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▶ プリベイル セラピューティクス，インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024177670
(43)【公開日】2024-12-20
(54)【発明の名称】神経変性疾患のための遺伝子治療
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20241213BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241213BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241213BHJP
C12N 15/866 20060101ALI20241213BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241213BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241213BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241213BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/866 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N15/113 Z
C12N15/12 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024128634
(22)【出願日】2024-08-05
(62)【分割の表示】P 2021530800の分割
【原出願日】2019-11-26
(31)【優先権主張番号】62/772,230
(32)【優先日】2018-11-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】520118865
【氏名又は名称】プリベイル セラピューティクス，インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＶＡＩＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｌｉｌｌｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ ４６２８５， Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アベリオビッチ，アサ
(72)【発明者】
【氏名】ヘックマン，ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】リーン，エルベ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
(57)【要約】
【課題】
本開示は、いくつかの側面において、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病の処置のための組成物および方法に関する。
【解決手段】
いくつかの態様において、本開示は、ＡＰＯＥタンパク質アイソフォームまたはその一部をコードする導入遺伝子を含む発現コンストラクト、ＡＰＯＥ遺伝子またはその一部を標的とする阻害性核酸、または上記のいずれかの組み合わせを提供する。いくつかの態様において、本開示は、これを必要とする対象に、発現コンストラクトを投与することによりアルツハイマー病を処置する方法を提供する。
【選択図】なし
本開示は、いくつかの側面において、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病の処置のための組成物および方法に関する。
【解決手段】
いくつかの態様において、本開示は、ＡＰＯＥタンパク質アイソフォームまたはその一部をコードする導入遺伝子を含む発現コンストラクト、ＡＰＯＥ遺伝子またはその一部を標的とする阻害性核酸、または上記のいずれかの組み合わせを提供する。いくつかの態様において、本開示は、これを必要とする対象に、発現コンストラクトを投与することによりアルツハイマー病を処置する方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子およびＡＰＯＥ４の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現コンストラクトを含む、単離された核酸。
【請求項2】
阻害性核酸が、配列番号５～８、１２～１５、および１７～２０のいずれか１つで表される配列によってコードされる、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項3】
阻害性核酸が、配列番号７、８、１４、１５、１９、および２０のいずれか１つで表される配列によってコードされる、請求項１または２に記載の単離された核酸。
【請求項4】
ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項5】
ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子が、コドン最適化された核酸配列を含み、ここで任意に、核酸配列が、配列番号４で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項6】
発現コンストラクトが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）の脇に配置される、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項7】
ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項8】
単離された核酸が、配列番号１１、１６、および２１のいずれか１つで表される配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項9】
ＡＰＯＥ２タンパク質をコードする発現コンストラクトを含む単離された核酸であって、ここで単離された核酸が、配列番号４で表される配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項10】
ＡＰＯＥ４の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現コンストラクトを含む、単離された核酸。
【請求項11】
発現コンストラクトが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）の脇に配置され、ここで任意にＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項９または１０に記載の単離された核酸。
【請求項12】
１以上のプロモーターをさらに含み、ここで任意に１以上のプロモーターの各々は、独立して、ニワトリ－ベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項14】
ベクターがプラスミドである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項15】
ベクターが、ウイルスベクターであり、ここで任意にウイルスベクターが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物。
【請求項17】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項18】
（ｉ）カプシドタンパク質；および
（ｉｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１５に記載のベクター
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
（ｉｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１５に記載のベクター
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項19】
カプシドタンパク質が、血液脳関門を通過することができ、ここで任意にカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、請求項１８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項20】
ｒＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および非神経細胞を形質導入する、請求項１８または請求項１９に記載のｒＡＡＶ。
【請求項21】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のベクター、請求項１６に記載の組成物、または請求項１８～２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを対象へ投与することを含む、アルツハイマー病を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための方法。
【請求項22】
投与が、対象のＣＮＳへの直接注射を含み、ここで任意に、直接注射が、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、またはそれらのいずれかの組み合わせである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
対象のＣＮＳへの直接注射が、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
投与が、末梢注射を含み、ここで任意に末梢注射が、静脈内注射である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
対象が、ＡＰＯＥ４アレルについてホモ接合である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下で、２０１８年１１月２８日に出願された米国仮出願第６２／７７２，２３０号、表題「神経変性疾患のための遺伝子治療」の出願日の利益を主張し、これら各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下で、２０１８年１１月２８日に出願された米国仮出願第６２／７７２，２３０号、表題「神経変性疾患のための遺伝子治療」の出願日の利益を主張し、これら各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は認知症の最も一般的な形態であり、米国だけで５００万人以上の人々が罹患している。アルツハイマー病は、ニューロン機能を阻害し、ニューロン間の接続を破壊し、最終的には細胞死をもたらす、脳全体にわたる異常なタンパク質沈着物の存在により特徴付けられる不可逆的で進行性の脳障害である。これらの沈着物は、アミロイド－βのプラークおよびリン酸化タウタンパク質によって形成されるタングル（tangle）を含む。軽度のＡＤを有する患者は、記憶喪失を経験し、徘徊、お金の取り扱いにおける困難、質問の繰り返し、および性格や行動の変化につながる。中等度のＡＤ患者は、増大した記憶喪失を示し、混乱して友人や家族の認識が困難になり、新しいことを学ぶことができなくなり、幻覚、妄想、およびパラノイアにつながる。重度のＡＤを有する患者はコミュニケーションをすることができず、彼らのケアは他人に完全に依存する。最終的に、タンパク質プラークおよびタングルは脳全体に広がり、著しい組織の萎縮につながる。
アルツハイマー病（ＡＤ）は認知症の最も一般的な形態であり、米国だけで５００万人以上の人々が罹患している。アルツハイマー病は、ニューロン機能を阻害し、ニューロン間の接続を破壊し、最終的には細胞死をもたらす、脳全体にわたる異常なタンパク質沈着物の存在により特徴付けられる不可逆的で進行性の脳障害である。これらの沈着物は、アミロイド－βのプラークおよびリン酸化タウタンパク質によって形成されるタングル（tangle）を含む。軽度のＡＤを有する患者は、記憶喪失を経験し、徘徊、お金の取り扱いにおける困難、質問の繰り返し、および性格や行動の変化につながる。中等度のＡＤ患者は、増大した記憶喪失を示し、混乱して友人や家族の認識が困難になり、新しいことを学ぶことができなくなり、幻覚、妄想、およびパラノイアにつながる。重度のＡＤを有する患者はコミュニケーションをすることができず、彼らのケアは他人に完全に依存する。最終的に、タンパク質プラークおよびタングルは脳全体に広がり、著しい組織の萎縮につながる。
【発明の概要】
【0003】
概要
ほとんどのアルツハイマー病（ＡＤ）患者は、遅発性ＡＤを有しており、その症状は対象において６０代半ばに現れる。アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子は、遅発性ＡＤの発症に関与している。ＡＰＯＥは、ＡＤに対して保護的であるＡＰＯＥ２、および遅発性ＡＤを発症するリスクの増大に関連するＡＰＯＥ４を含む、いくつかのアイソフォームを有する。ＡＰＯＥ４の２コピーを保有するホモ接合体患者（例として、ＡＰＯＥ４＋／＋である対象）は、ＡＰＯＥの１コピー、およびＡＰＯＥ２またはＡＰＯＥ３のいずれかの１コピーを保有するヘテロ接合体患者と比較して、遅発性ＡＤを発症するより大きなリスクにある。
