特開 2024-178411 試薬、測定方法、および測定装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024178411

(43)【公開日】2024-12-24

(54)【発明の名称】試薬、測定方法、および測定装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20241217BHJP

   G01N 33/02 20060101ALI20241217BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20241217BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

G01N33/02

C12N1/20 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024166805

(22)【出願日】2024-09-25

(62)【分割の表示】P 2023578171の分割

【原出願日】2022-12-19

(71)【出願人】

【識別番号】515052682

【氏名又は名称】株式会社バランス・イースト

(74)【代理人】

【識別番号】100145861

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 薫

(72)【発明者】

【氏名】徳田美幸

(57)【要約】      （修正有）

【課題】迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる試薬、測定方法、および測定装置を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の試薬１は、検体に含まれる標的となる微生物を蛍光させる試薬１であって、標的となる微生物を大腸菌とし、検体において大腸菌を選択的に蛍光させる。本発明の試薬１は、[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａと所定の蛍光試薬１Ｂとを結合した試薬１であり、[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａを所定の蛍光試薬１Ｂにより蛍光させるとともに、蛍光させた[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａが、検体に含まれる標的となる微生物である大腸菌と選択的に感染することにより、大腸菌を選択的に取り込んで蛍光させる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

検体に含まれる標的となる微生物である大腸菌を選択的に蛍光させる試薬により前記標的となる微生物である大腸菌の測定を行う測定方法であって、
バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡと、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とを混合して結合したものを前記試薬とし、
前記試薬を、標的となる大腸菌に選択的に感染させて大腸菌を蛍光させることを特徴とする測定方法。

【請求項2】

検体に含まれる標的となる微生物である大腸菌を選択的に蛍光させる試薬により前記標的となる微生物である大腸菌の測定を行う測定方法であって、
バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡと、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とを混合して結合したものを前記試薬とし、
黒色のフィルタに前記試薬を含侵させ、
前記試薬を含侵させた前記黒色のフィルタに大腸菌を含む検体を含侵させ、
スライドグラスにマーキングされた測定円に前記試薬および前記検体を含侵させた前記黒色のフィルタを設置し、さらに、前記スライドグラスをカバーグラスで覆いプレパラートを作製し、
顕微鏡装置のステージに設置した前記プレパラートを用いて、蛍光処理装置の励起光照射部により所定の波長の励起光を照射する蛍光処理を行い、
前記顕微鏡装置の撮影部により、前記励起光を吸収した前記プレパラートの前記黒色のフィルタを複数撮影し、
前記顕微鏡装置の解析部により、前記撮影部が撮影した画像から標的とする微生物である大腸菌を所定の認識パラメータに基づいて認識する一方で、前記大腸菌以外のものは認識しないように解析して前記大腸菌を測定することを特徴とする測定方法。

【請求項3】

前記撮影部が撮影した前記プレパラートの画像を補正部により補正することを特徴とする請求項２に記載の測定方法。

【請求項4】

前記補正部は、前記プレパラートにおける前記スライドグラス間の厚みおよび／または形状の相違を修正するよう前記画像を補正することを特徴とする請求項３に記載の測定方法。

【請求項5】

前記補正部は、 前記顕微鏡装置において前記プレパラートを設置するステージの水平方向に対する傾きを修正するよう前記画像を補正することを特徴とする請求項３または請求項４に記載の測定方法。

【請求項6】

前記解析部は、前記撮影された画像から前記標的とする微生物である大腸菌を所定の認識パラメータに基づいて認識し、前記大腸菌以外のものは認識しないものであり、前記認識パラメータは、前記標的とする微生物である大腸菌の形状、サイズ、蛍光の強度、および蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つを含むことを特徴とする請求項２～請求項５のいずれか一項に記載の測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試薬、測定方法、および測定装置に関し、特に、検体に含まれる標的となる微生物を蛍光させる試薬、測定方法、および測定装置に関する。

【背景技術】

【0002】

過去より食品の微生物管理は、トータルの品質管理の中でも中心的ファクターとなっている。食品衛生法でも、食品や食材事に一般細菌数と大腸菌数等の微生物数は基準値として定められている。よって各種食品関連事業所では日々、食品や、食材からサンプルを抜き取り、一般細菌数と大腸菌数等の微生物数の検査を行っている。食品の細菌数等を検査する技術は、例えば特許文献１に開示される技術を参照することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１４－５２９７６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

