変することができる。一部の場合には、Ｃａｓタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を標的とし得る。一部の場合には、ＮＬＲＣ５などの標的遺伝子が、例えば、Ｃａｓ９ ＰＡＭ、５’－ＮＧＧに隣接していることがある。他の場合には、他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ必要要件を有することがある。例えば、他のＰＡＭ、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰＡＭ（ＣＲＩＳＰＲ１については５’－ＮＮＡＧＡＡおよびＣＲＩＳＰＲ３については５’－ＮＧＧＮＧ）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓのＰＡＭ（５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ）が、ＮＬＲＣ５などの標的遺伝子に隣接して見出されることもある。本発明の導入遺伝子を任意のＣａｓ、またはＣａｓ誘導体、タンパク質からの任意のＰＡＭ配列に隣接して挿入することができる。一部の場合には、ＰＡＭは、ゲノム内に８～１２塩基対ごとに、または約８～１２塩基対ごとに見出されることがある。ＰＡＭは、ゲノム内に１～１５塩基対ごとに見出されることがある。ＰＡＭは、ゲノム内に５～２０塩基対ごとに見出されることもある。一部の場合には、ＰＡＭは、ゲノム内に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの塩基対ごとに見出されることがある。ＰＡＭは、ゲノム内の５～１００塩基対ごとにまたはそれらの間に見出されることがある。
【0371】
例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ系については、標的遺伝子配列は、５’－ＮＧＧ ＰＡＭに先行し（すなわち、その５’側にあり）、２０ｎｔガイドＲＮＡ配列は、逆鎖と塩基対合して、ＰＡＭに隣接したＣａｓ９切断を媒介することができる。一部の場合には、隣接切断部は、ＰＡＭの３塩基対上流にあることがあり、または約３塩基対上流にあることがある。一部の場合には、隣接切断部は、ＰＡＭの１０塩基対上流にあることがあり、または約１０塩基対上流にあることがある。一部の場合には、隣接切断部は、ＰＡＭの０～２０塩基対上流にあることがあり、または約０～２０塩基対上流にあることがある。例えば、隣接切断部は、ＰＡＭの隣に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対上流にあることがある。隣接切断部は、ＰＡＭの下流１～３０塩基対までにあることもある。
【0372】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の代替としては、哺乳動物細胞において切断活性を示すＣｐｆ１ファミリーからのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを挙げることができる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介ＤＮＡ切断の結果は、短い３’オーバーハングを伴う二本鎖切断である。Ｃｐｆ１の位置のずれた切断パターンは、旧来の制限酵素クローニングに類似した指向性遺伝子移入であって、遺伝子編集効率を向上させ得る指向性遺伝子移入の可能性を広げることができる。上記のＣａｓ９バリアントおよびオルソログと同様に、Ｃｐｆ１もまた、ＳｐＣａｓ９により選好されるＮＧＧ ＰＡＭ部位を欠いているＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムにＣＲＩＳＰＲにより標的化され得る部位の数を増やすことができる。
【0373】
１または複数の核局在配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のＮＬＳを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端にまたはその付近にＮＬＳを含むこともあり、カルボキシ末端にまたはその付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のもしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０より多くのＮＬＳを含むこともあり、またはこれらの組合せ（例えば、アミノ末端に１つまたは複数のＮＬＳ、およびカルボキシ末端に１つまたは複数のＮＬＳ）を含むこともある。１つより多くのＮＬＳが存在する場合、各々を互いに独立して選択することができ、したがって、単一のＮＬＳが１つより多くのコピーで存在することもあり、および／または１つもしくは複数のコピーで存在する１つもしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在することもある。
【0374】
方法に使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含むことができる。ＮＬＳに最も近いアミノ酸が、ＮまたはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約５０アミノ酸以内、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０アミノ酸以内にある場合、ＮＬＳは、ＮまたはＣ末端付近にあると見なされる。
【0375】
本明細書で開示される方法はまた、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは核酸、例えば少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞または胚に導入するステップを含むことができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用してエンドヌクレアーゼを特定の標的部位に方向付けることができ、この部位で、ガイドＲＮＡの５’末端は、染色体配列内の特定のプロトスペーサー配列と塩基対合する。
【0376】
ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡを含むことがあり、またはｃｒＲＮＡの一部分（例えば、機能的部分）とｔｒａｃｒＲＮＡの融合により形成されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むこともある。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを含む二重ＲＮＡであることもある。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。
【0377】
上記で論じられたように、ガイドＲＮＡは、発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。単離されたガイドＲＮＡを、またはそのガイドＲＮＡとプロモーターとをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡを、細胞または生物にトランスフェクトすることにより、ガイドＲＮＡを細胞または生物に移入することができる。他の方法で、例えばウイルス媒介遺伝子送達を使用して、ガイドＲＮＡを細胞または生物に移入することもできる。
【0378】
ガイドＲＮＡは、単離されていることもある。例えば、ガイドＲＮＡを単離されたＲＮＡの形態で細胞または生物にトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡは、当技術分野において公知の任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製することができる。ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく単離されたＲＮＡの形態で、ガイドＲＮＡを細胞に移入することができる。
【0379】
ガイドＲＮＡは、染色体配列内の標的部位に相補的であり得る５’末端の第１の領域、ステムループ構造を形成し得る第２の内部領域、および一本鎖であり得る第３の３’領域という、３つの領域を含むことができる。各ガイドＲＮＡが融合タンパク質を特定の標的部位に誘導するように、各ガイドＲＮＡの第１の領域が異なっていることもある。さらに、各ガイドＲＮＡの第２および第３の領域は、全てのガイドＲＮＡにおいて同一であることがある。
【0380】
ガイドＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対合することができるように、ガイドＲＮＡの第１の領域は、染色体配列内の標的部位の配列に相補的であることがある。一部の場合には、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチドもしくは約１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド（すなわち、１０ｎｔ～２５ｎｔ、もしくは約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、もしくは１０ｎｔ～約２５ｎｔ、もしくは約１０ｎｔ～２５ｎｔ）またはそれより多くを含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列内の標的部位との間の塩基対合領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５もしくはそれを超えるヌクレオチド長であり得、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５もしくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド長であり得ることもあり、または約１９、２０もしくは２１ヌクレオチド長であり得ることもある。
【0381】
ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成する第２の領域を含むこともある。例えば、ガイドＲＮＡにより形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループおよびステムの長さは、変わり得る。例えば、ループは、長さに３～１０ヌクレオチドまたは約３～１０ヌクレオチドの幅があり得、ステムは、長さに６～２０塩基対または約６～２０塩基対の幅があり得る。ステムは、１～１０または約１０ヌクレオチドの１つまたは複数のバルジを含み得る。第２の領域の全長は、長さに１６～６０ヌクレオチドまたは約１６～６０ヌクレオチドの幅があり得る。例えば、ループは、４ヌクレオチド長であり得または約４ヌクレオチド長であり得、ステムは、１２塩基であり得または約１２塩基対であり得る。
【0382】
ガイドＲＮＡは、本質的に一本鎖であり得る第３の領域を３’末端に含むこともある。例えば、第３の領域は、目的の細胞内のいずれの染色体配列にも相補的でないこともあり、ガイドＲＮＡの残部に相補的でないこともある。さらに、第３の領域の長さは、変わり得る。第３の領域は、４ヌクレオチド長を超えるまたは約４ヌクレオチド長を超えることがある。例えば、第３の領域の長さは、長さに５～６０ヌクレオチドまたは約５～６０ヌクレオチドの幅があり得る。
【0383】
ガイドＲＮＡは、遺伝子標的の任意のエクソンまたはイントロンを標的とすることができる。一部の場合には、ガイドは、遺伝子の第１または第２のエクソンを標的とすることができ、他の場合には、ガイドは、遺伝子の第３または第４のエクソンを標的とすることができる。組成物は、全てが同じエクソンを標的とする複数のガイドＲＮＡを含むこともあり、または一部の場合には、異なるエクソンを標的とすることができる複数のガイドＲＮＡを含むこともある。遺伝子のエクソンおよびイントロンを標的とすることができる。
【0384】
ガイドＲＮＡは、２０ヌクレオチドのまたは約２０ヌクレオチドの核酸配列を標的とすることができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満または約２０ヌクレオチド未満であり得る。標的核酸は、長さが少なくともまたは少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、または１～１００ヌクレオチドの間の範囲であり得る。標的核酸は、長さが最大でまたは最大で約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、または１～１００ヌクレオチドの間の範囲であり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基であり得、またはすぐ５’側の約２０塩基であり得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列を標的とすることができる。標的核酸は、少なくともまたは少なくとも約１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、または１～１００であり得る。
【0385】
ガイド核酸、例えば、ガイドＲＮＡは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム内の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズすることができる核酸を指すこともある。ガイド核酸は、ＲＮＡであることがある。ガイド核酸は、ＤＮＡであることもある。ガイド核酸を、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含むことがあり、シングルガイド核酸と呼ばれることがある。ガイド核酸は、２本のポリヌクレオチド鎖を含むことがあり、ダブルガイド核酸と呼ばれることがある。ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することができ、および／または化学的に合成することができる。ＲＮＡを、合成ＤＮＡ分子、例えばｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片から転写することができる。次いで、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。ガイドＲＮＡを、非ＲＮＡ核酸分子、例えばＤＮＡ分子、の形態で細胞または胚に導入することもできる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、目的の細胞または胚におけるガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列に作動可能に連結させることができる。ＲＮＡコード配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結ことができる。ガイドＲＮＡを発現させるために使用され得るプラスミドベクターとしては、ｐｘ３３０ベクターおよびｐｘ３３３ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の場合には、プラスミドベクター（例えば、ｐｘ３３３ベクター）は、少なくとも２つのガイドＲＮＡコードＤＮＡ配列を含むことができる。ｐｘ３３３ベクターを使用して、例えば、ＧＧＴＡ１－１０およびＧａｌ２－２、またはＧＧＴＡ１－１０、Ｇａｌ２－２およびＮＬＲＣ５－６を導入することができる。他の場合には、ＮＬＲＣ５－６およびＧａｌ２－２をｐｘ３３３ベクターで導入することができる。
【0386】
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列がベクターの一部であることもある。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことがある。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、直線状であることもある。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、環状であることもある。
【0387】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列、およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、細胞に導入される場合、各々のＤＮＡ配列が別の分子（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼコード配列を含有する１つのベクター、およびガイドＲＮＡコード配列を含有する第２のベクター）の一部であることもあり、または両方が同じ分子（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの両方のコード（および調節）配列を含有する１つのベクター）の一部であることもある。
【0388】
ガイドＲＮＡは、ブタまたはブタ細胞における遺伝子を標的とすることができる。一部の場合には、ガイドＲＮＡは、ブタＮＬＲＣ５遺伝子を標的とすることができる。一部の場合には、ガイドＲＮＡを、ブタＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨまたはＢ４ＧＡＬＮＴ２遺伝子を標的とするように設計することができる。一部の場合には、少なくとも２つのガイドＲＮＡが導入される。少なくとも２つのガイドＲＮＡは、各々、２つの遺伝子を標的とすることができる。例えば、一部の場合には、第１のガイドＲＮＡは、ＧＧＴＡ１を標的とすることができ、第２のガイドＲＮＡは、ＣＭＡＨを標的とすることができる。一部の場合には、第１のガイドＲＮＡは、ＧＧＴＡ１を標的とすることができ、第２のガイドＲＮＡは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的とすることができる。他の場合には、第１のガイドＲＮＡは、ＧＧＴＡ１を標的とすることができ、第２のガイドＲＮＡは、ＣＭＡＨを標的とすることができ、第３のガイドＲＮＡは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的とすることができる。一部の場合には、ガイドＲＮＡは、ヒトまたは非ヒト動物細胞における遺伝子を標的とすることができる。
【0389】
ガイド核酸は、新しいまたは増強された特徴を有する核酸を提供するための１つまたは複数の改変を含み得る。ガイド核酸は、核酸親和性タグを含むことがある。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および／または改変ヌクレオチドを含み得る。
【0390】
一部の場合には、ｇＲＮＡは、改変を含み得る。改変をｇＲＮＡの任意の位置に加えることができる。１つより多くの改変をシングルｇＲＮＡに加えることができる。ｇＲＮＡは、改変後に品質管理され得る。一部の場合には、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳまたはこれらの任意の組合せを含み得る。
【0391】
ｇＲＮＡの改変は、置換、挿入、欠失、化学的修飾、物理的修飾、安定化、精製、またはこれらの任意の組合せであり得る。ｇＲＮＡを、５’アデニレート、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸エステル、３’チオリン酸エステル、５’リン酸エステル、５’チオリン酸エステル、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジンダイマー、トリマー、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’改変、５’－５’改変、脱塩性、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシドアナログプリン、２’デオキシリボヌクレオシドアナログピリミジン、リボヌクレオシドアナログ、２’－０－メチルリボヌクレオシドアナログ、糖修飾アナログ、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホン酸エステル、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、プソイドウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、またはこれらの任意の組合せにより、改変することもできる。
【0392】
一部の場合には、改変は、永続的である。他の場合には、改変は、一過的である。一部の場合には、複数の改変がｇＲＮＡに加えられる。ｇＲＮＡ改変は、ヌクレオチドの物理化学的特性、例えば、それらの立体構造、方向性、疎水性、化学反応性、塩基対合相互作用、またはこれらの任意の組合せを変更することができる。
【0393】
改変は、代用ホスホロチオエートであることもある。一部の場合には、天然ホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによって急速に分解されやすいことがあり、代用ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を使用するヌクレオチド間連結の改変によって、細胞分解による加水分解に対する安定性がより高くなり得る。改変は、ｇＲＮＡの安定性を増大させることができる。改変は、生物活性を増強することもできる。一部の場合には、ホスホロチオエート増強ＲＮＡ ｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、仔ウシ血清ヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組合せを阻害することができる。これらの特性は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのヌクレアーゼへの曝露の可能性が高い用途に使用されるＰＳ－ＲＮＡ ｇＲＮＡの使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合をｇＲＮＡの５’または３’末端の最後の３～５ヌクレオチドの間に導入することができ、これはエンドヌクレアーゼ分解を阻害することができる。一部の場合には、ホスホロチオエート結合をｇＲＮＡ全体にわたって付加させて、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減させることができる。
導入遺伝子
導入遺伝子
【0394】
導入遺伝子、または外来性核酸配列は、導入遺伝子を用いないよりも高レベルで内在性遺伝子を過剰発現させるのに有用であり得る。加えて、外来性核酸配列を使用して、外来性遺伝子を発現させることができる。導入遺伝子は、他の遺伝子型、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子も包含し得る。
【0395】
タンパク質Ｘの導入遺伝子は、タンパク質Ｘをコードする外来性核酸配列を含む導入遺伝子を指すこともある。本明細書で使用される場合、一部の場合には、タンパク質Ｘをコードする導入遺伝子は、タンパク質Ｘのアミノ酸配列の１００％または約１００％をコードする導入遺伝子であり得る。一部の場合には、タンパク質Ｘをコードする導入遺伝子は、タンパク質Ｘの全アミノ酸配列をコードすることもあり、または部分アミノ酸配列をコードすることもある。例えば、導入遺伝子は、タンパク質Ｘのアミノ酸配列の少なくともまたは少なくとも約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％、例えば、９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０もしくは６０％～５０％、または約９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０もしくは６０％～５０％をコードし得る。導入遺伝子の発現は、機能性タンパク質、例えば、部分的にまたは完全に機能性のタンパク質を最終的にもたらすことができる。上記で論じられたように、部分配列が発現された場合、最終的な結果は、非機能性タンパク質となり得る場合もあり、またはドミナントネガティブタンパク質となり得る場合もある。非機能性タンパク質またはドミナントネガティブタンパク質は、機能性（内在性または外来性）タンパク質と競合することもある。導入遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ）をコードすることもある。一部の場合には、導入遺伝子がｍＲＮＡをコードする場合、その結果として、この導入遺伝子は、ポリペプチド（例えば、タンパク質）に翻訳され得る。したがって、導入遺伝子は、タンパク質をコードすることができると考えられる。導入遺伝子は、一部の事例では、タンパク質をコードすることもあり、またはタンパク質の一部分をコードすることもある。加えて、タンパク質は、野生型ポリペプチドと比較して１つまたは複数の突然変異（例えば、欠失、挿入、アミノ酸置換、または再配列）を有することがある。タンパク質は、天然ポリペプチドであることもあり、または人工ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）であることもある。導入遺伝子は、２つまたはそれより多くのポリペプチドにより形成された融合タンパク質をコードすることもある。
【0396】
導入遺伝子、または外来性核酸配列は、天然に存在するｍＲＮＡ（例えば、別の種に通常は見られるｍＲＮＡ）をコードし、このｍＲＮＡは、５’または３’非翻訳領域に１つまたは複数の改変を含むことがある。１つまたは複数の改変は、１つもしくは複数の挿入、１つもしくは複数の欠失、または１つもしくは複数のヌクレオチド変化、またはこれらの組合せを含み得る。１つまたは複数の改変は、ｍＲＮＡの安定性を増大させることができる。１つまたは複数の改変は、翻訳を阻害することまたはｍＲＮＡ分解を刺激することができるｍｉＲＮＡ分子などの、ｍｉＲＮＡ分子の結合部位を除去することができる。例えば、ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードするｍＲＮＡを、ｍｉＲ１４８ファミリーｍｉＲＮＡの結合部位を除去するように改変することができる。この結合部位の除去は、ｍＲＮＡ安定性を増大させることができる。
【0397】
導入遺伝子を、導入遺伝子の産物を産生する様式で生物、細胞、組織または臓器内に配置することができる。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子を含む非ヒト動物が、本明細書で開示される。１つまたは複数の導入遺伝子は、本明細書に記載の１つまたは複数の破壊と組み合わせて存在することができる。導入遺伝子を細胞の組み入れることができる。例えば、導入遺伝子を生物の生殖細胞系に組み入れることができる。細胞に挿入された場合、導入遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコピーである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）セグメント、またはゲノムＤＮＡのその元々の領域（イントロンを有するもしくは有さない）に存在するそれ自体の遺伝子、のどちらかになり得る。
【0398】
導入遺伝子は、ある種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、異なる種の動物においてタンパク質を発現するポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、導入遺伝子は、ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。そのようなポリヌクレオチドは、非ヒト動物（例えば、ブタ）においてヒトタンパク質（例えば、ＣＤ４７）を発現させるために使用することができる。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、合成のものであることがあり、例えば、任意のネイティブポリヌクレオチドとは配列および／または化学的特性の点で異なることがある。
【0399】
種Ｘのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、種Ｙの動物においてそのタンパク質を発現させるために最適化することができる。コドン使用頻度の偏り（例えば、コードＤＮＡにおける同義コドンの出現頻度の差）があることがある。コドンは、ポリペプチド鎖内の特定のアミノ酸残基をコードする一連のヌクレオチド（例えば、一連の３ヌクレオチド）であることもあり、または翻訳の終結のためのもの（例えば、停止コドン）であることもある。異なる種は、ＤＮＡコドンにおける異なる選好性を有し得る。最適化されたポリヌクレオチドは、一部の場合には種Ｙのコドンを有する、種Ｘのタンパク質をコードすることができ、したがって、種Ｘのタンパク質をコードするネイティブ遺伝子と比較して、種Ｙにおいてタンパク質をより高い効率で発現することができる。一部の場合には、最適化されたポリヌクレオチドは、種Ｙにおいてタンパク質を、同じタンパク質をコードする種Ｘのネイティブ遺伝子よりも少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、８０％、９０％、１．５倍、２倍、５倍または１０倍高い効率で発現することができる。
【0400】
導入遺伝子と遺伝子破壊の組合せを使用することができる。非ヒト動物は、１つまたは複数の低減された遺伝子および１つまたは複数の導入遺伝子を含むことができる。例えば、発現が低減される１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＭＨＣＩＩＴＡおよび／またはこれらの任意の組合せのうちのいずれか１つを含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、これらの任意の機能性断片、および／またはそれらの組合せを含むことがある。例えば、単に様々な組合せを説明すると、発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＴＡＰ１を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＧＧＴＡ１を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＴＡＰ１を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＧＧＴＡ１を含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含むことがある。発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１およびＣＭＡＨを含むことがあり、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含むことがある。
【0401】
一部の場合には、遺伝子の第１のエクソンは、遺伝子改変される。例えば、遺伝子改変され得る、遺伝子の１つまたは複数の第１のエクソンは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＭＨＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される遺伝子であり得る。
【0402】
一部の場合には、導入遺伝子は、１つまたは複数のＭＨＣ対立遺伝子の全てまたは一部をコードする。例えば、導入遺伝子は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の全てまたは一部（例えば、移植片ドナーもしくはレシピエントのクラスＩ Ａ、クラスＩ Ｂ、クラスＩ Ｃ、クラスＩＩ ＤＲＡ、クラスＩＩ ＤＲＢ、クラスＩＩ ＤＰＡ、クラスＩＩ ＤＰＢ、クラスＩＩ ＤＱＡ、クラスＩＩ ＤＱＢ対立遺伝子、これらの断片、これらのペプチド、またはそれらの組合せ）をコードし得る。
【0403】
使用され得るおよび特に考えられる導入遺伝子は、本明細書で開示される遺伝子、例えば、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ（例えば、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、もしくはＨＬＡ－Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン－９、これらの任意の機能性断片、および／またはそれらの組合せに対して、ある特定の同一性および／または相同性を示す遺伝子を含み得る。したがって、遺伝子が、少なくともまたは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％相同性、例えば、少なくともまたは少なくとも約９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０％相同性を（核酸またはタンパク質レベルで）示す場合、その遺伝子を導入遺伝子として使用することができると考えられる。少なくともまたは少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性、例えば、少なくともまたは少なくとも約９９％～９０％、９０％～８０％、８０％～７０％、７０％～６０％同一性を（核酸またはタンパク質レベルで）示す遺伝子を導入遺伝子として使用することができることも考えられる。
【0404】
細胞または非ヒト動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのドミナントネガティブ導入遺伝子も含むことがある。ドミナントネガティブ導入遺伝子の発現は、ドミナントネガティブ導入遺伝子の野生型対応物の発現および／または機能を抑制し得る。それ故、例えば、ドミナントネガティブ導入遺伝子Ｘを含む細胞または非ヒト動物は、発現が低減されるＸ遺伝子を含む異なる細胞または非ヒト動物と比較して同様の表現型を有することもある。１つまたは複数のドミナントネガティブ導入遺伝子は、ドミナントネガティブＮＬＲＣ５、ドミナントネガティブＴＡＰ１、ドミナントネガティブＧＧＴＡ１、ドミナントネガティブＣＭＡＨ、ドミナントネガティブＢ４ＧＡＬＮＴ２、ドミナントネガティブＣＸＣＬ１０、ドミナントネガティブＭＩＣＡ、ドミナントネガティブＭＩＣＢ、ドミナントネガティブＭＨＣＩＩＴＡ、ドミナントネガティブＣ３、またはこれらの任意の組合せであり得る。
【0405】
遺伝子発現を抑制することができる、例えば、遺伝子をノックダウンすることができる、１つまたは複数の核酸をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む細胞または非ヒト動物も提供される。遺伝子発現を抑制するＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉおよびマイクロＲＮＡを、これらに限定されないが、含み得る。例えば、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉおよび／またはマイクロＲＮＡを非ヒト動物に与えて遺伝子発現を抑制することができる。さらに、非ヒト動物は、ｓｈＲＮＡをコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含むことがある。ｓｈＲＮＡは、特定の遺伝子に特異的であり得る。例えば、ｓｈＲＮＡは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＭＨＣＩＩＴＡ、Ｃ３、Ｂ２Ｍおよび／またはこれらの任意の組合せを含むがそれらに限定されない、本願に記載の任意の遺伝子に特異的であり得る。
【0406】
対象に移植されたとき、遺伝子改変細胞、組織または臓器は、対象において非遺伝子改変細胞、組織または臓器と比較して低い免疫応答（例えば、移植片拒絶反応）を誘発し得る。一部の場合には、免疫応答は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）およびＮＫ細胞の活性化、増殖および細胞傷害性を含み得る。したがって、本明細書で開示される遺伝子改変細胞の表現型は、細胞をＮＫ細胞、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）と共培養し、ＮＫ細胞またはＴ細胞の活性化、増殖および細胞傷害性を試験することにより、測定することができる。一部の場合には、遺伝子改変細胞により誘導されるＴ細胞またはＮＫ細胞活性化、増殖および細胞傷害性は、非遺伝子改変細胞により誘導されるものより低いことがある。一部の場合には、本明細書における遺伝子改変細胞の表現型を酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにより測定することができる。
【0407】
対象に移植されたとき、遺伝子改変細胞、組織または臓器は、免疫寛容原性免疫応答を誘発し得る。例えば、本明細書で開示される移植レシピエントＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、クラスＩ ＤＲＢ対立遺伝子）の全てまたは一部を発現する遺伝子改変細胞は、免疫寛容原性免疫応答（例えば、Ｔｒｅｇ細胞、自然サプレッサー細胞、Ｔｒ１細胞、ｔＴｒｅｇ細胞、抗炎症性サイトカインまたはこれらの組合せを含む、免疫応答）を促進し得る。
【0408】
１つまたは複数の導入遺伝子は、異なる種からのものであり得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ブタ遺伝子、ウシ遺伝子、イヌ遺伝子、ネコ遺伝子、サル遺伝子、チンパンジー遺伝子、またはこれらの任意の組合せを含み得る。例えば、導入遺伝子は、ヒトからのものであり得、したがって、ヒト遺伝子配列を有する。１つまたは複数の導入遺伝子は、ヒト遺伝子を含み得る。一部の場合には、１つまたは複数の導入遺伝子は、アデノウイルス遺伝子でない。
【0409】
導入遺伝子を非ヒト動物のゲノムにランダムまたは部位特異的様式で挿入することができる。例えば、導入遺伝子を非ヒト動物のゲノム内のランダム遺伝子座に挿入することができる。これらの導入遺伝子は、ゲノム内のどこに挿入されても完全に機能性であり得る。例えば、導入遺伝子は、それ自体のプロモーターをコードすることができ、または導入遺伝子を、それが内在性プロモーターの制御下に置かれる位置に挿入することができる。あるいは、導入遺伝子を、遺伝子に、例えば、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーター、または非コード領域に挿入することができる。導入遺伝子を遺伝子の第１のエクソンに組み込むことができる。