ほとんどのアルツハイマー病（ＡＤ）患者は、遅発性ＡＤを有しており、その症状は対象において６０代半ばに現れる。アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子は、遅発性ＡＤの発症に関与している。ＡＰＯＥは、ＡＤに対して保護的であるＡＰＯＥ２、および遅発性ＡＤを発症するリスクの増大に関連するＡＰＯＥ４を含む、いくつかのアイソフォームを有する。ＡＰＯＥ４の２コピーを保有するホモ接合体患者（例として、ＡＰＯＥ４＋／＋である対象）は、ＡＰＯＥの１コピー、およびＡＰＯＥ２またはＡＰＯＥ３のいずれかの１コピーを保有するヘテロ接合体患者と比較して、遅発性ＡＤを発症するより大きなリスクにある。
【0004】
本開示の側面は、ＡＤを有するかまたは有することが疑われる対象を処置するための組成物および方法に関する。本開示は、部分的には、ＡＤ関連遺伝子（例として、ＡＰＯＥ４などのＡＰＯＥ）を標的とする阻害性ＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現コンストラクトに基づく。
【0005】
いくつかの側面において、本開示はＡＰＯＥ２（またはその一部）をコードする発現コンストラクト（例として、ベクター）、および任意に、ＡＤ関連遺伝子からの１以上の追加の遺伝子産物（例として、ＡＰＯＥ４を標的とする阻害性核酸）に基づく。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、本明細書に記載の遺伝子産物の組み合わせは、対象において発現される場合、ＡＤの１以上の兆候および症状を低減するために一緒に（例として、相乗的に）作用する。
結果的に、いくつかの側面において、本開示は、ＡＰＯＥ２タンパク質をコードする発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供し、ここで単離された核酸は、配列番号４で表される配列を含む。
結果的に、いくつかの側面において、本開示は、ＡＰＯＥ２タンパク質をコードする発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供し、ここで単離された核酸は、配列番号４で表される配列を含む。
【0006】
いくつかの態様において、本開示は、ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子およびＡＰＯＥ４の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、発現コンストラクトは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）の脇に配置される。いくつかの態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
【0007】
いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号１で表される配列の少なくとも６個の連続したヌクレオチドに相補的である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号５～８、１２～１５、および１７～２０のいずれか１つで表される核酸配列を含む（または、それによりコードされる）阻害性ＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性核酸は、配列番号７、８、１４、１５、１９、および２０のいずれか１つで表される配列を含む（または、それによりコードされる）。
【0008】
いくつかの態様において、ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子は、コドン最適化された核酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ２をコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号４で表される。
いくつかの態様において、本開示は、配列番号１１、１６、および２１のいずれか１つで表される配列を含む単離された核酸を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、配列番号１１、１６、および２１のいずれか１つで表される配列を含む単離された核酸を提供する。
【0009】
いくつかの側面において、本開示は、ＡＰＯＥ２タンパク質をコードする発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供し、ここで単離された核酸は、配列番号４で表される配列を含む。いくつかの側面において、本開示は、ＡＰＯＥ４の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、発現コンストラクトは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）の脇に配置され、ここで任意にＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
【0010】
いくつかの態様において、単離された核酸は、１以上のプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリ－ベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。
いくつかの態様において、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドである。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである。
いくつかの態様において、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドである。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである。
【0011】
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0012】
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質；および本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、血液脳関門を通過することができる。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および／または非神経細胞を形質導入する。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、血液脳関門を通過することができる。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および／または非神経細胞を形質導入する。
【0013】
いくつかの側面において、本開示は、アルツハイマー病を有するかまたは有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、本開示に記載の単離された核酸、ベクター、組成物、またはｒＡＡＶを対象へ投与することを含む。
【0014】
いくつかの態様において、投与は、対象のＣＮＳへの直接注射を含む。いくつかの態様において、直接注射は、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、またはそれらのいずれかの組み合わせである。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。いくつかの態様において、投与は、末梢注射を含む。いくつかの態様において、末梢注射は、静脈内注射である。いくつかの態様において、対象は、ＡＰＯＥ４アレルについてホモ接合（例として、ＡＰＯＥ４＋／＋）である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
図面の簡単な説明
【図1】図１は、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ転写産物バリアント４ ＡｐｏＥ４）を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現コンストラクトを含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、Ｈ１プロモーターに作動可能に連結されている。
【図2】図２は、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ転写産物バリアント４ ＡｐｏＥ４）を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現コンストラクトを含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡはイントロン内に位置し、プロモーター配列に作動可能に連結されている。
【図3】図３は、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ転写産物バリアント４ ＡｐｏＥ４）を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現コンストラクトを含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＡＰＯＥ２タンパク質コード配列との間のイントロン内に位置する。
【図4】図４は、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ転写産物バリアント４ ＡｐｏＥ４）を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現コンストラクトを含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＡＰＯＥ２タンパク質コード配列との間のイントロン内に位置する。
【図5】図５は、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ転写産物バリアント４ ＡｐｏＥ４）を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現コンストラクトを含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＡＰＯＥ２タンパク質コード配列との間のイントロン内に位置する。
【図6】図６は、ＩＴＲの「外側」（例として、導入遺伝子インサートまたは発現コンストラクトに対してＩＴＲの末端の近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクター（上）、およびＩＴＲをベクターの「内側」（例として、ベクターの導入遺伝子インサートの近位）に有する野生型ｒＡＡＶベクターを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
詳細な説明
本開示は、部分的には、対象におけるＡＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物および方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質のフラグメント（例として、一部）、ＡＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＤ関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはタンパク質フラグメントである。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例として、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
本開示は、部分的には、対象におけるＡＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物および方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質のフラグメント（例として、一部）、ＡＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＤ関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはタンパク質フラグメントである。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例として、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
【0017】
ＡＤ関連遺伝子は、遺伝子学的に、生化学的に、または機能的にアルツハイマー病（ＡＤ）に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、ＡＰＯＥ４の少なくとも１のコピーを有する個体は、遅発性ＡＤを発症する増大したリスクにある。別の例において、ＡＰＯＥ２は、ＡＤのマウスモデルにおいて神経保護効果を示す。本明細書に使用されるとき、用語「神経保護」は、神経保護の不在（例として、神経保護剤またはタンパク質の不在）における細胞または対象の神経構造および／または機能の保存と比較した、細胞または対象の神経構造および／または機能の保存を指す。
【0018】
単離された核酸およびベクター
単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの側面において、本開示は、ＡＰＯＥ２タンパク質またはその一部をコードする導入遺伝子４および／またはＡＰＯＥを標的とする阻害性核酸をコードする、発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供する。