検査の現状は国が定める培養法に頼らざるを得ない状況で４８時間の時間と、それに伴い膨大なコストが計上されている。自社検査体制が無い企業は、検査をすべて外部依頼している。しかしながら、これら検査体制は大きな問題を抱えている。それは、検査に要する時間である。食品の大半は、鮮度が重要で有るため、製造後はすぐに出荷される。つまり当日の生産品の微生物検査結果は４８時間の判定であるにもかかわらず、検査結果が出る前に、出荷され食されてしまうのである。万一、先に出荷された食品の微生物汚染により食中毒が発生したとしても、原因があとから分かると言う事である。この問題は、世界的にも共通のテーマとなっている。求められているニーズは、検査結果が出てから安心して出荷出来る事である。近年、培養法以外の簡易判定キットも各種販売はされているものの、２時間以上は、かかる上、簡易で有るため精度に問題がある。

【0005】

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる試薬、測定方法、および測定装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するために、本発明の試薬は、検体に含まれる標的となる微生物を蛍光させる試薬であって、前記標的となる微生物を選択的に蛍光させることを特徴とする。

【0007】

本発明によれば、前記標的となる微生物を選択的に蛍光させることにより、微生物を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる。

【0008】

前記標的となる微生物を大腸菌とし、前記検体において前記大腸菌を選択的に蛍光させることにより、検体において大腸菌を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく大腸菌の測定を行うことができる。

【0009】

バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡと所定の蛍光試薬とを結合したものであることが好ましい。

【0010】

バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡと所定の蛍光試薬とを結合したものを、前記検体に含まれる標的となる微生物である大腸菌と選択的に感染させることにより前記大腸菌を蛍光させることが好ましい。

【0011】

前記所定の蛍光試薬は、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とすることが好ましい。

【0012】

上記目的を達成するために、本発明の測定方法は、検体に含まれる標的となる微生物を蛍光させる試薬により前記標的となる微生物の測定を行う測定方法であって、前記標的となる微生物を選択的に蛍光させることを特徴とする。

【0013】

本発明によれば、前記標的となる微生物を選択的に蛍光させることにより、検体において微生物を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる。

【0014】

前記標的となる微生物を大腸菌とし、前記試薬は、前記検体において前記大腸菌を選択的に蛍光させることにより、検体において大腸菌を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく大腸菌の測定を行うことができる。

【0015】

前記試薬は、バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡに所定の蛍光試薬とを結合した試薬であることが好ましい。

【0016】

前記試薬は、バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡと所定の蛍光試薬とを結合した試薬であり、前記試薬を、前記検体に含まれる標的となる微生物である大腸菌と選択的に感染させることにより前記大腸菌を蛍光させることが好ましい。

【0017】

前記所定の蛍光試薬は、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とすることが好ましい。

【0018】

黒色のフィルタに前記微生物を選択的に蛍光させる試薬を含侵させるとともに、前記試薬を含侵させた前記黒色のフィルタを用いて前記微生物を選択的に蛍光させる処理を行うことにより、黒色の背景に微生物の蛍光を浮き出るようにすることができ、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる。

【0019】

スライドグラスにマーキングされた測定円の中に前記試薬および前記微生物を含む検体を含侵させた前記黒色のフィルタを設置してカバーガラスで覆いプレパラートを作製することができる。

【0020】

前記測定円は、前記スライドグラスに複数マーキングされ、前記複数マーキングされている前記測定円のそれぞれの中に前記微生物を含む検体を含侵させた前記黒色のフィルタを設置することにより、微生物を含む検体を複数並行して測定することができ、測定の効率を向上させることができる。

【0021】

前記プレパラートを設置するステージをＸＹ軸に沿って移動させて前記プレパラートの画像を撮影することができる。

【0022】

ＣＭＯＳセンサーを用いて前記プレパラートの画像を撮影するとともに、撮影した画像を補正し、撮影した画像を解析することができる。

【0023】

前記プレパラートにおけるスライドグラス間の厚みおよび／または形状の相違が修正されるように撮影した画像を補正することにより、スライドグラス間の厚みおよび／または形状が相違する場合にあっても相違が修正されるように補正することができる。

