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特開2024-178212ＣＤ７３免疫チェックポイントを抑制するためのモノクローナル抗体及びその抗原結合断片並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024178212
(43)【公開日】2024-12-24
(54)【発明の名称】ＣＤ７３免疫チェックポイントを抑制するためのモノクローナル抗体及びその抗原結合断片並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241217BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241217BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241217BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241217BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241217BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241217BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241217BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241217BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241217BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241217BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241217BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P35/02
C07K16/28
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024153652
(22)【出願日】2024-09-06
(62)【分割の表示】P 2022561430の分割
【原出願日】2021-04-09
(31)【優先権主張番号】10-2020-0043607
(32)【優先日】2020-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0144595
(32)【優先日】2020-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522293607
【氏名又は名称】エイプリルバイオ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】チャ、 サン フン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＣＤ７３免疫チェックポイントを抑制するためのモノクローナル抗体及びその抗原結合断片、並びにその用途を提供する。
【解決手段】特異的な配列を有するＣＤ７３免疫チェックポイントを抑制するための抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ７３に結合し、ＣＤ７３蛋白質の酵素活性を低減させ、かつ癌の転移または癌の成長を阻害することができる。当該抗体またはその抗原結合断片を癌の治療剤として活用する用途を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特異的な配列を有するＣＤ７３免疫チェックポイントを抑制するための抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ７３に結合し、ＣＤ７３蛋白質の酵素活性を低減させ、かつ癌の転移または癌の成長を阻害することができる。当該抗体またはその抗原結合断片を癌の治療剤として活用する用途を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のものを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１，４，７，１０，１４または１７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメ
イン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２，５，８，１１，１５または１８のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ２、及び配列番号３，６，９，１２，１３，１６または１９のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号２０，２３，２６または２９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメイン１
（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１，２４，２７または３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２
、及び配列番号２２，２５，２８または３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖
可変領域。
配列番号１，４，７，１０，１４または１７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメ
イン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２，５，８，１１，１５または１８のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ２、及び配列番号３，６，９，１２，１３，１６または１９のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号２０，２３，２６または２９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメイン１
（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１，２４，２７または３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２
、及び配列番号２２，２５，２８または３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖
可変領域。
【請求項2】
以下のものを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列
番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列
番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列
番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変
領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変
領域；
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３の重鎖可変領域；並びに配
列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；または
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列
番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列
番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列
番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変
領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変
領域；
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３の重鎖可変領域；並びに配
列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；または
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項3】
以下のものを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列に対して少な
くとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９、４０、
４１または４２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含
む軽鎖可変領域。
配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列に対して少な
くとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９、４０、
４１または４２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含
む軽鎖可変領域。
【請求項4】
以下のものを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列を含む重鎖可
変領域、及び配列番号３９、４０、４１または４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列を含む重鎖可
変領域、及び配列番号３９、４０、４１または４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項5】
以下のものを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項6】
以下のものを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項7】
以下のものを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
配列番号６６，６９，７２，７５または７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメ
イン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号６７，７０，７３，７６または７９のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ２、及び配列番号６８，７１，７４，７７または８０のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号８１，８４，８７，９０または９３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメ
イン（ＣＤＲＬ１）、配列番号８２，８５，８８，９１または９４のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＬ２、及び配列番号８３，８６，８９，９０または９５のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
配列番号６６，６９，７２，７５または７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメ
イン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号６７，７０，７３，７６または７９のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ２、及び配列番号６８，７１，７４，７７または８０のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号８１，８４，８７，９０または９３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメ
イン（ＣＤＲＬ１）、配列番号８２，８５，８８，９１または９４のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＬ２、及び配列番号８３，８６，８９，９０または９５のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項8】
以下のものを含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；また
は
配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；また
は
配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並び
に配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体
は、モノクローナル抗体であり、完全ヒト抗体またはキメラ抗体である、抗体またはその
抗原結合断片。
は、モノクローナル抗体であり、完全ヒト抗体またはキメラ抗体である、抗体またはその
抗原結合断片。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸
。
。
【請求項11】
請求項１０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項12】
請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防用
または治療用の組成物。
または治療用の組成物。
【請求項14】
免疫チェックポイント遮断剤または化学療法剤を追加して含む、請求項１３に記載の組
成物。
成物。
【請求項15】
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を被験者に投与する
ことを含む、それを必要とする被験者の癌を治療する方法。
ことを含む、それを必要とする被験者の癌を治療する方法。
【請求項16】
前記癌は、ＣＤ７３を過発現する癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記癌は、乳癌、三重陰性乳癌（ＴＢＮＣ）、膵臓大腸癌、卵巣癌、胃癌（gastric ca
ncer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌、食道癌、胃癌（stomach cancer）
、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である、請求項１５または１６に記載の方法。
ncer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌、食道癌、胃癌（stomach cancer）
、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願に係わる相互参照］
本出願は、２０２０年４月９日付けで提出された韓国出願第１０－２０２０－００４３
６０７号、及び２０２０年１１月２日付けで提出された韓国出願第１０－２０２０－０１
４４５９５号を、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９によって優先権として主張し、その開示内
容は、その全体が参照としてここに含まれる。
本出願は、２０２０年４月９日付けで提出された韓国出願第１０－２０２０－００４３
６０７号、及び２０２０年１１月２日付けで提出された韓国出願第１０－２０２０－０１
４４５９５号を、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９によって優先権として主張し、その開示内
容は、その全体が参照としてここに含まれる。
【0002】
［電子的に提出された配列表に係わる参照］
本出願と共に提出されたＡＳＣIIテキストファイル（名称：２６６２－０００３ＷＯ０
１－SequenceListing＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；大きさ：４８ＫＢ；及び生成日：４月７日、
２０２１）の電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照としてここに含まれる
。
本出願と共に提出されたＡＳＣIIテキストファイル（名称：２６６２－０００３ＷＯ０
１－SequenceListing＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；大きさ：４８ＫＢ；及び生成日：４月７日、
２０２１）の電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照としてここに含まれる
。
【0003】
本発明は、ＣＤ７３免疫チェックポイントを抑制するためのモノクローナル抗体及びそ
の抗原結合断片、並びにその使用に関する。
の抗原結合断片、並びにその使用に関する。
【背景技術】
【0004】
伝統的な癌治療方法は、放射線治療、化学的療法そして抗癌剤治療があり、そのような
方法は、直接癌の成長を阻害することにより、癌を治療することができる。しかしながら
、癌細胞は、抗癌剤に抵抗性を示し、抗癌剤使用は、癌細胞ではない他の細胞も攻撃し、
副作用問題が生じてしまう。そのような問題を克服するために、新たな癌治療方法として
、免疫治療が開発された。該免疫治療は、癌細胞ではなく免疫細胞を標的にし、該免疫細
胞が癌細胞を攻撃するように誘導する。
方法は、直接癌の成長を阻害することにより、癌を治療することができる。しかしながら
、癌細胞は、抗癌剤に抵抗性を示し、抗癌剤使用は、癌細胞ではない他の細胞も攻撃し、
副作用問題が生じてしまう。そのような問題を克服するために、新たな癌治療方法として
、免疫治療が開発された。該免疫治療は、癌細胞ではなく免疫細胞を標的にし、該免疫細
胞が癌細胞を攻撃するように誘導する。
【0005】
免疫治療のうち、免疫チェックポイント遮断剤（immune checkpoint blockade）が最近
注目されている。免疫チェックポイント（immune checkpoint）は、免疫反応を促進させ
たり抑制させたりする受容体である。該免疫チェックポイントは、免疫反応を調節するの
に必須であり、癌においても該免疫チェックポイントが作動するので、癌は、該免疫チェ
ックポイントを介して免疫回避を示す。最近では、該免疫チェックポイントを利用して癌
を治療しようとする多くの研究が報告されている。まず、ＣＴＬＡ－４（cytotoxic T-ly
mphocyte-associated antigen 4）及びＰＤ－１（programmed cell death protein 1）の
免疫チェックポイントに対する抗体が開発され、黒色腫癌患者において、生存率上昇を示
している。ＣＴＬＡ－４とＰＤ－１の免疫チェックポイント遮断は、多様な癌で使用され
、多くの癌において効能も示している。しかしながら、一部患者では、ＣＴＬＡ－４とＰ
Ｄ－１の免疫チェックポイント遮断による治療において、効果が示されていない。従って
、新たな免疫チェックポイントに対する多くの研究が進められ、癌の免疫回避メカニズム
のうち一つは、免疫抑制アデノシンの高濃度によるものであると知られている。
注目されている。免疫チェックポイント（immune checkpoint）は、免疫反応を促進させ
たり抑制させたりする受容体である。該免疫チェックポイントは、免疫反応を調節するの
に必須であり、癌においても該免疫チェックポイントが作動するので、癌は、該免疫チェ
ックポイントを介して免疫回避を示す。最近では、該免疫チェックポイントを利用して癌
を治療しようとする多くの研究が報告されている。まず、ＣＴＬＡ－４（cytotoxic T-ly
mphocyte-associated antigen 4）及びＰＤ－１（programmed cell death protein 1）の
免疫チェックポイントに対する抗体が開発され、黒色腫癌患者において、生存率上昇を示
している。ＣＴＬＡ－４とＰＤ－１の免疫チェックポイント遮断は、多様な癌で使用され
、多くの癌において効能も示している。しかしながら、一部患者では、ＣＴＬＡ－４とＰ
Ｄ－１の免疫チェックポイント遮断による治療において、効果が示されていない。従って
、新たな免疫チェックポイントに対する多くの研究が進められ、癌の免疫回避メカニズム
のうち一つは、免疫抑制アデノシンの高濃度によるものであると知られている。
【0006】
なお、「ＣＤ７３（Cluster of Differentiation 73）」とは、５’ヌクレオチドの脱
リン酸化を触媒する外部ヌクレオチダーゼ（ecto-nucleotidase）で、主に、ＡＭＰ（ade
nosine monophosphate）をアデノシンに変換させる役割を行う。該ＣＤ７３は、ＧＰＩア
ンカー（anchor）を介して、細胞膜上にホモダイマー（homodimer）形態で存在し、モノ
マー（monomer）は、６５ｋＤａであり、Ｎ末端とＣ末端とのドメインが、柔軟性あるヘ
リックス性リンカーを介して連結されている構造である。すなわち、該ＣＤ７３は、アデ
ノシンの生成に関与し、癌細胞で過発現され、免疫抑制作用を誘導する。従って、免疫抑
制アデノシンの濃度に焦点を当てた新たな免疫チェックポイント遮断剤の開発が必要であ
る。
リン酸化を触媒する外部ヌクレオチダーゼ（ecto-nucleotidase）で、主に、ＡＭＰ（ade
nosine monophosphate）をアデノシンに変換させる役割を行う。該ＣＤ７３は、ＧＰＩア
ンカー（anchor）を介して、細胞膜上にホモダイマー（homodimer）形態で存在し、モノ
マー（monomer）は、６５ｋＤａであり、Ｎ末端とＣ末端とのドメインが、柔軟性あるヘ
リックス性リンカーを介して連結されている構造である。すなわち、該ＣＤ７３は、アデ
ノシンの生成に関与し、癌細胞で過発現され、免疫抑制作用を誘導する。従って、免疫抑
制アデノシンの濃度に焦点を当てた新たな免疫チェックポイント遮断剤の開発が必要であ
る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本明細書は、配列番号１，４，７，１０，１４または１７のアミノ酸配列を含む重鎖相
補性決定ドメイン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２，５，８，１１，１５または１８のアミ
ノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号３，６，９，１２，１３，１６または１９のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０，２３，２６また
は２９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１，
２４，２７または３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２，２５，２８
または３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル
抗体またはその抗原結合断片を開示する。
補性決定ドメイン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２，５，８，１１，１５または１８のアミ
ノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号３，６，９，１２，１３，１６または１９のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０，２３，２６また
は２９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲＬ１）、配列番号２１，
２４，２７または３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２，２５，２８
または３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル
抗体またはその抗原結合断片を開示する。
【0008】
一実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配
列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列
番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号４のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２３のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２５のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配
列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１２または１３のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３の重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配
列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むものでありえる。
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配
列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列
番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号４のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２３のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２５のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配
列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１２または１３のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３の重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配
列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むものでありえる。
【0009】
一実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２，３３，３４
，３５，３６，３７または３８に対して少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上
、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１
００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域；及び配列番号３９，４０，４１ま
たは４２に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６
％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸
を含む軽鎖可変領域を含むものでありえる。一実施形態において、前記抗体またはその抗
原結合断片は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域；及び配列番号３９，４０，４１または４２の配列番号を含む軽鎖可
変領域を含むものでありえる。
，３５，３６，３７または３８に対して少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上
、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１
００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域；及び配列番号３９，４０，４１ま
たは４２に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６
％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸
を含む軽鎖可変領域を含むものでありえる。一実施形態において、前記抗体またはその抗
原結合断片は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域；及び配列番号３９，４０，４１または４２の配列番号を含む軽鎖可
変領域を含むものでありえる。
【0010】
また、配列番号６６，６９，７２，７５または７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号６７，７０，７３，７６または７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号
６８，７１，７４，７７または８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域
；及び配列番号８１，８４，８７，９０または９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配
列番号８２，８５，８８，９１または９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番
号８３，８６，８９，９０または９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領
域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
配列番号６７，７０，７３，７６または７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、配列番号
６８，７１，７４，７７または８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域
；及び配列番号８１，８４，８７，９０または９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配
列番号８２，８５，８８，９１または９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番
号８３，８６，８９，９０または９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領
域を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0011】
一実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６６のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６８
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８１のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８３
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号６９のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７１のアミ
ノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８４のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８６のアミ
ノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＨ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７４のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ１、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８９のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ１、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ１、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片を含むもので
ありえる。
列を含むＣＤＲＨ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６８
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８１のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８３
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号６９のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７１のアミ
ノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８４のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８６のアミ
ノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＨ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７４のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ１、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８９のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ１、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ１、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片を含むもので
ありえる。
【0012】
他の態様は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含む発現
ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【0013】
本明細書は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８に対して少なく
とも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７
％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可
変領域をコードする核酸、及び配列番号３９，４０，４１または４２に対して８０％以上
、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％
以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域をコード
する核酸を提供する。また、本明細書は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７
または３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９，４
０，４１または４２の配列番号を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。
とも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７
％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可
変領域をコードする核酸、及び配列番号３９，４０，４１または４２に対して８０％以上
、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％
以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域をコード
する核酸を提供する。また、本明細書は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７
または３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９，４
０，４１または４２の配列番号を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。
【0014】
本明細書は、配列番号３２の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９の軽鎖
可変領域をコードする核酸、または配列番号３３の重鎖可変領域をコードする核酸、及び
配列番号４０の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。例えば、配列番号３２の重鎖
可変領域をコードする核酸は、配列番号４３で表されることができ、配列番号３９の軽鎖
可変領域をコードする核酸は、配列番号４４で表されうる。一実施形態において、配列番
号３２または配列番号３３の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９または配
列番号４０の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。また、配列番号３３の重鎖可変
領域は、配列番号４５で表され、配列番号４０の軽鎖可変領域は、配列番号４６で表され
うる。
可変領域をコードする核酸、または配列番号３３の重鎖可変領域をコードする核酸、及び
配列番号４０の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。例えば、配列番号３２の重鎖
可変領域をコードする核酸は、配列番号４３で表されることができ、配列番号３９の軽鎖
可変領域をコードする核酸は、配列番号４４で表されうる。一実施形態において、配列番
号３２または配列番号３３の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９または配
列番号４０の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。また、配列番号３３の重鎖可変
領域は、配列番号４５で表され、配列番号４０の軽鎖可変領域は、配列番号４６で表され
うる。
【0015】
また、配列番号９６，９８，１００，１０２または１０４に対して少なくとも８０％以
上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８
％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域をコー
ドする核酸、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３または１０５に対して少なくとも
８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以
上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。また、配列番号９６，９８，１００，１０２または１０
４の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３，または
１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。
上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８
％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域をコー
ドする核酸、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３または１０５に対して少なくとも
８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以
上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。また、配列番号９６，９８，１００，１０２または１０
４の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３，または
１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。
【0016】
配列番号９６の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号９７の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；配列番号９８の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号９９の軽鎖
可変領域をコードする核酸；配列番号１００の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列
番号１０１の軽鎖可変領域をコードする核酸；配列番号１０２の重鎖可変領域をコードす
る核酸、及び配列番号１０３の軽鎖可変領域をコードする核酸；あるいは配列番号１０４
の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸
を提供する。例えば、配列番号９６の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０６
で表され、配列番号９７の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０７で表されう
る。配列番号９８の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０８で表され、配列番
号９９の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０９で表されうる。配列番号１０
０の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１０で表され、配列番号１０１の軽鎖
可変領域をコードする核酸は、配列番号１１１で表されうる。配列番号１０２の重鎖可変
領域をコードする核酸は、配列番号１１２で表され、配列番号１０３の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸は、配列番号１１３で表されうる。配列番号１０４の重鎖可変領域をコード
する核酸は、配列番号１１４で表され、配列番号１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸
は、配列番号１１５で表されうる。
ードする核酸；配列番号９８の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号９９の軽鎖
可変領域をコードする核酸；配列番号１００の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列
番号１０１の軽鎖可変領域をコードする核酸；配列番号１０２の重鎖可変領域をコードす
る核酸、及び配列番号１０３の軽鎖可変領域をコードする核酸；あるいは配列番号１０４
の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸
を提供する。例えば、配列番号９６の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０６
で表され、配列番号９７の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０７で表されう
る。配列番号９８の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０８で表され、配列番
号９９の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１０９で表されうる。配列番号１０
０の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１０で表され、配列番号１０１の軽鎖
可変領域をコードする核酸は、配列番号１１１で表されうる。配列番号１０２の重鎖可変
領域をコードする核酸は、配列番号１１２で表され、配列番号１０３の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸は、配列番号１１３で表されうる。配列番号１０４の重鎖可変領域をコード
する核酸は、配列番号１１４で表され、配列番号１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸
は、配列番号１１５で表されうる。
【0017】
また、配列番号１０６，１０８，１１０，１１２または１１４に対して少なくとも８０
％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、
９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域を
コードする核酸、及び配列番号１０７，１０９，１１１，１１３，または１１５に対して
８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以
上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。
％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、
９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域を
コードする核酸、及び配列番号１０７，１０９，１１１，１１３，または１１５に対して
８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以
上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。
【0018】
また、本明細書は、癌を予防または治療するための組成物であって、前記抗体またはそ
の抗原結合断片を含む組成物を開示する。一実施形態において、前記組成物は、免疫チェ
ックポイント遮断剤または化学療法剤をさらに含むものでありえる。
の抗原結合断片を含む組成物を開示する。一実施形態において、前記組成物は、免疫チェ
ックポイント遮断剤または化学療法剤をさらに含むものでありえる。
【0019】
また、本願に開示された前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を被験者に投与
することを含む、それを必要とする被験者の癌治療方法を開示する。一実施形態において
、前記癌は、ＣＤ７４を過発現する癌である。一実施形態において、前記癌は、乳癌、三
重陰性乳癌（ＴＢＮＣ：triple-negative breast cancer）、膵臓大腸癌、卵巣癌、胃癌
（gastric cancer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌、食道癌、胃癌（stom
ach cancer）、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である。
することを含む、それを必要とする被験者の癌治療方法を開示する。一実施形態において
、前記癌は、ＣＤ７４を過発現する癌である。一実施形態において、前記癌は、乳癌、三
重陰性乳癌（ＴＢＮＣ：triple-negative breast cancer）、膵臓大腸癌、卵巣癌、胃癌
（gastric cancer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌、食道癌、胃癌（stom
ach cancer）、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である。
【0020】
また、それを必要とする被験者における癌治療のための、本願に開示された前記モノク
ローナル抗体及びその抗原結合断片の使用を開示する。また、それを必要とする被験者の
癌治療における使用のための、本願に開示されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断
片を開示する。また、それを必要とする個体における癌治療用医薬の製造のための、本願
に開示されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片の使用を開示する。
ローナル抗体及びその抗原結合断片の使用を開示する。また、それを必要とする被験者の
癌治療における使用のための、本願に開示されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断
片を開示する。また、それを必要とする個体における癌治療用医薬の製造のための、本願
に開示されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片の使用を開示する。
【0021】
本開示の特定実施形態の上記及びその他の側面、特徴並びに利点は、添付図面と共に、
以下の説明からさらに明らかになる。
以下の説明からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】バイオパニングを介して選別された抗ＣＤ７３抗体のＣＤ７３に対する結合能力を示すグラフである。ファージ抗体のＣＤ７３結合は、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定して確認し、データの標準偏差は、誤差バーで表した。
【0023】
【図2A】抗ＣＤ７３ファージ抗体のＶＨ遺伝子配列とＶＬ遺伝子配列とを、ＣＨ遺伝子配列とＣＬ遺伝子配列とを含むｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターにクローニングして製造したヒトＩｇＧ１発現ベクターを示す。
【0024】
【図2B】ヒトＩｇＧ１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したものであり、レーン１～１２から順番に、Ｌ２－３、Ｌ２－４７、Ｌ４－１、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４－４６、Ｌ４－６６、Ｌ６－１、Ｌ６－７、Ｌ６－３０、Ｌ６－３７、Ｌ８－２４である。
【0025】
【図3A】精製された１２種ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＣＤ７３に対する結合を分析するために、ＥＬＩＳＡを遂行した結果を示す。
【0026】
【図3B】精製された１２種ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体をＣＤ７３酵素活性の阻害によって比較するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてインビトロアッセイを行った結果を示す。ＣＤ７３酵素活性は、マラカイトグリーンアッセイ（malachite green assay）を用いて、ＣＤ７３により分解されるホスフェートを測定することにより確認した。
【0027】
【図3C】ヒト、猿、ラットそしてマウスのＣＤ７３に対する交差結合能力を、ＥＬＩＳＡで分析した結果を示したものであり、ＣＤ７３に対する抗体の結合は、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定して確認した。
【0028】
【0029】
【図5A】ヒトＣＤ７３を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体の膜ＣＤ７３結合能力の比較を示すフローサイトメトリーのグラフである。
【0030】
【図5B】マウスＣＤ７３を発現する４Ｔ１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体の膜ＣＤ７３結合能力の比較を示すフローサイトメトリーのグラフである。
【0031】
【図6A】ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体によるＣＰＩ－００６のエピトープに対する競合的結合を分析するためのバイオレイヤ干渉法（biolayer interferometry）の結果を示したグラフである。
【0032】
【図6B】ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体によるＭＥＤＩ－９４４７のエピトープに対する競合的結合を分析するためのバイオレイヤ干渉法の結果を示したグラフである。
【0033】
【図7】ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体による水溶性ＣＤ７３酵素活性の阻害を比較するための、マラカイトグリーンアッセイの結果を示したグラフである。
【0034】
【図8A】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体による膜ＣＤ７３酵素活性の阻害を比較するための、マラカイトグリーンアッセイの結果を示したグラフである。
【0035】
【図8B】４Ｔ１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体による膜ＣＤ７３酵素活性の阻害を比較するための、CellTiter-Glo（登録商標）assayの結果を示したグラフである。
【0036】
【図8C】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体による膜ＣＤ７３酵素活性の阻害を比較するための、マラカイトグリーンアッセイの結果を示したグラフである。標準偏差は誤差バーで表し、縦軸は、相対的光ユニット（RLU: relative light units）を示す。
【0037】
【図8D】４Ｔ１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体による膜ＣＤ７３酵素活性の阻害を比較するための、CellTiter-Glo（登録商標）assayで比較した結果を示したグラフである。標準偏差は誤差バーで表し、縦軸はＲＬＵを示す。
【0038】
【図9】膜ＣＤ７３細胞内へのＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の移入を、走査顕微鏡で確認した結果である。ＦＩＴＣシグナルに対応するＣＤ７３が、白色で示されるように発現されており、スケールバーを共に表示した。
【0039】
【図10A】転移性乳癌マウスモデルにおいて平均肺重量を測定することにより、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の抗癌効能を評価した結果を示したグラフである；＊：Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析（one-way ANOVA））。
【0040】
【図10B】転移性乳癌マウスモデルにおいて肺転移コロニー数を測定することにより、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の抗癌効能を評価した結果を示したグラフである；＊：Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析（one-way ANOVA））。
【0041】
【図11A】乳癌マウスモデルにおいて腫瘍体積を測定することにより、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２ｍＩｇＧ抗体の腫瘍成長阻害効能を評価した結果を示したグラフである；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、ｎｓ（not significant：Ｐ＞０．０５（二元配置分散分析（two-way ＡＮＯＶＡ））。
【0042】
【図11B】乳癌マウスモデルにおいて、抗体試料間の腫瘍成長抑制力を比較することにより、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２ｍＩｇＧ抗体の腫瘍成長阻害効能を評価した結果を示したグラフである。
【0043】
【図11C】乳癌マウスモデルにおいてマウス重量を測定することにより、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２ｍＩｇＧ抗体の腫瘍成長阻害効能を評価した結果を示したグラフである；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１、ｎｓ（not significant：Ｐ＞０．０５（二元配置分散分析（two-way ＡＮＯＶＡ））。
【0044】
【図12A】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、抗ＣＤ７３抗体による膜ＣＤ７３の酵素活性の阻害能を比較するための、マラカイトグリーンアッセイの結果を示したグラフである。
【0045】
【図12B】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３酵素活性の阻害を比較するための、CellTiter-Glo（登録商標）assayの結果を示したグラフである。
【0046】
【図13A】４Ｔ１細胞における、Myxengo ３，４，６，７及び１５抗体の膜ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力を確認したグラフである。
【0047】
【図13B】４Ｔ１．２細胞において、Myxengo ３，４，６，７及び１５抗体の膜ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0048】
本明細書は、ＣＤ７３（cluster of differentiation 73）に結合するモノクローナル
抗体またはその抗原結合断片を開示する。
抗体またはその抗原結合断片を開示する。
【0049】
また、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を
含む発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を開示する。
含む発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を開示する。
【0050】
また、癌を予防または治療するための組成物であって、前記モノクローナル抗体または
その抗原結合断片を含む組成物を開示する。
その抗原結合断片を含む組成物を開示する。
【0051】
さらなる態様は、以下の説明で部分的に説明され、部分的には、該説明から明白となり
、または本開示内容で提示された実施形態の実行によって学習され得る。
、または本開示内容で提示された実施形態の実行によって学習され得る。
【0052】
配列番号１，４，７，１０，１４または１７のアミノ酸配列によって構成された群のう
ちから選択されるＣＤＲＨ１、配列番号２，５，８，１１，１５または１８のアミノ酸配
列によって構成された群のうちから選択されるＣＤＲＨ２、及び配列番号３，６，９，１
２，１３，１６または１９のアミノ酸配列によって構成された群のうちから選択されるＣ
ＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号２０，２３，２６または２９のアミノ酸配列
によって構成された群のうちから選択されるＣＤＲＬ１、配列番号２１，２４，２７また
は３０のアミノ酸配列によって構成された群のうちから選択されるＣＤＲＬ２、及び配列
番号２２，２５，２８または３１で表されるアミノ酸配列によって構成された群のうちか
ら選択されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片を開示
する。
ちから選択されるＣＤＲＨ１、配列番号２，５，８，１１，１５または１８のアミノ酸配
列によって構成された群のうちから選択されるＣＤＲＨ２、及び配列番号３，６，９，１
２，１３，１６または１９のアミノ酸配列によって構成された群のうちから選択されるＣ
ＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号２０，２３，２６または２９のアミノ酸配列
によって構成された群のうちから選択されるＣＤＲＬ１、配列番号２１，２４，２７また
は３０のアミノ酸配列によって構成された群のうちから選択されるＣＤＲＬ２、及び配列
番号２２，２５，２８または３１で表されるアミノ酸配列によって構成された群のうちか
ら選択されるＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片を開示
する。
【0053】
一実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配
列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列
番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号４のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２３のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２５のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配
列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１２または１３のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域でありえる。
のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配
列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列
番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号４のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２３のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２５のア
ミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＨ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号９のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ
１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を
含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配
列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１２または１３のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ
ＲＬ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配
列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号３１のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域でありえる。
【0054】
一実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２，３３，３４
，３５，３６，３７または３８に対して少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上
、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１
００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９，４０，４１ま
たは４２に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６
％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸
を含む軽鎖可変領域を含むものでありえる。一実施形態において、前記抗体またはその抗
原結合断片は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９，４０，４１または４２の配列番号を含む軽鎖可
変領域を含むものでありえる。
，３５，３６，３７または３８に対して少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上
、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１
００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９，４０，４１ま
たは４２に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６
％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸
を含む軽鎖可変領域を含むものでありえる。一実施形態において、前記抗体またはその抗
原結合断片は、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９，４０，４１または４２の配列番号を含む軽鎖可
変領域を含むものでありえる。
【0055】
また、配列番号６６，６９，７２，７５または７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号６７，７０，７３，７６または７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列
番号６８，７１，７４，７７または８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変
領域、及び配列番号８１，８４，８７，９０または９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号８２，８５，８８，９１または９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配
列番号８３，８６，８９，９０または９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むモノク
ローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
配列番号６７，７０，７３，７６または７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列
番号６８，７１，７４，７７または８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変
領域、及び配列番号８１，８４，８７，９０または９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号８２，８５，８８，９１または９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配
列番号８３，８６，８９，９０または９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むモノク
ローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0056】
一実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６６のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６８の
アミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８１のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８３の
アミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号６９のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＨ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７１のアミノ
酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８４のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＬ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８６のアミノ
酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ１、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域でありえる。
を含むＣＤＲＨ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号６８の
アミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８１のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８３の
アミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号６９のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＨ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７１のアミノ
酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８４のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＬ１、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８６のアミノ
酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｈ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ
Ｌ１、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列
を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む
ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；あるいは配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１
、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含
むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域でありえる。
【0057】
また、前記抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ
、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせの抗体定常領域でありえる。前記定常領域は、例え
ば、ＩｇＧ１の抗体定常領域に由来しうる。
、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせの抗体定常領域でありえる。前記定常領域は、例え
ば、ＩｇＧ１の抗体定常領域に由来しうる。
【0058】
一実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、個体において種間交差反応
性（species cross-reactivity）を有するものでありえる。前記個体または対象は、脊椎
動物でもあり得、哺乳類、両生類、爬虫類、鳥類でもあり得、種（species）は、例えば
、ヒト（Homo sapiens）、猿、ラット、マウスなどでありえる。例えば、前記抗ＣＤ７３
抗体は、ＣＤ７３が活性構造に変換されることを阻害するか、あるいはＣＤ７３に結合す
る阻害因子と競合的に結合することにより、ＣＤ７３の酵素活性を阻害することができる
。また、抗ＣＤ７３抗体は、陽性対照であるＭＥＤＩ９４４７またはＣＰＩ－００６のも
のと同様のエピトープに結合することにより、エンドサイトーシス活性を示しうる。従っ
て、前記抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ７３に特異的に結合しながら、種間交差反
応性を有しうる。
性（species cross-reactivity）を有するものでありえる。前記個体または対象は、脊椎
動物でもあり得、哺乳類、両生類、爬虫類、鳥類でもあり得、種（species）は、例えば
、ヒト（Homo sapiens）、猿、ラット、マウスなどでありえる。例えば、前記抗ＣＤ７３
抗体は、ＣＤ７３が活性構造に変換されることを阻害するか、あるいはＣＤ７３に結合す
る阻害因子と競合的に結合することにより、ＣＤ７３の酵素活性を阻害することができる
。また、抗ＣＤ７３抗体は、陽性対照であるＭＥＤＩ９４４７またはＣＰＩ－００６のも
のと同様のエピトープに結合することにより、エンドサイトーシス活性を示しうる。従っ
て、前記抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ７３に特異的に結合しながら、種間交差反
応性を有しうる。
【0059】
本明細書内における用語「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合することができる蛋
白質決定部位（determinant）を意味する。該エピトープは、通常は、化学的に活性であ
る表面分子群、例えば、アミノ酸または糖側鎖によって構成され、一般的に、特定の三次
元の構造的特徴ならびに特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピト
ープは、前者に対する結合は変性溶媒の存在下において消失するが後者は消失しないとい
う点で、区別される。前記エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続したアミノ酸（線
形または連続的エピトープ）であり得、あるいは、例えば、ポリペプチド（複数可）の２
以上の非連続領域から共にもたらされるものでありえる（立体構造的、非線形、不連続ま
たは非連続のエピトープ）。特定実施形態において、抗体の結合するエピトープは、例え
ば、ＮＭＲ分光学、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡ分析、質量分析（例えば、液体クロ
マトグラフィエレクトロスプレー質量分析）、アレイに基づくオリゴ－ペプチドスキャニ
ング分析、及び／または突然変異マッピング（例えば、部位特異的突然変異誘発マッピン
グ）によって決定され得る。Ｘ線結晶学の場合、当業界で公知の方法のうちいずれか一つ
を使用して結晶化がなされ得る（例えば、Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D
Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23;
Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 63
00-6303）。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ－ＰＬＯ
Ｒ（Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；例えば、
以下を参照、Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S.