一般に、本明細書に記載の単離された核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の阻害性核酸（例として、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードし得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、１０を超える阻害性核酸をコードする。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、異なる遺伝子または遺伝子の一部を標的とする（例として、第１のｍｉＲＮＡは遺伝子の第１の標的配列を標的とし、第２のｍｉＲＮＡは、第１の標的配列とは異なる、遺伝子の第２の標的配列を標的とする）。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、同じ遺伝子の同じ標的配列を標的とする（例として、単離された核酸は、同じｍｉＲＮＡの複数のコピーをコードする）。
単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの側面において、本開示は、ＡＰＯＥ２タンパク質またはその一部をコードする導入遺伝子４および／またはＡＰＯＥを標的とする阻害性核酸をコードする、発現コンストラクトを含む単離された核酸を提供する。
一般に、本明細書に記載の単離された核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の阻害性核酸（例として、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードし得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、１０を超える阻害性核酸をコードする。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、異なる遺伝子または遺伝子の一部を標的とする（例として、第１のｍｉＲＮＡは遺伝子の第１の標的配列を標的とし、第２のｍｉＲＮＡは、第１の標的配列とは異なる、遺伝子の第２の標的配列を標的とする）。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、同じ遺伝子の同じ標的配列を標的とする（例として、単離された核酸は、同じｍｉＲＮＡの複数のコピーをコードする）。
【0019】
本開示の側面は、ＡＰＯＥ４タンパク質（例として、ＡＰＯＥ遺伝子のアイソフォームＥ４）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例として、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現コンストラクトを含む、単離された核酸に関する。ＡＰＯＥタンパク質は、アポリポタンパク質Ｅを指し、これは、トリグリセリドに富むリポタンパク質の異化において役割を果たす脂肪結合タンパク質である。ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、およびＡＰＯＥ４と称されるＡＰＯＥの３つの主要なアイソフォームが存在する。各アイソフォームは、アミノ酸１３０およびアミノ酸１７６（タンパク質のシグナルペプチドを除いた場合、夫々位置１１２および１５８とも称される）の２つの位置において他と異なる。ＡＰＯＥ２は、Ｃｙｓ１３０／Ｃｙｓ１７６を含有する、ＩＩＩ型高脂血症および他の疾患に関連することが観察されているが、神経保護の役割も果たす。ＡＰＯＥ３はＣｙｓ１３０／Ａｒｇ１７６を含有し、最も一般的なＡＰＯＥアレルである。
【0020】
ＡＰＯＥ４はＡｒｇ１３０／Ａｒｇ１７６を含有し、遅発性アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）における好ましくない結果および他の疾患に関連していることが観察されている。ヒトにおいて、ＡＰＯＥ遺伝子は１９番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ４は、配列番号１で表される核酸配列（例として、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１３０２６９０．１）によってコードされる。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ２は、配列番号２で表される核酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００００４１．３）によってコードされる。
【0021】
ＡＰＯＥ遺伝子（例として、ＡＰＯＥ４）を標的とする阻害性核酸は、長さが６～５０ヌクレオチドである相補性の領域（例として、標的遺伝子、例えばＡＰＯＥ４をコードする遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６～３０、約８～２０、または約１０～１９ヌクレオチドである、ＡＰＯＥと相補性の領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＡＰＯＥ配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ遺伝子を標的とする阻害性核酸は、非アレル特異的である（例として、阻害性核酸は、ＡＰＯＥ遺伝子のすべてのアイソフォームをサイレンシングする）。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＡＰＯＥの１つ以上の特定のアレル、例えばＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、および／またはＡＰＯＥ４の１つ以上を標的とする。
【0022】
いくつかの態様において、遺伝子産物（例として、ＡＰＯＥ２をコードする導入遺伝子）は、天然に存在する遺伝子のコード部分（例として、ｃＤＮＡ）によりコードされる。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＰＯＥ遺伝子のＡＰＯＥ２アイソフォームによってコードされるタンパク質（またはそのフラグメント）である。いくつかの態様において、ＡＰＯＥ２遺伝子は、配列番号３で表される核酸配列を含む。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＤ関連遺伝子（例として、ＡＰＯＥ遺伝子のＡＰＯＥ４アイソフォーム）を標的とする（例として、それにハイブリッドする、またはそれと相補性を有する領域を含む）阻害性核酸である。当業者は、第１の遺伝子産物（例として、ＡＰＯＥ２）および第２の遺伝子産物（例として、ＡＰＯＥ遺伝子のＡＰＯＥ４アイソフォームを標的とする阻害性ＲＮＡ）の発現の順序は、一般的に逆転され得ることを認識する（例として、阻害性ＲＮＡは第１の遺伝子産物であり、ＡＰＯＥ２は第２の遺伝子産物である）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＡＰＯＥ遺伝子のフラグメント（例として、一部）である。タンパク質フラグメントは、ＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％を含み得る。いくつかの態様において、タンパク質フラグメントは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、５０％～９９．９％（例として、５０％～９９．９％の間のいずれかの値）を含む。いくつかの態様において、遺伝子産物（例として、阻害性ＲＮＡ）は、標的遺伝子の一部にハイブリダイズする（例として、標的遺伝子、例えば、配列番号１で表される配列などの、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォームの、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上の連続したヌクレオチドに相補的である）。
【0023】
いくつかの態様において、発現コンストラクトはモノシストロニックである（例として、発現コンストラクトは、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物を含む単一の融合タンパク質をコードする）。いくつかの態様において、発現コンストラクトはポリシストロニックである（例として、発現コンストラクトは、２つの異なる遺伝子産物、例えば２つの異なるタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする）。
【0024】
ポリシストロニックな発現ベクターは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のプロモーターを含み得る。任意の適切なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用することができる。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2に記載のもの）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えばTornoee et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32に記載のもの）である。いくつかの態様において、プロモーターは、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、または第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている。いくつかの態様において、発現カセットは１つ以上の追加の調節配列を含み、これには、限定することなく、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【0025】
いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離されている。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30に記載されている。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断型ペプチドをコードする核酸配列によって分離されている。自己切断型ペプチドの例には、限定はされないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、およびＢｍＩＦＶ ２Ａ、およびLiu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193に記載されたものが含まれる。いくつかの態様において、自己切断型ペプチドはＴ２Ａペプチドである。
【0026】
いくつかの態様において、ＡＤなどの障害は、ＡＰＯＥ４の少なくとも１つのコピーの発現に関連する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸は、ＡＰＯＥ４（例として、ＡＰＯＥ）の発現を低減または予防する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現ベクターの非翻訳領域（例として、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に配置され得る。
【0027】
いくつかの態様において、阻害性核酸は、発現コンストラクトのイントロン、例えば、第１の遺伝子産物をコードする配列の上流のイントロンに配置される。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーであることができる。一般に阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の約６～約３０（例えば、６から３０までの任意の整数）個の連続したヌクレオチドに結合する（例えば、ハイブリダイズする）。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ、例えば、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォーム（ＡＰＯＥ４タンパク質コードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＡＰＯＥ ｍＲＮＡの領域とのいかなるミスマッチも含まない（例として、ｍｉＲＮＡは「完全」である）。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ（例として、ＡＰＯＥを標的とするｓｈＲＮＡ）、例えば配列番号７、１４および１９のいずれか１つで表されるものである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＡＰＯＥ ｍＲＮＡの領域と、少なくとも１つ（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のミスマッチを含む。
【0028】