【0024】

前記ステージの傾きが修正されるように撮影した画像を補正することにより、ステージが傾く場合にあっても傾きが修正されるように補正することができる。

【0025】

撮影された画像から前記標的とする微生物を所定の認識パラメータに基づいて認識し、前記標的とする微生物以外のものは認識しないことにより、標的とする微生物のみを効率よく認識することができる。

【0026】

前記認識パラメータは、前記標的とする微生物の形状、前記標的とする微生物のサイズ、前記標的とする微生物の蛍光の強度、および前記標的とする微生物の蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つを含むことができる。

【0027】

上記目的を達成するために、本発明の測定装置は、検体に含まれる標的となる微生物を蛍光させる試薬により前記標的となる微生物の測定を行う測定装置であって、前記標的となる微生物を選択的に蛍光させることを特徴とする。

【0028】

本発明によれば、前記標的となる微生物を選択的に蛍光させることにより、微生物を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる。

【0029】

前記標的となる微生物を大腸菌とし、前記試薬は、前記検体において前記大腸菌を選択的に蛍光させることにより、検体において大腸菌を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく大腸菌の測定を行うことができる。

【0030】

前記試薬は、バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡに所定の蛍光試薬とを結合した試薬であることが好ましい。

【0031】

前記試薬は、バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡと所定の蛍光試薬とを結合した試薬であり、前記試薬を、前記検体に含まれる標的となる微生物である大腸菌と選択的に感染させることにより前記大腸菌を蛍光させることが好ましい。

【0032】

前記所定の蛍光試薬は、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とすることが好ましい。

【0033】

黒色のフィルタに前記微生物を選択的に蛍光させる試薬を含侵させるとともに、前記試薬を含侵させた前記黒色のフィルタを用いて前記微生物を選択的に蛍光させる処理を行うことにより、黒色の背景に微生物の蛍光を浮き出るようにすることができ、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる。

【0034】

スライドグラスにマーキングされた測定円の中に前記試薬および前記微生物を含む検体を含侵させた前記黒色のフィルタを設置してカバーガラスで覆いプレパラートを作製することができる。

【0035】

前記測定円は、前記スライドグラスに複数マーキングされ、前記複数マーキングされている前記測定円のそれぞれの中に前記微生物を含む検体を含侵させた前記黒色のフィルタを設置することにより、微生物を含む検体を複数並行して測定することができ、測定の効率を向上させることができる。

【0036】

前記プレパラートを設置するステージをＸＹ軸に沿って移動させて前記プレパラートの画像を撮影することができる。

【0037】

ＣＭＯＳセンサーを用いて前記プレパラートの画像を撮影するとともに、撮影した画像を補正し、撮影した画像を解析することができる。

【0038】

前記プレパラートにおける前記スライドグラス間の厚みおよび／または形状の相違が修正されるように撮影した画像を補正することにより、スライドグラス間の厚みおよび／または形状が相違する場合にあっても相違が修正されるように補正することができる。

【0039】

前記ステージの傾きが修正されるように撮影した画像を補正することにより、ステージが傾く場合にあっても傾きが修正されるように補正することができる。

【0040】

撮影された画像から前記標的とする微生物を所定の認識パラメータに基づいて認識し、前記標的とする微生物以外のものは認識しないことにより、標的とする微生物のみを効率よく認識することができる。

【0041】

前記認識パラメータは、前記標的とする微生物の形状、前記標的とする微生物のサイズ、前記標的とする微生物の蛍光の強度、および前記標的とする微生物の蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つを含むことができる。

【発明の効果】

【0042】

本発明によれば、迅速にかつ精度よく微生物の測定を行うことができる試薬、測定方法、および測定装置を提供することを目的とする。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】本発明の実施形態に係る試薬の構成を示す図である。