2004/0014194）及びＢＵＳＴＥＲ（Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crysta
llogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter C
W; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316
-1323）のようなコンピュータソフトウェアを使用して精密化され得る。突然変異誘発マ
ッピング研究は、当業者に知られた任意の方法を使用して達成され得る。アラニンスキャ
ニング突然変異技術を含む突然変異誘発技術の詳細な内容は、例えば、Champe M et al.,
(1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC、及びWells JA (1989) Scienc
e 244: 1081-1085を参照する。一実施例において、前記抗体のエピトープは、アラニンス
キャニング突然変異誘発研究を使用して決定される。
白質決定部位（determinant）を意味する。該エピトープは、通常は、化学的に活性であ
る表面分子群、例えば、アミノ酸または糖側鎖によって構成され、一般的に、特定の三次
元の構造的特徴ならびに特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピト
ープは、前者に対する結合は変性溶媒の存在下において消失するが後者は消失しないとい
う点で、区別される。前記エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続したアミノ酸（線
形または連続的エピトープ）であり得、あるいは、例えば、ポリペプチド（複数可）の２
以上の非連続領域から共にもたらされるものでありえる（立体構造的、非線形、不連続ま
たは非連続のエピトープ）。特定実施形態において、抗体の結合するエピトープは、例え
ば、ＮＭＲ分光学、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡ分析、質量分析（例えば、液体クロ
マトグラフィエレクトロスプレー質量分析）、アレイに基づくオリゴ－ペプチドスキャニ
ング分析、及び／または突然変異マッピング（例えば、部位特異的突然変異誘発マッピン
グ）によって決定され得る。Ｘ線結晶学の場合、当業界で公知の方法のうちいずれか一つ
を使用して結晶化がなされ得る（例えば、Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D
Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23;
Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 63
00-6303）。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ－ＰＬＯ
Ｒ（Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；例えば、
以下を参照、Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S.
2004/0014194）及びＢＵＳＴＥＲ（Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crysta
llogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter C
W; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316
-1323）のようなコンピュータソフトウェアを使用して精密化され得る。突然変異誘発マ
ッピング研究は、当業者に知られた任意の方法を使用して達成され得る。アラニンスキャ
ニング突然変異技術を含む突然変異誘発技術の詳細な内容は、例えば、Champe M et al.,
(1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC、及びWells JA (1989) Scienc
e 244: 1081-1085を参照する。一実施例において、前記抗体のエピトープは、アラニンス
キャニング突然変異誘発研究を使用して決定される。
【0060】
本明細書内における用語「抗体（antibody）」とは、ウイルス、細菌等のような抗原を
不活性化させ、身体に侵入した微生物に対抗する細胞外部刺激を誘導する糖蛋白質を指し
、特に、免疫グロブリンを指す。本明細書に開示された前記抗体は、モノクローナル抗体
、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗
体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及び抗イディ
オタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または前記抗体のエピトープ結合断片などを含むものでありえ
る。具体的には、前記抗体は、モノクローナル抗体でありながら、完全ヒト抗体またはヒ
ト・マウスキメラ抗体でありえる。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団（す
なわち、集団を占めている個々の抗体が、微量に存在しうる可能な天然発生的突然変異を
除いては、同一であるのもの）から得られた抗体を表す。モノクローナル抗体は、高度に
特異的であり、単一の抗原エピトープに対して誘導される。本開示は、抗ＣＤ７３抗体に
係わるものであるので、特別に他の指称がない場合、修飾なしに使用された「抗体」とい
う用語は、ＣＤ７３のエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体を意味しうる。本開示の範囲
には、ＣＤ７３に特異的に結合する完全な抗体形態だけではなく、前記抗体分子の抗原結
合断片も含まれる。完全な抗体は、２個の全長の軽鎖、及び２個の全長の重鎖を有する構
造において、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領
域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε
）のタイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３
（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽
鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のタイプを有する。
不活性化させ、身体に侵入した微生物に対抗する細胞外部刺激を誘導する糖蛋白質を指し
、特に、免疫グロブリンを指す。本明細書に開示された前記抗体は、モノクローナル抗体
、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗
体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及び抗イディ
オタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または前記抗体のエピトープ結合断片などを含むものでありえ
る。具体的には、前記抗体は、モノクローナル抗体でありながら、完全ヒト抗体またはヒ
ト・マウスキメラ抗体でありえる。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団（す
なわち、集団を占めている個々の抗体が、微量に存在しうる可能な天然発生的突然変異を
除いては、同一であるのもの）から得られた抗体を表す。モノクローナル抗体は、高度に
特異的であり、単一の抗原エピトープに対して誘導される。本開示は、抗ＣＤ７３抗体に
係わるものであるので、特別に他の指称がない場合、修飾なしに使用された「抗体」とい
う用語は、ＣＤ７３のエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体を意味しうる。本開示の範囲
には、ＣＤ７３に特異的に結合する完全な抗体形態だけではなく、前記抗体分子の抗原結
合断片も含まれる。完全な抗体は、２個の全長の軽鎖、及び２個の全長の重鎖を有する構
造において、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領
域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε
）のタイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３
（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽
鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のタイプを有する。
【0061】
「結合親和度（binding affinity）」とは、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結
合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用総計の強度を意味する
。異なって明示されない限り、本明細書で使用される「結合親和度」とは、結合対の構成
員（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映させる固有の結合親和力を意味す
る。分子ＸのパートナーＹに対する親和力は、一般的に、解離定数（ＫＤ（dissociation
constant））で示すことができる。親和度は、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡結合定数
（ＫＡ（association constant））を含み、当業界に知られたさまざまな方法で、測定及
び／または表現がなされうる。前記ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの商によって計算され、前
記ＫＡは、ｋｏｎ／ｋｏｆｆの商によって計算される。ｋｏｎは、例えば、抗原に対する
抗体の結合速度定数を意味し、ｋｏｆｆは、例えば、抗原に対する抗体の解離を意味する
。前述のｋｏｎとｋｏｆｆは、BIAcore（登録商標）またはKinExAのように、当業者に知
られた技術によって決定され得る。
合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用総計の強度を意味する
。異なって明示されない限り、本明細書で使用される「結合親和度」とは、結合対の構成
員（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映させる固有の結合親和力を意味す
る。分子ＸのパートナーＹに対する親和力は、一般的に、解離定数（ＫＤ（dissociation
constant））で示すことができる。親和度は、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡結合定数
（ＫＡ（association constant））を含み、当業界に知られたさまざまな方法で、測定及
び／または表現がなされうる。前記ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの商によって計算され、前
記ＫＡは、ｋｏｎ／ｋｏｆｆの商によって計算される。ｋｏｎは、例えば、抗原に対する
抗体の結合速度定数を意味し、ｋｏｆｆは、例えば、抗原に対する抗体の解離を意味する
。前述のｋｏｎとｋｏｆｆは、BIAcore（登録商標）またはKinExAのように、当業者に知
られた技術によって決定され得る。
【0062】
本明細書内における用語「免疫特異的に結合する（immunospecifically binds）」、「
免疫特異的に認識する（immunospecifically recognizes）」、「特異的に結合する（spe
cifically binds）」及び「特異的に認識する（specifically recognizes）」とは、抗体
の文脈において類似した用語であり、当業者が理解しているように、抗原に結合する分子
（例えば、エピトープ、免疫複合体、または抗原結合部位の結合パートナー）を表す。例
えば、抗原に特異的に結合する分子は、例えば免疫アッセイ、BIAcore（登録商標）、Kin
ExA 3000機器（Sapidyne Instruments, Boise, ID）、または本技術分野で知られる他の
アッセイによって決定されるところの概してより低い親和力で、他のペプチドまたはポリ
ペプチドと結合し得る。一実施形態において、抗原に特異的に結合する分子は、該分子が
他の抗原に結合するときのＫＡより、少なくとも２ログ（log）、２．５ログ、３ログ、
４ログ、またはそれより大きいＫＡで抗原に結合する。
免疫特異的に認識する（immunospecifically recognizes）」、「特異的に結合する（spe
cifically binds）」及び「特異的に認識する（specifically recognizes）」とは、抗体
の文脈において類似した用語であり、当業者が理解しているように、抗原に結合する分子
（例えば、エピトープ、免疫複合体、または抗原結合部位の結合パートナー）を表す。例
えば、抗原に特異的に結合する分子は、例えば免疫アッセイ、BIAcore（登録商標）、Kin
ExA 3000機器（Sapidyne Instruments, Boise, ID）、または本技術分野で知られる他の
アッセイによって決定されるところの概してより低い親和力で、他のペプチドまたはポリ
ペプチドと結合し得る。一実施形態において、抗原に特異的に結合する分子は、該分子が
他の抗原に結合するときのＫＡより、少なくとも２ログ（log）、２．５ログ、３ログ、
４ログ、またはそれより大きいＫＡで抗原に結合する。
【0063】
他の実施形態において、抗原に免疫特異的に結合する分子は、類似した結合条件下にお
いて、他の蛋白質と交差反応するものではない。一実施形態において、抗原に免疫特異的
に結合する分子は、他の蛋白質と交差反応するものではない。一実施形態において、本願
は、他の関係ない抗原に対してよりも高い親和度で、ＣＤ７３のような特定抗原に結合す
る、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。特定実施形態において、本願
は、例えば、放射線免疫測定、表面プラズモン共鳴または結合平衡除外法（Kinetic Excl
usion Assay）によって測定されるところにより、係わりのない他の抗原に対する親和度
より、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高い親和力で、ＣＤ７
３のような特定抗体に結合する、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。
一実施形態において、本明細書に記載されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片の
、無関係の蛋白質に対する結合の程度は、例えば、放射線免疫測定法によって測定される
ところの、特定抗原に対する該抗体の結合の１０％未満、１５％未満または２０％未満で
ある。
いて、他の蛋白質と交差反応するものではない。一実施形態において、抗原に免疫特異的
に結合する分子は、他の蛋白質と交差反応するものではない。一実施形態において、本願
は、他の関係ない抗原に対してよりも高い親和度で、ＣＤ７３のような特定抗原に結合す
る、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。特定実施形態において、本願
は、例えば、放射線免疫測定、表面プラズモン共鳴または結合平衡除外法（Kinetic Excl
usion Assay）によって測定されるところにより、係わりのない他の抗原に対する親和度
より、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高い親和力で、ＣＤ７
３のような特定抗体に結合する、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。
一実施形態において、本明細書に記載されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片の
、無関係の蛋白質に対する結合の程度は、例えば、放射線免疫測定法によって測定される
ところの、特定抗原に対する該抗体の結合の１０％未満、１５％未満または２０％未満で
ある。
【0064】
一実施形態において、本願は、抗原の他の種に対してよりも高い親和度で、ヒトＣＤ７
３に結合する、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。特定実施形態にお
いて、本願は、例えば、放射線免疫測定、表面プラズモン共鳴または結合平衡除外法によ
って測定されるところの、他の種に対する親和度より、２０％、３０％、３５％、４０％
、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、またはそれより高い親和力で、ヒトＣＤ７３に結合するモノクローナル抗体及
びその抗原結合断片を提供する。
３に結合する、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片を提供する。特定実施形態にお
いて、本願は、例えば、放射線免疫測定、表面プラズモン共鳴または結合平衡除外法によ
って測定されるところの、他の種に対する親和度より、２０％、３０％、３５％、４０％
、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、またはそれより高い親和力で、ヒトＣＤ７３に結合するモノクローナル抗体及
びその抗原結合断片を提供する。
【0065】
一実施形態において、前記抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）、又は完全な抗体形
態（ＩｇＧ）である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（
α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）のうちいずれか１つのイソタイプから選択さ
れ得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガン
マ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ型でありえる。
態（ＩｇＧ）である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（
α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）のうちいずれか１つのイソタイプから選択さ
れ得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガン
マ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ型でありえる。
【0066】
本明細書内における用語「重鎖（ＨＣまたはＣＨ（heavy chain））」とは、抗原に特
異性を付与するための十分な可変領域（ＶＲ（variable region））配列を有するアミノ
酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１，ＣＨ２及びＣ
Ｈ３を含む全長重鎖及びその断片をいずれも意味する。また、「軽鎖（ＬＣまたはＣＬ（
light chain））」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するア
ミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全体長軽鎖及び
その断片を意味する。
異性を付与するための十分な可変領域（ＶＲ（variable region））配列を有するアミノ
酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１，ＣＨ２及びＣ
Ｈ３を含む全長重鎖及びその断片をいずれも意味する。また、「軽鎖（ＬＣまたはＣＬ（
light chain））」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するア
ミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全体長軽鎖及び
その断片を意味する。
【0067】
「ヒト化」形態の非ヒト（例：マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小
配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの
超可変領域からの残基を、所望の特異性、親和性及び能力を保有しているマウス、ラット
、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域域からの残基
で代替させたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの
超可変領域からの残基を、所望の特異性、親和性及び能力を保有しているマウス、ラット
、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域域からの残基
で代替させたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【0068】
「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であり、相補性決定領域、構造
領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンで構成されて
いるものを意味する。一実施形態において、本発明は、意図されていない免疫反応を最小
化させることができる完全ヒト抗体に係わるものである。
領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンで構成されて
いるものを意味する。一実施形態において、本発明は、意図されていない免疫反応を最小
化させることができる完全ヒト抗体に係わるものである。
【0069】
「キメラ抗体」とは、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定
の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるかまたは
相同的である一方、残り鎖（複数可）は、他の種に由来するかまたは別の抗体のクラスも
しくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同的である、所望の生物
学的活性を示す「キメラ」抗体（免疫グロブリン）ならびにそのような抗体の断片を含む
。
の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるかまたは
相同的である一方、残り鎖（複数可）は、他の種に由来するかまたは別の抗体のクラスも
しくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同的である、所望の生物
学的活性を示す「キメラ」抗体（免疫グロブリン）ならびにそのような抗体の断片を含む
。
【0070】
「抗体可変領域」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ（complementary determining region
）、ＣＤＲＨまたはＣＤＲＬ、すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）、及
びフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖部分及び重鎖部分を
称する。ＶＨは、重鎖の可変領域（variable region of heavy chain）を称する。ＶＬは
、軽鎖の可変領域（variable region of light chain）を称する。
）、ＣＤＲＨまたはＣＤＲＬ、すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）、及
びフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖部分及び重鎖部分を
称する。ＶＨは、重鎖の可変領域（variable region of heavy chain）を称する。ＶＬは
、軽鎖の可変領域（variable region of light chain）を称する。
【0071】
「相補性決定領域（ＣＤＲ（complementarity determining region）、ＣＤＲＨまたは
ＣＤＲＬ、すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）」とは、抗原結合のため
に必要な存在である、抗体可変領域のアミノ酸残基を称しうる。各可変領域は、典型的に
は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と同定される３個のＣＤＲ領域を有する。
ＣＤＲＬ、すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）」とは、抗原結合のため
に必要な存在である、抗体可変領域のアミノ酸残基を称しうる。各可変領域は、典型的に
は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と同定される３個のＣＤＲ領域を有する。
【0072】
本明細書内における用語「フレームワーク領域（ＦＲ（frameworkregion））」とは、
ＣＤＲ残基以外の可変領域残基を意味する。各可変領域は、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２
、ＦＲ３及びＦＲ４として同定される４個のＦＲを有する。
ＣＤＲ残基以外の可変領域残基を意味する。各可変領域は、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２
、ＦＲ３及びＦＲ４として同定される４個のＦＲを有する。
【0073】
本発明において「抗原結合断片」とは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ
などを含む、抗原結合能を有する抗体の断片を意味する。「Ｆｖ」断片は、完全な抗体の
認識部位及び結合部位を含む抗体断片である。そのような領域は、１個の重鎖可変領域と
、１個の軽鎖可変領域とが、堅く共有結合された二量体（例えばｓｃＦｖ）によってなる
。「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変領域及び定常領域と、重鎖の可変領域及び第１定常領域
（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般的に、それら間において、ヒンジシ
ステインにより、それらのカルボキシ末端近辺で共有結合された１対のＦａｂ断片を含む
。「単鎖Ｆｖ」、すなわち、「ｓｃＦｖ」の抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬド
メインを含むが、それらドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチ
ドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これが
ｓｃＦｖに抗原結合のための望ましい構造を形成させる。
などを含む、抗原結合能を有する抗体の断片を意味する。「Ｆｖ」断片は、完全な抗体の
認識部位及び結合部位を含む抗体断片である。そのような領域は、１個の重鎖可変領域と
、１個の軽鎖可変領域とが、堅く共有結合された二量体（例えばｓｃＦｖ）によってなる
。「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変領域及び定常領域と、重鎖の可変領域及び第１定常領域
（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般的に、それら間において、ヒンジシ
ステインにより、それらのカルボキシ末端近辺で共有結合された１対のＦａｂ断片を含む
。「単鎖Ｆｖ」、すなわち、「ｓｃＦｖ」の抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬド
メインを含むが、それらドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチ
ドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これが
ｓｃＦｖに抗原結合のための望ましい構造を形成させる。
【0074】
Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体セグメントであり
、Ｆｖ断片を生成する組み換え技術は、ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０
、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されて
いる。二本鎖Ｆｖ（two-chain Fv）では、非共有結合で、重鎖可変領域と軽鎖可変領域と
が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：single-chain Fv）では、一般的に、ペプチド
リンカーを介した共有結合によって、重鎖の可変領域と、軽鎖の可変領域とが連結される
か、あるいはＣ末端に直接連結されており、二本鎖Ｆｖのように、ダイマーのような構造
をなしうる。そのような抗体断片は、蛋白質加水分解酵素を利用しても得られ（例えば、
全長抗体をパパインで消化すれば、Ｆａｂを得ることができ、抗体をペプシンで消化すれ
ば、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術を介して作製するこ
ともできる。
、Ｆｖ断片を生成する組み換え技術は、ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０
、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されて
いる。二本鎖Ｆｖ（two-chain Fv）では、非共有結合で、重鎖可変領域と軽鎖可変領域と
が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：single-chain Fv）では、一般的に、ペプチド
リンカーを介した共有結合によって、重鎖の可変領域と、軽鎖の可変領域とが連結される
か、あるいはＣ末端に直接連結されており、二本鎖Ｆｖのように、ダイマーのような構造
をなしうる。そのような抗体断片は、蛋白質加水分解酵素を利用しても得られ（例えば、
全長抗体をパパインで消化すれば、Ｆａｂを得ることができ、抗体をペプシンで消化すれ
ば、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術を介して作製するこ
ともできる。
【0075】
本明細書内における用語「ファージディスプレイ」とは、変異体ポリペプチドを、ファ
ージ、例えば、線維状ファージ粒子の表面上に、外被蛋白質の少なくとも一部との融合蛋
白質としてディスプレイする技術を意味する。該ファージディスプレイの有用性は、ラン
ダム蛋白質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配
列を迅速かつ効率的に分類することができるという事実にある。ペプチド及び蛋白質のラ
イブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有したポリペプチ
ドを同定するために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに使用された。
ージ、例えば、線維状ファージ粒子の表面上に、外被蛋白質の少なくとも一部との融合蛋
白質としてディスプレイする技術を意味する。該ファージディスプレイの有用性は、ラン
ダム蛋白質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配
列を迅速かつ効率的に分類することができるという事実にある。ペプチド及び蛋白質のラ
イブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有したポリペプチ
ドを同定するために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに使用された。
【0076】
ファージディスプレイ技術は、特異的リガンド（例：抗原）と結合する新規蛋白質を生
成及び選別するための強力なツールを提供した。該ファージディスプレイ技術を使用し、
蛋白質変異体の大きなライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅
速に分類することができる。変異体ポリペプチドをコードする核酸を、ウイルス外被蛋白
質、例えば、遺伝子III蛋白質または遺伝子VIII蛋白質をコードする核酸配列と融合させ
る。蛋白質またはポリペプチドをコードする核酸配列を、遺伝子III蛋白質の一部をコー
ドする核酸配列と融合させた一価ファージディスプレイシステムが開発された。該一価フ
ァージディスプレイシステムにおいては、遺伝子融合物が低レベルに発現され、野生型遺
伝子III蛋白質も発現され、それによって粒子の感染性が維持される。
成及び選別するための強力なツールを提供した。該ファージディスプレイ技術を使用し、
蛋白質変異体の大きなライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅
速に分類することができる。変異体ポリペプチドをコードする核酸を、ウイルス外被蛋白
質、例えば、遺伝子III蛋白質または遺伝子VIII蛋白質をコードする核酸配列と融合させ
る。蛋白質またはポリペプチドをコードする核酸配列を、遺伝子III蛋白質の一部をコー
ドする核酸配列と融合させた一価ファージディスプレイシステムが開発された。該一価フ
ァージディスプレイシステムにおいては、遺伝子融合物が低レベルに発現され、野生型遺
伝子III蛋白質も発現され、それによって粒子の感染性が維持される。
【0077】
線維状ファージ表面上におけるペプチドの発現と、Ｅ．ｃｏｌｉの辺縁細胞質（periph
eral cytoplasm）における機能性抗体断片の発現とを立証することが、抗体ファージディ
スプレイライブラリーを開発するにおいて重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチ
ドのライブラリーは、数多くの方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって
単一遺伝子を改変すること、または関連遺伝子系列をクローニングすることによって調製
されてきた。ライブラリーは、目的とする特徴を伴う抗体または抗原結合性蛋白質の発現
についてスクリーニングすることができる。
eral cytoplasm）における機能性抗体断片の発現とを立証することが、抗体ファージディ
スプレイライブラリーを開発するにおいて重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチ
ドのライブラリーは、数多くの方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって
単一遺伝子を改変すること、または関連遺伝子系列をクローニングすることによって調製
されてきた。ライブラリーは、目的とする特徴を伴う抗体または抗原結合性蛋白質の発現
についてスクリーニングすることができる。
【0078】