【0410】
導入遺伝子の１つより多くのコピーをゲノム内の１つより多くのランダム遺伝子座に挿入することができることもある。例えば、複数のコピーをゲノム内のランダム遺伝子座に挿入することができる。これは、導入遺伝子が１回ランダムに挿入された場合よりも全体的な発現の増加をもたらすことができる。あるいは、導入遺伝子のコピーを遺伝子に挿入することができ、導入遺伝子の別のコピーを異なる遺伝子に挿入することができる。導入遺伝子を標的とすることができ、したがって、それを非ヒト動物のゲノム内の特定の遺伝子座に挿入することができよう。
【0411】
導入遺伝子の発現を１つまたは複数のプロモーターにより制御することができる。プロモーターは、普遍的、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであることがある。プロモーターに隣接して挿入される導入遺伝子の発現が調節され得る。例えば、導入遺伝子を普遍的プロモーターの付近または隣に挿入した場合、導入遺伝子を非ヒト動物の全ての細胞に発現させることができる。一部の普遍的プロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＲｏｓａ２６プロモーターであり得る。
【0412】
プロモーターは、内在性プロモーターであることもあり、または外来性プロモーターであることもある。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子を内在性または外来性Ｒｏｓａ２６プロモーターに隣接して挿入することができる。さらに、プロモーターは、非ヒト動物に特異的であることがある。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子をブタＲｏｓａ２６プロモーターに隣接して挿入することができる。
【0413】
組織特異的プロモーター（細胞特異的プロモーターと同義であり得る）を使用して発現の位置を制御することができる。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子を組織特異プロモーターに隣接して挿入することができる。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、またはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、膵臓特異的プロモーター、例えばインスリンプロモーターであることがある。
【0414】
誘導性プロモーターを使用することもできる。これらの誘導性プロモーターを所望されるときに誘導剤の付加または除去により活性化および遮断することができる。誘導性プロモーターは、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ－１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、Ｍｘおよび／またはＴｒｅｘであり得ると考えられる。
【0415】
本明細書に記載の非ヒト動物または細胞は、インスリンをコードする導入遺伝子を含むことがある。インスリンをコードする導入遺伝子は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ブタ遺伝子、ウシ遺伝子、イヌ遺伝子、ネコ遺伝子、サル遺伝子、チンパンジー遺伝子、または任意の他の哺乳動物遺伝子であり得る。例えば、インスリンをコードする導入遺伝子は、ヒト遺伝子であることがある。インスリンをコードする導入遺伝子は、キメラ遺伝子、例えば、部分的にヒトの遺伝子であることもある。
【0416】
導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の転写物のレベルを検出することにより測定することができる。例えば、導入遺伝子の発現は、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護アッセイ）、逆転写ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ、例えばリアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、ドットブロット分析、ディフェレンシャルディスプレイ、遺伝子発現連鎖解析、サブトラクティブハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、ナノストリング、および／またはシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）により測定することができる。一部の場合には、導入遺伝子の発現を、遺伝子によりコードされているタンパク質を検出することによって測定することができる。例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現を、タンパク質免疫染色法、タンパク質免疫沈降、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロット法、ビシンコニン酸アッセイ、分光光度測定、質量分析、酵素アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定法）、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、および／または免疫細胞化学的検査により測定することができる。一部の場合には、導入遺伝子の発現を顕微鏡法により測定することができる。顕微鏡法は、光学、電子または走査プローブ顕微鏡法であり得る。一部の場合には、光学顕微鏡法は、明視野、斜照明、交差偏光、分散染色、暗視野、位相差、微分干渉コントラスト、干渉反射顕微鏡法、蛍光（例えば、粒子、例えば細胞が免疫染色される場合）、共焦点、単一平面照明顕微鏡法、ライトシート蛍光顕微鏡法、逆重畳積分、または連続時間符号化振幅顕微鏡法の使用を含む。
【0417】
導入遺伝子の挿入は、遺伝子型判定により検証することができる。遺伝子型判定法は、シークエンシング、制限酵素断片長多型特定（ＲＦＬＰＩ）、ランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ＰＣＲ（例えば、ロングレンジＰＣＲ、または段階的ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、およびＤＮＡマイクロアレイまたはビーズへのハイブリダイゼーションを含み得る。一部の場合には、遺伝子型判定をシークエンシングにより実行することができる。一部の場合には、シークエンシングは、高忠実度シークエンシングであり得る。シークエンシング法は、マクサム・ギルバートシークエンシング、連鎖停止法（例えば、サンガーシークエンシング）、ショットガンシークエンシング、およびブリッジＰＣＲを含み得る。一部の場合には、遺伝子型判定を次世代シークエンシングにより実行することができる。次世代シークエンシング法は、超並列シグネチャーシークエンシング、コロニーシークエンシング、パイロシークエンシング（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたパイロシークエンシング）、一分子リアルタイムシークエンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる）、イオン半導体シークエンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シークエンシングによる）、一塩基合成法（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａによるＳｏｌｅｘａシークエンシングによる）、ライゲーションによるシークエンシング（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍによるＳＯＬｉＤシークエンシング）、ＤＮＡナノボールシークエンシング、およびヘリスコープ一分子シークエンシングを含み得る。一部の場合には、本明細書における非ヒト動物の遺伝子型判定は、全ゲノムシークエンシング解析を含み得る。
【0418】
一部の場合には、動物における導入遺伝子の挿入を、導入遺伝子一部または導入遺伝子全体のシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）により検証することができる。例えば、Ｒｏｓａ２６プロモーター（例えば、細胞内のおよび／またはブタにおける）に隣接した導入遺伝子の挿入を、例えば、フォワードプライマー５’－ｃｇｃｃｔａｇａｇａａｇａｇｇｃｔｇｔｇ－３’およびリバースプライマー５’－ｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｔｇｇｔｇｔａｇ－３’を使用して、Ｒｏｓａ第１～第４のエクソンの次世代シークエンシングにより検証することができる。
【実施例0419】
これらの実施例は、単に例証目的で提供するものであり、本明細書において提供する特許請求の範囲を限定するために提供するものではない。
（実施例１）
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンでのＴ細胞活性化の抑制
（実施例１）
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンでのＴ細胞活性化の抑制
【0420】
ドナーからの寛容化ワクチンまたは前処置レジメンが、レシピエントによるグラフトに対する拒絶反応を抑制することができるかどうかを判定するために、寛容化ワクチンまたは前処置レジメン（例えば、異種グラフトまたは同種グラフトドナーからのＥＣＤＩ処理アポトーシス性脾細胞）をレシピエントに移植前および後に投与する。移植および寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与後に、レシピエントのＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化を調査する。
【0421】
ドナー膵島（例えば、野生型同種ブタ膵島、遺伝子改変ブタ膵島および／または非遺伝子改変ブタ膵島）を、１名または複数名の同種または異種レシピエント、例えば、糖尿病哺乳動物対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）に移植する。膵島と同じドナーから調製したアポトーシス性脾細胞をレシピエントに異なる時点で、例えば、（１）移植の７日前に、（２）移植の７日前におよび０日目に移植片に不随して、または（３）移植の７日前および１日後に投与する（図３）。ＰＢＭＣを同種または異種レシピエント各々から移植の前ならびに移植の７、１４、２８、４９、７７および９１日後に採取する。ＰＢＭＣにおける直接および間接的Ｔ細胞活性化をＥＬＩＳＰＯＴにより調査する。非移植レシピエントからのＰＢＭＣを陰性対照として使用する。非遺伝子改変ブタ膵島を移植したレシピエントからのＰＢＭＣを陽性対照として使用する。Ｔ細胞活性化を次の群に関して分析する：（１）非移植レシピエント（寛容化ワクチンも前処置レジメンもなし）、（２）例えば遺伝子改変ブタ膵島を、＋寛容化ワクチンまたは前処置レジメンで移植した、同種または異種レシピエント、（３）例えば遺伝子改変ブタ膵島を、＋寛容化ワクチンも前処置レジメンもなしで移植した、同種または異種レシピエント、（４）例えば非遺伝子改変ブタ膵島を、＋寛容化ワクチンまたは前処置レジメンで移植した、同種または異種レシピエント、および（５）例えば非遺伝子改変ブタ膵島を、＋寛容化ワクチンも前処置レジメンもなしで移植した、同種または異種レシピエント。寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与は、同種または異種レシピエントにおいてグラフトされた同種または異種ブタ膵島により誘導されるＴ細胞活性化を有意に低減させることができると予想される。
（実施例２）
移植レシピエントにおける移植寛容の誘導
（実施例２）
移植レシピエントにおける移植寛容の誘導
【0422】
本実施例は、移植レシピエント、例えば、哺乳動物対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）を本明細書に記載の寛容化ワクチンまたは前処置レジメン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞、ＥＣＤＩ固定Ｂリンパ球、ＥＣＤＩ固定遺伝子改変細胞）で寛容化するための例示的な方法を示す。移植片は、ヒトからのまたは有蹄動物を含むがこれらに限定されない非ヒト動物からの細胞、組織および／または臓器であり得る。例えば、膵島細胞を、例えば、死体または生存ヒトドナー、例えば、ＭＨＣ不適合ドナー、ハプロイド一致ドナーなど、または遺伝子改変もしくは遺伝子非改変有蹄動物（例えば、ブタ）から抽出し、ヒトレシピエント、例えば、糖尿病に罹患している対象に移植することができる。
【0423】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞を、移植片と同じドナーの細胞を使用して調製することができる。一部の場合には、ＭＨＣ不適合またはハプロイド一致ドナーは、移植レシピエントと部分的ＭＨＣ適合である。一部の場合には、部分的適合ドナーは、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、部分的適合ドナーは、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、部分的適合ドナーは、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
【0424】
寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの細胞を、移植ドナーとは異なるドナーからの細胞を使用して調製することができる。例えば、寛容化ワクチンまたは前処置レジメンを、細胞のドナーからの細胞を使用して調製することができ、移植片は、別の移植ドナーからのものであり得る。一部の場合には、細胞のＭＨＣ不適合またはハプロイド一致ドナーは、移植ドナーと部分的ＭＨＣ適合である。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ
Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得、移植ドナーおよび移植レシピエントによって共有されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が同じＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子である場合、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得、移植ドナーおよび移植レシピエントによって共有されるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が同じＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子である場合、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
【0425】
ドナーからの細胞（例えば、脾細胞）をＥＣＤＩにより固定し、移植レシピエントにおけるグラフト拒絶反応を抑制するために使用する。寛容化ワクチンまたは前処置レジメン（例えば、異種グラフトまたは同種グラフトドナーからのＥＣＤＩ処理アポトーシス性脾細胞）を移植前および後にレシピエントに投与して、異種グラフトまたは同種グラフトドナーからの寛容化ワクチンまたは前処置レジメンがレシピエントによる異種グラフトまたは同種グラフトに対する拒絶反応を抑制することができるかどうかを判定する。レシピエントのＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化を、実施例１で説明したように、移植および寛容化ワクチンまたは前処置レジメンの投与後に調査する。
【0426】
例えば、移植を必要とするヒトレシピエントをＥＣＤＩ固定細胞（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）で処置して、レシピエントを移植に対して寛容化する。ＥＣＤＩ固定細胞を遺伝子改変することができ、その結果、これらの細胞は、例えば、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２をコードする１つまたは複数の遺伝子の破壊を有することになる。例えば、細胞は、ＧＧＴＡ１のみが破壊されていること、またはＣＭＡＨのみが破壊されていること、またはＢ４ＧＡＬＮＴ２のみが破壊されていることがある。細胞はまた、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨが破壊されていること、ＧＧＴＡ１およびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されていること、またはＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されていることがある。細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が破壊されていることがある。一部の場合には、細胞は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０、ＭＨＣＩＩＴＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２ＤＬ、ＴＮＦＲ、ＰＥＲＶまたはこれらの任意の組合せをコードする１つまたは複数の遺伝子のさらなる破壊を有することがある。一部の場合には、細胞は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｓｐｉ９、ガレクチン、ＩＬ－３７、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ遮断剤、ＳＴ６Ｇａｌ１、ＦａｓＬ、これらの任意の機能性断片、またはそれらの任意の組合せをコードする、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを有し得る。一部の場合には、細胞のその表面をＣＤ４７でコーティングすることができる。
【0427】
ＥＣＤＩ固定細胞を移植の約７日前にレシピントに投与すること、０日目の移植に付随して投与すること、および／または移植の約１日後に再び投与することができる（図３および図４）。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路遮断剤（例えば、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト性抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）抗体、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ抗体、Ｆｃが操作されたアンタゴニスト性ＣＤ４０Ｌ抗体、アンタゴニスト性抗ｇｐ３９抗体、２Ｃ１０、２Ｃ１０Ｒ４、ＡＳＫＰ１２４０、４Ｄ１１、ブレセルマブ、ＢＩ－６５５０６４、ＨＣＤ１２２、ＣＦＺ５３３、ｃｈ５Ｄ１２、ＦＦＰ１０４、ＣＤＰ７６５７、ＢＧ９５８８、ルプリズマブ、トラリズマブ、ＩＤＥＣ－１３１、ダピロリズマブ、レトリズマブ、ＢＭＳ－９８６００４、ＶＩＢ４９２０、もしくはＭＥＤＩ４９２０）、ラパマイシン、コンプスタチン、α－ＩＬ－６Ｒ、ｓＴＮＦＲ、またはこれらの任意の組合せの用量も、移植の約８日前、ならびに移植の７および１４日後にレシピエントに投与することができる（図４）。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路遮断剤の用量は、レシピエント体重１ｋｇ当たりアンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体少なくとも約３０ｍｇであり得る。一部の場合には、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路遮断剤の用量は、約５～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【0428】
必要に応じて、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、またはこれらの任意の組合せも、移植の約８日前、ならびに移植の７および１４日後にレシピエントに投与することができる。Ｂ細胞を標的とする生物製剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または抗ＣＤ２０抗体であり得る。
（実施例３）
免疫抑制の維持を用いないヒトまたは非ヒト霊長類における膵島を移植することによるおよび同じドナーからの寛容化ワクチン（または前処置レジメン）を用いる糖尿病の処置。
（実施例３）
免疫抑制の維持を用いないヒトまたは非ヒト霊長類における膵島を移植することによるおよび同じドナーからの寛容化ワクチン（または前処置レジメン）を用いる糖尿病の処置。
【0429】
本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＣＤＩ固定ドナー細胞の免疫抑制効果を調査する。異種または同種供給源からのＥＣＤＩ固定脾細胞を、膵島を移植したヒトまたは非ヒト霊長類に投与することによって、ヒトまたは非ヒト霊長類におけるグラフト拒絶反応の可能性を最小限に抑える。
【0430】
説明に役立つ実例では、糖尿病哺乳動物対象、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類に、膵島、例えばブタ膵島、の同種グラフトまたは異種グラフトを移植する。ヒトまたは非ヒト霊長類にＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞を移植の７日前におよび必要に応じて移植の１日後に静脈内注入により投与する。免疫抑制薬を移植の当日から移植後２１日目まで投与する（図３）。ＥＣＤＩ処理脾細胞は、移植片に対する寛容を促進し、その結果、免疫抑制の中止にもかかわらず、移植片拒絶反応のリスクを低下させ、膵島による機能的状態の維持を可能にすると予想される。少用量の外因性インスリンを移植後２１日目まで投与することができる。正常血糖値を維持するために必要な外因性インスリンを移植の当日に低減させることができ、２１日目には完全に中止することができる。
【0431】
血糖値およびＣペプチドレベルを測定し、対照と比較する。例えば、非ヒト霊長類の処置のために、表１に概要を示す群に関してストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルを使用することができる。
【0432】
表１：糖尿病の非ヒト霊長類ストレプトゾトシン誘発モデルにおける膵島移植片と寛容化前処置レジメンの有効性を試験するための例示的処置群。＋は、処置を投与することを示し、－は、処置を投与しないことを示す。
【表1】
【0433】
群１については、血糖値は、移植直後に正常になり、２１日目にインスリンの中止にもかかわらず引き続き正常であると予想される。群１についての血糖値は、移植後１００日目を過ぎても外因性インスリンなしで正常なままであると予想される。移植後のピーク値、ランダムレベル、ならびに空腹条件下およびグルコース刺激条件下でのレベルを含む、血中Ｃペプチドレベルを試験することができ、血中Ｃペプチドレベルは、群１については移植後に上昇して長期間ベースラインより高いままであると予想され、これは、移植された膵島が機能していることを示す。
【0434】
ヒトまたは非ヒト霊長類のグルコース代謝は、例えば、静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）、または膵島ベータ細胞機能をモニタリングするために確立された任意の他の代謝試験によって調査することができる。ＩＶＧＴＴでは、外因性グルコースをヒトまたは非ヒト霊長類に注射し、注射後、経時的に血糖値を測定する。ＩＶＧＴＴを移植後２８日目および９０日目にヒトまたは非ヒト霊長類に対して実行することができる。群１の対象は、注射後により急速に血糖値を低下させ、グルコース濃度曲線下面積の低減を示すと予想される。
（実施例４）
寛容化ワクチン（または前処置レジメン）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤での循環免疫細胞レベルの抑制。
（実施例４）
寛容化ワクチン（または前処置レジメン）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤での循環免疫細胞レベルの抑制。
【0435】
本実施例は、異種移植または同種移植後の循環免疫細胞のレベルに対する寛容化ワクチンまたは前処置レジメン（例えば、ＥＣＤＩ固定細胞）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤（例えば、アンタゴニスト性α－ＣＤ４０抗体）の効果を調査する。循環免疫細胞のレベルは、移植片拒絶反応の指標になり得る。ＥＣＤＩ固定細胞およびアンタゴニスト性α－ＣＤ４０抗体は、異種移植または同種移植後のレシピエントにおける循環免疫細胞のレベルをモジュレートすることができる。循環免疫細胞を、ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞、およびＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞について試験する。ＥＣＤＩ固定細胞およびα－ＣＤ４０抗体は、ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリー細胞の移植後増幅を阻害する、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞のパーセンテージおよび／もしくは絶対数を増加させる、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞のパーセンテージおよび／もしくは絶対数を増加させる、またはこれらの組合せであると予想される。
ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞
ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞
【0436】
ヒトまたは非ヒト霊長類に異種または同種膵島を移植し、循環ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞のレベルをフローサイトメトリーにより判定する。寛容化ワクチンを投与しない場合、移植を受けるヒトまたは非ヒト霊長類における循環ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞のレベルは、ベースライン対照（移植片なし）と比較して増加すると予想される。ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞は、屠殺時に肝臓単核細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞区画内の存在率が高いはずである。
【0437】
ヒトまたは非ヒト霊長類の２つの群に異種または同種膵島を移植する。第１の群は対照群であり、第１の群には寛容化ワクチンを投与しない。第２の群には寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤の移植前後の注入を施す。両群における循環ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞をフローサイトメトリーにより測定する。
【0438】
寛容化ワクチンの移植前後の注入は、循環ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８－エフェクターメモリーＴ細胞の移植後増幅を対照群（寛容化ワクチンを投与しない）と比較して低減させる。一部の場合には、ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の移植後増幅の抑制レベルは、膵島移植後の免疫抑制剤、抗ＣＤ４０抗体、および／またはラパマイシンの長期投与から観察されるものと同等である。
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞
【0439】
異種移植または同種移植後の循環ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞のレベルに対する寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）およびアンタゴニスト性α－ＣＤ４０抗体の効果を調査する。低い循環ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞レベルは、移植片拒絶反応の指標になり得る。
【0440】
ヒトまたは非ヒト霊長類の２つの群に異種または同種膵島を移植する。第１の群は対照群であり、第１の群には寛容化ワクチンを投与しない。第２の群には寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤の移植前後の注入を施す。循環ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞を移植の当日、移植後７日目、５０日目および１００日目にフローサイトメトリーにより測定する。ナイーブ哺乳動物対象、例えばヒトまたは非ヒト霊長類、からの循環ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞のレベルを追加の対照として使用する。
【0441】
フローサイトメトリー結果は、寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤の移植前後の注入が、寛容化ワクチンおよび抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤を施さなかった対照レシピエントと比較して循環ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞の増加を促進することを示すと予想される。寛容化ワクチンを投与したヒトまたは非ヒト霊長類におけるこれらの調節性Ｔ細胞の移植後増加は、一部の場合には、膵島移植後に抗ＣＤ４０抗体およびラパマイシンでの維持免疫抑制を施す対象について観察される増加と同等であると予想される。
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞
【0442】
異種移植または同種移植後の循環ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞のレベルに対する寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）およびアンタゴニスト性α－ＣＤ４０抗体の効果を調査する。低い循環ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞レベルは、移植片拒絶反応の指標になり得る。
【0443】
ヒトまたは非ヒト霊長類の２つの群に異種または同種膵島を移植する。第１の群は対照群であり、第１の群には寛容化ワクチンを投与しない。第２の群には寛容化ワクチン（例えば、ＥＣＤＩ固定脾細胞）および抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤の移植前後の注入を施す。循環ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞を異種移植または同種移植の当日、ならびに異種移植または同種移植後７日目、５０日目および１００日目にフローサイトメトリーにより測定する。ナイーブヒトまたは非ヒト霊長類からの循環ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞レベルを追加の対照として使用する。
【0444】
フローサイトメトリー結果は、寛容化ワクチンおよび抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤の移植前後の注入が、寛容化ワクチンおよび抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ剤を施していない対照レシピエントと比較して循環ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋自然サプレッサー細胞の増加を促進することを示すと予想される。寛容化ワクチンレシピエントにおけるこれらの自然サプレッサー細胞の移植後増加は、一部の場合には、膵島移植後に抗ＣＤ４０抗体およびラパマイシンでの維持免疫抑制を施すレシピエントにおいて観察される増加と同等である。
（実施例５）
寛容化ワクチンおよび追加の免疫抑制剤でのヒトおよび非ヒト霊長類などの哺乳動物対象における膵島異種グラフトおよび／または同種グラフト生存の延長
（実施例５）
寛容化ワクチンおよび追加の免疫抑制剤でのヒトおよび非ヒト霊長類などの哺乳動物対象における膵島異種グラフトおよび／または同種グラフト生存の延長
【0445】
本実施例は、ＥＣＤＩ固定ドナー細胞（寛容化ワクチン）を他の免疫抑制薬と組み合わせて使用する免疫拒絶反応を抑制する例示的方法（図４）を示す。新規前処置レジメンの免疫寛容原性有効性を、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物対象における膵島（例えば、異種移植または同種移植膵島、ブタ膵島、または幹細胞由来の膵島）の門脈内移植の設定で研究する。レジメンは、（１）ＥＣＤＩ固定細胞（寛容化ワクチン）を用いて送達される抗原、（２）リツキシマブを伴うまたは伴わない、ラパマイシン、可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）、およびアンタゴニスト性抗ＩＬ－６Ｒ抗体、および（３）アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ Ａｂ ２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４の、移植前後の投与を含む。
【0446】
ＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞は、例えばクローンブタドナーからの、サイトカイン動員脾Ｂ細胞から調製する。ドナー脾臓は、例えば、クローンブタドナーから脾摘出術を使用して新たに採取する。ドナー脾Ｂ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増幅させる。約０．２５×１０９／ｋｇのＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞を、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）に移植の７日前に静脈内投与する。ドナー脾Ｂ細胞をレシピエントに移植の１日後にも投与する。
【0447】
移植を基準にして－７日目から＋２１日目までレシピエントにラパマイシンを５～１２ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルで投与する（例えば、経口的に）。可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）を－６日目から＋２１日目まで（例えば、０．５～１ｍｇ／ｋｇの用量で）皮下投与する。アンタゴニスト性抗ＩＬ－６Ｒ抗体を－７、０、７、１４および２１日目に（例えば、１０ｍｇ／ｋｇの用量で）静脈内投与する。
【0448】
一部のレシピエントについては、ＥＣＤＩ固定ドナー細胞の初回注入の前でもある膵島移植（異種または同種）の１０日前に、リツキシマブを用いてＢ細胞枯渇を開始する。２０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブの４用量を、移植を基準にして－１０、－３、＋５および＋１２日目にレシピエントに静脈内投与する。
【0449】
一部のレシピエントについては、５０ｍｇ／ｋｇのアンタゴニスト性抗ＣＤ４０ Ａｂ
２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４の３用量を、－１、＋７および＋１４日目に静脈内投与する。他のレシピエントについては、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ Ａｂ ２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４の４用量を、－８、－１、＋７および＋１４日目に静脈内投与する。
２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４の３用量を、－１、＋７および＋１４日目に静脈内投与する。他のレシピエントについては、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ Ａｂ ２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４の４用量を、－８、－１、＋７および＋１４日目に静脈内投与する。
【0450】
一部の場合には、クローンブタドナーからの成体ブタ膵島産物を移植片に使用することができる。例えば、ブタ膵島産物を７日間培養することができ、全ての放出基準を満たした時点で、レシピエントの体重１キログラム当たり２５，０００の膵島当量の用量で門脈血管アクセスポート経由で門脈内注入することができる。
【0451】
異種移植または同種移植の場でＥＣＤＩ固定ドナー細胞と一緒に薬学的活性薬剤を使用することの有効性を判定するためにレシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）を試験する。例えば、Ｔ細胞活性化ならびに循環調節性Ｔ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞および自然サプレッサーＴ細胞のレベルを経時的にモニタリングすることができる。ＥＣＤＩ処理脾細胞、ラパマイシン、ｓＴＮＦＲ、アンタゴニスト性抗ＩＬ－６Ｒ抗体およびアンタゴニスト性抗ＣＤ４０ Ａｂ（リツキシマブを伴うまたは伴わない）の移植前後レジメンは、ＥＣＤＩ処理脾細胞を施さない対象と比べて、グラフト生存を延長させる、エフェクターメモリーＴ細胞の活性化および増幅を制限する、ならびに調節性Ｔ細胞および自然サプレッサーＴ細胞の活性化および増幅を促進すると予想される。
