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特開2024-178424増殖性疾患の処置で使用するためのジスルホナートスチルベン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024178424
(43)【公開日】2024-12-24
(54)【発明の名称】増殖性疾患の処置で使用するためのジスルホナートスチルベン
(51)【国際特許分類】
A61K 31/27 20060101AFI20241217BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241217BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20241217BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20241217BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241217BHJP
【ＦＩ】
A61K31/27
A61P35/00
A61P15/00
A61P19/00
A61P25/00
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024167307
(22)【出願日】2024-09-26
(62)【分割の表示】P 2021529116の分割
【原出願日】2019-11-22
(31)【優先権主張番号】18306546.5
(32)【優先日】2018-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505028222
【氏名又は名称】ナント ユニベルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】516086358
【氏名又は名称】サントル ナショナル デ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】521221238
【氏名又は名称】ユニバーシテ デュ・マン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100227329
【弁理士】
【氏名又は名称】延原 愛
(72)【発明者】
【氏名】フルーリー，ファブリス
(72)【発明者】
【氏名】デマイヤー，アレクサンドレ
(72)【発明者】
【氏名】ウィーゲル，ピエール
(72)【発明者】
【氏名】シュネ，ブノワ
(72)【発明者】
【氏名】マテー，モニーク
(72)【発明者】
【氏名】ル・ブルトン，ジャック
(57)【要約】 （修正有）
【課題】増殖性疾患の処置に使用するための新規のＲＡＤ５１タンパク質阻害剤の提供。
【解決手段】式（Ｉ）：
の化合物であって、式中、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され； Ｒは、（Ｃ１－Ｃ４）－アルキルおよびフェニルから選択され、ここで前記フェニルは、独立して（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい；化合物またはその薬学的に許容される塩。
【選択図】なし
【解決手段】式（Ｉ）：
の化合物であって、式中、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され； Ｒは、（Ｃ１－Ｃ４）－アルキルおよびフェニルから選択され、ここで前記フェニルは、独立して（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい；化合物またはその薬学的に許容される塩。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
増殖性疾患の処置における使用のための医薬組成物であって、式（Ｉ）：
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され；
Ｒは、（Ｃ１－Ｃ４）－アルキルおよびフェニルから選択され、ここで前記フェニルは、独立して（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい；
医薬組成物。
【化1】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され；
Ｒは、（Ｃ１－Ｃ４）－アルキルおよびフェニルから選択され、ここで前記フェニルは、独立して（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい；
医薬組成物。
【請求項2】
前記フェニルは、独立してメチル、メトキシ、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂが両方ともナトリウムである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂが両方ともカリウムである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記式（Ｉ）の化合物が、
から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【表1】
【請求項6】
前記増殖性疾患が、がんである、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記がんが、乳がんである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記がんが、神経膠芽腫である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記がんが、多発性骨髄腫である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項10】
少なくとも別の活性成分をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記少なくとも別の活性成分が、抗悪性腫瘍性の活性成分である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
式（ＩＩ）：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択される、
化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化2】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択される、
化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項13】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂが、同一である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項14】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂが両方ともナトリウムである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項15】
ハロ－ホルメートと（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アミノベンゼンスルホナート）との反応のステップを含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の化合物を製造するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、増殖性疾患の処置に使用するための、ＲＡＤ５１タンパク質の阻害剤として有用なジスルホナートスチルベン化合物、特にジスルホナートスチルベンに関する。
【背景技術】
【0002】
放射線療法または化学療法などの増殖性疾患療法は、多くの場合、がん細胞から誘導された耐性および／または固有の耐性に直面している。ＤＮＡ修復経路は、この処置により損傷を受けたがん細胞のＤＮＡを回復させることが可能であり、これにより、上記処置の効力は低減する。よって、ＤＮＡ修復経路の阻害は、抗悪性腫瘍性処置に対し腫瘍を感作するための興味深い選択肢である。
【0003】
二重鎖切断（ＤＳＢ）は、ＤＮＡの最も有害な核の変化であり、相同組み換え（ＨＲ）と呼ばれる生体プロセスにより修復され得る。ＲＡＤ５１タンパク質は、ＨＲ修復経路の主要な要素である。ＲＡＤ５１タンパク質のリコンビナーゼ活性の第１のステップは、相同性の検索と、損傷したＤＮＡ配列と相同配列との間の鎖交換とを触媒するＲＡＤ５１タンパク質のヌクレオフィラメントの形成であり、これによりＤＳＢの正確な修復を確保する。よって、ＲＡＤ５１タンパク質の調節不全は、発がんをもたらし、がんの耐性を促進し得る。ＲＡＤ５１タンパク質の過剰発現は、いくつかのがんの起源で細胞のゲノムの不安定性をもたらし、また、一部の抗がん処置により誘導されるＤＳＢの修復を促進することにより耐性を提供する。特に、がんについて処置されており、より高いレベルのＲＡＤ５１タンパク質を発現する患者の生存が短いこと、およびアンチセンスまたはリボザイム処置によってＲＡＤ５１タンパク質の量を減少させると、放射線療法によるがん処置の有効性が改善することが示されている。よって、ＲＡＤ５１タンパク質は、ＨＲを調節するための適切な生物学的標的であり、よって、抗増殖性処置のより良好な効力をもたらす。
【0004】
抗リコンビナーゼ活性を示す小分子の同定に注目が集まっており、いくつかのＲＡＤ５１タンパク質阻害性小分子が見出されている。これらは、ＲＡＤ５１タンパク質リコンビナーゼ活性の特定のステップを直接妨害し、それによってＨＲ修復経路を防止または制限することができる。当該分野のＲＡＤ５１タンパク質小分子阻害剤の例として、以下がある。
【化1】
【0005】
特に、ＢＰＱが、タンパク質－ＤＮＡの相互作用を標的とすることによりＲＡＤ５１のフィラメントの形成を障害すること（Ｈｕａｎｇ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＡＤ５１ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｐｒｉｌ ２０１２， Ｖｏｌ． ５５， ｐｐ． ３０１１－３０２０）、およびドキソルビシンで処置したがん細胞の感作が観察され得ること（Ａｌａｇｐｕｌｉｎｓａ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， ”Ａ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＲＡＤ５１ ｒｅｄｕｃｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ”， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４， Ｖｏｌ． ４， ｐ． ２８９）が示されている。
【0006】
特に、ＤＩＤＳが、ＨＲの際にＲＡＤ５１のリコンビナーゼ活性を阻害できることが示された（Ｉｓｈｉｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ”ＤＩＤＳ， ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＲＡＤ５１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐａｉｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ．”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９， Ｖｏｌ． ３７， Ｎｏ． １０， ｐｐ． ３３６７ ３３７６）。阻害活性はＤＩＤＳとＲＡＤ５１タンパク質との直接的な相互作用に起因すると思われるが、ＤＩＤＳの作用機構は、解明されておらず、関与する生物学的標的も依然として決定されていない。
【0007】
しかしながら、ＤＩＤＳまたはＢＰＱなどのＲＡＤ５１タンパク質小分子阻害剤は、たとえば治療効率（たとえば感作効果に関する）、副作用の存在もしくは効力、他の生物学的受容体に対する選択性、および／または当該分子の化学的安定性に関する、がんに対するそれらの医学的使用を障害する制限を有する。
【0008】
特に、阻害剤としてのＤＩＤＳは、膜輸送体（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｍ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ． ”Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＤＩＤＳ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １ ｓｕｇｇｅｓｔ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ｐｌａｕｓｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ．”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００９， Ｖｏｌ． ２８４， Ｎｏ． ３０， ｐｐ． ２００１１ ２００２１）およびイオンチャネル（Ｍａｔｕｌｅｆ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． ”Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ＣＬＣ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．”， ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００８， Ｖｏｌ． ３， Ｎｏ． ７， ｐｐ． ４１９ ４２８）をも阻害するため、ＲＡＤタンパク質に特異的ではない。よって、ＤＩＤＳは、細胞傷害性などの有害な副作用を誘導し得る。
【0009】
さらに、ＤＩＤＳのイソチオシアネート官能基は、加水分解に感受性があることが知られており（Ｊａｋｏｂｓｅｎ， Ｐ． ａｎｄ Ｈｏｒｏｂｉｎ， Ｒ．Ｗ．， ”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ４－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ－４’－Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ－２，２’－Ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ （Ｓｉｔｓ） Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｔｉｌｂｅｎｅ Ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ” Ｓｔａｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９８９， Ｖｏｌ． ６４， Ｎｏ． ６， ｐｐ． ３０１－３１３）、結果として、潜在的な塩素チャネルまたは輸送体阻害活性を有するＤＩＤＳオリゴマーが、形成され得る（たとえば国際特許公開公報第２０１０／１４８１７７号参照）。
【0010】
本出願人は、既知の化合物の制限を克服するために可能な、新規ＲＡＤ５１タンパク質阻害剤を想定および合成するために徹底的な研究を行った。予想外なことに、この研究の過程の間に、いくつかのジスルホナートスチルベン化合物が、ＲＡＤ５１タンパク質の強力な阻害剤であり、よって、増殖性疾患の処置に有用であり得ることが見出された。
【0011】
本発明に係るジスルホナートスチルベンは、強力なＲＡＤ５１タンパク質阻害剤である。その有効性は、当該分野のＲＡＤ５１タンパク質と同等であるか、またはこれより優れている。特にこれらは、抗悪性腫瘍薬の存在下で増殖性細胞を効率的に感作する。
【0012】
本発明に係るジスルホナートスチルベンは、当該分野のＲＡＤ５１阻害剤よりも有害な副作用の誘導が少ない。特にこれらは、細胞傷害性が低い。
【0013】
本発明に係るジスルホナートスチルベンはまた、当該分野の分子と比較して改善された化学的安定性を有し得る。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、増殖性疾患の処置に使用するための、式（Ｉ）の化合物：
（式中、
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され；
ＲＡおよびＲＢは、同一であり、－ＮＨ－ＣＯＲ、－ＮＨ－ＣＯＯＲ、－ＮＨ－ＳＯ２Ｒ、アジド、シアノ、およびハロゲン化物から選択され；
ここで、各Ｒは、独立して、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル、（Ｃ３－Ｃ６）－シクロアルキル、（Ｃ６－Ｃ１０）アリール、および（Ｃ６－Ｃ１０）－ヘテロアリール基から選択され、
前記基は、独立して（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル、（Ｃ３－Ｃ６）－シクロアルキル、（Ｃ１－Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－Ｓ－、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい）
、またはその薬学的に許容される塩に関する。
【化2】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され；
ＲＡおよびＲＢは、同一であり、－ＮＨ－ＣＯＲ、－ＮＨ－ＣＯＯＲ、－ＮＨ－ＳＯ２Ｒ、アジド、シアノ、およびハロゲン化物から選択され；
ここで、各Ｒは、独立して、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル、（Ｃ３－Ｃ６）－シクロアルキル、（Ｃ６－Ｃ１０）アリール、および（Ｃ６－Ｃ１０）－ヘテロアリール基から選択され、
前記基は、独立して（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル、（Ｃ３－Ｃ６）－シクロアルキル、（Ｃ１－Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－Ｓ－、およびニトロから選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい）
、またはその薬学的に許容される塩に関する。