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有した抗体を製造するための一般的な
ハイブリードマ及び組み換え方法に比べ、いくつかの利点を有している。そのような技術
は、動物を使用せずとも、短時間に多様な配列を有した大きい抗体ライブラリーを生成さ
せることができるようにする。ハイブリードマの製造や、ヒト化抗体の製造は、数ヵ月の
製造期間を必要としうる。また、ファージ抗体ライブラリーは、免疫が全く要求されない
ために、毒性であったり抗原性が低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。該
ファージ抗体ライブラリーは新規の治療的抗体を生成及び同定することにも使用できる。
ハイブリードマ及び組み換え方法に比べ、いくつかの利点を有している。そのような技術
は、動物を使用せずとも、短時間に多様な配列を有した大きい抗体ライブラリーを生成さ
せることができるようにする。ハイブリードマの製造や、ヒト化抗体の製造は、数ヵ月の
製造期間を必要としうる。また、ファージ抗体ライブラリーは、免疫が全く要求されない
ために、毒性であったり抗原性が低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。該
ファージ抗体ライブラリーは新規の治療的抗体を生成及び同定することにも使用できる。
【0079】
ファージディスプレイライブラリーを用いてヒト生殖細胞系配列または免疫化もしくは
非免疫の未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリーからヒト抗体を生成させる技術を使用することが
できる。各種リンパ系組織を使用して、未感作または非免疫の抗原結合性ライブラリーを
調製することができる。
非免疫の未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリーからヒト抗体を生成させる技術を使用することが
できる。各種リンパ系組織を使用して、未感作または非免疫の抗原結合性ライブラリーを
調製することができる。
【0080】
ファージディスプレイライブラリーから、高親和性抗体を同定及び分離するための技術
は、新規治療用抗体を分離するために重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離
することは、ライブラリーの大きさ、細菌細胞における生産効率、及びライブラリーの多
様性にも左右される。ライブラリーの大きさは、抗体または抗原結合性蛋白質の不適切な
フォールディング及び停止コドンの存在による非効率的生産によって低減される。抗体ま
たは抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には、細菌細胞における
発現が抑制されうる。発現は、可変／定常界面の表面上の残基や、選別されたＣＤＲ残基
における残基を代替的に突然変異させることによって改善させることができる。フレーム
ワーク領域の配列は、細菌細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合、適
切なフォールディングを提供するための１つの要素である。
は、新規治療用抗体を分離するために重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離
することは、ライブラリーの大きさ、細菌細胞における生産効率、及びライブラリーの多
様性にも左右される。ライブラリーの大きさは、抗体または抗原結合性蛋白質の不適切な
フォールディング及び停止コドンの存在による非効率的生産によって低減される。抗体ま
たは抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には、細菌細胞における
発現が抑制されうる。発現は、可変／定常界面の表面上の残基や、選別されたＣＤＲ残基
における残基を代替的に突然変異させることによって改善させることができる。フレーム
ワーク領域の配列は、細菌細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合、適
切なフォールディングを提供するための１つの要素である。
【0081】
高親和性抗体分離において、抗体または抗原結合性蛋白質の多様なライブラリーを生成
させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、抗原結合にしばしば参与することが見出され
てきた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列、及び構造的立体形態の側面において、
かなり多様であるので、ＣＤＲ３領域を利用して多様なライブラリーを調製することがで
きる。
させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、抗原結合にしばしば参与することが見出され
てきた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列、及び構造的立体形態の側面において、
かなり多様であるので、ＣＤＲ３領域を利用して多様なライブラリーを調製することがで
きる。
【0082】
また、各位置において２０個のアミノ酸の全てを使用して、可変重鎖及び可変軽鎖のＣ
ＤＲ領域を無作為化させることにより、多様性を生じさせることができる。２０個の全て
のアミノ酸を使用すれば、多様性が高い変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を同定す
る機会が増大しうる。
ＤＲ領域を無作為化させることにより、多様性を生じさせることができる。２０個の全て
のアミノ酸を使用すれば、多様性が高い変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を同定す
る機会が増大しうる。
【0083】
本開示の抗体または抗体断片は、ＣＤ７３を特異的に認識することができる範囲内にお
いて、本明細書に記載された抗ＣＤ７３抗体の配列だけではなく、その生物学的均等物も
含み得る。例えば、抗体の結合親和度、及び／またはその他生物学的特性を一層改善させ
るために、抗体のアミノ酸配列にさらなる改変を与えることができる。そのような改変は
、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含む。そのようなア
ミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大
きさなどに基づいてなされる。該アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形態及び種類に対する分
析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり、
アラニン、グリシン及びセリンは、類似した大きさを有し、フェニルアラニン、トリプト
ファンとチロシンは、類似した形態を有するということが分かる。従って、そのような考
慮事項に基づき、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；
並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、それぞれ、生物学的に機能均
等物であることが見出される。
いて、本明細書に記載された抗ＣＤ７３抗体の配列だけではなく、その生物学的均等物も
含み得る。例えば、抗体の結合親和度、及び／またはその他生物学的特性を一層改善させ
るために、抗体のアミノ酸配列にさらなる改変を与えることができる。そのような改変は
、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含む。そのようなア
ミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大
きさなどに基づいてなされる。該アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形態及び種類に対する分
析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり、
アラニン、グリシン及びセリンは、類似した大きさを有し、フェニルアラニン、トリプト
ファンとチロシンは、類似した形態を有するということが分かる。従って、そのような考
慮事項に基づき、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；
並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、それぞれ、生物学的に機能均
等物であることが見出される。
【0084】
変異を導入するにおいて、アミノ酸の疎水性インデックス（hydropathic index）が考
慮されうる。それぞれのアミノ酸には、疎水性と電荷とにより、疎水性インデックスが付
与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）
；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（
＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；
セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（
－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタメート（－３．５）；グルタミン（－３．
５）；アスパルテート（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；
及びアルギニン（－４．５）。蛋白質の相互作用的な生物学的機能（interactive biolog
ical function）を付与するにおいて、疎水性アミノ酸インデックスは、非常に重要であ
る。類似した疎水性インデックスを有するアミノ酸での置換は、類似した生物学的活性を
保持しうるということは、よく知られている。疎水性インデックスを参照して変異を導入
させる場合、望ましくは、±２以内、さらに望ましくは、±１以内、一層望ましくは、±
０．５以内の疎水性インデックス差を示すアミノ酸間において置換を行う。
慮されうる。それぞれのアミノ酸には、疎水性と電荷とにより、疎水性インデックスが付
与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）
；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（
＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；
セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（
－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタメート（－３．５）；グルタミン（－３．
５）；アスパルテート（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；
及びアルギニン（－４．５）。蛋白質の相互作用的な生物学的機能（interactive biolog
ical function）を付与するにおいて、疎水性アミノ酸インデックスは、非常に重要であ
る。類似した疎水性インデックスを有するアミノ酸での置換は、類似した生物学的活性を
保持しうるということは、よく知られている。疎水性インデックスを参照して変異を導入
させる場合、望ましくは、±２以内、さらに望ましくは、±１以内、一層望ましくは、±
０．５以内の疎水性インデックス差を示すアミノ酸間において置換を行う。
【0085】
なお、類似した親水性値（hydrophilicity value）を有するアミノ酸間の置換が、均等
な生物学的活性を有する蛋白質をもたらすということもよく知られている。米国特許第４
，５５４，１０１号に開示されているように、以下の親水性値が、それぞれのアミノ酸残
基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（
＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（
＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロ
リン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（
－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イ
ソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリ
プトファン（－３．４）。分子の活性を全体的に変更させない蛋白質におけるアミノ酸交
換は、当該分野で公知である（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press
, New York, 1979）。最も一般的に起こる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ
／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ
／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｈｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ
／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓ
ｐ／Ｇｌｙ間の置換である。
な生物学的活性を有する蛋白質をもたらすということもよく知られている。米国特許第４
，５５４，１０１号に開示されているように、以下の親水性値が、それぞれのアミノ酸残
基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（
＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（
＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロ
リン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（
－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イ
ソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリ
プトファン（－３．４）。分子の活性を全体的に変更させない蛋白質におけるアミノ酸交
換は、当該分野で公知である（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press
, New York, 1979）。最も一般的に起こる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ
／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ
／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｈｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ
／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓ
ｐ／Ｇｌｙ間の置換である。
【0086】
一実施形態において、本願に記載された抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２また
はＣＤＲ３）領域及び／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）領域
に沿う１以上のＣＤＲの位置は、抗原に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に
維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９
０％以上９５％以上）される限り、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸位置だ
け異なり得る。例えば、本願に記載された抗体のＣＤＲを定義する位置は、抗原（複数可
）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５
０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、
本願で説明されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ位置に対し、ＣＤ
ＲのＮ－末端境界及び／またはＣ－末端境界を、１個、２個、３個、４個、５個または６
個のアミノ酸だけ移動させることにより、変動し得る。他の実施形態において、本明細書
に記載された抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）領域及び／ま
たはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）領域に沿う１またはそれ以上
のＣＤＲの長さは、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維
持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０
％以上９５％以上）される限り、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミ
ノ酸だけ異なり得る（例えばより短く、またはより長くあり得る）。
はＣＤＲ３）領域及び／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）領域
に沿う１以上のＣＤＲの位置は、抗原に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に
維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９
０％以上９５％以上）される限り、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸位置だ
け異なり得る。例えば、本願に記載された抗体のＣＤＲを定義する位置は、抗原（複数可
）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５
０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、
本願で説明されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲ位置に対し、ＣＤ
ＲのＮ－末端境界及び／またはＣ－末端境界を、１個、２個、３個、４個、５個または６
個のアミノ酸だけ移動させることにより、変動し得る。他の実施形態において、本明細書
に記載された抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）領域及び／ま
たはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）領域に沿う１またはそれ以上
のＣＤＲの長さは、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維
持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０
％以上９５％以上）される限り、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミ
ノ酸だけ異なり得る（例えばより短く、またはより長くあり得る）。
【0087】
一実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲ
Ｈ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３は、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が
維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０
％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載されたＣＤＲのう
ちの１以上より１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短かくあ
りえる。他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３
、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３は、抗原（複数可）に対する免疫特異
的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以
上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載されたＣ
ＤＲのうちの１以上より１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ
長くあり得る。さらに他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２
、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３のアミノ末端は、抗原（
複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なく
とも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される
限り、本願に記載されたＣＤＲのうちの１以上と比較し、１個、２個、３個、４個、５個
、またはそれ以上のアミノ酸だけ延長され得る。さらに他の実施形態において、本願に記
載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣ
ＤＲＨ３のカルボキシ末端は、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、
実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％
以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載されたＣＤＲのうちの１以上と比
較し、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ延長され得る。さ
らに他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、Ｃ
ＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３のアミノ末端は、抗原（複数可）に対する
免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、
６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載
されたＣＤＲのうちの１以上と比較し、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上
のアミノ酸だけ短縮され得る。さらに他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ
１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３のカルボ
キシ末端は、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持され
る、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上
９５％以上）される限り、本願に記載されたＣＤＲのうちの１以上と比較し、１個、２個
、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短縮され得る。当業界で知られる任
意の方法が、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持されるか否かということを確
認するために使用され得、例えば、本明細書の「実施例」欄に説明された結合の分析及び
条件が使用され得る。
Ｈ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３は、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が
維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０
％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載されたＣＤＲのう
ちの１以上より１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短かくあ
りえる。他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３
、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３は、抗原（複数可）に対する免疫特異
的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以
上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載されたＣ
ＤＲのうちの１以上より１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ
長くあり得る。さらに他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２
、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３のアミノ末端は、抗原（
複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なく
とも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される
限り、本願に記載されたＣＤＲのうちの１以上と比較し、１個、２個、３個、４個、５個
、またはそれ以上のアミノ酸だけ延長され得る。さらに他の実施形態において、本願に記
載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣ
ＤＲＨ３のカルボキシ末端は、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、
実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％
以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載されたＣＤＲのうちの１以上と比
較し、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ延長され得る。さ
らに他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、Ｃ
ＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３のアミノ末端は、抗原（複数可）に対する
免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持される、例えば、少なくとも５０％以上、
６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上９５％以上）される限り、本願に記載
されたＣＤＲのうちの１以上と比較し、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上
のアミノ酸だけ短縮され得る。さらに他の実施形態において、本願に記載されたＣＤＲＬ
１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／またはＣＤＲＨ３のカルボ
キシ末端は、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持（例えば、実質的に維持され
る、例えば、少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上
９５％以上）される限り、本願に記載されたＣＤＲのうちの１以上と比較し、１個、２個
、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短縮され得る。当業界で知られる任
意の方法が、抗原（複数可）に対する免疫特異的結合が維持されるか否かということを確
認するために使用され得、例えば、本明細書の「実施例」欄に説明された結合の分析及び
条件が使用され得る。
【0088】
２つの塩基配列（例えば、アミノ酸塩基配列または核酸塩基配列）間のパーセント同一
性の決定も、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に使用され
る数学的アルゴリズムの具体的かつ非限定的な例は、Karlin S & Altschul SF (1993) PN
AS 90: 5873-5877でのように、修正されたKarlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 226
4-2268のアルゴリズムである。前記アルゴリズムは、Altschul SF et al., (1990) J Mol
Biol 215: 403のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムに統合されている
。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、本願に記載された核酸分子と相同的なヌクレオチド配
列を得るために、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコ
ア＝１００、ワード長＝１２について遂行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本願
に記載されたタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴヌクレ
オチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３について遂行
され得る。比較の目的のためのギャップ付アラインメントを得るために、Altschul SF et
al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402に説明されているようなGapped BLASTを使用
することができる。または、PSI BLASTを使用して、分子間の遠い関係を探知する反復検
索を行うことができる（Ｉｄ）。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI Blastプログラムを使用
するとき、各プログラム（例えばXBLAST及びNBLAST）のデフォールトパラメータを使用す
ることができる（例えばNational Center for Biotechnology Information (NCBI) on th
e worldwide web, ncbi.nlm.nih.gov参照）。配列の比較のために使用される数学的アル
ゴリズムの他の具体的かつ非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17
のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウ
ェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されてい
る。アミノ酸塩基配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを活用する場合、ＰＡＭ１２０
荷重残基表、キャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用することができ
る。
性の決定も、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に使用され
る数学的アルゴリズムの具体的かつ非限定的な例は、Karlin S & Altschul SF (1993) PN
AS 90: 5873-5877でのように、修正されたKarlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 226
4-2268のアルゴリズムである。前記アルゴリズムは、Altschul SF et al., (1990) J Mol
Biol 215: 403のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムに統合されている
。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、本願に記載された核酸分子と相同的なヌクレオチド配
列を得るために、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコ
ア＝１００、ワード長＝１２について遂行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本願
に記載されたタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴヌクレ
オチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３について遂行
され得る。比較の目的のためのギャップ付アラインメントを得るために、Altschul SF et
al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402に説明されているようなGapped BLASTを使用
することができる。または、PSI BLASTを使用して、分子間の遠い関係を探知する反復検
索を行うことができる（Ｉｄ）。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI Blastプログラムを使用
するとき、各プログラム（例えばXBLAST及びNBLAST）のデフォールトパラメータを使用す
ることができる（例えばNational Center for Biotechnology Information (NCBI) on th
e worldwide web, ncbi.nlm.nih.gov参照）。配列の比較のために使用される数学的アル
ゴリズムの他の具体的かつ非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17
のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウ
ェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されてい
る。アミノ酸塩基配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを活用する場合、ＰＡＭ１２０
荷重残基表、キャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用することができ
る。
【0089】
２つの配列間のパーセント同一性は、前述のところで説明されたところと同様の技術を
使用し、ギャップを許容するか、あるいは許容せずに決定され得る。パーセント同一性を