いくつかの態様において、阻害性核酸は、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は典型的には、植物および動物に見られる小さな非コードＲＮＡを指し、遺伝子発現の転写および翻訳後調節に機能する。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて、プリｍｉＲＮＡと呼ばれるヘアピンループ構造を形成する；これは、その後酵素（Ｄｒｏｓｈａ、Ｐａｓｈａ、スプライセオソームなど）によって処理されてプレｍｉＲＮＡヘアピン構造を形成し、これは次にダイサーにより処理されて、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖（＊はｍｉＲＮＡ二重鎖のパッセンジャー鎖を示す）を形成し、その一方の鎖は次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォーム（ＡＰＯＥ４タンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。
【0029】
いくつかの態様において、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォーム）を標的とする阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖は、配列番号５、６、１２、１３、１７、および１８のいずれか１つで表される配列もしくはその一部を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ＊鎖は、配列番号５、６、１２、１３、１７、および１８のいずれか１つで表される配列を含むか、またはそれからなる。
【0030】
人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、天然のｍｉＲＮＡを修飾して、プレｍＲＮＡの天然の標的化領域を目的の標的化領域で置き換えることにより誘導される。例えば、天然に発現するｍｉＲＮＡを足場または骨格（例えば、プリｍｉＲＮＡ足場）として使用でき、ステム配列を、目的遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡのそれに置き換える。人工前駆体マイクロＲＮＡ（プレａｍｉＲＮＡ）は、通常、単一の安定した低分子ＲＮＡが優先的に生成されるように処理される。いくつかの態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶは、ａｍｉＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡのプリｍｉＲＮＡ足場は、プリＭＩＲ－２１、プリＭＩＲ－２２、プリＭＩＲ－２６ａ、プリＭＩＲ－３０ａ、プリＭＩＲ－３３、プリＭＩＲ－１２２、プリＭＩＲ－３７５、プリＭＩＲ－１９９、プリＭＩＲ－９９、プリＭＩＲ－１９４、プリＭＩＲ－１５５、およびプリＭＩＲ－４５１からなる群から選択されるプリｍｉＲＮＡに由来する。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡは、例えばFowler et al. Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48に記載されているように、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォーム）を標的とする核酸配列、およびｅＳＩＢＲ ａｍｉＲＮＡ足場を含む。
【0031】
いくつかの態様において、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォーム）を標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号８、１５、および２０のいずれか１つで表される配列を含むか、またはそれからなる。
本明細書に記載の単離された核酸は、それ自体で、またはベクターの一部として存在し得る。一般にベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）である。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離された核酸を含むプラスミド）である。いくつかの態様において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶベクターの「プラス鎖」または「マイナス鎖」のいずれかを含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖である（例えば、一本鎖ＤＮＡ）。いくつかの態様において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例として、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
本明細書に記載の単離された核酸は、それ自体で、またはベクターの一部として存在し得る。一般にベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）である。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離された核酸を含むプラスミド）である。いくつかの態様において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶベクターの「プラス鎖」または「マイナス鎖」のいずれかを含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖である（例えば、一本鎖ＤＮＡ）。いくつかの態様において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例として、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
【0032】
典型的には、ｒＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の脇に配置される導入遺伝子（例として、以下：プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性ＲＮＡコード配列、ポリＡテール配列などの各々を１以上含む発現コンストラクト）を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示に記載の単離された核酸を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの２つのＩＴＲ配列のそれぞれは、完全長ＩＴＲ（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲの１つは、切断されている（例えば、短縮されているかまたは完全長ではない）。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の生成のために使用される。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、例えば、McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8に記載のΔＩＴＲである。
【0033】
本開示の側面は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲと比べて、例えば野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号２５）と比べて、１つ以上の修飾（例えば、核酸の追加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの構造を、図６に示す。一般に野生型ＩＴＲは、自己アニーリングして回文構造の二本鎖Ｔ型ヘアピン構造（これは、２つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’およびＣ／Ｃ’と呼ばれる配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’によって形成される）、および「Ｄ」領域と呼ばれる一本鎖末端領域からなる）を形成する、１２５ヌクレオチドの領域を含む（図６）。一般に、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含むインサートの間に配置される（例えば、ＩＴＲの末端に対してＩＴＲの「内側」に配置されるか、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子インサートもしくは発現コンストラクトの近位に配置される）。いくつかの態様において、「Ｄ」領域は、配列番号２３に示される配列を含む。「Ｄ」領域は、例えば、Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)に開示されるように、カプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのカプシド形成において、重要な役割を果たすことが観察されている。
【0034】
本開示は、部分的に、ＩＴＲの「外側」に位置する「Ｄ」領域（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現コンストラクトに対してＩＴＲの末端に近い）を含むｒＡＡＶベクターが、修飾されていない（例えば、野生型の）ＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターよりも、ＡＡＶカプシドタンパク質によって効率的にカプシド化されるという、驚くべき発見に基づいている。いくつかの態様において、修飾された「Ｄ」領域を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターと比べて毒性が減少している。
【0035】
いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２３）と比べて、少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２３）と比べて、少なくも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド置換を有し得る。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２３）と比べて、少なくも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のヌクレオチド置換を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２３）と、約１０％～約９９％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一である。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80に記載のように、「Ｓ」配列とも呼ばれる配列番号２２に示される配列を含む。
【0036】
本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターはさらに、例えば、配列番号２４に示されるような、またはFrancois, et al. 2005. J Virol The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Elementに記載のような「ＴＲＹ」配列を含み得る。いくつかの態様において、ＴＲＹ配列は、単離された核酸またはｒＡＡＶベクターのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）と発現コンストラクト（例えば、導入遺伝子をコードするインサート）との間に配置される。
【0037】
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターを含む、バキュロウイルスベクターに関する。いくつかの態様において、バキュロウイルスベクターは、例えばUrabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43およびSmith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896に記載されるような、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。
【0038】
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は細菌細胞、例えば大腸菌細胞である。
【0039】
ｒＡＡＶ
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）。「ｒＡＡＶ」という用語は一般に、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されたｒＡＡＶベクターを含む、ウイルス粒子を指す。本開示に記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、野生型カプシドタンパク質のバリアントであるカプシドタンパク質を含み、これは例えば、それが由来する野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多く（例えば、１５、２０、２５、５０、１００など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含む、カプシドタンパク質バリアントである。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）。「ｒＡＡＶ」という用語は一般に、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されたｒＡＡＶベクターを含む、ウイルス粒子を指す。本開示に記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、野生型カプシドタンパク質のバリアントであるカプシドタンパク質を含み、これは例えば、それが由来する野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多く（例えば、１５、２０、２５、５０、１００など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含む、カプシドタンパク質バリアントである。