【0015】
一実施形態によれば、各Ｒは、独立して、（Ｃ１－Ｃ４）－アルキル、フェニル、ピリジニル、またはジアジニル基から選択され；フェニル、ピリジニル、またはジアジニル基は、独立して（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択される、好ましくはメチル、メトキシ、およびニトロから選択される、１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢは、－ＮＨ－ＣＯＲ、－ＮＨ－ＣＯＯＲ、および－ＮＨ－ＳＯ２Ｒから選択される。一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢは、アジド、シアノ、およびハロゲン化物から選択される。一実施形態によれば、ハロゲン化物は、ヨウ素である。一実施形態によれば、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂが両方ともナトリウムであるか、またはＲ０ＡおよびＲ０Ｂが両方ともカリウムである。
【0016】
一実施形態によれば、本化合物は、
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アセトアミドベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－プロピオンアミド（ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－ベンズアミドベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－メトキシベンズアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－ニトロベンズアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（エトキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（イソブトキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（フェノキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（フェニルスルホンアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（４－メチルフェニル）スルホンアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（４－ニトロフェニル）スルホンアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アジドベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－シアノベンゼンスルホナート）；および
カリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－ヨードベンゼンスルホナート）
から選択される。
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アセトアミドベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－プロピオンアミド（ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－ベンズアミドベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－メトキシベンズアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－ニトロベンズアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（エトキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（イソブトキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（フェノキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（フェニルスルホンアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（４－メチルフェニル）スルホンアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（４－ニトロフェニル）スルホンアミド）ベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アジドベンゼンスルホナート）；
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－シアノベンゼンスルホナート）；および
カリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－ヨードベンゼンスルホナート）
から選択される。
【0017】
一実施形態によれば、増殖性疾患は、がん、好ましくは乳がん、神経膠芽腫、または多発性骨髄腫である。
【0018】
また本発明は、本発明に係る使用のための式（Ｉ）の化合物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物にも関する。
【0019】
一実施形態によれば、本組成物は、少なくとも別の活性成分をさらに含む。一実施形態では、少なくとも別の活性成分は、抗悪性腫瘍性の活性成分である。
【0020】
また本発明は、式（ＩＩ）の化合物：
（式中、
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され；
各Ｒは、独立して、（Ｃ６－Ｃ１０）－アリールおよび（Ｃ６－Ｃ１０）－ヘテロアリール基から選択される）
またはその薬学的に許容される塩に関する。
【化3】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素、リチウム、ナトリウム、およびカリウムから選択され；
各Ｒは、独立して、（Ｃ６－Ｃ１０）－アリールおよび（Ｃ６－Ｃ１０）－ヘテロアリール基から選択される）
またはその薬学的に許容される塩に関する。
【0021】
一実施形態によれば、各Ｒは、独立して、フェニル、ピリジニル、およびジアジニルから選択され；好ましくはフェニルである。一実施形態によれば、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂが、同一であり；好ましくはＲ０ＡおよびＲ０Ｂがナトリウムである。
【0022】
また本発明は、本発明に係る式（ＩＩ）の化合物を製造するためのプロセスであって、ハロ－ホルメートと（Ｅ）６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アミノベンゼンスルホナート）の反応のステップを含む、プロセスに関する。
【発明を実施するための形態】
【0023】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【0024】
「活性成分」および「活性な薬学的成分」および「治療剤」は、治療で使用するためのおよび健康に関連する化合物を表す。特に活性成分は、疾患、好ましくは増殖性疾患を処置または防止するために適応され得る。また活性成分は、疾患、好ましくは増殖性疾患を処置または防止するために、別の活性成分の治療活性を改善するために適応され得る。
【0025】
「アルケン」または「アルケニル」は、２～１２個の炭素原子、好ましくは２～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を有し；少なくとも１つの二重結合を有する、いずれかの直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を表す。アルケニル基の例は、エテニル、２－プロペニル、２－ブテニル、３－ブテニル、２－ペンテニルおよびそのアイソマー、２－ヘキセニルおよびそのアイソマー、または２，４－ペンタジエニルである。
【0026】
「アルコキシ」は、式－Ｏ－アルキルの基を表す。
【0027】
「アルキル」は、１～１２個の炭素原子、好ましくは１～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を有するいずれかの直鎖状または分枝状の飽和炭化水素鎖を表す。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチルおよびそのアイソマー（たとえばｎ－ペンチルもしくはｉ－ペンチル）、またはヘキシルおよびそのアイソマー（たとえばｎ－ヘキシルもしくはｉ－ヘキシル）である。
【0028】
「アルキン」または「アルキニル」は、２～１２個の炭素原子、好ましくは２～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を有し；少なくとも１つの三重結合を有する、いずれかの直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を表す。アルキニル基の例は、エチニル、２－プロピニル、２－ブチニル、３－ブチニル、２－ペンチニルおよびそのアイソマー、または２－ヘキシニルおよびそのアイソマーである。
【0029】
「アミド」は、アミド部分（－ＮＨ－ＣＯ－）を含む基を表す。
【0030】
「アリール」は、５～１６個の炭素原子、好ましくは６～１２個の炭素原子、より好ましくは６～１０個の炭素原子を有し；単環（すなわちフェニル）または少なくとも１つの環が芳香環である、共に縮合（たとえばナフチル）かもしくは共有結合した複数の芳香環を有する、多価不飽和芳香族炭化水素基を表す。芳香環は、任意選択で、それに縮合した１～２つのさらなる環（シクロアルキル、ヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、またはヘテロアリールのいずれか）を含み得る。アリールの例は、フェニル、ビフェニリル、ビフェニレニル、５－または６－テトラリニル、ナフタレン－１－または－２－イル、４－、５－、６、または７－インデニル、１－、２－、３－、４－、または５－アセナフチレニル（ａｃｅｎａｐｈｔｙｌｅｎｙｌ）、３－、４－、または５－アセナフテニル（ａｃｅｎａｐｈｔｅｎｙｌ）、１－または２－ペンタレニル（ｐｅｎｔａｌｅｎｙｌ）、４－または５－インダニル、５－、６－、７－、または８－テトラヒドロナフチル、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、１，４－ジヒドロナフチル、１－、２－、３－、４－、または５－ピレニルである。
【0031】
「アジド」は、式－Ｎ３の基を表す。
【0032】
「ＢＰＱ」は、（Ｅ）－３－ベンジル－２－（２－（ピリジン－３－イル）ビニル）キナゾリン－４（３Ｈ）－オンを表す。
【0033】
「カルバメート」は、カルバメート部分（－ＮＨ－ＣＯＯ－）を含む基を表す。
【0034】
「Ｃｔｒｌ」は、「対照」を意味する。
【0035】
シアノは、式－ＣＮの基を表す。
【0036】
「シクロアルキル」は、直鎖状または分枝状である、少なくとも３個の炭素原子を含むいずれかの環式または多環式のアルキル基を表す。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルである。
【0037】
「シクロアルケニル」は、直鎖状または分枝状である、少なくとも５個の炭素原子を含むいずれかの環式または多環式のアルケニル基を表す。
【0038】
「ＤＩＤＳ」は、４，４’－ジイソチオシアノ－２，２’－スチルベン－ジスルホン酸を表す。
【0039】
「疾患」は、いずれかの疾患、障害、または病態、好ましくは増殖性の疾患、障害、または病態を包有する。処置の目的は、それを必要とする対象において疾患を防止または遅延させることである。
【0040】
「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を表す。
【0041】
「ハロゲン化物」は、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、またはヨウ素（Ｉ）原子を表す。
【0042】
「ヘテロアリール」は、５～１６個の炭素原子、好ましくは６～１２個の炭素原子、より好ましくは６～１０個の炭素原子を有し；少なくとも１つの環が芳香族である、共に縮合かまたは共有結合した１つまたは２つの環を有し；これら環の１つ以上で１つ以上の炭素原子が、酸素、窒素、および／または硫黄の元素に置換されており、窒素および硫黄ヘテロ原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が、任意選択で四級化されていてもよい、芳香環または芳香環系を表す。このような環は、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル環に縮合し得る。ヘテロアリールの例は、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、オキサトリアゾリル（ｏｘａｔｒｉａｚｏｌｙｌ）、チアトリアゾリル（ｔｈｉａｔｒｉａｚｏｌｙｌ）、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、ジオキシニル、チアジニル、トリアジニル、イミダゾ［２，１－ｂ］［１，３］－チアゾリルまたはチエノ［３，２－ｂ］フラニルである。
【0043】
「ヘテロアルキル」は、少なくとも３個の炭素原子を含み、酸素、窒素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子によって中断される、いずれかのアルキル基を表す。窒素および硫黄のヘテロ原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されてもよい。
【0044】
「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも３個の炭素原子を含み、直鎖状または分枝状であり、酸素、窒素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子によって中断される、非芳香族の環式または多環式のアルキル基を表す。窒素および硫黄のヘテロ原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されてもよい。
【0045】
「ニトロ」は、式－ＮＯ２の基を表す。
【0046】
「医薬組成物」は、薬学的に許容される賦形剤と会合した活性成分を含む組成物を表す。医薬組成物は、治療に使用するためのものであり、健康に関連している。特に医薬組成物は、疾患、好ましくは増殖性疾患を処置または防止するために適応され得る。
【0047】
「薬学的に許容される」は、医薬組成物の成分が互いに適合性であり、対象に投与した際に有害ではないことを意味する。
【0048】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に投与した際に、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない賦形剤またはビヒクルを表す。これは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。ヒトへの投与では、調製物は、たとえばアメリカ食品医薬局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）が要求する無菌性、発熱性、全般的な安全性、および純度の基準と一致しなければならない。
【0049】
「ＲＡＤ５１」、「ＲＡＤ５１Ａ」、または「ＲＥＣＡ」は、ＲＡＤ５１遺伝子を表す。
【0050】
「ＲＡＤ５１タンパク質」は、「ＤＮＡ修復タンパク質ＲＡＤ５１タンパク質ホモログ１」または「ＲＡＤリコンビナーゼ」の略語であり、ＲＡＤ５１によりコードされるタンパク質を表す。
【0051】
「ＲＡＤ５１タンパク質ヌクレオフィラメント」は、ＲＡＤ５１タンパク質依存性相同組み換え（ＨＲ）プロセスの主要なステップに関与するシナプス前のフィラメントアセンブリを表す（Ｖｅｌｉｃ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ”ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”， Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５， Ｖｏｌ． ５， Ｎｏ． ４， ｐｐ． ３２０４－３０５９）。
【0052】
「対象」は、温血動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを表す。好ましくは、対象は、患者、すなわち医療の受診を待機しているか、または医療を受診しているか、または現在／将来に医療の対象である／あろう対象である。好ましくは、対象は増殖性疾患を有する。
【0053】
「スルホンアミド」は、スルホンアミド部分（－ＮＨ－ＳＯ２－）を含む基を表す。
【0054】
「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」は、治療的処置および予防的または防止的手段（この目的は、それを必要とする対象の目的の疾患を防止または遅延する（弱める）ことである）の両方を表す。処置を必要とするものは、疾患、障害、もしくは病態をすでに有するもの、および障害を有する傾向のあるもの、または障害を防止すべきものを含む。本発明に係る物質または組成物の治療量を投与した後に、対象が、以下：病原性細胞の数の低下；病原性である総細胞のパーセントの低下；特定の疾患、障害、もしくは病態に関連する症状のうちの１つ以上のある程度までの緩和；罹患率および死亡率の低下；および／またはクオリティオブライフの問題の改善のうちの１つ以上の観察可能かつ／または測定可能な低減または不存在を示す場合、対象の当該疾患、障害、または病態に関する「処置」が成功している。処置の成功および疾患、障害、または病態の改善を評価するための上記パラメータは、医師に知られている通常の手順により容易に測定可能である。好ましくは、処置される疾患は、増殖性疾患である。
【0055】
化学的な置換基が化学基の組み合わせである場合、分子に対する置換基の結合点は、記載される最後の化学基によるものである。たとえば、「アリールアルキル」置換基は、アルキル部分を介して分子の残りに結合しており、これは、以下：「アリール－アルキル－」のように表され得る。
【0056】
詳細な説明
化合物
本発明は、式（Ｉ－０）の化合物：
（式中、
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素；薬学的に許容される陽イオン；およびスルホナート官能保護基または前駆体から選択され；