【図2】同試薬が大腸菌に取り込まれた状態を示す図である。

【図3】本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図である。

【図4】本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図３に続く図である。

【図5】本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図４に続く図である。

【図6】本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図５に続く図である。

【図7】本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図６に続く図である。

【図8】本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図７に続く図である。

【図9】同測定方法および測定装置に用いられる顕微鏡装置の構成を示す図である。

【図10】同測定方法および測定装置に用いられる顕微鏡装置の構成を示す別の図である。

【発明を実施するための形態】

【0044】

以下、本発明の実施形態について図面を参照して詳細に説明する。

【0045】

[試薬の実施形態]
図１は、本発明の実施形態に係る試薬の構成を示す図、図２は、同試薬が大腸菌に取り込まれた状態を示す図である。

【0046】

本発明の実施形態に係る試薬１は、図１に示すように、[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａと所定の蛍光試薬１Ｂとを予め混合して結合した試薬である。バクテリオファージＴ４は、大腸菌１０２に感染するバクテリオファージの種であり、二本鎖ＤＮＡウイルスに分類される。バクテリオファージｔ４ＤＮＡは、バクテリオファージＴ４のＤＮＡであり、例えば、バクテリオファージＴ４からＤＮＡを抽出して得ることができる。

【0047】

すなわち、試薬１は、図２に示す検体１００に含まれる標的となる微生物１０１を蛍光させる試薬１であって、標的となる微生物１０１を選択的に蛍光させることができる。本実施形態にあっては、標的となる微生物１０１を大腸菌１０２とし、検体１００において大腸菌１０２を選択的に蛍光させることができる。

【0048】

つまり、試薬１は、上記したように、[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａと所定の蛍光試薬１Ｂとを予め混合して結合した試薬であり、試薬１を、検体１００に含まれる標的となる微生物１０１である大腸菌１０２と選択的に感染させて大腸菌１０２に取り込むことにより大腸菌１０２を蛍光させることができる。本実施形態にあっては、所定の蛍光試薬１Ｂは、ＤＮＡ蛍光試薬であり、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とすることができる。ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）は、大腸菌１０２の培養をすることなく用いることができ、例えば予め大腸菌１０２の培養が必要なＡＯ（アクリルオレンジ）に対し顕著な効果を有する。

【0049】

このように、試薬１は、標的となる微生物１０１を選択的に蛍光させることにより、微生物１０１を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく微生物１０１の測定を行うことができる。

【0050】

また、標的となる微生物１０１を大腸菌１０２とし、検体１００において大腸菌１０２を選択的に蛍光させることにより、検体１００において大腸菌１０２を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく大腸菌１０２の測定を行うことができる。

【0051】

[測定方法および測定装置の実施形態]
図３乃至図８は、本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置に用いられるプレパラートの作製方法を示す図、図９および図１０は、同測定方法および測定装置に用いられる顕微鏡装置の構成を示す図である。

【0052】

本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置２００には、上記した試薬１が用いられる。すなわち、本測定方法および測定装置２００は、検体１００に含まれる標的となる微生物１０１を蛍光させる試薬１により標的となる微生物１０１の測定を行う測定方法および測定装置２００であって、標的となる微生物１０１を選択的に蛍光させることができる。測定装置２００は、後述する蛍光処理装置６０および顕微鏡装置７０を有している。

【0053】

本測定方法および測定装置２００においては、標的となる微生物１０１を大腸菌１０２とし、試薬１は、検体において大腸菌１０２を選択的に蛍光させることができる。

【0054】

試薬１は、図１に示すように、[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａに所定の蛍光試薬１Ｂとを予め混合して結合した試薬である。バクテリオファージＴ４は、大腸菌１０２に感染するバクテリオファージの種であり、二本鎖ＤＮＡウイルスに分類される。バクテリオファージｔ４ＤＮＡは、バクテリオファージＴ４のＤＮＡであり、例えば、バクテリオファージＴ４からＤＮＡを抽出して得ることができる。

【0055】

すなわち、試薬１は、図２に示す検体１００に含まれる標的となる微生物１０１を蛍光させる試薬１であって、標的となる微生物１０１を選択的に蛍光させることができる。本実施形態にあっては、標的となる微生物１０１を大腸菌１０２とし、検体１００において大腸菌１０２を選択的に蛍光させることができる。