計算するとき、一般的には、正確なマッチだけがカウントされる。
使用し、ギャップを許容するか、あるいは許容せずに決定され得る。パーセント同一性を
計算するとき、一般的には、正確なマッチだけがカウントされる。
【0090】
他の態様は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含む発現
ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【0091】
配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８に対して少なくとも８０％以
上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８
％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域をコー
ドする核酸、及び配列番号３９，４０，４１または４２に対して８０％以上、８５％以上
、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％
以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を提
供する。また、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９，４０，４１または４２の配列
番号を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。
上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８
％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域をコー
ドする核酸、及び配列番号３９，４０，４１または４２に対して８０％以上、８５％以上
、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％
以上または１００％の同一性を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を提
供する。また、配列番号３２，３３，３４，３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９，４０，４１または４２の配列
番号を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。
【0092】
一実施形態において、配列番号３２の重鎖可変領域、及び配列番号３９の軽鎖可変領域
をコードする核酸、または配列番号３３の重鎖可変領域、及び配列番号４０の軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。例えば、前記配列番号３２の重鎖可変領域をコードする
核酸は、配列番号４３で表されるものでもあり、前記配列番号３９の軽鎖可変領域をコー
ドする核酸は、配列番号４４で表されるものでありえる。一実施形態において、配列番号
３２または配列番号３３の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９または配列
番号４０の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。また、前記配列番号３３の重鎖可
変領域をコードする核酸は、配列番号４５で表されるものでもあり、前記配列番号４０の
軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号４６で表されるものでありえる。
をコードする核酸、または配列番号３３の重鎖可変領域、及び配列番号４０の軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。例えば、前記配列番号３２の重鎖可変領域をコードする
核酸は、配列番号４３で表されるものでもあり、前記配列番号３９の軽鎖可変領域をコー
ドする核酸は、配列番号４４で表されるものでありえる。一実施形態において、配列番号
３２または配列番号３３の重鎖可変領域をコードする核酸、及び配列番号３９または配列
番号４０の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。また、前記配列番号３３の重鎖可
変領域をコードする核酸は、配列番号４５で表されるものでもあり、前記配列番号４０の
軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号４６で表されるものでありえる。
【0093】
また、配列番号９６，９８，１００，１０２または１０４に対して少なくとも８０％以
上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８
％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を
コードする核酸、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３または１０５に対して８５％
以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９
９％以上または１００％の同一性を有する軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。ま
た、配列番号９６，９８，１００，１０２または１０４の重鎖可変領域をコードする核酸
、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３または１０５の軽鎖可変領域をコードする核
酸を提供する。
上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８
％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を
コードする核酸、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３または１０５に対して８５％
以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９
９％以上または１００％の同一性を有する軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。ま
た、配列番号９６，９８，１００，１０２または１０４の重鎖可変領域をコードする核酸
、及び配列番号９７，９９，１０１，１０３または１０５の軽鎖可変領域をコードする核
酸を提供する。
【0094】
一実施形態において、配列番号９６の重鎖可変領域、及び配列番号９７の軽鎖可変領域
をコードする核酸；配列番号９８の重鎖可変領域、及び配列番号９９の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；配列番号１００の重鎖可変領域、及び配列番号１０１の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；配列番号１０２の重鎖可変領域、及び配列番号１０３の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；または配列番号１０４の重鎖可変領域、及び配列番号１０５の軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。例えば、配列番号９６の重鎖可変領域をコードする核酸
は、配列番号１０６で表されるものでもあり、前記配列番号９７の軽鎖可変領域をコード
する核酸は、配列番号１０７で表されるものでありえる。配列番号９８の重鎖可変領域を
コードする核酸は、配列番号１０８で表されるものでもあり、前記配列番号９９の軽鎖可
変領域をコードする核酸は、配列番号１０９で表されるものでありえる。配列番号１００
の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１０で表されるものでもあり、前記配列
番号１０１の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１１で表されるものでありえ
る。配列番号１０２の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１２で表されるもの
でもあり、前記配列番号１０３の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１３で表
されるものでありえる。配列番号１０４の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１
１４で表されるものでもあり、前記配列番号１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸は、
配列番号１１５で表されるものでありえる。
をコードする核酸；配列番号９８の重鎖可変領域、及び配列番号９９の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；配列番号１００の重鎖可変領域、及び配列番号１０１の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；配列番号１０２の重鎖可変領域、及び配列番号１０３の軽鎖可変領域をコ
ードする核酸；または配列番号１０４の重鎖可変領域、及び配列番号１０５の軽鎖可変領
域をコードする核酸を提供する。例えば、配列番号９６の重鎖可変領域をコードする核酸
は、配列番号１０６で表されるものでもあり、前記配列番号９７の軽鎖可変領域をコード
する核酸は、配列番号１０７で表されるものでありえる。配列番号９８の重鎖可変領域を
コードする核酸は、配列番号１０８で表されるものでもあり、前記配列番号９９の軽鎖可
変領域をコードする核酸は、配列番号１０９で表されるものでありえる。配列番号１００
の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１０で表されるものでもあり、前記配列
番号１０１の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１１で表されるものでありえ
る。配列番号１０２の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１２で表されるもの
でもあり、前記配列番号１０３の軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１３で表
されるものでありえる。配列番号１０４の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１
１４で表されるものでもあり、前記配列番号１０５の軽鎖可変領域をコードする核酸は、
配列番号１１５で表されるものでありえる。
【0095】
また、配列番号１０６，１０８，１１０，１１２または１１４に対して少なくとも８０
％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、
９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領
域をコードする核酸、及び配列番号１０７，１０９，１１１，１１３または１１５に対し
て８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％
以上、９９％以上または１００％の同一性を有する軽鎖可変領域をコードする核酸を提供
する。
％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、
９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領
域をコードする核酸、及び配列番号１０７，１０９，１１１，１１３または１１５に対し
て８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％
以上、９９％以上または１００％の同一性を有する軽鎖可変領域をコードする核酸を提供
する。
【0096】
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を単離し、モノクローナル抗体
またはその抗原結合断片を組み換え的に生産することができる。核酸を単離し、さらにク
ローニング（ＤＮＡの増幅）または発現させるためにそれを複製可能なベクター内に挿入
する。一実施形態において、本明細書に開示された核酸のうちの１以上は、１つのベクタ
ーに挿入されるか、あるいは本明細書に開示されたそれぞれの核酸が、別途のベクターに
挿入されうる。このことに基づいて、本開示は、他の側面において、本明細書に開示され
る核酸を含むベクターに関する。
またはその抗原結合断片を組み換え的に生産することができる。核酸を単離し、さらにク
ローニング（ＤＮＡの増幅）または発現させるためにそれを複製可能なベクター内に挿入
する。一実施形態において、本明細書に開示された核酸のうちの１以上は、１つのベクタ
ーに挿入されるか、あるいは本明細書に開示されたそれぞれの核酸が、別途のベクターに
挿入されうる。このことに基づいて、本開示は、他の側面において、本明細書に開示され
る核酸を含むベクターに関する。
【0097】
本明細書内における用語「核酸」とは、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）分子、並びに
ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸における基本構成単位であるヌクレオチドは
、天然のヌクレオチドだけではなく、糖部分または塩基部分が修飾された類似体（analog
ue）も含む。本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は、改変さ
れうる。前記変形改変は、ヌクレオチドの追加、欠失、あるいは非保存的置換もしくは保
存的置換を含む。
ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸における基本構成単位であるヌクレオチドは
、天然のヌクレオチドだけではなく、糖部分または塩基部分が修飾された類似体（analog
ue）も含む。本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は、改変さ
れうる。前記変形改変は、ヌクレオチドの追加、欠失、あるいは非保存的置換もしくは保
存的置換を含む。
【0098】
前記抗体をコードするＤＮＡは、一般的な手順を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖
をコードするＤＮＡと特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用
して）、容易に分離または合成することができる。多くのベクターが入手可能である。ベ
クター成分には、一般的には、以下のうち１以上が含まれるが、それらに限定されるもの
ではない：シグナル配列、複製基点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント
、プローモーター、及び転写終結配列。
をコードするＤＮＡと特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用
して）、容易に分離または合成することができる。多くのベクターが入手可能である。ベ
クター成分には、一般的には、以下のうち１以上が含まれるが、それらに限定されるもの
ではない：シグナル配列、複製基点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント
、プローモーター、及び転写終結配列。
【0099】
本明細書内における用語「ベクター」とは、宿主細胞において、目的遺伝子を発現させ
るための手段を言い、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベク
ター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクタ
ーのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて、抗体をコードする核酸
は、プローモーターと作動的に連結される。
るための手段を言い、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベク
ター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクタ
ーのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて、抗体をコードする核酸
は、プローモーターと作動的に連結される。
【0100】
「作動的に連結」とは、核酸発現調節配列（例：プローモーター、シグナル配列、また
は一連の転写調節因子結合位置）と別の核酸配列との間の機能的な連結を意味し、該核酸
配列の転写及び／または翻訳により調節される。
は一連の転写調節因子結合位置）と別の核酸配列との間の機能的な連結を意味し、該核酸
配列の転写及び／または翻訳により調節される。
【0101】
原核細胞を宿主にする場合には、ベクターは、転写を進めさせることができる強力なプ
ローモーター（例えば、ｔａｃプローモーター、ｌａｃプローモーター、ｌａｃＵＶ５プ
ローモーター、ｌｐｐプローモーター、ｐＬλプローモーター、ｐＲλプローモーター、
ｒａｃ５プローモーター、ａｍｐプローモーター、ｒｅｃＡプローモーター、ＳＰ６プロ
ーモーター、ｔｒｐプローモーター及びＴ７プローモーターなど）、翻訳開始のためのリ
ボソーム結合サイト、及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。また、例えば
、真核細胞を宿主にする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプローモーター（例
：メタロチオニンプローモーター、β－アクチンプローモーター、ヒトヘモグロビンプロ
ーモーター及びヒト筋肉クレアチンプローモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来す
るプローモーター（例：アデノウイルス後期プローモーター、ワクシニアウイルス７．５
Ｋプローモーター、ＳＶ４０プローモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プローモ
ーター、ＨＳＶ ｔｋプローモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プローモー
ター、ＨＩＶ ＬＴＲプローモーター、モロニーウイルス・プローモーター、エブスタイ
ンバールウイルス（ＥＢＶ）・プローモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロ
ーモーター）が利用され、転写終結配列として、ポリアデニル化配列を一般的に有する。
場合により、ベクターは、そこから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列
と融合され得る。融合される配列としては、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラー
ゼ（Pharmacia、米国）、マルトース結合蛋白質（ＮＥＢ、米国）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、
米国）及び６ｘＨｉｓ（hexahistidine）（Quiagen、米国）などがある。前記ベクターは
、選択マーカーとして、当業界で一般的に利用される抗生物質耐性遺伝子を含み、その例
としては、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ス
トレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン
に対する耐性遺伝子がある。
ローモーター（例えば、ｔａｃプローモーター、ｌａｃプローモーター、ｌａｃＵＶ５プ
ローモーター、ｌｐｐプローモーター、ｐＬλプローモーター、ｐＲλプローモーター、
ｒａｃ５プローモーター、ａｍｐプローモーター、ｒｅｃＡプローモーター、ＳＰ６プロ
ーモーター、ｔｒｐプローモーター及びＴ７プローモーターなど）、翻訳開始のためのリ
ボソーム結合サイト、及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。また、例えば
、真核細胞を宿主にする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプローモーター（例
：メタロチオニンプローモーター、β－アクチンプローモーター、ヒトヘモグロビンプロ
ーモーター及びヒト筋肉クレアチンプローモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来す
るプローモーター（例：アデノウイルス後期プローモーター、ワクシニアウイルス７．５
Ｋプローモーター、ＳＶ４０プローモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プローモ
ーター、ＨＳＶ ｔｋプローモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プローモー
ター、ＨＩＶ ＬＴＲプローモーター、モロニーウイルス・プローモーター、エブスタイ
ンバールウイルス（ＥＢＶ）・プローモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロ
ーモーター）が利用され、転写終結配列として、ポリアデニル化配列を一般的に有する。
場合により、ベクターは、そこから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列
と融合され得る。融合される配列としては、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラー
ゼ（Pharmacia、米国）、マルトース結合蛋白質（ＮＥＢ、米国）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、
米国）及び６ｘＨｉｓ（hexahistidine）（Quiagen、米国）などがある。前記ベクターは
、選択マーカーとして、当業界で一般的に利用される抗生物質耐性遺伝子を含み、その例
としては、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ス
トレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン
に対する耐性遺伝子がある。
【0102】
本発明は、他の観点において、前述のベクターで形質転換された細胞を提供する。本願
で開示された抗体またはその抗原結合断片を生成させるために使用される細胞は、原核生
物細胞、酵母細胞または高等真核生物細胞であり得るが、それらに限定されない。大腸菌
（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）及びBacillus thuringiensisのよ
うなバシラス属菌株、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomo
nas）（例えば、Pseudomonas putida）、Proteus mirabilis及びブドウ球菌（Staphyloco
ccus）（例えば、Staphylococcus carnosus）のような原核宿主細胞を利用することがで
きる。ただし、動物細胞に対する関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７
、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ
１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲ
Ｌ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３
Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、
Ｕ２０ＳまたはＨＴ１０８０を含むが、それらに限定されない。
で開示された抗体またはその抗原結合断片を生成させるために使用される細胞は、原核生
物細胞、酵母細胞または高等真核生物細胞であり得るが、それらに限定されない。大腸菌
（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）及びBacillus thuringiensisのよ
うなバシラス属菌株、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomo
nas）（例えば、Pseudomonas putida）、Proteus mirabilis及びブドウ球菌（Staphyloco
ccus）（例えば、Staphylococcus carnosus）のような原核宿主細胞を利用することがで
きる。ただし、動物細胞に対する関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７
、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ
１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲ
Ｌ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３
Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、
Ｕ２０ＳまたはＨＴ１０８０を含むが、それらに限定されない。
【0103】
本発明は、（ａ）前記発現ベクターを含む前記細胞を培養する段階、及び（ｂ）前記培
養された細胞において、抗体またはその抗原結合断片を回収する段階を含む、前記抗体ま
たはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記細胞は、各種培地で培養することがで
きる。任意の市販用培地が制限なく培養培地として使用され得る。当業者に知られるその
他全ての必須補充物が適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、
発現のために選ばれた宿主細胞と共にすでに使用されてきており、それらは当業者に明白
であろう。前記抗体またはその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離または限外濾過
によって不純物を除去すること、及びその結果物を、例えば、親和クロマトグラフィなど
を利用して精製することによって行うことができる。追加のその他精製技術、例えば、陰
イオンイオン交換クロマトグラフィまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作
用クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィなどが使用されうる。
養された細胞において、抗体またはその抗原結合断片を回収する段階を含む、前記抗体ま
たはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記細胞は、各種培地で培養することがで
きる。任意の市販用培地が制限なく培養培地として使用され得る。当業者に知られるその
他全ての必須補充物が適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、
発現のために選ばれた宿主細胞と共にすでに使用されてきており、それらは当業者に明白
であろう。前記抗体またはその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離または限外濾過
によって不純物を除去すること、及びその結果物を、例えば、親和クロマトグラフィなど
を利用して精製することによって行うことができる。追加のその他精製技術、例えば、陰
イオンイオン交換クロマトグラフィまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作
用クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィなどが使用されうる。
【0104】
他の態様は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌予防用、改善用または治療用の
組成物を提供する。前記組成物は、医薬組成物または健康機能食品でありえる。一実施形
態において、前記組成物は、免疫チェックポイント遮断剤または化学療法剤を追加して含
むものでありえる。例えば、前記免疫チェックポイント遮断剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、
抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などであり得、前記化学療法剤は、例えば、化学療法
薬（chemotherapy drug）、チロシンキナーゼ抑制剤（tyrosine kinase inhibitor）など
でありえる。他の実施形態において、前記組成物は、放射線治療剤と併用投与されるもの
でありえる。従って、一態様による組成物は、ＣＤ７３を発現する多様な癌種において増
大した抗癌活性を有し、従って癌の治療剤として使用され得る。
組成物を提供する。前記組成物は、医薬組成物または健康機能食品でありえる。一実施形
態において、前記組成物は、免疫チェックポイント遮断剤または化学療法剤を追加して含
むものでありえる。例えば、前記免疫チェックポイント遮断剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、
抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などであり得、前記化学療法剤は、例えば、化学療法
薬（chemotherapy drug）、チロシンキナーゼ抑制剤（tyrosine kinase inhibitor）など
でありえる。他の実施形態において、前記組成物は、放射線治療剤と併用投与されるもの
でありえる。従って、一態様による組成物は、ＣＤ７３を発現する多様な癌種において増
大した抗癌活性を有し、従って癌の治療剤として使用され得る。
【0105】
例えば、該組成物は、（ａ）前記ＣＤ７３に対する抗体またはその抗原結合断片の薬学
的有効量、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、癌の予防用または治療用の医薬組
成物でありえる。また、本発明は、それを必要とする対象において、癌を予防するか、あ
るいは治療する方法を提供し、前記方法は、対象に、本開示によるＣＤ７３に対する抗体
またはその抗原結合断片の有効量を投与することを含む。
的有効量、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、癌の予防用または治療用の医薬組
成物でありえる。また、本発明は、それを必要とする対象において、癌を予防するか、あ
るいは治療する方法を提供し、前記方法は、対象に、本開示によるＣＤ７３に対する抗体
またはその抗原結合断片の有効量を投与することを含む。
【0106】
前記組成物は、本願に開示されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を有効成
分として利用するため、その二者間に共通する内容は、記載を省略する。
分として利用するため、その二者間に共通する内容は、記載を省略する。
【0107】
下記の実施例で立証されているように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ
７３に高い親和度で結合し、ＣＤ７３を過発現する癌細胞の移動を抑制することができる
ので、癌の予防及び治療に使用可能である。「予防」とは、前記組成物の投与により、癌
を抑制させるか、あるいは進行を遅延させる全ての行為を意味する。「治療」とは、癌の
発生抑制、癌の軽減または癌の除去を意味する。
７３に高い親和度で結合し、ＣＤ７３を過発現する癌細胞の移動を抑制することができる
ので、癌の予防及び治療に使用可能である。「予防」とは、前記組成物の投与により、癌
を抑制させるか、あるいは進行を遅延させる全ての行為を意味する。「治療」とは、癌の
発生抑制、癌の軽減または癌の除去を意味する。
【0108】
「ＣＤ７３を過発現する癌」とは、同一組織類型の非癌性細胞と比較して、有意的によ
り高いレベルでＣＤ７３を癌細胞表面に有している癌を意味する。Hay, C. M. et al., O
ncoImmunol. 5: e1208875, 10 pages (2016)、及びGao, Z-w. et al., BioMed Res. Intl
. 2014: 460654, 9 pages (2014)を参照する。前記組成物に適用される疾患である癌は、
ＣＤ７３を過発現する癌であり、例えば、乳癌、大腸癌、膠芽細胞腫、脳脊髄腫瘍、頭頸
部癌、肺癌、胸腺種、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、胆道癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾
丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血
病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫または皮膚癌などでありえる。一実施形態において
、前記癌は、乳癌、三重陰性乳癌（ＴＢＮＣ：triple-negative breast cancer）、膵臓
大腸癌、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌
、食道癌、胃癌（stomach cancer）、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である。
り高いレベルでＣＤ７３を癌細胞表面に有している癌を意味する。Hay, C. M. et al., O
ncoImmunol. 5: e1208875, 10 pages (2016)、及びGao, Z-w. et al., BioMed Res. Intl
. 2014: 460654, 9 pages (2014)を参照する。前記組成物に適用される疾患である癌は、
ＣＤ７３を過発現する癌であり、例えば、乳癌、大腸癌、膠芽細胞腫、脳脊髄腫瘍、頭頸
部癌、肺癌、胸腺種、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、胆道癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾
丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血
病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫または皮膚癌などでありえる。一実施形態において
、前記癌は、乳癌、三重陰性乳癌（ＴＢＮＣ：triple-negative breast cancer）、膵臓
大腸癌、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌
、食道癌、胃癌（stomach cancer）、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である。
【0109】
他の態様は、前記ＣＤ７３に対する抗体またはその抗原結合断片を含む、癌細胞の転移
または浸潤を抑制するための組成物でありえる。また、本発明は、それを必要とする対象
において、癌細胞の転移または浸潤を抑制する方法を提供し、前記方法は、前記ＣＤ７３
に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含む。