ＲＡおよびＲＢは、独立して、アミド、カルバメート、スルホンアミド、アジド、シアノ、およびハロゲン化物から選択される）
に関する。
化合物
本発明は、式（Ｉ－０）の化合物：
【化4】
Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、独立して、水素；薬学的に許容される陽イオン；およびスルホナート官能保護基または前駆体から選択され；
ＲＡおよびＲＢは、独立して、アミド、カルバメート、スルホンアミド、アジド、シアノ、およびハロゲン化物から選択される）
に関する。
【0057】
一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢは同一である。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは、同じアミドである。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは、同じカルバミドである。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは、同じスルホンアミドである。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは、アジドである。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは、シアノである。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは、ハロゲン化物である。
【0058】
一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢは、独立して、アミド、カルバメート、およびスルホンアミドから選択される。一実施形態によれば、アミドは、－ＮＨ－ＣＯＲであり、カルバメートは、ＮＨ－ＣＯＯＲであり、および／またはスルホンアミドは、－ＮＨ－ＳＯ２Ｒであり；
各Ｒは、独立して、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、アリールシクロアルキル、ヘテロアリールシクロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、シクロアルケニル、アリールシクロアルケニル、ヘテロアリールシクロアルケニル、アルキニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキニル、アリール、アルキルアリール、シクロアルキルアリール、アルケニルアリール、シクロアルケニルアリール、アルキニルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、シクロアルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、シクロアルケニルヘテロアリール、およびアルキニルヘテロアリール基から選択され、
基または置換基は、任意選択で、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、および硫黄（Ｓ）から選択される少なくとも１つの置換基によって中断され、
基は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アミノ（－ＮＨ２）、アジド（－Ｎ３）、シアノ（－ＣＮ）、ニトロ（－ＮＯ２）、オキソ（＝Ｏ）、ハロゲン化物、ヒドロキシル（－ＯＨ）、ホルミル（－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ２）、およびチオ（＝Ｓ）およびスルフヒドリル（－ＳＨ）から選択される少なくとも１つの置換基で、任意選択で置換され；
基または置換基において置換しているかまたはこれに含まれている窒素原子または硫黄原子は、任意選択で酸化されており、基または置換基において置換しているかまたはこれに含まれている窒素原子は、任意選択で四級化されている。
各Ｒは、独立して、アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、アリールシクロアルキル、ヘテロアリールシクロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、シクロアルケニル、アリールシクロアルケニル、ヘテロアリールシクロアルケニル、アルキニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキニル、アリール、アルキルアリール、シクロアルキルアリール、アルケニルアリール、シクロアルケニルアリール、アルキニルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、シクロアルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、シクロアルケニルヘテロアリール、およびアルキニルヘテロアリール基から選択され、
基または置換基は、任意選択で、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、および硫黄（Ｓ）から選択される少なくとも１つの置換基によって中断され、
基は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アミノ（－ＮＨ２）、アジド（－Ｎ３）、シアノ（－ＣＮ）、ニトロ（－ＮＯ２）、オキソ（＝Ｏ）、ハロゲン化物、ヒドロキシル（－ＯＨ）、ホルミル（－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ２）、およびチオ（＝Ｓ）およびスルフヒドリル（－ＳＨ）から選択される少なくとも１つの置換基で、任意選択で置換され；
基または置換基において置換しているかまたはこれに含まれている窒素原子または硫黄原子は、任意選択で酸化されており、基または置換基において置換しているかまたはこれに含まれている窒素原子は、任意選択で四級化されている。
【0059】
一実施形態では、Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように、中断、置換、酸化、および／または四級化されている。１つの具体的な実施形態では、Ｒは、アルキル、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように、中断、置換、酸化、および／または四級化されている。１つのさらなる具体的な実施形態では、Ｒは、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル（Ｃ３－Ｃ６）－シクロアルキル基、（Ｃ６－Ｃ１０）－アリール基、および（Ｃ６－Ｃ１０）－ヘテロアリール基から選択され、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように、中断、置換、酸化、および／または四級化されている。１つのさらなる具体的な実施形態では、Ｒは、アルキル基およびアリール基から選択され、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように、中断、置換、酸化、および／または四級化されている。１つのさらなる具体的な実施形態では、Ｒは、アルキル基およびシクロアルキル基から選択され、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように、中断、置換、酸化、および／または四級化されている。１つのさらなる具体的な実施形態では、Ｒは、アリール基およびヘテロアリール基から選択され、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように、中断、置換、酸化、および／または四級化されている。
【0060】
一実施形態では、Ｒは、本明細書中上記に定義される通りであり、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように中断、酸化、または四級化されており；この基は、任意選択で、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキル－Ｓ－、およびニトロから選択される少なくとも１つの置換基で、置換されている。１つの具体的な実施形態では、Ｒは、本明細書中上記に定義される通りであり、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように中断、酸化、または四級化されており、この基は、任意選択で、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル、（Ｃ３－Ｃ６）－シクロアルキル、（Ｃ１－Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－Ｓ、およびニトロから選択され、好ましくは（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択され；より好ましくは（Ｃ１－Ｃ２）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ２）－アルコキシ、およびニトロから選択され、さらにより好ましくはメチル、メトキシ、およびニトロから選択される少なくとも１つの置換基で置換されている。１つの具体的な実施形態では、Ｒは、本明細書中上記に定義される通りであり、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように中断、酸化、または四級化されており；この基は、任意選択で、アルキル、アルコキシ、およびニトロから選択される少なくとも１つの置換基で置換されている。一実施形態では、Ｒは、本明細書中上記に定義される通りであり、この基は、任意選択で、本明細書中上述されるように中断、酸化、または四級化されており；この基は、任意選択で、（Ｃ１－Ｃ３）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ３）－アルコキシ、およびニトロから選択；好ましくは（Ｃ１－Ｃ２）－アルキル、（Ｃ１－Ｃ２）－アルコキシ、およびニトロから選択；より好ましくはメチル、メトキシ、およびニトロから選択される少なくとも１つの置換基で置換されている。
【0061】
１つのより具体的な実施形態では、Ｒは、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され；この基は、任意選択で、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキル－Ｓ－、およびニトロから選択される少なくとも１つの置換基で置換されている。１つのさらなる具体的な実施形態では、Ｒは、アルキル基およびアリール基から選択され；アリール基は、任意選択で、アルキル、アルコキシ、およびニトロから選択される少なくとも１つの置換基で置換されている。たとえば、アルキルとしてのＲは、メチル、エチル、プロピル、およびブチルであり得る。たとえば、アリールとしてのＲは、置換基を含まないフェニル、またはメチル、メトキシ、およびニトロから選択される１つのみの基で置換されているフェニルであり得る。
【0062】
１つのより具体的な実施形態では、Ｒは、（Ｃ１－Ｃ４）－アルキル、たとえばメチル、エチル、プロピル（たとえばｎ－プロピルおよびイソプロピル）、ならびにブチル（たとえばｎ－ブチル、イソブチルおよびｔｅｒｔ－ブチル）である。
【0063】
別のより具体的な実施形態では、Ｒは、フェニルであり、フェニルは、任意選択で、本明細書中上述されるように中断、置換、酸化、および／または四級化されている。
【0064】
別のより具体的な実施形態では、Ｒは、ピリジニルまたはジアジニルであり、ピリジニルまたはジアジニルは、任意選択で、本明細書中上述されるように中断、置換、酸化、および／または四級化されている。ピリジニル基またはジアジニル基は、ピリジニルまたはジアジニルの炭素原子（たとえば２－ピリジニル、３－ピリジニル、４－ピリジニル、５－ピリジニル、または６－ピリジニル）または窒素原子（たとえば１－ピリジニル）のいずれかより；好ましくはピリジニルもしくはジアジニルの炭素原子により、アミド、カルバメート、またはスルホンアミドの官能基に結合し得る。
【0065】
一実施形態では、Ｒは、本明細書中上述されるように１つまたは２つの置換基で置換されている。１つの具体的な実施形態では、Ｒは、本明細書中上述されるように１つのみの置換基で置換されている。
【0066】
一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢは、独立して、アジド、シアノ、およびハロゲン化物から選択される。一実施形態では、ハロゲン化物は、ヨウ素（Ｉ）原子である。
【0067】
一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢのうち少なくとも１つはアミドではなく、特に－ＮＨ－ＣＯＲ（Ｒは、本明細書中上述される通りである）ではない。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは両方ともアミドではない。一実施形態によれば、ＲＡおよびＲＢのうち少なくとも１つはスルホンアミドではなく、特に－ＮＨ－ＳＯ２Ｒ（式中Ｒは、本明細書中上述される通りである）ではない。一実施形態では、ＲＡおよびＲＢは両方ともスルホンアミドではない。一実施形態によれば、Ｒ基のうち少なくとも１つは、アルキルではない。一実施形態では、Ｒ基はアルキルではない。一実施形態によれば、Ｒ基のうち少なくとも１つは、シクロアルキルではない。一実施形態では、Ｒ基はシクロアルキルではない。一実施形態によれば、Ｒ基のうち少なくとも１つは、スルホナート官能基（－ＳＯ２－）で置換されていない。一実施形態では、Ｒ基は、スルホナート官能基で置換されていない。
【0068】
一実施形態によれば、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、同一である。一実施形態では、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは水素である。一実施形態では、Ｒ０ＡおよびＲ０Ｂは、同じ薬学的に許容される陽イオンである。
【0069】
一実施形態によれば、Ｒ０Ａおよび／またはＲ０Ｂは、薬学的に許容されるアルカリ性陽イオンである。一実施形態では、薬学的に許容されるアルカリ性陽イオンは、リチウム（Ｌｉ＋）、ナトリウム（Ｎａ＋）、およびカリウム（Ｋ＋）から選択される。好ましくは、薬学的に許容されるアルカリ性陽イオンは、ナトリウム（Ｎａ＋）またはカリウム（Ｋ＋）、より好ましくはナトリウム（Ｎａ＋）である。
【0070】
一実施形態によれば、Ｒ０Ａおよび／またはＲ０Ｂは、本明細書中上述されるアルキル基、たとえばエチル、イソペンチル、メチル、エチル、イソプロピル、またはネオペンチルなどである。この実施形態では、式（Ｉ－０）の化合物は、たとえば合成前駆体として有用である。
【0071】
一実施形態によれば、Ｒ０Ａおよび／またはＲ０Ｂは、本明細書中上述されるアリール基、たとえばフェニルまたはパラ－ニトロフェニルなどである。一実施形態では、アルキル基は、エチルから選択される。この実施形態では、式（Ｉ－０）の化合物は、たとえばプロドラッグとして有用である。
【0072】
一実施形態によれば、Ｒ０Ａおよび／またはＲ０Ｂは、酵素系（たとえばニトロレダクターゼまたはエステラーゼ）により、遊離スルホナート官能基、たとえば国際特許公開公報第２０１１／０１７８００号（Ｋｏｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．）に開示される官能基に変換され得る官能基を含む基である。この実施形態では、この実施形態では、式（Ｉ－０）の化合物は、たとえばプロドラッグとして有用である。
【0073】
一実施形態によれば、本発明に係る化合物は、式（Ｉ－ａ）の化合物である。
（式中、Ｒ０Ａおよび／またはＲ０Ｂは、本明細書中上述される通りである）
【化5】
【0074】
一実施形態では、本発明に係る化合物は、式（Ｉ－ａ－ｉ）の化合物である。
（式中、ＲＡは、本明細書中上述される通りである）
【化6】
【0075】
一実施形態では、本発明に係る化合物は、式（Ｉ－ａ－ｉｉ）の化合物である。
（式中、ＲＡは、本明細書中上述される通りである）
【化7】
【0076】
一実施形態によれば、本発明に係る化合物は、式（Ｉ－ｂ）の化合物である。
（式中、ＲＡおよびＲＢは、本明細書中上述される通りである）
【化8】
【0077】
一実施形態によれば、本発明に係る化合物は、式（Ｉ－ｃ）の化合物である。
（式中、ＲＡおよびＲＢは、本明細書中上述される通りである）
【化9】
【0078】
一実施形態によれば、本発明に係る化合物は、式（ＩＩ－０）の化合物である。
（式中、ＲＡおよびＲＢ、ならびに各Ｒは、本明細書中上述される通りである）
【化10】
【0079】
一実施形態によれば、本発明に係る化合物は、式（ＩＩＩ－０）の化合物である。
（式中、ＲＡおよびＲＢは、本明細書中上述される通りである）
【化11】
【0080】
１つの具体的な実施形態では、本発明に係る化合物は、以下の表１の化合物から選択される。
【表1】
【0081】
表１の化合物は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ １５．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して命名した。
【0082】
一実施形態によれば、ＲＡおよび／またはＲＢは、チオシアネートではない。一実施形態によれば、ＲＡおよび／またはＲＢは、ニトロではない。
【0083】
一実施形態では、Ｒはメチルではない。一実施形態によれば、Ｒはエチルではない。
【0084】
本発明に係る化合物に対する言及は、その全てのエナンチオマー、溶媒和物（たとえば水和物）、多形（たとえば結晶形態）、複数の成分の複合体、および薬学的に許容される塩を包有する。さらに本発明に係る化合物に対する言及は、その全てのプロドラッグを包有する。
【0085】