【0040】
いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、特にＣＳＦ空間にまたは直接脳実質に導入された場合に、ＣＮＳを通して容易に広がる。したがって、いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるカプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０血清型を有するカプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶの生成は、例えば、Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8およびWright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706に記載されている。
【0041】
いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されてｒＡＡＶカプシド粒子を形成する、組換えｒＡＡＶゲノムを含むもの）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）で生成される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶの生成は、例えば以下に記載されている：Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43、Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896、米国特許第８，９４５，９１８号、米国特許第９，８７９，２８２号、および国際ＰＣＴ公開ＷＯ ２０１７／１８４８７９。しかしながらｒＡＡＶは、任意の適切な方法を使用して（例えば、組換えｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を使用して）生成され得る。
【0042】
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」という用語は、化合物の生物活性または特性を無効にせず、また比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、例えば材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、またはそれが含まれている組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与し得る。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」という用語は、化合物の生物活性または特性を無効にせず、また比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、例えば材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、またはそれが含まれている組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与し得る。
【0043】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容し得る担体」とは、薬学的に許容し得る材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料などであって、本発明内で有用な化合物をそれが意図する機能を果たすことができるように患者内にまたは患者に運ぶかまたは輸送することに関連するものを、意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得るさらなる成分は、当該分野で知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている；これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0044】
本明細書で提供される組成物（例えば、医薬組成物）は、以下を含む任意の経路で投与することができる：経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内（intraventricular）、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴剤による）、粘膜、鼻腔、頬側、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入；および／または経口スプレー、鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給による局所投与、および／または罹患部位への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、様々な因子、例えば薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）などに依存するであろうある態様において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に好適である。
【0045】
方法
本開示は部分的に、アルツハイマー病を処置するために一緒に（例として、相乗的に）作用する、対象におけるＡＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物に基づく。本明細書で使用される「処置する」または「処置すること」とは、（ａ）アルツハイマー病の発病を予防または遅延させること；（ｂ）アルツハイマー病の重症度を低減すること；（ｃ）アルツハイマー病に特徴的な症状の発症を低減または予防すること；（ｄ）および／または、アルツハイマー病に特徴的な症状の悪化を予防すること、を指す。アルツハイマー病の症状には、例えば、認知機能障害（例として、認知症、幻覚、記憶喪失など）、運動機能障害（例として、日常のタスクの実施困難など）、ならびに感情的および行動的機能障害が含まれる。
本開示は部分的に、アルツハイマー病を処置するために一緒に（例として、相乗的に）作用する、対象におけるＡＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物に基づく。本明細書で使用される「処置する」または「処置すること」とは、（ａ）アルツハイマー病の発病を予防または遅延させること；（ｂ）アルツハイマー病の重症度を低減すること；（ｃ）アルツハイマー病に特徴的な症状の発症を低減または予防すること；（ｄ）および／または、アルツハイマー病に特徴的な症状の悪化を予防すること、を指す。アルツハイマー病の症状には、例えば、認知機能障害（例として、認知症、幻覚、記憶喪失など）、運動機能障害（例として、日常のタスクの実施困難など）、ならびに感情的および行動的機能障害が含まれる。
【0046】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、アルツハイマー病を有するかまたは有することが疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の組成物（例として、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。
【0047】
対象は、典型的には、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ハムスター、ラット、マウスなどである。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、ＡＰＯＥ４アレルによって特徴づけられる。対象は、ＡＰＯＥ４についてホモ接合（例として、ＡＰＯＥ４＋／＋）またはヘテロ接合であり得る。いくつかの態様において、対象は、ＡＰＯＥ４についてヘテロ接合であり、対象の第２のＡＰＯＥアレルは、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３から選択される。
【0048】
いくつかの態様において、組成物は、対象のＣＮＳに直接的に、例えば対象の脳および／または脊髄への直接注射によって、投与される。ＣＮＳ直接投与法の例には、限定はされないが、脳内注射、脳室内注射、槽内注射、実質内注射、髄腔内注射、および前述の任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体および／または大脳皮質における、導入遺伝子発現（例として、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注入は、対象の脊髄および／またはＣＳＦにおける導入遺伝子発現（例として、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。
【0049】
いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。対流強化送達は、脳の外科的露出および小径カテーテルを脳の標的領域に直接配置し、続いて治療剤（例として、本明細書に記載の組成物またはｒＡＡＶ）を対象の脳に直接注入することを含む、治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27に記載されている。
いくつかの態様において、組成物は、例えば末梢注射により、対象の末梢に投与される。末梢注射の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
いくつかの態様において、組成物は、例えば末梢注射により、対象の末梢に投与される。末梢注射の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
【0050】
いくつかの態様において、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象の末梢および直接的にＣＮＳの両方で投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）および実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって、組成物を投与される。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射および末梢注射は同時である（例えば、同時に起こる）。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の前（例えば、１分から１週間の間、またはそれより前）に行われる。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の後（例えば、１分から１週間の間、またはその後）に行われる。
【0051】
対象に投与される本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、対象に、約１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇと約１０１４ＧＣ／ｋｇの間（例えば、約１０９ＧＣ／ｋｇ、約１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、または約１０１４ＧＣ／ｋｇ）の力価で投与される。いくつかの態様において、対象は、高力価（例えば、＞１０１２ゲノムコピーＧＣ／ｋｇのｒＡＡＶ）を、ＣＳＦ空間への注射により、または実質内注射により投与される。
【0052】
本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象に１回または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの態様において、組成物は対象に継続的に（例えば、慢性的に）、例えば注入ポンプを介して、投与される。
【実施例0053】
例
例１：核酸およびｒＡＡＶベクター
この例は、ＡＰＯＥ２タンパク質またはその一部をコードする導入遺伝子および／またはＡＰＯＥ４を標的とする阻害性核酸を含む、単離された核酸（例として、ｒＡＡＶベクターなどのベクター、および単離された核酸を含有するｒＡＡＶ）について説明する。いくつかの態様において、この例に記載のコンストラクトは、ＡＰＯＥ４アイソフォームの少なくとも１つのコピーを有するアルツハイマー病（ＡＤ）を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するために有用である。いくつかの態様において、対象は、ＡＰＯＥ４アイソフォームについてホモ接合（例として、ＡＰＯ４４＋／＋）である。
例１：核酸およびｒＡＡＶベクター