または浸潤を抑制するための組成物でありえる。また、本発明は、それを必要とする対象
において、癌細胞の転移または浸潤を抑制する方法を提供し、前記方法は、前記ＣＤ７３
に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含む。
【0110】
本発明の組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、以下のところに限定されるもの
ではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、
澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、
微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒ
ドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシ
ウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるものではない。本発明の組成
物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤など
を追加して含むものでありえる。
ではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、
澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、
微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒ
ドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシ
ウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるものではない。本発明の組成
物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤など
を追加して含むものでありえる。
【0111】
本発明の医薬組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合
には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺
内投与及び直腸内投与などによって投与することができる。一実施形態において、静脈注
射形態で投与されるものでありえる。経口投与時、蛋白質またはペプチドは消化されるた
め、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、あるいは胃における分解から保護
するように剤形化されるべきである。また、該医薬組成物は、活性物質を標的細胞に輸送
することができる任意の装置によって投与され得る。
には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺
内投与及び直腸内投与などによって投与することができる。一実施形態において、静脈注
射形態で投与されるものでありえる。経口投与時、蛋白質またはペプチドは消化されるた
め、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、あるいは胃における分解から保護
するように剤形化されるべきである。また、該医薬組成物は、活性物質を標的細胞に輸送
することができる任意の装置によって投与され得る。
【0112】
本開示による組成物の適する投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性
別・病的状態・飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因に
よって多様であり、一般的に熟練医師は、所望する治療、または予防に効果的な投与量を
容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の医薬組成物の１日投与量は、対
象の体重のｋｇ当たり０．０００１ないし１００ｍｇ、０．００１ｍｇないし５０ｍｇ、
０．０１ｍｇないし２５ｍｇ、０．１ｍｇないし１０ｍｇ、１ｍｇないし５ｍｇ、または
それら内の範囲でありえる。本明細書において用語「薬学的有効量」とは、癌を予防また
は治療するのに十分な量を意味する。
別・病的状態・飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因に
よって多様であり、一般的に熟練医師は、所望する治療、または予防に効果的な投与量を
容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の医薬組成物の１日投与量は、対
象の体重のｋｇ当たり０．０００１ないし１００ｍｇ、０．００１ｍｇないし５０ｍｇ、
０．０１ｍｇないし２５ｍｇ、０．１ｍｇないし１０ｍｇ、１ｍｇないし５ｍｇ、または
それら内の範囲でありえる。本明細書において用語「薬学的有効量」とは、癌を予防また
は治療するのに十分な量を意味する。
【0113】
本発明の医薬組成物は、本開示が属する技術分野で当業者が容易に実施することができ
る方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化させること
により、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させて製造され得る
。このとき、該剤形は、油性または水性媒質内の溶液、懸濁液または乳化液の形態である
か、あるいはエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であ
り得、分散剤または安定化剤を追加して含むものでありえる。
る方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化させること
により、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させて製造され得る
。このとき、該剤形は、油性または水性媒質内の溶液、懸濁液または乳化液の形態である
か、あるいはエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であ
り得、分散剤または安定化剤を追加して含むものでありえる。
【0114】
本発明の組成物は、個別の治療剤として投与されるか、あるいは他の治療剤と併用して
投与され、既存の治療剤と順次または同時に投与されうる。
投与され、既存の治療剤と順次または同時に投与されうる。
【0115】
本開示による癌の予防用または改善用の健康機能食品において、前記抗体またはその抗
原結合断片を、健康機能食品の添加物として使用する場合、それらをそのまま添加するか
、あるいは他の食品または食品添加物と共に添加することができ、一般的な方法により、
適切に使用することができる。有効成分の混合量は、予防、健康または治療などの各使用
目的に応じて適切に決定されうる。
原結合断片を、健康機能食品の添加物として使用する場合、それらをそのまま添加するか
、あるいは他の食品または食品添加物と共に添加することができ、一般的な方法により、
適切に使用することができる。有効成分の混合量は、予防、健康または治療などの各使用
目的に応じて適切に決定されうる。
【0116】
健康機能食品の剤形は、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤の形態だけではなく、
一般の食品または飲料の形態のいずれも可能である。
一般の食品または飲料の形態のいずれも可能である。
【0117】
前記食品の種類には、特別に制限はなく、前記物質を添加することができる食品の例と
しては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、
ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、
飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、一般的な意味に
おける食品をいずれも含むものでありえる。
しては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、
ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、
飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、一般的な意味に
おける食品をいずれも含むものでありえる。
【0118】
一般的には、食品または飲料の製造時、前述の抗体またはその抗原結合断片は、原料１
００重量部につき、１５重量部以下、具体的には、１０重量部以下の量で添加することが
できる。しかしながら、健康及び衛生を目的とするか、あるいは健康調節を目的とする長
期間の摂取の場合には、前記量は、前述の範囲以下でもあり得、また本発明は、天然物か
らの分画物を利用する点において、安全性面において問題がないので、前述の範囲以上の
量でも使用することができる。
００重量部につき、１５重量部以下、具体的には、１０重量部以下の量で添加することが
できる。しかしながら、健康及び衛生を目的とするか、あるいは健康調節を目的とする長
期間の摂取の場合には、前記量は、前述の範囲以下でもあり得、また本発明は、天然物か
らの分画物を利用する点において、安全性面において問題がないので、前述の範囲以上の
量でも使用することができる。
【0119】
本発明による健康機能食品における飲料は、通常の飲料のように、さまざまな香味剤ま
たは天然炭水化物などを追加成分として含むものでありえる。前述の天然炭水化物は、ブ
ドウ糖、果糖のようなモノサッカリド；マルトース、スクロースのようなジサッカリド；
デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカリド；またはキシリトール、ソル
ビトール、エリトリトールのような糖アルコールでありえる。甘味剤としては、ソーマチ
ン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘
味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明による飲料１００
ｍＬ当たり、約０．０１～０．０４ｇ、具体的には、約０．０２～０．０３ｇでありえる
。
たは天然炭水化物などを追加成分として含むものでありえる。前述の天然炭水化物は、ブ
ドウ糖、果糖のようなモノサッカリド；マルトース、スクロースのようなジサッカリド；
デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカリド；またはキシリトール、ソル
ビトール、エリトリトールのような糖アルコールでありえる。甘味剤としては、ソーマチ
ン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘
味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明による飲料１００
ｍＬ当たり、約０．０１～０．０４ｇ、具体的には、約０．０２～０．０３ｇでありえる
。
【0120】
前述の成分以外に、本発明による癌の予防用または改善用の健康機能食品は、さまざま
な栄養物質、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及
びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン
、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤を含むものでありえる。それ以外に、本開
示の癌改善用組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のため
の果肉を含むものでありえる。そのような成分は、独立して、あるいは混合して使用され
うる。そのような添加剤の比率は、制限されるものではないが、本発明の健康機能食品１
００重量部対比で、０．０１～０．１重量部の範囲において選択されることが一般的であ
る。
な栄養物質、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及
びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン
、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤を含むものでありえる。それ以外に、本開
示の癌改善用組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のため
の果肉を含むものでありえる。そのような成分は、独立して、あるいは混合して使用され
うる。そのような添加剤の比率は、制限されるものではないが、本発明の健康機能食品１
００重量部対比で、０．０１～０．１重量部の範囲において選択されることが一般的であ
る。
【0121】
他の態様は、前述の抗体またはその抗原結合断片を含む癌診断用組成物、及びそれを含
む癌診断用キットを提供する。本開示は、また、本開示によるＣＤ７３に対する抗体また
はその抗原結合断片で処置することにより、癌を診断する方法に係わるものである。
む癌診断用キットを提供する。本開示は、また、本開示によるＣＤ７３に対する抗体また
はその抗原結合断片で処置することにより、癌を診断する方法に係わるものである。
【0122】
本開示によるＣＤ７３に対する抗体を介して、サンプルにおけるＣＤ７３発現レベルを
測定することにより、癌を診断することができる。該発現レベルは、一般的な免疫分析方
法によって測定することができ、前記ＣＤ７３に対する抗体を利用した放射能免疫分析、
放射能免疫沈澱、免疫沈澱、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorb
ent assay）、キャプチャＥＬＩＳＡ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ
、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、及び免疫親和性精製を介して測定することがで
きるが、それらに限定されるものではない。前記免疫アッセイ過程によりもたらされる最
終的なシグナルの強度を分析することにより、癌を診断することができる。すなわち、生
物学的試料において、本開示のマーカーの蛋白質が高発現され、シグナルが正常生物学的
試料（例えば、正常の胃組織、血液、血漿または血清）より強く示される場合には、癌と
診断される。
測定することにより、癌を診断することができる。該発現レベルは、一般的な免疫分析方
法によって測定することができ、前記ＣＤ７３に対する抗体を利用した放射能免疫分析、
放射能免疫沈澱、免疫沈澱、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorb
ent assay）、キャプチャＥＬＩＳＡ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ
、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、及び免疫親和性精製を介して測定することがで
きるが、それらに限定されるものではない。前記免疫アッセイ過程によりもたらされる最
終的なシグナルの強度を分析することにより、癌を診断することができる。すなわち、生
物学的試料において、本開示のマーカーの蛋白質が高発現され、シグナルが正常生物学的
試料（例えば、正常の胃組織、血液、血漿または血清）より強く示される場合には、癌と
診断される。
【0123】
他の態様は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットを提供する。前記キットは、本
開示によるＣＤ７３に対する抗体を含み、該試料と抗体が反応することによって示される
シグナルを分析して、癌を診断することができる。このとき、前記シグナルは、抗体に結
合された酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはシトクロムＰ４５０を含むものでもある
が、それに制限されるものではなく、このとき、酵素としてアルカリホスファターゼが利
用される場合には、基質として、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニ
トロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（naphth
ol-AS-B1-phosphate）及びＥＣＦ（enhanced chemifluorescence）のような発色反応基質
が利用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合には、クロロナフト
ール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン
（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウムニトレート）、レソルフィンベンジルエーテル、ルミ
ナル、アンプレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジ
ン）、ＨＹＲ（p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol）、ＴＭＢ（tetramethylbenz
idine）、ＡＢＴＳ（2,2’-azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]）、ｏ－フェニ
レンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼ、ｔ－ニト
ロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びｍ－ＰＭＳ（phenzaine methosulfate）のような
基質が利用されうるが、それらに制限されるものではない。
開示によるＣＤ７３に対する抗体を含み、該試料と抗体が反応することによって示される
シグナルを分析して、癌を診断することができる。このとき、前記シグナルは、抗体に結
合された酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはシトクロムＰ４５０を含むものでもある
が、それに制限されるものではなく、このとき、酵素としてアルカリホスファターゼが利
用される場合には、基質として、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニ
トロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（naphth
ol-AS-B1-phosphate）及びＥＣＦ（enhanced chemifluorescence）のような発色反応基質
が利用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合には、クロロナフト
ール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン
（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウムニトレート）、レソルフィンベンジルエーテル、ルミ
ナル、アンプレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジ
ン）、ＨＹＲ（p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol）、ＴＭＢ（tetramethylbenz
idine）、ＡＢＴＳ（2,2’-azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]）、ｏ－フェニ
レンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼ、ｔ－ニト
ロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びｍ－ＰＭＳ（phenzaine methosulfate）のような
基質が利用されうるが、それらに制限されるものではない。
【0124】
また、前記キットは、検出可能なシグナルを生じさせる標識を含み得、前記標識は、化
学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、
Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物
質、化学発光物質（chemiluminescent）及びＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy
transfer）を含み得るが、それらに限定されるものではない。癌診断のために使用される
酵素の活性測定またはシグナル測定は、当業界で知られる多様な方法によって実施され得
る。該測定を介して、ＣＤ７３発現を定性的または定量的に分析することができる。
学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、
Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物
質、化学発光物質（chemiluminescent）及びＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy
transfer）を含み得るが、それらに限定されるものではない。癌診断のために使用される
酵素の活性測定またはシグナル測定は、当業界で知られる多様な方法によって実施され得
る。該測定を介して、ＣＤ７３発現を定性的または定量的に分析することができる。
【0125】
以下、添付された図面に例示された実施形態を詳細に参照するが、全体を通じて、類似
の参照符号は類似した要素を示す。それと係わり、本実施形態は、異なる形態を有し得、
本明細書に記載された説明に限定されると解釈されるものではない。従って、以下、図面
を参照して、本開示の様態について説明するだけのために、実施形態について簡単に説明
する。本明細書で使用される用語「及び／または」とは、１以上の関連リスト項目の、任
意及び全ての組み合わせを含む。構成要素リストの前にある「少なくとも１以上」のよう
な表現は、構成要素リスト全体を修飾し、リストの個々の要素を修飾するものではない。
の参照符号は類似した要素を示す。それと係わり、本実施形態は、異なる形態を有し得、
本明細書に記載された説明に限定されると解釈されるものではない。従って、以下、図面
を参照して、本開示の様態について説明するだけのために、実施形態について簡単に説明
する。本明細書で使用される用語「及び／または」とは、１以上の関連リスト項目の、任
意及び全ての組み合わせを含む。構成要素リストの前にある「少なくとも１以上」のよう
な表現は、構成要素リスト全体を修飾し、リストの個々の要素を修飾するものではない。
【実施例0126】
以下、本開示の理解の一助とするために、典型的な実施形態を提示する。しかしながら
、下記の典型的な実施形態は、本開示をより容易に理解するために提供されるだけであり
、下記典型的な実施形態により本開示の内容が限定されるものではない。
、下記の典型的な実施形態は、本開示をより容易に理解するために提供されるだけであり
、下記典型的な実施形態により本開示の内容が限定されるものではない。
【0127】
［調製例１．バイオパニングによる抗ＣＤ７３抗体の選別］
【0128】
１－１．ＣＤ７３に特異的に結合するファージ抗体の選別
【0129】
ヒトとマウスとのＣＤ７３蛋白質に特異的に結合する抗体クローンを選別するために、
ＨｕＤＶＦａｂ－８Ｌファージ抗体ライブラリーを利用したバイオパニングを行った。ま
ず、組み換えヒトＣＤ７３蛋白質（Sino Biological、中国）及び組み換えマウスＣＤ７
３蛋白質（Sino Biological）を、それぞれDynabeads Ｍ－２８０ Tosylactivatedビーズ
で、４℃で４８時間反応させた。それぞれのＣＤ７３蛋白質が結合されたビーズを、Ｈｕ
ＤＶＦａｂ－８Ｌ（ＨｕＤＶＦａｂ－Ｌ１～Ｌ６，Ｌ８，Ｌ１２）組み換え抗体（ファー
ジ外被蛋白質pIIIにディスプレイされるＦａｂ）ライブラリーが含まれているブロッキン
グバッファ［blocking buffer：３％スキムミルク、０．１％ tween-20が含まれているリ
ン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate-buffered saline）］で処理し、４℃で１６時間
反応させた。その後、ＣＤ７３蛋白質に非特異的に結合している組み換えファージを、Ki
ngFisher ｍＬ装置を利用して除去した。ＣＤ７３蛋白質に特異的に結合するファージを
、０．２Ｍグリシン（glycine、ｐＨ２．２）バッファで処理して溶出させた後、１Ｍ tr
is-HCl（ｐＨ９．０）バッファで処理することにより中和させた。抗体ライブラリーの軽
鎖遺伝子が導入されたＴＧ１細胞（Amersham Pharmacia Biotech、スウェーデン）を、中
和されたファージで処理し、３７℃で１時間感染させた。ファージ感染されたＴＧ１細胞
をＬＢ／ＡＣＴ固体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ampicillin）、１０μｇ／ｍｌ
カルベニシリン（carbenicillin）、及び１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（tetracyclin
e）が含まれたＬＢ培地）上に塗抹し、２７℃で１６時間インキュベートし、非感染ＴＧ
１細胞を除去した。培養されたコロニーが含まれたプレートに１０ｍｌの液体培地を添加
した後、４．８×１０８細胞／ｍｌの濃度に懸濁及び希釈した。Ex-phageを添加し、３７
℃で１時間ＴＧ１細胞を感染させた。その後遠心分離機を使用して、感染されたＴＧ１細
胞を沈殿させ、上澄み液を除去した。５ｍｌの２×ＹＴ／ＡＣＴＫＡ培地（５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン（ampicillin）、１０μｇ／ｍｌカルベニシリン（carbenicillin）、１
０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（tetracycline）、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（kanamy
cin）、０．００１％アラビノース（arabinose）が含まれた２×ＹＴ培地）でＴＧ１細胞
を再懸濁し、２７℃で６時間インキュベートした。その後、遠心分離器を利用して、ファ
ージが含まれた上澄み液を確保し、ＣＤ７３蛋白質が結合されたDynabeads Ｍ－２８０ T
osylactivatedビーズと、４℃で約２０時間反応させた。その後、前記バイオパニング過
程を３回反復遂行し、ＣＤ７３に特異的に結合しているファージ抗体を選別した。その結
果、ＨｕＤＶＦａｂ－８Ｌファージ抗体ライブラリーから、Ｌ２，Ｌ４，Ｌ６，Ｌ８軽鎖
を含みＣＤ７３に結合するポリクローナル抗体が選別された。
ＨｕＤＶＦａｂ－８Ｌファージ抗体ライブラリーを利用したバイオパニングを行った。ま
ず、組み換えヒトＣＤ７３蛋白質（Sino Biological、中国）及び組み換えマウスＣＤ７
３蛋白質（Sino Biological）を、それぞれDynabeads Ｍ－２８０ Tosylactivatedビーズ
で、４℃で４８時間反応させた。それぞれのＣＤ７３蛋白質が結合されたビーズを、Ｈｕ
ＤＶＦａｂ－８Ｌ（ＨｕＤＶＦａｂ－Ｌ１～Ｌ６，Ｌ８，Ｌ１２）組み換え抗体（ファー
ジ外被蛋白質pIIIにディスプレイされるＦａｂ）ライブラリーが含まれているブロッキン
グバッファ［blocking buffer：３％スキムミルク、０．１％ tween-20が含まれているリ
ン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate-buffered saline）］で処理し、４℃で１６時間
反応させた。その後、ＣＤ７３蛋白質に非特異的に結合している組み換えファージを、Ki
ngFisher ｍＬ装置を利用して除去した。ＣＤ７３蛋白質に特異的に結合するファージを
、０．２Ｍグリシン（glycine、ｐＨ２．２）バッファで処理して溶出させた後、１Ｍ tr
is-HCl（ｐＨ９．０）バッファで処理することにより中和させた。抗体ライブラリーの軽
鎖遺伝子が導入されたＴＧ１細胞（Amersham Pharmacia Biotech、スウェーデン）を、中
和されたファージで処理し、３７℃で１時間感染させた。ファージ感染されたＴＧ１細胞
をＬＢ／ＡＣＴ固体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ampicillin）、１０μｇ／ｍｌ
カルベニシリン（carbenicillin）、及び１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（tetracyclin
e）が含まれたＬＢ培地）上に塗抹し、２７℃で１６時間インキュベートし、非感染ＴＧ
１細胞を除去した。培養されたコロニーが含まれたプレートに１０ｍｌの液体培地を添加
した後、４．８×１０８細胞／ｍｌの濃度に懸濁及び希釈した。Ex-phageを添加し、３７
℃で１時間ＴＧ１細胞を感染させた。その後遠心分離機を使用して、感染されたＴＧ１細
胞を沈殿させ、上澄み液を除去した。５ｍｌの２×ＹＴ／ＡＣＴＫＡ培地（５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン（ampicillin）、１０μｇ／ｍｌカルベニシリン（carbenicillin）、１
０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（tetracycline）、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（kanamy
cin）、０．００１％アラビノース（arabinose）が含まれた２×ＹＴ培地）でＴＧ１細胞
を再懸濁し、２７℃で６時間インキュベートした。その後、遠心分離器を利用して、ファ
ージが含まれた上澄み液を確保し、ＣＤ７３蛋白質が結合されたDynabeads Ｍ－２８０ T
osylactivatedビーズと、４℃で約２０時間反応させた。その後、前記バイオパニング過
程を３回反復遂行し、ＣＤ７３に特異的に結合しているファージ抗体を選別した。その結
果、ＨｕＤＶＦａｂ－８Ｌファージ抗体ライブラリーから、Ｌ２，Ｌ４，Ｌ６，Ｌ８軽鎖
を含みＣＤ７３に結合するポリクローナル抗体が選別された。
【0130】
１－２．ＣＤ７３に特異的に結合するモノクローナルファージ抗体の選別
【0131】
前述の１－２で選別されたポリクローナル抗体のうち、ＣＤ７３に特異的に結合しなが
ら、重鎖のＣＤＲ（ＨＣＤＲ）配列が互いに異なるモノクローナル抗体を、ファージＥＬ
ＩＳＡ（phage enzyme-linked immunosorbent assay）を遂行することにより選別した。
組み換えヒトＣＤ７３蛋白質と組み換えマウスＣＤ７３蛋白質とをコーティングバッファ
（coating buffer）（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に２μｇ／ｍｌ濃度に希釈
した後、９６ウェルMaxisorp ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に、ウェル
当たり５０μＬずつ分注し、４℃で１６時間反応させて、ＣＤ７３蛋白質をプレートにコ
ーティングした。コーティングされていない蛋白質とバッファは完全に除去し、ブロッキ
ングバッファを、ウェル当たり２００μＬずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。１時
間後、バッファを完全に除去し、０．１％ tween-20が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）バ
ッファを、全てのウェルに２００μＬずつ分注し、そのような洗浄過程を３回反復させた
。ファージが含まれた上澄み液をブロッキングバッファで１／１０に希釈し、各ウェルに
その５０μＬずつを分注し、３７℃で１時間反応させた。その後、前述のところと同じ方
法で洗浄を行い、ヤギ抗Ｍ１３ＨＲＰ（horseradish peroxidase）抗体（GE Healthcare
、シカゴ、イリノイ）で処理し、３７℃で１時間反応させた。前述のところと同じ方法で
洗浄した後、プレートの全てのウェルに、ＴＭＢ（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）
（BD Biosciences、Franklin Lakes、ニュージャージー）基質を５０μＬずつ分注した。
その後、Model 680 Microplate Reader（Bio-Rad Laboratories、Hercules、カルフォル
ニア）装置で、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定して、ＣＤ７３に特異的なモノクロ
ーナルファージ抗体１４種を選別した。
ら、重鎖のＣＤＲ（ＨＣＤＲ）配列が互いに異なるモノクローナル抗体を、ファージＥＬ
ＩＳＡ（phage enzyme-linked immunosorbent assay）を遂行することにより選別した。
組み換えヒトＣＤ７３蛋白質と組み換えマウスＣＤ７３蛋白質とをコーティングバッファ
（coating buffer）（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に２μｇ／ｍｌ濃度に希釈
した後、９６ウェルMaxisorp ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に、ウェル
当たり５０μＬずつ分注し、４℃で１６時間反応させて、ＣＤ７３蛋白質をプレートにコ
ーティングした。コーティングされていない蛋白質とバッファは完全に除去し、ブロッキ
ングバッファを、ウェル当たり２００μＬずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。１時
間後、バッファを完全に除去し、０．１％ tween-20が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）バ
ッファを、全てのウェルに２００μＬずつ分注し、そのような洗浄過程を３回反復させた
。ファージが含まれた上澄み液をブロッキングバッファで１／１０に希釈し、各ウェルに
その５０μＬずつを分注し、３７℃で１時間反応させた。その後、前述のところと同じ方
法で洗浄を行い、ヤギ抗Ｍ１３ＨＲＰ（horseradish peroxidase）抗体（GE Healthcare
、シカゴ、イリノイ）で処理し、３７℃で１時間反応させた。前述のところと同じ方法で
洗浄した後、プレートの全てのウェルに、ＴＭＢ（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）
（BD Biosciences、Franklin Lakes、ニュージャージー）基質を５０μＬずつ分注した。
その後、Model 680 Microplate Reader（Bio-Rad Laboratories、Hercules、カルフォル
ニア）装置で、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定して、ＣＤ７３に特異的なモノクロ
ーナルファージ抗体１４種を選別した。
【0132】
図１は、バイオパニングを介して選別された抗ＣＤ７３抗体のＣＤ７３結合能力を示す
グラフである。
図１に示されているように、Ｌ２－２０を除く全てのファージ抗体が、ヒトＣＤ７３に
結合した。また、Ｌ２－４７，Ｌ４－６６，Ｌ６－１，Ｌ６－３０，Ｌ６－３７ファージ