（実施例６）
腎臓および膵島同種グラフトに対する寛容誘導の臨床移行
（実施例６）
腎臓および膵島同種グラフトに対する寛容誘導の臨床移行
【0452】
死体グラフトドナー
【0453】
死体（例えば、死亡）ドナー同種移植（例えば、腎臓または膵島同種グラフト）は、本開示の寛容化ワクチンおよびプロトコールを使用する寛容誘導にさらなる課題を提示する。本明細書で開示するプロトコールの一部は、０日目の移植を基準にして－７日目と＋１日目の両方におけるアポトーシス性ドナー白血球の移植前後の注入を含み、これらのプロトコールは、小型および大型非ヒト動物実験モデルにおいて有効であることが判明した。しかし、死亡ドナー同種移植にこのプロトコールを直接移行させることは、（１）予定ドナーの正体および利用可能性がドナー死亡時まで分からない可能性があるため、および（２）一部のタイプのグラフト（例えば、腎臓または膵臓）をドナー（例えば、死亡ドナー）からの回収後７日間、体外で保管することができないため、困難である。図２は、これらの制限を克服できる方法のプロセス概要の概略図である。
【0454】
予定の死体ドナーが前もって特定された場合（例えば、脳死した心拍のあるドナー（ＢＤＤ））、死体ドナー同種移植（例えば、腎臓の）の前に寛容誘導白血球の供給源としての第２の好適なドナーを特定することにより、本明細書に記載の寛容化ワクチンを使用する寛容誘導プロトコールを臨床の場に移行させることができる。第２のドナーからの白血球を予定同種グラフトに対するドナー特異的寛容の誘導に使用することができる。例えば、Ｂリンパ球を第２の生体ドナーから１回もしくは複数回の採血および／もしくはアフェレーシス手順で採取し、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅させることができ、または脾細胞を第２の死体ドナーから採取し、必要に応じてｅｘ ｖｉｖｏで増幅させることができる。第２のドナーは、第１の（予定同種移植）ドナーと完全ＭＨＣ適合または部分的ＭＨＣ適合であり得る。一部の場合には、寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーとハプロイドが一致している。一部の場合には、寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと１つまたは複数のＭＨＣ対立遺伝子を共有する。例えば、免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ
ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数を共有し得る。寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと１つのＤＲ対立遺伝子を共有し得る。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を、ならびに移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を、共有し得る。一部の場合には、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、免疫寛容原性細胞のドナーと移植ドナーとレシピエントとの間で共有される。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数を共有し得る。寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと１つのＤＲ対立遺伝子を共有し得る。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を、ならびに移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を、共有し得る。一部の場合には、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、免疫寛容原性細胞のドナーと移植ドナーとレシピエントとの間で共有される。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
【0455】
第２の生体ドナーについては、反復採血によってまたは１回もしくは２、３回のアフェレーシス手順によって採取したドナーＢリンパ球（ＭＨＣクラスＩ抗原とＭＨＣクラスＩＩ抗原の両方を発現する）をｅｘ ｖｉｖｏで増幅させることによって、死体ドナー（例えば、腎臓同種グラフト）に対する寛容の誘導に十分なドナー白血球を得ることができる。ヒトＢリンパ球のｅｘ ｖｉｖｏでの大規模増幅を可能にするプロトコールは、Ｓｕ ＫＹ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １５， ２０１６， １９７ （１０） ４１６３－４１７６）で報告されている。
【0456】
第２の死体ドナーから適合、部分的適合またはハプロイド一致脾臓を入手できる次第、プロトコールを開始し、－７日目に寛容誘導脾細胞、その後、０日目に移植片（例えば、腎臓移植片）の注入、そして＋１日目にｅｘ ｖｉｖｏ増幅脾Ｂ細胞の注入を行うことができる（図２および図３）。脾細胞の大部分は、ＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスＩＩの両方を発現するＢリンパ球であり、したがって、ＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞を、同種グラフト（例えば、腎臓、膵島、心臓）に対する寛容誘導のためにうまく使用することができる。１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子および１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を生体ドナーと共有する死体ドナーから調製した脾細胞および増幅脾Ｂ細胞の移植前後の注入により可能になる寛容誘導は、連鎖抑制に依存する。連鎖抑制および感染性寛容の現象は、実験的移植寛容文献に記載されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ ＨによりＮａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８において総説されている）。
【0457】
膵島移植レシピエントのために－７日目の寛容化ワクチンを死体ドナー脾臓から調製し、同日に予定膵島移植レシピエントに注入することができる。これは、単離された膵島を移植前に７日間培養下で保持することができるため、膵島移植の状況下で実行できる。＋１日目の寛容化ワクチンは、死体ドナー脾臓の分割量に由来するｅｘ ｖｉｖｏ増幅Ｂ細胞に基づき得る（例えば、図５に示す通り）。したがって、膵島移植に使用するための寛容化ワクチン接種の臨床移行を、非ヒト霊長類における膵島または腎臓同種グラフトの前臨床研究において詳しく調査することができる手法に続いてすぐに行うことができる。
【0458】
生体グラフトドナー
【0459】
本明細書に記載の寛容化ワクチンを使用する寛容誘導プロトコールを、ドナー白血球の臨床的に適切な供給源を特定することにより生体ドナー同種移植（例えば、腎臓または膵島）の臨床の場に移行させることができる。あるいはまたは加えて、代用白血球の好適な供給源を特定し、予定同種グラフトに対するドナー特異的寛容を誘導するために使用することができる。ドナー白血球の供給源として生体ドナーの脾臓を回収することで、感染を阻止するドナーの能力を損なうことがあり、そのため、ドナー白血球の代替供給源のほうが好ましいこともある。例えば、Ｂリンパ球をドナーから１回もしくは複数回の採血および／もしくはアフェレーシス手順で採取し、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅させることができ、または移植ドナーとの好適な適合者もしくは部分的適合者である別の細胞ドナーを特定することができる。
【0460】
別のドナーを免疫寛容原性白血球および同種グラフトに使用することができる。例えば、予定生体移植ドナーと完全に適合しているまたは部分的に適合している死体ドナーからの脾細胞は、免疫寛容原性白血球の臨床的に実行可能な供給源である。一部の場合には、寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーとハプロイドが一致している。一部の場合には、寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと１つまたは複数のＭＨＣ対立遺伝子を共有する。例えば、部分的適合ドナーは、移植ドナーと、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数を共有し得る。寛容化ワクチンの調製または前処置レジメンに使用される免疫寛容原性細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと１つのＤＲ対立遺伝子を共有し得る。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、細胞の部分的適合ドナーは、移植ドナーと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ
Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が、免疫寛容原性のドナーと、移植ドナーと、移植レシピエントとによって共有される場合、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｃ対立遺伝子）および少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が、免疫寛容原性のドナーと、移植ドナーと、移植レシピエントとによって共有される場合、移植レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）を共有し得る。一部の場合には、１つまたは複数の共有ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ Ｃを含まない。
【0461】
生体ドナーからの移植片については、反復採血によってまたは１回もしくは２、３回のアフェレーシス手順によって採取したドナーＢリンパ球（ＭＨＣクラスＩ抗原とＭＨＣクラスＩＩ抗原の両方を発現する）をｅｘ ｖｉｖｏで増幅させることによって、同じドナー同種グラフト（例えば、腎臓同種グラフト）に対する寛容の誘導に十分なドナー白血球を得ることができる。ヒトＢリンパ球のｅｘ ｖｉｖｏでの大規模増幅を可能にするプロトコールは、Ｓｕ ＫＹ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １５， ２０１６， １９７ （１０） ４１６３－４１７６）において報告されている。
【0462】
死体ドナーから適合、部分的適合またはハプロイド一致脾臓を入手でき次第、プロトコールを開始し、－７日目の寛容誘導脾細胞、その後、０日目に生体ドナー移植片（例えば、腎臓移植片）の注入、そして＋１日目にｅｘ ｖｉｖｏ増幅脾Ｂ細胞の注入を行うことができる（図２および図３）。１つのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子および１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を生体ドナーと共有する死体ドナーから調製した脾細胞および増幅脾Ｂ細胞の移植前後の注入により可能になる寛容誘導は、連鎖抑制に依存する。連鎖抑制および感染性寛容の現象は、実験的移植寛容文献に記載されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ ＨによりＮａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８において総説されている）。
（実施例７）
臨床の場における慢性および全身性免疫抑制の非存在下でのヒトレシピエントの膵島同種グラフトもしくは異種グラフトに対する拒絶反応の防止または膵島同種グラフトもしくは異種グラフトの生存の延長
（実施例７）
臨床の場における慢性および全身性免疫抑制の非存在下でのヒトレシピエントの膵島同種グラフトもしくは異種グラフトに対する拒絶反応の防止または膵島同種グラフトもしくは異種グラフトの生存の延長
【0463】
本実施例は、臨床の場において異種グラフトレシピエントの慢性および全身性免疫抑制の非存在下でヒトレシピエントの異種グラフト（細胞、組織もしくは臓器異種グラフト、例えば膵島）に対する拒絶反応を防止するおよび／または異種グラフトの生存を延長する例示的手法を示す。この手法は、次の３つの構成要素を含み、統合する：（１）膵島；αＧａｌ、ＭＨＣクラスＩ、補体Ｃ３およびＣＸＣＬ１０の発現の欠損および／もしくは低減を有する、ならびに／またはＨＬＡ－Ｇおよび／もしくはＨＬＡ－Ｅをトランスジェニック発現する、必要に応じて遺伝子操作された膵島；（２）αＧａｌ、Ｎｅｕ５ＧｃおよびＳｄａ／ＣＡＤの発現の欠損／低減を有する、ならびに／またはＨＬＡ－Ｇおよび／もしくはＨＬＡ－ＥをヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＤ－Ｌ２とともにもしくはなしでトランスジェニック発現する、遺伝子操作された寛容化ワクチン（例えば、ドナーアポトーシス性および非アポトーシス性単核細胞、例えば脾細胞）（遺伝子操作されたワクチン）；および（３）アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ、Ｆｃが操作されたアンタゴニスト性抗ＣＤ４０Ｌ抗体、アンタゴニスト性抗ｇｐ３９ ｍＡｂ、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、ラパマイシンおよび一過性抗炎症療法（例えば、アンタゴニスト性抗ＩＬ－６受容体ｍＡｂ、可溶性ＴＮＦ受容体、ＮＦκＢ阻害剤（例えば、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ））および／またはアルファ１アンチトリプシンの任意の組合せ）の任意の組合せを含む、一過性免疫抑制の投与。（図４）。Ｂ細胞を標的とする生物製剤の非限定的な例としては、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂおよび他の抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【0464】
破壊されたＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２とＨＬＡ－Ｇ（またはＨＬＡ－Ｅおよび／またはＢ２Ｍ）、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＰＤ－Ｌ２を発現する導入遺伝子とを含む寛容化ワクチンドナーを生成する。これらのワクチンドナーは、αＧａｌ欠損、Ｎｅｕ５Ｇｃ欠損、Ｓｄａ／ＣＡＤ欠損、ならびにＨＬＡ－Ｇおよび／またはＨＬＡ－Ｅ、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＰＤ－Ｌ２の発現を有する、単核細胞（例えば、脾細胞）を提供することができる。単核細胞（例えば、脾細胞）の一部をＥＣＤＩ固定によりアポトーシス性にすることができる。アポトーシス性および非アポトーシス性単核細胞（例えば、脾細胞）を混合して寛容化ワクチンを作製することができる。グラフトドナーは、ワクチンドナーにおけるＮＬＲＣ５（またはＴＡＰ１）、Ｃ３およびＣＸＣＬ１０遺伝子をさらに破壊することにより作製することができる。グラフトドナーは、ヒトレシピエントへの移植のための細胞、組織または臓器（例えば、膵島）を提供することができる。例えば体細胞核移植を使用して、クローニングによりワクチンドナーおよびグラフトドナーの集団を増幅させることができる。
【0465】
グラフトドナー（例えば、ヒトまたはブタ）からのグラフトをレシピエントに移植する。ワクチンドナー（例えば、ワクチンドナーブタ）により提供された細胞を含む寛容化ワクチンを移植の７日前および１日後にレシピエントに投与する。一部の場合には、ワクチンドナーとグラフトドナーは同じである。一部の場合には、グラフトドナーとワクチンドナーは、遺伝学的に同一である。一部の場合には、ワクチンドナーおよび／またはグラフトドナーは、死体である。一部の場合には、ワクチンドナーとグラフトドナーは異なる。一部の場合には、グラフトドナーとワクチンドナーは、遺伝学的に同一でない。一部の場合には、ワクチンドナーおよび／またはグラフトドナーは、死体でない。免疫抑制剤を移植より前の時点から移植後２１日目まで投与する。免疫抑制剤は、アンタゴニスト性α－ＣＤ４０抗体、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ抗体、Ｆｃが操作されたアンタゴニスト性ＣＤ４０Ｌ抗体、Ｂ細胞標的化剤（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる生物製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を標的とする生物製剤、および／またはＢ細胞をモジュレートする生物製剤、例えば、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とする生物製剤）、ラパマイシン、ならびに／または抗炎症剤、例えば、コンプスタチン、α－ＩＬ－６Ｒ抗体、ｓＴＮＦＲ、およびＮＦκＢ阻害剤（例えば、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ））の、任意の組合せを含み得る。Ｂ細胞標的化剤の非限定的な例としては、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂおよび他の抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。この手法は、レシピエントの慢性および全身性免疫抑制の非存在下でヒトレシピエントにおける異種グラフト（例えば、ブタ膵島）に対する拒絶反応を防止することおよび／または異種グラフトの生存を延長することができる。
（実施例８）
臨床試験のためのヒトおよび／またはブタＡＤＬ産物のｅｘ ｖｉｖｏ増幅
（実施例８）
臨床試験のためのヒトおよび／またはブタＡＤＬ産物のｅｘ ｖｉｖｏ増幅
【0466】
非ヒト霊長類におけるおよびヒトにおける０日目の腎臓および／または膵島移植を基準にして－７および＋１日目に注入するためのアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）の目標用量は、近似的に、レシピエント種の脾臓に存在する脾細胞の数またはその約８０％に相当し得る。例えば、ヒトレシピエントにおける０日目の腎臓および／または膵島移植を基準にして－７および＋１日目に注入するためのアポトーシスドナー白血球の目標用量は、近似的に、１つのヒト脾臓から入手可能な脾細胞の数またはその約８０％であり得る。別の例では、目標用量は、ネズミ科動物モデルでの研究により提案されているように、マウスについては約１×１０８であり得る。別の例では、目標用量は、非ヒト霊長類同種移植モデルでの研究により提案されているように、約０．２５×１０９／ｋｇまたはそれより高い用量であり得る。この多くの細胞を得るために、かなりのｅｘ ｖｉｖｏ増幅が必要であり得る。
脾臓からのｅｘ ｖｉｖｏ増幅
脾臓からのｅｘ ｖｉｖｏ増幅
【0467】
アポトーシス性ドナー白血球を脾細胞（例えば、死体ドナー脾臓からの）から生成することができる。例示的プロトコールを図５に示す。脾細胞を単離し、ＲＢＣ溶解に供し、ナイロンウールカラムでのＢ細胞濃縮に供する。
【0468】
単離された脾細胞の第１の画分（例えば、約８０％）を使用して、移植を基準にして第１の時点（例えば、－７日目）の注入のためのアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）の用量を生成することができる。脾細胞を本明細書で開示するようにＥＣＤＩ処理し、放出試験に供し、レシピエントに注入することができる。
【0469】
単離された脾細胞の第２の画分（例えば、約２０％）を取っておき、＋１日目の注入のためのＡＤＬの第２の用量を生成するために使用することができる。第２の画分をＢ細胞について濃縮するための選択（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用する陽性または陰性選択）に供することができ、ｅｘ ｖｉｖｏで（例えば、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈ－ＩＬ－２１、ｈＢＡＦＦ、およびｈ－マルチマーＣＤ４０Ｌの存在下で８日にわたって）増幅することができる。ＥＣＤＩ処理、放出試験、および移植レシピエントへの（例えば１日目の）注入の前に、濃縮Ｂ細胞を少なくとも１５倍増幅することができる。
末梢血のからのｅｘ ｖｉｖｏ増幅
末梢血のからのｅｘ ｖｉｖｏ増幅
【0470】
血液５００ｍＬ当たり１×１０８のＢ細胞に相当する、年齢２５～５０歳のヒト個体（例えば、生体腎臓ドナー）の末梢血１μＬ当たりおおよそ２００のＣＤ１９＋Ｂ細胞が存在すると仮定し、Ｂ細胞が初回濃縮プロセスにおいておよびＥＣＤＩ固定中に（最大５０％）喪失されると仮定すると、レシピエントにおける寛容誘導に十分な数の細胞を得るには≧２００倍ｅｘ ｖｉｖｏ増幅（例えば、約４００倍）が必要であり得る。例えば、体重８０ｋｇのレシピテントについては、Ｂ細胞約４×１０１０個は、－７日目と＋１日目両方のＡＤＬ注入のために、ＥＣＤＩ固定後のＢ細胞２×１０１０個を得る必要があり得る。
【0471】
例示的プロトコールを図７に示す。このプロトコールを移植の少なくとも３～４週間前に開始することができる。１回または複数回の低体積白血球アフェレーシス手順を非サイトカイン刺激生体ドナー（例えば、腎臓ドナー）に対して行う。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用して陽性または陰性選択によってＢ細胞を濃縮して、Ｂ細胞おおよそ０．５×１０９という投入細胞収量を得る。目標細胞用量を得るためにｅｘ ｖｉｖｏで濃縮したＢ細胞を少なくとも２００倍増幅させる（例えば、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－４、ｈ－ＩＬ－２１、ｈＢＡＦＦ、およびｈ－マルチマーＣＤ４０Ｌの存在下で、約１６日にわたって）。増幅後、Ｂ細胞を本明細書で開示するようにＥＣＤＩ処理し、放出試験に供し、レシピエントに（例えば、移植を基準にして－７日目および＋１日目に）注入する。
【0472】
増幅プロトコールは、ＣＤ２０ビーズを使用する磁気選別によって末梢血から循環Ｂ細胞を濃縮すること、ｅｘ ｖｉｖｏでＧＲＥＸ１００ＭフラスコにおいてｒｈＩＬ－１０、ｒＩＬ－４、ｒｈＢＡＦＦ、ｒｈＴＬＲ９ａ、ｒｈＣＤ４０Ｌ－マルチマー型、およびｒｈＡＰＲＩＬの存在下で増幅することも含み得る。増幅された細胞を回収前に２４時間、ｒｈＩＬ－２１で刺激することができる。
細胞増幅のための標準実施要領の確立
細胞増幅のための標準実施要領の確立
【0473】
例示的な標準実施要領（ＳＯＰ）を以下のように確立することができる。
【0474】
凍結保存／解凍した、または新たに使用する、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配を用いて、血液試料から単核細胞を単離し、ヒト成熟ナイーブＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ２７－ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋）細胞をＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｎａｉｖｅ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔにより陰性選択によって濃縮する。ｒｈ ＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＢＡＦＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した、５％ヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｒ５培地）中、様々な密度でＢ細胞を８～１６日の間、培養する。培養プレートもしくは皿にＣＤ１５４発現細胞（例えば、ＣＤ４０ｌｏｗ間質細胞系）を一晩、事前播種するか、または培養プレートもしくは皿をＣＤ４０Ｌ－マルチマー（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養する。４および６日目（ならびに細胞を分割し、１６日間培養する場合には１２および１４日目）に、培地の５０％を、サイトカインを含有する新鮮な予温したＲ５培地で置換する。ｅｘ ｖｉｖｏ増幅期間の終了時に、細胞を回収し、計数し、小分けし、使用するまで液体窒素中で凍結保存する。これらの条件、低投入細胞数（１条件当たり１～１０×１０３またはそれ未満）および密度（１００ Ｂ細胞／ｃｍ２）、ならびに６ウェルプレートまたは１０ｃｍ組織培養皿のどちらかを使用して、８および１６日にわたって増幅倍率および生存率を、健常ヒトボランティア、非ヒト霊長類および新生仔ブタドナー（各々ｎ＝３）からの末梢血由来Ｂ細胞、ならびに死亡ヒトドナーおよび新生仔ブタドナー（各々ｎ＝３）からの脾臓由来Ｂ細胞について比較する。
【0475】
実験計画（ＤＯＥ）統計的方法を使用して、以下のパラメーターを評価する：（１）３つの投入細胞密度；（２）３つの異なる培養容器（培養皿、Ｔフラスコ、およびＧＲＥＸ１００Ｍフラスコ）；（３）ＣＤ４０Ｌ－マルチマー（非存在、低、中および高濃度）およびＣＤ４０ｌｏｗ間質細胞；（４）ＩＬ－２対ＩＬ－１０（各々非存在または低、中もしくは高濃度）；（５）ＩＬ－４（非存在、低、中および高濃度）；（６）培養の最終日中のみ非存在もしくは１０ｎｇ／ｍｌ、または培養期間全体にわたって低、中もしくは高濃度のいずれかのＩＬ－２１；（７）ＢＡＦＦ（非存在、低、中および高濃度）；（８）ＡＰＲＩＬ（非存在、低、中および高濃度）；および（９）ｒｈＴＬＲ９（非存在、低、中および高濃度）。ロバストなＢ細胞増幅をもたらす実験条件を特定する。
【0476】
ＤＯＥ研究で特定した好適な実験条件を、血液５００ｍｌから単離したＢ細胞１×１０８などの多い投入細胞数の増幅に適した培養容器を使用して評価した。増幅したＢ細胞産物の完全品質管理（例えば、Ｂ細胞マーカーおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子産物の発現、エンドトキシン含量、生存率、生存細胞、アポトーシス性細胞および壊死細胞の計数、共培養ヒトＰＢＬからのＩＬ－１ベータおよびＩＬ－６の放出などについてのフローサイトメトリー）を行う。
【0477】
ａ）ヒト末梢血由来のＢリンパ球、ｂ）新生仔ブタ末梢血由来のＢリンパ球、ｃ）死亡ヒト臓器ドナー脾臓由来のＢリンパ球、ｄ）新生仔ブタドナー脾臓由来のＢリンパ球、およびｅ）非ヒト霊長類末梢血由来のＢリンパ球という５つの供給源からのＢ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増幅のためのＳＯＰを開発する。
【0478】
生体ドナー腎臓移植の場で末梢血から単離したＢ細胞の実規模増幅において最適化播種密度およびサイトカイン濃度を利用することにより、プロトコールの拡張性を試験する。意図した移植日の２１日前に、５００ｍＬの末梢血を採取し、陽性および陰性選択を使用してＢ細胞を精製する。精製したＢ細胞を、サイトカインと増殖因子とを補充した５Ｌの培地中で１０日間、２Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）５００Ｍ－ＣＳで増幅させて、増幅１４日目に４４×１０９のＢ細胞を得、そのうちの４０×１０９のＢ細胞を－７日目のワクチンに使用するが、残りの４×１０９のＢ細胞をｅｘ ｖｉｖｏでさらに増幅させて、＋１日目のワクチンとして使用するための４０×１０９のＢ細胞にする。
（実施例９）
腎臓同種グラフトに対するドナー特異的寛容を誘導する点でのｅｘ ｖｉｖｏ増幅ＡＤＬの移植前後の注入の有効性
（実施例９）
腎臓同種グラフトに対するドナー特異的寛容を誘導する点でのｅｘ ｖｉｖｏ増幅ＡＤＬの移植前後の注入の有効性
【0479】
ＡＤＬでの先行陰性ワクチン接種は、安全であり、その有効性は、非ヒト霊長類における膵島同種移植の臨床移行モデルにおけるロバストな寛容の誘導について比類ない。臨床移行可能なＡＤＬ産物での非ヒト霊長類における腎臓同種移植へのその用途の拡大は、臨床の場で移植寛容試験の開始への重要な波及効果があり得る。ｅｘ ｖｉｖｏ増幅Ｂ細胞を含むＡＤＬ産物は、短期免疫抑制（ＳＩ）哺乳動物レシピエント（例えば、１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子について適合している（１ＤＲＢ適合）ヒトまたは非ヒト霊長類）における腎臓同種グラフトに対する安定した同種抗原特異的寛容を誘導すると予想される。例示的プロトコールを図６に示す。
【0480】
安定した腎同種グラフト寛容を誘導するためのＡＤＬ産物の移植前後の注入の有効性を、１ＤＲＢ適合のＳＩ非ヒト霊長類において評価する。実験群には、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅ドナーＢ細胞を含むＡＤＬ産物を施し、その一方で対照群には食塩水注入を施す。ｎ＝５の群サイズを研究し、１群当たり最大２匹の追加の非ヒト霊長類を加えて、情報価値のないレシピエント（例えば、無関係の疾患に罹患しているレシピエント）の代わりに使用する。ＳＩ哺乳動物レシピエントは、両群において同一であり、長期維持薬をどのレシピエントにも投与しない。腎同種グラフト不全は、血清クレアチニン＞２．５ｍｇ／ｄＬと定義し、グラフト組織診断により確認する。
【0481】
研究用に繁殖された適格な非ヒト霊長類ドナーおよびレシピエント（検査、実験、微生物スクリーニング、ワクチン接種など）を認定ベンダーから選択する。ドナーおよびレシピエントは、定義されたＭＨＣの差異を有する（ディープシークエンシング用のアンプリコンを生成するためにＦｌｕｉｄｉｇｍ Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙを使用する高分解能ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子型判定に基づいて、ＭＨＣクラスＩが異なり、１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子が適合している、ドナー－レシピエント対）。
【0482】
既存同種反応性記憶の証拠があるレシピエントを研究から除外することができる。レシピエントの適格性基準は、ＡＢＯ適合性、負のパネル反応性抗体（ＰＲＡ；ＯｎｅＬａｍｂｄａ Ｂｅａｄアッセイ）により定義される低い記憶同種反応性、流量による負のドナー特異的抗体（ＤＳＡ）、およびドナー非ヒト霊長類に対するＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ≦１２ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣ（Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ）を含み得る。雄または雌非ヒト霊長類レシピエントを協力するようにトレーニングし、留置する中心および門脈血管アクセスを装着する。
【0483】
非ヒト霊長類における腎臓移植は、確立された手順に従う。手短に述べると、ドナーとレシピエントの両方の全身ヘパリン化後、ドナー臓器を切除し、血管をレシピエントの腎下大動脈および大静脈と吻合する。典型的に、これは、左腎血管の長さのほうが長いことから左から右への形式で実行する。ドナー尿管の中を進んで後腹膜を通り抜け、改良Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ－Ｐｏｌｉｔａｎｏ手法を使用して初期尿管膀胱吻合を膀胱の後壁に典型的には形成する。尿漏出および尿管狭窄を回避することに特に注意を払う。両側自己腎摘出を完了した後、閉鎖する。
【0484】
ｅｘ ｖｉｖｏで増幅させ、ＥＣＤＩ固定したドナーＢ細胞を、レシピエント体重１ｋｇ当たり０．２５×１０９の用量で－７および＋１日目に実験レシピエントにＩＶ注入する。おおよそ６０ｍｌの血液（体重の１％に相当する）を計画した腎移植を基準にして－２１または－２２日目（±２日）にドナーから採取し、非ヒト霊長類ＣＤ２０ビーズを使用する磁気選別によりＢ細胞を精製する。あるいはまたは加えて、Ｂ細胞を白血球アフェレーシス産物から濃縮することができる。Ｂ細胞増幅プロトコールを、Ｓｕらにより報告された培養システム（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６， １９７：４１６３－７６）から適応させる。精製されたＢ細胞（血液６０ｍｌからのおおよそ２４×１０６Ｂ細胞）をＧＲＥＸ１００Ｍフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）内で５％アカゲザル血清と５５μＭの２－ＭＥと２ｍＭのＬ－グルタミンと１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと１％ＭＥＭ非必須アミノ酸とを添加したＲＰＭＩ １６４０培地において－７日目までｅｘ ｖｉｖｏで増幅させる。培養培地に組換えヒトＣＤ４０Ｌ－マルチマー型、ＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＢＡＦＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充する。投入細胞数、培地体積、およびＣＤ４０Ｌ－マルチマー型の濃度を実行可能性研究で最適化する。細胞を７および１４日後に計数し、１４日後（－７日目）に分割し、－７日目に注入しない細胞を、＋１日目の注入のためにさらに８日間増幅させる。注入当日、細胞を氷上で１時間、ＤＰＢＳ中のＥＣＤＩ（３．２×１０８細胞当たり３０ｍｇ／ｍＬ）とともに攪拌し、洗浄し、清澄化して壊死細胞および微小凝集塊を除去し、ＡＯ／ＰＩ蛍光顕微鏡法により生存率／壊死について評定する。全てのリリース基準を満たすＥＣＤＩ固定Ｂ細胞を、２０×１０６細胞／ｍＬの最大濃度でＩＶ注入用の冷却注射器にロードする。細胞は、レシピエントへの投与まで氷上に置いたままである。ＥＣＤＩ固定細胞の分割量を３７℃で４～６時間インキュベートし、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩで標識し、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーによって分析することにより、アポトーシスの誘導をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングする。
【0485】
同一の短期免疫抑制および抗炎症療法を対照および実験対象に投与する。各薬物の初回用量を０日目の移植を基準にして－８または－７日目に投与する。アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４を５０ｍｇ／ｋｇで－８、－１、７および１４日目にＩＶ投与する。ラパマイシン（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））を－７日目から移植後２１日目まで経口（ＰＯ）投与する。目標トラフレベルは５～１２ｎｇ／ｍｌである。併用抗炎症療法は、ｉ）－７、０、７、１４および２１日目における１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶでのα－ＩＬ－６Ｒ（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））と、ｉｉ）－７および０日目における１ｍｇ／ｋｇ ＩＶでのならびに３、７、１０、１４および２１日目における皮下的に０．５ｍｇ／ｋｇでのｓＴＮＦＲ（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））とを用いるものである。
【0486】
主要有効性アウトカムは、拒絶反応のない同種グラフト生存（病理組織診断により確認される）を移植後３６５日目に示す、移植を受けた非ヒト霊長類の割合である。したがって、追跡調査は、３６５日目またはグラフト不全、どちらか早く起こる方、までである。ＡＤＬを施した実験群である群は、短期免疫抑制および抗炎症療法のみを施した対照群と比較して、拒絶反応のない同種グラフト生存の上昇を示すと予想される。
（実施例１０）
ＭＨＣにより定義されるヒトレスポンダーを使用する、ＭＨＣにより定義されるアポトーシス性ドナーＢ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹状およびＴ細胞免疫調節効果
（実施例１０）
ＭＨＣにより定義されるヒトレスポンダーを使用する、ＭＨＣにより定義されるアポトーシス性ドナーＢ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹状およびＴ細胞免疫調節効果
【0487】
異なる実験条件下で生成したＥＣＤＩ固定Ｂ細胞産物を、樹状細胞（ＤＣ）において成熟停止を誘導するそれらの能力について比較する。ヒト単球由来ＤＣをＩＬ－４およびＧＣＳＦで生成する。これらのＤＣを様々なＥＣＤＩ固定Ｂ細胞産物の存在または非存在下でインキュベートする。標準ＥＣＤＩ固定Ｂ細胞産物と、ＥＣＤＩ固定の前にＤＣ成熟の阻害剤を培養物に添加する、増強産物とを比較する。ＥＣＤＩでＢ細胞の表面にカップリングさせる、ＤＣ成熟の阻害剤は、例えば、ラパマイシン、クルクミン、ビタミンＤ３、Ｂａｙ－１１７０８５、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、およびα１－アンチトリプシンを含み得る。ＩＦＮ－γへの早期曝露はＤＣにおいてＳＴＡＴ－６およびＮＦ－ｋＢ活性化を阻害するので、ＩＦＮ－γも調査する。ＤＣ成熟阻止の読み取りは、ｉ）ＤＣ表現型マーカー（ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０）の発現、ｉｉ）ＳＴＡＴ－６リン酸化、ｉｉｉ）ＲＥＬＰ核移行、ｉｖ）ＩＬ－１２ｐ７０産生、ｖ）同種刺激能、およびｖｉ）調節表現型を有するＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏｗＦｏｘｐ３＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ４９ｂ＋Ｌａｇ－３＋ＣＤ４５ＲＡ－Ｔｒ１細胞）のプライミングを含む。ＤＣにおいて成熟阻止を誘導するＥＣＤＩ処理Ｂ細胞産物を特定する。