この例は、ＡＰＯＥ２タンパク質またはその一部をコードする導入遺伝子および／またはＡＰＯＥ４を標的とする阻害性核酸を含む、単離された核酸（例として、ｒＡＡＶベクターなどのベクター、および単離された核酸を含有するｒＡＡＶ）について説明する。いくつかの態様において、この例に記載のコンストラクトは、ＡＰＯＥ４アイソフォームの少なくとも１つのコピーを有するアルツハイマー病（ＡＤ）を有するかまたは有することが疑われる対象を処置するために有用である。いくつかの態様において、対象は、ＡＰＯＥ４アイソフォームについてホモ接合（例として、ＡＰＯ４４＋／＋）である。
【0054】
ｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸は、具体的にはin vitroおよびin vivoの両方でＡＰＯＥ４アイソフォームの発現をノックダウンするために利用される。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは非アレル特異的であり、例として、それらは、他のＡＰＯＥアイソフォーム（例として、Ｅ２、Ｅ３、またはＥ４）の発現をノックダウンすることもできる。
ＡＰＯＥ２をコードする導入遺伝子をコードする単離された核酸は、ＡＰＯＥ２を過剰発現するために利用される。アイソフォームにかかわらず、野生型ＡＰＯＥを標的とするｓｈＲＮＡによって認識されないように、ＡＰＯＥ２導入遺伝子は、細胞内の内因性ＡＰＯＥ２配列と充分に異なるようにコドン最適化されている。
ＡＰＯＥ２をコードする導入遺伝子をコードする単離された核酸は、ＡＰＯＥ２を過剰発現するために利用される。アイソフォームにかかわらず、野生型ＡＰＯＥを標的とするｓｈＲＮＡによって認識されないように、ＡＰＯＥ２導入遺伝子は、細胞内の内因性ＡＰＯＥ２配列と充分に異なるようにコドン最適化されている。
【0055】
ｓｈＲＮＡおよび導入遺伝子は、同じプロモーターまたは別のプロモーターに作動可能に連結され得る。ｓｈＲＮＡは、別のプロモーター、典型的にはＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（例として、Ｈ１プロモーター）、またはＰｏｌ ＩＩプロモーター（例としてＣＢＡ、Ｔ７など）の下で発現する。一般に、ｓｈＲＮＡは、コドン最適化されたＡＰＯＥ２導入遺伝子を含むオープンリーディングフレームの上流のイントロン配列に配置されたＰｏｌ ＩＩプロモーターに作動可能に連結される。本開示によって記載される発現コンストラクトの例は、図１～５および以下の表１に示される。
【0056】
単離された核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、トリプルプラスミドトランスフェクション用のＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して生成される。ＩＴＲ配列は、典型的には、以下：少なくとも１つのプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、およびＷＰＲＥ要素などの翻訳後シグナルの１つ以上を含む発現コンストラクトに隣接する。ＡＰＯＥのＡＰＯＥ２アイソフォームおよび１つ以上の阻害性核酸（例として、ＡＰＯＥのＡＰＯＥ４アイソフォームを標的とする阻害性核酸）などの複数の遺伝子産物は同時に発現される。発現された遺伝子の上流に効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを改善し得る。ｓｈＲＮＡおよび他の調節性ＲＮＡは、潜在的にこれらの配列内に含まれ得る。
【0057】
表１
【表1】
【0058】
例２：ＡＰＯＥ４＋／＋細胞へのウイルス形質導入の細胞ベースアッセイ
細胞は、例えばＡＤ患者からの線維芽細胞、単球、またはｈＥＳ細胞、または患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として取得される。これらの細胞は、アミロイド－βタンパク質を含むタンパク質性プラークと、タンパク質タウのねじれた鎖を含むタングルを蓄積する。
細胞は、例えばＡＤ患者からの線維芽細胞、単球、またはｈＥＳ細胞、または患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として取得される。これらの細胞は、アミロイド－βタンパク質を含むタンパク質性プラークと、タンパク質タウのねじれた鎖を含むタングルを蓄積する。
【0059】
このような細胞モデルを使用して、ＡＤに関連する神経変性の特徴は、例えば、α－アミロイド－β抗体またはα－リン酸化タウ抗体を利用して、プラークやタングルなどのタンパク質凝集体の蓄積の観点から定量化され、続いて蛍光顕微鏡を使用したイメージングされる。アミロイド－β、リン酸化タウ、またはＡＰＯＥ４などのタンパク質マーカーのＩＣＣによるＡＤに関連する神経変性の特徴のイメージングも行われる。ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および／またはｑＰＣＲが、これらの細胞におけるＡＰＯＥ４発現レベルを定量するために使用される。
【0060】
治療エンドポイント（例として、ＡＤに関連する病的状態の低減）は、ｒＡＡＶの形質導入の発現の文脈において測定され、活性と機能を確認および定量される。アミロイド－βおよびリン酸化タウのレベルも、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および／またはｑＰＣＲを使用して定量される。
【0061】
例３：ヒトＡＰＯＥ４を発現するマウスを使用したin vivoアッセイ
この例は、突然変異体マウスを使用したｒＡＡＶのin vivoアッセイについて説明する。突然変異体マウスにおける上記のｒＡＡＶのin vivo研究は、例えば、Liao et al. (2018) J. Clin. Invest 128(5): 2144-2155; Rosenberg, et al. (2018) Hum Gene Ther Clin Dev 29(1): 24-47; Zhao et al. (2016) Neurobiol Aging 44: 159-172によって記載されるアッセイを使用して行われる。これらの突然変異体マウスは、マウスのＡＰＯＥ遺伝子座にヒトＡＰＯＥ４アイソフォームを保持している。
ビークル対照とｒＡＡＶ（例として、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）の髄腔内または脳室内送達は、濃縮されたｒＡＡＶストックを使用して、例えば５～１０μＬの注射体積で行われる。対流強化送達による実質内送達が行われる。
処置は、症状の発病前または発病に続いてのいずれかで開始される。測定されたエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおけるＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２発現のレベルである。
この例は、突然変異体マウスを使用したｒＡＡＶのin vivoアッセイについて説明する。突然変異体マウスにおける上記のｒＡＡＶのin vivo研究は、例えば、Liao et al. (2018) J. Clin. Invest 128(5): 2144-2155; Rosenberg, et al. (2018) Hum Gene Ther Clin Dev 29(1): 24-47; Zhao et al. (2016) Neurobiol Aging 44: 159-172によって記載されるアッセイを使用して行われる。これらの突然変異体マウスは、マウスのＡＰＯＥ遺伝子座にヒトＡＰＯＥ４アイソフォームを保持している。
ビークル対照とｒＡＡＶ（例として、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）の髄腔内または脳室内送達は、濃縮されたｒＡＡＶストックを使用して、例えば５～１０μＬの注射体積で行われる。対流強化送達による実質内送達が行われる。
処置は、症状の発病前または発病に続いてのいずれかで開始される。測定されたエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおけるＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２発現のレベルである。
【0062】
例４：ＡＤのマウスモデルのin vivoアッセイ
この例は、突然変異体マウスを使用したｒＡＡＶのin vivoアッセイについて説明する。突然変異体マウスにおける上記のｒＡＡＶのin vivo研究は、例えば、Liao et al. (2018) J. Clin. Invest 128(5): 2144-2155; Rosenberg, et al. (2018) Hum Gene Ther Clin Dev 29(1): 24-47; Zhao et al. (2016) Neurobiol Aging 44: 159-172によって記載されるアッセイを使用して行われる。これらの突然変異体マウスは、マウスのＡＰＯＥ遺伝子座にヒトＡＰＯＥ４アイソフォームを保持している。いくつかの場合において、ヒトＡＤにおけるアミロイド－βプラークの発生をモデル化するために、これらのマウスは、突然変異体ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、突然変異体ヒトプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質、および／または突然変異体ヒトプレセニリン２（ＰＳ２）タンパク質も発現する。
この例は、突然変異体マウスを使用したｒＡＡＶのin vivoアッセイについて説明する。突然変異体マウスにおける上記のｒＡＡＶのin vivo研究は、例えば、Liao et al. (2018) J. Clin. Invest 128(5): 2144-2155; Rosenberg, et al. (2018) Hum Gene Ther Clin Dev 29(1): 24-47; Zhao et al. (2016) Neurobiol Aging 44: 159-172によって記載されるアッセイを使用して行われる。これらの突然変異体マウスは、マウスのＡＰＯＥ遺伝子座にヒトＡＰＯＥ４アイソフォームを保持している。いくつかの場合において、ヒトＡＤにおけるアミロイド－βプラークの発生をモデル化するために、これらのマウスは、突然変異体ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、突然変異体ヒトプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質、および／または突然変異体ヒトプレセニリン２（ＰＳ２）タンパク質も発現する。
【0063】
ビークル対照とｒＡＡＶ（例として、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）の髄腔内または脳室内送達は、濃縮されたｒＡＡＶストックを使用して、例えば５～１０μＬの注射体積で行われる。対流強化送達による実質内送達が行われる。末梢送達は、尾静脈注射によって達成される。
処置は、症状の発病前または発病に続いてのいずれかで開始される。測定されたエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおけるＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２発現のレベル、Ａβ４２などのより長いアミロイド－β（Ａβ）種の蓄積、すべてのＡβ種の増大、運動および認知エンドポイント、ならびにアミロイド－βプラークおよびタウタングルの蓄積である。
処置は、症状の発病前または発病に続いてのいずれかで開始される。測定されたエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおけるＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２発現のレベル、Ａβ４２などのより長いアミロイド－β（Ａβ）種の蓄積、すべてのＡβ種の増大、運動および認知エンドポイント、ならびにアミロイド－βプラークおよびタウタングルの蓄積である。
【0064】
例５：ＡＤ患者の臨床試験
この例は、ＡＤを有する患者において、本開示によって記載されるｒＡＡＶの安全性および有効性を査定するための臨床試験を説明する。
ＡＤの処置のための本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦ中に、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
測定されるエンドポイントは、アミロイド－βプラークのレベル、タウタングル、運動および認知エンドポイント、ならびにＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２タンパク質のレベルである。
この例は、ＡＤを有する患者において、本開示によって記載されるｒＡＡＶの安全性および有効性を査定するための臨床試験を説明する。
ＡＤの処置のための本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦ中に、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
測定されるエンドポイントは、アミロイド－βプラークのレベル、タウタングル、運動および認知エンドポイント、ならびにＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２タンパク質のレベルである。
【0065】
例６：アミロイド－β抗体と組み合わせたＡＤ患者における臨床試験