本発明に係る化合物に対する言及は、その全ての薬学的に許容される塩を包有する。薬学的に許容される塩は、その酸付加塩および塩基付加塩を含む。適切な酸付加塩は、非毒性の塩を形成する酸から形成される。例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、サイクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチルスルファート、ナフタレート（ｎａｐｈｔｈｙｌａｔｅ）、２－ナプシラート、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／水素、リン酸塩／二水素、リン酸塩、ピログルタミン酸塩、サッカラート、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル化物、トリフルオロ酢酸塩、およびキシナホ酸塩が挙げられる。適切な塩基は、非毒性の塩を形成する塩基から形成される。例として、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、２－（ジエチルアミノ）エタノール、エタノールアミン、モルフォリン、４－（２－ヒドロキシエチル）モルフォリン、および亜鉛の塩が挙げられる。酸および塩基のヘミ塩、たとえばヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩もまた形成され得る。本化合物が酸性基および塩基性基を含む場合、これは分子内塩をも形成し得る。本化合物が水素を供与するヘテロ原子（たとえばＮＨ）を含む場合、その薬学的に許容される塩は、分子内の塩基性基または原子に上記水素原子を伝達することにより形成される塩および／またはアイソマーをも含む。これら塩は、標準的な手順、たとえば適切な有機塩基または無機塩基と遊離酸を反応させることにより、調製され得る。
【0086】
本発明の一部ではない、スルホネートの官能基を有さない化合物を、以下の表２に提示する。
【表2】
【0087】
表２の化合物は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標） Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ １５．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して命名した。表２の化合物は、以下の「実施例」のセクションにおいて比較のため使用されている。これらは、本発明の一部ではない。
【0088】
合成
本明細書中上述される本発明に係る化合物は、当該分野で知られているいずれかの合成方法により製造され得る。
本明細書中上述される本発明に係る化合物は、当該分野で知られているいずれかの合成方法により製造され得る。
【0089】
一実施形態によれば、本化合物は、ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アミノベンゼンスルホナート）（ＤＡＤＳ）：
から開始して製造される。
【化12】
【0090】
一実施形態では、本化合物は、たとえば酸塩化物または無水塩化物などの酸ハロゲン化物または無水ハロゲン化物とＤＡＤＳの反応により製造される。一実施形態では、本化合物は、たとえばクロロホルメートなどのハロ－ホルメートとＤＡＤＳの反応により製造される。一実施形態では、本化合物は、たとえばスルホニル塩化物などのスルホニルハロゲン化物とＤＡＤＳの反応により製造される。１つの具体的な実施形態では、この反応は、塩基性媒体において、たとえばＮａ２ＣＯ３またはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で行われる。１つの具体的な実施形態では、この反応は、溶媒、たとえば水／ジオキサン混合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）またはジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）などにおいて行われる。１つの具体的な実施形態では、触媒、たとえばテトラブチルアンモニウムクロリドなどが存在し得る。１つの具体的な実施形態では、この反応は、室温または８０℃で行われる。
【0091】
これら実施形態を、以下のスキーム１に示す。
【化13】
【0092】
一実施形態では、本化合物は、ジアゾニウム複塩の調製後の求核剤による置換（サンドマイヤー反応）を介した芳香族アミノ基の置換によりＤＡＤＳから開始して製造され、求核剤は、たとえばＮ－
３、ＣＮ－、またはＩ－である。
【0093】
１つの具体的な実施形態では、ジアゾニウム複塩の調製は、Ｎａ２ＮＯ２および酢酸（ＡｃＯＨ）の存在下で行われる。１つの具体的な実施形態では、求核剤は、ナトリウムまたはカリウムの塩である。１つの具体的な実施形態では、置換ステップは、触媒、たとえば銅（Ｉ）または（ＩＩ）触媒、たとえばヨウ化銅（ＣｕＩ）などの存在下で行われる。１つの具体的な実施形態では、第１および／または第２の反応ステップは、たとえば水などの溶媒において行われる。１つの具体的な実施形態では、第１および／または第２の反応ステップは、室温で行われる。
【0094】
組成物
また本発明は、本明細書中上述される本発明に係る化合物を含む組成物に関する。
また本発明は、本明細書中上述される本発明に係る化合物を含む組成物に関する。
【0095】
一実施形態によれば、本組成物は、少なくとも別の活性成分をさらに含み、すなわち本発明に係る化合物および別の異なる活性成分を含む。一実施形態では、活性成分は、抗悪性腫瘍薬、すなわち、増殖性疾患の処置に有効な化合物である。１つの具体的な実施形態では、活性成分は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生剤から選択される。抗悪性腫瘍薬の例は、参照により本明細書中に組み込まれているＡｃｔｕａｌｉｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅｓ， Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９２（Ｎｏ． ３０２， ｐｐ． ４１－４３）に列挙されている。１つのさらなる具体的な実施形態では、活性成分は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、シスプラチン、およびシスプラチン誘導体（たとえばカルボプラチンおよびオキサリプラチン）から選択されるアルキル化剤、ならびにプロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンなどの非古典的なアルキル化剤から選択される。抗悪性腫瘍薬の例として、シスプラチンもしくはその誘導体；トポイソメラーゼの阻害剤、たとえばエトポシドもしくはトポテカン；またはチロシンキナーゼ受容体、たとえばエルロチニブもしくはイマチニブが挙げられる。
【0096】
一実施形態によれば、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。一実施形態では、本組成物は、医薬組成物である。一実施形態では、本組成物は薬物である。
【0097】
キット
また本発明は、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物を含むキットに関する。
また本発明は、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物を含むキットに関する。
【0098】
一実施形態によれば、本キットは、本発明に係る少なくとも１つの医薬組成物と、別の活性成分を含む少なくとも別の医薬組成物とを含む。
【0099】
一実施形態によれば、本キットは、本発明に係る複数の医薬組成物、たとえば、毎月、毎週、または毎日の投与のための複数の単回用量を含む。
【0100】
使用および方法
【0101】
また本発明は、ＤＮＡ修復を阻害するため、たとえば二重鎖切断の修復を阻害するための、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物の使用に関する。また本発明は、それを必要とする対象のＤＮＡ修復（たとえばたとえば二重鎖切断の修復）を阻害するための方法であって、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物を対象に投与するステップを含む、方法に関する。
【0102】
一実施形態によれば、二重鎖切断の修復の阻害は、ＲＡＤ５１タンパク質の阻害を含む。ＲＡＤ５１タンパク質の阻害は、たとえばＲＡＤ５１タンパク質合成の防止などのＲＡＤ５１タンパク質の存在のいずれかの低減、および／またはＲＡＤ５１タンパク質のフォールディングの防止を含む。ＲＡＤ５１タンパク質の阻害はまた、たとえばＲＡＤ５１タンパク質ヌクレオフィラメントの形成、ＤＮＡとＲＡＤ５１タンパク質の結合、および／またはＲＡＤ５１タンパク質の触媒活性の防止などの、ＲＡＤ５１タンパク質の生体活性のいずれかの低減を含む。
【0103】
また本発明は、薬物として使用するための、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物に関する。一実施形態によれば、本発明は、増殖性疾患の処置に使用するための化合物または組成物に関する。一実施形態によれば、本発明は、がんの処置に使用するための化合物または組成物に関する。
【0104】
また本発明は、それを必要とする対象の疾患を処置する方法であって、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物を対象に投与するステップを含む方法に関する。一実施形態によれば、この疾患は、増殖性疾患である。
【0105】
また本発明は、薬物の製造における、本明細書中上述される本発明に係る化合物または組成物の使用に関する。一実施形態によれば、この薬物は、増殖性疾患を処置するためのものである。
【0106】
一実施形態では、増殖性疾患はがんである。具体的な実施形態では、がんは、乳がん、神経膠芽腫、および多発性骨髄腫から選択される。一実施形態では、処置は、第１選択、第２選択、または第３選択のがんの処置である。
【0107】
一実施形態によれば、本化合物または本組成物は、少なくとも別の活性成分と同時に、連続して、または別々に、それを必要とする対象に投与される。一実施形態では、他の活性成分は、本化合物または本組成物との同時投与により投与される。一実施形態では、他の活性成分は、本化合物または本組成物との連続投与により投与される。一実施形態では、他の活性成分は、本化合物または本組成物と別々の投与により投与される。
【0108】
一実施形態によれば、本化合物は、ウイルス性疾患の処置に使用するためのものではない。一実施形態では、本化合物は、ＨＳＶ、ＨＩＶ、またはＣＭＶの処置に使用するためのものではない。一実施形態によれば、本化合物は、炎症性疾患の処置に使用するためのものではない。一実施形態では、本化合物は、炎症性皮膚疾患の処置に使用するためのものではない。一実施形態によれば、本化合物は、自己免疫疾患の処置に使用するためのものではない。一実施形態によれば、本化合物は、避妊に使用するためのものではない。
【0109】
一実施形態によれば、本化合物は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）アンタゴニストではない。一実施形態によれば、本化合物は、塩化物チャネルまたは輸送体化合物（ＣＬＣ）ではない。
【図面の簡単な説明】
【0110】
【図1】図１は、以下の実施例２に提示されるように、化合物Ｂ－１～Ｂ－３、Ｘ－４、およびＤＩＤＳのうちの１つの存在下でＲＡＤ５１タンパク質のオリゴマー形成の度合いをｙ軸上にそれぞれ示すヒストグラムのシリーズである。
【図2】図２は、以下の実施例３に提示されるように、化合物Ｂ－１～Ｂ－３、Ｘ－４、ＤＩＤＳ、およびＢＰＱのうちの１つの存在下での、一本鎖ＮＤＡとＲＡＤ５１タンパク質の相対的結合（％）をｙ軸上に示し、異なる量の化合物（μＭ）をｘ軸上にそれぞれ示す一連のヒストグラムである。
【図4】図４は、以下の実施例６に提示されるように、シスプラチン単独の存在下（四角の印を有する上の曲線）またはＢ－２化合物２０μＭを伴うシスプラチンの存在下（円形の印を有する下の曲線）での細胞の生存率（％）をｙ軸上に示し、異なる量のシスプラチン（μＭ）をｘ軸上に示すグラフである。
【実施例0111】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
【0112】
実施例１：スチルベン化合物の合成
材料および方法
材料
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アミノベンゼンスルホナート）（ＤＡＤＳ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した（４，４’－ジアミノスチルベン２，２’－ジスルホン酸， ＣＡＳ ８１－１１－８）。４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩（ＣＡＳ ５４７６０－７５－７）を含む他の反応物は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＵＳ）から購入した。使用される全ての溶媒は、試薬のグレードであった。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカで覆われたアルミニウムシート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４， ＭＥＲＣＫ）で行った。
材料および方法
材料
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アミノベンゼンスルホナート）（ＤＡＤＳ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した（４，４’－ジアミノスチルベン２，２’－ジスルホン酸， ＣＡＳ ８１－１１－８）。４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩（ＣＡＳ ５４７６０－７５－７）を含む他の反応物は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＵＳ）から購入した。使用される全ての溶媒は、試薬のグレードであった。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカで覆われたアルミニウムシート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４， ＭＥＲＣＫ）で行った。
【0113】
全般的な方法
溶出したＴＬＣを、ＵＶ照射（λ＝２５４ｎｍ）またはモリブデン酸溶液を使用して顕色した。ＮＭＲスペクトルを、適切な重水素化溶媒に溶解したサンプルについて、室温にてＢＲＵＫＥＲ ＡＣ３００（１Ｈでは３００ＭＨｚ、１３Ｃでは７５ＭＨｚ）またはＢＲＵＫＥＲ ４００（１Ｈでは４００ＭＨｚ、１３Ｃでは１００ＭＨｚ）で記録した。１Ｈに関してテトラメチルシラン（ＴＭＳ）、１３Ｃに関して重水素化溶媒シグナルの参照物質を使用した。化学シフト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の値（δ）を、ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）およびヘルツ（Ｈｚ）でのカップリング定数で表す。明らかに同定されたプロトンおよび炭素を明記した。赤外線分光法分析は、ＩＲＴＦ Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ ２７， Ｖｅｃｔｏｒ ２２で記録した。低分解能マススペクトル（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、ＣＥＩＳＡＭ研究所において、７０ｅＶのＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＤＳＱＩＩ ｑｕａｄｒｉｐｏｌａｒ（ＮＨ３ガスを伴うＣＩ）またはＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦで、記録した。高低分解能マススペクトル（Ｄａ単位のＨＲＭＳ）分析は、ＩＲＳ－ＵＮ ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ， Ｎａｎｔｅｓ）において、ＬＣ－Ｑ－ＴＯＦ（Ｓｙｎａｐｔ－Ｇ２ ＨＤＭＳ， Ｗａｔｅｒｓ）で記録した。
溶出したＴＬＣを、ＵＶ照射（λ＝２５４ｎｍ）またはモリブデン酸溶液を使用して顕色した。ＮＭＲスペクトルを、適切な重水素化溶媒に溶解したサンプルについて、室温にてＢＲＵＫＥＲ ＡＣ３００（１Ｈでは３００ＭＨｚ、１３Ｃでは７５ＭＨｚ）またはＢＲＵＫＥＲ ４００（１Ｈでは４００ＭＨｚ、１３Ｃでは１００ＭＨｚ）で記録した。１Ｈに関してテトラメチルシラン（ＴＭＳ）、１３Ｃに関して重水素化溶媒シグナルの参照物質を使用した。化学シフト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の値（δ）を、ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）およびヘルツ（Ｈｚ）でのカップリング定数で表す。明らかに同定されたプロトンおよび炭素を明記した。赤外線分光法分析は、ＩＲＴＦ Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ ２７， Ｖｅｃｔｏｒ ２２で記録した。低分解能マススペクトル（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、ＣＥＩＳＡＭ研究所において、７０ｅＶのＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＤＳＱＩＩ ｑｕａｄｒｉｐｏｌａｒ（ＮＨ３ガスを伴うＣＩ）またはＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦで、記録した。高低分解能マススペクトル（Ｄａ単位のＨＲＭＳ）分析は、ＩＲＳ－ＵＮ ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ， Ｎａｎｔｅｓ）において、ＬＣ－Ｑ－ＴＯＦ（Ｓｙｎａｐｔ－Ｇ２ ＨＤＭＳ， Ｗａｔｅｒｓ）で記録した。
【0114】
合成方法
全般的合成手順１：水／ジオキサン（比率１０：２）の混合物中のＤＡＤＳ（１ｍｍｏｌ、０．３７ｇ）の懸濁液に、Ｎａ２ＣＯ３（５ｅｑ、５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液は清澄かつ黄色となり、無水物（４ｍｍｏｌ）を、テトラブチルアンモニウムクロリド（０．１ｅｑ）の触媒量と共に添加した。２時間～１８時間撹拌した後、沈殿物が形成された。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、ＮＭＲ分析により観察されるように、予想された純粋な化合物を提供した。純度の最適化のため、第２の沈殿ステップ（ＤＭＳＯ：Ｅｔ２Ｏ）を行うことができた。
全般的合成手順１：水／ジオキサン（比率１０：２）の混合物中のＤＡＤＳ（１ｍｍｏｌ、０．３７ｇ）の懸濁液に、Ｎａ２ＣＯ３（５ｅｑ、５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液は清澄かつ黄色となり、無水物（４ｍｍｏｌ）を、テトラブチルアンモニウムクロリド（０．１ｅｑ）の触媒量と共に添加した。２時間～１８時間撹拌した後、沈殿物が形成された。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、ＮＭＲ分析により観察されるように、予想された純粋な化合物を提供した。純度の最適化のため、第２の沈殿ステップ（ＤＭＳＯ：Ｅｔ２Ｏ）を行うことができた。