【0488】
レスポンダー末梢血リンパ球（ＰＢＬ）における免疫プロファイルに対するＥＣＤＩ固定ドナーＢリンパ球の厳密な組成（抗原特異性、表面にコンジュゲートしているサイトカイン／分子、ＭＨＣの差異）の効果を評価する。様々なサイトカイン／分子（例えば、ラパマイシン、クルクミン、定義されたＭＨＣクラスＩＩ抗原）がＥＣＤＩによってそれらの表面上にコンジュゲートされているＢ細胞を含む、ＥＣＤＩ固定ドナーＢ細胞を生成する。漸増用量のＥＣＤＩ固定ドナーＢ細胞を添加してまたは添加せずに、完全不適合、１ＤＲＢ適合、または１ＤＱ適合ドナーレシピント対からのＰＢＬを使用して、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行う。
【0489】
細胞を表現型判定し、増殖を様々な時点でマルチパラメーターフローサイトメトリー（例えば、ＣＦＳＥ希釈、および目的の細胞サブセットを区別するマーカーについての染色を含む）により評価する。遮断抗体を添加し、明確に異なる細胞サブセットを枯渇させて、根本的なメカニズムを精査し、増強されたＥＣＤＩ固定Ｂ細胞産物（例えば、ラパマイシン、クルクミン、定義されたＭＨＣクラスＩＩ抗原を伴うまたは伴わないＢ細胞産物）がＴ細胞免疫にどのような影響を与えるのかを判定する。読み取りは、ｉ）表面マーカー、細胞内サイトカインおよび／または転写因子により判定したときにエフェクター表現型を有するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖倍率、ｉｉ）表面マーカー、細胞内サイトカインおよび／または転写因子により判定したときに調節表現型を有するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖倍率、ならびにｉｉｉ）ＭＬＲにおける標的細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞傷害性を含む。
（実施例１１）
ＡＤＬ注入ならびに二次リンパ器官（ＳＬＯ）ドナー特異的エフェクターおよび調節性免疫細胞サブセットの効果
（実施例１１）
ＡＤＬ注入ならびに二次リンパ器官（ＳＬＯ）ドナー特異的エフェクターおよび調節性免疫細胞サブセットの効果
【0490】
本開示の前処置レジメンおよび寛容化ワクチンがどのように移植寛容を誘導するかを決定するため、ならびに移植寛容および／または拒絶の相関を特定するために、以下のアッセイを行うことができる。
【0491】
同種反応性Ｔ細胞の持続的欠失
【0492】
ナイーブな動物においては、約１～１０％の循環Ｔ細胞が同種反応性であってよく、その増幅および／または収縮は、移植グラフトの運命を決定付け得る。ＡＤＬ注入の直後、間接的なドナー特異性を示すＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、同種反応性ＴおよびＢ細胞の不稔性（ａｂｏｒｔｉｖｅ）増幅が観察される。例えば、同種反応性ＴおよびＢ細胞は、初期には増幅を示した後、鋭い数の減少を示し得る。本開示の寛容化ワクチンに応答する同種反応性Ｔ細胞を長期的に追跡するために、以下の４つの試験を同時に実施する。
【0493】
第１に、循環中の増殖しているＴ細胞を、ＡＤＬ注入後の様々な時点でＫｉ６７染色によって連続的に数える。Ｋｉ６７＋Ｔ細胞は、ＡＤＬ注入後、最初は数の増加を示した後、鋭く減少すると予想される。これらの細胞を、ナイーブな、エフェクター、および記憶表現型マーカーについて同時染色して、ＡＤＬ注入後に不稔性増幅を起こす特定のサブセットを特定する。エフェクター記憶Ｔ細胞は、初期には増幅を起こした後、鋭く減少すると予想される。ＡＤＬ注入後のドナー特異的Ｔ細胞の欠失がアポトーシスによって媒介されるかどうかを決定するために、Ｔ細胞によるアポトーシスマーカー（例えば、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＦ、ホスファチジルセリン）の発現を、特異的抗体およびアネキシンＶを使用するフローサイトメトリーによって分析する。ドナー特異的エフェクター記憶Ｔ細胞は、ＡＤＬ注入後のその初期増幅後にアポトーシスを起こすと予想される。
【0494】
第２に、自己ＭＨＣクラスＩＩによって提示される不適合ドナー抗原に対する間接的免疫に対するＡＤＬ注入の効果を決定するために、レシピエントのＰＢＬ（連続試料）および脾臓細胞（ＳＰＬＣ；終結時）を、ドナーＰＢＬに由来する溶解物でパルスした自己ＤＣと共にインキュベートする。読出しは、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（ＣＦＳＥ）、細胞内ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、およびＴＧＦ－β染色、上清中のサイトカイン、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＣＤ４０Ｌの上方調節を含む。ＡＤＬ注入は、ドナーＰＢＬに由来する溶解物でパルスした自己ＤＣに応答したＴ細胞増殖の減少をもたらすと予想されるが、第３者のＰＢＬに応答した増殖は変化しない。ＡＤＬ注入は、ドナーＰＢＬに由来する溶解物でパルスしたＤＣに応答してＩＦＮ－γおよび／またはＣＤ４０Ｌを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の数および／または割合の減少をもたらすと予想される。ＡＤＬ注入は、ドナーＰＢＬに由来する溶解物でパルスしたＤＣに応答してＩＬ－１０およびＴＧＦ－βを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の数および／または割合の増加または不変化をもたらすと予想される。
【0495】
第３に、ＭＨＣクラスＩＩ四量体を使用して、ＡＤＬ処置された対象および対照哺乳動物対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）における間接特異性を有する抗ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を追跡する。非ヒト霊長類およびヒトにおけるＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合モチーフにおける高い程度の類似性のため、ＮＣＢＩのウェブサイトのヒトゲノムを用いたＭａｍｕ ＤＲＢ１＊０３：０３：０１配列のｔ－ＢＬＡＳＴ分析を実施して、ヒトホモログを決定する。Ｍａｍｕ ＤＲＢ１＊０３：０３：０１は、ＨＬＡクラスＩＩによって ＤＲＢ１－１３ベータ鎖（受託番号ＰＯ１９１２）と９４％同一であり、９５％陽性であり、０％のギャップを有し、そのｅ値は１ｅ－１７７である。かくして、ＮＩＨ四量体施設で利用可能なＨＬＡ ＤＲＢ１－１３四量体が使用される。ＨＬＡ ＤＲＢ１－１３四量体を、Ｍａｍｕ ＤＲＢ１＊０３：０３：０１／ＨＬＡ ＤＲＢ１－１３に対する高い親和性を有する、クラスＩ同種ペプチドおよび共通のクラスＩＩペプチドと共にロードする。免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）および分析資源は、ＩＥＤＢにより推奨される予測方法を使用してＭａｍｕ ＤＲＢ１＊０３：０３：０１に対する高い結合親和性を有するドナーＭＨＣクラスＩ Ｍａｍｕ ＡおよびＢ同種ペプチドの超可変領域中のエピトープを特定するのに役立つ（例えば、Ｍａｍｕ－Ａ４＊０１：０１は、ＤＲＢ１＊１０．０１に対する非常に高い親和性を示す；その配列はＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＲＭであり、９．６のパーセンタイル順位を有する）。これらの四量体を使用して、間接同種ペプチドおよび自己ペプチド特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を追跡することができる。間接同種ペプチド特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡＤＬを注入された哺乳動物対象において、初期増幅、次いで、数の鋭い減少を示すと予想される。
【0496】
第４に、移植されたサルにおけるドナー反応性Ｔ細胞クローンを追跡するために、ＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域の高効率シーケンシングを用いる。ドナー反応性Ｔ細胞クローンは、ＡＤＬ注入に応答して最初は不稔性増幅を起こした後、数が減少すると予想される。ＲＮＡに基づく高効率ＴＣＲシーケンシング技術を使用して、（ｉ）ＡＤＬ注入および移植の前後の間隔でＴ細胞クローンの全レパートリーを比較する；ならびに（ｉｉ）その所定の分子フィンガープリントを使用することによって直接および間接ドナー特異性を示すＡＤＬ後および移植後の選択的Ｔ細胞クローンをモニタリングする。この手法は、ゲノムＤＮＡから始まる他の方法を超える利点を有する。この手法は、Ｖ遺伝子セグメント全体に及ぶ多重プライマーセットを設計および最適化する要求の多いステップを必要としない。その代わりに、ＡＤＬ注入の前後でのヒトまたは非ヒト霊長類における全ＴＣＲレパートリーを、１回目のＡＤＬ注入の２日後および２回目のＡＤＬ注入の６日後にＶＤＪセグメントの５’ＵＴＲおよび定常領域のプライマーを使用してシーケンシングする。これらの試験を拡張し、クローンレベルでのドナー反応性細胞の移植後増幅の規模および動力学を追跡するために、ＴＣＲシーケンシングを使用して、移植後に増幅されたＣＤ４＋Ｔｆｈ細胞、ＣＤ４＋ＴＥＭ、ＣＤ８＋ＴＥＭ、およびＣＤ１０７ａ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ベースライン時に存在するクローンに由来するか、またはｄｅ ｎｏｖｏで出現するクローンに由来するかどうかを決定する。直接および間接特異性を有するドナー反応性Ｔ細胞に対するＡＤＬ注入の効果を見定めるために、その分子フィンガープリントを決定する。直接特異性を有するＴ細胞のフィンガープリントについては、１方向の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、応答因子として移植前、ＡＤＬ前のＡＰＣ枯渇レシピエントＰＢＬを用いて実施する。増殖している（ＣＦＳＥ－低）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、そのＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域をシーケンシングする。ベースライン時のレシピエントであるアカゲザルに由来するＰＢＬを、ドナーＰＢＬ溶解物と共に培養した後、３サイクルの刺激後に限界希釈し、次いで、そのＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域をシーケンシングすることによって、間接ドナー特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞のフィンガープリントについては、ＡＤＬ前の自己限定、同種抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを生成する。ＡＤＬ注入および移植の前後の間隔での全ＴＣＲレパートリー内の直接および間接ＴＣＲフィンガープリントの分析は、直接および間接にプライミングされたＴ細胞クローンの単離された追跡を可能にする。
同種反応性Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導
同種反応性Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導
【0497】
ＡＤＬで処置された非ヒト霊長類におけるＴ細胞の機能状態を決定するために、Ｂｃｌ－ｘＬおよびＮＦＡＴ転写物の発現を、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって分析し、タンパク質をウエスタンブロットによって分析する。アネルギーＴ細胞は、Ｂｃｌ－ｘＬおよびＮＦＡＴの発現プロファイルの変更を示すと予想される。アネルギーは、ＩＬ－２および他のエフェクター機能の減少と関連し、主にＣＴＬＡ４およびＰＤ－１阻害シグナルによって媒介され得る。ＰＤ－１ライゲーションは、重要な細胞生存因子であるＢｃｌ－ｘＬの誘導を阻害する。そのリガンドの結合時に、ＰＤ－１はリン酸化され、ＳＨＰ１／２の動員および重要なＴＣＲシグナル伝達分子の下流の脱リン酸化を可能にし、Ｔ細胞アネルギーをもたらす。一部の場合、Ｔ細胞アネルギーは、本開示の寛容化ワクチンによる寛容誘導に寄与しない。一部の場合、Ｔ細胞アネルギーは、本開示の寛容化ワクチンによる寛容誘導に寄与する。
同種反応性Ｂ細胞レパートリー
同種反応性Ｂ細胞レパートリー
【0498】
ナイーブ（ＣＤ３－ＣＤ１９＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７－）、移行（ＣＤ３－ＣＤ１９＋ＣＤ２７－ＩｇＤ＋）、調節性（ＣＤ３－ＣＤ１９＋ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ）、および活性化記憶（ＣＤ３－ＣＤ１９＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７＋）Ｂ細胞サブセットを連続的に分析して、ｉ）寛容または拒絶に関する移植前のサブセットの重要性；および（ｉｉ）Ｂ細胞レパートリー中の移植後変化に対する本開示のレジメンの効果を決定する。結果はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＡＤＬ＋ＳＩの効果およびＢ細胞の回収からのその（失われる）助けを示す。
【0499】
Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、循環およびグラフト浸潤記憶Ｂ細胞の頻度および抗原特異性における洞察を提供することができる。連続血清試料を、ドナーＰＢＬに対するその反応性について試験して、再度、間接ドナー特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞において誘導された寛容の間接的読出しであってもよい、ドナー特異的抗体のｄｅ ｎｏｖｏでの発生に対するＡＤＬ産物の効果を試験する。精製されたＴおよびＢ細胞に対する血清反応性を使用して、それぞれ、不適合ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体の発生を区別する。ＡＤＬを含む本開示のレジメンは、レシピエントにおけるドナー特異的抗体のｄｅ ｎｏｖｏでの発生を減少させると予想される。
【0500】
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）におけるＶＤＪセグメントの体細胞組換えは、ＴＣＲと同様、受容体多様性をもたらす。ＡＤＬ注入が、ドナー反応性エフェクターＢ細胞クローンの欠失と関連し、調節性クローンの増幅を促進するかどうかを試験する。エフェクターおよび調節性Ｂ細胞を、蛍光活性化細胞選別によって選別し、５’－ＲＡＣＥ手法およびＢＣＲネットワーク分析を使用してＢＣＲシーケンシングを行う。ＡＤＬを含む本開示のレジメンは、ドナー反応性エフェクターＢ細胞クローンの増幅の減少および／または欠失と関連すると予想される。ＡＤＬを含む本開示のレジメンは、調節性Ｂ細胞クローンの増幅の増加と関連すると予想される。
ドナー特異的応答の調節
ドナー特異的応答の調節
【0501】
ＡＤＬ＋短期免疫抑制（ＳＩ）が、エフェクター／活性化ＣＤ４＋（ＴＥＭ、Ｔｂｅｔ＋、ＣＤ４０＋、Ｔｆｈ）およびＣＤ８＋（ＴＥＭ、Ｔｂｅｔ＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ１０７＋）Ｔ細胞サブセット、ならびに活性化記憶ＣＤ２０＋（Ｔｂｅｔ＋、ＣＤ２１＋ＣＤ２７＋）Ｂ細胞サブセットの移植後増幅を抑制するかどうかを、ＡＤＬ処置腎臓移植レシピエントにおいて試験し、対照である非ＡＤＬ処置腎臓レシピエントと比較する。
【0502】
ＡＤＬ注入が、活性化Ｔ細胞の負の調節因子であるＰＤ－１のその発現を上方調節することによって、Ｔ細胞免疫応答を負に調節するかどうかを決定するために、ＰＤ－１＋ＣＤ４＋およびＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＡＤＬおよびＳＩを投与したヒトまたは非ヒト霊長類の腎臓レシピエントにおいて連続的にモニタリングする。ＰＤ－１発現およびＴ細胞疲弊表現型に対するＡＤＬの効果を検査する。ＡＤＬ投与は、ドナー反応性Ｔ細胞によるＰＤ－１発現を増加させると予想される。細胞内サイトカイン染色を使用して、ドナー抗原による刺激に応答するＰＢＬのサイトカイン分泌プロファイルを分析する。ＡＤＬ投与は、ドナー抗原による刺激に応答する炎症促進性サイトカインの産生の減少、およびドナー抗原による刺激に応答する寛容と関連するサイトカインの発現の増加と関連すると予想される。ＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞のプライミングを抑制するＡＤＬ注入の能力を、１方向ＥＬＩＳＰＯＴによって評価する。一部の場合、ＡＤＬ投与は、ＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞のプライミングの減少と関連すると予想される。一部の場合、ＡＤＬ投与は、ＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞のプライミングの減少と関連しないと予想される。
【0503】
ＡＤＬ＋ＳＩが、調節性免疫細胞サブセットの数および／または頻度を増加させるかどうかを検査する。ヒトまたは非ヒト霊長類腎臓移植モデルにおける免疫サブセットの分析は、ＡＤＬ注入後のＴｒ１、Ｔｒｅｇ、ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）、Ｂｒｅｇ、および他の調節性免疫細胞サブセットの増幅を示すことができる。ＡＤＬ注入されたレシピエントおよび対照レシピエントにおけるこれらのサブセットの発生および増幅の動力学および頻度を、フローサイトメトリーによって検査し、ＡＤＬの効果を決定する。ＡＤＬ注入は、レシピエントにおけるＴｒ１、Ｔｒｅｇ、ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）、Ｂｒｅｇ、および／または他の調節性免疫細胞サブセットの増幅と関連すると予想される。循環中のこれらの調節性細胞の頻度の増加は、短命であるか、または持続的であってもよい。マウスモデルにおける試験は、共通の自己ＭＨＣクラスＩＩによる同種抗原由来ペプチドの提示が、ハプロタイプ共通ドナー特異的輸注（ＤＳＴ）の有益な効果にとって必須であることを示唆する。存在する場合、寛容の喪失の先に、１つまたは複数の調節性サブセットの喪失があるかどうかを検査する。
【0504】
調節性表現型を有する循環細胞がＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ２０＋細胞のドナー抗原特異的増殖を抑制するかどうかを評価する。ドナー抗原に応答するレシピエントのＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ２０＋細胞の増殖を、第３者抗原に応答する増殖と比較する。調節性細胞は、直接接触ならびに／またはＩＬ－１０およびＴＧＦ－βを含むサイトカインによりその抑制を示す抗原特異的エフェクター細胞の能動的な抑制によって末梢寛容を媒介することができる。枯渇および受動移入試験を実施して、腎臓または膵島同種グラフトの寛容が、ドナー特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を効率的に抑制する、循環およびグラフト内Ｔｒ１、Ｔｒｅｇ、およびＢｒｅｇ細胞の頻度の増大と関連するかどうかを検査する。さらなる試験は、ドナー反応性ＴおよびＢ細胞クローンが移植後１年で寛容レシピエントに依然として存在するが、その活性化および増殖が調節性細胞によって抑制されるかどうかを決定する。単一のＭＨＣが、ドナーと、Ｔｒｅｇを増幅するために使用される抗原との間で共有される限り、Ｔｒｅｇは、連鎖抑制を誘導することができる。ドナー特異的増殖を抑制するための調節性サブセットの効力に対するＡＤＬの影響を試験するために、レシピエントに由来するＴｒ１、Ｔｒｅｇ、ＮＳ、およびＢｒｅｇ細胞を精製し、ドナーおよび第３者のＰＢＬに応答してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制するその能力を、ＣＦＳＥ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において試験する。移植寛容を誘導する本開示の前処置レジメンは、Ｔｒ１、Ｔｒｅｇ、ＮＳ、もしくはＢｒｅｇサブセット、またはその組合せにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のドナー特異的増殖を抑制すると予想される。
【0505】
ドナー抗原に特異的である細胞の調節性プロファイルに寄与する分子メカニズムを解明するために、単一細胞プロテオミクスを行って、ドナー抗原への曝露後、細胞内リン酸化事象を特定する。マウスにおける試験により、末梢寛容の維持における異なる調節性サブセット間の多方面の相互作用が示された。本明細書に開示されるモデルにおける異なる調節性サブセット間の協調を試験するために、調節性サブセットを抑制アッセイにおいて様々な組合せで試験する。抗原認識およびＴＣＲによるシグナル伝達は、調節性Ｔ細胞の抗原特異性にとって必須である。
ＡＤＬ＋ＳＩ処置された非ヒト霊長類における寛容原性調節性メカニズムの確立および持続
ＡＤＬ＋ＳＩ処置された非ヒト霊長類における寛容原性調節性メカニズムの確立および持続
【0506】
ＡｈＲおよびＰＤ－１シグナル伝達は、免疫系において重要な役割を果たす。ナイーブ、エフェクター、および調節性Ｔ細胞サブセットにおけるＡｈＲおよびＰＤ－１の分析は、本明細書に記載のモデルにおける調節性Ｔ細胞サブセットが、調節性細胞の活性化および増幅から生じる、またはエフェクター細胞のトランス分化形質転換から生じるかどうかを明確にすることができる。Ｔ細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達の標準的活性化およびＡｈＲの発現の増加は、エフェクター細胞の調節性表現型への変換をもたらす。ＡｈＲは、トランス活性化により、Ｔｒ１細胞の機能における重要な要素であるＩＬ－１０の産生を調節する。ＡＤＬを注入された非ヒト霊長類に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞のＡｈＲ転写およびタンパク質発現の分析は、本明細書に記載のモデルにおけるＴｒ１およびＴｒｅｇ細胞の発生におけるその役割を解明するのに役立ち得る（例えば、ＡｈＲ、Ａｂ ＭＡ１－５１３を用いるフローサイトメトリーおよび／または免疫沈降による）。ＡｈＲの連続モニタリングも実施して、その発現の喪失が寛容原性調節性細胞サブセットおよびエフェクター細胞増幅の喪失と関連するかどうかを決定する。
【0507】
アポトーシス性細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の活性化を介して、調節性Ｔ細胞サブセットの発生に寄与する。ＡＰＣによるＰＤ－Ｌ１発現およびＴ細胞によるＰＤ－１発現の連続モニタリングは、調節性サブセットの発生におけるこの経路の役割を解明することができる。拒絶の前後での調節性およびエフェクター細胞のＴＣＲシーケンシングは、新しいエフェクタークローンが、拒絶を起こす完全に不適合のレシピエントにおいてｄｅ
ｎｏｖｏで出現する、および／または調節性細胞から変換されるかどうかを特定する。
ｎｏｖｏで出現する、および／または調節性細胞から変換されるかどうかを特定する。
【0508】
最新の胸腺移出（ＲＴＥ）から分化するＴ細胞サブセットと、寛容または拒絶との関連を評価する。最新の胸腺移出（ＲＴＥ）は、末梢において誘導される調節性細胞の主要な前駆体を形成し、微小環境がその運命を決定付ける。ＣＤ４＋ＲＴＥ（ＣＤ４＋ＣＤ３１＋ＰＫＴ７＋）およびＣＤ８＋ＲＴＥ（ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋）細胞を、ＰＢＬにおいては長期的に、肝臓および二次リンパ器官においては終結時に断面的に分析する。ＲＴＥおよび成熟ナイーブＴ細胞は、エフェクター、アネルギー、もしくはＴｒｅｇ（Ｔｒ１、ＮＳ）サブセットへの分極化、または欠失を含む、抗原に遭遇した後、いくつかの異なる運命をたどり得る。フロー選別されたＣＤ４／ＣＤ８ ＲＴＥ細胞の転写物を分析する。トランスクリプトームプロファイル（例えば、ＮＦＡＴおよび関連するパートナーＡＰ－１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）および他のアネルギー関連遺伝子）は、ＲＴＥ細胞の系列または運命へのコミットメントを示し得る。本開示の前処置レジメンによって誘導される寛容は、調節性および／またはアネルギー表現型を有するＴ細胞へのＲＴＥの分化と関連すると予想される。胸腺依存性末梢調節は、ＭＨＣクラスＩが異なるブタにおける、高用量カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）に基づく腎移植寛容の誘導にとって重要であると考えられる。
寛容バイオマーカーとしての調節性細胞のトランスクリプトーム
寛容バイオマーカーとしての調節性細胞のトランスクリプトーム
【0509】
寛容な非ヒト霊長類の腎臓および膵島移植レシピエントにおけるフロー選別された免疫調節性細胞サブセットのトランスクリプトームを検査して、調節性細胞が、対照と比較した場合、寛容なレシピエントにおいて機能的であり、代謝的に活性化されることを示す、ミトコンドリア呼吸の免疫調節因子および活性化因子の発現の増加が存在するかどうかを試験する。本開示の寛容誘導前処置レジメンを受けたレシピエント中の調節性細胞は、ミトコンドリア呼吸活性および免疫調節性シグナル伝達の増加と関連する遺伝子の発現の増加を示すと予想される。
【0510】
ＡＤＬ注入後の免疫調節性細胞サブセットの誘導、増幅、および維持に関与するメカニズムをさらに理解するために、移植後１４、９０、および１８０日でＰＢＬから単離されたフロー選別された細胞のトランスクリプトームを分析して、調節性Ｔ細胞の運命を決定付ける転写プログラムを見定める。ＡＤＬ処置されたレシピエントおよび対照レシピエントにおいて誘導される調節性細胞のトランスクリプトームを検査して、本明細書に記載のモデルにおける調節の誘導および維持におけるＡＤＬの役割をさらに定義する。
（実施例１２）
ＡＤＬ処置された、１つのＤＲＢ適合および不適合ＳＩ哺乳動物レシピエントにおける腎臓同種グラフトに対する抗原特異的寛容の誘導および維持におけるグラフトの役割
（実施例１２）
ＡＤＬ処置された、１つのＤＲＢ適合および不適合ＳＩ哺乳動物レシピエントにおける腎臓同種グラフトに対する抗原特異的寛容の誘導および維持におけるグラフトの役割
【0511】
ＡＤＬ＋短期免疫抑制（ＳＩ）が同種グラフトをモジュレートすることによって寛容を潜在的に持続させることができる方法の例は、（ｉ）エフェクターの、調節性免疫細胞サブセットに対する比を変化させること、（ｉｉ）両方とも、調節性免疫細胞の生成に寄与する、形質細胞様（ｐ）ＤＣおよび尿細管上皮細胞（ＲＴＥＣ）の表現型の動員／生成に影響すること、ならびに（ｉｉｉ）同種グラフト由来循環エキソソームの組成を変更することを含む。非ヒト霊長類腎同種グラフトレシピエントにおいて試験を行う。ＡＤＬを含む前処置レジメンを受けるレシピエントを、ＡＤＬを受けないレシピエントと比較する。剖検時に得られた腎臓組織を、標準的な組織病理、ＲＮＡ転写物発現試験、および回収された腎臓単核細胞（ＫＭＮＣ）の表現型決定のためにプロセシングする。
腎臓同種グラフトにおけるＡＤＬおよびエフェクター：調節性免疫細胞サブセットの比
腎臓同種グラフトにおけるＡＤＬおよびエフェクター：調節性免疫細胞サブセットの比
【0512】
ＡＤＬ注入がどのようにグラフト浸潤白血球（ＧＩＬ）の動員および普及に影響するかを確認するために、腎臓生検からＫＭＮＣを回収し、以下の細胞サブセットの絶対数および頻度を、フローサイトメトリーによって決定する：（ｉ）エフェクター／活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＥＭ、Ｔｂｅｔ＋、ＣＤ４０＋、Ｔｆｈ）、エフェクター／活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＥＭ、Ｔｂｅｔ＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ１０７＋）、および活性化記憶ＣＤ２０＋Ｂ細胞（Ｔｂｅｔ＋、ＣＤ２１＋ＣＤ２７＋）；（ｉｉ）宿主ＤＣ；（ｉｉｉ）骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、Ｔｒｅｇ、Ｔｒ１、ＮＳ、およびＢｒｅｇ細胞；ならびに（ｉｖ）組織常在性リンパ球（Ｔｒｍ、ｉＮＫＴなど）。ＧＩＬ表現型のフローサイトメトリーによる評価は、免疫病理学的試験を補完することができる。ＡＤＬを含む前処置レジメンを受けるレシピエントは、より少ないグラフト浸潤エフェクター／活性化Ｔ細胞および／またはより少ない活性化記憶Ｂ細胞を示すと予想される。ＡＤＬを含む前処置レジメンを受けるレシピエントは、より多くのＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ、Ｔｒ１、ＮＳ、および／またはＢｒｅｇ細胞を示すと予想される。
【0513】
ケモカインＩＰ－１０、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、およびリンホタクチン、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ２、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＲ５のｍＲＮＡの上方調節が、同種グラフト拒絶の間に示された。ＡＤＬ処置された、およびＡＤＬ処置されていない腎同種グラフトレシピエントから、生検を採取する。タンパク質および転写物プロファイリングを行って、エフェクターおよび調節性免疫サブセットの動員に関与するケモカインおよびケモカイン受容体の発現レベルを決定する。ＡＤＬを含む前処置レジメンを受けるレシピエントは、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、リンホタクチン、ＣＣＲ２、ＣＸＣＲ４、および／またはＣＣＲ５のより低い発現レベルを示すと予想される。
【0514】
ＣＤ３＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＤＣ、Ｂ細胞およびインドールアミン－ピロール２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）陽性細胞の動脈周囲リンパ鞘含有結節を示すＴ細胞に富むリンパ構造（ＴＯＬ）の存在を、腎臓において検査する。
同種グラフトへのｐＤＣの動員および尿細管上皮細胞（ＲＴＥＣ）の表現型に対するＡＤＬ注入の効果
同種グラフトへのｐＤＣの動員および尿細管上皮細胞（ＲＴＥＣ）の表現型に対するＡＤＬ注入の効果
【0515】
血管形成された同種グラフトに対する寛容を誘導するのに熟練した細胞集団は、（ｉ）形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）；および（ｉｉ）尿細管上皮細胞（ＲＴＥＣ；ＩＦＮ－γの存在下）を含む。ｐＤＣおよびＲＴＥＣは、移植された腎臓において特定されている。両方とも、ＩＤＯ、ＴＧＦβ、ＩＣＯＳ－Ｌ、およびＰＤ－Ｌ１を含む異なる分子の発現によって、Ｔｒｅｇの発生および同種反応性細胞の抑制を媒介することができる。ＩＦＮ－γで処理されたヒトＲＴＥＣは、クラスＩＩ経路によって同種特異的寛容を誘導する。
【0516】
実験を行って、ＡＤＬ注入が共通のＭＨＣクラスＩＩ上でのＲＴＥＣによる同種ペプチド提示を促進するかどうか、およびこれが寛容の維持と関連するかどうかを決定する。共通のＭＨＣクラスＩＩによる同種ペプチド提示は、非ＴｒｅｇのＴｒｅｇへの変換を促進することができる。実験を行って、腎同種グラフト内皮上に発現された共通のＭＨＣクラスＩＩによる同種ペプチド提示が、腎同種グラフトにおけるＴｒｅｇおよび他の調節性サブセットの富化と関連するかどうかを決定する。
【0517】
ＡＤＬを含む前処置レジメンを受けるレシピエントは、共通のＭＨＣクラスＩＩ上でのＲＴＥＣによる同種ペプチド提示の増加を示すと予想され、これは、腎同種グラフトにおけるＴｒｅｇおよび他の調節性サブセットの富化と関連すると予想される。
グラフト由来循環エキソソームプロファイルに対するＡＤＬ注入の効果
グラフト由来循環エキソソームプロファイルに対するＡＤＬ注入の効果
【0518】
エキソソームは、細胞によって循環中に放出される細胞外小胞である。エキソソームは、そのプロテオミック、ＲＮＡ、およびＤＮＡカーゴによって組織の条件状態を示すことができる。エキソソームのサイズ、プロテオーム、およびＲＮＡプロファイルは、免疫応答をモジュレートすることができ、ドナーＭＨＣエキソソームシグナルは、膵島、腎臓、および心臓移植の拒絶のバイオマーカーとして役立ち得る。エキソソーム中に存在するドナーＭＨＣ分子は、レシピエントのＡＰＣをクロスドレッシングすることができ、これらの同種ＭＨＣによりクロスドレッシングされた細胞による抗原提示は、移植後のＴ細胞活性化に寄与することができる。寛容化された同種グラフトに由来するエキソソームが寛容を媒介し、それを持続させる方法は、依然としてあまり理解されていない。
【0519】
血清精製されたエキソソームを、ＡＤＬ処置された、およびＡＤＬ処置されていないヒトまたは非ヒト霊長類の移植レシピエントから取得する。ドナーＭＨＣおよび腎組織特異性を示すエキソソームのサイズ、量、腎組織特異性、ＲＮＡプロファイル、およびプロテオミックカーゴ（同種ＭＨＣ／ペプチド複合体を含む）を、例えば、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ蛍光を使用して特徴付ける。ＡＤＬを含む前処置レジメンを受けるレシピエントは、ＡＤＬを受けていないレシピエントと比較して、変更されたエキソソームサイズ、量、腎組織特異性、ＲＮＡプロファイル、および／またはプロテオミックカーゴを示すと予想される。
（実施例１３）
膵島を移植し、短期免疫抑制と共に前処置レジメンを提供することによる糖尿病の処置。
（実施例１３）
膵島を移植し、短期免疫抑制と共に前処置レジメンを提供することによる糖尿病の処置。
【0520】
本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵島移植のためのＥＣＤＩ処理されたドナー細胞の寛容原性効果を検査する。異種または同種起源に由来するＥＣＤＩ処理された脾細胞を、膵島を移植されたヒトまたは非ヒト霊長類に投与することによって、ヒトまたは非ヒト霊長類におけるグラフト拒絶の可能性を最小化する。本実施例の前処置レジメンを、ヒトレシピエントにおける同種移植または異種移植（例えば、膵島、腎臓、または他の細胞、組織、もしくは臓器の移植）に容易に適合させることができる。
【0521】
実例では、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルを、非ヒト霊長類対象と共に使用する。ストレプトゾトシンを用いた静脈内処置によって、糖尿病を誘導する。レシピエント対象に、ＭＨＣ－Ｉが異なる、１つのＭＨＣ－ＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子適合ドナーに由来する膵島を移植する。（ｉ）移植に対して－８、－１、７、および１４日目に５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体；（ｉｉ）５～１２ｎｇ／ｍＬの標的トラフレベルで移植に対して－７日目から２１日目まで経口投与されるラパマイシン；（ｉｉｉ）移植に対して－７および０日目に１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に、移植に対して３、７、１０、１４、および２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下的に投与される可溶性ＴＮＦ受容体；ならびに（ｉｖ）移植に対して－７、０、７、１４、および２１日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されるアンタゴニスト性抗ＩＬ－６受容体抗体を含む短期免疫抑制レジメンを用いて、レシピエントを処置する。
【0522】
実験群の移植レシピエントは、移植前および必要に応じて移植後にＥＣＤＩ処理されたアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）の静脈内注入を受ける。一部の場合、ＡＤＬは、移植の約８日前に投与される。一部の場合、ＡＤＬは、移植の約７日前に投与される。一部の場合、ＡＤＬは、移植の約１日後に投与される。一部の場合、ＡＤＬは、移植の約７日後に投与される。一部の場合、ＡＤＬは、移植の約１４日後に投与される。一部の場合、ＡＤＬは、移植の約７または８日前および移植の約１、７、および／または１４日後に投与される。ＡＤＬは、本明細書に開示されるように、膵島と同じドナーまたは異なるドナーに由来するものであってもよい。
【0523】
対照群の移植レシピエントはＡＤＬを受けない。
【0524】
小用量の外因性インスリンを、移植後、２１日目まで投与してもよい。
【0525】
ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＡＤＬを受けない群と比較して、生存の改善を示すと予想される。ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＡＤＬを受けない群と比較して、拒絶のない生存の改善を示すと予想される。ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、膵島同種グラフトの長期的な機能的生存を示すと予想される。例えば、ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、彼らが外因性インスリンを受けるのをやめた後の時点（例えば、過ぎた１００日目または移植後３６５日目）を含め、移植後に血糖制御の改善を示す（例えば、正常血糖になる）と予想される。例えば、静脈内ブドウ糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、混合食事負荷試験（ＭＭＴＴ）、または膵島ベータ細胞機能をモニタリングするために確立された他の任意の代謝試験によって、血糖制御を評価することができる。ＩＶＧＴＴでは、外因性グルコースを静脈内注射し、注射後、経時的に血糖値を測定する。ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＩＶＧＴＴ後に血糖値の急速な低下およびグルコース濃度曲線下面積の減少を示すと予想される（例えば、ストレプトゾトシン処置の前のものと同等のレベル）。ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、移植後にヘモグロビンＡ１Ｃレベルの低下を示すと予想される。ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、長期的に維持される移植後のＣペプチドレベルの増加を示すと予想され、これは、移植された膵島が機能的であることを示す（例えば、空腹時Ｃペプチドレベル、グルコース刺激Ｃペプチドレベル、および／またはグルコース刺激時のＣペプチドレベルの増加）。
（実施例１４）
寛容誘導のためのレシピエント型ＭＨＣ－ＩＩの完全に不適合のアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）へのコンジュゲーション
（実施例１４）
寛容誘導のためのレシピエント型ＭＨＣ－ＩＩの完全に不適合のアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）へのコンジュゲーション
【0526】
本実施例は、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ分子をアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）にコンジュゲートすることにより、前処置レジメンの寛容誘導有効性を増強することができることを証明する。例えば、完全にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ不適合のドナー－レシピエント対について、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ分子をＡＤＬにコンジュゲートすることにより、移植された細胞、組織、または臓器に対する寛容の誘導におけるＡＤＬの有効性を増強することができる。
【0527】
１つ（または複数）の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１つまたは複数のペプチドの、完全に不適合のＡＤＬの表面へのカップリングは、ＡＤＬの取込み後のレシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子による提示のための豊富な量のレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩペプチドを提供することができる（例えば、レシピエント脾臓辺縁帯抗原提示細胞または肝臓類洞内皮細胞による）。自己ＭＨＣクラスＩＩの認識は、例えば、調節性Ｔ細胞サブセットにより、レシピエントにおいて寛容を促進することができる。
【0528】
寛容を誘導することができる手段のさらなる例は、胸腺由来ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）の活性化によるものである。ｔＴｒｅｇは、それ自身のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される、それ自身のＭＨＣクラスＩＩペプチドの認識によって選択される。ＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合し、それによって提示される自己ペプチドのかなりの割合は、ＭＨＣクラスＩＩ自体に由来する。したがって、循環（ｔ）Ｔｒｅｇの多くは、自己ＭＨＣクラスＩＩペプチドに対する特異性を有する。この複合体が活性化されたエフェクターＴ細胞の表面上に提示される場合、それはｔＴｒｅｇに対する強力な活性化シグナルとして働き、ｔＴｒｅｇ活性化、かくして、免疫寛容の促進をもたらすことができる。
【0529】
ｔＴｒｅｇを活性化することができる１つの方法は、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるＭＨＣクラスＩＩペプチドの、活性化Ｔ細胞へのトロゴサイトーシスによるものである。トロゴサイトーシスは、ＭＨＣクラスＩＩペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子全体の交換を含む。自己ＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＤＲＢ）ペプチドが結合したＭＨＣクラスＩＩ複合体の、活性化Ｔ細胞へのトロゴサイトーシスは、これらのＴ細胞を、同じ自己ＭＨＣクラスＩＩペプチドに対する特異性を有するｔＴｒｅｇの強力な活性化因子に変化させることができる。したがって、レシピエントＭＨＣクラスＩＩペプチドを提示するレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ分子が、活性化されたレシピエントＴ細胞に送達され、それによって提示される場合、これはｔＴｒｅｇに対する強力な活性化シグナルとして働くことができる。ｔＴｒｅｇの活性化は抗原特異性を必要とするが、その調節機能は抗原特異性を必要としない。そのため、活性化されたｔＴｒｅｇは、直接および間接特異性のドナー特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む抗ドナー免疫を直接下方調節し、また、Ｔｒ１細胞を含む、調節能を有する他の免疫細胞サブセットの増幅によって抗ドナー免疫を下方調節することもできる。
【0530】
自己ＭＨＣクラスＩＩに結合した自己ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）は、ＬＡＧ－３受容体シグナル伝達により寛容の誘導にも寄与することができる。それらが由来するＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合した自己ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）は、Ｔ細胞上のＬＡＧ－３受容体による認識およびそれによるシグナル伝達にとって必要とされるペプチド：ＭＨＣクラスＩＩコンフォメーションを安定化することができる。ＬＡＧ－３は、不安定なペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ複合体と安定なものを区別することができるＴＣＲコレセプターである。かくして、自己ＭＨＣクラスＩＩに結合したペプチドの特異性は、ＬＡＧ－３を介して免疫応答の特異性を調節することができる。したがって、
【0531】
ＬＡＧ－３の発現および機能は、寛容誘導と関連する。例えば、ＬＡＧ３とＣＤ４９ｂとの同時発現を使用して、Ｔｒ１細胞を特定することができ、Ｔｒ１細胞上でのＬＡＧ３の遮断は、Ｔｒ１により誘導される寛容を抑止する。ＬＡＧ３はまた、活性化されたｔＴｒｅｇ上において一過的に、および活性化されたＴｅｆｆ細胞上において有意により低いレベルで発現し、ＬＡＧ３が調節能力を有する細胞の信頼できるマーカーであり得ることを示唆する。さらに、ＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩのＬＡＧ３架橋は、ＤＣを寛容化する。自己ＭＨＣクラスＩＩペプチドが、ＬＡＧ－３認識と関連するコンフォメーションでペプチドを提示している自己ＭＨＣクラスＩＩを安定化することを考慮すると、豊富な量の自己ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）の送達は、ＤＣ上の安定な自己ペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体の存在をブーストし、それによって、寛容に寄与し得る（例えば、Ｔｒ１細胞の増幅による）。これは、１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子で適合するアポトーシス性ドナー白血球が同種移植レシピエントにおいて寛容を促進することを示すデータによって支持される。
混合リンパ球反応
混合リンパ球反応
【0532】
レシピエント型ＤＲＢペプチドとＥＣＤＩを介してカップリングしたアポトーシス性ドナー白血球が、免疫調節および移植寛容を促進する能力を決定するために、ＭＨＣにより定義される刺激性（ドナー）および応答性（レシピエント）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施した。レシピエント（応答性）型ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、Ｍａｍｕ ＤＲ３対立遺伝子について陽性の試験されたアカゲザルまたはＭａｆａ ＤＲＢ＊ｗ５０１対立遺伝子について陽性の試験されたモーリシャスカニクイザルに由来する抗原）の、ＥＣＤＩを用いたアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）の表面へのコンジュゲーションは、レシピエント（応答性）において、レシピエント／応答型ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲ３またはＤＲＢ＊Ｗ００５：０１ペプチド）に対する間接的特異性を有する（ｔ）Ｔｒｅｇ細胞およびＴｒ１細胞の活性化および増幅を増加させると仮定された。
【0533】
以下の完全に不適合のサルレシピエント／ドナー対および実験条件を選択した：レシピエントＰＢＭＣは、モーリシャスカニクイザル（Ｍａｆａ Ｍ４Ａ、Ｍ４Ａ、Ｍ４Ｂ、Ｍ４Ｂ、Ｍ４ＤＲ、Ｍ１ＤＲ）であった。アポトーシス性ドナー白血球は、ＥＣＤＩを介して細胞表面にコンジュゲートされた１４μｇの合成ＤＲＢ＊Ｗ００５：０１ペプチド（アミノ酸３２～４６、ＴＲＰＲＦＬＥＱＡＫＳＥＣＨＦ、配列番号４４）を含む、モーリシャスカニクイザル（Ｍ３Ａ、Ｍ３Ａ、Ｍ３Ｂ、Ｍ３Ｂ、Ｍ３ＤＲ、Ｍ３ＤＲ）であった。
【0534】
ＭＬＲアッセイでは、コンジュゲートされたＤＲＢペプチドを含む、および含まない３ｘ１０６個のアポトーシス性ドナー白血球を使用して、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３ｘ１０６個のレシピエントＰＢＭＣを刺激した。１日目および３日目に刺激後に収集した連続試料を、フローサイトメトリーにより、ＤＣ－１０（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋のＣＤ１４１＋ＣＤ１６３＋）、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋のＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋）およびＴｒ１細胞（ＣＤ４＋のＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋）の誘導について分析した。刺激した細胞の分析により、対照アポトーシス性ドナー白血球のみで刺激したＰＢＬと比較して、ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス性ドナー白血球を用いた刺激後、Ｔｒｅｇの頻度が１日目に６．８倍増加し、３日目に４４．３倍増加することが示された。同様に、Ｔｒ１細胞の頻度の徐々の増加（１日目に３６％および３日目に８０％）が、ＤＲＢペプチドにコンジュゲートされた、および対照のアポトーシス性ドナー白血球を用いる刺激後に観察された。ＤＣ－１０細胞については、１日目および３日目に、それぞれ、０．９８倍および１．２３倍の増加が観察された。Ｂｒｅｇについては、１日目および３日目に、それぞれ、２．１６倍および２．５２倍の増加が観察された。
【0535】
これらの結果は、アポトーシス性ドナー白血球へのレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢ）のコンジュゲーションが、寛容促進性免疫調節性細胞サブセットの増幅を促進することができることを示す。
好適なＭＨＣクラスＩＩペプチドの特定
好適なＭＨＣクラスＩＩペプチドの特定
【0536】
免疫調節性細胞サブセット（例えば、ｔＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞）を活性化および増幅するのに有効であるＭＨＣクラスＩＩペプチド（例えば、ＤＲＢペプチド）を特定するためのさらなる試験を行う。目的のペプチドを、例えば、上に開示された混合リンパ球反応によって評価することができる。読出しは、それぞれの刺激後、１、３、４および７日目でのフローサイトメトリーおよび／またはＣｙＴＯＦによるｔＴｒｅｇ、Ｔｒ１細胞、ＤＣ－１０、Ｂ１０、およびＢｒｅｇ細胞の頻度の計数を含んでもよい。増幅されたＴ細胞クローンの特異性を、合成された応答型ＭＨＣクラスＩＩおよび不適合ドナーＭＨＣクラスＩペプチドをロードした四量体（例えば、ＤＲ３およびＤＲＢ＊ｗ５０１四量体）を使用するフローによって試験することができる。目的のペプチドを、公知の、または本明細書に開示される他の技術を使用して評価することもできる。
【0537】
応答型ＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ＤＲＢ分子）に対する高い、中程度の、および低い結合親和性を有するペプチドを特定する。アポトーシス性ドナー白血球にカップリングされるペプチドの最も有効な量を、用量滴定試験において決定する。
【0538】
１つ（または複数）の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ＤＲα鎖、ＤＲβ鎖、ＤＱα鎖、ＤＱβ鎖、ＤＰα鎖、またはＤＰβ鎖）に由来する１つまたは複数のペプチドを、ＥＣＤＩを用いて（または任意の他のプロセスを用いて）、完全に不適合のＡＤＬの表面にコンジュゲートする。ＤＲα鎖は機能的に単形性であってよく、かくして、一部の場合、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰ分子のβ鎖に由来するペプチドが寛容誘導にとって好ましい。
【0539】
レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα鎖全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ鎖全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα１および／またはα２ドメイン全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ１および／またはβ２ドメイン全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＭＨＣ－ＤＲ１、ＭＨＣ－ＤＲ２、ＭＨＣ－ＤＲ３、ＭＨＣ－ＤＲ４、および／またはＭＨＣ－ＤＲ５を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、超可変領域に由来する配列を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲＢ分子の超可変領域に由来するｉｎ ｓｉｌｉｃｏで特定される高い、中程度の、または低い親和性のペプチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸のペプチド）を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ペプチド結合領域に広がる可変領域（例えば、約２０、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または４０アミノ酸のペプチド）を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、ＤＲＢ結合溝に対する親和性が変化するカテプシンＳ切断性リンカーを含む二量体ペプチドを含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、約１０～３０アミノ酸長であってもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、少なくとも１０～３０アミノ酸長であってもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、合成または組換えであってもよい。
【0540】
一部の場合、レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドは、１型糖尿病を有する患者において最も優勢なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子であるＨＬＡ ＤＲ３およびＤＲ４分子のペプチド結合溝への結合に関する高い親和性を有してもよい。考察された候補ＭＨＣクラスＩＩペプチドおよび提示されたＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ
ＤＲ３および／またはＤＲ４について陽性の移植レシピエントと関連する例として働き、この知見は、１型糖尿病、２型糖尿病、および高血圧、糸球体腎炎、間質性腎炎、多発性嚢胞腎、腎盂腎炎を含む他の疾患によって引き起こされる末期腎不全の処置のための腎臓移植を受ける移植レシピエントを含む、異なるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を有する患者における寛容誘導のためのＭＨＣクラスＩＩペプチドの選択に関する有意性を有するであろう。
ＤＲ３および／またはＤＲ４について陽性の移植レシピエントと関連する例として働き、この知見は、１型糖尿病、２型糖尿病、および高血圧、糸球体腎炎、間質性腎炎、多発性嚢胞腎、腎盂腎炎を含む他の疾患によって引き起こされる末期腎不全の処置のための腎臓移植を受ける移植レシピエントを含む、異なるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を有する患者における寛容誘導のためのＭＨＣクラスＩＩペプチドの選択に関する有意性を有するであろう。
【0541】
ヒトにおけるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ３およびＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ４分子への結合に関する高い親和性を有するＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ３およびＤＲ４ペプチドの例を、以下に提示する。
【0542】
表２：ＨＬＡ ＤＲ３複合体に結合することができるＨＬＡ ＤＲ３に由来する例示的ペプチド。
【表2-1】
【表2-2】
【0543】
表３：ＨＬＡ ＤＲ４複合体に結合することができるＨＬＡ ＤＲ３に由来する例示的ペプチド。
【表3】
【0544】
表４：ＨＬＡ ＤＲ３複合体に結合することができるＨＬＡ ＤＲ４に由来する例示的ペプチド
【表4】
【0545】
ＭＨＣクラスＩＩペプチドを、アカゲザルにおいて特定することもできる。応答型ＤＲＢ分子に対する高い、中程度の、および低い結合親和性を有するペプチドを、これらのＤＲＢ分子のヒトホモログおよび免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）を使用することによって特定することができる。
【0546】
前臨床試験において使用されるアカゲザル集団におけるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ遺伝子座の分析は、１４．３９％のコロニーがハプロタイプＤＲ３ａのものであり、１９．９％がハプロタイプＤＲ４のものであることを示す。Ｍａｍｕ ＤＲＢ配列と、ヒトゲノムとのｔ－ＢＬＡＳＴアラインメントを行って、ヒトホモログを決定した。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊０３（受託番号ＣＤＰ３２９０５．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０３ａと９２％同一であり、９６％陽性であり、０％のギャップであり、５ｅ－１７８のｅ値であった。ＨＬＡ
ＤＲＢ１＊１４（受託番号ＡＢＮ５４６８３．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０４と９２％同一であり、９５％陽性であり、０％のギャップであり、２ｅ－１７４のｅ値であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４に対する高い結合親和性を有するＭａｍｕクラスＩＩ配列に由来するペプチドを、免疫エピトープデータベース分析資源を使用して特定して、ＤＲ結合ペプチドを特定した。アカゲザルにおける選択されたＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に関する高い親和性を有するペプチドを、以下に提示する。
ＤＲＢ１＊１４（受託番号ＡＢＮ５４６８３．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０４と９２％同一であり、９５％陽性であり、０％のギャップであり、２ｅ－１７４のｅ値であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４に対する高い結合親和性を有するＭａｍｕクラスＩＩ配列に由来するペプチドを、免疫エピトープデータベース分析資源を使用して特定して、ＤＲ結合ペプチドを特定した。アカゲザルにおける選択されたＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に関する高い親和性を有するペプチドを、以下に提示する。
【0547】
表５：Ｍａｍｕ ＤＲ０３ａ複合体に結合することができるＭａｍｕ ＤＲ３に由来する例示的ペプチド。
【表5】
【0548】
表６：Ｍａｍｕ ＤＲ０３ａ複合体に結合することができるＭａｍｕ ＤＲ４に由来する例示的ペプチド
【表6】
【0549】
本実施例の前処置レジメンを、哺乳動物レシピエントにおける同種移植または異種移植（例えば、膵島、腎臓、または胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来、もしくは間葉幹細胞由来細胞、組織および臓器などの、他の細胞、組織、もしくは臓器の移植）に容易に適合させることができる。
【0550】
実例では、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ鎖、ドメイン、および／またはペプチドをＡＤＬにコンジュゲートし、ＡＤＬを使用して、異種または同種ドナーにＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩが完全に不適合のヒト膵島移植レシピエントに対する寛容を誘導する。
【0551】
脾細胞を、ＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩが完全に不適合の異種または同種起源から取得する。ＭＨＣクラスＩＩ鎖、ドメイン、および／またはペプチドを、ＥＣＤＩ処理の間にコンジュゲートして、ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートした（ＡＤＬ）を生成する。ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートしたＡＤＬを、膵島移植を受けるヒト対象に投与することによって、グラフト拒絶の可能性を低減させる。移植レシピエントは、移植前および必要に応じて、移植後、例えば、移植に対して－７日目および＋１日目に、ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートしたＡＤＬの静脈内注入を受ける。ＡＤＬは、本明細書に開示されるように、膵島と同じドナーまたは異なるドナーに由来するものであってもよい。
【0552】
レシピエント対象に、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが完全に不適合のドナーに由来する膵島を移植する。
【0553】
（ｉ）移植に対して－８、－１、７、および１４日目に５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体；（ｉｉ）５～１２ｎｇ／ｍＬの標的トラフレベルで移植に対して－７日目から２１日目まで経口投与されるラパマイシン；（ｉｉｉ）移植に対して－７および０日目に１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に、移植に対して３、７、１０、１４、および２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下的に投与される可溶性ＴＮＦ受容体；ならびに（ｉｖ）移植に対して－７、０、７、１４、および２１日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されるアンタゴニスト性抗ＩＬ－６受容体抗体を含む短期免疫抑制レジメンを用いて、レシピエントを処置する。
【0554】
小用量の外因性インスリンを、移植後、２１日目まで投与してもよい。
【0555】
対照群の移植レシピエントは、ＡＤＬを受けないか、またはレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩにコンジュゲートされていないＡＤＬを受ける。ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受けないレシピエントと比較して、改善された生存を示すと予想される。ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受けないレシピエントと比較して、改善された拒絶のない生存を示すと予想される。ＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受けないレシピエントと比較して、膵島同種グラフトの長期的な機能的生存を示すと予想される。例えば、ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受ける移植レシピエントは、彼らが外因性インスリンを受けるのをやめた後（例えば、過ぎた１００日目または移植後３６５日目）を含む、移植後に血糖制御の改善を示す（例えば、正常血糖になる）と予想される。例えば、静脈内ブドウ糖負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、混合食事負荷試験（ＭＭＴＴ）、または膵島ベータ細胞機能をモニタリングするために確立された他の任意の代謝試験によって、血糖制御を評価することができる。ＩＶＧＴＴでは、外因性グルコースを静脈内注射し、注射後、経時的に血糖値を測定する。ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受ける移植レシピエントは、ＩＶＧＴＴ後に血糖値の急速な低下およびグルコース濃度曲線下面積の減少（例えば、健康な対象と同等のレベル）を示すと予想される。ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受ける移植レシピエントは、移植後にヘモグロビンＡ１Ｃレベルの低下を示すと予想される。ＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされたＡＤＬを受ける移植レシピエントは、長期的に維持される移植後のＣペプチドレベルの増加を示すと予想され、これは、移植された膵島が機能的であることを示す（例えば、空腹時Ｃペプチドレベル、グルコース刺激Ｃペプチドレベル、および／またはグルコース刺激時のＣペプチドレベルの増加）。
（実施例１５）
同じ幹細胞ドナーに由来する細胞、組織、または臓器に対する寛容誘導のためのドナーＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ抗原の供給源としての幹細胞由来Ｂ細胞
（実施例１５）
同じ幹細胞ドナーに由来する細胞、組織、または臓器に対する寛容誘導のためのドナーＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ抗原の供給源としての幹細胞由来Ｂ細胞
【0556】
１つのドナーに由来する幹細胞を、アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）としての使用のための第１の細胞集団に分化させ、移植のための第２の細胞集団に別々に分化させることができる。この技術を使用して、任意の普遍的な細胞に由来する細胞、組織、または臓器移植に対する寛容を誘導することができる。
【0557】
幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および／または間葉幹細胞であってもよい。幹細胞を、ＭＨＣクラスＩ抗原とＭＨＣクラスＩＩ抗原との両方を発現する第１の細胞集団に分化させる。例えば、移植ドナーに由来するｉＰＳＣを、ＭＨＣクラスＩとＩＩ抗原との両方を発現するＢリンパ球に分化させる。ｉＰＳＣをＢ細胞に分化させる方法は、例えば、Ｆｒｅｎｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ． （２０１５）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２４（９）：１０８２－９５に記載されている。
【0558】
好ましくは、寛容原性有効性の増大のために、ドナー幹細胞由来Ｂ細胞は、１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原をレシピエントと共有する（例えば、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）。１つのレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ抗原と適合するグラフトおよびＢ細胞が入手可能でない場合、Ｂ細胞を、実施例１４に記載されたレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ鎖、ドメイン、もしくはペプチドとコンジュゲートするか、または任意の幹細胞由来ＭＨＣクラスＩ発現細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＥＣＤＩもしくは任意の他の方法を使用して、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ抗原とコンジュゲートすることができる。
【0559】
別に、ｉＰＳＣを、移植しようとする第２の細胞集団に分化させる。
【0560】
幹細胞由来Ｂ細胞および／またはＭＨＣ－ＩＩにコンジュゲートされた細胞を、ＥＣＤＩで処理して、アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）を生成する。
【0561】
幹細胞由来ＡＤＬを、同じ幹細胞ドナーに由来する細胞、組織、または臓器の移植を受ける対象に投与することによって、移植拒絶の可能性を低減させる。移植レシピエントは、移植前および必要に応じて、移植後に、例えば、移植に対して－７日目および＋１日目に幹細胞由来ＡＤＬの静脈内注入を受ける。
【0562】
必要に応じて、（ｉ）移植に対して－８、－１、７、および１４日目に５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体；（ｉｉ）５～１２ｎｇ／ｍＬの標的トラフレベルで移植に対して－７日目から２１日目まで経口投与されるラパマイシン；（ｉｉｉ）移植に対して－７および０日目に１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に、移植に対して３、７、１０、１４、および２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下的に投与される可溶性ＴＮＦ受容体；ならびに（ｉｖ）移植に対して－７、０、７、１４、および２１日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されるアンタゴニスト性抗ＩＬ－６受容体抗体を含む短期免疫抑制レジメンを用いて、レシピエントを処置することができる。
【0563】
レシピエントは、幹細胞由来ＡＤＬを受けていないレシピエントと比較して改善された拒絶のない生存を示すと予想される。
【0564】
この技術を使用して、任意の普遍的な細胞に由来する細胞、組織、または臓器移植に対する寛容を誘導することができる。
（実施例１６）
寛容誘導のためのレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡの不適合アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）へのコンジュゲーション
（実施例１６）
寛容誘導のためのレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡの不適合アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）へのコンジュゲーション
【0565】
本実施例は、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ分子をアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）にコンジュゲートすることにより、前処置レジメンの寛容誘導有効性を増強することができることを証明する。一部の場合、単形性ＤＲアルファ鎖に由来するレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ提示ペプチドは、その同族特異性について胸腺において選択されるｔＴｒｅｇ細胞のサブセットに対する活性化シグナルとして働き得る。普遍的細胞に由来する任意の用意に増幅可能なＴ細胞などの任意の細胞を、単形性ＤＲＡ抗原に由来する同じ鎖、ドメイン、またはペプチドとコンジュゲートさせ、プロセシングして、移植に対する寛容を促進するために使用することができるＡＤＬを生成することができる。この方法は、レシピエントがＤＲＡ抗原について陽性である様々な移植シナリオに広く適用可能であり得る。例えば、この方法を使用して、普遍的ドナー細胞を使用して寛容を誘導することができる。
【0566】
部分的にまたは完全にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩが不適合のドナー－レシピエント対について、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ分子をアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）にコンジュゲートすることにより、移植された細胞、組織、または臓器に対する寛容の誘導においてＡＤＬの有効性を増強することができる。
【0567】
１つ（または複数）の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ分子に由来する１つまたは複数のペプチドの、ＡＤＬの表面へのカップリングは、ＡＤＬの取込み後のレシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子による提示のための豊富な量のレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡペプチドを提供することができる（例えば、レシピエント脾臓辺縁帯抗原提示細胞または肝臓類洞内皮細胞による）。
【0568】
自己ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡの認識は、例えば、胸腺由来ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）により、レシピエントにおける寛容を促進することができる。ｔＴｒｅｇは、それ自身のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される、それ自身のＭＨＣクラスＩＩペプチドの認識によって選択される。この複合体が活性化されたエフェクターＴ細胞の表面上に提示される場合、それはｔＴｒｅｇに対する強力な活性化シグナルとして働き、ｔＴｒｅｇ活性化、かくして、免疫寛容の促進をもたらすことができる。活性化されたエフェクターＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子全体の交換を含む、トロゴサイトーシスのプロセスによってそのようなＭＨＣ複合体を提示することができる。したがって、レシピエントＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡペプチドを提示するレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ分子が、活性化されたレシピエントＴ細胞に送達され、それによって提示される場合、これはｔＴｒｅｇに対する強力な活性化シグナルとして働くことができる。ｔＴｒｅｇの活性化は抗原特異性を必要とするが、その調節機能は抗原特異性を必要としない。そのため、活性化されたｔＴｒｅｇは、直接および間接特異性のドナー特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む抗ドナー免疫を直接下方調節し、また、Ｔｒ１細胞を含む、調節能を有する他の免疫細胞サブセットの増幅によって抗ドナー免疫を下方調節することもできる。
【0569】
ＤＲα鎖は機能的に単形性であってよく、それを寛容誘導のための都合のよい標的にし得る。１つ（または複数）の移植レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα鎖に由来する１つまたは複数の鎖、ドメイン、またはペプチドを、ＥＣＤＩを用いて（または任意の他のプロセスを用いて）、不適合ＡＤＬの表面にコンジュゲートする。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する鎖、ドメイン、またはペプチドは、ＤＲアルファ鎖全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する鎖、ドメイン、またはペプチドは、ＤＲのα１および／またはα２ドメイン全体を含んでもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡに由来するペプチドは、約１０～３０アミノ酸長であってもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡに由来するペプチドは、少なくとも１０～３０アミノ酸長であってもよい。レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡに由来するペプチドは、合成または組換えであってもよい。