この例は、ＡＤを有する患者におけるアミロイド－β抗体（例として、バピネオズマブおよびソラネズマブ）と組み合わせて利用される、本開示によって記載されるｒＡＡＶの安全性および有効性を査定するための臨床試験を説明する。
ＡＤの処置のための、抗アミロイド－β抗体と組み合わせた本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦに、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
この例は、ＡＤを有する患者におけるアミロイド－β抗体（例として、バピネオズマブおよびソラネズマブ）と組み合わせて利用される、本開示によって記載されるｒＡＡＶの安全性および有効性を査定するための臨床試験を説明する。
ＡＤの処置のための、抗アミロイド－β抗体と組み合わせた本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦに、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
【0066】
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶは、抗アミロイド－β抗体と相乗作用して、ＡＤ患者がアミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ）を発症する可能性を低減させ、これはＡＰＯＥ遺伝子型と高度に相関する。ＡＲＩＡは、具体的にはヒトモノクローナル抗体によるアミロイド修飾療法に関連する、ＡＤ患者に観察される一連の異常である。脳の浮腫を指すＡＲＩＡ－Ｅ、および脳微小出血を指すＡＲＩＡ－ＨのＡＲＩＡの２種類が存在する。
【0067】
評価されるエンドポイントは、ＡＲＩＡが発生したかどうかを決定するための処置前後の脳イメージング、ならびに本開示のｒＡＡＶがＡＲＩＡの可能性、アミロイド－βプラークのレベル、タウタングル、運動および認知エンドポイント、ならびにＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２タンパク質のレベルを低減するかどうかである。
【0068】
例７：ＡＰＯＥ４＋／＋、ＡＰＯＥ４＋／－、およびＡＰＯＥ４－／－であるＡＤ患者における臨床試験
この例は、ＡＰＯＥ４＋／－またはＡＰＯＥ４－／－である患者と比較したＡＰＯＥ４＋／＋であるＡＤを有する患者の、脳卒中、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、頭部外傷からの回復不良、およびバイパス装置での外科手術からの認知回復を含む、他の病状の増大したリスクの改善における、本開示によって記載されるｒＡＡＶの有効性を査定するための臨床試験について説明する。
この例は、ＡＰＯＥ４＋／－またはＡＰＯＥ４－／－である患者と比較したＡＰＯＥ４＋／＋であるＡＤを有する患者の、脳卒中、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、頭部外傷からの回復不良、およびバイパス装置での外科手術からの認知回復を含む、他の病状の増大したリスクの改善における、本開示によって記載されるｒＡＡＶの有効性を査定するための臨床試験について説明する。
【0069】
ＡＤの処置およびＡＰＯＥ４＋／＋である患者に関連する他の状態の増大したリスクの改善のための、本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦに、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
本開示のｒＡＡＶによる処置の前後に評価されるエンドポイントは、血圧、血中コレステロールおよび血糖レベル、運動および認知エンドポイント、ＭＲＩ、ＰＥＴ、および冠状動脈の超音波イメージング、認知的外傷（cognitive trauma）からの回復、ならびにバイパス装置での外科手術からの回復である。
本開示のｒＡＡＶによる処置の前後に評価されるエンドポイントは、血圧、血中コレステロールおよび血糖レベル、運動および認知エンドポイント、ＭＲＩ、ＰＥＴ、および冠状動脈の超音波イメージング、認知的外傷（cognitive trauma）からの回復、ならびにバイパス装置での外科手術からの回復である。
【0070】
例８：ＡＰＯＥ４アイソフォームの患者保有者におけるＡＤの予防またはＡＤの処置
この例は、少なくとも１つのＡＰＯＥ４アイソフォームを有する対象がＡＤを発症するリスクの低減、および少なくとも１つのＡＰＯＥ４アイソフォームを有する患者におけるＡＤの処置における、本開示によって記載されるｒＡＡＶの有効性を査定するための臨床試験について説明する。ＡＰＯＥ４アイソフォームを有する患者は、ＡＰＯＥ４＋／＋またはＡＰＯＥ４＋／－のいずれかであり得る。
ＡＰＯＥ４アレルの保有者におけるＡＤの予防または処置のための本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦに、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
本開示のｒＡＡＶによる処置の前後に評価されるエンドポイントは、ＣＳＦおよび血液中のＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２のレベル、ならびに認知および運動エンドポイントである。
この例は、少なくとも１つのＡＰＯＥ４アイソフォームを有する対象がＡＤを発症するリスクの低減、および少なくとも１つのＡＰＯＥ４アイソフォームを有する患者におけるＡＤの処置における、本開示によって記載されるｒＡＡＶの有効性を査定するための臨床試験について説明する。ＡＰＯＥ４アイソフォームを有する患者は、ＡＰＯＥ４＋／＋またはＡＰＯＥ４＋／－のいずれかであり得る。
ＡＰＯＥ４アレルの保有者におけるＡＤの予防または処置のための本開示のｒＡＡＶの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究設計を使用して行われる。ｒＡＡＶは、ＣＳＦに、実質内に、海馬に、または別の脳領域に、または末梢に送達される。
本開示のｒＡＡＶによる処置の前後に評価されるエンドポイントは、ＣＳＦおよび血液中のＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２のレベル、ならびに認知および運動エンドポイントである。
【0071】
例９：ＩＴＲ「Ｄ」配列配置および細胞形質導入の試験
ｒＡＡＶの細胞形質導入に対するＩＴＲ「Ｄ」配列の配置の効果を調査する。ＨＥＫ２９３細胞は、図６に示されるとおり、１）野生型ＩＴＲ（例として、導入遺伝子インサートの近位、かつＩＴＲの末端の遠位にある「Ｄ」配列）または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」を含むＩＴＲ（例として、ＩＴＲの末端の近位、かつ導入遺伝子インサートの遠位に位置する「Ｄ」配列）を有するＡｐｏＥ２をコードするｒＡＡＶによりで形質導入される。
ｒＡＡＶの細胞形質導入に対するＩＴＲ「Ｄ」配列の配置の効果を調査する。ＨＥＫ２９３細胞は、図６に示されるとおり、１）野生型ＩＴＲ（例として、導入遺伝子インサートの近位、かつＩＴＲの末端の遠位にある「Ｄ」配列）または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」を含むＩＴＲ（例として、ＩＴＲの末端の近位、かつ導入遺伝子インサートの遠位に位置する「Ｄ」配列）を有するＡｐｏＥ２をコードするｒＡＡＶによりで形質導入される。
【0072】
例９：内在性ＡＰＯＥサイレンシングおよびＡＰＯＥ２過剰発現に対するｓｈＲＮＡのin vitro検証
ＡＰＯＥに対するユニークなｓｈＲＮＡおよびＡＰＯＥ２のコドン最適化されたコード配列を含有する複数のプラスミドをin vitroトランスフェクションスクリーニングで評価し、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ４）ノックダウンとＡＰＯＥ２の異種発現の程度を査定した。プラスミドは、ベクターにコードされたＡＰＯＥ２タンパク質の発現に影響を与えることなく、内在性ＡＰＯＥ遺伝子を選択的にノックダウンするように特別に設計された。複数のプラスミドは、ｑＲＴ－ＰＣＲを介して、内在性ＡＰＯＥの低減（図７Ａ）およびコドン最適化されたＡＰＯＥ２の発現（図７Ｂ）を示す。ｓｈＲＮＡ候補は、コドン最適化されたＡＰＯＥ２に影響を与えることなく、内在性ＡＰＯＥの有意な低減を示した。
ＡＰＯＥに対するユニークなｓｈＲＮＡおよびＡＰＯＥ２のコドン最適化されたコード配列を含有する複数のプラスミドをin vitroトランスフェクションスクリーニングで評価し、ＡＰＯＥ（例として、ＡＰＯＥ４）ノックダウンとＡＰＯＥ２の異種発現の程度を査定した。プラスミドは、ベクターにコードされたＡＰＯＥ２タンパク質の発現に影響を与えることなく、内在性ＡＰＯＥ遺伝子を選択的にノックダウンするように特別に設計された。複数のプラスミドは、ｑＲＴ－ＰＣＲを介して、内在性ＡＰＯＥの低減（図７Ａ）およびコドン最適化されたＡＰＯＥ２の発現（図７Ｂ）を示す。ｓｈＲＮＡ候補は、コドン最適化されたＡＰＯＥ２に影響を与えることなく、内在性ＡＰＯＥの有意な低減を示した。
【0073】
例１０：内在性ＡＰＯＥサイレンシングおよびＡＰＯＥ２過剰発現に対するｓｈＲＮＡのin vivo検証
コドン最適化されたＡＰＯＥ２に影響を与えない内因性ＡＰＯＥの有意な低減を実証するｓｈＲＮＡ候補は、さらなるin vivo研究のために選択される。ＡＰＯＥ４ノックイン（ＫＩ）マウスモデルは、ＡＰＯＥ４に対する候補ｓｈＲＮＡのin vivoでの有効性を評価するために使用される。ＡＰＯＥ４ ＫＩマウスにおいて、両方のマウスＡｐｏｅアレルがヒトＡＰＯＥ－ε４で置き換えられる。マウス（ｎ＝５）は、側脳室内（intracerebroventricular）注射（ＩＣＶ）を介してＡＰＯＥ４に対する候補ｓｈＲＮＡを運ぶベクターを受け取り、ヒトＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの体内分布を注射の６０日後に分析する（図８）。
コドン最適化されたＡＰＯＥ２に影響を与えない内因性ＡＰＯＥの有意な低減を実証するｓｈＲＮＡ候補は、さらなるin vivo研究のために選択される。ＡＰＯＥ４ノックイン（ＫＩ）マウスモデルは、ＡＰＯＥ４に対する候補ｓｈＲＮＡのin vivoでの有効性を評価するために使用される。ＡＰＯＥ４ ＫＩマウスにおいて、両方のマウスＡｐｏｅアレルがヒトＡＰＯＥ－ε４で置き換えられる。マウス（ｎ＝５）は、側脳室内（intracerebroventricular）注射（ＩＣＶ）を介してＡＰＯＥ４に対する候補ｓｈＲＮＡを運ぶベクターを受け取り、ヒトＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの体内分布を注射の６０日後に分析する（図８）。
【0074】
均等物
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように説明してきたが、様々な変更、修正、および改善が当業者には容易に思い浮かぶであろうことを理解されたい。かかる変更、修正、および改善は、この開示の一部であることが意図されており、本発明の精神および範囲の内にあることが意図されている。したがって、前述の説明および図面は、例示としてのみのものである。
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように説明してきたが、様々な変更、修正、および改善が当業者には容易に思い浮かぶであろうことを理解されたい。かかる変更、修正、および改善は、この開示の一部であることが意図されており、本発明の精神および範囲の内にあることが意図されている。したがって、前述の説明および図面は、例示としてのみのものである。
【0075】
本明細書では本発明のいくつかの態様を説明および図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行し、および／または結果および／または１つ以上の利点を取得するための、さまざまな他の手段および／または構造を容易に思い浮かべるであろうし、かかる変更および／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載されおよび特許請求された以外の方法で実施できることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。さらに、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
【0076】
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解すべきである。明確に逆が示されない限り、任意に他の要素も、「および／または」節で具体的に識別された要素以外に、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく存在し得る。したがって非限定的な例として、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合の「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様では、ＢなしでＡを指す（任意にＢ以外の要素を含む）ことができ；別の態様では、ＡなしでＢを指す（任意にＡ以外の要素を含む）ことができ；さらに別の態様では、ＡおよびＢの両方を指す（任意に他の要素を含む）ことができる；など。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解すべきである。明確に逆が示されない限り、任意に他の要素も、「および／または」節で具体的に識別された要素以外に、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく存在し得る。したがって非限定的な例として、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合の「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様では、ＢなしでＡを指す（任意にＢ以外の要素を含む）ことができ；別の態様では、ＡなしでＢを指す（任意にＡ以外の要素を含む）ことができ；さらに別の態様では、ＡおよびＢの両方を指す（任意に他の要素を含む）ことができる；など。