抗体は、ヒトＣＤ７３に対する結合能力の５０％以上に該当する結合能力で、マウスＣＤ
７３に結合した。Ｌ８－３４ファージ抗体は、ＣＤ７３ではなくＣＤ３２Ｂ蛋白質に非特
異的に結合した。異なるＨＣＤＲ配列を有する１４種の抗体のうち、ヒトＣＤ７３に対し
て結合が弱いＬ２－２０及び非特異的結合を示したＬ８－３４を除いた１２種の抗ＣＤ７
３ファージ抗体が、その後の実験に使用された。
グラフである。
図１に示されているように、Ｌ２－２０を除く全てのファージ抗体が、ヒトＣＤ７３に
結合した。また、Ｌ２－４７，Ｌ４－６６，Ｌ６－１，Ｌ６－３０，Ｌ６－３７ファージ
抗体は、ヒトＣＤ７３に対する結合能力の５０％以上に該当する結合能力で、マウスＣＤ
７３に結合した。Ｌ８－３４ファージ抗体は、ＣＤ７３ではなくＣＤ３２Ｂ蛋白質に非特
異的に結合した。異なるＨＣＤＲ配列を有する１４種の抗体のうち、ヒトＣＤ７３に対し
て結合が弱いＬ２－２０及び非特異的結合を示したＬ８－３４を除いた１２種の抗ＣＤ７
３ファージ抗体が、その後の実験に使用された。
【0133】
［調製例２．ヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体の生産及び選別］
【0134】
２－１．抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１アイソタイプ発現ベクターの調製
【0135】
前述の調製例１で選別された１２種の抗ＣＤ７３ファージ抗体をクローニングして、ヒ
トＩｇＧ１抗体を調製した。具体的には、前述の調製例１において選別されたファージ抗
体のＶＬ（軽鎖可変領域）遺伝子配列とＶＨ（重鎖可変領域）遺伝子配列とを、ヒトＩｇ
Ｇ１（immunoglobulin G1）アイソタイプのＣＬ（軽鎖定常領域）遺伝子配列とＣＨ１－
ＣＨ２－ＣＨ３（重鎖定常領域（constant heavy chain）、軽鎖定常領域）遺伝子配列と
を含むｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ発現ベクター（江原大学のHyo Jeong Hong教授提供）にクロ
ーニングし、それによって完全なＩｇＧ１形態を調製した（図２Ａ）。ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）は、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（Takara
、日本）及びＴ１００サーマルサイクラー（thermal cycler）を使用して行った。前述の
調製例１で選別されたファージ抗体の各軽鎖配列をクローニングするために、下記表１の
配列番号４７、配列番号４８を利用し、９４℃ ３０秒、５８℃ ３０秒、７２℃２０秒の
条件でＰＣＲ反応を行い、軽鎖リーダー配列（leader sequence）を増幅させた。前述の
調製例１で選別されたファージ抗体のＶＬ遺伝子から、配列番号４９、配列番号５０を利
用してＰＣＲ反応を行うことにより、ＶＬ配列の各遺伝子を増幅させた。増幅された２つ
のＰＣＲ生成物を、９４℃ ３０秒、５８℃３０秒、７２℃ ６０秒の条件で、アセンブリ
ーポリメラーゼ連鎖反応（assembly PCR）で融合した。その後、前記ＰＣＲ生成物とｐｄ
ＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターとを、３７℃と５５℃とにおいて、HindIII及びBsiWI（Takara
）制限酵素でそれぞれ処理して、互いに反応させた。２つの制限酵素で処理されたリーダ
ー配列ＶＬ遺伝子断片とｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターとを、T4DNA Ligaseを利用してラ
イゲーションし、ヒートショックによりＣａＣｌ２処理コンピテント細胞（competent ce
ll）に形質転換した。次に、前述の調製例１で選別されたファージ抗体の重鎖配列をクロ
ーニングするために、配列番号５１、配列番号５２を利用して、EcoRI配列が含まれた重
鎖リーダー配列をＰＣＲ反応で増幅させた。配列番号５３、配列番号５４を利用して、Ap
aI配列が含まれたＶＨ配列の各遺伝子をＰＣＲ反応で増幅させた。増幅された２つのＰＣ
Ｒ生成物を、アセンブリーＰＣＲ反応を介して融合し（リーダー－配列ＶＨ）、EcoRI制
限酵素とApaI制限酵素とで処理した。前述のところと同じ方法によって、制限酵素で処理
されたリーダー配列－ＶＨ遺伝子断片をｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターにクローニングし
、そこに軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）遺伝子とＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３遺伝子とを挿入して、ヒト
ＩｇＧ１発現ベクターを調製した。
トＩｇＧ１抗体を調製した。具体的には、前述の調製例１において選別されたファージ抗
体のＶＬ（軽鎖可変領域）遺伝子配列とＶＨ（重鎖可変領域）遺伝子配列とを、ヒトＩｇ
Ｇ１（immunoglobulin G1）アイソタイプのＣＬ（軽鎖定常領域）遺伝子配列とＣＨ１－
ＣＨ２－ＣＨ３（重鎖定常領域（constant heavy chain）、軽鎖定常領域）遺伝子配列と
を含むｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ発現ベクター（江原大学のHyo Jeong Hong教授提供）にクロ
ーニングし、それによって完全なＩｇＧ１形態を調製した（図２Ａ）。ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）は、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（Takara
、日本）及びＴ１００サーマルサイクラー（thermal cycler）を使用して行った。前述の
調製例１で選別されたファージ抗体の各軽鎖配列をクローニングするために、下記表１の
配列番号４７、配列番号４８を利用し、９４℃ ３０秒、５８℃ ３０秒、７２℃２０秒の
条件でＰＣＲ反応を行い、軽鎖リーダー配列（leader sequence）を増幅させた。前述の
調製例１で選別されたファージ抗体のＶＬ遺伝子から、配列番号４９、配列番号５０を利
用してＰＣＲ反応を行うことにより、ＶＬ配列の各遺伝子を増幅させた。増幅された２つ
のＰＣＲ生成物を、９４℃ ３０秒、５８℃３０秒、７２℃ ６０秒の条件で、アセンブリ
ーポリメラーゼ連鎖反応（assembly PCR）で融合した。その後、前記ＰＣＲ生成物とｐｄ
ＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターとを、３７℃と５５℃とにおいて、HindIII及びBsiWI（Takara
）制限酵素でそれぞれ処理して、互いに反応させた。２つの制限酵素で処理されたリーダ
ー配列ＶＬ遺伝子断片とｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターとを、T4DNA Ligaseを利用してラ
イゲーションし、ヒートショックによりＣａＣｌ２処理コンピテント細胞（competent ce
ll）に形質転換した。次に、前述の調製例１で選別されたファージ抗体の重鎖配列をクロ
ーニングするために、配列番号５１、配列番号５２を利用して、EcoRI配列が含まれた重
鎖リーダー配列をＰＣＲ反応で増幅させた。配列番号５３、配列番号５４を利用して、Ap
aI配列が含まれたＶＨ配列の各遺伝子をＰＣＲ反応で増幅させた。増幅された２つのＰＣ
Ｒ生成物を、アセンブリーＰＣＲ反応を介して融合し（リーダー－配列ＶＨ）、EcoRI制
限酵素とApaI制限酵素とで処理した。前述のところと同じ方法によって、制限酵素で処理
されたリーダー配列－ＶＨ遺伝子断片をｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターにクローニングし
、そこに軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）遺伝子とＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３遺伝子とを挿入して、ヒト
ＩｇＧ１発現ベクターを調製した。
【0136】
なお、陽性対照群として使用されたＣＰＩ－００６（Corvus Pharmaceuticals、Burlin
game、ＣＡ）とＭＥＤＩ９４４７（MedImmune、Gaithersburg、ＭＤ）の重鎖遺伝子、軽
鎖遺伝子（ＷＯ２０１８／０１３６１１、ＷＯ２０１６／０７５０９９）は、Cosmogenet
ech co, Ltdで合成し、軽鎖制限酵素としてHindIII（Takara）及びXbaI（Takara）、並び
に重鎖制限酵素としてEcoRI（Takara）とNotI（Takara）とを使用して、前述のところと
同じ方法で、ｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターにクローニングした。
game、ＣＡ）とＭＥＤＩ９４４７（MedImmune、Gaithersburg、ＭＤ）の重鎖遺伝子、軽
鎖遺伝子（ＷＯ２０１８／０１３６１１、ＷＯ２０１６／０７５０９９）は、Cosmogenet
ech co, Ltdで合成し、軽鎖制限酵素としてHindIII（Takara）及びXbaI（Takara）、並び
に重鎖制限酵素としてEcoRI（Takara）とNotI（Takara）とを使用して、前述のところと
同じ方法で、ｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターにクローニングした。
【表1】
【0137】
２－２．抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体の生産及び精製
【0138】
選別された１２種の抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１抗体を生産するために、前記２－１でクロ
ーニングされたｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）（Gibco
）細胞にトラスフェクトした。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞は、Ｅｘｐ
ｉＣＨＯ－Ｓ（商標）発現培地（Gibco、ThermoFisher Scientific）を使用して、３７℃
、１４０ｒｐｍ、湿度８０％、ＣＯ２ ５％条件の振盪培養器（shaking incubator）にお
いてインキュベートした。少なくとも３回継代培養されたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細
胞に、選別された１２種の抗体遺伝子が挿入されたベクターを、ExpiFectamine CHO Tran
sfectionキットとＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（１ｘ）（Gibco）とを利用してトラス
フェクトした。その後、前述のところと同一条件の振盪培養器で２０時間インキュベート
した。インキュベートされた細胞を、ExpiFectamine（商標）ＣＨＯフィード（feed）と
エンハンサ（enhancer）とで処理し、７日間、前述のところと同一条件でインキュベート
した。培養液を回収し、４，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離し、蛋白質試料が含
まれている上澄み液を確保した。該上澄み液を０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去
した。その後、ＣＨＯ細胞から生産された抗体試料を、親和性クロマトグラフィで精製し
た。具体的には、CaptureSelect IgG-CH1 Affinity Matrixレジンを、不純物が除去され
た培養液と４℃で１６時間反応させて、培養液中の抗体試料をレジンに結合させた。反応
させたレジンを、１０カラム体積（ＣＶ：column volume）のＴＢＳバッファ（ｐＨ７．
４）で洗浄し、１００ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３．０）を流して抗体試料を溶出し、
１ＭのTris－HClバッファ（ｐＨ９．０）を添加することにより弱酸性（ｐＨ６．０～６
．５）に中和させた。中和されたバッファを、０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去
した後、蛋白質をＵＶ２８０ｎｍ波長において定量分析した。
ーニングされたｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）（Gibco
）細胞にトラスフェクトした。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞は、Ｅｘｐ
ｉＣＨＯ－Ｓ（商標）発現培地（Gibco、ThermoFisher Scientific）を使用して、３７℃
、１４０ｒｐｍ、湿度８０％、ＣＯ２ ５％条件の振盪培養器（shaking incubator）にお
いてインキュベートした。少なくとも３回継代培養されたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細
胞に、選別された１２種の抗体遺伝子が挿入されたベクターを、ExpiFectamine CHO Tran
sfectionキットとＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（１ｘ）（Gibco）とを利用してトラス
フェクトした。その後、前述のところと同一条件の振盪培養器で２０時間インキュベート
した。インキュベートされた細胞を、ExpiFectamine（商標）ＣＨＯフィード（feed）と
エンハンサ（enhancer）とで処理し、７日間、前述のところと同一条件でインキュベート
した。培養液を回収し、４，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離し、蛋白質試料が含
まれている上澄み液を確保した。該上澄み液を０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去
した。その後、ＣＨＯ細胞から生産された抗体試料を、親和性クロマトグラフィで精製し
た。具体的には、CaptureSelect IgG-CH1 Affinity Matrixレジンを、不純物が除去され
た培養液と４℃で１６時間反応させて、培養液中の抗体試料をレジンに結合させた。反応
させたレジンを、１０カラム体積（ＣＶ：column volume）のＴＢＳバッファ（ｐＨ７．
４）で洗浄し、１００ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３．０）を流して抗体試料を溶出し、
１ＭのTris－HClバッファ（ｐＨ９．０）を添加することにより弱酸性（ｐＨ６．０～６
．５）に中和させた。中和されたバッファを、０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去
した後、蛋白質をＵＶ２８０ｎｍ波長において定量分析した。
【0139】
２－３．抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体蛋白質のサイズ分析
【0140】
前述の２－２で生産及び精製された抗体蛋白質のサイズを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し
た。まず、抗体蛋白質を、２－メルカプトエタノールが含まれたPierce（商標）ＬＤＳサ
ンプルバッファと非還元バッファ（４ｘ；ThermoFisher Scientific）で希釈した後、５
分間試料を加熱した。その後、蛋白質試料を、４～１５％ Mini-PROTEAN（登録商標）TGX
（商標）Precast Protein Gel gradient（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、ウェル当たり１μｇずつ
ローディングした後、PowerPac（商標）Basic Power Supplyを利用し、１４０Ｖで４０分
間電気泳動した。電気泳動が完了したゲルを、Brilliant Blue R 250蛋白質染色溶液（EL
PISBIO、大韓民国）で６０分間反応させた後、脱染色バッファ［３０％メタノール、１０
％酢酸］で処理し、蛋白質バンドを観察した。
た。まず、抗体蛋白質を、２－メルカプトエタノールが含まれたPierce（商標）ＬＤＳサ
ンプルバッファと非還元バッファ（４ｘ；ThermoFisher Scientific）で希釈した後、５
分間試料を加熱した。その後、蛋白質試料を、４～１５％ Mini-PROTEAN（登録商標）TGX
（商標）Precast Protein Gel gradient（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、ウェル当たり１μｇずつ
ローディングした後、PowerPac（商標）Basic Power Supplyを利用し、１４０Ｖで４０分
間電気泳動した。電気泳動が完了したゲルを、Brilliant Blue R 250蛋白質染色溶液（EL
PISBIO、大韓民国）で６０分間反応させた後、脱染色バッファ［３０％メタノール、１０
％酢酸］で処理し、蛋白質バンドを観察した。
【0141】
図２Ｂは、ヒトＩｇＧ１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す。
図２Ｂに示されているように、１２種の精製された抗体の重鎖と軽鎖は、それぞれ５０
ｋＤａ及び２５ｋＤａの大きさを示し、前記蛋白質バンドは、いずれも理論的サイズに相
当する位置で観察された。
図２Ｂに示されているように、１２種の精製された抗体の重鎖と軽鎖は、それぞれ５０
ｋＤａ及び２５ｋＤａの大きさを示し、前記蛋白質バンドは、いずれも理論的サイズに相
当する位置で観察された。
【0142】
２－３．抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＣＤ７３結合能力の確認
【0143】
前述の２－２で生産及び精製された１２種のヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体のＣＤ７３
結合能力を比較するために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。組み換えヒトＣＤ７３蛋白質を、
カボネートコーティングバッファで１μｇ／ｍｌの濃度に希釈した後、９６ウェルMaxiso
rp ＥＬＩＳＡプレートに、ウェル当たり１００μＬずつ分注し、４℃で１６時間コーテ
ィングした。コーティングされていない蛋白質とバッファを完全に除去し、３％ ＢＳＡ
と０．１％tween-20とが含まれたＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）を、ウェル当たり３００
μＬずつ分注した後、常温で２時間反応させ、ブロッキングを行った。２時間後、残って
いるバッファを除去し、ＰＢＳ－Ｔバッファを、全てのウェルに３００μＬずつ分注した
後、除去する過程を３回反復して洗浄を行った。抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体をＰＢＳバッ
ファで１００ｎＭの濃度に順次に希釈し、添加して３７℃で１時間反応させた。洗浄後、
ロバ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Baltimore Pi
ke）を添加し、３７℃で１時間反応させた。前述の方法と同一の洗浄過程を遂行した後、
ＴＭＢ基質を、全てのウェルに１００μＬずつ分注し、７分間反応させた。Model 680 Mi
croplate Readerで、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定した。陰性対照（リツキシマ
ブ）試料及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）試料についても、前述のと
ころと同じ方法で吸光度を測定した。
結合能力を比較するために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。組み換えヒトＣＤ７３蛋白質を、
カボネートコーティングバッファで１μｇ／ｍｌの濃度に希釈した後、９６ウェルMaxiso
rp ＥＬＩＳＡプレートに、ウェル当たり１００μＬずつ分注し、４℃で１６時間コーテ
ィングした。コーティングされていない蛋白質とバッファを完全に除去し、３％ ＢＳＡ
と０．１％tween-20とが含まれたＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）を、ウェル当たり３００
μＬずつ分注した後、常温で２時間反応させ、ブロッキングを行った。２時間後、残って
いるバッファを除去し、ＰＢＳ－Ｔバッファを、全てのウェルに３００μＬずつ分注した
後、除去する過程を３回反復して洗浄を行った。抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体をＰＢＳバッ
ファで１００ｎＭの濃度に順次に希釈し、添加して３７℃で１時間反応させた。洗浄後、
ロバ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Baltimore Pi
ke）を添加し、３７℃で１時間反応させた。前述の方法と同一の洗浄過程を遂行した後、
ＴＭＢ基質を、全てのウェルに１００μＬずつ分注し、７分間反応させた。Model 680 Mi
croplate Readerで、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定した。陰性対照（リツキシマ
ブ）試料及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）試料についても、前述のと
ころと同じ方法で吸光度を測定した。
【0144】
図３Ａは、精製された１２種のヒト抗ＣＤＩｇＧ１抗体のヒトＣＤ７３結合能力を示す
グラフである。
図３Ａに示されているように、精製された１２種の抗体のうち９種と、２つの陽性対照
群は、ＢＳＡに比べて、ヒトＣＤ７３に顕著に強く結合し、残り３種の抗体（Ｌ４－４６
、Ｌ６－７及びＬ６－３７）は、相対的に弱く結合した。また、陰性対照（リツキシマブ
ＩｇＧ１）抗体は、ヒトＣＤ７３に結合しなかった。
グラフである。
図３Ａに示されているように、精製された１２種の抗体のうち９種と、２つの陽性対照
群は、ＢＳＡに比べて、ヒトＣＤ７３に顕著に強く結合し、残り３種の抗体（Ｌ４－４６
、Ｌ６－７及びＬ６－３７）は、相対的に弱く結合した。また、陰性対照（リツキシマブ
ＩｇＧ１）抗体は、ヒトＣＤ７３に結合しなかった。
【0145】
２－４．膜ＣＤ７３蛋白質の酵素活性の確認
【0146】
前述の２－２で生産及び精製された１２種のヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体の膜ＣＤ７
３酵素活性の阻害能を比較するために、細胞表面に膜ＣＤ７３を発現するＭＤＡ－ＭＢ－
２３１細胞（韓国細胞株バンク）でマラカイトグリーンアッセイを行った。ＭＤＡ－ＭＢ
－２３１細胞を、２．０×１０４細胞／ウェルの濃度になるように９６ウェルフラットプ
レートに分注し、３７℃、５％ ＣＯ２条件のインキュベータで２０時間インキュベート
した。インキュベーション後アッセイバッファで２回ずつ洗浄を行い、１２種のヒト抗Ｃ
Ｄ７３ ＩｇＧ１抗体試料を５００ｎＭ濃度でアッセイバッファに希釈した後に各ウェル
に添加し、３７℃で１時間反応させた。その後、２５０μＭのＡＭＰを各ウェルに添加し
、３７℃で２０分間反応させた。細胞を除いた４０μＬの上澄み液を、新たな９６ウェル
プレートに分注した。ＣＤ７３の酵素活性を測定するために、Malachite Green Phosphat
e Detection Kitを使用して、上澄み液に含まれたホスフェートを検出し、Epoch Micropl
ate Spectrophotometer装備で、６２０ｎｍの波長における吸光度を測定した。陰性対照
（リツキシマブ）試料及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）試料について
も、前述のところと同じ方法で吸光度を測定した。
３酵素活性の阻害能を比較するために、細胞表面に膜ＣＤ７３を発現するＭＤＡ－ＭＢ－
２３１細胞（韓国細胞株バンク）でマラカイトグリーンアッセイを行った。ＭＤＡ－ＭＢ
－２３１細胞を、２．０×１０４細胞／ウェルの濃度になるように９６ウェルフラットプ
レートに分注し、３７℃、５％ ＣＯ２条件のインキュベータで２０時間インキュベート
した。インキュベーション後アッセイバッファで２回ずつ洗浄を行い、１２種のヒト抗Ｃ
Ｄ７３ ＩｇＧ１抗体試料を５００ｎＭ濃度でアッセイバッファに希釈した後に各ウェル
に添加し、３７℃で１時間反応させた。その後、２５０μＭのＡＭＰを各ウェルに添加し
、３７℃で２０分間反応させた。細胞を除いた４０μＬの上澄み液を、新たな９６ウェル
プレートに分注した。ＣＤ７３の酵素活性を測定するために、Malachite Green Phosphat
e Detection Kitを使用して、上澄み液に含まれたホスフェートを検出し、Epoch Micropl
ate Spectrophotometer装備で、６２０ｎｍの波長における吸光度を測定した。陰性対照
（リツキシマブ）試料及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）試料について
も、前述のところと同じ方法で吸光度を測定した。
【0147】
図３Ｂは、精製された１２種のヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１アイソタイプ抗体が、ＣＤ７
３酵素活性を阻害するか否かということを調べた結果である。
図３Ｂに示されているように、１２種の抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１抗体のうち５種の抗体
（Ｌ２－３、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４－６６及びＬ６－１）は、陰性対照と比較して５
０％以上のＣＤ７３酵素活性阻害能を示し、そのうちＬ６－１抗体は、９０％以上のＣＤ
７３酵素活性の阻害を示し、ＣＰＩ－００６（９１％）と類似した高い阻害能を示した。
残り４種の抗体（Ｌ２－３、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４－６６）は、順に６３％、６１％
、５８％、５０％のＣＤ７３酵素活性阻害を示し、ＭＥＤＩ９４４７（３４％）と同様ま
たはそれ以上の阻害能を示した。
３酵素活性を阻害するか否かということを調べた結果である。
図３Ｂに示されているように、１２種の抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１抗体のうち５種の抗体
（Ｌ２－３、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４－６６及びＬ６－１）は、陰性対照と比較して５
０％以上のＣＤ７３酵素活性阻害能を示し、そのうちＬ６－１抗体は、９０％以上のＣＤ
７３酵素活性の阻害を示し、ＣＰＩ－００６（９１％）と類似した高い阻害能を示した。
残り４種の抗体（Ｌ２－３、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４－６６）は、順に６３％、６１％
、５８％、５０％のＣＤ７３酵素活性阻害を示し、ＭＥＤＩ９４４７（３４％）と同様ま
たはそれ以上の阻害能を示した。
【0148】
２－５．抗ＣＤ７３ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＣＤ７３交差結合能力の確認
【0149】
前述の２－３において、陽性対照群と同様またはそれ以上に高いＣＤ７３酵素活性阻害
能を示した５種のヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体（Ｌ２－３、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４
－６６、Ｌ６－１）の、ヒト、猿、ラット及びマウスのＣＤ７３蛋白質（Sino Biologica
l）に対する交差結合能力を比較するために、前述の２－３と同じ方法でＥＬＩＳＡ実験
を行った。
能を示した５種のヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体（Ｌ２－３、Ｌ４－４、Ｌ４－５、Ｌ４
－６６、Ｌ６－１）の、ヒト、猿、ラット及びマウスのＣＤ７３蛋白質（Sino Biologica
l）に対する交差結合能力を比較するために、前述の２－３と同じ方法でＥＬＩＳＡ実験
を行った。
【0150】
図３Ｃは、ヒト、猿、ラット及びマウスのＣＤ７３に対する交差結合能力を分析した結
果を示す。
図３Ｃは、Ｌ４－６６，Ｌ６－１抗体とＭＥＤＩ９４４７抗体は、ヒト、猿、ラット及
びマウスのＣＤ７３にいずれとも反応したが、Ｌ２－３，Ｌ４－５抗体とＣＰＩ－００６
抗体は、ヒトＣＤ７３と猿ＣＤ７３にだけ反応し、Ｌ４－４抗体は、ヒトＣＤ７３、猿Ｃ
Ｄ７３及びラットＣＤ７３にだけ反応した。従って互いに異なる結合パターンを示した。
以上の結果を基に、ＭＥＤＩ９４４７抗体と同様にヒトＣＤ７３とマウスＣＤ７３に交差
結合する２種の抗体（Ｌ４－６６、Ｌ６－１）を選別し、それぞれＡＰＢＡ２－０１及び
とＡＰＢＡ２－０２と命名した。
果を示す。
図３Ｃは、Ｌ４－６６，Ｌ６－１抗体とＭＥＤＩ９４４７抗体は、ヒト、猿、ラット及
びマウスのＣＤ７３にいずれとも反応したが、Ｌ２－３，Ｌ４－５抗体とＣＰＩ－００６
抗体は、ヒトＣＤ７３と猿ＣＤ７３にだけ反応し、Ｌ４－４抗体は、ヒトＣＤ７３、猿Ｃ
Ｄ７３及びラットＣＤ７３にだけ反応した。従って互いに異なる結合パターンを示した。
以上の結果を基に、ＭＥＤＩ９４４７抗体と同様にヒトＣＤ７３とマウスＣＤ７３に交差
結合する２種の抗体（Ｌ４－６６、Ｌ６－１）を選別し、それぞれＡＰＢＡ２－０１及び
とＡＰＢＡ２－０２と命名した。
【0151】
［調製例３．ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体の調製］
【0152】
３－１．ＡＰＢＡ２－０１モノクローナル抗体及びＡＰＢＡ２－０２モノクローナル抗体
の調製
の調製
【0153】
前述の調製例２－５で選別されたＡＰＢＡ２－０１モノクローナルＩｇＧ抗体及びＡＰ
ＢＡ２－０２モノクローナルＩｇＧ抗体を発現する安定した細胞プール（cell pool）を
生産した。まず、ＡＰＢＡ２－０１モノクローナル抗体及びＡＰＢＡ２－０２モノクロー
ナル抗体の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子とを、それぞれ、ｐＤ２５３９とｐＤ２５３５ｎｔ（
Horizon Discovery、イギリス）のベクターにクローニングした。ＡＰＢＡ２－０１抗体
及びＡＰＢＡ２－０２抗体のＶＬ，ＶＨ遺伝子と、ヒトＩｇＧアイソタイプのＣＬ，ＣＨ
遺伝子を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Chinese hamster ovary）細胞のため
に最適化されたコドン配列で合成した。合成されたＡＰＢＡ２－０１抗体の軽鎖遺伝子を
、Ｂｂｓ１（ThermoFisher Scientific）制限酵素とＢｓｒＧ１（ThermoFisher Scientif
ic）制限酵素とで処理し、同一制限酵素で処理されたｐＤ２５３９ベクターにライゲーシ
ョンした。合成されたＡＰＢＡ２－０１抗体のＶＨ遺伝子は、表１の配列番号５１、及び
表２の配列番号５５を利用したＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのＣＨ遺伝子は、下記表２の
配列番号５６、配列番号５７を利用したＰＣＲで増幅した。増幅された２つのＰＣＲ生成
物を、アセンブリーＰＣＲを介して融合した。融合された重鎖遺伝子とｐＤ２５３５ｎｔ
ベクターとをＢｂｓ１制限酵素で処理して反応させた。合成されたＡＰＢＡ２－０２抗体
のＶＬ遺伝子は、表１の配列番号４７及び表２の配列番号５８を利用したＰＣＲで増幅し
、ヒトＩｇＧのＣＬ遺伝子は、下記表２の配列番号５９、配列番号６０を利用したＰＣＲ
で増幅した。ＡＰＢＡ２－０２抗体のＶＨは、表１の配列番号５１及び表２の配列番号６
１を利用したＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのＣＨ遺伝子は、下記表２の配列番号５７、配
列番号６２を利用したＰＣＲで増幅した。それぞれの増幅された２つのＰＣＲ生成物を、
アセンブリーＰＣＲ反応を介して融合した。その後、前述のところと同じ方法でクローニ
ングを。
ＢＡ２－０２モノクローナルＩｇＧ抗体を発現する安定した細胞プール（cell pool）を
生産した。まず、ＡＰＢＡ２－０１モノクローナル抗体及びＡＰＢＡ２－０２モノクロー
ナル抗体の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子とを、それぞれ、ｐＤ２５３９とｐＤ２５３５ｎｔ（
Horizon Discovery、イギリス）のベクターにクローニングした。ＡＰＢＡ２－０１抗体
及びＡＰＢＡ２－０２抗体のＶＬ，ＶＨ遺伝子と、ヒトＩｇＧアイソタイプのＣＬ，ＣＨ
遺伝子を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Chinese hamster ovary）細胞のため
に最適化されたコドン配列で合成した。合成されたＡＰＢＡ２－０１抗体の軽鎖遺伝子を
、Ｂｂｓ１（ThermoFisher Scientific）制限酵素とＢｓｒＧ１（ThermoFisher Scientif
ic）制限酵素とで処理し、同一制限酵素で処理されたｐＤ２５３９ベクターにライゲーシ
ョンした。合成されたＡＰＢＡ２－０１抗体のＶＨ遺伝子は、表１の配列番号５１、及び
表２の配列番号５５を利用したＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのＣＨ遺伝子は、下記表２の
配列番号５６、配列番号５７を利用したＰＣＲで増幅した。増幅された２つのＰＣＲ生成
物を、アセンブリーＰＣＲを介して融合した。融合された重鎖遺伝子とｐＤ２５３５ｎｔ
ベクターとをＢｂｓ１制限酵素で処理して反応させた。合成されたＡＰＢＡ２－０２抗体
のＶＬ遺伝子は、表１の配列番号４７及び表２の配列番号５８を利用したＰＣＲで増幅し
、ヒトＩｇＧのＣＬ遺伝子は、下記表２の配列番号５９、配列番号６０を利用したＰＣＲ
で増幅した。ＡＰＢＡ２－０２抗体のＶＨは、表１の配列番号５１及び表２の配列番号６
１を利用したＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのＣＨ遺伝子は、下記表２の配列番号５７、配
列番号６２を利用したＰＣＲで増幅した。それぞれの増幅された２つのＰＣＲ生成物を、
アセンブリーＰＣＲ反応を介して融合した。その後、前述のところと同じ方法でクローニ
ングを。
【表2】
【0154】
３－２．ＡＰＢＡ２－０１キメラ抗体及びＡＰＢＡ２－０２キメラ抗体の調製
【0155】
ＡＰＢＡ２－０１抗体とＡＰＢＡ２－０２抗体とを、ヒトＶＬ遺伝子配列及びヒトＶＨ
遺伝子配列、並びにマウス抗体配列のＣＬ配列及びＣＨ配列を有したヒト・マウスＩｇＧ
１キメラ抗体配列及びＩｇＧ２Ａキメラ抗体配列として調製した。合成されたＡＰＢＡ２
－０１とＡＰＢＡ２－０２のヒトＶＬ・マウスＣＬキメラ抗体遺伝子断片を、ｐＤ２５３
９ベクターに、前記３－１と同じ方法で挿入してクローニングした。合成されたマウスＩ
ｇＧ１とマウスＩｇＧ２ＡとのＣＨ遺伝子は、それぞれ配列番号６３、配列番号６４、配
列番号６４及び配列番号６５を利用したＰＣＲで増幅した。その後、前記３－１と同じ方
法で、ＡＰＢＡ２－０１抗体のＶＨ遺伝子とアセンブリーＰＣＲ反応により融合させた。