【0570】
本実施例の前処置レジメンを、哺乳動物レシピエントにおける同種移植または異種移植（例えば、膵島、腎臓、または細胞、組織および臓器の胚性幹細胞由来、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来グラフトなどの、他の細胞、組織、もしくは臓器の移植）に容易に適合させることができる。ＡＤＬを、本明細書に開示される脾細胞、末梢血、または分化した幹細胞から調製することができる。
【0571】
実例では、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ鎖、ドメイン、および／またはペプチドを、幹細胞由来細胞にコンジュゲートし、処理してＡＤＬを生成し、そのＡＤＬを使用して、移植のための幹細胞由来細胞の別々に分化した第２の集団に対する寛容を誘導する。この技術を使用して、任意の普遍的な細胞に由来する細胞、組織、または臓器移植に対する寛容を誘導することができる。
【0572】
幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。幹細胞を、第１の細胞集団に分化させる。一部の場合、第１の細胞集団は、ＭＨＣクラスＩ抗原とＭＨＣクラスＩＩ抗原との両方を発現する。例えば、移植ドナーに由来するｉＰＳＣを、ＭＨＣクラスＩとＩＩ抗原との両方を発現するＢリンパ球に分化させる。ｉＰＳＣをＢ細胞に分化させる方法は、例えば、Ｆｒｅｎｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ． （２０１５）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２４（９）：１０８２－９５に記載されている。一部の場合、寛容原性有効性の増大のために、ドナー幹細胞由来Ｂ細胞は、１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原をレシピエントと共有する（例えば、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子、またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子）。一部の場合、ドナー幹細胞は、１つもＭＨＣクラスＩＩ抗原をレシピエントと共有しない。一部の場合、ドナー幹細胞由来寛容誘導細胞は、Ｔ細胞である。
【0573】
幹細胞由来細胞を、レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡ鎖、ドメイン、またはペプチドとコンジュゲートし、ＥＣＤＩまたは任意の他の方法を用いる処理によって、アポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）にする。
【0574】
別に、ｉＰＳＣを、移植しようとする第２の細胞集団に分化させる。
【0575】
ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡにコンジュゲートしたＡＤＬを、同じ幹細胞ドナーに由来する細胞、組織、または臓器の移植を受ける対象に投与することによって、移植拒絶の可能性を低減させる。移植レシピエントは、移植前および必要に応じて、移植後、例えば、移植に対して－７日目および＋１日目に、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡにコンジュゲートしたＡＤＬの静脈内注入を受ける。
【0576】
必要に応じて、（ｉ）移植に対して－８、－１、７、および１４日目に５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体；（ｉｉ）５～１２ｎｇ／ｍＬの標的トラフレベルで移植に対して－７日目から２１日目まで経口投与されるラパマイシン；（ｉｉｉ）移植に対して－７および０日目に１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に、移植に対して３、７、１０、１４、および２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下的に投与される可溶性ＴＮＦ受容体；ならびに（ｉｖ）移植に対して－７、０、７、１４、および２１日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されるアンタゴニスト性抗ＩＬ－６受容体抗体を含む短期免疫抑制レジメンを用いて、レシピエントを処置することができる。
【0577】
レシピエントは、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＡにコンジュゲートしたＡＤＬを受けないレシピエントと比較して、改善された拒絶のない生存を示すと予想される。
【0578】
この技術を使用して、任意の普遍的な細胞に由来する細胞、組織、または臓器移植に対する寛容を誘導することができる。
（実施例１７）
ＥＣＤＩによる共通ドナーＭＨＣクラスＩ抗原の、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅されたレシピエント由来Ｂ細胞へのコンジュゲーション
（実施例１７）
ＥＣＤＩによる共通ドナーＭＨＣクラスＩ抗原の、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅されたレシピエント由来Ｂ細胞へのコンジュゲーション
【0579】
レシピエント型ＭＨＣクラスＩＩペプチドの、本明細書に開示されるアポトーシス性ドナー白血球へのコンジュゲーションは、移植に対する寛容を誘導するのに有効であり得るが、ＭＨＣクラスＩＩは、製造において課題が多い分子であり得る。ＭＨＣクラスＩＩが異なるドナーのアポトーシス性ドナー白血球へのカップリングのための大量のレシピエント型ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ（またはＤＰおよびＤＱ）ペプチドの製造と関連する困難を回避するために、Ｂリンパ球をレシピエントから採取し、増幅し、ＥＣＤＩを介して、ドナー集団において非常に一般的である対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１）のＭＨＣクラスＩα鎖、ドメイン、またはペプチドとカップリングすることができる。例えば、Ｂリンパ球を、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩが不適合の死体ドナーからの計画された臓器または膵島細胞移植の約３週間前に移植レシピエントから取得し、増幅し、ＥＣＤＩを介して、ドナー集団において非常に一般的である対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１）のＭＨＣクラスＩα鎖とカップリングすることができる。
【0580】
抗原の担体としてのＢ細胞を、非サイトカイン刺激レシピエントにおける低体積白血球除去輸血によって取得し、約０．５ｘ１０＾９個の細胞のナイーブＢ細胞の入力収量を提供することができる。これらの細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦ、およびＣＤ４０Ｌ－多量体の存在下（または他のサイトカインおよび増殖因子の組合せの存在下）、ｅｘ ｖｉｖｏでの増幅の前後で大量の自己ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。２週間で１２０倍以上のＢ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増幅は、ＥＣＤＩへの曝露に起因する細胞喪失を考慮し、＋１日目の細胞療法生成物のための入力細胞収量として５～１０ｘ１０＾９個のＢ細胞を取り分けると、－７日目でのＩＶ注入のための３５ｘ１０＾９個の細胞のアポトーシス性自己白血球の用量、および＋１日目での注入のための継続的増幅後に同様の用量を提供する。ＥＣＤＩによって自己Ｂ細胞にカップリングしたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を発現する任意の死体ドナー（例えば、臓器または膵島細胞ドナー）は、連鎖抑制および感染寛容が他の不適合抗原に対する特異性を有するＴ細胞に対する寛容化を拡張する限り、寛容誘導のための好適なドナーであると考えられる。免疫抑制レジメン（例えば、本明細書に開示される短期免疫抑制レジメン）を、レシピエントに投与することができる。
（実施例１８）
共通のＭＨＣクラスＩ抗原による、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅された、レシピエント由来Ｂ細胞を使用する寛容誘導
（実施例１８）
共通のＭＨＣクラスＩ抗原による、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅された、レシピエント由来Ｂ細胞を使用する寛容誘導
【0581】
ｅｘ ｖｉｖｏで増幅された、レシピエント由来Ｂ細胞の使用は、レシピエントとＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を共有しない、生きている非関連ドナーグラフトに対する寛容誘導を可能にし得る。アポトーシス性自己Ｂ細胞の移植前後の注入は、レシピエントにおいてｔＴｒｅｇを活性化し、増幅すると予想される。
【0582】
Ｂリンパ球を、レシピエントから採取し、増幅することができる。例えば、Ｂリンパ球を、計画された移植の約３週間前に移植レシピエントから取得することができる。抗原の担体としてのＢ細胞を、非サイトカイン刺激レシピエントにおける低体積白血球除去輸血によって取得し、約０．５ｘ１０＾９個の細胞の成熟ナイーブＢ細胞の入力収量を提供することができる。これらの細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦ、およびＣＤ４０Ｌ－多量体の存在下（または他のサイトカインおよび増殖因子の組合せの存在下）、ｅｘ ｖｉｖｏでの増幅の前後で大量の自己ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。２週間で１２０倍以上のＢ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増幅は、ＥＣＤＩへの曝露に起因する細胞喪失を考慮し、＋１日目の細胞療法生成物のための入力細胞収量として５～１０ｘ１０＾９個のＢ細胞を取り分けると、－７日目でのＩＶ注入のための３５ｘ１０＾９個の細胞のアポトーシス性自己白血球の用量、および＋１日目での注入のための継続的増幅後に同様の用量を提供する。
【0583】
一部の場合、Ｂリンパ球を、ＥＣＤＩによって、ドナーと共有される対立遺伝子のＭＨＣクラスＩα鎖、ドメイン、またはペプチドとカップリングさせることができる。ＥＣＤＩによって自己Ｂ細胞にカップリングしたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を発現する任意のドナー（例えば、臓器または膵島細胞ドナー）は、連鎖抑制および感染寛容が他の不適合抗原に対する特異性を有するＴ細胞に対する寛容化を拡張する限り、寛容誘導のための好適なドナーであると考えられる。
【0584】
一部の場合、ＭＨＣクラスＩＩが不適合の非関連の生きているドナーが、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原をレシピエントと共有する場合、不適合ＭＨＣクラスＩドナー抗原を、寛容誘導のために増幅された、自己アポトーシス性ドナーＢ細胞の表面にカップリングさせる必要はないかもしれない。
【0585】
免疫抑制レジメン（例えば、本明細書に開示される短期免疫抑制レジメン）を、レシピエントに投与することができる。
（実施例１９）
アポトーシス性ドナー白血球は安定な膵島同種グラフト寛容を促進する
（実施例１９）
アポトーシス性ドナー白血球は安定な膵島同種グラフト寛容を促進する
【0586】
本実施例は、本開示の前処置レジメンまたは寛容化ワクチンが、膵島同種グラフトに対する長期寛容を誘導することができることを示す。アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体２Ｃ１０Ｒ４、ラパマイシン、可溶性腫瘍壊死因子受容体、および抗インターロイキン６受容体抗体を用いる短期免疫療法下でのアポトーシス性ドナー白血球の２回の移植前後の注入は、感作されていないＭＨＣクラスＩが異なり、１つのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子が適合するアカゲザルにおける膵島同種グラフトに対する長期的（１年以上）寛容を誘導する。
動物試験
動物試験
【0587】
研究用に繁殖されたサル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ドナーおよびレシピエントのコホートを、認定ベンダーから取得した。レシピエントサルの構成を表７に提示する。
【0588】
表７：レシピエントサルの構成。
【表7-1】
【表7-2】
【0589】
調査群（コホートＡ）は、７．３±０．１歳および１２．５±１．５ｋｇの体重の３匹の雄を含んでいた。対照コホート（Ｂ）は、４．３±２．１歳および６．２±１．６ｋｇの体重の８匹の雄を含んでいた。実験コホート（Ｃ）は、４．１±１．７歳および５．２±１．２ｋｇの体重の７匹の雄および１匹の雌を含んでいた。ドナーコホートは、６．７±３．３歳および１１．７±３．６ｋｇの体重の１９匹の雄を含んでいた。
【0590】
動物は、ヘルペスウイルス－１（Ｂウイルス）、サル免疫不全ウイルス、Ｄ型サルレトロウイルス、およびサルＴリンパ向性ウイルスを含まなかった。適格性はさらに、ＡＢＯ適合性および試験により定義されるＭＨＣ適合（ＭＨＣ－Ｉが異なり、１つのＭＨＣ－ＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子が適合するドナー－レシピエント対）を含んでいた。全ての動物は、４５４のパイロシーケンシングによる高分解能ＭＨＣ－ＩおよびＩＩ遺伝子型決定を受けた。コホートＢおよびＣでは、ＳＴＺ（１００ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）を用いて糖尿病を誘導し、０．３ｎｇ／ｍＬ未満の基底ＣペプチドおよびＩＶグルコース負荷に対する陰性のＣペプチド応答によって確認した。
ＡＤＬプロセシング
ＡＤＬプロセシング
【0591】
膵島移植に対して－７日目に、脾細胞をドナーサル脾臓から単離し、赤血球を溶解し、残りの細胞を、ナイロンウール製カラムを用いてＢ細胞について富化した。細胞（８０％）を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、ＥＣＤＩ（３．２ｘ１０８個の細胞あたり３０ｍｇ／ｍＬ）を用いて１ｈ、氷上で撹拌し、洗浄し、壊死細胞および微小凝集体を清浄し、アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）蛍光顕微鏡により生存性／壊死について評価した。ＥＣＤＩ固定脾細胞を、２０ｘ１０６細胞／ｍＬの最大濃度と共にレシピエントの体重１キログラムあたり０．２５ｘ１０９個の細胞の標的用量でのＩＶ注入のために冷やしたシリンジ（ｎ＝９）またはＩＶバッグ（ｎ＝２）にロードし、レシピエントへの投与まで氷上に置いた。３７℃で４～６時間、ＥＣＤＩ固定された細胞をインキュベートし、アネキシンＶ／ＰＩで標識し、蛍光顕微鏡によって分析することによって、アポトーシスの誘導をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングした。
【0592】
＋１日目の注入のためのＥＣＤＩ固定されたＡＤＬの標的用量を満たすために、膵島移植に対して－１５および－７日目にドナーサルから採取した血液、および残りの２０％の脾細胞を、ＮＨＰ ＣＤ２０ビーズを使用する磁気選別によりＢ細胞について富化し、ｒｈＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＢＡＦＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＴＬＲ９ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびｒｈＣＤ４０Ｌ－ＭＥＧＡまたはｒｈＣＤ４０Ｌ多量体（５００ｎｇ／ｍＬ）とｒｈＡＰＲＩＬ（５０ｎｇ）との両方の存在下、＋１日目までＧＲＥＸ１００Ｍフラスコ中、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅した。増幅された細胞を、ｒｈＩＬ－２１（５ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、２４ｈ後に収穫した。レシピエントを、注入前にジフェンヒドラミン１２．５ｍｇ、アセトアミノフェン１６０ｍｇ、およびオンダンセトロン４ｍｇの組合せで経口（ＰＯ）により準備処置した。
短期免疫抑制
短期免疫抑制
【0593】
免疫抑制を、コホートＡ～Ｃにおける全てのレシピエントサルに投与した。コホートＡおよびＣのサルにおいて全てのＡＤＬ注入をカバーするために、第１の用量のそれぞれの薬物を、０日目の膵島移植に対して－８または－７日目にコホートＡ～Ｃの全てのレシピエントに与えた。アンタゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４を、－８、－１、７、および１４日目に５０ｍｇ／ｋｇでＩＶにより与えた。ラパマイシン（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））を、－７日目から移植後２１日目までＰＯにより与えた；標的トラフレベルは５～１２ｎｇ／ｍＬであった。同時的抗炎症療法は、（ｉ）－７、０、７、１４、および２１日目の１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶでのαＩＬ－６Ｒ（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））、ならびに（ｉｉ）－７日目の１ｍｇ／ｋｇ ＩＶならびに３、７、１０、１４、および２１日目の０および０．５ｍｇ／ｋｇの皮下でのｓＴＮＦＲ（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））からなっていた。調査コホートのサルを、＋７日目に終結させ、したがって、免疫抑制の最後の用量を、＋７日目にこれらのサルに与えた。
膵島のプロセシング、移植、および機能
膵島のプロセシング、移植、および機能
【0594】
ドナーサルは、膵全切除術を受け、膵島を単離し、精製し、７日間培養して、直接経路刺激能力を最小化し、品質制御にかけた。０日目に、１．０ＥＵ／ｋｇ以下のレシピエント体重の内毒素含量を有するＤＮＡによる５０００ＩＥ／ｋｇ以上の標的数を、留置門脈内血管アクセスポートを使用して非外科的にＳＴＺ糖尿病サルに移植した。防御的外因性インスリンを、完全なグラフト機能を示す動物において移植後２１日目に停止させた。代謝モニタリングは、グルコースに対する急性Ｃペプチド応答およびグルコース消失速度（Ｋｇ）の決定と共に、毎日ａ．ｍ．／ｐ．ｍ．の血糖、毎週のＣペプチド、毎月のＨｂＡ１ｃ、混合食事試験、および２ヶ月毎のＩＶブドウ糖負荷試験を含んでいた。
膵島グラフトの組織病理
膵島グラフトの組織病理
【0595】
肝臓標本を、それぞれのレシピエントの１０の異なる解剖学的領域から取得し、１０％ホルマリン中で固定し、日常的な組織学のためにプロセシングした。１０個のブロックのそれぞれに由来する切片をヘマトキシリン＆エオシンで染色するか、またはインスリンについて免疫染色して、移植された膵島をスコア化した。剖検時にグラフトの組織病理上でかなりの数のインタクトなＡ型および軽度に浸潤したＢ型の膵島を示し、Ｃ型からＦ型の膵島を示さない、またはわずかしか示さないことによって（中程度から顕著に浸潤した膵島および浸潤物または線維化によって部分的または完全に置き換えられた膵島）、拒絶のない膵島同種グラフト生存を確認した。
免疫細胞表現型のフローサイトメトリー分析
免疫細胞表現型のフローサイトメトリー分析
【0596】
コホートＢ～Ｃのサルの凍結保存されたＰＢＬ、ＬＭＮＣ、およびＬＮ試料に対して、マルチカラーフローサイトメトリー分析を実施した。全てにおいて、１ｘ１０６個の細胞を、生存性を示す染料で染色して、生きた細胞と、細胞デブリとを識別した。細胞を、室温（ＲＴ）で２５ｍｉｎ、抗体、蛍光マイナスワン、および／またはアイソタイプ対照で染色した後、固定および洗浄した。調節性Ｔ細胞および増殖性ＴおよびＢ細胞ならびに細胞内サイトカインを評価するために、ＰＢＬを、細胞外エピトープ（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７）を認識する抗体で染色した後、ＦｏｘＰ３固定／透過処理キットを用いて固定／透過処理し、抗ＦｏｘＰ３、Ｋｉ６７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、およびＴＧＦ－β抗体で染色した。ＦＡＣＳＤＩＶＡ６．１．３を含む３レーザーＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で最小で２００，０００の事象を獲得した。これらのサブ集団のそれぞれの相対パーセンテージを、ＦｌｏｗＪｏ １０．１．ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して決定した。
ゲーティング戦略
ゲーティング戦略
【0597】
第１に、細胞を、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａ上でゲート化した後、ＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上でゲート化して、ダブレットを識別した。次いで、リンパ球を、よく特徴付けられたＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ａ特性に基づいてゲート化した。死滅した細胞を、生存性を示す染料に基づいて除外した。以下の表現型特性を使用して、免疫細胞集団を定義した：Ｔ細胞：ＣＤ３＋リンパ球；ＣＤ４＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８－；ＣＤ８＋Ｔ細胞：ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４－；ＣＤ４またはＣＤ８ ＴＥＭ細胞を、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞内のＣＤ２ｈｉ／ＣＤ２８－と決定した。ＰＤ－１、Ｔｂｅｔ、ＣＤ４０およびＫｉ６７の発現を、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＣＤ２０＋Ｂ細胞の両方の上で決定した。ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ－５）発現を、ＣＤ４ Ｔ細胞上で検査して、Ｔｆｈ細胞を計数した：ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞。Ｔｒｅｇ細胞：ゲート化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球のうち、ＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋。ＮＳ細胞：ゲート化されたＣＤ８リンパ球のうち、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋。Ｂｒｅｇ細胞：調節性Ｂ細胞（ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ）、Ｂ１０細胞：ＣＤ２４、ＣＤ２７、およびＣＤ３８抗原の発現に基づいて、ＣＤ３－ＣＤ１９＋／ＣＤ２０＋リンパ球内の（ＣＤ２４ｈｉＣＤ２７＋）。ゲート化されたＬｉｎ－（ＣＤ３－ＣＤ２０－）ＨＬＡ－ＤＲ－ＣＤ１４＋細胞を分析して、ＣＤ１４＋Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－細胞のうちのＭＤＳＣ：ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ３３ｈｉを計数した。
ドナー特異的ＴおよびＢ細胞応答
ドナー特異的ＴおよびＢ細胞応答
【0598】
ＭＬＲを、膵島ドナーおよび移植レシピエントに由来する凍結保存されたＰＢＬ試料上で実施した。レシピエントサルに由来する応答性ＰＢＬ（３００，０００個の細胞）試料を、２．５μＭのＣＦＳＥで標識し、膵島ドナー（ドナー）由来の照射された（３０００ｃＧｙ）ＶＰＤ－４５０で標識された刺激性ＰＢＬ（３００，０００個の細胞）と共に同時培養した。
ＡＤＬは安定な膵島同種グラフト寛容を促進する
ＡＤＬは安定な膵島同種グラフト寛容を促進する
【0599】
コホートＢおよびＣのサルは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病後に１回のＤＲＢが適合する膵島移植を受けた。両方のコホートが短期免疫抑制を受けたが、コホートＣのみはアポトーシス性ドナー白血球（ＡＤＬ）を受けた（図８Ａ）。ＡＤＬ注入は、有意に改善された生存と関連していた（図８Ｂ）。全てのコホートＣのサルが、移植後３６５日以上にわたって膵島同種グラフトの操作可能な寛容を示した。７匹のコホートＢのサルのうちの２匹が、３６５日以上にわたって門脈内移植を受け入れた。
【0600】
コホートＣに由来するサルは、移植の直後に正常血糖になり、移植後２１日目の免疫抑制および外因性インスリンの中止後でも、そのままであった（図９Ａ）。そのレシピエントの糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルは、移植後に正常になり、そのままであった（図９Ｂ）。他のコホートＣのサルにおいても観察された、移植後の継続的な体重増加（図９Ｃ）は、処置レジメンの全体的な安全性と一致している。移植前の血清Ｃペプチドレベルおよびグルコース刺激に対する応答は、５匹全てのレシピエントにおいて陰性であった。コホートＣに由来するサルにおいて、強く陽性の移植後空腹時および無作為の血清Ｃペプチドレベルならびに１年のフォローアップを通した刺激後のその増加により、安定な膵島同種グラフト機能が確認された（図９Ｄ）。そのレシピエントは、グルコースによるＩＶ負荷後に安定な移植後血糖消失速度（Ｋｇ）を示し、これはＳＴＺ前の速度と同等であった（図９Ｅ）；適合試験に由来するＣペプチドレベルは、移植後の経過を通じて１ｎｇ／ｍＬを超える実質的な増加を示した（図９Ｆ）。剖検時のそのレシピエントの肝臓の組織病理学的分析により、いくつかのインタクトな膵島が示され、膵島周囲への浸潤は見られないか、または最小限であった（図１０Ａ）。移植された、肝内膵島は、インスリンに関する強い陽性染色を示した（図１０Ｂ）；剖検での天然膵臓中のインスリン陽性膵島ベータ細胞の非存在（図１０Ｃ）は、移植後の正常血糖が、グラフトの機能を反映し、ＳＴＺ誘導性糖尿病後の寛解に起因するものではないことを示していた。
【0601】
移植の１年後に犠牲にならなかったコホートＣのサルは、免疫抑制の中止後も２年を超えて継続的な膵島同種グラフト機能を示した（図１１Ａ～Ｆ）。図１１Ａは、食前および食後血糖（それぞれ、実線および破線）ならびに１日インスリン（バー）を提供する。図１１Ｂは、フォローアップを通した正の、かつ安定なＣペプチドレベル（空腹、無作為、および混合食刺激）を示す。図１１Ｃは、フォローアップを通した正常に近いＨｂＡ１ｃレベルの回復を示す。図１１Ｄは、移植後の継続的な体重増加を示し、移植後の正常血糖が吸収不良状態に起因するものではないことを示している。図１１Ｅは、０．５ｇ／ｋｇのグルコースのＩＶ注入（ＩＶＧＴＴ）の前後での血糖ならびに糖尿病誘導の前後および移植後のＫｇレベルを示す。図１１Ｆは、ＩＶグルコース（０．５ｇ／ｋｇ）に対する急性Ｃペプチド応答を示す。
【0602】
剖検時の組織病理学的分析により、そのサルにおける拒絶のない膵島同種グラフト生存が確認された（図１２）。比較により、コホートＢのサル（ＡＤＬを受けなかった）は、移植後に正常血糖になったが、グラフト機能の低下が移植後４ヶ月から始まって明らかであった（図１３Ａ～Ｆ）。図１３Ａは、食前および食後血糖値（それぞれ、実線および破線）ならびに１日インスリン（バー）を示す。上向きの傾向と共に、移植後１３３日目で出発して食後不安定性が明らかであり、拒絶に起因する同種グラフトの喪失を示唆していた。図１３Ｂは、Ｃペプチドレベル（空腹、無作為、および混合食刺激）が移植後に正になり、基底レベルは、移植後１６１日目まで約１ｎｇ／ｍＬのままであったことを示す。図１３Ｃは、正常に近いＨｂＡ１ｃレベルの回復を示し、次いで、１４０日目あたりで、継続的な上向きの傾向と共にレベルの上昇が始まっている。図１３Ｄは、移植後の継続的な体重増加を示し、移植後の正常血糖が吸収不良状態に起因するものではないことを示している。図１３Ｅは、０．５ｇ／ｋｇのグルコースのＩＶ注入（ＩＶＧＴＴ）の前後での血糖値ならびに糖尿病誘導の前後および移植後のＫｇレベルを示す。図１３Ｆは、ＩＶグルコース（０．５ｇ／ｋｇ）に対する急性のＣペプチド応答を示す。１ヶ月後の剖検により、拒絶を確認した。
【0603】
これらの結果は、免疫抑制の中止後であっても、ＡＤＬ処置されたサルにおける１つのＤＲＢが適合する膵島同種グラフトの長期的な機能的および組織学的生存を示し、厳密な臨床移行モデルにおけるロバストな寛容を示している。これらの結果は、本開示の前処置レジメンまたは寛容原性ワクチンが、同種グラフトの長期的な機能的および組織学的生存を促進することができることを示す。
ＡＤＬはエフェクター細胞の増幅および機能を抑制する
ＡＤＬはエフェクター細胞の増幅および機能を抑制する
【0604】
コホートＢおよびＣにおけるエフェクター細胞応答を比較した。移植前後のＡＤＬ注入（コホートＣ）は、循環肝臓単核細胞（ＬＭＮＣ）、腸間膜リンパ節（ＬＮ）、および抗ドナーＣＤ４＋（図１４Ａ～Ｃ）およびＣＤ８＋（図１４Ｄ～Ｆ）Ｔエフェクター記憶（ＴＥＭ）細胞の増幅の長期的抑制と関連していた。ＬＭＮＣおよびＬＮの分析を、拒絶またはスケジュール化された終結の時点で実施したところ、コホートＢについては変化したが、コホートＣの動物については変化しなかった。ＬＭＮＣおよびＬＮ内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＥＭ細胞のパーセンテージは、図１４Ｂおよび図１４Ｅに示されるように寛容性のコホートＣのサルにおいて移植後１年またはそれより後でも低かった；寛容な動物が移植後１年より前に犠牲にされたとすれば、これらのパーセンテージはおそらく、グラフト機能を失ったコホートＢのサルと同等に低かったであろう。
【0605】
１２ヶ月の移植後フォローアップを通じて、ＡＤＬ注入は、コホートＢのサルと比較してコホートＣにおいて低頻度の循環Ｔ濾胞性ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞と関連していた（図１５Ａ）。ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｂ）およびＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｃ）の割合は、コホートＣ対コホートＢにおいて移植後により高かったが、これは、ＡＤＬによるＴ細胞疲弊表現型誘導を示唆している。循環ＣＤ２０＋Ｂ細胞の頻度は、コホートＢおよびＣにおいて類似していた（図１５Ｄ）。
【0606】
まとめると、移植前後のＡＤＬ注入は、エフェクターＴおよびＢ細胞の移植後の活性化および増幅、ならびに短期免疫抑制での１つのＤＲＢが適合するサルにおける同種グラフトへのそれらの動員を妨げた。これらの結果は、本開示の前処置レジメンまたは寛容原性ワクチンが、移植レシピエントにおけるエフェクター免疫細胞の増幅および機能を抑制することができることを示している。
ＡＤＬは移植レシピエントにおいて免疫調節性細胞を増幅させる
ＡＤＬは移植レシピエントにおいて免疫調節性細胞を増幅させる
【0607】
コホートＢおよびＣにおける調節性表現型を有するリンパ系細胞および骨髄性細胞の頻度を比較した。
【0608】
移植後のフォローアップ期間を通して、ＡＤＬ処置された動物において、有意により高いパーセンテージの循環ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）およびＴｒｅｇ細胞が観察された（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。調節性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）もまた、コホートＢのサルよりもコホートＣにおいて、移植後のフォローアップ期間に循環中（図１６Ｃ）で、ならびに犠牲時の肝臓およびＬＮにおいて（図１６Ｄ）、有意により豊富であった。
【0609】
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）も、移植後のフォローアップ期間に循環中で有意により豊富であった。図１７Ａは、ＭＤＳＣの特定のためのゲーティング戦略を示す。シングレットを最初にゲート化して、ダブレットを除去し、死滅した細胞を除外した。ＣＤ３３＋およびＣＤ１１ｂ＋の同時発現に基づいて、Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－集団内のゲート化されたＣＤ１４＋細胞中で、およびＣＤ３－ＣＤ２０－細胞を描写するＬｉｎを用いて、ＭＤＳＣを特定した。１匹のコホートＢ（上）および１匹のコホートＣ（下）のサルに由来する代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す。
【0610】
移植後１４日目の循環ＭＤＳＣに対するＡＤＬ注入の効果に関するさらなる試験は、コホートＣにおいては実質的な増加（ＣＤ１４＋Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－細胞の２２．８６±６．２０％から４７．７４±１５．４８％への増加）を示し、コホートＢにおいては小さな増加のみ（ＣＤ１４＋Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－細胞の１７．６５±５．８０％から２４．０１±１０．４５％への増加）を示した。図１７Ｂは、コホートＢのサルと比較した、コホートＣのサルにおける循環ＭＤＳＣのパーセンテージの有意な増加を示す。
【0611】
ＡＰＣサブセットに対するＡＤＬ注入の効果も分析した。興味深いことに、コホートＢおよびＣを比較する場合、ＡＤＬ注入は、移植後２および４週間で、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ、ＣＤ１４＋単球におけるＨＬＡ－ＤＲ発現の下方調節と関連し、ＣＤ２０＋Ｂ細胞においてはごくわずかであったが、ＨＬＡ－ＤＲ発現は、対照コホートＢのサブセットにおいては３つ全てのＡＰＣサブセットにおいて増加した（図１７Ｃ～Ｅ）。図１７Ｃは、循環ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞のＭＦＩの倍率変化を示す。図１７Ｄは、循環ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１４＋単球のＭＦＩの倍率変化を示す。図１７Ｅは、循環ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ２０＋Ｂ細胞のＭＦＩの倍率変化を示す。
【0612】
これらのデータは、移植前後のＡＤＬ注入が、短期免疫抑制を受ける１つのＤＲＢが適合するサルにおいて調節性免疫細胞サブセットの移植後増幅を促進することを示している。これらの結果は、本開示の前処置レジメンまたは寛容原性ワクチンが、移植レシピエントにおける調節性免疫細胞の増幅および機能を促進することができることを示している。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
同種移植または異種移植のための前処置レジメンであって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性ドナー白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記前処置レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、前処置レジメン。
（項目２）
前記レシピエントへの（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の投与のための説明書をさらに含む、項目１に記載の前処置レジメン。
（項目３）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、前記同種移植または異種移植の約１０日前～約３０日後に前記レシピエントに投与される、項目１から２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つが、前記同種移植または異種移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日前に前記レシピエントに投与される、項目１から３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つが、前記同種移植または異種移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日前に前記レシピエントに投与される、項目１から４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つが、前記レシピエントに、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、脳室内、鼻腔内、頭蓋内、腔内、脳内、髄腔内もしくは経皮、または局所に投与される、項目１から５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目７）