【0115】
全般的合成手順２：ジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）中のＤＡＤＳ（１ｍｍｏｌ、０．３７ｇ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（５ｅｑ）を添加した。酸塩化物（４ｅｑ）を添加し、この反応物を、８０℃で一晩加熱した。室温に冷却した後、沈殿物が形成されるまでメタノールを添加した。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄した。次に、沈殿物をＤＭＳＯに溶解し、Ｎａ２ＣＯ３の水溶液を添加して、Ｅｔ２Ｏで沈殿させた後に、予想したナトリウム塩を得た。
【0116】
全般的合成手順３：水／ジオキサン（比率１０：２）の混合物中のＤＡＤＳ（１ｍｍｏｌ、０．３７ｇ）の懸濁液に、Ｎａ２ＣＯ３（５ｅｑ、５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液は清澄かつ黄色となり、クロロホルメート試薬（２．５ｅｑ）を添加した。一晩撹拌した後、沈殿物が形成された。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄すると、ＮＭＲ分析により観察されるように、予想された純粋な化合物を提供した。純度の最適化のため、第２の沈殿ステップ（ＤＭＳＯ：Ｅｔ２Ｏ）を行うことができた。
【0117】
全般的合成手順４：水／ジオキサン（比率１０：２）の混合物中のＤＡＤＳ（１ｍｍｏｌ、０．３７ｇ）の懸濁液に、Ｎａ２ＣＯ３（５ｅｑ、５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液は清澄かつ黄色となり、スルホニルクロリド試薬（２．５ｅｑ）を添加した。一晩撹拌した後、沈殿物が形成された。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄すると、ＮＭＲ分析により観察されるように予想された純粋な化合物を提供した。純度の最適化のため、第２の沈殿ステップ（ＤＭＳＯ：Ｅｔ２Ｏ）を行うことができた。
【0118】
全般的合成手順５：ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩（１ｍｍｏｌ、０．２８ｇ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（５ｅｑ）を添加した。溶液は清澄かつ褐色となり、塩化物試薬（２．５ｅｑ）を添加した。一晩撹拌した後、沈殿物が形成された。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄すると、ＮＭＲ分析により観察されるように予想された純粋な化合物を提供した。純度の最適化のため、第２の沈殿ステップ（ＤＭＳＯ：Ｅｔ２Ｏ）を行うことができた。
【0119】
全般的合成手順６：水（６ｍＬ）中のＤＡＤＳ（１ｍｍｏｌ、０．３７ｇ）の懸濁液に、Ｎａ２ＮＯ２（０．１４ｇ、２．２ｅｑ）水溶液（２ｍＬ）、次いで酢酸（５ｅｑ）の水溶液（２ｍＬ）を添加した。４５分間撹拌した後、触媒量のＣｕ（Ｉ）（０．２ｅｑ）の存在下または非存在下で、ナトリウム塩またはカリウム塩を添加した（２ｍＬの水において２ｅｑ～４ｅｑ）。４時間～３日間撹拌した後、ＭｅＯＨおよびＥｔ２Ｏを添加し、沈殿物を得た。これをろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄すると、ＮＭＲ分析により観察されるように予想された純粋な化合物を提供した。純度の最適化のため、第２の沈殿ステップ（ＤＭＳＯ：Ｅｔ２Ｏ）を行うことができた。
【0120】
結果
上記の表１に提示されるジスルホナートスチルベン化合物および上記の表２に提示される比較されるの非スルホン化スチルベン化合物を、上述の全般的合成手順１～５により合成した。
上記の表１に提示されるジスルホナートスチルベン化合物および上記の表２に提示される比較されるの非スルホン化スチルベン化合物を、上述の全般的合成手順１～５により合成した。
【0121】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アセトアミドベンゼンスルホナート）（Ａ－１）を、全般的合成手順１にしたがい、ＤＡＤＳおよび酢酸無水物から調製した。沈殿により精製した後、これを６２％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ｐｐｍ １０．０３ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ７．９６ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．９４ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．６８ （ｄｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．５２ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ２．０３ （ｓ， ６Ｈ， ２ ｘ ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １６８．０８ （２ ｘ ＣＯ）， １４５．６９ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３７．２９ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．８８ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２５．９８ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２５．５７ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１８．９９ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１７．７４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， ２３．９０ （２ ｘ ＣＨ３）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ＝ ５２１．０， ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－＝４７５．０． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］ Ｃ１８Ｈ１６Ｎ２Ｏ８Ｎａ３Ｓ２の理論値５２１．００４１；実測値５２１．００２９．
【0122】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－プロピオンアミド（ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ベンゼンスルホナート））（Ａ－２）を、全般的合成手順１にしたがい、ＤＡＤＳおよびプロピオン酸無水物から調製した。沈殿により精製した後、これを、７６％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ９．６３ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ７．９３ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．９０ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．４９ （ｓ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ４．１２ （ｑ， ４Ｈ， ２ ｘ ＣＨ２）， １．２４ （ｔ， ６Ｈ， ２ ｘ ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １５３．４３ （２ ｘ ＣＯ）， １４５．７１ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３７．１３ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．４０ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２５．８８ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２５．６８ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１８．３９ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１７．２２ （２ ｘ ＣＨａｒ）， ６０．０４ （２ ｘ ＣＨ２）， １４．５０ （２ ｘ ＣＨ３）． ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ５３５．２． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ－）：［Ｍ－Ｎａ］－ Ｃ２０Ｈ２０Ｎ２Ｏ１０ＮａＳ２の理論値５３５．０４５７；実測値５３５．０４４３．
【0123】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－ベンズアミドベンゼンスルホナート）（Ａ－３）を、全般的合成手順１にしたがい、ＤＡＤＳおよび安息香酸無水物から調製した。沈殿により精製した後、これを、７０％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ８．１１ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ８．０９ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．９６ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．６９ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．３３ （ｍ， １０Ｈ， １０ ｘ Ｈａｒ）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １５４．０４ （２ ｘ ＣＩＶａｒ’）， １５２．３５ （２ ｘ ＣＯ）， １４４．２７ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３８．６４ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３２．１３ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３０．４５ （４ ｘ ＣＨａｒ’）， １２８．６７ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２７．９９ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２６．６４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２２．９２ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２１．５７ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１９．０１ （２ ｘ ＣＨａｒ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ＝ ６７６．９． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］ Ｃ２８Ｈ２０Ｎ２Ｏ１０Ｎａ３Ｓ２の理論値６７７．０２５２；実測値６７７．０２６２．
【0124】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－メトキシベンズアミド）ベンゼンスルホナート）（Ａ－４）を、全般的合成手順２にしたがい、ＤＡＤＳおよび４－メトキシベンゾイルクロリドから調製した。沈殿により精製した後、これを、４４％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ １０．２１ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ８．１８ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ８．０５ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ８．０２ （ｄ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ７．８８ （ｄｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．５８ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．０５ （ｄ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ３．８４ （ｓ， ６Ｈ， ２ ｘ ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ １６４．５７ （２ ｘ ＣＯ）， １６１．８０ （２ ｘ ＣＩＶａｒ’）， １４５．６６ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３７．３７ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３０．２７ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．６０ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２６．７７ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２６．１４ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２５．４１ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２０．３５ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１９．１８ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１３．４８ （４ ｘ ＣＨａｒ）， ５５．３５ （２ ｘ ＯＭｅ）． ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ６５９．１． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ－）： ｃａｌｄ ｆｏｒ ［Ｍ－２Ｎａ］２－ Ｃ３０Ｈ２５Ｎ２Ｏ１０Ｓ２ ６３７．０９５１； ｆｏｕｎｄ ６３７．０９３２．［Ｍ－Ｎａ］－ Ｃ３０Ｈ２４Ｎ２Ｏ１０ＮａＳ２の理論値６５９．０７７０；実測値６５９．０７７８．
【0125】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－ニトロベンズアミド）ベンゼンスルホナート）（Ａ－５）を、全般的合成手順２にしたがい、ＤＡＤＳおよび４－ニトロベンゾイルクロリドから調製した。沈殿により精製した後、これを、７０％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １０．７０ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ８．３６ （ｍ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ８．２４ （ｍ， ６Ｈ， ６ ｘ Ｈａｒ）， ８．０８ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．９１ （ｄｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．６３ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １６３．５４ （２ ｘ ＣＯ）， １４９．０６ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １４５．８６ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １４０．４１ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３６．７８ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３０．９２ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．２３ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２６．４２ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２５．５８ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２３．４１ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２０．４４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１９．３２ （２ ｘ ＣＨａｒ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ＝ ７３４．９， ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ６８８．９． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２８Ｈ１８Ｎ４Ｏ１２Ｎａ３Ｓ２の理論値７３５．００５６；実測値７３５．００５７．