融合されたＡＰＢＡ２－０１抗体遺伝子と合成されたＡＰＢＡ２－０２抗体のＶＨ マウ
スＩｇＧ１遺伝子切片及びマウスＩｇＧ２Ａ遺伝子断片を、ｐＤ２５３５ｎｔベクターに
、前述のところと同じ方法でクローニングした。
遺伝子配列、並びにマウス抗体配列のＣＬ配列及びＣＨ配列を有したヒト・マウスＩｇＧ
１キメラ抗体配列及びＩｇＧ２Ａキメラ抗体配列として調製した。合成されたＡＰＢＡ２
－０１とＡＰＢＡ２－０２のヒトＶＬ・マウスＣＬキメラ抗体遺伝子断片を、ｐＤ２５３
９ベクターに、前記３－１と同じ方法で挿入してクローニングした。合成されたマウスＩ
ｇＧ１とマウスＩｇＧ２ＡとのＣＨ遺伝子は、それぞれ配列番号６３、配列番号６４、配
列番号６４及び配列番号６５を利用したＰＣＲで増幅した。その後、前記３－１と同じ方
法で、ＡＰＢＡ２－０１抗体のＶＨ遺伝子とアセンブリーＰＣＲ反応により融合させた。
融合されたＡＰＢＡ２－０１抗体遺伝子と合成されたＡＰＢＡ２－０２抗体のＶＨ マウ
スＩｇＧ１遺伝子切片及びマウスＩｇＧ２Ａ遺伝子断片を、ｐＤ２５３５ｎｔベクターに
、前述のところと同じ方法でクローニングした。
【0156】
３－３．ＡＰＢＡ２－０１及びＡＰＢＡ２－０２抗体蛋白質の安定したプールの調製
【0157】
前述の調製例３－１及び３－２の抗体蛋白質を生産する安定したプールを調製した。ま
ず、ＧＳ ｎｕｌｌＣＨＯ Ｋ１（Horizon Discovery）細胞を、ＣＤｆｏｒｔｉＣＨＯ（T
hermoFisher Scientific）に４ｍＭのＬ－グルタミン（L-glutamine）（Gibco）が添加さ
れた培地に分注し、３７℃、１２５ｒｐｍ、湿度８０％、ＣＯ２ ５％条件の振盪培養器
でインキュベートした。ＡＰＢＡ２－０１、ＡＰＢＡ２－０２それぞれの軽鎖遺伝子と重
鎖遺伝子とが挿入されたベクターを、Freestyle（商標）MAX Reagent（Invitrogen）を使
用して、１：３［ｐＤ２５３９（軽鎖）：ｐＤ２５３５ｎｔ（重鎖）］の比率で、培養さ
れた細胞に同時トランスフェクションし、総３７．６μｇのプラスミドベクターを使用し
、前述のところと同一の条件で４８時間培養した。その後、培養された細胞を、５０ｍｌ
コニカルチューブ（conical tube）（Ｎｕｎｃ）に移した後で遠心分離し、Ｌ－グルタミ
ンが添加されていないＣＤｆｏｒｔｉＣＨＯ培地に細胞ペレットを再懸濁し、５０μＭメ
チオニンスルホキシミン（methionine sulfoximine）（ＭＳＸ、Sigma-Aldrich、セント
ルイス、ミズーリ）で処理して４８時間一次選別した。その後、１０μｇ／ｍｌのピュー
ロマイシン（puromycin）（Gibco）で処理して、４８時間二次選別した。その後、沈澱さ
れた細胞を、濃度が０．５×１０６細胞／ｍｌになるように、Ｌ－グルタミンが添加され
ていない培地に懸濁させた後、ＭＳＸとピュロマイシンとによる同時処理によって３週間
さらなる選別過程を進めた。このとき、細胞の濃度が２．０×１０６細胞／ｍｌ以下に維
持されるように、培地を定期的に交替し、細胞の生存率（viability）が９０％以上に達
するまで培養して、安定したプール細胞ストック（cell stock）を作製した。細胞濃度と
生存率は、COUNTESSII自動セルカウンタを利用して測定した。
ず、ＧＳ ｎｕｌｌＣＨＯ Ｋ１（Horizon Discovery）細胞を、ＣＤｆｏｒｔｉＣＨＯ（T
hermoFisher Scientific）に４ｍＭのＬ－グルタミン（L-glutamine）（Gibco）が添加さ
れた培地に分注し、３７℃、１２５ｒｐｍ、湿度８０％、ＣＯ２ ５％条件の振盪培養器
でインキュベートした。ＡＰＢＡ２－０１、ＡＰＢＡ２－０２それぞれの軽鎖遺伝子と重
鎖遺伝子とが挿入されたベクターを、Freestyle（商標）MAX Reagent（Invitrogen）を使
用して、１：３［ｐＤ２５３９（軽鎖）：ｐＤ２５３５ｎｔ（重鎖）］の比率で、培養さ
れた細胞に同時トランスフェクションし、総３７．６μｇのプラスミドベクターを使用し
、前述のところと同一の条件で４８時間培養した。その後、培養された細胞を、５０ｍｌ
コニカルチューブ（conical tube）（Ｎｕｎｃ）に移した後で遠心分離し、Ｌ－グルタミ
ンが添加されていないＣＤｆｏｒｔｉＣＨＯ培地に細胞ペレットを再懸濁し、５０μＭメ
チオニンスルホキシミン（methionine sulfoximine）（ＭＳＸ、Sigma-Aldrich、セント
ルイス、ミズーリ）で処理して４８時間一次選別した。その後、１０μｇ／ｍｌのピュー
ロマイシン（puromycin）（Gibco）で処理して、４８時間二次選別した。その後、沈澱さ
れた細胞を、濃度が０．５×１０６細胞／ｍｌになるように、Ｌ－グルタミンが添加され
ていない培地に懸濁させた後、ＭＳＸとピュロマイシンとによる同時処理によって３週間
さらなる選別過程を進めた。このとき、細胞の濃度が２．０×１０６細胞／ｍｌ以下に維
持されるように、培地を定期的に交替し、細胞の生存率（viability）が９０％以上に達
するまで培養して、安定したプール細胞ストック（cell stock）を作製した。細胞濃度と
生存率は、COUNTESSII自動セルカウンタを利用して測定した。
【0158】
３－４．ＡＰＢＡ２－０１及びＡＰＢＡ２－０２キメラ抗体蛋白質の生産及び精製
【0159】
前記３－３で調製された安定したプールから、ＡＰＢＡ２－０１及びＡＰＢＡ２－０２
のヒト・マウスキメラ抗体蛋白質を生産した。まず、細胞の濃度が０．２×１０６細胞／
ｍｌになるように、ＣＤｆｏｒｔｉＣＨＯ培地に細胞を懸濁させた後、３７℃、１２５ｒ
ｐｍ、湿度８０％、ＣＯ２ ５％条件の振盪培養器でインキュベートした。インキュベー
ション後、細胞の濃度が２．０×１０６細胞／ｍｌに逹したとき、３２℃、１２５ｒｐｍ
、湿度８０％、ＣＯ２ ５％が維持される条件の振盪培養器に移し、７日間抗体試料を生
産した。その後、遠心分離して、抗体試料が含まれている上澄み液を確保し、０．２μｍ
濾過紙で濾過して不純物を除去した。その後、ＣＨＯ細胞から生産された抗体試料を、３
段階のクロマトグラフィ（親和性クロマトグラフィ、陽イオン交換精製、陰イオン交換精
製）過程を経て精製した。まず、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＬＸレジンを使用して親
和性クロマトグラフィを遂行した。１０ＣＶのトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ：tris-buffere
d saline）バッファでレジンを洗浄した後、抗体試料を含む上澄み液を、２０ｍｌ／分の
流速でレジンに通過させた。５ＣＶのＴＢＳバッファと、５ＣＶの３％ Ｄ－マンニトー
ルが含まれたＴＢＳバッファとを２５ｍｌ／分の流速で流して、レジンに非特異的に結合
された物質を除去した。５０ｍＭクエン酸（ｐＨ３．５）と３％ Ｄ－マンニトールとの
バッファを２０ｍｌ／分の流速で流して、レジンに特異的に結合された抗体試料をレジン
から溶出させた。その後、溶出された蛋白質試料を含有するバッファを、１Ｍ tris-HCl
（ｐＨ８．０）バッファで処理して中和し、０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去し
た。次に、５０ｍＭ trisと２００ｍＭクエン酸とのバッファ（ｐＨ７．０）で平衡化さ
せたCapto adhere ImpRes multimodal chromatographyレジンを使用して陽イオン交換精
製を行った。親和性クロマトグラフィから確保された抗体試料を、滅菌蒸溜水で１／４に
希釈した。その後、５ｍｌ／分の流速で、抗体試料をレジンに結合させた後、５０ｍＭ t
ris，２００ｍＭクエン酸，１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）バッファ５ＣＶで洗浄した。そ
の後、５０ｍＭ tris，２００ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０）バッファ５ＣＶで、２５ｍｌ
／分の流速で洗浄して、レジンに非特異的に結合された物質を除去した。その後、５０ｍ
Ｍ tris，２００ｍＭクエン酸（ｐＨ３．０）バッファを２０％，３０％，４０％，５０
％，７０％，１００％段階別に順次流し、レジンに特異的に結合された抗体試料を溶出し
た。各段階の溶出液を収集し、０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去した。最後に、
POROS（商標）50 HQ Strong Anion Exchangeレジンを使用して陰イオン交換精製を行った
。まず、２Ｍ ＮａＣｌバッファを、３ｍｌ／分の流速で流してレジンを洗浄し、２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）バッファ５ＣＶを流して平衡化させた。陽イオン交換
精製によって確保された抗体試料をレジンに結合させるために、試料を２０ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ６．０）バッファで透析して、ｐＨと塩濃度とを調整した。透析された試
料を、レジンに５ｍｌ／分の流速で流して、収集された蛋白質を含むバッファを、０．２
μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去した。蛋白質を定量及び分析した。
のヒト・マウスキメラ抗体蛋白質を生産した。まず、細胞の濃度が０．２×１０６細胞／
ｍｌになるように、ＣＤｆｏｒｔｉＣＨＯ培地に細胞を懸濁させた後、３７℃、１２５ｒ
ｐｍ、湿度８０％、ＣＯ２ ５％条件の振盪培養器でインキュベートした。インキュベー
ション後、細胞の濃度が２．０×１０６細胞／ｍｌに逹したとき、３２℃、１２５ｒｐｍ
、湿度８０％、ＣＯ２ ５％が維持される条件の振盪培養器に移し、７日間抗体試料を生
産した。その後、遠心分離して、抗体試料が含まれている上澄み液を確保し、０．２μｍ
濾過紙で濾過して不純物を除去した。その後、ＣＨＯ細胞から生産された抗体試料を、３
段階のクロマトグラフィ（親和性クロマトグラフィ、陽イオン交換精製、陰イオン交換精
製）過程を経て精製した。まず、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＬＸレジンを使用して親
和性クロマトグラフィを遂行した。１０ＣＶのトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ：tris-buffere
d saline）バッファでレジンを洗浄した後、抗体試料を含む上澄み液を、２０ｍｌ／分の
流速でレジンに通過させた。５ＣＶのＴＢＳバッファと、５ＣＶの３％ Ｄ－マンニトー
ルが含まれたＴＢＳバッファとを２５ｍｌ／分の流速で流して、レジンに非特異的に結合
された物質を除去した。５０ｍＭクエン酸（ｐＨ３．５）と３％ Ｄ－マンニトールとの
バッファを２０ｍｌ／分の流速で流して、レジンに特異的に結合された抗体試料をレジン
から溶出させた。その後、溶出された蛋白質試料を含有するバッファを、１Ｍ tris-HCl
（ｐＨ８．０）バッファで処理して中和し、０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去し
た。次に、５０ｍＭ trisと２００ｍＭクエン酸とのバッファ（ｐＨ７．０）で平衡化さ
せたCapto adhere ImpRes multimodal chromatographyレジンを使用して陽イオン交換精
製を行った。親和性クロマトグラフィから確保された抗体試料を、滅菌蒸溜水で１／４に
希釈した。その後、５ｍｌ／分の流速で、抗体試料をレジンに結合させた後、５０ｍＭ t
ris，２００ｍＭクエン酸，１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）バッファ５ＣＶで洗浄した。そ
の後、５０ｍＭ tris，２００ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０）バッファ５ＣＶで、２５ｍｌ
／分の流速で洗浄して、レジンに非特異的に結合された物質を除去した。その後、５０ｍ
Ｍ tris，２００ｍＭクエン酸（ｐＨ３．０）バッファを２０％，３０％，４０％，５０
％，７０％，１００％段階別に順次流し、レジンに特異的に結合された抗体試料を溶出し
た。各段階の溶出液を収集し、０．２μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去した。最後に、
POROS（商標）50 HQ Strong Anion Exchangeレジンを使用して陰イオン交換精製を行った
。まず、２Ｍ ＮａＣｌバッファを、３ｍｌ／分の流速で流してレジンを洗浄し、２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）バッファ５ＣＶを流して平衡化させた。陽イオン交換
精製によって確保された抗体試料をレジンに結合させるために、試料を２０ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ６．０）バッファで透析して、ｐＨと塩濃度とを調整した。透析された試
料を、レジンに５ｍｌ／分の流速で流して、収集された蛋白質を含むバッファを、０．２
μｍ濾過紙で濾過して不純物を除去した。蛋白質を定量及び分析した。
【0160】
［実施例１．ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力の比較］
【0161】
１－１．水溶性ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力
【0162】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
の水溶性ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力を、ＥＬＩＳＡ実験を介して確認した。抗体を
、１，５００ｎｇ／ｍｌないし０．０１９ｎｇ／ｍｌの濃度に段階希釈して添加したとい
う点を除いては、前述の２－３と同じ方法で実験を遂行した。陽性対照（ＭＥＤＩ９４４
７、ＣＰＩ－００６）及び陰性対照（リツキシマブ）についても、同じ手順を行った。
の水溶性ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力を、ＥＬＩＳＡ実験を介して確認した。抗体を
、１，５００ｎｇ／ｍｌないし０．０１９ｎｇ／ｍｌの濃度に段階希釈して添加したとい
う点を除いては、前述の２－３と同じ方法で実験を遂行した。陽性対照（ＭＥＤＩ９４４
７、ＣＰＩ－００６）及び陰性対照（リツキシマブ）についても、同じ手順を行った。
【0163】
図４Ａ～４Ｄは，それぞれヒト、猿、ラット及びマウスのＣＤ７３に対するＡＰＢＡ２
－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体の結合能力を確認したグラフである。
図４に示されているように、ヒトＣＤ７３蛋白質（Ａ）につき、ＭＥＤＩ９４４７＞Ａ
ＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＣＰＩ－００６の順に結合能力が高く、猿ＣＤ７３
蛋白質（Ｂ）については、ＭＥＤＩ９４４７＝ＡＰＢＡ２－０１＞ＣＰＩ－００６＞ＡＰ
ＢＡ２－０２の順に結合能力が高かった。また、ラットＣＤ７３蛋白質（Ｃ）においては
、ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＡＰＢＡ２－０１の順に結合能力が高く、マウ
スＣＤ７３蛋白質（Ｄ）においては、ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２
－０２の順に結合能力を示している。すなわち、ＡＰＢＡ２－０１は、ＭＥＤＩ９４４７
の次いで二番目に高いＣＤ７３蛋白質（ヒト、猿及びマウス）結合能力を示し、ＡＰＢＡ
２－０２は、ＭＥＤＩ９４４７及びＡＰＢＡ２－０１と比較して相対的に低いＣＤ７３結
合能力を示したが、ＣＰＩ－００６とは類似した結合能力を示した。
－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体の結合能力を確認したグラフである。
図４に示されているように、ヒトＣＤ７３蛋白質（Ａ）につき、ＭＥＤＩ９４４７＞Ａ
ＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＣＰＩ－００６の順に結合能力が高く、猿ＣＤ７３
蛋白質（Ｂ）については、ＭＥＤＩ９４４７＝ＡＰＢＡ２－０１＞ＣＰＩ－００６＞ＡＰ
ＢＡ２－０２の順に結合能力が高かった。また、ラットＣＤ７３蛋白質（Ｃ）においては
、ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＡＰＢＡ２－０１の順に結合能力が高く、マウ
スＣＤ７３蛋白質（Ｄ）においては、ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２
－０２の順に結合能力を示している。すなわち、ＡＰＢＡ２－０１は、ＭＥＤＩ９４４７
の次いで二番目に高いＣＤ７３蛋白質（ヒト、猿及びマウス）結合能力を示し、ＡＰＢＡ
２－０２は、ＭＥＤＩ９４４７及びＡＰＢＡ２－０１と比較して相対的に低いＣＤ７３結
合能力を示したが、ＣＰＩ－００６とは類似した結合能力を示した。
【0164】
１－２．膜ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力
【0165】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
が、膜ＣＤ７３蛋白質に対して結合能を有するか否かということを、フローサイトメトリ
ーで確認した。まず、ヒトＣＤ７３を過発現する乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１
（韓国細胞株バンク）と、マウスＣＤ７３を過発現する乳癌細胞株である４Ｔ１（ＡＴＣ
Ｃ）とを、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：fetal bovine serum）（Gibco）と１％ペニシリ
ン・ストレプトマイシン（Gibco）とが添加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（ThermoFishe
r Scientific）にそれぞれ分注し、３７℃、５％ ＣＯ２条件の加湿インキュベータ（hum
idified incubator）においてインキュベートした。細胞の数と生存率は、Vi-cell autom
ated cell analyzerを使用して測定した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とを、
それぞれ滅菌マイクロチューブに２．０×１０５細胞の密度で分注し、ＭＡＣＳバッファ
（０．５％ ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡが含まれているＰＢＳ）で２回ずつ洗浄した。その
後、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体を、ＭＡＣＳバッファ中に４０ｎＭ濃
度に希釈し、それでもって、ＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及び４Ｔ１細胞をそれぞれ処理して
、４℃で１時間反応させた。１時間後、細胞をＭＡＣＳバッファで３回ずつ洗浄し、ヤギ
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣ抗体（Invitrogen）を添加し、４℃で３０分間反応させた。
前述のところと同じ方法でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及び４Ｔ１細胞を洗浄し、１％ホル
ムアルデヒドで処理して前記細胞を固定させた後、ＢＤ ＦＡＣＳＶＥＲＳＥ装備を使用
してフローサイトメトリーを行った。陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）及
び陰性対照（リツキシマブ）も、同じ方法で分析した。
が、膜ＣＤ７３蛋白質に対して結合能を有するか否かということを、フローサイトメトリ
ーで確認した。まず、ヒトＣＤ７３を過発現する乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１
（韓国細胞株バンク）と、マウスＣＤ７３を過発現する乳癌細胞株である４Ｔ１（ＡＴＣ
Ｃ）とを、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：fetal bovine serum）（Gibco）と１％ペニシリ
ン・ストレプトマイシン（Gibco）とが添加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（ThermoFishe
r Scientific）にそれぞれ分注し、３７℃、５％ ＣＯ２条件の加湿インキュベータ（hum
idified incubator）においてインキュベートした。細胞の数と生存率は、Vi-cell autom
ated cell analyzerを使用して測定した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とを、
それぞれ滅菌マイクロチューブに２．０×１０５細胞の密度で分注し、ＭＡＣＳバッファ
（０．５％ ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡが含まれているＰＢＳ）で２回ずつ洗浄した。その
後、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体を、ＭＡＣＳバッファ中に４０ｎＭ濃
度に希釈し、それでもって、ＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及び４Ｔ１細胞をそれぞれ処理して
、４℃で１時間反応させた。１時間後、細胞をＭＡＣＳバッファで３回ずつ洗浄し、ヤギ
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣ抗体（Invitrogen）を添加し、４℃で３０分間反応させた。
前述のところと同じ方法でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及び４Ｔ１細胞を洗浄し、１％ホル
ムアルデヒドで処理して前記細胞を固定させた後、ＢＤ ＦＡＣＳＶＥＲＳＥ装備を使用
してフローサイトメトリーを行った。陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）及
び陰性対照（リツキシマブ）も、同じ方法で分析した。
【0166】
図５Ａは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２
－０２抗体の膜ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力を比較したグラフであり、図５Ｂは、４
Ｔ１細胞における結合能力を比較したグラフである。
図５Ａ及び図５Ｂに示されているように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とに
つき、ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＣＰＩ－００６の順に
高い抗原結合能力を示した。また、ＭＥＤＩ９４４７抗体、ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡ
ＰＢＡ２－０２抗体は、陰性対照群（リツキシマブ）に比べ、強い結合能力を示した。し
かしながら、陽性対照であるＣＰＩ－００６抗体は、ＭＥＤＩ９４４７抗体、ＡＰＢＡ２
－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体と比較して弱い結合能力を示した。
－０２抗体の膜ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力を比較したグラフであり、図５Ｂは、４
Ｔ１細胞における結合能力を比較したグラフである。
図５Ａ及び図５Ｂに示されているように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とに
つき、ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＣＰＩ－００６の順に
高い抗原結合能力を示した。また、ＭＥＤＩ９４４７抗体、ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡ
ＰＢＡ２－０２抗体は、陰性対照群（リツキシマブ）に比べ、強い結合能力を示した。し
かしながら、陽性対照であるＣＰＩ－００６抗体は、ＭＥＤＩ９４４７抗体、ＡＰＢＡ２
－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体と比較して弱い結合能力を示した。
【0167】
［実施例２．エピトープの比較分析］
【0168】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
と、陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）の、ＣＤ７３エピトープを、ＢＬＩ
（bio-layer interferometry）で比較分析した。まず、抗ヒトＩｇＧＦｃ Capture（ＡＨ
Ｃ）チップを、滅菌蒸溜水中で１５分間水和（hydration）させ、０．１％ ＢＳＡが添加
されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）（０．１％ ＰＢＡ）バッファと１０ｍＭグリシン（glycine
）（ｐＨ１．７）バッファとに、それぞれ２０秒間３回ずつ反復反応させることにより、
コンディショニング（conditioning）を行った。次に、陽性対照であるＣＰＩ－００６抗
体及びＭＥＤＩ９４４７抗体を、０．１％ ＰＢＡバッファで２００ｎＭの濃度に希釈し
、それぞれＡＨＣチップに６００秒間ローディングした。そこに、０．１％ ＰＢＡバッ
ファで２０ｎＭの濃度に希釈された組み換えヒトＣＤ７３蛋白質試料を９００秒間反応さ
せてて結合させた。最後に、ＡＰＢＡ２－０１試料、ＡＰＢＡ２－０２試料を、０．１％
ＰＢＡバッファで２０ｎＭの濃度に希釈し、組み換えヒトＣＤ７３蛋白質が結合されて
いるＣＰＩ－００６に９００秒間反応させた。全ての実験過程は、３０℃、１，０００ｒ
ｐｍ振盪（shaking）条件で遂行され、実験結果は、ForteBio Data analysis 8ソフトウ
ェアで分析した。
と、陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）の、ＣＤ７３エピトープを、ＢＬＩ
（bio-layer interferometry）で比較分析した。まず、抗ヒトＩｇＧＦｃ Capture（ＡＨ
Ｃ）チップを、滅菌蒸溜水中で１５分間水和（hydration）させ、０．１％ ＢＳＡが添加
されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）（０．１％ ＰＢＡ）バッファと１０ｍＭグリシン（glycine
）（ｐＨ１．７）バッファとに、それぞれ２０秒間３回ずつ反復反応させることにより、
コンディショニング（conditioning）を行った。次に、陽性対照であるＣＰＩ－００６抗
体及びＭＥＤＩ９４４７抗体を、０．１％ ＰＢＡバッファで２００ｎＭの濃度に希釈し
、それぞれＡＨＣチップに６００秒間ローディングした。そこに、０．１％ ＰＢＡバッ
ファで２０ｎＭの濃度に希釈された組み換えヒトＣＤ７３蛋白質試料を９００秒間反応さ
せてて結合させた。最後に、ＡＰＢＡ２－０１試料、ＡＰＢＡ２－０２試料を、０．１％
ＰＢＡバッファで２０ｎＭの濃度に希釈し、組み換えヒトＣＤ７３蛋白質が結合されて
いるＣＰＩ－００６に９００秒間反応させた。全ての実験過程は、３０℃、１，０００ｒ
ｐｍ振盪（shaking）条件で遂行され、実験結果は、ForteBio Data analysis 8ソフトウ
ェアで分析した。
【0169】
図６Ａは、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体が、ＣＰＩ－００６のエピト
ープに競合的に結合するか否かということ分析した結果を示し、図６Ｂは、ＭＥＤＩ９４
４７のエピトープに競合的に結合するか否かということを分析した結果を示す。
図６Ａに示されているように、ＣＰＩ－００６とエピトープを共有する抗体は観察され
なかった。なお、図６Ｂに示されているように、陽性対照（ＭＥＤＩ９４４７、ＣＰＩ－
００６）及びＡＰＢＡ２－０１抗体は、ヒトＣＤ７３蛋白質に結合しなかったが、ＡＰＢ
Ａ２－０２抗体は結合した。
ープに競合的に結合するか否かということ分析した結果を示し、図６Ｂは、ＭＥＤＩ９４
４７のエピトープに競合的に結合するか否かということを分析した結果を示す。
図６Ａに示されているように、ＣＰＩ－００６とエピトープを共有する抗体は観察され
なかった。なお、図６Ｂに示されているように、陽性対照（ＭＥＤＩ９４４７、ＣＰＩ－
００６）及びＡＰＢＡ２－０１抗体は、ヒトＣＤ７３蛋白質に結合しなかったが、ＡＰＢ
Ａ２－０２抗体は結合した。
【0170】
結果として、ＭＥＤＩ９４４７抗体が結合されたヒトＣＤ７３蛋白質にＡＰＢＡ２－０
１抗体は結合することができなかったため、ＡＰＢＡ２－０１抗体は、ＭＥＤＩ９４４７
抗体のものと類似したエピトープに競合的に結合することができる可能性が示唆された。
一方、ＣＰＩ－００６抗体は、図６Ａの結果と異なり、ＭＥＤＩ９４４７抗体が結合され
ているヒトＣＤ７３蛋白質に結合することができなかった。すなわち、ＣＰＩ－００６は
、ＡＭＰがＣＤ７３に結合するところのＣ末端でエピトープに結合し、従ってＡＭＰと競
合してＣＤ７３酵素活性を阻害する。一方、ＭＥＤＩ９４４７は、ホモダイマーであるＣ
Ｄ７３のＮ末端側ドメインに結合して、ＣＤ７３が活性構造に移行することを防いでＣＤ
７３酵素活性を阻害する。従って、ＭＥＤＩ９４４７と類似した活性阻害パターンを示す
ＡＰＢＡ２－０１抗体は、ＣＤ７３が活性構造に移行することを阻害すると予測され、Ｃ
ＰＩ－００６と類似している活性阻害パターンを示すＡＰＢＡ２－０２抗体は、ＡＭＰが
ＣＤ７３に結合することを競合的に阻害すると予測される。
１抗体は結合することができなかったため、ＡＰＢＡ２－０１抗体は、ＭＥＤＩ９４４７
抗体のものと類似したエピトープに競合的に結合することができる可能性が示唆された。
一方、ＣＰＩ－００６抗体は、図６Ａの結果と異なり、ＭＥＤＩ９４４７抗体が結合され
ているヒトＣＤ７３蛋白質に結合することができなかった。すなわち、ＣＰＩ－００６は
、ＡＭＰがＣＤ７３に結合するところのＣ末端でエピトープに結合し、従ってＡＭＰと競
合してＣＤ７３酵素活性を阻害する。一方、ＭＥＤＩ９４４７は、ホモダイマーであるＣ
Ｄ７３のＮ末端側ドメインに結合して、ＣＤ７３が活性構造に移行することを防いでＣＤ
７３酵素活性を阻害する。従って、ＭＥＤＩ９４４７と類似した活性阻害パターンを示す
ＡＰＢＡ２－０１抗体は、ＣＤ７３が活性構造に移行することを阻害すると予測され、Ｃ
ＰＩ－００６と類似している活性阻害パターンを示すＡＰＢＡ２－０２抗体は、ＡＭＰが
ＣＤ７３に結合することを競合的に阻害すると予測される。
【0171】
［実施例３．インビトロＣＤ７３酵素活性阻害能の評価］
【0172】
３－１．水溶性ＣＤ７３に対する活性阻害能の評価
【0173】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
が、水溶性ＣＤ７３蛋白質の酵素活性を阻害するか否かということを確認するために、ホ
スフェートを定量化することができるマラカイトグリーンアッセイを行った。まず、組み
換えヒトＣＤ７３蛋白質を、アッセイバッファ（２５ｍＭ tris、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐ
Ｈ７．５）で２ｎＭ濃度に希釈し、ＡＰＢＡ２－０１抗体試料、ＡＰＢＡ２－０２抗体試
料をそれぞれ、前記アッセイバッファにで５０ｎＭから０．７８１３ｎＭまでの濃度に段
階希釈した。希釈されたＣＤ７３蛋白質と、それぞれの抗体試料とを、３７℃で１時間反
応させた。その後、ＡＭＰを最終濃度４００μＭで添加し、３７℃で２０分間反応させた
。その後、Malachite Green Phosphate Detection Kitを使用して２０分間反応させた後
、Epoch Microplate Spectrophotometerで、６２０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）及び陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイ
プ）（BIO X Cell、West Lebanon、New Hampshire）も、前述のところと同じ方法で吸光
度を測定した。
が、水溶性ＣＤ７３蛋白質の酵素活性を阻害するか否かということを確認するために、ホ
スフェートを定量化することができるマラカイトグリーンアッセイを行った。まず、組み
換えヒトＣＤ７３蛋白質を、アッセイバッファ（２５ｍＭ tris、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐ
Ｈ７．５）で２ｎＭ濃度に希釈し、ＡＰＢＡ２－０１抗体試料、ＡＰＢＡ２－０２抗体試
料をそれぞれ、前記アッセイバッファにで５０ｎＭから０．７８１３ｎＭまでの濃度に段
階希釈した。希釈されたＣＤ７３蛋白質と、それぞれの抗体試料とを、３７℃で１時間反
応させた。その後、ＡＭＰを最終濃度４００μＭで添加し、３７℃で２０分間反応させた
。その後、Malachite Green Phosphate Detection Kitを使用して２０分間反応させた後
、Epoch Microplate Spectrophotometerで、６２０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）及び陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイ
プ）（BIO X Cell、West Lebanon、New Hampshire）も、前述のところと同じ方法で吸光
度を測定した。
【0174】
図７は、ＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体による水溶性ＣＤ７３の酵素
活性阻害を評価するための、マラカイトグリーンアッセイ方法の結果を示す。
図７に示されているように、水溶性ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３抗体の酵素活性阻害能
は、ＣＰＩ－００６＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＭＥＤＩ９４４７の順で高
かった。
活性阻害を評価するための、マラカイトグリーンアッセイ方法の結果を示す。
図７に示されているように、水溶性ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３抗体の酵素活性阻害能
は、ＣＰＩ－００６＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２＞ＭＥＤＩ９４４７の順で高
かった。
【0175】
３－２．膜ＣＤ７３に対する活性阻害能の評価
【0176】
前述の調製例３で生産されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体が、膜Ｃ
Ｄ７３蛋白質の酵素活性を阻害するか否かということを確認するために、ホスフェート定
量（マラカイトグリーンアッセイ）及びルシフェリン酸化測定（CellTiter-Glo（登録商
標）assay）をそれぞれ行った。
Ｄ７３蛋白質の酵素活性を阻害するか否かということを確認するために、ホスフェート定
量（マラカイトグリーンアッセイ）及びルシフェリン酸化測定（CellTiter-Glo（登録商