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、静脈内に投与される、項目６に記載の前処置レジメン。
（項目８）
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、項目１から７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９）
前記レシピエントにおける前記ｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルが、１ｍＬあたり約５～１２ｎｇである、項目１から８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０）
前記抗腫瘍壊死因子剤が、抗腫瘍壊死因子抗体またはその抗原結合性断片である、項目１から９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１１）
前記抗腫瘍壊死因子剤が、腫瘍壊死因子受容体の腫瘍壊死因子結合ドメインを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１２）
前記抗腫瘍壊死因子剤が、エタネルセプトである、項目１から９のいずれか一項に記
載の前処置レジメン。
（項目１３）
前記抗腫瘍壊死因子剤または前記抗腫瘍壊死因子受容体剤が、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１４）
前記抗腫瘍壊死因子剤または前記抗腫瘍壊死因子受容体剤が、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１５）
前記抗インターロイキン６受容体剤が、アンタゴニスト性抗インターロイキン６受容体抗体またはその抗原結合性断片である、項目１から１４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１６）
前記抗インターロイキン６受容体剤が、トシリズマブである、項目１から１５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１７）
前記抗インターロイキン６剤または前記抗インターロイキン６受容体剤が、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１８）
前記抗インターロイキン６剤または前記抗インターロイキン６受容体剤が、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１９）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片である、項目１から１８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２０）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４である、項目１から１９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２１）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から２０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２２）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から２１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２３）
前記前処置レジメンの前記レシピエントへの投与が、前記移植細胞、組織または臓器に対する長期寛容を提供する、項目１から２２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２４）
前記アポトーシス性白血球が、哺乳動物白血球である、項目１から２３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２５）
前記アポトーシス性白血球が、ブタ白血球である、項目１から２４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２６）
前記アポトーシス性白血球が、ヒト白血球である、項目１から２４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２７）
前記アポトーシス性白血球が、死体ドナー、脳死ドナー、心停止ドナーまたは生体ドナー由来である、項目１から２６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２８）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球である、項目１から２７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２９）
前記アポトーシス性白血球が、脾臓または末梢血から単離されている、項目１から２８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３０）
前記アポトーシス性白血球が、Ｂリンパ球を含む、項目１から２９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３１）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞または誘導多能性幹細胞から分化した細胞を含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３２）
前記幹細胞が、前記移植細胞、組織または臓器のドナーに由来する、項目３１に記載の前処置レジメン。
（項目３３）
前記移植細胞、組織または臓器が、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、胚性幹細胞由来膵島ベータ細胞、誘導多能性幹細胞由来膵島ベータ細胞、胚性幹細胞由来膵島、誘導多能性幹細胞由来膵島、幹細胞由来の細胞、組織もしくは臓器、またはそれらの組合せである、項目１から３２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３４）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ＭＨＣクラスＩ不適合である、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３５）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ＭＨＣクラスＩＩ不適合である、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３６）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ハプロタイプ一致である、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３７）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について適合している、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３８）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子について適合している、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３９）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ＭＨＣクラスＩＩ
ＤＲＢ対立遺伝子である少なくともＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子について適合している、項目３８に記載の前処置レジメン。
（項目４０）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子のうちの少なくとも１つについて適合している、項目１から３９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４１）
前記アポトーシス性白血球およびレシピエントが、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子であるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子について適合している、項目４０に記載の前処置レジメン。
（項目４２）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、完全に不適合である、項目１から３５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４３）
前記アポトーシス性白血球および移植片が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子について適合している、項目１から４２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４４）
前記アポトーシス性白血球および移植片が、ハプロタイプ一致である、項目１から４２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４５）
前記アポトーシス性白血球が、移植片の前記ドナーに由来する、項目１から４２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４６）
前記アポトーシス性白血球が、前記移植細胞、組織または臓器の前記ドナー由来の幹細胞の分化に由来する、項目４５に記載の前処置レジメン。
（項目４７）
前記アポトーシス性白血球が、その表面上にコンジュゲートされた、前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む、項目１から４６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４８）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖もしくはＤＰβ鎖、またはそれらの組合せに由来するペプチドを含む、項目４７に記載の前処置レジメン。
（項目４９）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα１またはα２ドメイン全部を含む、項目４７または項目４８に記載の前処置レジメン。
（項目５０）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ１またはβ２ドメイン全部を含む、項目４７から４９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５１）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、前記レシピエントのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子によってコードされている、項目４７から５０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５２）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、超可変領域由来の配列を含む、項目４７から５１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５３）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、少なくとも１０アミノ酸長である、項目４７から５２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５４）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、約１０～３０アミノ酸長である、項目４７から５３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５５）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、合成または組換えである、項目４７から５４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５６）
前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントに由来するか、または前記レシピエント由来の幹細胞の分化の際に誘導されたものであり、前記アポトーシス性白血球が、その表面にコンジュゲートされたＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む、項目１から５５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５７）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、前記移植片の前記ドナー中で発現している、項目５６に記載の前処置レジメン。
（項目５８）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７またはＨＬＡＢ８である、項目５６または項目５７に記載の前処置レジメン。
（項目５９）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１によってコードされている、項目５６から５８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６０）
前記１種または複数のペプチドが、前記架橋剤での処理によって前記アポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートされている、項目４７から５９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６１）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含む、項目１から６０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６２）
前記カルボジイミドが、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む、項目６１に記載の前処置レジメン。
（項目６３）
前記架橋剤が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む、項目６２に記載の前処置レジメン。
（項目６４）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含まない、項目１から６０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６５）
前記架橋剤が、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む、項目１から６０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６６）
前記ジイミドエステルが、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含む、項目６５に記載の前処置レジメン。
（項目６７）
前記アポトーシス性白血球が、所定の時間、固定されている、項目１から６６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６８）
前記所定の時間が、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である、項目６７に記載の前処置レジメン。
（項目６９）
前記アポトーシス性白血球が、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである、項目１から６８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目７０）
１種または複数の免疫調節分子の前記量が、前記レシピエントの抗原提示細胞の機能を改変するのに十分である、項目６９に記載の前処置レジメン。
（項目７１）
前記１種または複数の免疫調節分子が、ＩＦＮ－γ、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質のすべてもしくは一部、またはそれらの組合せを含む、項目６９または項目７０に記載の前処置レジメン。
（項目７２）
前記ＮＦ－ｋＢ阻害剤が、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せである、項目７１に記載の前処置レジメン。
（項目７３）
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、別々に、または同時に投与される、項目１から７２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目７４）
同種移植片または異種移植片のレシピエントの移植後安定化のための寛容化レジメンであって、
（ａ）カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、前記架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされているアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記寛容化レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、寛容化レジメン。
（項目７５）
前記アポトーシス性白血球が、前記架橋剤との接触の前に、出発集団に対して、少なくとも約３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍または２５０倍増やされている、項目７４に記載の寛容化レジメン。
（項目７６）
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、別々に、または同時に投与される、項目７４または項目７５に記載の寛容化レジメン。
（項目７７）
細胞、組織または臓器移植片をレシピエントに移植するための前処置レジメンであって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含み、前記前処置レジメンが、前記レシピエントへの投与のためである、前処置レジメン。
（項目７８）
前記移植レシピエントの短期免疫抑制のための１種または複数の薬剤を投与することをさらに含む、項目７７に記載の前処置レジメン。
（項目７９）
短期免疫抑制のための前記１種または複数の薬剤が、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤もしくは抗腫瘍壊死因子受容体剤、抗インターロイキン６剤もしくは抗インターロイキン６受容体剤、抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０リガンド剤、またはそれらの組合せを含む、項目７７または項目７８に記載の前処置レジメン。
（項目８０）
前記移植レシピエントへの短期免疫抑制のための前記１種または複数の薬剤の投与のための説明書をさらに含む、項目７７から７９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８１）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドが、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖もしくはＤＰβ鎖、またはそれらの組合せに由来するペプチドを含む、項目７７から８０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８２）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲのβ１またはβ２ドメイン全部を含む、項目７７から８１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８３）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、前記レシピエントのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子によってコードされている、項目７７から８２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８４）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα１またはα２ドメイン全部を含む、項目７７から８０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８５）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ１またはβ２ドメイン全部を含む、項目７７から８１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８６）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、超可変領域由来の配列を含む、項目７７から８５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８７）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、少なくとも１０アミノ酸長である、項目７７から８６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８８）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、約１０～３０アミノ酸長である、項目７７から８７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８９）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、合成または組換えられたものである、項目７７から８８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９０）
架橋剤中において固定された前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントの前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記アポトーシス性白血球が、前記ドナーとＭＨＣクラスＩＩ適合、および前記レシピエントとＭＨＣクラスＩＩ不適合である、項目７７から８９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９１）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、前記移植片の前記ドナー中で発現している、項目７７から９０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９２）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７またはＨＬＡＢ８である、項目７７から９１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９３）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１によってコードされている、項目７７から９２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９４）
架橋剤中において固定された前記アポトーシス性白血球が、前記ドナーの前記ＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントと、ＭＨＣクラスＩ適合もしくはＭＨＣクラスＩＩ適合、またはその両方である、項目９１から９３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９５）
前記１種または複数のペプチドが、前記架橋剤での処理によって前記アポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートされている、項目７７から９４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９６）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含む、項目７７から９５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９７）
前記カルボジイミドが、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む、項目９６に記載の前処置レジメン。
（項目９８）
前記架橋剤が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む、項目９７に記載の前処置レジメン。
（項目９９）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含まない、項目７７から９５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１００）
前記架橋剤が、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む、項目７７から９５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０１）
前記ジイミドエステルが、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含む、項目１００に記載の前処置レジメン。
（項目１０２）
前記アポトーシス性白血球が、所定の時間、固定されている、項目７７から１０１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０３）
前記所定の時間が、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である、項目１０２に記載の前処置レジメン。
（項目１０４）
前記アポトーシス性白血球が、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである、項目７７から１０３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０５）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含む、有効量の組成物を前記レシピエントに投与することを含む、方法。
（項目１０６）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、前記レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について適合している、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、ＭＨＣ不適合である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記１種または複数のペプチドが、前記アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされている、項目１０５から１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞から分化した細胞を含み、前記幹細胞が、前記細胞、組織または臓器移植片のドナーに由来する、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントとＭＨＣ適合である、項目１０５に記載の方法。
（項目１１１）
前記アポトーシス性白血球が、前記細胞、組織または臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記１種または複数のペプチドが、前記アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされている、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞から分化した細胞を含み、前記幹細胞が、前記細胞、組織または臓器移植片の前記レシピエントに由来する、項目１１０または項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記細胞、組織または臓器移植片を移植することをさらに含む、項目１０５から１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記移植することが、前記組成物の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日後、またはそれよりも後に行われる、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記組成物の少なくとも１ブースター用量を投与することをさらに含む、項目１０５から１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記ブースター用量が、前記移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、２０、２１または２４日後に投与される、項目１１５
に記載の方法。
（項目１１７）
前記寛容が、少なくとも１か月の期間にわたる、項目１０５から１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記寛容が、少なくとも１００日の期間にわたる、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記寛容が、少なくとも１年の期間にわたる、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む有効量の組成物を前記レシピエントに投与することを含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含む、方法。
（項目１２１）
前記寛容が、移植後５０日後に免疫抑制療法の非存在下において存在する、項目１２０に記載の前処置レジメン。
（項目１２２）
前記寛容が、ブースターレジメンの非存在下において存在する、項目１２０から１２１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１２３）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する免疫応答を阻害するための方法であって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
の有効量を前記レシピエントに投与することを含む、方法。
（項目１２４）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する免疫応答を阻害するための方法であって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む有効量の組成物を前記レシピエントに投与することを含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含む、方法。
（項目１２５）
前記免疫応答が、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞増殖、マクロファージ活性化、サイトカイン産生、またはそれらの組合せを含む、項目１２３から１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
対象を移植後免疫寛容化する方法であって、
（ａ）カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、前記架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされているアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１２７）
前記アポトーシス性白血球が、末梢血から単離されている、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記アポトーシス性白血球が、陽性または陰性選択によってＢ細胞について富化されている、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記アポトーシス性白血球が、前記カルボジイミド架橋剤による前記モジュレートの前に、出発集団に対して少なくとも２００倍増やされている、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片の移植のためのキットであって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む第１の組成物を含む第１の容器、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤を含む第２の組成物を含む第２の容器、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を含む第３の組成物を含む第３の容器、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を含む第４の組成物を含む第４の容器、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含む第５の組成物を含む第５の容器を含む、キット。
（項目１３１）
レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片の移植のためのキットであって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む第１の組成物を含む第１の容器を含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含む、キット。
（項目１３２）
前記細胞、組織または臓器移植片をさらに含む、項目１２７から１３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目１３３）
前処置レジメンおよび寛容化レジメンを含む移植キットであって、
前記前処置レジメンが、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、
ｍＴＯＲ阻害剤、
抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記寛容化レジメンが、
カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、前記架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされているアポトーシス性白血球、
ｍＴＯＲ阻害剤、
抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに
抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記前処置レジメンが、移植の前に対象に投与され、前記寛容化レジメンが、移植後に前記対象に投与される、移植キット。
（項目１３４）
細胞、組織または臓器移植片をさらに含む、項目１３３に記載の移植キット。
（項目１３５）
前記寛容化レジメンの前記アポトーシス性白血球が、末梢血から単離されている、項目１３３に記載の移植キット。
（項目１３６）
前記寛容化レジメンの前記アポトーシス性白血球が、陽性または陰性選択によってＢ細胞について富化されている、項目１３５に記載の移植キット。
（項目１３７）
前記寛容化レジメンの前記アポトーシス性白血球が、前記架橋剤との接触の前に、出発集団に対して少なくとも２００倍増やされている、項目１３６に記載の移植キット。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
同種移植または異種移植のための前処置レジメンであって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性ドナー白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記前処置レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、前処置レジメン。
（項目２）
前記レシピエントへの（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の投与のための説明書をさらに含む、項目１に記載の前処置レジメン。
（項目３）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、前記同種移植または異種移植の約１０日前～約３０日後に前記レシピエントに投与される、項目１から２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つが、前記同種移植または異種移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日前に前記レシピエントに投与される、項目１から３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つが、前記同種移植または異種移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日前に前記レシピエントに投与される、項目１から４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの少なくとも１つが、前記レシピエントに、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、脳室内、鼻腔内、頭蓋内、腔内、脳内、髄腔内もしくは経皮、または局所に投与される、項目１から５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目７）