【0126】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（エトキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）（Ｃ－１）を、全般的合成手順３にしたがい、ＤＡＤＳおよびエチルクロロホルメートから調製した。沈殿により精製した後、これを、６６％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ９．６３ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ７．９３ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．９０ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．４９ （ｓ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ４．１２ （ｑ， ４Ｈ， ２ ｘ ＣＨ２）， １．２４ （ｔ， ６Ｈ， ２ ｘ ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １５３．４３ （２ ｘ ＣＯ）， １４５．７１ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３７．１３ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．４０ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２５．８８ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２５．６８ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１８．３９ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１７．２２ （２ ｘ ＣＨａｒ）， ６０．０４ （２ ｘ ＣＨ２）， １４．５０ （２ ｘ ＣＨ３）． ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ５３５．２． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ－）：［Ｍ－ Ｎａ］－ Ｃ２０Ｈ２０Ｎ２Ｏ１０ＮａＳ２の理論値５３５．０４５７；実測値５３５．０４４３．
【0127】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（イソブトキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）（Ｃ－２）を、全般的合成手順３にしたがい、ＤＡＤＳおよびイソブチルクロロホルメートから調製した。沈殿により精製した後、これを、６７％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ９．６５ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ７．９４ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．９２ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．４９ （ｍ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ３．８７ （ｄ， ４Ｈ， ２ ｘ ＣＨ２）， １．９２ （ｍ， ２Ｈ， ２ ｘ ＣＨ）， ０．９４ （ｄ， １２Ｈ， ４ ｘ ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １５３．５８ （２ ｘ ＣＯ）， １４５．７２ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３７．１６９ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．４１ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２５．８９ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２５．７０ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１８．４４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１７．２５ （２ ｘ ＣＨａｒ）， ７０．０１ （２ ｘ ＯＣＨ２）， ２７．５５ （２ ｘ ＣＨ）， １８．９０ （４ ｘ ＣＨ３）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ＝ ６３７．１， ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ５９１．０． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２４Ｈ２８Ｎ２Ｏ１０Ｎａ３Ｓ２の理論値６３７．０８７８；実測値６３７．０８７０．
【0128】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（フェノキシカルボニル）アミノ）ベンゼンスルホナート）（Ｃ－３）を、全般的合成手順３にしたがい、ＤＡＤＳおよびフェニルクロロホルメートから調製した。沈殿により精製した後、これを、３８％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ ８．１１ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ８．０９ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．９６ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．６９ （ｄｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．３９ （ｍ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ７．２２ （ｍ， ６Ｈ， ６ ｘ Ｈａｒ）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） ： δ ｐｐｍ １５４．０４ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １５２．３５ （２ ｘ ＣＯ）， １４４．２７ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３８．６４ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３２．１３ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３０．４５ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２８．６７ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２７．９９ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２６．６４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２２．９２ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２１．５７ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１９．０１ （２ ｘ ＣＨａｒ）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ＝ ６７６．９． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２８Ｈ２０Ｎ２Ｏ１０Ｎａ３Ｓ２の理論値６７７．０２５２；実測値６７７．０２６２．
【0129】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（フェニルスルホンアミド）ベンゼンスルホナート）（Ｓ－１）を、全般的合成手順４にしたがい、ＤＡＤＳおよびベンゼンスルホニルクロリドから調製した。沈殿により精製した後、これを、８１％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ｐｐｍ ７．８０ （ｍ， ４Ｈ， Ｈａｒ）， ７．６５ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．６４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝８．２ Ｈｚ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．６０－７．４８ （ｍ， ６Ｈ， Ｈａｒ）， ７．４３ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ２．４４ Ｈｚ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．０６ （ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ２．４４ Ｈｚおよび８．６ Ｈｚ， ２Ｘ Ｈａｒ）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ｐｐｍ １４４．０６ （２ｘＣＩＶ）， １４１．１１ （２ｘＣＩＶ）， １４０．１９ （２ｘＣＩＶ）， １３２．１８ （２ｘＣＨａｒ）， １２９．１１ （４ｘＣＨａｒ）， １２７．９１ （２ｘＣＨａｒ）， １２７．６１ （２ｘＣＩＶ）， １２６．４７ （４ｘＣＨａｒ）， １２５．７８ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２４．４０ （２ｘＣＨａｒ）， １１９．６６ （２ｘＣＨａｒ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：Ｃ２６Ｈ１９Ｎ２Ｏ１０Ｎａ２Ｓ４ ［Ｍ－Ｈ］－の理論値６９２．９７１８；実測値６９２．９７１９．
【0130】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（（４－メチルフェニル）スルホンアミド）ベンゼンスルホナート）（Ｓ－２）を、全般的合成手順４にしたがい、ＤＡＤＳおよびパラ－トルエンスルホニルクロリドから調製した。沈殿により精製した後、これを、８７％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ｐｐｍ ７．６８ （ｍ， ４Ｈ， ４ｘＨａｒ）， ７．６４ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．６４ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．６４ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．４２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．３３ （ｍ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ７．０３ （ｄｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚおよび２．５ Ｈｚ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ２．３５ （ｓ， ６Ｈ， ２ ｘ ＣＨ３）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ－）：Ｃ２８Ｈ２３Ｎ２Ｏ１０Ｓ４Ｎａ２ ［Ｍ＋Ｈ］－の理論値７２１．００３１；実測値７２１．００２４．
【0131】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－（４－ニトロフェニルスルホンアミド）ベンゼンスルホナート）（Ｓ－３）を、全般的合成手順３にしたがい、ＤＡＤＳおよび４－ニトロベンゼンスルホニルクロリドから調製した。沈殿により精製した後、これを、８１％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ｐｐｍ ８．３２ （ｄｌ， ４Ｈ， ４ ｘ Ｈａｒ）， ７．９９（ｄｌ， ４Ｈ， ４ｘＨａｒ）， ７．６６４ （ｍ， ４Ｈ， ２ ｘ ＨａｒおよびＣＨ＝ＣＨ）， ７．４３ （ｓｌ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．０５ （ｄｌ， ２Ｈ， ２ｘ Ｈａｒ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：Ｃ２６Ｈ１９Ｎ４Ｏ１４Ｓ４Ｎａ２ ［Ｍ＋Ｈ］＋の理論値７８４．９５７０；実測値７８４．９５６０．
【0132】
（Ｅ）－Ｎ，Ｎ’－（エテン－１，２－ジイルビス（４，１－フェニレン））ジアセトアミド（Ｘ－１）を、全般的合成手順５にしたがい、４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩および塩化アセチルから調製した。沈殿により精製した後、これを、５３％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １０．０６ （ｓ， ２Ｈ， ２ ｘ ＮＨ）， ７．５４ （ｍ， ８Ｈ， ８ ｘ Ｈａｒ）， ７．０７ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ２．０５ （ｓ， ６Ｈ， ２ ｘ ＣＨ３）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １６８．１７ （２ ｘ ＣＯ）， １３８．５８ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １３１．９５ （２ ｘ ＣＩＶａｒ）， １２６．５８ （４ ｘ ＣＨａｒ）， １２６．４７ （ＣＨ＝ＣＨ）， １１８．９８ （４ ｘ ＣＨａｒ）， ２３．９６ （２ ｘ ＣＨ３）． ＭＳ （ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ＝ ３１７．１． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋の理論値Ｃ１８Ｈ１８Ｎ２Ｏ２Ｎａ ３１７．１２６６；実測値３１７．１２７８．
【0133】
ジフェニル（エテン－１，２－ジイルビス（４，１－フェニレン））（Ｅ）－ジカルバメート（Ｘ－２）を、全般的合成手順５にしたがい、４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩およびフェニルクロロホルメートから調製した。沈殿により精製した後、これを、５４％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １０．３３ （ｓ， ２Ｈ， ＮＨＣＯ）， ７．５７－７．４２ （ｍ， １０Ｈ， Ｈａｒ）， ７．３０－７．２３ （ｍ， ８Ｈ， Ｈａｒ）， ７．１１ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １５１．５４ （２ｘ ＣＩＶ）， １５０．４１ （２ｘ ＣＩＶ）， １３７．８１ （２ｘ ＣＩＶａｒ）， １３１．９９ （２ｘ ＣＩＶａｒ）， １２９．３６ （４ｘＣＨａｒ）， １２６．８２ （４ｘＣ）， １２６．５２ （ＣＨ＝ＣＨ）， １２５．３９ （２ｘＣＨａｒ）， １２１．８９ （４ｘＣＨａｒ）， １１８．４８ （４ｘＣＨａｒ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２８Ｈ２２Ｎ２Ｏ４Ｎａの理論値４７３．１４７２； 実測値４７３．１４７１．
【0134】
（Ｅ）－Ｎ，Ｎ’－（エテン－１，２－ジイルビス（４，１－フェニレン））ジベンゼンスルホンアミド（Ｘ－３）を、全般的合成手順５にしたがい、４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩およびフェニルスルホニルクロリドから調製した。沈殿により精製した後、これを、４１％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １０．３１ （ｓｌ， ２Ｈ， ＮＨ）， ７．７６ （ｄｄ， ４Ｈ， Ｊ＝８．３３ Ｈｚおよび１．５５ Ｈｚ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．６０－７．５４ （ｍ， ６Ｈ， ６ｘＨａｒ）， ７．３８ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．６４ Ｈｚ， Ｈａｒ ｓｔｉｌｂ）， ７．０７ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．６４ Ｈｚ， Ｈａｒ ｓｔｉｌｂ）， ６．９７ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２６Ｈ２２Ｏ４Ｎ２ＮａＳ２の理論値５１３．０９１３；実測値５１３．０９１８．
【0135】
（Ｅ）－１，２－ビス（４－アジドフェニル）エテン（Ｘ－４）を、全般的合成手順６に従い、ＮａＮ３（２ｅｑ）を伴い、Ｃｕ触媒を伴わずに、４，４’－ジアミノスチルベン二塩酸塩から調製した。褐色の沈殿物をろ過した後、カラムクロマトグラフィーによる精製により２つの生成物が提供され、予測される（Ｅ）－アイソマー（Ｘ－４）が同定された。ＩＲ （ｃｍ－１）： υｍａｘ ＝ ２１１１および２０８１ （Ｎ３）． １ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ７．６４ （ｄ， ４Ｈ， ＣＨａｒ）， ７．２３ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．１３ （ｄ， ４Ｈ， ＣＨａｒ）．