【0077】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち要素の数またはリストの少なくとも１つを含み、さらにまた複数も含み、および任意にリストされていない追加の項目を含むものとして解釈される。明確に逆の用語が示されている場合、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」など、または特許請求の範囲で使用されている場合の「からなる」は、要素の数またはリストの正確に１つを含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「１つ」または「１つのみ」、または「正確に１つ」が先行する場合には、排他的選択肢（すなわち、一方または他方だが、両方ではない）を指すとして解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用される場合の「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【0078】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されたい；ただし、要素のリスト内に具体的にリストされているすべてのそれぞれの要素の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外することもない。この定義により、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく、任意に存在可能とされる。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＡを含み、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＢを含み、Ａが存在しない（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＡを含み、および少なくとも１つ、任意に複数のＢを含む（および任意に他の要素を含む）；など。
【0079】
特許請求の範囲、および上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保持する（carrying）」、「有する」、「含有する」、「含む（involving）」、「保有する（holding）」などのすべての移行句は、オープンエンドとして、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されたい。「からなる」および「本質的にからなる」という移行句のみが、米国特許庁の特許審査手続きマニュアルのＳｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３に記載されているように、それぞれクローズまたはセミクローズの移行句とする。
「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の、クレーム要素を修飾するためのクレームにおける使用は、それ自体では、あるクレーム要素の他に対する優先権、先行、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的な順序を示すものではなく、しかし、特定の名前を有する一定のクレーム要素を、同じ名前（ただし順序用語のみが異なる）の別の要素から区別するためのラベルとしてのみ使用されて、クレーム要素を区別する。
明確に逆が示されない限り、１つ以上のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が示されている順序に限定されないことも、理解されるべきである。
「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の、クレーム要素を修飾するためのクレームにおける使用は、それ自体では、あるクレーム要素の他に対する優先権、先行、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的な順序を示すものではなく、しかし、特定の名前を有する一定のクレーム要素を、同じ名前（ただし順序用語のみが異なる）の別の要素から区別するためのラベルとしてのみ使用されて、クレーム要素を区別する。
明確に逆が示されない限り、１つ以上のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が示されている順序に限定されないことも、理解されるべきである。
【0080】
配列
いくつかの態様において、１つ以上の遺伝子産物（例として、第１、第２および／または第３の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１～２１のいずれか１つで表される配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、遺伝子産物は、配列番号１～２１のいずれか１つで表される配列の一部（例として、フラグメント）によってコードされる。当業者は、阻害性核酸をコードする核酸配列が、全ての「Ｔ」が「Ｕ」よって置き換えられている配列を記載し得ることを理解する。
いくつかの態様において、１つ以上の遺伝子産物（例として、第１、第２および／または第３の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１～２１のいずれか１つで表される配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、遺伝子産物は、配列番号１～２１のいずれか１つで表される配列の一部（例として、フラグメント）によってコードされる。当業者は、阻害性核酸をコードする核酸配列が、全ての「Ｔ」が「Ｕ」よって置き換えられている配列を記載し得ることを理解する。
【0081】
＞ヒトＡＰＯＥ４核酸配列（ＮＭ＿００１３０２６９０．１）（配列番号１）
【表2-1】
【表2-2】
【0082】
＞ヒトＡＰＯＥ２核酸配列（ＮＭ＿００００４１．３）（配列番号２）
【表3】
【0083】
＞ヒトＡｐｏＥ２アミノ酸配列（配列番号３）
【表4-1】
【表4-2】
【0084】
＞ＡｐｏＥ２核酸配列（コドン最適化された）（配列番号４）
【表5】
【0085】
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ１核酸配列（配列番号５）
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ１核酸配列（配列番号６）
＞ループを有するＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ１（配列番号７）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ１（配列番号８）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ ｒＡＡＶベクターＨ１（配列番号９）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ ｒＡＡＶベクター１（配列番号１０）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ－ＡｐｏＥ２ｏｐｔ ｒＡＡＶベクター１（配列番号１１）
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ２核酸配列（配列番号１２）
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ２核酸配列（配列番号１３）
＞ループを有するＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ２（配列番号１４）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ２（配列番号１５）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ－ＡｐｏＥ２ｏｐｔ ｒＡＡＶベクター２（配列番号１６）
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ３核酸配列（配列番号１７）
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ３核酸配列（配列番号１８）
＞ループを有するＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ３（配列番号１９）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ３（配列番号２０）
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ－ＡｐｏＥ２ｏｐｔ ｒＡＡＶベクター３（配列番号２１）
＞ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｄ領域「Ｓ」配列（配列番号２２）
＞ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｄ領域「Ｄ」配列（配列番号２３）
＞ＴＲＹモチーフ配列（配列番号２４）
＞野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ核酸配列（配列番号２５）
【表6】
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ１核酸配列（配列番号６）
【表7】
＞ループを有するＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ１（配列番号７）
【表8】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ１（配列番号８）
【表9】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ ｒＡＡＶベクターＨ１（配列番号９）
【表10-1】
【表10-2】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ ｒＡＡＶベクター１（配列番号１０）
【表11】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ－ＡｐｏＥ２ｏｐｔ ｒＡＡＶベクター１（配列番号１１）
【表12-1】
【表12-2】
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ２核酸配列（配列番号１２）
【表13】
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ２核酸配列（配列番号１３）
【表14】
＞ループを有するＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ２（配列番号１４）
【表15】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ２（配列番号１５）
【表16】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ－ＡｐｏＥ２ｏｐｔ ｒＡＡＶベクター２（配列番号１６）
【表17-1】
【表17-2】
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ３核酸配列（配列番号１７）
【表18】
＞ＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ３核酸配列（配列番号１８）
【表19】
＞ループを有するＡｐｏＥ４ ｓｈＲＮＡ３（配列番号１９）
【表20】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ３（配列番号２０）
【表21】
＞ＡｐｏＥ４ ａｍｉＲＮＡ－ＡｐｏＥ２ｏｐｔ ｒＡＡＶベクター３（配列番号２１）
【表22-1】
【表22-2】
＞ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｄ領域「Ｓ」配列（配列番号２２）
【表23】
＞ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｄ領域「Ｄ」配列（配列番号２３）
【表24】
＞ＴＲＹモチーフ配列（配列番号２４）
【表25】
＞野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ核酸配列（配列番号２５）
【表26】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＰＯＥ２を発現する導入遺伝子およびＡＰＯＥ４の発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現コンストラクトを含む、単離された核酸。
【外国語明細書】