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、静脈内に投与される、項目６に記載の前処置レジメン。
（項目８）
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、項目１から７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９）
前記レシピエントにおける前記ｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルが、１ｍＬあたり約５～１２ｎｇである、項目１から８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０）
前記抗腫瘍壊死因子剤が、抗腫瘍壊死因子抗体またはその抗原結合性断片である、項目１から９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１１）
前記抗腫瘍壊死因子剤が、腫瘍壊死因子受容体の腫瘍壊死因子結合ドメインを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１２）
前記抗腫瘍壊死因子剤が、エタネルセプトである、項目１から９のいずれか一項に記
載の前処置レジメン。
（項目１３）
前記抗腫瘍壊死因子剤または前記抗腫瘍壊死因子受容体剤が、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１４）
前記抗腫瘍壊死因子剤または前記抗腫瘍壊死因子受容体剤が、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１５）
前記抗インターロイキン６受容体剤が、アンタゴニスト性抗インターロイキン６受容体抗体またはその抗原結合性断片である、項目１から１４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１６）
前記抗インターロイキン６受容体剤が、トシリズマブである、項目１から１５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１７）
前記抗インターロイキン６剤または前記抗インターロイキン６受容体剤が、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１８）
前記抗インターロイキン６剤または前記抗インターロイキン６受容体剤が、約１０ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から１７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１９）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性断片である、項目１から１８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２０）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、２Ｃ１０または２Ｃ１０Ｒ４である、項目１から１９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２１）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から２０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２２）
前記抗ＣＤ４０剤または前記抗ＣＤ４０リガンド剤が、約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記レシピエントに投与される、項目１から２１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２３）
前記前処置レジメンの前記レシピエントへの投与が、前記移植細胞、組織または臓器に対する長期寛容を提供する、項目１から２２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２４）
前記アポトーシス性白血球が、哺乳動物白血球である、項目１から２３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２５）
前記アポトーシス性白血球が、ブタ白血球である、項目１から２４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２６）
前記アポトーシス性白血球が、ヒト白血球である、項目１から２４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２７）
前記アポトーシス性白血球が、死体ドナー、脳死ドナー、心停止ドナーまたは生体ドナー由来である、項目１から２６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２８）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで増やされた白血球である、項目１から２７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目２９）
前記アポトーシス性白血球が、脾臓または末梢血から単離されている、項目１から２８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３０）
前記アポトーシス性白血球が、Ｂリンパ球を含む、項目１から２９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３１）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞または誘導多能性幹細胞から分化した細胞を含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３２）
前記幹細胞が、前記移植細胞、組織または臓器のドナーに由来する、項目３１に記載の前処置レジメン。
（項目３３）
前記移植細胞、組織または臓器が、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島細胞、小腸、骨髄、造血幹細胞、胚性幹細胞由来膵島ベータ細胞、誘導多能性幹細胞由来膵島ベータ細胞、胚性幹細胞由来膵島、誘導多能性幹細胞由来膵島、幹細胞由来の細胞、組織もしくは臓器、またはそれらの組合せである、項目１から３２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３４）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ＭＨＣクラスＩ不適合である、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３５）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ＭＨＣクラスＩＩ不適合である、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３６）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ハプロタイプ一致である、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３７）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について適合している、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３８）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子について適合している、項目１から３３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目３９）
前記レシピエントおよび前記移植細胞、組織または臓器のドナーが、ＭＨＣクラスＩＩ
ＤＲＢ対立遺伝子である少なくともＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子について適合している、項目３８に記載の前処置レジメン。
（項目４０）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、ＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子のうちの少なくとも１つについて適合している、項目１から３９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４１）
前記アポトーシス性白血球およびレシピエントが、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲＢ対立遺伝子であるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子について適合している、項目４０に記載の前処置レジメン。
（項目４２）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、完全に不適合である、項目１から３５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４３）
前記アポトーシス性白血球および移植片が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ Ａ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩ Ｂ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ対立遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＱ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ ＤＰ対立遺伝子について適合している、項目１から４２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４４）
前記アポトーシス性白血球および移植片が、ハプロタイプ一致である、項目１から４２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４５）
前記アポトーシス性白血球が、移植片の前記ドナーに由来する、項目１から４２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４６）
前記アポトーシス性白血球が、前記移植細胞、組織または臓器の前記ドナー由来の幹細胞の分化に由来する、項目４５に記載の前処置レジメン。
（項目４７）
前記アポトーシス性白血球が、その表面上にコンジュゲートされた、前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む、項目１から４６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目４８）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖もしくはＤＰβ鎖、またはそれらの組合せに由来するペプチドを含む、項目４７に記載の前処置レジメン。
（項目４９）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα１またはα２ドメイン全部を含む、項目４７または項目４８に記載の前処置レジメン。
（項目５０）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ１またはβ２ドメイン全部を含む、項目４７から４９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５１）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、前記レシピエントのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子によってコードされている、項目４７から５０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５２）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、超可変領域由来の配列を含む、項目４７から５１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５３）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、少なくとも１０アミノ酸長である、項目４７から５２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５４）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、約１０～３０アミノ酸長である、項目４７から５３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５５）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、合成または組換えである、項目４７から５４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５６）
前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントに由来するか、または前記レシピエント由来の幹細胞の分化の際に誘導されたものであり、前記アポトーシス性白血球が、その表面にコンジュゲートされたＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含む、項目１から５５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目５７）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、前記移植片の前記ドナー中で発現している、項目５６に記載の前処置レジメン。
（項目５８）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７またはＨＬＡＢ８である、項目５６または項目５７に記載の前処置レジメン。
（項目５９）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１によってコードされている、項目５６から５８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６０）
前記１種または複数のペプチドが、前記架橋剤での処理によって前記アポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートされている、項目４７から５９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６１）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含む、項目１から６０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６２）
前記カルボジイミドが、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む、項目６１に記載の前処置レジメン。
（項目６３）
前記架橋剤が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む、項目６２に記載の前処置レジメン。
（項目６４）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含まない、項目１から６０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６５）
前記架橋剤が、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む、項目１から６０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６６）
前記ジイミドエステルが、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含む、項目６５に記載の前処置レジメン。
（項目６７）
前記アポトーシス性白血球が、所定の時間、固定されている、項目１から６６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目６８）
前記所定の時間が、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である、項目６７に記載の前処置レジメン。
（項目６９）
前記アポトーシス性白血球が、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである、項目１から６８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目７０）
１種または複数の免疫調節分子の前記量が、前記レシピエントの抗原提示細胞の機能を改変するのに十分である、項目６９に記載の前処置レジメン。
（項目７１）
前記１種または複数の免疫調節分子が、ＩＦＮ－γ、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９－２３、表面抗原分類タンパク質のすべてもしくは一部、またはそれらの組合せを含む、項目６９または項目７０に記載の前処置レジメン。
（項目７２）
前記ＮＦ－ｋＢ阻害剤が、クルクミン、トリプトリド、Ｂａｙ－１１７０８５、またはそれらの組合せである、項目７１に記載の前処置レジメン。
（項目７３）
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、別々に、または同時に投与される、項目１から７２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目７４）
同種移植片または異種移植片のレシピエントの移植後安定化のための寛容化レジメンであって、
（ａ）カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、前記架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされているアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記寛容化レジメンが、移植細胞、組織または臓器のレシピエントへの投与のためである、寛容化レジメン。
（項目７５）
前記アポトーシス性白血球が、前記架橋剤との接触の前に、出発集団に対して、少なくとも約３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍または２５０倍増やされている、項目７４に記載の寛容化レジメン。
（項目７６）
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）が、別々に、または同時に投与される、項目７４または項目７５に記載の寛容化レジメン。
（項目７７）
細胞、組織または臓器移植片をレシピエントに移植するための前処置レジメンであって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含み、前記前処置レジメンが、前記レシピエントへの投与のためである、前処置レジメン。
（項目７８）
前記移植レシピエントの短期免疫抑制のための１種または複数の薬剤を投与することをさらに含む、項目７７に記載の前処置レジメン。
（項目７９）
短期免疫抑制のための前記１種または複数の薬剤が、ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍壊死因子剤もしくは抗腫瘍壊死因子受容体剤、抗インターロイキン６剤もしくは抗インターロイキン６受容体剤、抗ＣＤ４０剤もしくは抗ＣＤ４０リガンド剤、またはそれらの組合せを含む、項目７７または項目７８に記載の前処置レジメン。
（項目８０）
前記移植レシピエントへの短期免疫抑制のための前記１種または複数の薬剤の投与のための説明書をさらに含む、項目７７から７９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８１）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドが、ＤＲβ鎖、ＤＱβ鎖もしくはＤＰβ鎖、またはそれらの組合せに由来するペプチドを含む、項目７７から８０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８２）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲのβ１またはβ２ドメイン全部を含む、項目７７から８１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８３）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、前記レシピエントのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子によってコードされている、項目７７から８２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８４）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのα１またはα２ドメイン全部を含む、項目７７から８０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８５）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰのβ１またはβ２ドメイン全部を含む、項目７７から８１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８６）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、超可変領域由来の配列を含む、項目７７から８５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８７）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、少なくとも１０アミノ酸長である、項目７７から８６のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８８）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、約１０～３０アミノ酸長である、項目７７から８７のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目８９）
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記１種または複数のペプチドが、合成または組換えられたものである、項目７７から８８のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９０）
架橋剤中において固定された前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントの前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記アポトーシス性白血球が、前記ドナーとＭＨＣクラスＩＩ適合、および前記レシピエントとＭＨＣクラスＩＩ不適合である、項目７７から８９のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９１）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、前記移植片の前記ドナー中で発現している、項目７７から９０のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９２）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７またはＨＬＡＢ８である、項目７７から９１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９３）
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１またはＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１によってコードされている、項目７７から９２のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９４）
架橋剤中において固定された前記アポトーシス性白血球が、前記ドナーの前記ＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントと、ＭＨＣクラスＩ適合もしくはＭＨＣクラスＩＩ適合、またはその両方である、項目９１から９３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９５）
前記１種または複数のペプチドが、前記架橋剤での処理によって前記アポトーシス性白血球の表面にコンジュゲートされている、項目７７から９４のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９６）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含む、項目７７から９５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目９７）
前記カルボジイミドが、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはそれらの組合せを含む、項目９６に記載の前処置レジメン。
（項目９８）
前記架橋剤が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を含む、項目９７に記載の前処置レジメン。
（項目９９）
前記架橋剤が、カルボジイミドを含まない、項目７７から９５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１００）
前記架橋剤が、ゲニピン、アクリルアルデヒド、ジホルミル、四酸化オスミウム、ジイミドエステル、塩化第二水銀、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、トリニトロフェノール（ピクリン酸）、重クロム酸カリウム、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸、またはそれらの組合せを含む、項目７７から９５のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０１）
前記ジイミドエステルが、塩化シアヌル、ジイソシアネート、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、マレイミド、ベンゾキノン、またはそれらの組合せを含む、項目１００に記載の前処置レジメン。
（項目１０２）
前記アポトーシス性白血球が、所定の時間、固定されている、項目７７から１０１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０３）
前記所定の時間が、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分である、項目１０２に記載の前処置レジメン。
（項目１０４）
前記アポトーシス性白血球が、ある量の１種または複数の免疫調節分子とさらに接触されたものである、項目７７から１０３のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１０５）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含む、有効量の組成物を前記レシピエントに投与することを含む、方法。
（項目１０６）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、前記レシピエントと少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について適合している、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記アポトーシス性白血球および前記レシピエントが、ＭＨＣ不適合である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記１種または複数のペプチドが、前記アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされている、項目１０５から１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞から分化した細胞を含み、前記幹細胞が、前記細胞、組織または臓器移植片のドナーに由来する、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記アポトーシス性白血球が、前記レシピエントとＭＨＣ適合である、項目１０５に記載の方法。
（項目１１１）
前記アポトーシス性白血球が、前記細胞、組織または臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種または複数のペプチドを含み、前記１種または複数のペプチドが、前記アポトーシス性白血球の表面上にコンジュゲートされている、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記アポトーシス性白血球が、ｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞から分化した細胞を含み、前記幹細胞が、前記細胞、組織または臓器移植片の前記レシピエントに由来する、項目１１０または項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記細胞、組織または臓器移植片を移植することをさらに含む、項目１０５から１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記移植することが、前記組成物の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日後、またはそれよりも後に行われる、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記組成物の少なくとも１ブースター用量を投与することをさらに含む、項目１０５から１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記ブースター用量が、前記移植の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、２０、２１または２４日後に投与される、項目１１５
に記載の方法。
（項目１１７）
前記寛容が、少なくとも１か月の期間にわたる、項目１０５から１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記寛容が、少なくとも１００日の期間にわたる、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記寛容が、少なくとも１年の期間にわたる、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する寛容を誘導する方法であって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む有効量の組成物を前記レシピエントに投与することを含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含む、方法。
（項目１２１）
前記寛容が、移植後５０日後に免疫抑制療法の非存在下において存在する、項目１２０に記載の前処置レジメン。
（項目１２２）
前記寛容が、ブースターレジメンの非存在下において存在する、項目１２０から１２１のいずれか一項に記載の前処置レジメン。
（項目１２３）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する免疫応答を阻害するための方法であって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
の有効量を前記レシピエントに投与することを含む、方法。
（項目１２４）
レシピエントにおいて細胞、組織または臓器移植片に対する免疫応答を阻害するための方法であって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む有効量の組成物を前記レシピエントに投与することを含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含む、方法。
（項目１２５）
前記免疫応答が、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞増殖、マクロファージ活性化、サイトカイン産生、またはそれらの組合せを含む、項目１２３から１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
対象を移植後免疫寛容化する方法であって、
（ａ）カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、前記架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされているアポトーシス性白血球、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１２７）
前記アポトーシス性白血球が、末梢血から単離されている、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記アポトーシス性白血球が、陽性または陰性選択によってＢ細胞について富化されている、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記アポトーシス性白血球が、前記カルボジイミド架橋剤による前記モジュレートの前に、出発集団に対して少なくとも２００倍増やされている、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片の移植のためのキットであって、
（ａ）架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む第１の組成物を含む第１の容器、
（ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤を含む第２の組成物を含む第２の容器、
（ｃ）抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤を含む第３の組成物を含む第３の容器、
（ｄ）抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤を含む第４の組成物を含む第４の容器、および
（ｅ）抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤を含む第５の組成物を含む第５の容器を含む、キット。
（項目１３１）
レシピエントにおける細胞、組織または臓器移植片の移植のためのキットであって、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球を含む第１の組成物を含む第１の容器を含み、前記アポトーシス性白血球は、その表面上にコンジュゲートされた、
前記レシピエントのＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド、または
前記細胞、組織もしくは臓器移植片のドナーのＭＨＣクラスＩ分子に由来する１種もしくは複数のペプチド
を含む、キット。
（項目１３２）
前記細胞、組織または臓器移植片をさらに含む、項目１２７から１３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目１３３）
前処置レジメンおよび寛容化レジメンを含む移植キットであって、
前記前処置レジメンが、
架橋剤中において固定されたアポトーシス性白血球、
ｍＴＯＲ阻害剤、
抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、および
抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記寛容化レジメンが、
カルボジイミド架橋剤でモジュレートされたアポトーシス性白血球であって、前記架橋剤との接触の前に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、ＢＡＦＦおよびＣＤ４０Ｌの１つまたは複数の存在下で増やされているアポトーシス性白血球、
ｍＴＯＲ阻害剤、
抗腫瘍壊死因子剤または抗腫瘍壊死因子受容体剤、
抗インターロイキン６剤または抗インターロイキン６受容体剤、ならびに
抗ＣＤ４０剤または抗ＣＤ４０リガンド剤
を含み、
前記前処置レジメンが、移植の前に対象に投与され、前記寛容化レジメンが、移植後に前記対象に投与される、移植キット。
（項目１３４）
細胞、組織または臓器移植片をさらに含む、項目１３３に記載の移植キット。
（項目１３５）
前記寛容化レジメンの前記アポトーシス性白血球が、末梢血から単離されている、項目１３３に記載の移植キット。
（項目１３６）
前記寛容化レジメンの前記アポトーシス性白血球が、陽性または陰性選択によってＢ細胞について富化されている、項目１３５に記載の移植キット。
（項目１３７）
前記寛容化レジメンの前記アポトーシス性白血球が、前記架橋剤との接触の前に、出発集団に対して少なくとも２００倍増やされている、項目１３６に記載の移植キット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【外国語明細書】