標）assay）をそれぞれ行った。
【0177】
マラカイトグリーンアッセイによりＣＤ７３の酵素活性を分析した。まず、ＣＤ７３の
酵素活性を測定するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とをそれぞれ２×１
０４細胞／ウェルと１．０×１０４細胞／ウェルの濃度で分注しＡＰＢＡ２－０１及びＡ
ＰＢＡ２－０２抗体を４００ｎＭ濃度ないし０．０２４４ｎＭ濃度に段階希釈して使用し
たという点を除いては、前述の調製例２－４と同じ方法でアッセイを遂行した。陰性対照
（リツキシマブ）及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）の試料についても
、前述のところと同じ方法で吸光度を測定した。
酵素活性を測定するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とをそれぞれ２×１
０４細胞／ウェルと１．０×１０４細胞／ウェルの濃度で分注しＡＰＢＡ２－０１及びＡ
ＰＢＡ２－０２抗体を４００ｎＭ濃度ないし０．０２４４ｎＭ濃度に段階希釈して使用し
たという点を除いては、前述の調製例２－４と同じ方法でアッセイを遂行した。陰性対照
（リツキシマブ）及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）の試料についても
、前述のところと同じ方法で吸光度を測定した。
【0178】
次に、CellTiter-Glo（登録商標）assayによりＣＤ７３の酵素活性を分析した。まず、
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とを、それぞれ２．０×１０４細胞／ウェル、１
．０×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルフラットプレート（ＳＰＬ）に分注し、３
７℃、５％ ＣＯ２条件のインキュベータで２０時間インキュベートした。インキュベー
ション後、上澄み液を除去し、ＦＢＳが含まれていないＲＰＭＩ－１６４０培地で細胞を
洗浄した。その後、ＡＰＢＡ２－０１抗体試料、ＡＰＢＡ２－０２抗体試料を、培地で５
００ｎＭないし０．０３０５ｎＭ濃度に段階希釈し、各ウェルをそれで処理して、３７℃
で３０分間反応させた。反応後、ＡＭＰを４００μＭの濃度で添加し、３７℃で３時間反
応させた。その後、上澄み液を、新たな９６ウェルホワイトプレート中で２００μＭ濃度
のＡＴＰと反応させ、CellTiter-Glo（登録商標）で処理し、製造社で提供された標準方
法によりSynergy Ｍ１ reader装備を用いてルミネセンス（luminescence）を測定した。
陰性対照（リツキシマブ）試料及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）試料
についても、前述のところと同じ方法でルミネセンスを測定した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と４Ｔ１細胞とを、それぞれ２．０×１０４細胞／ウェル、１
．０×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルフラットプレート（ＳＰＬ）に分注し、３
７℃、５％ ＣＯ２条件のインキュベータで２０時間インキュベートした。インキュベー
ション後、上澄み液を除去し、ＦＢＳが含まれていないＲＰＭＩ－１６４０培地で細胞を
洗浄した。その後、ＡＰＢＡ２－０１抗体試料、ＡＰＢＡ２－０２抗体試料を、培地で５
００ｎＭないし０．０３０５ｎＭ濃度に段階希釈し、各ウェルをそれで処理して、３７℃
で３０分間反応させた。反応後、ＡＭＰを４００μＭの濃度で添加し、３７℃で３時間反
応させた。その後、上澄み液を、新たな９６ウェルホワイトプレート中で２００μＭ濃度
のＡＴＰと反応させ、CellTiter-Glo（登録商標）で処理し、製造社で提供された標準方
法によりSynergy Ｍ１ reader装備を用いてルミネセンス（luminescence）を測定した。
陰性対照（リツキシマブ）試料及び陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）試料
についても、前述のところと同じ方法でルミネセンスを測定した。
【0179】
図８Ａは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、膜ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３抗体の
酵素活性阻害を分析するためのマラカイトグリーンアッセイ方法の結果を示し、図８Ｃは
、そのCellTiter-Glo（登録商標）assay方法の結果を示す。
図８Ａに示されているように、膜ＣＤ７３に対する活性阻害能は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３
１細胞において、ＡＰＢＡ２－０２＞ＣＰＩ－００６＞ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－
０１の順で高く、図８Ｃに示されているように、ＭＥＤＩ９４４７＝ＡＰＢＡ２－０１＞
ＣＰＩ－００６＞ＡＰＢＡ２－０２の順に測定された。
酵素活性阻害を分析するためのマラカイトグリーンアッセイ方法の結果を示し、図８Ｃは
、そのCellTiter-Glo（登録商標）assay方法の結果を示す。
図８Ａに示されているように、膜ＣＤ７３に対する活性阻害能は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３
１細胞において、ＡＰＢＡ２－０２＞ＣＰＩ－００６＞ＭＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－
０１の順で高く、図８Ｃに示されているように、ＭＥＤＩ９４４７＝ＡＰＢＡ２－０１＞
ＣＰＩ－００６＞ＡＰＢＡ２－０２の順に測定された。
【0180】
図８Ｂは、４Ｔ１細胞において、膜ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３抗体の酵素活性阻害能
を分析するためのマラカイトグリーンアッセイの結果を示し、図８Ｄは、そのCellTiter-
Glo（登録商標）assayの結果を示す。
図８Ｂに示されているように、４Ｔ１細胞において、阻害能力はＡＰＢＡ２－０２＞Ｍ
ＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１の順に測定され、図８Ｄに示されているように、ＭＥ
ＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２の順に測定された。測定法によって
阻害能の違いを示した。
を分析するためのマラカイトグリーンアッセイの結果を示し、図８Ｄは、そのCellTiter-
Glo（登録商標）assayの結果を示す。
図８Ｂに示されているように、４Ｔ１細胞において、阻害能力はＡＰＢＡ２－０２＞Ｍ
ＥＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１の順に測定され、図８Ｄに示されているように、ＭＥ
ＤＩ９４４７＞ＡＰＢＡ２－０１＞ＡＰＢＡ２－０２の順に測定された。測定法によって
阻害能の違いを示した。
【0181】
すなわち、マラカイトグリーンアッセイの結果において、ＡＰＢＡ２－０２抗体は、相
対的に最も高い数値の活性阻害を示したが（図８Ａ、図８Ｂ）、CellTiter-Glo（登録商
標）assayの結果においては、最も低い数値の活性阻害を示した（図８Ｃ、図８Ｄ）。ま
た、ＡＰＢＡ２－０１抗体とＭＥＤＩ９４４７は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、
ＣＤ７３活性の約５０％の阻害しか示さなかったが（図８Ａ）、４Ｔ１細胞においては、
９０％以上の阻害を示した（図８Ｂ）。一方、ＣＰＩ－００６抗体は、マウスＣＤ７３に
交差結合せず、従ってマウス４Ｔ１細胞においては反応を示さなかった（図８Ｂ、図８Ｄ
）。
対的に最も高い数値の活性阻害を示したが（図８Ａ、図８Ｂ）、CellTiter-Glo（登録商
標）assayの結果においては、最も低い数値の活性阻害を示した（図８Ｃ、図８Ｄ）。ま
た、ＡＰＢＡ２－０１抗体とＭＥＤＩ９４４７は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、
ＣＤ７３活性の約５０％の阻害しか示さなかったが（図８Ａ）、４Ｔ１細胞においては、
９０％以上の阻害を示した（図８Ｂ）。一方、ＣＰＩ－００６抗体は、マウスＣＤ７３に
交差結合せず、従ってマウス４Ｔ１細胞においては反応を示さなかった（図８Ｂ、図８Ｄ
）。
【0182】
［実施例４．抗ＣＤ７３抗体の膜ＣＤ７３細胞内への移入］
【0183】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
が、細胞表面の膜ＣＤ７３に結合することにより細胞内に移入（internalization）され
る否かということを、免疫蛍光法顕微鏡（immunofluorescence microscopy）で確認した
。まず、１２ウェルプレート（ＳＰＬ）に、滅菌されたカバーグラス（Paul Marienfeld
、ドイツ）を入れ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１．０×１０５）を各ウェルに分注し、
３７℃、５％ ＣＯ２培養基で２４時間インキュベートした。その後、培養液を除去し、
培地中に１０μｇ／ｍｌの濃度のＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体で各ウェ
ルを処理し、３７℃で、２０分間、４０分間、６０分間及び１２０分間それぞれ反応させ
た。陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）も同じ方法で反応させた。その後、
反応が完了した培養液をそれぞれ除去した。付着された細胞を、ＰＢＳバッファで３回ず
つ洗浄した後、４％ホルムアルデヒドを１ｍｌずつ分注することにより３７℃で１５分間
細胞を固定させた。前述のところと同じ方法で洗浄を行った後、０．０５％ トリトンＸ
１００を、ウェル当たり１ｍｌずつ分注し、常温で１５分間反応させて、細胞に孔が生ず
るように誘導した。その後、前記細胞を洗浄し、２％ ＰＢＡバッファを添加することに
より常温で５０分間ブロッキングした。洗浄後、ＦＩＴＣがコンジュゲーションされた抗
ヒトＦｃ抗体を添加し、常温で５０分間反応させた。前述のところと同じ方法で洗浄を行
った後、細胞が固定されているカバースリップ（cover slip）を、4’,6-ジアミジノ-2－
フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むVECTASHIELD HardSet Antifadeマウンティング培
地（mounting medium）と共に、スライドガラス上に配置した。その後、固定された細胞
を、超高感度高解像力共焦点レーザ走査顕微鏡で分析した。
が、細胞表面の膜ＣＤ７３に結合することにより細胞内に移入（internalization）され
る否かということを、免疫蛍光法顕微鏡（immunofluorescence microscopy）で確認した
。まず、１２ウェルプレート（ＳＰＬ）に、滅菌されたカバーグラス（Paul Marienfeld
、ドイツ）を入れ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１．０×１０５）を各ウェルに分注し、
３７℃、５％ ＣＯ２培養基で２４時間インキュベートした。その後、培養液を除去し、
培地中に１０μｇ／ｍｌの濃度のＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体で各ウェ
ルを処理し、３７℃で、２０分間、４０分間、６０分間及び１２０分間それぞれ反応させ
た。陽性対照（ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９４４７）も同じ方法で反応させた。その後、
反応が完了した培養液をそれぞれ除去した。付着された細胞を、ＰＢＳバッファで３回ず
つ洗浄した後、４％ホルムアルデヒドを１ｍｌずつ分注することにより３７℃で１５分間
細胞を固定させた。前述のところと同じ方法で洗浄を行った後、０．０５％ トリトンＸ
１００を、ウェル当たり１ｍｌずつ分注し、常温で１５分間反応させて、細胞に孔が生ず
るように誘導した。その後、前記細胞を洗浄し、２％ ＰＢＡバッファを添加することに
より常温で５０分間ブロッキングした。洗浄後、ＦＩＴＣがコンジュゲーションされた抗
ヒトＦｃ抗体を添加し、常温で５０分間反応させた。前述のところと同じ方法で洗浄を行
った後、細胞が固定されているカバースリップ（cover slip）を、4’,6-ジアミジノ-2－
フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むVECTASHIELD HardSet Antifadeマウンティング培
地（mounting medium）と共に、スライドガラス上に配置した。その後、固定された細胞
を、超高感度高解像力共焦点レーザ走査顕微鏡で分析した。
【0184】
図９は、高解像力共焦点レーザ走査顕微鏡（ＳＲ－ＣＬＳＭ）で調べられた、膜ＣＤ７
３細胞内へのＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の移入を示すイメージである
。
図９に示されているように、ＡＰＢＡ２－０１抗体もしくはＡＰＢＡ２－０２抗体、ま
たはＭＥＤＩ９４４７でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を処理した２０分後、ＭＤＡ－ＭＢ－
２３１細胞の膜周囲において、ＣＤ７３シグナルが観察され、処理の４０分後には、ＣＤ
７３細胞内への移入が観察された。しかしながら、ＣＰＩ－００６の細胞内移入は観察さ
れなかった。
３細胞内へのＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の移入を示すイメージである
。
図９に示されているように、ＡＰＢＡ２－０１抗体もしくはＡＰＢＡ２－０２抗体、ま
たはＭＥＤＩ９４４７でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を処理した２０分後、ＭＤＡ－ＭＢ－
２３１細胞の膜周囲において、ＣＤ７３シグナルが観察され、処理の４０分後には、ＣＤ
７３細胞内への移入が観察された。しかしながら、ＣＰＩ－００６の細胞内移入は観察さ
れなかった。
【0185】
［実施例５．インビボモデルでの効能の評価］
【0186】
５－１．転移性乳癌マウスモデルにおける抗癌効果の確認
【0187】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
の抗癌効能を、転移性乳癌マウスモデルにおいて確認した。乳癌細胞株４Ｔ１（５．０×
１０５）を、６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に投与して、肺癌を誘導した。３
日後、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の２０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ腹腔投
与（３日間隔で４回）した。陽性対照群（ＭＥＤＩ９４４７ ｈＩｇＧ１）及び陰性対照
群（アイソタイプ対照ＩｇＧ）も、同一の用量及び方法で投与した。マウスの体重を毎回
薬物投与時に測定した。実験が終わった後、マウスの肺と脾臓とを摘出し、その重さを測
定した。摘出された肺を、Bouin’s solutionで染色し、コロニー数を調べた。GraphPad
Prism Version５．０プログラムを使用して統計分析した。体重及び腫瘍サイズは、一元
配置分散分析（one-way ANOVA）で分析し、ｐ＜０．０５である場合、有意であると判定
した。
の抗癌効能を、転移性乳癌マウスモデルにおいて確認した。乳癌細胞株４Ｔ１（５．０×
１０５）を、６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に投与して、肺癌を誘導した。３
日後、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体の２０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ腹腔投
与（３日間隔で４回）した。陽性対照群（ＭＥＤＩ９４４７ ｈＩｇＧ１）及び陰性対照
群（アイソタイプ対照ＩｇＧ）も、同一の用量及び方法で投与した。マウスの体重を毎回
薬物投与時に測定した。実験が終わった後、マウスの肺と脾臓とを摘出し、その重さを測
定した。摘出された肺を、Bouin’s solutionで染色し、コロニー数を調べた。GraphPad
Prism Version５．０プログラムを使用して統計分析した。体重及び腫瘍サイズは、一元
配置分散分析（one-way ANOVA）で分析し、ｐ＜０．０５である場合、有意であると判定
した。
【0188】
図１０Ａは、転移性乳癌マウスモデルにおいて、平均肺重量を測定したグラフである。
図１０Ａに示されているように、陽性対照及びＡＰＢＡ２－０１抗体の場合、陰性対照
群と比較してマウス肺の重さに変化がなく、ＡＰＢＡ２－０２の場合、マウス肺の重量が
１０．８５％低減したことを認めた。
図１０Ａに示されているように、陽性対照及びＡＰＢＡ２－０１抗体の場合、陰性対照
群と比較してマウス肺の重さに変化がなく、ＡＰＢＡ２－０２の場合、マウス肺の重量が
１０．８５％低減したことを認めた。
【0189】
図１０Ｂは、転移性乳癌マウスモデルにおいて、肺転移コロニー数を測定したグラフで
ある。
図１０Ｂに示されているように、陽性対照群、ＡＰＢＡ２－０１投与群及びＡＰＢＡ２
－０２投与群の場合、陰性対照群と比較して、肺転移されたコロニー数がそれぞれ０．０
４％、１３％及び１６％が減少したが、統計学的有意性はなかった。
ある。
図１０Ｂに示されているように、陽性対照群、ＡＰＢＡ２－０１投与群及びＡＰＢＡ２
－０２投与群の場合、陰性対照群と比較して、肺転移されたコロニー数がそれぞれ０．０
４％、１３％及び１６％が減少したが、統計学的有意性はなかった。
【0190】
一方、マウスの体重及び脾臓重量に関しては、ＡＰＢＡ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０
１抗体、及び陽性対照投与群とにおいて、陰性対照群と比較して有意な変化は観察されて
いなかった。
１抗体、及び陽性対照投与群とにおいて、陰性対照群と比較して有意な変化は観察されて
いなかった。
【0191】
５－２．乳癌マウスモデルにおける癌成長阻害の確認
【0192】
前述の調製例３で生産及び精製されたＡＰＢＡ２－０１抗体及びＡＰＢＡ２－０２抗体
の癌成長阻害効能を、乳癌マウスモデルにおいて確認した。乳癌細胞株４Ｔ１（５．０×
１０５）を乳房脂肪体（mammary fat pad）に注射して乳癌を誘導した。３日後、ＡＰＢ
Ａ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体をそれぞれＴＢＳ（ｐＨ７．４）バッファと混合
し、総２０ｍｇ／kg用量で、マウスに腹腔投与（２日間隔で６回）した。陽性対照群（Ｍ
ＥＤＩ９４４７マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２Ａ）及び陰性対照群（アイソタイプ対照群マウ
スＩｇＧ１，ＩｇＧ２Ａ）（Bio Ｘ Cell）も、同一の用量及び方法で投与した。乳癌サ
イズは、ノギス（calipers）を利用して、２日間隔で測定した。最後の抗体投与が終わっ
た６日後にマウスの肺を摘出し、癌細胞の転移有無を観察した。
の癌成長阻害効能を、乳癌マウスモデルにおいて確認した。乳癌細胞株４Ｔ１（５．０×
１０５）を乳房脂肪体（mammary fat pad）に注射して乳癌を誘導した。３日後、ＡＰＢ
Ａ２－０１抗体、ＡＰＢＡ２－０２抗体をそれぞれＴＢＳ（ｐＨ７．４）バッファと混合
し、総２０ｍｇ／kg用量で、マウスに腹腔投与（２日間隔で６回）した。陽性対照群（Ｍ
ＥＤＩ９４４７マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２Ａ）及び陰性対照群（アイソタイプ対照群マウ
スＩｇＧ１，ＩｇＧ２Ａ）（Bio Ｘ Cell）も、同一の用量及び方法で投与した。乳癌サ
イズは、ノギス（calipers）を利用して、２日間隔で測定した。最後の抗体投与が終わっ
た６日後にマウスの肺を摘出し、癌細胞の転移有無を観察した。
【0193】
図１１Ａは、乳癌マウスモデルにおける腫瘍体積を測定することによりＡＰＢＡ２－０
１のｍＩｇＧ１抗体、ｍＩｇＧ２Ａ抗体、及びＡＰＢＡ２－０１のｍＩｇＧ１抗体、ｍＩ
ｇＧ２Ａ抗体の癌成長阻害効能を確認したグラフであり、図１１Ｂは、腫瘍成長抑制力を
比較し、癌成長阻害効能を確認したグラフである。
１のｍＩｇＧ１抗体、ｍＩｇＧ２Ａ抗体、及びＡＰＢＡ２－０１のｍＩｇＧ１抗体、ｍＩ
ｇＧ２Ａ抗体の癌成長阻害効能を確認したグラフであり、図１１Ｂは、腫瘍成長抑制力を
比較し、癌成長阻害効能を確認したグラフである。
【0194】
図１１Ａ及び図１１Ｂに示されているように、ＡＰＢＡ２－０１抗体は、抗体のＦｃ機
能に関係なく、陰性対照群に比べ、約１７％の乳癌成長阻害を示し、ＡＰＢＡ２－０２抗
体は、Ｆｃ機能があるｍＩｇＧ２Ａが３３％、Ｆｃ機能がないｍＩｇＧ１が１８％の乳癌
成長阻害効果を示した。なお、陽性対照群は、Ｆｃ機能があるｍＩｇＧ２Ａが２３％の成
長阻害を示し、Ｆｃ機能がないｍＩｇＧ１は、３５％の活性阻害を示した。
能に関係なく、陰性対照群に比べ、約１７％の乳癌成長阻害を示し、ＡＰＢＡ２－０２抗
体は、Ｆｃ機能があるｍＩｇＧ２Ａが３３％、Ｆｃ機能がないｍＩｇＧ１が１８％の乳癌
成長阻害効果を示した。なお、陽性対照群は、Ｆｃ機能があるｍＩｇＧ２Ａが２３％の成
長阻害を示し、Ｆｃ機能がないｍＩｇＧ１は、３５％の活性阻害を示した。
【0195】
【0196】
［実施例６．インビトロ細胞モデルにおける効能評価］
【0197】
６－１．モノクローナル抗体の調製
【0198】
Myxengo社（米国）に、ＣＤ７３蛋白質に特異的に結合する抗体選別を依頼した。Myxen
go社は、保有しているナイーブヒトｓｃＦｖライブラリーを利用してバイオパニングを行
い、候補抗体クローンを選別した。選別されたクローンはＩｇＧ４抗体として発現され、
対応する培養液がMyxengo社から配送された。配送されたそれぞれの培養液を、CaptureSe
lect IgG-CH1 Affinity Matrixレジンを使用した親和性クロマトグラフィに付して、それ
ぞれのＩｇＧ４抗体蛋白質を分離及び精製し、調製例２－２と同じ方法で実験を遂行した
。
go社は、保有しているナイーブヒトｓｃＦｖライブラリーを利用してバイオパニングを行
い、候補抗体クローンを選別した。選別されたクローンはＩｇＧ４抗体として発現され、
対応する培養液がMyxengo社から配送された。配送されたそれぞれの培養液を、CaptureSe
lect IgG-CH1 Affinity Matrixレジンを使用した親和性クロマトグラフィに付して、それ
ぞれのＩｇＧ４抗体蛋白質を分離及び精製し、調製例２－２と同じ方法で実験を遂行した
。
【0199】
６－２．膜ＣＤ７３蛋白質の酵素活性の確認
【0200】
前記実施例６－１で調製した７種のヒト抗ＣＤ７３ ＩｇＧ１抗体の、膜ＣＤ７３酵素
活性に対する阻害能を、前記実施例３－２と同じ方法で確認した。このとき、陽性対照群
として、ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９９４７を使用した。
活性に対する阻害能を、前記実施例３－２と同じ方法で確認した。このとき、陽性対照群
として、ＣＰＩ－００６、ＭＥＤＩ９９４７を使用した。
【0201】
図１２Ａは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、膜ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３抗体
の酵素活性阻害能を、マラカイトグリーンアッセイ方法で評価した結果であり、図１２Ｂ
は、CellTiter-Glo（登録商標）assay方法で評価した結果である。
図１２Ａ及び図１２Ｂに示されているように、７種抗体のうち５種抗体（Ｎｏ．３，４
，６，７，１５）は、陰性対照群と比較し、ＣＤ７３酵素活性阻害能が有意的に高いとい
うことを認めた。
の酵素活性阻害能を、マラカイトグリーンアッセイ方法で評価した結果であり、図１２Ｂ
は、CellTiter-Glo（登録商標）assay方法で評価した結果である。
図１２Ａ及び図１２Ｂに示されているように、７種抗体のうち５種抗体（Ｎｏ．３，４
，６，７，１５）は、陰性対照群と比較し、ＣＤ７３酵素活性阻害能が有意的に高いとい
うことを認めた。
【0202】
［実施例７．膜ＣＤ７３蛋白質に対する結合能力の確認］
【0203】
前記実施例６で選別された抗ＣＤ７３抗体（Myxengo抗体３，４，６，７，１５）の種
間交差反応性を確認するために、マウス細胞膜ＣＤ７３発現細胞株（４Ｔ１（ＡＴＣＣ、
ＣＲＬ－２５３９）及び４Ｔ１．２（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３４０６））を利用し、抗体結
合確認実験を行った。まず、４Ｔ１細胞は、RPMI-1640（Gibco、Cat No.A10491-01）培地
に牛胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、Cat No.16000-044）を１０％添加したもので培養し、
４Ｔ１．２細胞は、Alpha MEM（Minimum Essential Medium）（Corning Fisher Sci、10-
022-CV）培地に牛胎児血清を１０％添加したもので培養した。その後、培養皿に付着した
細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco、Cat No.25200-056）を利用して分離した後、１
．５ｍｌチューブに、２．０ｘ１０５細胞ずつ分注した。その後、遠心分離機で細胞を沈
めた後、上澄み液を除去した。ＭＡＣＳバッファ［０．５％牛血清アルブミン（Sigma）
、２ｍＭＥＤＴＡ（Intronbio）を添加したＤＰＢＳバッファ（Gibco）］中に１００ｎＭ
濃度に希釈された抗体試料１００μｌに細胞を懸濁した後、４℃条件で１時間反応させた
。その後、８００μｌのＭＡＣＳバッファを加えて遠心分離し、上澄み液を除去した。Ｍ
ＡＣＳバッファ中に１：５００比率に希釈された二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴ
Ｃ（Ｎｏｖｅｘ、Ａ１８８３０）５０μｌを追加し、細胞を懸濁した。４℃条件で１時間
反応させた後、５００μｌのＭＡＣＳバッファを加えて遠心分離し、上澄み液を除去した
。その後、０．４％パラホルムアルデヒド（Ｔ＆Ｉ、ＰＢＳで希釈）２００μｌで細胞を
懸濁して固定させた後、準備された試料をフローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＶｅｒ
ｓｅ）を利用して分析した。
間交差反応性を確認するために、マウス細胞膜ＣＤ７３発現細胞株（４Ｔ１（ＡＴＣＣ、
ＣＲＬ－２５３９）及び４Ｔ１．２（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３４０６））を利用し、抗体結
合確認実験を行った。まず、４Ｔ１細胞は、RPMI-1640（Gibco、Cat No.A10491-01）培地
に牛胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco、Cat No.16000-044）を１０％添加したもので培養し、
４Ｔ１．２細胞は、Alpha MEM（Minimum Essential Medium）（Corning Fisher Sci、10-
022-CV）培地に牛胎児血清を１０％添加したもので培養した。その後、培養皿に付着した
細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco、Cat No.25200-056）を利用して分離した後、１
．５ｍｌチューブに、２．０ｘ１０５細胞ずつ分注した。その後、遠心分離機で細胞を沈
めた後、上澄み液を除去した。ＭＡＣＳバッファ［０．５％牛血清アルブミン（Sigma）
、２ｍＭＥＤＴＡ（Intronbio）を添加したＤＰＢＳバッファ（Gibco）］中に１００ｎＭ
濃度に希釈された抗体試料１００μｌに細胞を懸濁した後、４℃条件で１時間反応させた
。その後、８００μｌのＭＡＣＳバッファを加えて遠心分離し、上澄み液を除去した。Ｍ
ＡＣＳバッファ中に１：５００比率に希釈された二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴ
Ｃ（Ｎｏｖｅｘ、Ａ１８８３０）５０μｌを追加し、細胞を懸濁した。４℃条件で１時間
反応させた後、５００μｌのＭＡＣＳバッファを加えて遠心分離し、上澄み液を除去した
。その後、０．４％パラホルムアルデヒド（Ｔ＆Ｉ、ＰＢＳで希釈）２００μｌで細胞を
懸濁して固定させた後、準備された試料をフローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＶｅｒ
ｓｅ）を利用して分析した。
【0204】
図１３Ａは、４Ｔ１細胞における、Myxengo ３，４，６，７及び１５抗体の膜ＣＤ７３
蛋白質に対する結合能力を確認したグラフである。
図１３Ｂは、４Ｔ１．２細胞において、Myxengo ３，４，６，７及び１５抗体の膜ＣＤ
７３蛋白質に対する結合能力を確認したグラフである。
蛋白質に対する結合能力を確認したグラフである。
図１３Ｂは、４Ｔ１．２細胞において、Myxengo ３，４，６，７及び１５抗体の膜ＣＤ
７３蛋白質に対する結合能力を確認したグラフである。
【0205】
図１３Ａ及び図１３Ｂに示されているように、５種抗体（Ｎｏ．３，４，６，７，１５
）のうち１種抗体（Ｎｏ．１５）は、陰性対照群と比較し、マウス膜ＣＤ７３に強く結合
し、ＡＰＢＡ２－０２抗体と類似したレベルの抗原結合能力を示した。しかしながら、４
種抗体（Ｎｏ．３，４，６，７）は、マウス膜ＣＤ７３に結合しなかった。すなわち、My
xengo １５抗体は、ＡＰＢＡ２－０２抗体と類似したレベルの抗原結合能力を示すため、
ＡＰＢＡ２－０２と類似した特性を有すると予測される。従って、Myxengo １５抗体は、
ＣＤ７３に特異的に結合しながら、種間交差反応性を有しうる。
）のうち１種抗体（Ｎｏ．１５）は、陰性対照群と比較し、マウス膜ＣＤ７３に強く結合
し、ＡＰＢＡ２－０２抗体と類似したレベルの抗原結合能力を示した。しかしながら、４
種抗体（Ｎｏ．３，４，６，７）は、マウス膜ＣＤ７３に結合しなかった。すなわち、My
xengo １５抗体は、ＡＰＢＡ２－０２抗体と類似したレベルの抗原結合能力を示すため、
ＡＰＢＡ２－０２と類似した特性を有すると予測される。従って、Myxengo １５抗体は、
ＣＤ７３に特異的に結合しながら、種間交差反応性を有しうる。
【0206】
要約すれば、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ７３に結合し、ＣＤ
７３蛋白質の酵素活性を低減させることができ、かつ癌の転移、または癌の成長を阻害す
ることができ、それを癌の治療剤として活用することができる。また、前記抗体またはそ
の抗原結合断片は、種間交差反応性を示し、前臨床段階である動物実験に使用されうるの
で、免疫治療剤の副作用、毒性及び／または安定性を試験するのにかかる時間、コストな
どを節約することができる。
７３蛋白質の酵素活性を低減させることができ、かつ癌の転移、または癌の成長を阻害す
ることができ、それを癌の治療剤として活用することができる。また、前記抗体またはそ
の抗原結合断片は、種間交差反応性を示し、前臨床段階である動物実験に使用されうるの
で、免疫治療剤の副作用、毒性及び／または安定性を試験するのにかかる時間、コストな
どを節約することができる。
【0207】
前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の当業者で
あるならば、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易
に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述さ
れた実施例は、全ての面において、例示的なものであり、限定的ではないと理解しなけれ
ばならない。
あるならば、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易
に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述さ
れた実施例は、全ての面において、例示的なものであり、限定的ではないと理解しなけれ
ばならない。
【0208】
本発明の幅（breadth）及び範囲は、前述の例示的な実施例のうち、いずれによっても
制限されるものではなく、特許請求の範囲、及びその均等物によってのみ定義されるもの
である。
制限されるものではなく、特許請求の範囲、及びその均等物によってのみ定義されるもの
である。
【0209】
本明細書で説明された多様な様態、実施例及び選択肢は、いずれも任意の変形にも結合
され得る。
され得る。
【0210】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個別の刊行物、
特許または特許出願が参照によって組み入れられることが具体的及び個別的に表されたと
ころと同一の範囲で、参照によって本明細書に組み入れられる。
特許または特許出願が参照によって組み入れられることが具体的及び個別的に表されたと
ころと同一の範囲で、参照によって本明細書に組み入れられる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のものを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲＬ１）、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲＨ１）、配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲＬ１）、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項2】
以下のものを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項3】
前記抗体は、ヒト抗体またはキメラ抗体である、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項6】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
【請求項7】
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防用または治療用の医薬組成物。
【請求項8】
免疫チェックポイント遮断剤または化学療法剤を追加して含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記癌は、ＣＤ７３を過発現する癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記癌は、乳癌、三重陰性乳癌（ＴＢＮＣ）、膵臓大腸癌、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、膀胱癌、白血病、前立腺癌、悪性黒色腫、癌、食道癌、胃癌（stomach cancer）、頭頸部癌、肺癌または腎臓癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
【誤訳訂正書】
【提出日】2024-10-21
【誤訳訂正1】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【外国語明細書】