【0136】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－アジドベンゼンスルホナート）（Ｂ－１）を、全般的合成手順６にしたがい、ＮａＮ３（２ｅｑ）を伴い、銅触媒を用いずに、ＤＡＤＳから調製した。３時間３０分の間撹拌した後、Ｎａ２ＣＯ３を添加して、約９のｐＨを得た。沈殿により精製した後、これを、８０％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ８．０４ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．６３ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．５０ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．１２ （ｄｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）．１３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １４７．０７ （２ ｘ ＣＩＶ）， １３６．９９ （２ ｘ ＣＩＶ）， １３１．８２ （２ ｘ ＣＩＶ）， １２７．０５ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２６．５０ （ＣＨ＝ＣＨ）， １１９．５５ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１７．３２ （２ ｘ ＣＨａｒ）． ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ４４２．９． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ－）：［Ｍ－Ｎａ］－の理論値Ｃ１４Ｈ８Ｎ６Ｏ６ＮａＳ２； ４４２．９８４４実測値４４２．９８５８．
【0137】
ナトリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－シアノベンゼンスルホナート）（Ｂ－２）を、全般的合成手順６にしたがい、触媒としてＮａＣＮ（０．２ｇ）およびＣｕＣｌ（０．０５ｇ）を使用して、ＤＡＤＳから調製した。沈殿により精製した後、これを褐色の粉末として５９％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ８．２７ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ８．０７ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．８８ （ｄｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）， ７．７７ （ｄ， ２Ｈ， ２ ｘ Ｈａｒ）． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ １４６．５９ （２ ｘ ＣＩＶ）， １３８．８３ （２ ｘ ＣＩＶ）， １３２．６４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １３０．５１ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １２９．５０ （２ ｘ ＣＨ＝ＣＨ）， １２６．６４ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １１８．６２ （２ ｘ ＣＮ）， １０９．２５ （２ ｘ ＣＩＶ）． ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ ： ［Ｍ－Ｎａ］－ ＝ ４１１．
【0138】
カリウム（Ｅ）－６，６’－（エテン－１，２－ジイル）ビス（３－ヨードベンゼンスルホナート）（Ｂ－３）を、全般的合成手順６にしたがい、触媒としてＫＩ（５ｅｑ、０．８３ｇ）およびＣｕＩ（０．１ｅｑ、０．０２ｇ）を使用して、ＤＡＤＳから調製した。沈殿により精製した後、これを、褐色の粉末として４１％の収率で得た。１ＨＮＭＲ （３００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）：δ ｐｐｍ ８．２３ （ｄ， Ｊ ＝ １．４ Ｈｚ， ４Ｈ， ＣＨａｒ）， ７．９２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １．４ ＨｚおよびＪ ＝ ８．２ Ｈｚ， ４Ｈ， ＣＨａｒ）， ７．８４ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ＝ＣＨ）， ７．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ＣＨａｒ （５））． １３Ｃ ＮＭＲ （７５ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ｐｐｍ １４０．１ （２ ｘ ＣＩＶ）， １４０．６５ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １３５．５２ （２ ｘ ＣＨａｒ）， １３４．０７ （２ ｘ ＣＩＶ）， １２８．９ （２ ｘ ＣＨａｒ），１２７．９ （ＣＨ＝ＣＨ）， ９２．３７ （２ ｘ Ｃ－Ｉ）． ＭＳ （ＥＳＩ－） ｍ／ｚ： ［Ｍ－２Ｋ＋Ｎａ］－ ＝ ６１２．８； ［Ｍ－２Ｋ＋Ｈ］－ ＝ ５９０．８； ［Ｍ－Ｋ］－＝ ６２８．８． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ ）：［Ｍ－Ｋ］－ Ｃ１４Ｈ８Ｏ６Ｎ２Ｋの理論値６２８．７４８９；実測値６２８．７４９６。
【0139】
実施例２：Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（架橋）によるＲＡＤ５１オリゴマー形成
材料および方法
この反応は、室温で行った。２．５μｍのＨｓＲａｄ５１を、表記の濃度の試験化合物と、２０ｍｍのリン酸ナトリウム、５０ｍｍのＮａＣｌ、１ｍｍのＭｇＣｌ２、および１ｍｍのＡＴＰを含むバッファーにおいて１０分間インキュベートした。架橋反応を、スベリン酸ジスクシンイミジル（５０μｍ）の添加により開始し、３０分間進行させた。反応を、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、最終濃度５０ｍｍ）の添加によりクエンチし、その後１５分間インキュベートした。次に生成物を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、マウスモノクローナル抗Ｒａｄ５１抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）および抗マウスＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ７００コンジュゲート型２次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を用いたウェスタンブロットにより検出した。架橋した二量体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｒａｄ５１ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０， Ｖｏｌ． ９２， Ｎｏ． １２， ｐｐ． １８３２－１８３８）。
材料および方法
この反応は、室温で行った。２．５μｍのＨｓＲａｄ５１を、表記の濃度の試験化合物と、２０ｍｍのリン酸ナトリウム、５０ｍｍのＮａＣｌ、１ｍｍのＭｇＣｌ２、および１ｍｍのＡＴＰを含むバッファーにおいて１０分間インキュベートした。架橋反応を、スベリン酸ジスクシンイミジル（５０μｍ）の添加により開始し、３０分間進行させた。反応を、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、最終濃度５０ｍｍ）の添加によりクエンチし、その後１５分間インキュベートした。次に生成物を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、マウスモノクローナル抗Ｒａｄ５１抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）および抗マウスＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ７００コンジュゲート型２次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を用いたウェスタンブロットにより検出した。架橋した二量体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｒａｄ５１ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０， Ｖｏｌ． ９２， Ｎｏ． １２， ｐｐ． １８３２－１８３８）。
【0140】
結果
架橋後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動は、ＲＡＤ５１タンパク質複合体を維持および固定し、よって、ＲＡＤ５１タンパク質のオリゴマー形成（ポリマー形成）の度合いの可視化を可能にする。よって、このＲＡＤ５１タンパク質のリコンビナーゼの活性の鍵となるステップに及ぼすＲＡＤタンパク質阻害剤、Ｂ－１、Ｂ－２、Ｂ－３、ＤＩＤＳ、およびＸ－４の作用が評価されている。この結果を、図１に提示する。
架橋後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動は、ＲＡＤ５１タンパク質複合体を維持および固定し、よって、ＲＡＤ５１タンパク質のオリゴマー形成（ポリマー形成）の度合いの可視化を可能にする。よって、このＲＡＤ５１タンパク質のリコンビナーゼの活性の鍵となるステップに及ぼすＲＡＤタンパク質阻害剤、Ｂ－１、Ｂ－２、Ｂ－３、ＤＩＤＳ、およびＸ－４の作用が評価されている。この結果を、図１に提示する。
【0141】
これら結果は、ジスルホナートスチルベンＢ－１、Ｂ－２、およびＢ－３の存在下で、ＲＡＤ５１のオリゴマー形成状態の有意な低下が観察されたことを示している。オリゴマーの形態は、２つのシアノ基を含むＢ－２では非常に強く減少している。ジスルホナートスチルベンＢ－１、Ｂ－２、およびＢ－３により誘導されるこの低下は、参照化合物ＤＩＤＳで観察された低下と比較して同じ桁の範囲内である。ＤＩＤＳおよびＢ－１～Ｂ－３が、ＲＡＤ５１タンパク質のモノマー間の界面で作用することによりオリゴマー形成を妨げるということが、本出願人の理解である。
【0142】
注目すべきことに、Ｂ－１とは対照的に、スルホネート基を含まない比較化合物Ｘ－４は、ＲＡＤ５１タンパク質のオリゴマー形成に作用しない。よって、２つのスルホネート基は、ＲＡＤ５１タンパク質の阻害特性に必須であると思われる。
【0143】
よって、本発明に係るジスルホナートスチルベンは、ＲＡＤ５１タンパク質のオリゴマー形成の防止により証明されるように、強力なＲＡＤ５１タンパク質阻害剤である。
【0144】
実施例３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ－干渉分光法によるＲＡＤ５１ヌクレオフィラメント形成
材料および方法
ｓｓＤＮＡに対するＲａｄ５１の結合を、ＢＬＩｔｚ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ．）を使用してＢＬＩ（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）技術によりモニタリングおよび定量化した。この手順は、４つのステップを含む：（１）１×ＰＢＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００７５％のＴｗｅｅｎ２０を含むバッファーでのベースラインを、２０秒間記録した；（２）Ｒａｄ５１のローディングおよび結合を、バッファーＡにおいて１．５μＭのＲａｄ５１および１ｍＭのＡＴＰを使用して４０秒間測定した；（３）ｓｓＤＮＡからのＲａｄ５１の解離を、バッファーＡにおいて２０秒間記録した；（４）ｓｓＤＮＡバイオセンサーを、５０ｍＭのＮａＯＨ浴を使用して再生成した。タンパク質サンプルの４μＬの滴下を使用したステップ２を除き、ステップ１、３、および４は、０．５ｍＬのチューブにおいて２５０μＬの溶液を使用した。測定パラメータは、以下の通りであった：室温の測定および撹拌速度２２００ｒｐｍ。Ｒａｄ５１のｓｓＤＮＡ結合に対するＣＳＢおよび類縁体の作用を調査するために、分子を、表記の濃度でステップ２のタンパク質サンプルに含め、５分間インキュベートした後、バイオセンサー上にローディングした（Ｎｏｒｍａｎｄ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｒａｄ５１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｄｒｕｇ ｌｉｂｒａｒｙ．”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４， Ｖｏｌ． ９１， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ２９３－３００．）。
材料および方法
ｓｓＤＮＡに対するＲａｄ５１の結合を、ＢＬＩｔｚ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ．）を使用してＢＬＩ（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）技術によりモニタリングおよび定量化した。この手順は、４つのステップを含む：（１）１×ＰＢＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００７５％のＴｗｅｅｎ２０を含むバッファーでのベースラインを、２０秒間記録した；（２）Ｒａｄ５１のローディングおよび結合を、バッファーＡにおいて１．５μＭのＲａｄ５１および１ｍＭのＡＴＰを使用して４０秒間測定した；（３）ｓｓＤＮＡからのＲａｄ５１の解離を、バッファーＡにおいて２０秒間記録した；（４）ｓｓＤＮＡバイオセンサーを、５０ｍＭのＮａＯＨ浴を使用して再生成した。タンパク質サンプルの４μＬの滴下を使用したステップ２を除き、ステップ１、３、および４は、０．５ｍＬのチューブにおいて２５０μＬの溶液を使用した。測定パラメータは、以下の通りであった：室温の測定および撹拌速度２２００ｒｐｍ。Ｒａｄ５１のｓｓＤＮＡ結合に対するＣＳＢおよび類縁体の作用を調査するために、分子を、表記の濃度でステップ２のタンパク質サンプルに含め、５分間インキュベートした後、バイオセンサー上にローディングした（Ｎｏｒｍａｎｄ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｒａｄ５１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｄｒｕｇ ｌｉｂｒａｒｙ．”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４， Ｖｏｌ． ９１， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ２９３－３００．）。
【0145】
結果
干渉分光法（Ｂｌｉｔｚ（登録商標）， Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に基づく試験は、阻害剤の存在下または非存在下でバイオセンサーの担体に固定された一本鎖ＤＮＡとのＲＡＤ５１タンパク質の結合の動態の測定を可能にする。ＲＡＤ５１ヌクレオフィラメントの形成に及ぼす化合物Ｂ－１、Ｂ－２、Ｂ－３、ＢＰＱ、およびＸ－４の作用が、漸増用量の阻害剤の存在下で評価されている。この結果を、図２に提示する。
干渉分光法（Ｂｌｉｔｚ（登録商標）， Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に基づく試験は、阻害剤の存在下または非存在下でバイオセンサーの担体に固定された一本鎖ＤＮＡとのＲＡＤ５１タンパク質の結合の動態の測定を可能にする。ＲＡＤ５１ヌクレオフィラメントの形成に及ぼす化合物Ｂ－１、Ｂ－２、Ｂ－３、ＢＰＱ、およびＸ－４の作用が、漸増用量の阻害剤の存在下で評価されている。この結果を、図２に提示する。
【0146】
これら結果は、ジスルホナートスチルベンＢ－１、Ｂ－２、およびＢ－３が、ＲＡＤ５１タンパク質ヌクレオフィラメントの形成を阻害することを示している。ヌクレオフィラメントの形成は、２つのシアノ基を含むＢ－２では非常に強く減少している。Ｂ－１、Ｂ－２、およびＢ－３の活性は、参照物質の１つＢＰＱと同等であるかまたはさらにはこれよりも良好である。Ｂ－１、Ｂ－２、およびＢ－３の活性は、低用量（５μＭ）で参照物質の１つＤＩＤＳと同等である。Ｂ－２は、高用量（５０μＭ）でＤＩＤＳと比較して同じ作用を有する。
【0147】
これら結果もまた、比較化合物Ｘ－３が、いずれの量においても、ＲＡＤ５１タンパク質に何の阻害作用も有さないことを示している。
【0148】
よって、本発明に係るジスルホナートスチルベンは、ＲＡＤ５１タンパク質ヌクレオフィラメント形成の防止により証明されるように、強力なＲＡＤ５１タンパク質阻害剤である。
【0149】
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ－Ｄ－ループアッセイによるＤＮＡ侵入
材料および方法
標識した１００－ｓｓＤＮＡ＊＊（１μＭ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む標準的な反応バッファー１０μＬにおいて表記の量の対応する分子の存在下または不存在下で、０．５μＭのＲａｄ５１と、３７℃で２０分間インキュベートした。この反応を、スーパーコイルｐＰＢ４．３ ＤＮＡ（ｂｐにおいて２００μＭ）を添加することにより開始した。３７℃で３０分間インキュベートした後、反応を停止溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＳＤＳ、および１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）により停止および除タンパクした。反応混合物を、３７℃で１５分間さらにインキュベートした。５倍のｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（０．０５％のブロモフェノールブルー、８％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した後、反応生成物を、１％アガロースゲル上での電気泳動により分離させた。電気泳動は、０．５ＸＴＡＥバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭの酢酸、および１ｍＭのＥＤＴＡ）において１００Ｖで２時間行った。標識した生成物（１００－ｓｓＤＮＡ＊＊およびＤ－ループ）を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ）の７００ｎｍの赤外線蛍光検出チャネルを用いたＩＲＤ－７００色素の検出により可視化および定量化した（Ｎｏｒｍａｎｄ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４， Ｖｏｌ． ９１， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ２９３－３００．）。