【0056】

つまり、試薬１は、上記したように、[バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ]１Ａと所定の蛍光試薬１Ｂとを予め混合して結合した試薬であり、試薬１を、検体１００に含まれる標的となる微生物１０１である大腸菌１０２と選択的に感染させて大腸菌１０２に取り込むことにより大腸菌１０２を蛍光させることができる。本実施形態にあっては、所定の蛍光試薬１Ｂは、ＤＮＡ蛍光試薬であり、ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）とすることができる。ＦＤＡ (フルオレセイン・ジアセテート)および／またはＰＩ（プロピディウムイオダイド）は、大腸菌１０２の培養をすることなく用いることができ、例えば予め大腸菌１０２の培養が必要なＡＯ（アクリルオレンジ）に対し顕著な効果を有する。

【0057】

本測定方法および測定装置２００においては、所定のプレパラート１０を用いて大腸菌１０２の測定を行うことができる。プレパラート１０の作製方法は次のように説明される。

【0058】

すなわち、まず図３に示すように、黒色のフィルタ２０を用意する。
次いで、図４に示すように、黒色のフィルタ２０に大腸菌１０２を選択的に蛍光させる試薬１を含侵させるとともに、試薬１を含侵させた黒色のフィルタ２０を用いて大腸菌１０２を選択的に蛍光させる処理を行うことを可能とする。

【0059】

より詳しくは、図４に示すように、黒色のフィルタ２０に大腸菌１０２を選択的に蛍光させる試薬１を含侵させるとともに、図５に示すように、試薬１を含侵させた黒色のフィルタ２０に大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させて大腸菌１０２を選択的に蛍光させる処理を行うことを可能とする。

【0060】

続いて、スライドグラス３０を用意し、図６に示すように、スライドグラス３０に測定円４０をマーキングする。

【0061】

次に、図７に示すように、マーキングされた測定円４０の中に試薬１および大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０を設置して、続いて、図８に示すように、カバーガラス５０で覆いプレパラート１０を作製する。

【0062】

測定円４０は、スライドグラス３０に複数マーキングされ、複数マーキングされている測定円４０のそれぞれの中に大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０を設置する。

【0063】

また、本測定方法および測定装置２００においては、このように作製されたプレパラート１０を用いて、図９および図１０に示すように、蛍光処理装置６０により蛍光処理を行い、顕微鏡装置７０により画像の撮影や補正、解析を行うことができる。顕微鏡装置７０は蛍光顕微鏡装置である。

【0064】

すなわち、蛍光処理装置６０は、励起光照射部６１および波長測定部６２を有している。励起光照射部６１は、プレパラート１０（より詳しくは、試薬１および大腸菌１０２を含侵させた複数の黒色のフィルタ２０）に所定の波長の励起光を照射することができる。波長測定部６２は、励起光を吸収したプレパラート１０（より詳しくは、試薬１および大腸菌１０２を含侵させた複数の黒色のフィルタ２０）からの蛍光の波長を測定することができる。

【0065】

顕微鏡装置７０は、ＸＹ軸に沿って移動するステージ７１を有している。すなわち、顕微鏡装置７０において、プレパラート１０を設置するステージ７１をＸＹ軸に沿って移動させて励起光を吸収したプレパラート１０（より詳しくは、試薬１および大腸菌１０２を含侵させた複数の黒色のフィルタ２０）の画像を複数撮影することができる。

【0066】

より詳しくは、顕微鏡装置７０は、更に記憶部７２、撮影部７３、補正部７５、および解析部７４を有している。

【0067】

記憶部７２は、標準的な認識パラメータとして標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的なサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の濃淡のデータを記憶することができる。

【0068】

また、撮影部７３は、ＣＭＯＳセンサーを用いてプレパラート１０の画像を複数の黒色フィルタ２０のそれぞれにおいて複数撮影するとともに、補正部７５は、撮影部７３が撮影した画像を補正し、解析部７４は、撮影部７３が撮影した画像を定性的および／または定量的に解析することができる。

【0069】

ここで、補正部７５は、プレパラート１０におけるスライドグラス３０間の厚みおよび／または形状の相違が修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することができる。

【0070】

すなわち、補正部７５は、標準とするスライドグラス３０の厚みおよび／または形状に対する撮影対象となるスライドグラス３０の厚みおよび／または形状の相違が修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することができる。

【0071】

また、補正部７５は、ステージ７１の傾きが修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することができる。すなわち、補正部７５は、ステージ７１の所定の方向より詳しくは水平方向に対する傾きが修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することができる。なお、撮影部７３は、プレパラート１０との距離を複数変更することにより、画像を拡大または縮小しながら撮影することもできる。すなわち、スライドグラス３０の厚みや形状の個体差、およびスライドグラス３０を設置するステージ７１の傾きを測定毎に、検体１００の表面を撮影部７３にて３測点以上の距離で測定して、スライドグラス３０の個体差（厚みや歪み）や傾きを撮影部７３のズームや補正部７５で補正しながら撮影することができる機能を有している。

【0072】

更に、解析部７４は、撮影部７３により撮影された画像から標的とする微生物１０１である大腸菌１０２を所定の認識パラメータに基づいて認識し、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２以外のものは認識しないように解析することができる。

【0073】

認識パラメータは、例えば、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２のサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つを含むことができる。

【0074】

すなわち、解析部７４は、記憶部７２に記憶された標準的な認識パラメータとして標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的なサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の濃淡のデータを読み出すとともに、これら読み出したデータと撮影部７３により撮影された画像（より詳しくは補正部７５により補正された画像）とを比較して、撮影された画像（より詳しくは補正された画像）が、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的なサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つと所定の範囲で合致するか否かを解析することができる。

【0075】

撮影された画像（より詳しくは補正された画像）が、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的なサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つと所定の範囲で合致した場合、解析部７４は、撮影された画像（より詳しくは補正された画像）の微生物１０１が標的とする微生物１０１である大腸菌１０２であるとみなすことができる。

【0076】

本発明者は、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的なサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の標準的な蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つと所定の範囲で合致した場合に撮影された画像（より詳しくは補正された画像）の微生物１０１が標的とする微生物１０１である大腸菌１０２とみなすことができることを明らかにしている。

【0077】

すなわち、検体１００には、大腸菌１０２等の微生物１０１の他に、食品残さや、汚れ、その他の異物が混入されていることがあり、上記のような蛍光染色を行っても、微生物１０１と非微生物との判定が難しい場合があるが、上記のような３つ以上の認識パラメータによって認識することによって大腸菌１０２等の微生物１０１のみを測定し、微生物１０１以外は測定しないこととすることが可能となる。

【0078】

なお、撮影部７３が撮影した画像において、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２のサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の蛍光の濃淡は、プレパラート１０におけるスライドグラス３０間の厚みおよび／または形状の相違やステージ７１の傾きによりピントがずれて画像がぼやけてしまう等影響を受けることとなるが、上記したように、補正部７５は、プレパラート１０におけるスライドグラス３０間の厚みおよび／または形状の相違が修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することができるとともに、ステージ７１の傾きが修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することができるため、このような影響を適宜補正して正確な画像処理を行うことができる。

【0079】

以上説明したように、本発明の測定方法および測定装置２００によれば、標的となる微生物１０１を選択的に蛍光させることにより、検体１００において微生物１０１を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく微生物１０１の測定を行うことができる。

【0080】

また、標的となる微生物１０１を大腸菌１０２とし、試薬１は、検体１００において大腸菌１０２を選択的に蛍光させることにより、検体１００において大腸菌１０２を選択して測定することができる等、迅速にかつ精度よく大腸菌１０２の測定を行うことができる。

【0081】

更に黒色のフィルタ２０に大腸菌１０２を選択的に蛍光させる試薬１を含侵させるとともに、試薬１を含侵させた黒色のフィルタ２０を用いて大腸菌１０２を選択的に蛍光させる処理を行うことにより、黒色の背景に大腸菌１０２の蛍光を浮き出るようにすることができ、迅速にかつ精度よく大腸菌１０２の測定を行うことができる。

【0082】

更にまた、測定円４０は、スライドグラス３０に複数マーキングされ、複数マーキングされている測定円４０のそれぞれの中に大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０を設置することにより、大腸菌１０２を含む検体１００を複数並行して測定することができ、測定の効率を向上させることができる。