材料および方法
標識した１００－ｓｓＤＮＡ＊＊（１μＭ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む標準的な反応バッファー１０μＬにおいて表記の量の対応する分子の存在下または不存在下で、０．５μＭのＲａｄ５１と、３７℃で２０分間インキュベートした。この反応を、スーパーコイルｐＰＢ４．３ ＤＮＡ（ｂｐにおいて２００μＭ）を添加することにより開始した。３７℃で３０分間インキュベートした後、反応を停止溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＳＤＳ、および１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）により停止および除タンパクした。反応混合物を、３７℃で１５分間さらにインキュベートした。５倍のｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（０．０５％のブロモフェノールブルー、８％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した後、反応生成物を、１％アガロースゲル上での電気泳動により分離させた。電気泳動は、０．５ＸＴＡＥバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭの酢酸、および１ｍＭのＥＤＴＡ）において１００Ｖで２時間行った。標識した生成物（１００－ｓｓＤＮＡ＊＊およびＤ－ループ）を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ）の７００ｎｍの赤外線蛍光検出チャネルを用いたＩＲＤ－７００色素の検出により可視化および定量化した（Ｎｏｒｍａｎｄ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４， Ｖｏｌ． ９１， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ２９３－３００．）。
【0150】
結果
「Ｄ－ループ」ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験は、鎖交換構造（Ｄ－ループ）の形成の定量化、よって、リコンビナーゼの機構の鎖交換ステップの間の分子の阻害力の決定を可能にする。次に、化合物Ａ－１～Ａ－５、Ｂ－１～Ｂ－３、Ｂ－１～Ｂ－３、およびＤＩＤＳの存在下でのＲＡＤ５１タンパク質の阻害を測定するＩＣ５０を計算する。この結果を以下の表３に提示する。
「Ｄ－ループ」ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験は、鎖交換構造（Ｄ－ループ）の形成の定量化、よって、リコンビナーゼの機構の鎖交換ステップの間の分子の阻害力の決定を可能にする。次に、化合物Ａ－１～Ａ－５、Ｂ－１～Ｂ－３、Ｂ－１～Ｂ－３、およびＤＩＤＳの存在下でのＲＡＤ５１タンパク質の阻害を測定するＩＣ５０を計算する。この結果を以下の表３に提示する。
【表3】
【0151】
これら結果は、ジスルホナートスチルベンＡ－３、Ａ－４、Ｃ－３、Ｓ－１、Ｓ－２、Ｂ－１、Ｂ－２、およびＢ－３が比較的低いＩＣ５０を有し、よって、鎖交換構造（Ｄ－ループ）の形成の強力な阻害剤であることを示している。ジスルホナートスチルベンＡ－４、Ｃ－３、およびＢ－２は、ＤＩＤＳ参照化合物の同じ桁の範囲内で非常に低いＩＣ５０値を有し、よって、鎖交換ステップの防止に特に効率的である。
【0152】
よって、本発明に係るジスルホナートスチルベンは、ＤＮＡ侵入により証明されるように、強力なＲＡＤ５１タンパク質阻害剤である。
【0153】
実施例５：細胞アッセイ－細胞内相同組み換え（ＨＲ）に及ぼす作用
材料および方法
ｐＣＭＶ－ＨＡ－Ｉ－ＳｃｅＩプラスミドでトランスフェクションし、７２時間インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳおよび５０ｍＭのＥＤＴＡにおいて回収し、ペレット状にし、２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｅｄｈｙｄｅ）で２０分間固定した。ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＦＡＣＳ分析によりスコア付けした。少なくとも３回の独立した実験を行い、ＨＡ－Ｉ－ＳｃｅＩｂの発現を、ウサギの抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）でのウェスタンブロットにより毎回検証した。
材料および方法
ｐＣＭＶ－ＨＡ－Ｉ－ＳｃｅＩプラスミドでトランスフェクションし、７２時間インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳおよび５０ｍＭのＥＤＴＡにおいて回収し、ペレット状にし、２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｅｄｈｙｄｅ）で２０分間固定した。ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＦＡＣＳ分析によりスコア付けした。少なくとも３回の独立した実験を行い、ＨＡ－Ｉ－ＳｃｅＩｂの発現を、ウサギの抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）でのウェスタンブロットにより毎回検証した。
【0154】
結果
組み換え線維芽細胞株ＲＧ３７を使用して、細胞の状況でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果（実施例２～５）を確認する。この細胞株は、２つの非機能的なＧＦＰカセットを含み、このうちの１つは、制限酵素のトランスフェクションにより誘導可能な固有の切断部位を有する。ＤＮＡの二重鎖切断（ＤＳＢ）と等価である切断の後、相同組み換え（ＨＲ）は、完全なＧＦＰカセットの再構成をもたらし、よって細胞を蛍光にする。次に、細胞内ＨＲの比率をフローサイトメトリーでの測定により決定し、化合物Ｃ－３、Ｂ－２、およびＸ－２での処置後の細胞におけるＨＲのレベルを測定する。この結果を、図３に提示する。
組み換え線維芽細胞株ＲＧ３７を使用して、細胞の状況でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果（実施例２～５）を確認する。この細胞株は、２つの非機能的なＧＦＰカセットを含み、このうちの１つは、制限酵素のトランスフェクションにより誘導可能な固有の切断部位を有する。ＤＮＡの二重鎖切断（ＤＳＢ）と等価である切断の後、相同組み換え（ＨＲ）は、完全なＧＦＰカセットの再構成をもたらし、よって細胞を蛍光にする。次に、細胞内ＨＲの比率をフローサイトメトリーでの測定により決定し、化合物Ｃ－３、Ｂ－２、およびＸ－２での処置後の細胞におけるＨＲのレベルを測定する。この結果を、図３に提示する。
【0155】
よって、ＨＲに及ぼす有意な阻害性作用が、ジスルホナートスチルベンＣ－３およびＢ－２で得られるが、スルホナート基を含まない比較化合物Ｘ－２はいずれの阻害ももたらさないことから、これらの結果はｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果を裏付けた（図３）。
【0156】
よって、本発明に係るジスルホナートスチルベンは、細胞内相同組み換えにより証明されるように、強力なＲＡＤ５１タンパク質阻害剤である。
【0157】
実施例６：細胞アッセイ－抗悪性腫瘍薬での感作作用
材料および方法
クローン形成能試験を、前立腺がん（ＤＵ－１４５）を含むがん由来のいくつかのモデル細胞株に対して行う。細胞を、ＤＮＡを標的とする抗がん剤（シスプラチンまたはカンプトテシン）に対して曝露する。損傷した細胞数を計測し、三連の培養プレートにおいてＢ－２の存在下または非存在下で播種する。３７℃での約２週間のインキュベーションの後、形成されるクローンの数を計測する。その後、その損傷を修復することが可能な各細胞はクローンを形成する。計測した後、生存のパーセンテージを、１００％が生存するとみなされる対照条件と比較して計算する。
材料および方法
クローン形成能試験を、前立腺がん（ＤＵ－１４５）を含むがん由来のいくつかのモデル細胞株に対して行う。細胞を、ＤＮＡを標的とする抗がん剤（シスプラチンまたはカンプトテシン）に対して曝露する。損傷した細胞数を計測し、三連の培養プレートにおいてＢ－２の存在下または非存在下で播種する。３７℃での約２週間のインキュベーションの後、形成されるクローンの数を計測する。その後、その損傷を修復することが可能な各細胞はクローンを形成する。計測した後、生存のパーセンテージを、１００％が生存するとみなされる対照条件と比較して計算する。
【0158】
結果
ＲＡＤ５１タンパク質阻害剤の主な関心は、化学物質耐性または放射線耐性の癌細胞株の感作である。クローン形成能の評価を、ジスルホナートスチルベンＢ－２（ＲＡＤ５１タンパク質阻害剤）の存在下または非存在下においてシスプラチン処置で処置したＤＵ－１４５細胞株で行った。この結果を、図４および以下の表４に提示する。
ＲＡＤ５１タンパク質阻害剤の主な関心は、化学物質耐性または放射線耐性の癌細胞株の感作である。クローン形成能の評価を、ジスルホナートスチルベンＢ－２（ＲＡＤ５１タンパク質阻害剤）の存在下または非存在下においてシスプラチン処置で処置したＤＵ－１４５細胞株で行った。この結果を、図４および以下の表４に提示する。
【表4】
【0159】
これら結果は、シスプラチン単独の存在下（四角の印を有する上の曲線）での細胞の生存率が、シスプラチンの量にかかわらずＢ－２化合物２０μＭを伴うシスプラチンの存在下（円形の印を有する下の曲線）よりも高いことを示している（図４）。よって、Ｂ－２は、実際に、シスプラチンの抗悪性腫瘍活性を補完するがん細胞株に対する感作剤として作用する。この作用はまた、シスプラチンの成長阻害のＩＣ５０がＢ－２の存在下で約４０％減少することによっても証明されている（表４）。
【0160】
同じ実験を、ＲＡＤ５１が媒介する相同組み換えにより修復されるＤＮＡ損傷を誘導することが知られているカンプトテシンの処置を使用して行った。
【0161】
ＤＵ－１４５細胞株を、ジスルホナートスチルベンＢ－２（ＲＡＤ５１タンパク質阻害剤）の存在下または非存在下においてカンプトテシンで処置し、クローン形成性細胞の生存を決定した。この結果を、図５および以下の表５に示す。
【表5】
【0162】
これら結果は、カンプトテシン単独の存在下（四角いドットを伴う上の曲線）での細胞の生存率が、カンプトテシンの量にかかわらず、Ｂ－２化合物２０μＭおよびカンプトテシンの存在下（円形の印を有する下の曲線）よりも高いことを示している（図５）。よって、Ｂ－２は、実際に、カンプトテシンの抗悪性腫瘍活性を補完する癌性細胞株に対する感作剤として作用する。この作用はまた、カンプトテシンの増殖阻害のＩＣ５０がＢ－２の存在下で約９０％減少することによっても証明されている（表５）。
【0163】
よって、本発明に係るジスルホナートスチルベンは、強力な感作剤であり、よって増殖性疾患の処置に有用である。
【0164】
実施例７：細胞アッセイ－細胞傷害性
材料および方法
前立腺がん細胞ＤＵ１４５（癌）および線維芽細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した最小必須培地（ＲＰＭＩ１６４０培地）において培養し、５％のＣＯ２、３７℃で増殖させた。
材料および方法
前立腺がん細胞ＤＵ１４５（癌）および線維芽細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した最小必須培地（ＲＰＭＩ１６４０培地）において培養し、５％のＣＯ２、３７℃で増殖させた。
【0165】
処置した分子を、２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、保存した。
【0166】
ＤＵ１４５細胞および線維芽細胞を、標準的な９６ウェルプレートにおいて１００μｌの培地に５×１０３個の細胞／ウェルで播種した。これらプレートを、５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃で２４時間インキュベートした。ＤＭＳＯに希釈した分子溶液を、ＲＰＭＩ１６４０培地により６０μＭから０．０２μＭに連続希釈し、１００μｌのＲＰＭＩに４連で添加した。
【0167】
７２時間のインキュベーションの後、５ｍｇ／ｍｌ－１のＭＴＴ２０μｌを製造社の指示に従い各ウェルに添加した。３７℃での２時間のインキュベーションの後、培地を除去し、２００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加してホルマザン結晶を溶解した。次に、各ウェルの５４０ｎｍでの吸光度を、ＥｎＳｐｉｒｅ マルチモードプレートリーダーを使用してモニタリングした。各ウェルの吸光度は、対照（未処置の細胞を有するウェル）のパーセンテージとして表し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値は、５０％成長阻害をもたらす薬物の濃度として定義される。結果は、少なくとも３回の実験の平均値を表す。全てのデータは、平均値±標準偏差として表した。ＩＣ５０値は、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔ ３．０を使用して濃度－対数応答曲線の線形回帰分析により計算した。
【0168】
結果
ＤＵ２４５前立腺がん細胞株を使用して、小分子である本発明のスチルベン化合物Ｂ－１～Ｂ－３および参照化合物ＢＰＱの毒性を評価および比較した。
ＤＵ２４５前立腺がん細胞株を使用して、小分子である本発明のスチルベン化合物Ｂ－１～Ｂ－３および参照化合物ＢＰＱの毒性を評価および比較した。
【0169】
化合物Ｂ１～Ｂ３は、ＤＵ－１４５細胞に対して３日間５０μＭで細胞傷害作用を有しなかったのに対して、ＢＰＱは、同じインキュベーション時間、同じ濃度において細胞において高い細胞傷害性（低い細胞のバイアビリティ）をもたらす（図６）。実際に、ＢＰＱは、９０％の細胞の死亡率をもたらすが、本発明のスチルベン誘導体は、細胞のバイアビリティに影響しない（＞９５％の細胞のバイアビリティ）。同じ結果が、線維芽細胞で得られている（図７）。
【0170】
線維芽細胞で行った試験（図７）もまた、ＤＩＤＳが、本発明のスチルベン誘導体とは反対に、５０μＭで３日間細胞傷害性作用を有することを示している。
【0171】
実施例８：細胞アッセイ－Ｒａｄ５１の病巣の定量化
材料および方法
ＤＵ－１４５細胞を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した培地（ＲＰＭＩ）においてウェルあたり５×１０３個の細胞の密度でカバーガラス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で成長させた。細胞を、２０μＭのＲＡＤ５１阻害剤Ｂ－２の存在下または非存在下で１時間、３０μＭのシスプラチンで処置し、次に培地を、分子フリー培地（ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）と交換した。１８時間後に、細胞をＰＢＳで５分間洗浄し、２５分間無水エタノールで固定した。
材料および方法
ＤＵ－１４５細胞を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した培地（ＲＰＭＩ）においてウェルあたり５×１０３個の細胞の密度でカバーガラス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で成長させた。細胞を、２０μＭのＲＡＤ５１阻害剤Ｂ－２の存在下または非存在下で１時間、３０μＭのシスプラチンで処置し、次に培地を、分子フリー培地（ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）と交換した。１８時間後に、細胞をＰＢＳで５分間洗浄し、２５分間無水エタノールで固定した。
【0172】
固定した細胞を、１：１０００に希釈した抗ＲＡＤ５１抗体を含むＰＢＳバッファーにおいて室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで５分間３回洗浄した後、暗室でスライドを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５とコンジュゲートした二次抗体（希釈１：００００）を含むＰＢＳ溶液と４５分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を伴うＰｒｏＬｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で対比染色および標本作製を行い、カバーガラスを適用した。このスライドを、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ－１ＲＳｉ， Ｍｉｎａｔｏ－ｋｕ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）および落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００）で観察した。画像を、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６， Ｎｉｋｏｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を使用して記録した。ＲＡＤ５１の病巣の定量化を、Ｆｉｊｉ－ＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）由来のプログラムで処理した。
【0173】
結果
ＤＵ１４５前立腺がん細胞株を使用して、Ｂ－２の存在下または非存在下でのシスプラチン処置後のＲＡＤ５１の病巣のレベルを評価した。
ＤＵ１４５前立腺がん細胞株を使用して、Ｂ－２の存在下または非存在下でのシスプラチン処置後のＲＡＤ５１の病巣のレベルを評価した。
【0174】
シスプラチン単独での処置は、高レベルのＲＡＤ５１の病巣を誘導するが、このレベルは、処置がＢ－２２０μＭと関連する場合は、減少する。細胞あたりのＲＡＤ５１の病巣の数の定量化の後、２０超のＲＡＤ５１の病巣を含む細胞の数を決定した。
【0175】
図８のヒストグラムのグラフから、シスプラチン３０μＭが媒介するＲＡＤ５１の病巣のレベルが、Ｂ－２によって減少する（約２０％）ことが確認される。この結果は、Ｂ－２が、シスプラチンが媒介するＤＮＡ損傷後のＲＡＤ５１病巣形成を減少できることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