【0083】

また更に、補正部７５は、プレパラート１０におけるスライドグラス３０間の厚みおよび／または形状の相違が修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することにより、スライドグラス３０間の厚みおよび／または形状が相違する場合にあっても相違が修正されるように補正することができる。

【0084】

また、補正部７５は、ステージ７１の傾きが修正されるように撮影部７３が撮影した画像を補正することにより、ステージ７１が傾く場合にあっても傾きが修正されるように補正することができる。

【0085】

更に、補正部７５は、撮影部７３により撮影された画像から標的とする微生物１０１を所定の認識パラメータに基づいて認識し、標的とする微生物１０１以外のものは認識しないことにより、標的とする微生物１０１のみを効率よく認識することができる。

【0086】

なお、本発明は上述した実施形態に限定されることなく種々の変形実施、応用実施が可能であることは勿論である。

【0087】

すなわち、上述した実施形態にあっては、微生物１０１を大腸菌１０２とすることとしているが、大腸菌１０２以外の微生物１０１に適宜対応可能である。

【0088】

つまり、上述した実施形態にあっては、黒色のフィルタ２０に大腸菌１０２を選択的に蛍光させる試薬１を含侵させるとともに、試薬１を含侵させた黒色のフィルタ２０を用いて大腸菌１０２を選択的に蛍光させる処理を行うこととしているが、黒色のフィルタ２０に大腸菌１０２以外の微生物１０１を選択的に蛍光させる試薬１を含侵させるとともに、試薬１を含侵させた黒色のフィルタ２０を用いて大腸菌１０２以外の微生物１０１を選択的に蛍光させる処理を行うこととしても所要の効果を奏することができる。

【0089】

また、上述した実施形態にあっては、スライドグラス３０にマーキングされた測定円４０の中に試薬１および大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０を設置してカバーガラス５０で覆いプレパラート１０を作製することとしているが、スライドグラス３０にマーキングされた測定円４０の中に試薬１および大腸菌１０２以外の微生物１０１を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０を設置してカバーガラス５０で覆いプレパラート１０を作製することとしても所要の効果を奏することができる。

【0090】

更に、上述した実施形態にあっては、撮影部７３により撮影された画像から標的とする微生物１０１である大腸菌１０２を所定の認識パラメータに基づいて認識し、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２以外のものは認識しないこととし、認識パラメータは、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の形状、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２のサイズ、標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の蛍光の強度、および標的とする微生物１０１である大腸菌１０２の蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つを含むこととしているが、標的とする微生物１０１を大腸菌１０２以外の微生物１０１としても所要の効果を奏することができる。

【0091】

つまり、単に、撮影部７３により撮影された画像から標的とする微生物１０１を所定の認識パラメータに基づいて認識し、標的とする微生物１０１以外のものは認識しないこととし、認識パラメータは、標的とする微生物１０１の形状、標的とする微生物１０１のサイズ、標的とする微生物１０１の蛍光の強度、および標的とする微生物１０１の蛍光の濃淡の少なくともいずれか三つを含むこととしても所要の効果を奏することができる。

【0092】

更にまた、上述した実施形態にあっては、複数マーキングされている測定円４０のそれぞれの中に大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０を設置することとしているが、大腸菌１０２を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０と大腸菌１０２以外の微生物１０１を含む検体１００を含侵させた黒色のフィルタ２０をそれぞれ別々の測定円４０の中に設置し二種以上の微生物１０１を同時測定することとしてもよい（例えば、一般細菌数と大腸菌数を同時に測定する）。

【符号の説明】

【0093】

１：試薬
１Ａ：バクテリオファージｔ４および／またはバクテリオファージｔ４ＤＮＡ
１Ｂ：蛍光試薬
１０：プレパラート
２０：フィルタ
３０：スライドグラス
４０：測定円
５０：カバーガラス
６０：蛍光処理装置
６１：励起光照射部
６２：波長測定部
７０：顕微鏡装置
７１：ステージ
７２：記憶部
７３：撮影部
７４：解析部
７５：補正部
１００：検体
１０１：微生物
１０２：大腸菌
２００：測定装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】